JP2009507943A - 末端アミン基を有するポリマーの調製方法 - Google Patents

Abstract

本発明は末端アミンを高純度で含むポリアルキレンオキサイドなどの直鎖状ポリマーの調製方法に関する。１つの好ましい方法として、末端アジドを含むポリエチレングリコールなどのポリアルキレンオキサイドを、トリフェニルホスフィンなどのホスフィン系還元剤、または水素化ホウ素ナトリウムなどのアルカリ金属ホウ化水素還元剤と、溶媒中で還流させながら反応させることが挙げられる。結果として得られるポリマー−アミンは、医薬品グレードのポリマーに必要とされる高価で時間のかかる精製工程を回避するのに十分な純度である。

Description

関連出願の説明

この出願は、２００５年８月２６日出願の米国特許出願第１１／２１２，９０１号、およびその一部継続出願である、２００５年１２月１日出願の米国特許出願第１１／２９１ ,５４６号の各優先権を主張するものであり、これら各出願の内容をここに参照することによりそのすべてを本願に援用する。

本発明は、ポリアルキレンオキサイドなどの活性化ポリマーを調製する方法に関する。具体的には、本発明は、末端アミンを高純度で含む直鎖状ポリマーの調製方法に関する。

水溶性のポリアルキレンオキサイドと、タンパク質およびポリペプチドなどの治療成分との結合が知られている。例えば、引用することにより本明細書に援用される、特許文献１を参照。特許文献１には、ＰＥＧで修飾された生物活性ポリペプチドが、インビボで長期間循環し、免疫原性および抗原性を低減させることが開示されている。

ポリアルキレンオキサイドと結合させるためには、ポリマーのヒドロキシ末端基は、まず、反応性の官能基へと転換されなければならない。この過程は、しばしば「活性化」と称され、その生成物は「活性化されたポリアルキレンオキサイド」と呼ばれる。他のポリマーも同様に活性化される。

ＰＥＧ−ＮＨ_２などのアミン末端化されたポリマーが知られている。非特許文献１参照。それらは、一部の生物活性化合物に見られるＣＯＯＨ基への直接結合に「そのまま」利用することができる。他のポリマー輸送系が望ましい場合は、ＰＥＧ−ＮＨ_２（またはＰＥＧ−アミン）が、さらに官能化された中間体として頻繁に用いられる。例えば、ベンジルの脱離システム、トリメチル・ロック・システム(trimethyl lock systems)などを含む、特定のポリマー系のドラッグ・デリバリー・プラットフォーム・システムに、合成過程におけるキー中間体として、ＰＥＧ−ＮＨ_２を含めることができる。非特許文献２〜４参照。これらの各内容を、ここに引用することにより本明細書に援用する。

ＰＥＧ−アミンは、また、利用可能なアルデヒド基を有する、生物活性のある小分子およびポリペプチドとの結合（還元的アミノ化を介して）にも有用である。ここに引用することによりその内容を本明細書に援用する、非特許文献５も参照のこと。

以前は、ＰＥＧ−アミンは、ＰＥＧ−ＯＨからＰＥＧ−ハロゲン化物、メシレート(mesylate)、またはトシレート(tosylate)を調製することによって、また、その後は、アンモニア水（ホフマン反応）、アジ化ナトリウムまたはフタルイミドカリウム（ガブリエル試薬(Gabriel Reagent)）との求核置換反応を行なうことによって、調製できることが一般に知られていた。ＰＥＧ−ハロゲン化物とアンモニアとの反応によって、ＰＥＧ−アミンが直接形成される。さらに重大なことには、主たる不利点が、高濃度のアンモニア水処理の間にかなりの割合のＰＥＧ−ハロゲン化物が加水分解され、ＰＥＧ−ＯＨを形成してしまうことである。これは、分子量の大きいＰＥＧ−アミンの形成の際に特に懸念される。ＰＥＧの分子量が大きくなると、ＰＥＧ−ＯＨがより多く生じる。例えば、ＰＥＧ_5,000の場合、その量は約５％であり、ＰＥＧ_40,000などのより大きい分子量では、その量は最大で２０％までになりうる。したがって、目的の最終生成物の純度は、大幅に減少する可能性がある。

ＰＥＧ−アジ化物を中間体として用いてＰＥＧ−アミンを調製する場合でさえ、金属触媒による水素化を利用する際には、いくつかの欠点が認められる。さらには、フタルイミドカリウムとの反応は、基本的に保護されたアミンを提供し、これを還流下、エタノール中のヒドラジンで脱保護化するが、これも欠点と関係する。フタロイル基の除去に必要とされる厳しい条件、および、最終生成物の徹底的な精製の必要性により、目的の生成物の費用が大幅に増加することとなる。
米国特許第４，１７９，３３７号明細書 Zalipsky et al. Eur. Polym. J. (1983) Vol.19 No.12., pp1177-1183 Greenwald et al. J. Med. Chem. Vol. 42, 1999 Sept. 9; No. 18, 3657-3667 Greenwald et al. J. Med. Chem. 2004 Jan. 29; Vol. 47, No. 3, 726-734 Greenwald et al. J. Med. Chem. 2000 Feb.10; Vol. 43, No. 3, 475-487 Nektar Advanced PEGylation catalog 2005-2006, page 24

上記を考慮すると、先行技術の欠点および難点の解決に向けて取り組む、末端アミンを有するＰＥＧ−アミンおよび関連ポリマーの改良された調製方法の提供が望まれるであろう。本発明は、この必要性に取り組むものである。

本発明の１つの好ましい態様では、末端アミンを有するポリマーの改良された調製方法が提供される。本方法には、一般式（Ｉ）：
（Ｉ） Ｒ_１−Ｒ_２−Ｎ_３
で表され、
ここで、
Ｒ_１は、キャップされた基またはＮ_３であり、
Ｒ_２は、実質的に非抗原性のポリマーである、
実質的に非抗原性のポリマーを、
ホスフィン系の還元剤またはアルカリ金属ホウ化水素還元剤と、
反応させることが含まれる。

ポリマーのアジ化物とホスフィン系還元剤との反応は、極性溶媒中で行なわれることが好ましく、反応物質を、還流条件下、反応が実質的に完了するのに十分な時間で反応させ、ポリマーに末端アミンを形成させる。本発明のさらに好ましい態様では、アミン誘導体に転換されたポリマーはＰＥＧ−アジ化物であり、そのアジド基が、少なくとも１つ以上のＰＥＧ末端上に存在しうる。好ましいホスフィン系の還元剤の１つは、トリフェニルホスフィンである。本発明の別の態様では、好ましいアルカリ金属ホウ化水素は、ＮａＢＨ_４である。

本明細書に記載される方法によって形成される末端アミンを含むポリマーの純度は、約９５％よりも高く、９８％よりも高いことが好ましく、９９％よりも高いことがさらに好ましい。

本発明の主な利点の１つは、ポリアルキレンオキサイド誘導体など、結果として得られる末端アミン含有ポリマーが高純度で調製されることである。よって、生成物に混入する物質、すなわち、ｍＰＥＧ−ＯＨなどの出発材料は、大量には認められない。言い換えれば、それらは約５％未満の量で認められ、約２％未満が好ましく、約１％未満が最も好ましい。好ましいＰＥＧ−アミンが、さらに経済的に、高純度で生成される場合には、当業者は、さらに効率的かつ安い費用で、ＰＥＧ−アミンを取り入れた最終生成物を調製することができる。ＰＥＧ−アミンの生成反応を遂行させ、再結晶化によって過剰の小分子試薬を除去することができる。１つには、出発物質であるアルコールまたは反応性の中間体（例えばトシレート）から目的のアミン末端化されたポリマーを分離する必要がないため、結果的に効率がよい。さらには、カラムクロマトグラフィーに基づく精製技術の必要がなく、目的のＰＥＧ−アミンを提供する。したがって、本発明は、費用の嵩むカラム精製をせずに、高純度のＰＥＧ−アミンを提供する。

別の利点は、本明細書に記載される方法で調製されるアミンがＰＥＧの骨格をまったく変化させないという事実である。したがって、それは、現在および将来にわたるＰＥＧ−アミンのすべての用途に適合するであろう。

本発明にかかる方法は、一般に、少なくとも１つの末端アミンを含むポリマーの形成に関する。本発明のほとんどの態様では、本明細書に記載される方法を利用して修飾可能なポリマーは、実質的に非抗原性のポリマーである。この類のポリマーの中では、ポリアルキレンオキサイドが好ましく、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が最も好ましい。限定ではなく、説明を容易にする目的で、本方法は、しばしば、ＰＥＧを原型的なポリマーとして用いて記載されるが、当然ながら、本方法は、直鎖状、実質的に直鎖状、分岐鎖状などでありうる、多種多様のポリマーに適用可能なことが理解されよう。数少ない要件の１つとしては、ポリマーが、アジドと共有結合する手段を有し、必要とされる処理に耐えて、本明細書に記載される条件下で、アジドをアミンに転換可能なことである。

前述に従って、末端アミンを有するポリマーを調製する本発明の１つの好ましい態様は、一般式（Ｉ）：
（Ｉ） Ｒ_１−Ｒ_２−Ｎ_３
で表され、
ここで、
Ｒ_１はキャップされた基またはＮ_３であり、
Ｒ_２は実質的に非抗原性のポリマーである、
実質的に非抗原性のポリマーと、
ホスフィン系の還元剤またはアルカリ金属ホウ化水素還元剤とを、
反応させることを含む。

上記のように、Ｒ_１はキャップされた基である。当然ながら、本発明の目的では、キャップされた基は、ポリマーの末端に認められる基を意味することが理解されよう。一部の態様では、それは、当業者に理解されるように、ＣＯ_２Ｈ、Ｃ_１−６アルキル（ＣＨ_３が好ましい）、ＯＨなど、または他の末端基から選択することができる。

Ｒ_２も、ポリアルキレンオキサイド（ＰＡＯ）などの室温で水溶性を示すポリマーが好ましく、ｍＰＥＧまたはビス活性化ＰＥＧなどのポリエチレングリコールがさらに好ましい。したがって、こういったポリマーの限定されないリストとしては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはポリプロピレングリコールなどのポリアルキレンオキサイド・ホモポリマー、ポリオキシエチレン化ポリオール、それらの共重合体、および、それらのブロック共重合体であって、そのブロック共重合体の水溶性が維持されることが提供されるもの、などが挙げられる。

説明の目的であって、限定はしないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のＲ_２残基部分は、−ＣＨ_２ＣＨ_２−Ｏ−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｘ−ＣＨ_２ＣＨ_２−で表すことができ、
ここで、
ｘは重合度、すなわち、約１０〜約２，３００である。よって、キャップされた基Ｒ_１がＣＨ_３であり、Ｒ_２がＰＥＧである、本発明の１つの態様では、モノ活性化ポリマーは、一般式（Ｉｂ）：
（Ｉｂ） ＣＨ_３−Ｏ−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｘ−ＣＨ_２ＣＨ_２−Ｎ_３
で表すことができる。

本発明の別の態様では、ビス活性化ポリマーを目的物とする場合には、Ｒ_１はＣＨ_３であり、得られる反応物質はビス−アミン末端化されたポリマー化合物の調製に利用される。こういったビス活性化ポリマーは、一般式（Ｉａ）：
（Ｉａ） Ｎ_３−ＣＨ_２ＣＨ_２−Ｏ−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｘ−ＣＨ_２ＣＨ_２−Ｎ_３
で表すことができ、
ここでｘは上記と同じである。

ポリマーの重合度はポリマー鎖の繰り返し単位の数で表され、ポリマーの分子量によって左右される。実質的に非抗原性のポリマーであるＰＡＯおよびＰＥＧの重合度は、実質的に重量平均分子量によって変化し、Ｒ_２は、本発明のほとんどの態様において、約２００〜約１００，０００Ｄａの重量平均分子量であることが好ましい。実質的に非抗原性のポリマーは、約２００〜約４８，０００Ｄａの重量平均分子量であることがさらに好ましい。

Ｒ_２は、また、ここに参照することによりその内容を本明細書に援用する、NOF Corp. Drug Delivery System catalog, Ver. 8, April 2006に記載されるような「スター−ＰＥＧ」または、マルチアームのＰＥＧでありうる。

さらに別の好ましい実施の形態では、Ｒ_２は、本発明にかかるポリマーに対応する分岐鎖ポリマーの一要素である。具体的には、Ｒ_２は、一般式：

もしくは

で表すことができ、
ここで、
ｎは約１０〜約３４０の整数であり、総分子量が約１２，０００〜約４０，０００であって、末端部分の残基の少なくとも１つ〜最大３つがメチルまたは他の低級アルキルでキャップされている、ポリマーを提供することが好ましい。上記特許文献５の２６ページ、 “4-arm PEG”を参照。こういった末端をアミノ化する前の化合物としては、下記のものが好ましい。

参照することにより各開示を本明細書に援用する、同一出願人による米国特許第５，６０５，９７６号、同第５，６４３，５７５号、同第５，９１９，４５５号、および同第６，１１３，９０６号の各明細書に記載される分岐鎖ポリマー残基を含む、様々な他のＰＥＧ系化合物への末端アミンの形成もまた、本発明の範囲内にあることが意図されている。いくつかの特定化合物の代表的なリストとして、下記のものが挙げられる：

ここで、
ｚは１〜約１２０の整数であり、
Ｌ_１およびＬ_３は、独立して、下記の限定されない化合物群の１つなどの二官能性の連結基から選択される：

ここで、
Ｒ_９−１３は、独立してＣ_１−６アルキルなどと同一の基から選択され、ＨまたはＣＨ_３であることが好ましく、
Ｒ_６は、Ｒ_９−１３、ＮＯ_２、Ｃ_１−６ハロ-アルキル、およびハロゲンを定義するのと同一の基から選択され、
ｑ、ｔ、およびｙは、それぞれ独立して、１〜約１２などの正の整数から選択され、
Ｌ_２は、ジアミノアルキルまたはリジン残基などの分岐鎖連結基である。例えば、前述の米国特許第６，１１３，９０６号明細書を参照。

さらなる実施の形態では、ＰＡＯ系ポリマーの代替として、Ｒ_２は、デキストラン、ポリビニルアルコール、炭水化物系ポリマー、ヒドロキシプロピルメタクリル−アミド（ＨＰＭＡ）、ポリアルキレンオキサイド、および／またはこれらの共重合体などの１種類以上の効果的な非抗原性材料の中から任意的に選択される。ここに参照することによりその内容を本明細書に援用する、同一出願人による米国特許第６，１５３，６５５号明細書を参照。ＰＥＧなどのＰＡＯ系ポリマー用として本明細書に記載されるのと同様に、活性化に利用できることが、当業者に理解されるであろう。さらに、前述のリストが単なる例示であり、本明細書に記載される性質を持つポリマー材料のすべてが意図されることも、当業者に認識されるであろう。

水溶性ポリマーは、アミノ化前に必要以上の実験をすることなく、必要に応じてアジド基の付加による官能基化が可能であることもまた理解されよう。

目的のアミン末端化されたポリマーの調製方法に必要な反応物質の１つは、アジド（Ｎ_３）末端化された出発物質である。こういったアジドで修飾されたポリマーの調製は文献で報告されている。例えば、前述の非特許文献１を参照。あるいは、一般式（ＩＩ）：
（ＩＩ） Ｒ_３−０−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｘ−Ｒ_３
で表され、
ここで、Ｒ_３は、Ｂｒ、Ｃｌ、トシレートまたはメシレート、ブロシレート(brosylate)、トレシレート(tresylate)、ノシレート(nosylate)からなる群より選択され、
ｘは、重合度である、
一般式（ＩＩ）の化合物を、
エタノールおよび／またはＤＭＦなどの溶媒の存在下、ＮａＮ_３と、
反応させることによって、アジドを調製することができる。

本発明の１つの態様では、ＰＥＧ−アジ化物の対応するアミンへの転換は、アジドとホスフィン系還元剤を溶剤中で反応させ、反応物質をポリマーに末端アミンを生じさせるのに十分な時間、還流させることにより、達成することができる。

本発明の方法に利用可能な適切なホスフィン系の還元剤は多数存在する。限定されないリストとして、トリフェニルホスフィン、トリトリルホスフィン、トリブチルホスフィン、ｔ−ブチルジフェニルホスフィン、ジフェニル（ｐ−トリル）ホスフィン、トリス（２，４，６−トリメトキシフェニル）ホスフィン、トリス（２，６−ジメトキシ−フェニル）ホスフィン、トリス（２−メトキシフェニル）ホスフィン、トリス（３−クロロフェニル）ホスフィン、トリス（３−メトキシフェニル）ホスフィン、トリス（４−フルオロフェニル）ホスフィン、トリス（４−メトキシフェニル）ホスフィン、トリス（ｐ−クロロフェニル）ホスフィン、およびトリス（ペンタフルオロフェニル）ホスフィンなどの還元剤が挙げられる。ホスフィン系還元剤として、トリフェニルホスフィンが好ましい。

本発明の方法に利用可能な適切な溶剤もまた、多数存在する。適切な溶剤としては、メタノール、エタノール、ブタノール、イソプロパノール、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）およびジオキサンなどからなる極性溶剤が挙げられる。

本発明の別の態様では、アルカリ金属ホウ化水素を還元剤としてＰＥＧ−アジ化物のＰＥＧ−アミンへの転換に利用できる。適切なアルカリ金属ホウ化水素還元剤として、限定はしないが、水素化ホウ素ナトリウム（好ましい）、水素化ホウ素リチウムおよび水素化ホウ素カリウムが挙げられる。他については、当業者にとって明らかであろう。この経路を選択してアミノ化する場合、アルカリ金属ホウ化水素を還元剤として用いるアジドの還元は、Ｃ_１−６アルコール中で行なわれ、Ｃ_１−６アルコールとしてはイソプロピルアルコール、メタノール、またはエタノールが好ましい。

本発明の方法は、少なくとも、およそ等モル量の反応物質を用いて行なわれることが好ましい。ポリマーがアジドを１つだけ有している場合、ホスフィン系還元剤は、一般式（Ｉ）の化合物に対して過剰モルで存在することがさらに好ましい。トリフェニルホスフィンのｍＰＥＧに対する好ましい比は、約５〜約１である。デルタＰＥＧ（ビス−ＰＥＧまたは各末端が活性化されている）を用いる場合、その比は約１０〜約２であり、６〜２が好ましい。分岐鎖ポリマーを用いる場合も、付加すべきアミン基について同様の比が用いられる。ビス−アジドポリマーを用いる場合、反応中に存在するホスフィン系還元剤の量は、一般式（Ｉ）の化合物に対して、少なくとも約２倍〜過剰モルであることが好ましい。末端分岐鎖ポリマーを用いる場合には、用いられるホスフィン系還元剤の過剰モルは、ポリマー上に認められるアジド部分の数と少なくとも等しいことが好ましい。

アルカリ金属ホウ化水素の事例では、ポリマーに対して少なくとも約１０倍の過剰モルのホウ化水素が存在することが好ましい。約１５倍の過剰モルで存在することがさらに好ましい。過剰モルは、必要に応じて、５０倍または１００倍の量であって構わない。

本発明にかかる方法は、還流下で、すなわち、およそ溶剤の沸点の温度か、またはそれより少し高い温度で行なうことが好ましい。

高純度のＰＥＧ−アミンは、その後、当技術分野で認識されている何らかの用途に用いることができる。例えば、限定はしないが、当業者に周知の技術を用いて、対象とする生物活性ターゲットに認められるＣＯ_２Ｈ基または他の適切な反応基と直接結合させるのに利用することができる。あるいは、ＰＥＧ−アミンは、前述のベンジル脱離（ＲＮＬ）プラットフォームなどのさらに複雑なポリマーの結合系、またはＰＥＧ−リポソーム系の一部としてさえも、高純度の反応中間体として利用することができる。実証の目的で、ＰＥＧ−アミンを適切な保護化ベンジルアルコールと反応させることにより、ＲＮＬ系を調製し、その後、当業者に既知の技術を利用して脱保護化および活性化することができる。下記の最後の例も参照のこと。

本発明にかかる多くの態様では、キャップ化されていないＰＥＧ−ＯＨ（ジＰＥＧ−ＯＨ）またはｍＰＥＧなどのポリアルキレンオキサイド（ＰＡＯ）を、一般式（ＩＩａ）または（ＩＩｂ）の化合物に転換する：
（ＩＩａ） Ｎ_３−Ｒ_２−Ｎ_３
または
（ＩＩｂ） Ｒ_１−Ｒ_２−Ｎ_３
ここで、
Ｒ_１はメチルであり、
Ｒ_２は、ＰＥＧなどのＰＡＯである。

アジド含有ポリマーの形成後、本明細書に記載のように転換して、目的のＰＥＧ−アミン誘導体を高純度で生成する。高純度のＰＥＧ−アミンを、その後、当技術分野で認識されている何らかの用途に用いることができる。

下記の実施例は、本発明のさらなる認識を提供する役割をするが、決して、本発明の有効な範囲を制限することを意図してはいない。

実施例１
ＰＥＧ−アミン
スキーム１

ＰＥＧ−トシレート（ＰＥＧ−ＯＴｓ）
方法Ａ： ^{２０ＫＤａ}ΔＰＥＧ−ＯＨ（すなわち、ビスＰＥＧ−ＯＨ）（２．８ｇ、０．１４ｍｍｏｌ) をトルエン中で２時間共沸させた。トルエンを真空除去し、固体の残渣を５０ｍｌの無水ジクロロメタン（ＤＣＭ）に再び溶解させた。この溶液に、トリエチルアミン（９５ｍｌ、１．４ｍｍｏｌ）および４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）（１６５ｍｇ、１．３５ｍｍｏｌ）を加えた。混合液を氷浴で冷却し、次に、ＤＣＭ中のｐ−トルエンスルホニルクロリド（２６７ ｍｇ、１．４ｍｍｏｌ）を滴下して加えた。反応混合物を室温まで徐々に温め、一晩攪拌した。反応混合物を０．１ＮのＨＣｌで２回洗浄した。真空下、有機相を蒸発させた。得られた固体を最小量のＣＨ_２Ｃｌ_２に溶解させ、次に、エチルエーテルを加えて沈殿させた。ろ過後、得られた固体を２−イソプロパノール（ＩＰＡ）で再結晶化した。¹³C NMR (67.8 MHz, CDCl₃)δ143.92, 132.38, 129.1, 127.29, 67.99- 70.22, 21.09。

方法Ｂ：２００ｍｌのＤＣＭ中の^{３０ＫＤａ}ｍＰＥＧ−ＯＨ（２５ｇ、０．８３ｍｍｏｌ、１当量)の溶液に１５０ ｍｌの ３０％ＮａＯＨ水溶液とＢｎＥｔ_３ＮＣｌ（７６ ｍｇ、０．３３ ｍｍｏｌ、０．４当量）を加えた。次に、強攪拌した混合物に、側管付き滴下ロートを介して、１５０ｍｌのＤＣＭ中のｐ−トルエンスルホニルクロリド溶液（４７５ｍｇ、２．５ｍｍｏｌ、３当量）を滴下して加え、その反応混合物を室温で一晩攪拌した。２００ｍｌのＤＣＭと２００ｍｌの飽和ＮａＣｌを加えた後、有機相を分離し、２００ｍｌの飽和ＮａＣｌ溶液で２回洗浄した。有機相を無水ＭｇＳＯ_４で乾燥させ、ろ過し、真空下で蒸発させ、得られた固体を最小量のＤＣＭに溶解し、エチルエ−テルで沈殿させた。ろ過により、２４ｇの^{３０ＫＤａ}ｍＰＥＧ−ＯＴｓを得た（収率９６％）。¹³C NMR: 21.56, 58.86, 68.45, 69.07, 69.96- 71.71 (PEG), 127.64, 129.53, 132.70, 144.43。GPC: 100%。

ＰＥＧ−アジ化物（ＰＥＧ−Ｎ_３）： ２０ｍｌの無水ＤＭＦ中の^{３０ＫＤａ}ｍＰＥＧ−ＯＴｓ溶液（２ｇ、０．０６６ｍｍｏｌ、１当量）にＮａＮ_３（１３ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ、３当量）を加えた。反応混合物を８０℃で一晩加熱し、次に、冷却し、真空下で蒸発させた。得られた固体をＣＨ_３ＣＮ／ＩＰＡで再結晶化し、１．７ｇの^{３０ＫＤａ}ｍＰＥＧ−Ｎ_３を得た（収率８５％）。¹³C NMR (ppm): 50.49, 58.84, 69.37-71.72 (PEG)。GPC: 99.3%。

ＰＥＧ−アミン（ＰＥＧ−ＮＨ_２）:１２０ｍｌの無水ＭｅＯＨ中の^{３０ＫＤａ}ｍＰＥＧ−Ｎ_３溶液（１０．６４ｇ、０．３５ ｍｍｏｌ、１当量）にトリフェニルホスフィン（２７９ ｍｇ、１．０６ｍｍｏｌ、３当量）を加えた。反応混合物を一晩、加熱還流し、冷却し、真空下で蒸発させた。得られた固体を最小量のＤＣＭに溶解し、次に、エチルエーテルを加えて沈殿させた。ろ過後、固体をＣＨ_３ＣＮ／ＩＰＡで再結晶化し、９．９４ｇの^{３０ＫＤａ}ｍＰＥＧ−ＮＨ_２を得た（収率９５％）。¹³C NMR (ppm): 41.61 , 58.83, 69.42-73.23 (PEG)。GPC: 98.91%。

対応する^{２０ＫＤａ}ΔＰＥＧ−アジ化物および^{２０ＫＤａ}ΔＰＥＧ−アミンを、方法Ａの^{２０ＫＤａ}ΔＰＥＧ−ＯＴｓから調製した。

実施例２
スキーム２

ＰＥＧ−クロリド：^{１２ＫＤａ}ｍＰＥＧ−ＯＨの溶液（１２ｇ、０．１ｍｍｏｌ）をトルエン中で２時間共沸させた。この混合物を３０℃まで冷却し、次にチオニルクロリドを加えた。反応混合物を１８時間還流後、溶媒を一部除去し、エチルエーテルで生成物を沈殿させた。固体をろ過によって回収し、エチルエーテルで洗浄し、イソプロパノールから再結晶化させ、生成物を生じた（１０．８ｇ、０．８１ｍｍｏｌ）。¹³C NMR (67.8 MHz, CDCl₃)δ69.64-70.9, 42.5。

ＰＥＧ−アジ化物（ＰＥＧ−Ｎ_３）：無水ＤＭＦ中の^{１２ＫＤａ}ｍＰＥＧ−Ｃｌ（１０．６ｇ、０．８８３ｍｍｏｌ）にＮａＮ_３（９１９ｍｇ、３５．５ｍｍｏｌ）を加えた。反応を、８０℃で２４時間、加熱した。エチルエーテルを加えた後、ろ過回収した。固体残渣をＤＣＭ中に溶解し、溶液を水で３回洗浄し、ＮａＳＯ_４で乾燥させ、ろ過し、真空下で蒸発させた。得られた固体をＤＣＭ／エチルエーテルで再結晶化し、ＰＥＧ−アジ化物（９．５４ｇ、０．７９５ｍｍｏｌ）を得た。¹³C NMR (67.8 MHz, CDCl₃)δ69.64-70.9, 50.29。

ＰＥＧ−アミン：ＩＰＡ中の^{１２ＫＤａ}ｍＰＥＧ−Ｎ_３懸濁液（１．２３ｇ、０．１ｍｍｏｌに水素化ホウ素ナトリウム（５８ ｍｇ、１．５ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を一晩還流した。反応混合物を室温まで冷却し、エチルエーテルを加えた。得られた固体をろ過によって回収した。固体残渣をＤＣＭ中に溶解し、溶液を水で３回洗浄し、ＮａＳＯ_４で乾燥させ、真空下で蒸発させ、ＩＰＡから再結晶化させ、ＰＥＧ−アミンを得た（１．１３ｇ、０．０９ｍｍｏｌ）。¹³C NMR (67.8 MHz, CDCl₃)δ68.42-72.89, 41.53。

実施例３
ｍＰＥＧ^３０ＫＲＮＬ９リンカー
この実施例では、次の反応スキームにしたがって、実施例１の^{３０ＫＤａ}ｍＰＥＧ−ＮＨ_２を活性化ＰＥＧリンカーへと転換する。

ｍＰＥＧ ^３０Ｋ ＲＮＬ９ ＯＴＢＤＭＳ２３：
無水ＣＨ_３Ｃｌ中のアルコ−ル溶液２２（２３８ ｍｇ、１ｍｍｏｌ、６当量）に、ＤＳＣ（２３５ｍｇ、０．９２ｍｍｏｌ、５．５当量）およびピリジン（８８ｍｌ、１．０８ｍｍｏｌ、６．５当量）を加えた。得られた懸濁液を一晩還流加熱し、室温まで冷却し、２５ｍｌの無水ＣＨ_３Ｃｌ中の^{３０ＫＤａ}ｍＰＥＧ−ＮＨ_２溶液（以後、２１）（５ ｇ、０．１７ｍｍｏｌ、１当量）に加えた。室温で３日間攪拌後、溶媒を真空下で蒸発させた。得られた固体を最小量のジクロロメタンに溶解し、次に、エーテルを加えて沈殿させ、ろ過し、ＣＨ_３ＣＮ／ＩＰＡで再結晶化し、４．８５ｇ を得た（収率９４％）。 GPC: 98.39%。¹³C NMR (75.4 MHz, CDCl₃)δ154.47, 149.59, 137.90, 126.52, 121.02, 69.09-71.65 (PEG), 64.24, 58.83, 40.83, 25.84, 18.27, 5.28。

ｍＰＥＧ ^３０Ｋ ＲＮＬ９ＯＨ ２４：
２０ｍｌのＣＨ_３ＣＮおよび１０ｍｌの水中の２３（４．８５ｇ、０．１６ｍｍｏｌ）溶液に、５０ｍｌの氷酢酸を加えた。反応混合物を室温で一晩攪拌し、次に、真空下で蒸発させた。残渣を７５ｍｌのＣＨ_２Ｃｌ_２に溶解した。有機相を１５ｍｌの水で２回洗浄し、ＭｇＳＯ_４で乾燥させ、ろ過し、真空下で蒸発させた。得られた固体を最小量のＣＨ_２Ｃｌ_２に溶解し、次に、エーテルを加えて沈殿させ、４．４９ｇを得た（収率９４％）。 GPC: 98.35%。¹³C NMR (75.4 MHz, CDCl₃)δ154.36, 149.90, 138.18, 127.37, 121.15, 69.42-71.69 (PEG), 63.93, 58.80, 40.83。

ｍＰＥＧ ^３０Ｋ ＲＮＬ９ＮＨＳ ２５：
５０ｍｌの無水ＣＨ_２Ｃｌ_２および５ｍｌの無水ＤＭＦ中の２４（４．４９ｇ、０．１５ｍｍｏｌ、１当量）溶液にＤＳＣ（３０５ｍｇ、１．１９ｍｍｏｌ、８当量）を加えた。混合物を０℃まで冷却し、次に、ピリジン（８７ｍｌ、１．０７ｍｍｏｌ、７．２当量）を加えた。反応混合物を室温で一晩攪拌し、次に、真空下で蒸発させた。得られた固体を最小量のＣＨ_２Ｃｌ_２に溶解し、次に、エーテルを加えて沈殿させ、ろ過し、ＣＨ_３ＣＮ ／ＩＰＡで再結晶化して４．２６ｇを得た（収率９４％）。GPC: 97.04%。¹³C NMR (75.4 MHz, CDCl₃) δ168.33, 154.01 , 151.51 , 151.22, 129.80, 129.53, 121.68, 69.88-73.08 (PEG), 58.83, 40.89, 25.32。

最終生成物は、結合に利用可能なアミンまたはヒドロキシを有する、ありとあらゆる生物活性ポリペプチド、酵素、タンパク質、小分子などとの結合に利用することができる。こういった結合反応の手法については、例えば、ここに参照することにより本明細書に援用される、同一出願人による米国特許第６，１８０，０９５号明細書、または前述の非特許文献２に記載されている。

Claims (24)

1. 一般式（Ｉ）：
   （Ｉ） Ｒ_１−Ｒ_２−Ｎ_３
   で表され、
   ここで、
   Ｒ_１がキャップされた基またはＮ_３であり、
   Ｒ_２が、実質的に非抗原性のポリマーである、
   実質的に非抗原性のポリマーを、
   ホスフィン系還元剤またはアルカリ金属ホウ化水素還元剤と、
   反応させることを含む、末端アミンを有するポリマーの調製方法。
2. 前記反応工程が溶媒中で行なわれ、前記反応物質が前記ポリマーに末端アミンを形成するのに十分な時間で反応させることを特徴とする、請求項１記載の方法。
3. 前記Ｒ_１のキャップされた基がＣＨ_３であることを特徴とする請求項１記載の方法。
4. Ｒ_１がＮ_３であることを特徴とする請求項１記載の方法。
5. Ｒ_２がポリアルキレンオキサイドであることを特徴とする請求項１記載の方法。
6. 前記ポリアルキレンオキサイドが、ポリエチレングリコールおよびポリプロピレングリコールからなる群より選択されることを特徴とする請求項５記載の方法。
7. 前記ポリアルキレンオキサイドが、一般式−Ｏ−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｘ−で表されるポリエチレングリコールであり、ここで、ｘが約１０〜約２，３００の整数であることを特徴とする請求項６記載の方法。
8. 前記ホスフィン系還元剤が、トリフェニルホスフィン、トリ（トリル）ホスフィン、トリブチルホスフィン、ｔ−ブチルジフェニルホスフィン、ジフェニル（ｐ−トリル）ホスフィン、トリス（２，４，６−トリメトキシフェニル）ホスフィン、トリス（２，６−ジメトキシフェニル）ホスフィン、トリス（２−メトキシフェニル）ホスフィン、トリス（３−クロロフェニル）ホスフィン、トリス（３−メトキシフェニル）ホスフィン、トリス（４−フルオロフェニル）ホスフィン、トリス（４−メトキシフェニル）ホスフィン、トリス（ｐ−クロロフェニル）ホスフィン、およびトリス（ペンタフルオロフェニル）ホスフィンからなる群より選択されることを特徴とする請求項１記載の方法。
9. 前記ホスフィン系還元剤がトリフェニルホスフィンであることを特徴とする請求項８記載の方法。
10. 前記アルカリ金属ホウ化水素還元剤が、水素化ホウ素ナトリウム、水素化ホウ素リチウムおよび水素化ホウ素カリウムからなる群より選択されることを特徴とする請求項１記載の方法。
11. 前記アルカリ金属ホウ化水素還元剤が、水素化ホウ素ナトリウムであることを特徴とする請求項１０記載の方法。
12. 前記実質的に非抗原性のポリマーが、約２００〜約１００，０００Ｄａの重量平均分子量であることを特徴とする請求項１記載の方法。
13. 前記実質的に非抗原性のポリマーが、約２，０００〜約４８，０００Ｄａの重量平均分子量であることを特徴とする請求項１２記載の方法。
14. 前記溶媒が、極性溶媒またはＣ_１−１０アルコールであることを特徴とする請求項１記載の方法。
15. 前記極性溶媒が、メタノール、エタノール、ブタノール、イソプロパノール、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ジメチルホルムアミドおよびジオキサンからなる群より選択されることを特徴とする請求項１４記載の方法。
16. 前記極性溶媒がメタノールであることを特徴とする請求項１５記載の方法。
17. 前記ホスフィン系還元剤が、一般式（Ｉ）の化合物に対して、およそ等モル〜過剰モルの範囲の量で存在することを特徴とする請求項１記載の方法。
18. 前記化合物の一般式（Ｉ）が、
    （Ｉａ） Ｎ_３−ＣＨ_２ＣＨ_２−Ｏ−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｘ−ＣＨ_２ＣＨ_２−Ｎ_３ または
    （Ｉｂ） ＣＨ_３−０−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｘ−ＣＨ_２ＣＨ_２−Ｎ_３
    で表され、
    ここで、ｘが重合度であることを特徴とする請求項１記載の方法。
19. 前記ホスフィン系還元剤が少なくとも一般式（Ｉ）の化合物に対して約２倍〜過剰モルの量で存在することを特徴とする請求項１７記載の方法。
20. 前記方法によって形成される前記末端アミンを含む前記ポリマー純度が、約９５％よりも高いことを特徴とする請求項１記載の方法。
21. 前記方法によって形成される前記末端アミンを含む前記ポリマー純度が、約９８％よりも高いことを特徴とする請求項２０記載の方法。
22. 前記方法によって形成される前記末端アミンを含む前記ポリマー純度が、約９９％よりも高いことを特徴とする請求項２１記載の方法。
23. 一般式（Ｉａ）で表される前記化合物が、一般式（ＩＩ）：
    （ＩＩ） Ｒ_３−Ｏ−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｘ−Ｒ_３
    で表され、
    ここで、
    Ｒ_３が、Ｂｒ、Ｃｌ、トシレートまたはメシレート、ブロシレート、トレシレート、およびノシレートからなる群より選択され、
    ｘが重合度である、
    化合物を、
    溶媒の存在下、ＮａＮ_３と、
    反応させることによって調製されることを特徴とする請求項１８記載の方法。
24. 一般式（Ｉ）で表される前記化合物が、
    

    

    

    からなる群より選択され、
    ここで、ｎは約１０〜約３４０の整数であることを特徴とする請求項１記載の方法。