JP2009284870A - 精神疾患の評価方法 - Google Patents

Abstract

【課題】新規なマーカー遺伝子を用いて精神疾患を簡便かつ正確に検査することのできる方法と、このマーカー遺伝子の発現を指標として、精神疾患の原因因子や精神疾患の治療薬剤の成分特定する方法を提供する。
【解決手段】被験者から単離した生体試料におけるGNAT2遺伝子の発現を測定し、この遺伝子発現に変調がある場合に、被験者が精神疾患の状態にあると評価することを特徴とする精神疾患の評価方法を提供する。また、GNAT2遺伝子発現変調を生じさせる因子を精神疾患の原因因子として特定する方法、およびGNAT2遺伝子の発現変調を改善させる物質を精神疾患の治療薬の成分として特定する方法を提供する。
【選択図】なし

Description

本発明は、GNAT2遺伝子の発現量を指標として精神疾患を評価する方法および精神疾患治療薬成分をスクリーニングする方法に関するものである。

現代社会では、将来への不安、職場や学校の人間関係、生活環境や騒音、家庭内の不和や子育てへの不安等の精神的なストレスにより自律神経系の失調をきたし、様々な精神疾患に至ることが多々ある。WHO国際疾病分類第10版（ICD-10）に基づくと、精神疾患は10種類1分類ほどに分けられ、脳の大きな病変による精神疾患、アルコール依存症、統合失調症、うつ病、摂食障害、睡眠障害、適応障害、多動性障害など様々な疾患を含むとされているが、これら精神疾患の発症には、遺伝と環境（ストレス）が非常に重要な危険因子であると考えられている。近年、精神疾患々者数が世界的に増加傾向にあり、社会的に大きな問題になっている。現在、多くの研究機関で精神疾患を診断・評価する技術の開発が行われており、これらの技術が精神疾患の予防や治療に役立てられるものと考えられる。

今日まで、ストレス状態を評価したり、精神疾患を診断あるいは評価するいくつかの方法として例えば以下にあげられるような多くの方法が提案されている。
1．体液中のクロモグラミンの濃度を定量する方法（特許文献１）、
2．副腎又は下垂体における一酸化窒素合成酵素の活性を測定する方法（特許文献２）、
3．唾液における副腎性性ホルモン又はその代謝物の濃度を指標にする方法（特許文献３）、
4．グルタチオン付加ヘモグロビン量を測定する方法（特許文献４）、
5．唾液中のコルチゾール濃度を測定する方法（特許文献５）、
6．モノアミン類の濃度変化率を測定する方法（特許文献６）、
7．V-1遺伝子発現量又はV-1蛋白質量を測定する方法（特許文献７）、
8．血中のKYN濃度の変化率を測定する方法（特許文献８）、
9．perl遺伝子とper2遺伝子の発現レベルを指標とする方法（特許文献９）、
10．特定遺伝子群の発現プロファイル解析によるストレス評価法（特許文献１０）、
11．血清中のアポリポタンパク質Ｅ、アポリポタンパク質Ａ−ＩＶ、ハプトグロビン、及びビタミンＤ結合タンパク質をマーカーとして使用する方法（特許文献１１）、
12．セロトニン１型受容体タンパク質の活性を促進又は阻害する化合物を用いたうつ病スクリーニング法（特許文献１２）
13．トランスサイレチン遺伝子にハイブリダイズできるポリヌクレオチドを使用した睡眠不足または睡眠障害の検出方法（特許文献１３）
14．細胞内グルタチオン（ＧＳＨ）レベル調節関与遺伝子の発現レベルを指標とする精神障害の診断方法（特許文献１４）
15．血球の遺伝子発現を指標とした統合失調症の客観的診断方法（特許文献１５）
しかし、ストレスが中枢神経系に影響を及ぼし、精神・神経疾患に至ることは知られているにもかかわらず、脳由来total RNAを用いて、ストレスを負荷する前後にその発現量が増減する遺伝子を精神疾患ストレスのマーカー遺伝子として用いることは少なく、さらに脳だけでなく血漿でも検出できる共通のマーカー遺伝子をストレスのマーカー遺伝子として用いることは今までになかった。また、今回のように多動性障害モデル、拘束ストレス、水浸ストレスなど数種の条件で発現量が増減するマーカー遺伝子を選択する方法も今までになかった。

一方、GNAT2遺伝子ついては以下が知られている。

哺乳動物の細胞からは数多くのＧタンパク質が見出されているが、いずれも各組織において細胞のシグナル伝達系に関与しており、ホルモン受容、神経伝達、細胞の増殖・分化などにおいて重要な役割を果たしている。近年、Ｇタンパク質αサブユニットが正常な機能を失うことにより、胎便吸引症候群、末端肥大症、下垂体腫瘍、甲状腺腫瘍、筋肉内腫瘍等の疾患が誘発されることが明らかになってきている（非特許文献1）。

GNAT2遺伝子のcDNAとそれがコードしているGNAT2タンパク質のアミノ酸配列はラット、ヒトおよびマウスにおいて公知である（ラット：GenBank Accession No. XM_001070101、ヒト：GenBank Accession No. NM_005272、マウス：GenBank Accession No. NM_008141）。Gnat2(guanine nucleotide binding protein, alpha transducing 2)は、錐体物質とcGMP-リン酸ジエステル加水分解酵素の結合を促進する、αβγの3トランスデューシン（サブユニット）からなるグアニンヌクレオチド結合タンパク質（Gタンパク質）のうちの錐体型のαトランスデューシン（サブユニット）をコードする遺伝子であり、錐体での光シグナル伝達に関与している。現在のところ、Gnat2遺伝子の突然変異は錐体機能障害を伴う網膜ジストロフィーの原因になるといわれている（非特許文献2）。また、Gnat2遺伝子のエクソン6にミスセンス変異がおこることで、色覚異常が引き起こされることも知られている。実際遺伝的に同型のGnat2変異ラットは、網膜伝図による錐体媒介反応が3週で鈍くなり、4週では錐体媒介反応がまったくなくなるとの報告がある（非特許文献3）。このようにGnat2遺伝子は目の病気に関する報告が、近年少しずつ増えているが、脳や精神疾患に関する報告は未だない。
特許公開平１１−２３５７２ 特許公開平８−２６２０２５ 特許公開平１１−３８００４ 特許公開２０００−７４９２３ 特許公開平１１−３２６３１８ 特許公開２００２−１５６３７８ 特許公開２００３−６１６５４ 特許公開２００４−１９８３２５ 特許公開２００７−１１０９１２ 特許公開２００６−１５ 特許公開２００７−２２５６０６ 法特許公開２００２−２３３３７２ 特許公開２００７−７５０７１ 特許公表２００７−５２４４０８ 特許公開２００４−１３５６６７ ：特許公開２００１−１８６８２８ ：Lee S. Weinstein., et al., TRENDS in Pharmacological Sciences. Vol. 27 No. 5 May 2006 ：Aligianis IA., et al., J Med Genet. 2002. Sep; 39 (9) 656-60 ：S. Nusinowitz., et al., Experimental Eye Research 84 (2007) 1104-1114

本発明は、新規なマーカー遺伝子を用いて精神疾患を簡便かつ正確に検査することのできる方法を提供することを課題としている。また本発明は、このマーカー遺伝子の発現を指標として、精神疾患の原因因子を特定する方法および精神疾患の治療薬剤の成分特定する方法を提供することを課題としている。

本発明者らは、精神疾患の疾患マーカー探索のための研究を行っていたところ、多動性障害モデルラット（注意欠陥多動性障害（attention deficit hyperactive disorder：ＡＤＨＤ）の中脳においてGNAT2遺伝子の発現が顕著に減少していることを新たに見出した。

多動性障害モデルラット（特許文献１６）は、北海道大学実験生物センターで進めている肝炎・肝癌・ヒトWilson病モデルLECラットのオリジナル系統の維持過程で、
１）歩行中、絶えず頭部を小さく振る、
２）突然、旋回運動をしたり、頭部を大きく後方にそらす行動をする、
３）一般のラットは尾を持ち体を引き揚げた場合、四肢を一旦伸ばした後、少ししてその状態から逃れようと体をよじり出すが、この異常行動のラットは、体を持ち上げた瞬間に体を左右に大きくよじり（くねらせる）、時には持たれた尾を中心に、空中で円を描くように回転する
などの異常行動をもつ個体が見出され、これらを従来のLEC系統維持ラインとは分離し、多動性障害モデルラット(WKAH Wig)として維持されているものである。

また、GNAT2遺伝子の発現の変化は、拘束ストレス、水浸ストレスを与えたWisterラットの脳においても見出されることが新たに明らかになった。

これらのことから、本発明者らは、GNAT2遺伝子が精神疾患の疾患マーカーとなる遺伝子であるとの確信が得られた。更に本発明者らは、GNAT2遺伝子の発現が血漿においても検出できることを見出した。

そのため、GNAT2遺伝子の発現抑制や、GNAT2遺伝子によりコードされるタンパク質（GNAT2）の発現抑制を指標としたスクリーニングは、精神疾患の予防、治療薬の探索に有効であるとの確信を得て、本発明を完成するに至った。

すなわち本出願は、前記の課題を解決するものとして、被験者から単離した生体試料におけるGNAT2遺伝子の発現を測定し、この遺伝子発現に変調がある場合に、被験者が精神疾患の状態にあると評価することを特徴とする精神疾患の評価方法を提供する。

この評価方法においては、前記生体試料が血漿であることを好ましい態様としている。さらに、この評価方法においては、精神疾患は、例えば行動傷害を伴う疾患またはストレス性精神疾患である。

本出願はまた、精神疾患の原因因子をスクリーニングする方法であって、GNAT2遺伝子を正常に発現する細胞に候補因子を作用させ、GNAT2遺伝子の発現変調を生じさせる因子を目的因子として特定することを特徴とする精神疾患の原因因子スクリーニング方法を提供する。

本出願はさらに、精神疾患の治療薬成分をスクリーニングする方法であって、GNAT2遺伝子の発現変調を示す細胞に候補物質を作用させ、GNAT2遺伝子の発現変調を改善させる物質を目的物質として特定することを特徴とするスクリーニング方法を提供する。

なお、以上の評価方法およびスクリーニングする方法において、「GNAT2遺伝子の発現変調」とは、例えば、GNAT2遺伝子の発現制御系の不全または変調（例えば、転写因子の変異や転写因子量の不足等）、GNAT2遺伝子からのmRNAの転写不全、mRNAからGNAT2タンパク質の合成不全、あるいはGNAT2遺伝子の変異（１または複数個のヌクレオチドの欠失、付加、置換等）による不完全なタンパク質合成等を意味する。さらには、これらのGNAT2遺伝子の発現変調によって、生体試料中のGNAT2タンパク質量が、健常者のそれと比較して90％以下、詳しくは70％以下、さらに詳しくは50％以下、特に詳しくは30％以下、最も詳しくは10％以下まで低下していることを意味する。

また、前記の発明におけるその他の用語や概念は、発明の実施形態の説明や実施例において詳しく規定する。なお、用語は基本的にはIUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclatureによるものであり、あるいは当該分野において慣用的に使用される用語の意味に基づくものである。また発明を実施するために使用する様々な技術は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能である。例えば、遺伝子工学および分子生物学的技術はJ. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd edition)", Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989); D. M. Glover et al. ed., "DNA Cloning", 2nd ed., Vol. 1 to 4, (The Practical Approach Series), IRL Press, Oxford University Press (1995); Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y, 1995；日本生化学会編、「続生化学実験講座１、遺伝子研究法II」、東京化学同人 (1986);日本生化学会編、「新生化学実験講座２、核酸 III（組換えDNA技術）」、東京化学同人 (1992); R. Wu ed., "Methods in Enzymology", Vol. 68 (Recombinant DNA), Academic Press, New York (1980); R. Wu et al. ed., "Methods in Enzymology", Vol. 100 (Recombinant DNA, Part B) & 101 (Recombinant DNA, Part C), Academic Press, New York (1983); R. Wu et al. ed., "Methods in Enzymology", Vol. 153 (Recombinant DNA, Part D), 154 (Recombinant DNA, Part E) & 155 (Recombinant DNA, Part F), Academic Press, New York (1987)などに記載の方法あるいはそこで引用された文献記載の方法またはそれらと実質的に同様な方法や改変法により行うことができる。

本発明によれば、被験者から単離した生体試料（例えば、血漿）を対象として、そのGNAT2遺伝子の発現変調を確認することによって、被験者が精神疾患の状態にあるか否かを簡便にかつ正確に評価することが可能となる。これによって、精神疾患の状態にある被験者に対して適切かつ有効な治療法等を選択することが可能となる。

また本発明によれば、GNAT2遺伝子の発現変調を指標として、精神疾患の原因因子が特定される。これによって特定された原因因子は、精神疾患の予防や症状の進行を抑制するための処置を効果的に行うことを可能とする。

さらに本願発明によれば、精神疾患の治療薬成分が特定され、精神疾患の有効な治療薬の開発に大きく貢献する。

本発明の精神疾患評価方法は、被験者から単離した生体試料（例えば、血漿）を対象として、そのGNAT2遺伝子の発現変調を確認することによって、被験者が精神疾患の状態にあるか否かを評価する。なお、生体試料（例えば、血漿）におけるGNAT2遺伝子の発現は、通常の血液検査技術を有する者であれば容易に実施可能であり、またその発現についての判定も、医療従事者の関与を必要としない。

GNAT2遺伝子の発現変調は、具体的には、GNAT2遺伝子の転写産物を測定することによって判定するができる。GNAT2遺伝子の転写産物としてmRNAを測定する場合には、公知の遺伝子工学および分子生物学的技術に従い、当該分野で特定の遺伝子の発現を検知測定するために知られた手法、例えばin situ ハイブリダイゼーション、ノーザンブロッティング、ドットブロット、RNaseプロテクションアッセイ、RT-PCR、Real-Time PCR（Journal of Molecular Endocrinology, 25, 169-193(2000)およびそこで引用されている文献）、DNA アレイ解析法（Mark Shena編、"Microarray Biochip Technology", Eaton Publishing, 2000）などによってKLF5 mRNA発現量を検知・測定して実施することができる。

例えば、オリゴヌクレオチドプローブを用いてGNAT2遺伝子のmRNA量を検出する方法（ノーザンブロット分析法の場合には、少なくとも以下の工程：
(a)被験者の生体試料よりRNAを調製する工程；
(b)工程(a)で調製されたRNAを電気泳動分離する工程；
(c)工程(b)で分離されたRNAをオリゴヌクレオチドプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする工程；
(d)工程(e)でRNAにハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドプローブの標識量をGNAT2 mRNA発現量の指標とし、正常生体試料の結果と比較する工程；および
(e)正常生体試料と比較して低いGNAT2 mRNA発現量を、精神疾患を示す指標として使用する工程、
を含むことを特徴とする。

オリゴヌクレオチドプローブは、GNAT2 mRNAとストリンジェントな条件（例えば特表平10-508186号公報、特表平9-511236号公報に記載された条件）でハイブリダイズするため、mRNAの任意領域と正確に相補的な配列からなるDNA配列を用いる。このようなDNA配列は、例えばGNAT2 cDNAを適当な制限酵素で切断することによっても得ることができる。あるいは、Carruthers（1982）Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 47:411-418; Adams（1983）J. Am. Chem. Soc. 105:661; Belousov（1997）Nucleic Acid Res. 25:3440-3444; Frenkel（1995）Free Radic. Biol. Med. 19:373-380; Blommers（1994）Biochemistry 33:7886-7896; Narang（1979）Meth. Enzymol. 68:90; Brown（1979）Meth. Enzymol. 68:109; Beaucage（1981）Tetra. Lett. 22:1859; 米国特許第4,458,066号に記載されているような周知の化学合成技術により、in vitroにおいて合成することができる。

また、オリゴヌクレオチドプローブはラジオアイソトープ（RI）法または非RI法によって標識するが、非RI法を用いることが好ましい。非RI法としては、蛍光標識法、ビオチン標識法、化学発光法等が挙げられるが、蛍光標識法を用いることが好ましい。蛍光物質としては、オリゴヌクレオチドの塩基部分と結合できるものを適宜に選択して用いることができるが、シアニン色素（例えば、Cy Dye ^TMシリーズのCy3、Cy5等）、ローダミン6G試薬、N-アセトキシ-N²-アセチルアミノフルオレン（AAF）、AAIF（AAFのヨウ素誘導体）などを使用することができる。また標識法としては、当該分野で知られた方法（例えばランダムプライム法、ニック・トランスレーション法、PCRによるDNAの増幅、ラベリング／テイリング法、in vitro transcription法等）を適宜選択して使用できる。例えば、HRFオリゴヌクレオチドに官能基（例えば、第一級脂肪族アミノ基、SH基など）を導入し、こうした官能基に前記の標識を結合して標識化オリゴヌクレオチドプローブを作成することができる。

また、DNAマイクロアレイを使用することによってもGNAT2 mRNA量を測定することができる。この方法は、少なくとも以下の工程：
(a)被験者の生体試料よりRNAを調製する工程；
(b)工程(a)で調製したRNAから、標識cDNAを調製する工程、
(c)工程(b)で調製した標識cDNAをDNAマイクロアレイに接触させる工程；
(d)工程(c)でDNAマイクロアレイのキャプチャープローブにハイブリダイズした標識cDNAの標識量をGNAT2 mRNA量の指標とし、正常生体試料の結果と比較する工程；および
(e)正常生体試料と比較して低いGNAT2 mRNA量を、精神疾患の指標として使用する工程、
を含むことを特徴とする。

マイクロアレイを使用してGNAT2 mRNA量を測定する場合には、例えば被験者の生体試料から単離したmRNAを鋳型としてcDNAを合成し、PCR増幅する。その際に、標識dNTPを取り込ませて標識cDNAとする。この標識cDNAをマクロアレイに接触させ、マイクロアレイのキャプチャープローブにハイブリダイズしたcDNAを検出する。ハイブリダイゼーションは、96穴もしくは384穴プラスチックプレートに分注して標識cDNA水性液を、マイクロアレイ上に点着することによって実施することができる。点着の量は、1〜100nl程度とすることができる。ハイブリダイゼーションは、室温〜70℃の温度範囲で、6〜20時間の範囲で実施することが好ましい。ハイブリダイゼーション終了後、界面活性剤と緩衝液との混合溶液を用いて洗浄を行い、未反応の標識cDNAを除去する。界面活性剤としては、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）を用いることが好ましい。緩衝液としては、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液等を用いることができるが、クエン酸緩衝液を用いることが好ましい。

またさらに、GNAT2 mRNA量はRT-PCT法によっても測定することができる。この方法は、少なくとも以下の工程：
(a)被験者の生体試料よりRNAを調製する工程；
(b)工程(a)で調製したRNAを鋳型とし、プライマーセットを用いてcDNAを合成する工程；
(c)工程(b)で合成されたcDNA量をGNAT2 mRNA量の指標とし、正常生体試料の結果と比較する工程；および
(d)正常生体試料と比較して低いGNAT2 mRNA量を、精神疾患を示す指標として使用する工程、
を含むことを特徴とする。

使用するプライマーセットは、公知のヒトGNAT2 cDNA配列（GenBank/NM_005272）に基づき設計し、公知の方法により合成・精製の各工程を経て調製することができる。また、プライマーの設計には、プライマー設計用の市販のソフトウェア、例えばOligoTM［National Bioscience Inc.（米国）製］、GENETYX［ソフトウェア開発（株）（日本）製］等を用いることもできる。

GNAT2遺伝子の発現変調を判定するための別の方法は、GNAT2遺伝子の転写産物としてGNAT2タンパク質量を定量することである。このようなタンパク質の定量は、公知の遺伝子工学および分子生物学的技術に従い、当該分野で特定のタンパク質量を検知測定するために知られた手法、例えばin situ ハイブリダイゼーション、ウェスタンブロッティング、各種の免疫組織学的方法などによって実施することができる。

具体的には、GNAT2タンパク質を特異的に認識する抗体を用いて実施することができる。抗体はポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であり、それぞれGNAT2タンパク質のエピトープに結合することができる全体分子、およびFab、F(ab')₂、Fv断片等が全て含まれる。このような抗体は、例えばポリクローナル抗体の場合には、タンパク質やその一部断片を免疫原として動物を免役した後、血清から得ることができる。あるいは、GNAT2遺伝子を組込んだ真核細胞用発現ベクターを注射や遺伝子銃によって、動物の筋肉や皮膚に導入した後、血清を採取することによって作製することができる。動物としては、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ニワトリなどが用いられる。

また、モノクローナル抗体は、公知のモノクローナル抗体作製法（「単クローン抗体」、長宗香明、寺田弘共著、廣川書店、1990年； "Monoclonal Antibody" James W. Goding, third edition, Academic Press, 1996）に従い作製することができる。

こららの抗体は、標識物質によって標識化して使用する。標識物質は、酵素、放射性同位体または蛍光色素を使用することができる。酵素は、turnover numberが大であること、抗体と結合させても安定であること、基質を特異的に着色させる等の条件を満たすものであれば特段の制限はなく、通常のEIAに用いられる酵素、例えば、ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、グルコース−６−リン酸化脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素等を用いることもできる。また、酵素阻害物質や補酵素等を用いることもできる。これら酵素と抗体との結合は、マレイミド化合物等の架橋剤を用いる公知の方法によって行うことができる。基質としては、使用する酵素の種類に応じて公知の物質を使用することができる。例えば酵素としてペルオキシダーゼを使用する場合には、3,3',5,5'−テトラメチルベンジシンを、また酵素としてアルカリフォスファターゼを用いる場合には、パラニトロフェノール等を用いることができる。放射性同位体としては、¹²⁵Ｉや³Ｈ等の通常のRIAで用いられているものを使用することができる。蛍光色素としては、フルオレッセンスイソチオシアネート（FITC）やテトラメチルローダミンイソチオシアネート（TRITC）等の通常の蛍光抗体法に用いられるものを使用することができる。

このような抗体を使用する方法は、例えば免疫染色、例えば組織あるいは細胞染色、免疫電子顕微鏡、イムノアッセイ、例えば競合型イムノアッセイまたは非競合型イムノアッセイで行うことができ、放射免疫測定法（RIA）、蛍光免疫測定法（FIA）、ルミネッセント免疫測定法（LIA）、酵素免疫測定法（EIA）、ELISAなどを用いることができ、B-F分離を行ってもよいし、あるいは行わないでその測定を行うことができる。好ましくはRIA、EIA、FIA、LIAであり、さらにサンドイッチ型アッセイが挙げられる。サンドイッチ型アッセイには、同時サンドイッチ型アッセイ、フォワード（forward）サンドイッチ型アッセイあるいは逆サンドイッチ型アッセイなどであってもよい。

このような抗体を用いた診断方法における一つの態様は、抗体とGNAT2タンパク質との結合を液相系において検出する方法である。例えば、標識化抗体と生体試料（例えば血漿）とを接触させて標識化抗体とGNAT2タンパク質を結合させ、この結合体を分離する。分離は、公知の分離手段（クロマト法、固相法等）によって行うことができる。また公知のウエスタンブロット法に準じた方法を採用することもできる。標識シグナルの測定は、標識として酵素を用いる場合には、酵素作用によって分解して発色する基質を加え、基質の分解量を光学的に測定することによって酵素活性を求め、これを結合抗体量に換算し、標準値との比較から抗体量が算出される。放射生同位体を用いる場合には、放射性同位体の発する放射線量をシンチレーションカウンター等により測定する。また、蛍光色素を用いる場合には、蛍光顕微鏡を組み合わせた測定装置によって蛍光量を測定すればよい。

液相系での診断の別の方法は、一次抗体と生体試料（例えば、血漿）とを接触させて一次抗体とGNAT2タンパク質を結合させ、この結合体に標識化二次抗体を結合させ、この三者の結合体における標識シグナルを検出する。あるいは、さらにシグナルを増強させるためには、非標識の二次抗体を先ず一次抗体＋GNAT2タンパク質結合体に結合させ、この二次抗体に標識物質を結合させるようにしてもよい。このような二次抗体への標識物質の結合は、例えば二次抗体をビオチン化し、標識物質をアビジン化しておくことによって行うことができる。あるいは、二次抗体の一部領域（例えば、Fc領域）を認識する抗体（三次抗体）を標識し、この三次抗体を二次抗体に結合させるようにしてもよい。なお、一次抗体と二次抗体は、両方ともモノクローナル抗体を用いることもでき、あるいは、一次抗体と二次抗体のいずれか一方をポリクローナル抗体とすることもできる。液相からの結合体の分離やシグナルの検出は前記と同様とすることができる。

抗体を用いる場合のさらに別の態様は、抗体とGNAT2タンパク質との結合を固相系において試験する方法である。この固相系における方法は、極微量のGNAT2タンパク質の検出と操作の簡便化のため好ましい方法である。すなわちこの固相系の方法は、抗体を樹脂プレートまたはメンブレン等に固定化し、この固定化抗体に被験者の血漿を接触させ、非結合タンパク質を洗浄除去した後、プレート上に残った抗体＋GNAT2タンパク質結合体に標識化抗抗体を結合させて、この標識化抗体のシグナルを検出する方法である。この方法は、いわゆる「サンドイッチ法」と呼ばれる方法であり、マーカーとして酵素を用いる場合には、「ELISA（enzyme linked immunosorbent assay）」として広く用いられている方法である。2種類の抗体は、両方ともモノクローナル抗体を用いることもでき、あるいは、いずれか一方をポリクローナル抗体とすることもできる。

なお本発明の評価方法においては、以上に例示した各方法の２以上を組み合わせて行うことによって、より精度の高い診断方法とすることもできる。

次に、本発明の精神疾患の原因因子スクリーニング方法は、GNAT2遺伝子を正常に発現する細胞に候補因子を作用させ、GNAT2遺伝子の発現変調を生じさせる因子を精神疾患の原因因子として特定する。

この方法において、「GNAT2遺伝子を正常に発現する細胞」とは、例えば、正常動物（ラット、マウス、ウサギ、ネコ、イヌ、ブタ等の実験用動物）の体内に存在する細胞、あるいはこれらの動物から単離して培養条件化に維持された細胞である。好ましくは、動物の脳組織（大脳皮質、線状体、中脳など）の細胞を対象とする。

また、「候補因子」としては、精神疾患の原因因子として想定される薬剤や化合物、飲食用の素材、各種のストレス（例えば、強制的な体温変化、自立的な運動の制限や強制運動、自立的な危険回避および逃避行動の制限、あるいは生活環境の変化など）である。また、飲食用の素材やストレスを候補因子とする場合は、動物個体を対象として、その細胞あるいは動物から単離した血漿におけるGNAT2遺伝子の発現変調を確認することによって、精神疾患の原因因子を特定することができる。GNAT2遺伝子の発現変調は、前記の評価方法において採用する手段と同一とすることができる。

本発明の精神疾患の薬剤成分スクリーニング方法は、GNAT2遺伝子の発現変調を示す細胞に候補物質を作用させ、GNAT2遺伝子の発現変調を改善させる物質を目的物質として特定する。

このスクリーニング方法における「GNAT2遺伝子の発現変調を示す細胞」とは、例えば、実施例に示したような多動性障害モデルラット（特許文献１６）、拘束負荷動物、水浸負荷動物などの脳（大脳皮質、線状体、中脳など）の細胞、あるいは前記の精神疾患の原因因子スクリーニング方法で特定された原因因子によって処理された動物の細胞などである。これらの細胞は、動物個体内に存在する状態で候補物質を作用させてもよく、あるいは動物個体から単離した状態で候補物質を作用させてもよい。動物個体内の細胞に候補物質を作用させる場合には、動物に候補物質を注射するか、あるいは摂取させる。培養条件下の細胞に候補物質を作用させる場合には、細胞の培地に候補物質を添加するなどの方法を採用することができる。

このスクリーニング方法に使用する候補物質には、例えば、有機または無機の化合物（特に低分子量の化合物）、タンパク質、ペプチド等が含まれる。これらの物質は、機能や構造が公知のものであって未知のものであってもよい。あるいは「コンビナトリアルケミカルライブラリー」は、目的物質を効率的に特定するための候補物質群として有効な手段である。コンビナトリアルケミカルライブラリーは、化学合成または生物学的合成により、試薬などの多くの化学的「ビルディングブロック」を結びつけることにより生成される種々の化学組成物のコレクションである。例えば、ペプチドライブラリーなどの直線的なコンビナトリアルケミカルライブラリーは、ビルディングブロック（アミノ酸）のセットを、所与の化合物の長さ（すなわちペプチドのサイズ）について可能なすべての方法で結びつけることにより形成される。化学的なビルディングブロックについてのこのようなコンビナトリアルミキシングを通して、多数の化学組成物を合成することが可能である。例えば、100の可換的な化学的ビルディングブロックについての系統的なコンビナトリアルミキシングは、結果として１億個の4量体化合物または100億個の5量体化合物を生じる（例えば、Gallop et al.,（1994）37（9）:1233-1250参照）。コンビナトリアルケミカルライブラリーの調製およびスクリーニングは、当該技術分野において周知である（例えば、米国特許第6,004,617号；5,985,365号を参照）。また各種の市販ライブラリーを使用することもできる。

以下、実施例として、精神疾患とGNAT2遺伝子の発現との関係を確認した実験データを示して本発明の実施可能性等を説明するが、本発明は以下の例に限定されるものではない。

多動性障害モデルラットの脳と正常ラットの脳でのGNAT2遺伝子発現量の比較
4週齢の多動性障害モデルラット各3個体から摘出した大脳皮質、線条体、中脳の各サンプル（北海道大学実験生物センターから入手）、多動性障害病態を示さない4週齢のWKAHラット各3個体から摘出した大脳皮質、線条体、中脳の各サンプルからそれぞれtotal RNAを抽出し、DNAマイクロアレイ解析による遺伝子発現解析を行った。

3個体分の大脳皮質を合わせ、液体窒素中で粉末化し、約100mgほどをtotal RNA抽出用に分けた。線条体および中脳も同様に行った。

total RNAの調製は、RNeasy Mini kit（Qiagen社製）を用いて付属のプロトコールに従って行った。抽出したtotal RNAはゲル電気泳動や吸光度測定でDNAマイクロアレイ解析に用いられる品質であるかどうかを確認した。DNAマイクロアレイ解析には大脳皮質、線条体、中脳の各サンプルから抽出したtotal RNAを各150ngずつ混合して解析に供し、多動性障害モデルラットと正常ラットの比較を行った。

DNAマイクロアレイ解析は、ラベリング、ハイブリダイズ、スキャンの３つの作業に分けられる。まず、前述のtotal RNA 450ng（大脳皮質、線条体、中脳の各サンプルから抽出したtotal RNAを各150ngずつ混合）からLow RNA Input Linear Amp Kit（Agilent Technologiest社製）を用いcDNAを合成した。さらにcDNAからCy3-dCTP（PerkinElmer社製）を添加してラベル化cRNAを調整した。次にラベル化cRNAをフラグメント化し、フラグメント化したラベル化cRNAとチップ（Whole Rat Genome Oligo Microarray Kit G4131F、Agilent Technologiest社製）上のプローブとのハイブリダイズを行った。さらに、チップを洗浄し、マイクロアレイスキャナー(G2565BA、Agilent Technologiest社製）及びGeneSpring ver 7.3を使用した遺伝子発現解析を行った。蛍光ラベルとしてCy5-dCTPを用いた場合でも同様の方法でcRNAのラベリングを行った。

DNAマイクロアレイ解析から得られた多動性障害モデルラットと正常ラットの脳（大脳皮質、線条体、中脳）でのGNAT2遺伝子の発現量（Signal値）を図1に示す。正常ラットをCy3-dCTPでラベルし、多動性障害モデルラットをCy5-dCTP でラベルした場合のものと、反対に、正常ラットをCy5-dCTPでラベルし、多動性障害モデルラットをCy3-dCTP でラベルした場合のものの２つの結果を示している。どちらの蛍光ラベルを使用してもGNAT2遺伝子の発現量は、正常ラットにおける発現量よりも約10分の1にまで減少することが確認できた。

図１の結果からわかるように、GNAT2遺伝子は、正常なラットの脳より、多動性障害モデルラットの脳での発現が減少しているため、精神疾患に関するマーカー遺伝子として応用可能な遺伝子であると考えられた。

多動性障害モデルラットと正常ラットの大脳皮質、線条体、中脳でのGNAT2遺伝子発現量の比較
実験例１で抽出した大脳皮質、線条体、中脳の各total RNAを使用し、RT-PCR解析を行った。まず、total RNA各 1ngからAffinityScript QPCR cDNA Synthesis Kit（Stratagene社製）を用い大脳皮質、線条体、中脳それぞれのcDNAを合成した。

Gnat2遺伝子に対して特異的なプライマーを設計した。プライマーデザインは以下に示してある通りである。プライマー合成は北海道システムサイエンスに依頼した。
Gnat2-1
Forward Primer: 5’-acaagttctttgcggctacttc-3’（配列番号１）
Reverse Primer: 5’-agcattaaaagagcccacagtc-3’（配列番号２）
上記プライマーを用いて、大脳皮質、線条体、中脳の各cDNAを鋳型として、Ex Taq Hot Start Version (TaKaRa社製)を使用し、添付プロトコールに従いPCR反応を行った。PCR反応は27サイクル繰り返した。

PCR反応後、1.8%アガロースゲル電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色で目的遺伝子の検出をした。検出にはUVトランスイルミネーター(ATTO)を用い、遺伝子バンドの強度を測定した。

RT-PCR解析で得られた結果を図2に示す。各バンドの強度の数値からわかるように、Gnat2遺伝子は正常ラットでは中脳において発現が多く見られることがわかるが、多動性障害モデルラットの中脳においてはバンドが検出されないほど発現が減少していることがわかった。

図2の結果からわかるように、GNAT2遺伝子は、正常なラットの中脳より、多動性障害モデルラットの中脳での発現が減少しているため、精神疾患に関するマーカー遺伝子として応用可能な遺伝子であると考えられた。

GNAT2遺伝子の血漿中での発現解析
正常ラットより血液を採取し、遠心分離により血漿と血清にわけ、それぞれを-80℃に保存した。凍結血漿を溶解し、約500μlを新しいチューブに移し、SolutionD （5.5M Guanidium thiocyanate、25mM Sodium citrate、0.5% Lauryl sarcosine、0.1M 2-Mercaptoethanol）を500μl添加して混合した後、フェノール溶液 (Phenol : Chloroform : Isoamyl alcohol (25:24:1))を500μl添加してよく混合した。遠心分離により、上清を回収し、この上清に20μlの3M Sodium Acetate (pH5.5) を添加し、さらに500μlのTE飽和フェノールと100μlのクロロホルムを加え、良く混合した後に0℃で15分間放置した。遠心分離により、上清を回収し、この上清に等量の2-propanolを加え、良く混合した後に0℃で15分間放置し、遠心分離により沈殿を得た。この沈殿に100μlの滅菌水を加え、溶解した後にRNeasy Mini kit（Qiagen社製）を用いて、添付説明書に従いtotal RNAの精製を行った。

抽出したtotal RNAはゲル電気泳動や吸光度測定でRT-PCR解析に用いられる品質であるかどうかを確認した。

次に、total RNA各 1ngからAffinityScript QPCR cDNA Synthesis Kit（Stratagene社製）を用い血漿のcDNAを合成した。

Gnat2遺伝子に対して特異的なプライマーを設計した。プライマーデザインは以下に示してある通りである。プライマー合成は北海道システムサイエンスに依頼した。
Gnat2 - 1
Forward Primer: 5’-acaagttctttgcggctacttc-3’（配列番号１）
Reverse Primer: 5’-agcattaaaagagcccacagtc-3’（配列番号２）
Gnat2-2
Forward Primer: 5’-agttccttgacctcaacatga-3’（配列番号３）
Reverse Primer: 5’-gtgctggccacactactaacag-3’（配列番号４）
上記2組のプライマーを用いて、血漿cDNAを鋳型として、Ex Taq Hot Start Version (TaKaRa社製)を使用し、添付プロトコールに従いPCR反応を行った。PCR反応は38サイクル繰り返した。

PCR反応後、1.8%アガロースゲル電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色で目的遺伝子の検出をした。検出にはUVトランスイルミネーター(ATTO)を用い、遺伝子バンドの強度を測定した。

RT-PCR解析で得られた結果を図3に示す。Gnat2-1 primerは脳のcDNAの時に使用したプライマーだが、血漿のcDNAを鋳型としたRT-PCR解析では目的のDNAバンドが検出できなかった。しかし、プライマーデザインを変更し検討したところ、Gnat2-2 primerのプライマーであれば、Gnat2遺伝子は血漿中でも検出できることがわかった。

図3の結果からわかるように、GNAT2遺伝子は、採取が簡単な血漿においても検出できることがわかったことから、精神疾患に関するマーカー遺伝子として応用可能な遺伝子であると考えられた。

拘束ストレス負荷ラット脳とストレスのないラットの脳でのGNAT2遺伝子発現量の比較
9週齢のWisterラット5匹を用い、拘束ストレス負荷実験を行った。金属製拘束ケージにラットを拘束し、水および餌を与えない状態で16時間放置した。ストレスのない条件（コントロール）のラット5匹には通常通り水および餌を与えた。

拘束ストレス負荷の各3個体のラットから摘出した脳、ストレスのない各3個体のラットから摘出した脳サンプルからそれぞれtotal RNAを抽出し、DNAマイクロアレイ解析による遺伝子発現解析を行った。

3個体分の脳を合わせ、液体窒素中で粉末化し、約100mgほどをtotal RNA抽出用に分けた。

total RNAの調製は、RNeasy Mini kit（Qiagen社製）を用いて付属のプロトコールに従って行った。抽出したtotal RNAはゲル電気泳動や吸光度測定でDNAマイクロアレイ解析に用いられる品質であるかどうかを確認した。 DNAマイクロアレイ解析には脳サンプルから抽出したtotal RNA 400ngを解析に供し、拘束ストレス負荷ラットとストレスのないラットの比較を行った。

DNAマイクロアレイ解析は、実施例１と同様の手続で行った。

DNAマイクロアレイ解析から得られた拘束ストレス負荷ラットとストレスのないラットの脳でのGNAT2遺伝子の発現量（Signal値）を図4に示す。ストレスのないラットをCy3-dCTPでラベルし、拘束ストレス負荷ラットをCy5-dCTP でラベルした場合のものと、反対に、ストレスのないラットをCy5-dCTPでラベルし、拘束ストレス負荷ラットをCy3-dCTP でラベルした場合のものの２つの結果を示している。どちらの蛍光ラベルを使用してもGNAT2遺伝子の発現量は、拘束ストレスにおける発現量よりも約1.3から2倍にまで増加することが確認できた。

図4の結果からわかるように、GNAT2遺伝子は、ストレスのないラットの脳より、拘束ストレス負荷ラットの脳での発現が増加しているため、精神疾患に関するマーカー遺伝子として応用可能な遺伝子であると考えられた。

水浸ストレス負荷ラットの脳とストレスのないラットの脳でのGNAT2遺伝子発現量の比較
9週齢のWisterラット5匹を用い、水浸ストレス負荷実験を行った。ストレスのない状態（コントロール）は飼育繁殖ケージに木屑の床敷を使用して飼育するが、水浸ストレスを負荷の場合は、木屑の床敷をなくして底から約 2cmの高さになるまで水を入れ、この状態で24時間放置した。

水浸ストレス負荷の各3個体のラットから摘出した脳、ストレスのない各3個体のラットから摘出した脳サンプルからそれぞれtotal RNAを抽出し、DNAマイクロアレイ解析による遺伝子発現解析を行った。

3個体分の脳を合わせ、液体窒素中で粉末化し、約100mgほどをtotal RNA抽出用に分けた。total RNA調整は、実施例４に記載の方法で行った。DNAマイクロアレイ解析は、実施例１に記載の通りに行った。

DNAマイクロアレイ解析から得られた水浸ストレス負荷ラットとストレスのないラットの脳でのGNAT2遺伝子の発現量（Signal値）を図5に示す。ストレスのないラットをCy3-dCTPでラベルし、水浸ストレス負荷ラットをCy5-dCTP でラベルした場合のものと、反対に、ストレスのないラットをCy5-dCTPでラベルし、水浸ストレス負荷ラットをCy3-dCTP でラベルした場合のものの２つの結果を示している。どちらの蛍光ラベルを使用してもGNAT2遺伝子の発現量は、水浸ストレスにおける発現量よりも約5から7倍にまで増加することが確認できた。

図5の結果からわかるように、GNAT2遺伝子は、ストレスのないラットの脳より、水浸ストレス負荷ラットの脳での発現が増加しているため、精神疾患に関するマーカー遺伝子として応用可能な遺伝子であると考えられた。

ラット脳由来GNAT2遺伝子の大腸菌での大量発現および発現タンパク質の同定
（1）発現ベクターの構築
実施例2で作成した正常ラットの中脳のcDNAを鋳型として以下に示すプライマーを使用してPCR反応で得たGnat2 cDNA断片をNcoIおよびHindIIIの制限酵素処理してから、pET28bベクター（Novagen社製）のNcoI、HindIIIサイトに挿入して発現ベクター（Gnat2-15/pET28b）を構築した。発現ベクター（Gnat2-15/pET28b）のGnat2 cDNA断片の全塩基配列はシークエンス解析により確認した。
Gnat2-FNcoI
Forward Primer: 5’-gaggggacagcagccatggggagtggcatc-3’（配列番号５）
Gnat2-RHindIII
Reverse Primer: 5’-gaagcctcggattctaagcttgcttataaa-3’（配列番号６）
発現ベクター（Gnat2-15/pET28b）を発現用宿主菌BL21(DE3)（Invitrogen社製）に形質転換し、カナマイシン添加LB培地で37℃の温度で前培養した。前培養液の濁度（OD660）が0.6になったら、3mlを新たなカナマイシン添加LB培地100mlに接種した。これを2本用意し、大量発現用のものにはIPTGを終濃度1mMになるように添加した。37℃振とう培養を行い、培養開始から1、2、3時間でサンプリングし、遠心分離により菌体を集菌した後にSDS-PAGE解析を行った。
（2）SDS-PAGE解析
菌体にLBTT buffer (7M Urea、2M Thiourea、4% CHAPS、18mM Tris-HCl (pH8.0)、14mM Trizma Base、EDTA-free proteinase Inhibitor (2tablets/100ml)、0.2% Triton X-100、50mM DTT)を添加し、溶解させタンパク質濃度をCoomassie Plus Protein Assay （PIERCE社製）を用いて測定した。各サンプルのタンパク質濃度を等量に合わせ、さらにSDS-Sample bufferを2.5倍量加えてよく混合した後に、ポリアクリルアミド・プレキャストゲルePAGEL 12% (ATTO社製)でタンパク質を分離した。電気泳動後、染色液（エタノール：酢酸：水＝9：2：9＋0.25% CBB R-250）でタンパク質を染色した。その後、脱色液（エタノール：酢酸：水＝5：2：13）で余分な染色液を除去した。

図6にラット脳由来GNAT2遺伝子の大腸菌での大量発現の結果を示した。Gnat2タンパク質の予想サイズは矢印で示した。図6からもわかるように、IPTGで発現を誘導した場合、特に37℃、3時間（IPTG添加）の試験区において、タンパク質の大量発現が認められた。
（3）Gnat2タンパク質の精製
大量発現させた大腸菌からGnat2タンパク質をHis-GraviTrap（GE Healthcare社製）を用いて精製した。精製は添付資料に従って行った。精製画分からSDS-PAGE解析により目的のバンドを回収し、MS解析のための以下に示すトリプシン酵素処理を行った。
（4）In-gel digestion法
MS解析のためのトリプシン酵素処理は文献（Hirano, M., et al., Jounal of Proteome Research 2007, 6, 2656-2668）で示しているIn-gel digestion法と同様に行った。
（5）MS解析
MS解析は文献（Hirano, M., et al., Jounal of Proteome Research 2007, 6, 2656-2668）に記載されている方法と同様に行い、タンパク質を同定した。結果は図７に示したとおりである。

DNAマイクロアレイ解析から得られた多動性障害モデルラットと正常ラットの脳（大脳皮質、線条体、中脳）でのGNAT2遺伝子の発現量（Signal値）を示したものである。 RT-PCR解析による多動性障害モデルラットと正常ラットの大脳皮質、線条体、中脳でのGNAT2遺伝子発現を示したものである。 RT-PCR解析による血漿中のGNAT2遺伝子発現を示したものである。 DNAマイクロアレイ解析から得られた拘束ストレス負荷ラットとストレスのないラットの脳でのGNAT2遺伝子の発現量（Signal値）を示したものである。 DNAマイクロアレイ解析から得られた水浸ストレス負荷ラットとストレスのないラットの脳でのGNAT2遺伝子の発現量（Signal値）を示したものである。 ラット脳由来GNAT2遺伝子の大腸菌での大量発現を示したものである。 MS解析の結果である。太字下線が一致したアミノ酸を示す。

Claims (5)

1. 被験者から単離した生体試料におけるGNAT2遺伝子の発現を測定し、この遺伝子発現に変調がある場合に、被験者が精神疾患の状態にあると評価することを特徴とする精神疾患の評価方法。
2. 生体試料が、血漿である請求項１の評価方法。
3. 精神疾患が、行動傷害を伴う疾患またはストレス性精神疾患である請求項１の評価方法。
4. 精神疾患の原因因子をスクリーニングする方法であって、GNAT2遺伝子を正常に発現する細胞に候補因子を作用させ、GNAT2遺伝子の発現変調を生じさせる因子を目的因子として特定することを特徴とする精神疾患の原因因子スクリーニング方法。
5. 精神疾患の治療薬成分をスクリーニングする方法であって、GNAT2遺伝子の発現変調を示す細胞に候補物質を作用させ、GNAT2遺伝子の発現変調を改善させる物質を目的物質として特定することを特徴とするスクリーニング方法。