JP2009232858A - 植物体内のグリカンプロセシングの最適化 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】本発明は、N-グリカンをもつ糖タンパク質を含む細胞または生体組織特に植物のグリカンプロセシングを最適化し、もって複合型の2本鎖N-グリカンをもち、また少なくとも1本のアーム上にガラクトース残基を含み、かつキシロースおよびフコース残基を欠く(または少なくした)糖タンパク質が得られるようにする方法に関する。本発明はさらに、得られる糖タンパク質、および特に該タンパク質を含む植物宿主系に関する。
【選択図】なし
Description
本発明は、N-グリカンをもつ糖タンパク質を含む細胞または生体組織特に植物のグリカンプロセシングを最適化し、もって2本鎖N-グリカンを非限定的な例とする・また少なくとも1本のアーム上にガラクトース残基を含む・N-グリカン(高マンノース型、混成型または好ましくは複合型N-グリカン)をもち、かつキシロースおよびフコース残基を欠く(または少なくした)糖タンパク質が得られるようにする方法に関する。本発明はさらに、得られる糖タンパク質、および特に該タンパク質を含む植物宿主系に関する。
N-結合グリカン(すなわち糖タンパク質のアスパラギン残基に結合した特有の多糖構造)は該タンパク質の性質に、ひいては生物の性質に、大きく寄与しうる。植物タンパク質はN-結合グリカンをもちうるが、哺乳動物の場合とはきわめて対照的に、その寄与を受けている生物学的過程は少ししかわかっていない。
以下、本発明の理解の一助として、本明細書で使用する多数の用語の意味を明確にする。
NH2-XXXXXXHHHHHHHHSSSSSSSSCCCCCCCC
最後に、特定のハイブリッドを指すときに(たとえばTmXyl-のように)指標「Tm」を使用することで、全膜貫通/CTSドメインとその部分が(どちらについても野生型配列への変化の有無を問わず)包摂されるものとする。
本発明はハイブリッド酵素(または「融合タンパク質」)をコードする(DNAまたはRNAの)核酸、そうした核酸を含むベクター、そうしたベクターを含み該ハイブリッド酵素を発現する(植物組織および全植物中の細胞を非限定的に含む)宿主細胞、および該ハイブリッド酵素自体の単離体を見込む。一実施態様では、該ハイブリッド酵素(または「融合タンパク質」)の発現は、所期のグリコフォームの集積を妨げるキシロース、フコース、LewisA/B/Xまたは他の糖鎖構造などのような糖鎖の減少を非限定的に含む糖化の変化を招く。一実施態様では、本発明はハイブリッド酵素をコードする核酸を見込むが、該ハイブリッド酵素は(植物糖転移酵素を非限定的に含む)糖転移酵素のCTS領域(またはその一部分)と非植物(たとえば哺乳動物、魚類、両生類、および菌類)糖転移酵素の触媒領域(またはその一部分)とを含む。CTS領域(またはその一部分)は発現時には触媒領域(またはその一部分)に(作動可能な組合せとして)(直接または間接に)連結されているのが好ましい。該連結は共有結合であるのが好ましく、また該組合せは触媒領域が触媒機能を示すという意味で(たとえその触媒機能が野生型酵素と比較して低下しているとはいえ)作動可能である。該連結が直接的なのは介在するアミノ酸または他領域/ドメインが存在しない場合である。他方、介在するアミノ酸(または他化学基)および/または領域/ドメインが存在する場合には間接的な連結となる。もちろん前記ハイブリッド酵素をコードする核酸の作製に使用する核酸は物理的な配列(たとえばゲノムDNA、cDNAなど)から酵素的に獲得することができるし、また遺伝子配列情報(電子またはハードコピー配列情報など)を手引きとして使用して合成することもできる。
「植物宿主系」は植物またはその一部分を非限定的に含むが、植物の一部分は植物細胞、植物器官および/または植物組織を非限定的に含む。植物は胚に1枚の子葉をもつ単子葉の顕花植物でもよい。その非限定的な例はユリ、牧草・芝、トウモロコシ(Zea mays)、コメ、穀物(オーツ、コムギ、オオムギなど)、ラン、アヤメ類、オニオン、ヤシなどである。植物はまたタバコ(Nicotiana)、トマト、ジャガイモ、豆類(アルファルファ、ダイズなど)、バラ、ヒナギク、サボテン、スミレ、ウキクサなどを非限定的に含む双子葉植物でもよいし、Physcomitrella patensを非限定的に含むコケでもよい。
ハイブリッド酵素
マンノシダーゼ、GlcNAcTs、ガラクトシル転移酵素など種々の糖化酵素をコードする核酸配列は、ポリメラーゼ連鎖反応法(PCR)または発現ライブラリーのスクリーニングによる共通の構造的特徴をもつクローン化DNA断片の検出などのような技術上周知の組換えDNA法を用いて獲得することができる。たとえばInnis et al., 1990, PCR: A Guide to Methods and Application, Academic Press, New Yorkなどを参照。リガーゼ連鎖反応(LCR)、ligated activated transcription(LAT)、nucleic acid sequence-based amplification (NASBA)またはロングレンジPCRなど他の核酸増幅法を使用してもよい。
タンパク質特に酵素たとえばER中に残留するガラクトシル転移酵素、マンノシダーゼおよびN-アセチルグルコサミン転移酵素などをコードする核酸配列は、膜貫通断片をコードする配列を除去してメチオニン(翻訳開始)コドンに取り替え、またガラクトシル転移酵素の最後のコドンと終止コドンの間にER残留シグナルをコードする核酸配列たとえばKDEL(アミノ酸残基配列: リジン-アスパラギン酸-グルタミン酸-ロイシン)をコードする配列などを挿入する[Rothman, Cell 50:521 (1987)]。
前述のように、「の少なくとも一部分」または「の断片」という言い回しは、タンパク質またはペプチドがその天然または本来の機能を維持するうえでの必要最小限のアミノ酸配列をいう。たとえば酵素の機能は酵素的または触媒的な機能、タンパク質をゴルジ装置内に固定する能力、またはシグナルペプチドとしての機能をいう。従って「膜貫通ドメインの少なくとも一部分」または「膜貫通ドメインの断片」という言い回しはそれぞれ、より大きな膜貫通ドメインのうちの、天然の膜貫通ドメイン機能を少なくとも部分的に保持する(たとえば該機能が低下してもなお明白である)ような最小アミノ酸配列をいう。別の例として、「触媒領域の少なくとも一部分」または「触媒領域の断片」という言い回しはそれぞれ、より大きな触媒領域のうち、天然の触媒機能を少なくとも部分的に保持する(たとえば該機能が低下してもなお明白である)ような最小アミノ酸配列をいう。本明細書で述べるように、あるタンパク質またはペプチドが天然タンパク質またはペプチドの機能を少なくとも部分的に保持する上での必要最小限のアミノ酸配列は当業者には自明であろう。
ハイブリッドまたは組換え酵素または他の異種タンパク質たとえば異種糖タンパク質をコードする核酸は本発明のある種の実施態様に従って適正な発現ベクターに挿入することができるが、そうした適正な発現ベクターは被挿入コード配列の転写・翻訳に必要な因子を収めたベクターまたはRNAウイルスベクターの場合には必要な複製・翻訳因子ならびに選択マーカーを収めたベクターである。そうした因子の非限定的な例はプロモーター領域、シグナル配列、5’末端非翻訳配列、開始コドン(構造遺伝子がそれを備えているかどうかによる)、および転写・翻訳終結配列などである。こうしたベクターを獲得する方法は技術上周知である(国際公開第WO 01/29242号明細書を参照)。
本発明は特に、前記ハイブリッド酵素の安定発現と一過性発現の両方を見込む。多種多様な高等植物種を形質転換して発現カセットの一過性発現を実現させる手法は技術上周知である[たとえばWeising et al., Ann. Rev. Genet. 22:421-477 (1988)を参照]。種々のシステムには被導入核酸の種類(DNA、RNA、プラスミド、ウイルス)、形質転換される組織の種類、遺伝子導入の手段、および形質転換条件といった変数がある。たとえば核酸コンストラクトはエレクトロポレーション、PEGポレーション、パーティクルガン、ケイ素繊維デリバリー、植物細胞原形質または不定胚形成カルスまたは他植物組織のマイクロインジェクション、あるいはアグロバクテリア媒介型の形質転換を用いて植物細胞に直接導入してもよい[Hiei et al., Plant J. 6:271-282 (1994)]。形質転換効率は変化しやすいので、しばしば内部標準(たとえば35S-Luc)を使用して形質転換効率を標準化する。
以前に開示したPCR法に基づく兄弟株選別法[Bakker et al., BBRC 261:829 (1999)]によりcDNAライブラリーからβ1,2-キシロシル転移酵素をコードするシロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana) cDNAを単離した。キシロシル転移酵素活性を感染CHO細胞の、ウサギ抗西洋ワサビペルオキシダーゼ抗血清から精製したキシロース特異抗体による免疫染色で確認した。キシロシル転移酵素のN末端部分をカバーするDNA断片を、プライマー: XylTpvuF:ATACT CGAGTTAACAATGAGTAAACGGAATC(SEQ ID NO:45)およびXylTpvuR:TTCTCGATCGCCGATTGGTTATTC(SEQ ID NO:46)を使用して増幅した。XhoIおよびHpaI制限部位を開始コドンの手前に導入し、PvuIを反対端に導入した。ヒトβ1,4ガラクトシル転移酵素(acc.no.x55415, Aoki 1992)由来のC末端断片を、プライマーGalTpvuF:GCCGCCGCGATCGGGCAGTCCTCC(SEQ ID NO:47)およびGalTrev:AACGGATCCACGCTAGCTCGGTGTCCCGAT(SEQ ID NO:48)を使用して増幅し、もってPvuIおよびBamHI部位を導入した。XhoI/PvuIおよびPvuI/BamHIで消化したPCR断片をXhoI/BamHI消化pBluescriptSK+にライゲートし、配列を解析した。生成したオープンリーディングフレームはA. thaliana β1,2-キシロシル転移酵素の最初の54アミノ酸をヒトβ1,4ガラクトシル転移酵素のアミノ酸69〜398と融合させて含む融合タンパク質をコードしており、TmXyl-GalTと命名する。この断片を植物発現ベクターのCaMV35SプロモーターとNosターミネーターの間に、HpaI/BamHIを使用してクローニングした。このクローンを天然ヒトβ1,4ガラクトシル転移酵素の場合と同様の要領でNicotiana tabacum(samsun NM)に導入した[Bakker et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:2899 (2001)]。
1. TmXyl-GalT植物ではグリカンのキシロシル化とフコシル化が劇的に減少しており、キシロースもフコースも含まないグリカンが82%にものぼるが、野生型植物ではこれは14%である。
2. ガラクトシル化はGalT植物の9%からTmXyl-GalT植物の32%へと増大した。
前記TmXyl-GalT遺伝子を発現するトランスジェニック植物(TmXyl-GalT-12植物)を、ビオチン標識RCA(Vector Laboratories, Burlingame, California)を使用するレクチンブロッティングで選別した(前記)。MGR48トランスジェニック(対照)植物、非組換えヒトβ1,4ガラクトシル転移酵素遺伝子を発現する選別トランスジェニック植物およびTmXyl-GalT-12植物のタンパク質抽出物について(高い抗キシロースおよび抗フコース活性で知られる)抗HRP(西洋ワサビペルオキシダーゼ)ポリクローナル抗体を使用してキシロースおよびフコースの存在量を調べ比較すると、キシロースとフコースの減少がはっきりした(図34:抗-HRP)。抗HRP抗体の抗キシロース画分と抗フコース画分(各画分は適正なリガンドによるアフィニティークロマトグラフィーで調製することができる)を使用したウェスタンブロット法では、対照植物と比較して特にキシロースが減少すると判明した(図34:抗-Fucと抗-Xyl)。
TmXyl-GalT-12植物と1本鎖T-DNA組み込みイベントに由来するモノクローナル抗体MGR48を発現するトランスジェニック植物(MGR48-31)とを交雑し、それをまずカナマイシン耐性マーカーおよび抗体産生で分離されていない子孫植物体を分別することによりホモ接合体とした(MGR48-31-4)。MGR48-31-4の花粉を除雄TmXyl-GalT-12植物の受粉に使用した。同様に、TmXyl-GalT-12植物の花粉を除雄MGR48-31-4植物の受精に使用した。多数のF1植物について、ウェスタンブロット法でMGR48の有無を、またRCA使用のレクチンブロット法で内在性糖タンパク質のガラクトシル化を調べた(図35)。MGR48を発現し内在性糖タンパク質のガラクトシル化を示した一植物を選別してさらなる分析に回した。この植物はXGM8と命名した。
1. F1交雑種ではグリカンのキシロシル化とフコシル化が激減した。内在性糖タンパク質のグリカンの43%はキシロースとフコースを欠くが、野生型タバコではこれが14%止まりである。
2. このF1交雑種の精製mAbのグリカンではキシロースとフコースの含量が野生型タバコの14%に対して47%も低下している。図36のパネルB〜Dをも参照。
3. F1交雑種の内在性糖タンパク質のガラクトシル化はGalT植物での9%からF1 TmXyl-GalT X MGR48植物での37%へと増進した。図35をも参照。
4. 該F1由来の精製rec-mAb(図36のパネルA)はガラクトシル化の増進を示している(46%がガラクトース)。図36のパネルAをも参照。
キシロース、フコースおよびガラクトースの各含量のもっと直接的な比較を、ハイブリドーマ、トランスジェニックタバコおよびTmXyl-GalTトランスジェニックタバコに由来するMGR48 IgG抗体を調べることによって行った。前述のようにTmXyl-GalT-12植物とMGR48 IgG発現タバコ植物(MGR48タバコ)を交雑させて、MGR48 TmXyl-GalTをもつF1交雑種を生成した。MGR48 IgGの抽出精製のためのF1植物を選別した。該植物(タバコおよびTmXyl-GalT)由来の抗体をプロテインGクロマトグラフィーにより単離、精製した(Elbers et al., 2001, Plant Physiology 126:1314-1322)。ハイブリドーマMGR48と植物由来recMGR48各々300ngを12%SDS-PAGEゲル(BioRad)に添加して電気泳動を行った。各レーンの中身は次のとおりであった: レーン1、ハイブリドーマ由来MGR48; レーン2、通常のトランスジェニックタバコ植物由来の精製recMGR48; レーン3、TmXyl-GalTトランスジェニック植物由来の精製recMGR48。SDS-PAGEの後、CAPS緩衝液を使用してタンパク質をニトロセルロース膜に転写した。ブロットにインキュベーションに使用した抗体は次のとおり: A、抗マウスIgG; B、ウサギ抗HRPポリクローナル抗体(抗キシロース/(α1,3-)フコース); C、抗キシロース; D、抗(α1,3-)フコース抗体; およびE、ビオチニル化RCA。検出は、HRP標識ヒツジ抗マウス(パネルA)またはヤギ抗ウサギ(パネルB〜D)抗体およびHRP標識ストレプトアビジン(バネルE)とのインキュベーション後に、Lumi ImagerでLumiLightを使用して行った。
前記F1交雑種のさらなる特性解明をβ-ガラクトシダーゼ処理によって行った。Table 3はTmXyl-GalT植物とMGR48植物のF1交雑種由来する(プロテインGクロマトグラフィー精製)rec-mAbのN-グリカンの、β-ガラクトシダーゼ処理前後の質量スペクトル(MALDI-TOF)分析結果の比較である。
1. F1交雑種由来のrec-mAbが含むガラクトース量はβ-ガラクトシダーゼ処理後の特定(含ガラクトース)グリコフォームの実際の減少とガラクトースを欠くグリコフォームの増加から推測しうる。m/z1622の6%から1%への実際の減少とそれと同時に見られるm/z1460の10%から14%への増加とはGalGNM5からのガラクトースの除去に伴うGNM5の生成の結果である。同じことはm/z1768 (3%から1%への減少)とそれに対応するm/z1606(4%から6%への増加)にも言える。図36のパネルEをも参照。
2. 同様に、ガラクトシダーゼ処理により、ガラクトースを含むグリカンに帰することが可能な多数のピーク特にガラクトースの存在を裏付けるm/z 1501、1647および1663が消失する。
別の実施態様では、昆虫マンノシダーゼIII 遺伝子(登録番号AF005034; マンノシダーゼII遺伝子と誤記されている!)のアミノ末端CTS領域を、小胞体(ER)への搬入用のマウスのシグナルペプチドをコードする配列に取り替える(図37参照)。このシグナルペプチド配列は、通常はIgG配列のアミノ末端に存在する完全活性シグナルペプチドをコードしており、植物や他生物に使用して成功した実績がある。さらに、いわゆる小胞体残留配列(KDEL)をコードする合成配列をER残留用に、触媒断片をコードする遺伝子部分のカルボキシル末端に付加する。この遺伝子配列によってコードされるハイブリッドマンノシダーゼIII タンパク質は従って、ERに優先的に集積することになろう。
別の実施態様では、ヒトβ-1,4-ガラクトシル転移酵素(GalT)遺伝子(登録番号A52551)のアミノ末端CTS領域を、小胞体(ER)への搬入用のマウスのシグナルペプチドをコードする配列に取り替える(図39参照)。このシグナルペプチド配列は、通常はIgG配列のアミノ末端に存在する完全活性シグナルペプチドをコードしており、植物や他生物に使用して成功した実績がある。さらに、いわゆる小胞体残留配列(KDEL)をコードする合成配列をER残留用に、触媒断片をコードする遺伝子部分のカルボキシル末端に付加する。この遺伝子配列によってコードされるハイブリッドβ-1,4-ガラクトシル転移酵素タンパク質は従って、ERに優先的に集積することになろう。
別の実施態様では、シロイヌナズナGnTI(登録番号AJ243198)のアミノ末端CTS領域を、小胞体(ER)への搬入用のマウスのシグナルペプチドをコードする配列に取り替える(図41参照)。このシグナルペプチド配列は、通常はIgG配列のアミノ末端に存在する完全活性シグナルペプチドをコードしており、植物や他生物に使用して成功した実績がある。さらに、いわゆる小胞体残留配列(KDEL)をコードする合成配列をER残留用に、触媒断片をコードする遺伝子部分のカルボキシル末端に付加する。この遺伝子配列によってコードされるハイブリッドGnTIタンパク質は従って、ERに優先的に集積することになろう。
別の実施態様では、シロイヌナズナGnTII(登録番号AJ249274)のアミノ末端CTS領域を、小胞体(ER)への搬入用のマウスのシグナルペプチドをコードする配列に取り替える(図43参照)。このシグナルペプチド配列は、通常はIgG配列のアミノ末端に存在する完全活性シグナルペプチドをコードしており、植物や他生物に使用して成功した実績がある。さらに、いわゆる小胞体残留配列(KDEL)をコードする合成配列をER残留用に、触媒断片をコードする遺伝子部分のカルボキシル末端に付加する。この遺伝子配列によってコードされるハイブリッドGnTIIタンパク質は従って、ERに優先的に集積することになろう。
別の実施態様では、ヒトβ-1,4-ガラクトシル転移酵素(GalT)遺伝子のアミノ末端CTS領域を、ヒトGnTI(TmhuGnTI-GalT)遺伝子のCTS領域に取り替える(図45参照)。
Claims (61)
- 配列番号3の核酸配列を含む、植物キシロシル転移酵素の膜貫通領域及び哺乳類ガラクトシル転移酵素の触媒領域を含むバイブリッド酵素をコードする核酸。
- 請求項1に記載の核酸を含む発現ベクター。
- 請求項2に記載のベクターによりトランスフェクトされた植物細胞。
- 請求項3に記載の植物細胞を含む細胞懸濁液。
- 請求項3に記載の植物細胞を含む植物。
- 請求項3に記載の植物細胞により発現されたハイブリッド酵素。
- 配列番号4のアミノ酸配列を含むハイブリッド酵素。
- 以下のステップ:
a)i)植物細胞と、ii)請求項1に記載の、ハイブリッド酵素をコードする核酸を含む発現ベクターとを、用意し、そして
b)前記ハイブリッド酵素が発現される条件下で、前記植物細胞内に、前記発現ベクターを、導入する、
を含む、ハイブリッド酵素の製造方法。 - 植物糖転移酵素の膜貫通領域と哺乳動物糖転移酵素の触媒領域とを含むハイブリッド酵素をコードする核酸。
- 前記植物糖転移酵素はキシロシル転移酵素である、請求項9に記載の核酸。
- 前記植物糖転移酵素はN-アセチルグルコサミニル転移酵素である、請求項9に記載の核酸。
- 前記植物糖転移酵素はフコシル転移酵素である、請求項9に記載の核酸。
- 前記哺乳動物糖転移酵素はヒト・ガラクトシル転移酵素である、請求項9に記載の核酸。
- 前記ヒト・ガラクトシル転移酵素はSEQ ID NO:1の核酸配列の少なくとも一部分によりコードされる、請求項13に記載の核酸。
- 請求項9に記載の核酸を含む発現ベクター。
- 請求項15に記載のベクターにより形質転換された宿主細胞。
- 植物細胞である、請求項16に記載の宿主細胞。
- 請求項17に記載の宿主細胞を含む細胞懸濁液。
- 請求項17に記載の宿主細胞が発現するハイブリッド酵素。
- 請求項17に記載の宿主細胞を含む植物。
- 第1糖転移酵素の膜貫通領域と第2糖転移酵素の触媒領域とを含むハイブリッド酵素をコードする核酸。
- 前記第1糖転移酵素が植物糖転移酵素を含む、請求項21に記載の核酸。
- 前記植物糖転移酵素はキシロシル転移酵素である、請求項22に記載の核酸。
- 前記植物糖転移酵素はフコシル転移酵素である、請求項22に記載の核酸。
- 前記第2糖転移酵素が哺乳動物糖転移酵素である、請求項21に記載の核酸。
- 前記哺乳動物糖転移酵素はヒト・ガラクトシル転移酵素である、請求項25に記載の核酸。
- 前記第1糖転移酵素が第1哺乳動物糖転移酵素を含み、かつ、前記第2糖転移酵素が第2哺乳動物糖転移酵素を含む、請求項21に記載の核酸。
- 前記第1糖転移酵素は非ヒト糖転移酵素である、請求項27に記載の核酸。
- 前記第2糖転移酵素はヒト糖転移酵素である、請求項27に記載の核酸。
- 次のステップa)、b)、すなわち
a) 次のi)とii)を用意するステップ: i)植物細胞、およびii)植物糖転移酵素の膜貫通領域と哺乳動物糖移転酵素の触媒領域とを含むハイブリッド酵素をコードする核酸を含む発現ベクター; および
b) 該発現ベクターを、該植物細胞中に、該ハイブリッド酵素を発現させるような条件下に、導入するステップ
を含む方法。 - 前記植物糖転移酵素はキシロシル転移酵素である、請求項30に記載の方法。
- 前記植物糖転移酵素はN-アセチルグルコサミニル転移酵素である、請求項31に記載の方法。
- 前記植物糖転移酵素はフコシル転移酵素である、請求項31に記載の方法。
- 前記哺乳動物糖転移酵素はヒト・ガラクトシル転移酵素である、請求項30に記載の方法。
- 前記ヒト・ガラクトシル転移酵素はSEQ ID NO:1の核酸配列の少なくとも一部分によりコードされる、請求項34に記載の方法。
- 次のステップa)、b)、すなわち
a) 次のi)、ii) およびiii)を用意するステップ: i)植物細胞、ii)植物糖転移酵素の膜貫通領域と哺乳動物糖移転酵素の触媒領域とを含むハイブリッド酵素をコードする核酸を含む第1発現ベクター、およびiii)異種糖タンパク質をコードする核酸を含む第2発現ベクター; および
b) 該第1および第2発現ベクターを、該植物細胞中に、該ハイブリッド酵素と該異種タンパク質を発現させるような条件下に、導入するステップ
を含む方法。 - 前記異種タンパク質は抗体又は抗体断片である、請求項36に記載の方法。
- 次のステップa)、b)、すなわち
a) 次のi) およびii)を用意するステップ: i)植物糖転移酵素の膜貫通領域の少なくとも一部分と哺乳動物糖移転酵素の触媒領域の少なくとも一部分とを含むハイブリッド酵素をコードする核酸を含む第1発現ベクターを含む第1植物、およびii)異種糖タンパク質をコードする核酸を含む第2発現ベクターを含む第2植物; および
b) 該第1および第2植物を交雑して該ハイブリッド酵素と該異種タンパク質とを発現する子孫を生み出すステップ
を含む方法。 - 第1発現ベクターと第2発現ベクターとを含む植物であって、該第1発現ベクターは植物糖転移酵素の膜貫通領域の少なくとも一部分と哺乳動物糖移転酵素の触媒領域の少なくとも一部分とを含むハイブリッド酵素をコードする核酸を含み、該第2発現ベクターは異種タンパク質をコードする核酸を含む前記植物。
- 前記異種タンパク質がハイブリッド酵素を欠く植物中で発現した場合と比較してフコース含量の減少を示す請求項39に記載の植物。
- 前記異種タンパク質がハイブリッド酵素を欠く植物中で発現した場合と比較してキシロース含量の減少を示す、請求項39に記載の植物。
- 前記異種タンパク質がハイブリッド酵素を欠く植物中で発現した場合と比較してフコース、キシロース両含量の減少を示す、請求項39に記載の植物。
- 前記異種タンパク質が複合型の2本鎖グリカンを示し、少なくとも1本のアーム上にガラクトース残基を含む、請求項39に記載の植物。
- 膜貫通部分を削除し小胞体残留シグナルを挿入した組換え哺乳動物ガラクトシル転移酵素を含むハイブリッド酵素をコードする核酸。
- 植物糖転移酵素のCTS領域またはその一部分と哺乳動物糖転移酵素の触媒領域とを含むハイブリッド酵素をコードする核酸であって、該CTS領域はN-アセチルグルコサミニル転移酵素I(GnTI)に由来し、該触媒部分はマンノシダーゼII(ManII)に由来する前記核酸。
- 植物糖転移酵素のCTS領域またはその一部分と哺乳動物糖転移酵素の触媒領域とを含むハイブリッド酵素をコードする核酸であって、該CTS領域またはその一部分はN-アセチルグルコサミニル転移酵素I(GnTI)に由来し、該触媒部分はN-アセチルグルコサミニル転移酵素II(GnTII)に由来する前記核酸。
- (a)マンノシダーゼIII 糖転移酵素をコードする核酸配列と(b)植物糖転移酵素のCTS領域またはその一部分と哺乳動物糖転移酵素の触媒領域とを含むハイブリッド酵素をコードする核酸配列とを含む植物宿主系。
- (a) (i)植物には通常見られないガラクトシル転移酵素の触媒領域とタンパク質の膜貫通領域とを含むハイブリッド酵素をコードする核酸配列、(ii)N-アセチルグルコサミニル転移酵素I(GnTI)の膜貫通領域とマンノシダーゼII(ManII)の触媒領域とを含むハイブリッド酵素をコードする核酸配列、(iii) N-アセチルグルコサミニル転移酵素I(GnTI)の膜貫通領域とN-アセチルグルコサミニル転移酵素II(GnTII)の触媒領域とを含むハイブリッド酵素をコードする核酸配列−以上の(i)、(ii)、(iii)を含むベクターを植物宿主系に導入するステップと(b)該核酸配列を発現する植物またはその一部分を単離するステップとを含む方法。
- 次のステップa)、b)、すなわち
a) 次のi)とii)を用意するステップ: i)宿主細胞、およびii)第1糖転移酵素の膜貫通領域と第2糖移転酵素の触媒領域とを含むハイブリッド酵素をコードする核酸を含む発現ベクター; および
b) 該発現ベクターを、該宿主細胞中に、該ハイブリッド酵素を発現させるような条件下に、導入するステップ
を含む方法。 - 前記第1糖転移酵素が植物糖転移酵素を含む、請求項49に記載の方法。
- 前記植物糖転移酵素がキシロシル転移酵素である、請求項50に記載の方法。
- 前記植物糖転移酵素はN-アセチルグルコサミニル転移酵素である、請求項50に記載の方法。
- 前記植物糖転移酵素はフコシル転移酵素である、請求項50に記載の方法。
- 前記第2糖転移酵素は哺乳動物転移酵素である、請求項49に記載の方法。
- 前記哺乳動物糖転移酵素はヒト・ガラクトシル転移酵素である、請求項54に記載の方法。
- 次のステップa)、b)、すなわち
a) 次のi)、ii)およびiii)を用意するステップ: i)宿主細胞、ii)第1糖転移酵素の膜貫通領域と第2糖移転酵素の触媒領域とを含むハイブリッド酵素をコードする核酸を含む第1発現ベクター、およびiii)異種糖タンパク質をコードする核酸を含む第2発現ベクター; および
b) 該第1および第2発現ベクターを、該宿主細胞中に、該ハイブリッド酵素と該異種タンパク質を発現させるような条件下に、導入するステップ
を含む方法。 - 前記異種タンパク質が抗体又は抗体断片である、請求項56に記載の方法。
- 異種タンパク質を単離するステップc)をさらに含む、請求項56に記載の方法。
- 請求項58に記載の方法に従って生産される単離異種タンパク質。
- 第1発現ベクターと第2発現ベクターとを含む宿主細胞であって、該第1発現ベクターは第1糖転移酵素の膜貫通領域の少なくとも一部分と第2糖移転酵素の触媒領域の少なくとも一部分とを含むハイブリッド酵素をコードする核酸を含み、該第2発現ベクターは異種タンパク質をコードする核酸を含む前記宿主細胞。
- 請求項60に記載の宿主細胞から単離される異種タンパク質。
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