JP2009227671A - 視神経障害を伴う眼疾患の予防又は治療剤 - Google Patents

Abstract

【課題】 ２−フェニル−１，２−ベンズイソセレナゾール−３（２Ｈ）−オン又はその塩の新たな医薬用途を探索すること。
【解決手段】 ２−フェニル−１，２−ベンズイソセレナゾール−３（２Ｈ）−オン又はその塩は、ラットを用いた薬理試験において優れた網膜神経節細胞死抑制効果を発揮するので、視神経障害を伴う眼疾患の予防又は治療剤として有用である。
【選択図】 なし

Description

本発明は、２−フェニル−１，２−ベンズイソセレナゾール−３（２Ｈ）−オン又はその塩を有効成分とする視神経障害を伴う眼疾患の予防又は治療剤に関する。

網膜は、外部からの光を受容する機能を有しており、視機能に関して重要な役割を果たしている。構造的には網膜色素上皮層を始め、内網状層、神経節細胞層、神経線維層等、１０層の層から成る、厚さ０．１〜０．５ｍｍの組織である。内網状層には、アマクリン細胞という神経節細胞突起と対をなしてシナプスを形成する神経細胞が存在するが、光の照射開始時と終了時によく応答することから、この神経細胞は光強度の検出器として働くと考えられている。神経節細胞層には、網膜のもっとも内側に位置する神経節細胞（以下「ＲＧＣ」ともいう。）が存在しており、運動視、周辺視、色覚、形態覚などに深く関与している。また、神経線維層には、網膜中心動静脈の分枝である網膜血管が走行しており、網膜神経細胞に酸素および栄養を供給する役割を担っている。

ところで、網膜血管が攣縮、血栓、動脈硬化等の要因により閉塞または狭窄すると網膜血流循環に障害が生じ、網膜や視神経への酸素ならびに栄養の供給が閉ざされる。そのため網膜神経細胞の変性や消失が生じ、視神経障害を誘発する。このように網膜血流循環障害は、網膜疾患の中で特に重要な位置を占めている。網膜血流循環障害に伴う症状の代表的な例として、網膜動脈や網膜静脈が閉塞あるいは狭窄した網膜血管閉塞症（網膜中心動脈閉塞症、網膜動脈分枝閉塞症など）、網膜剥離の一因である糖尿病網膜症、視機能障害が出現する虚血性視神経症がある。さらに、黄斑変性、網膜色素変性症、レーベル病などにおいても、この神経節細胞死が発症に深く関与すると考えられている。

また、緑内障は、適切に治療されなければ失明に至る重篤な視機能障害をもたらす眼疾患のひとつである。緑内障においては網膜神経細胞のうち特にＲＧＣが選択的に障害を受け、視神経障害が引き起こされる結果、視野障害へと進行していくことから、ＲＧＣ障害を予防あるいは最小限に抑える治療を考えることが究極的な緑内障治療につながるという、いわゆる「ニューロプロテクション」という考え方が確立されつつある（非特許文献１）。

緑内障性視神経障害の詳細なメカニズムは未だに明らかではないが、眼圧上昇により視神経が直接圧迫され、視神経萎縮が生ずるという機械的障害説と視神経乳頭の循環障害が視神経萎縮の主因であるという循環障害説が提唱されており、これら機械的障害と循環障害に基づく両メカニズムが複雑に関与していると考えられている。そして、機械的障害および循環障害は、いずれも視神経軸索輸送障害を引き起こし、この軸索輸送障害に伴って神経栄養因子の供給が途絶することがＲＧＣ障害の一因となっていると考えられている（非特許文献２）。また、グルタミン酸は網膜内の神経伝達物質の一つであるが、何らかの原因によりこのグルタミン酸シグナルカスケードが過度に活性化することもＲＧＣ障害の一因であると考えられている（非特許文献３）。

以上のことから、ＲＧＣなどの網膜神経細胞に対して保護効果を有する薬物が存在すれば、緑内障、緑内障性視神経症、緑内障性視野狭窄、緑内障性視神経萎縮、網膜血管閉塞症、網膜色素変性症、レーベル病などの視神経障害を伴う眼疾患の予防や治療に有用であることが期待される。

一方、２−フェニル−１，２−ベンズイソセレナゾール−３（２Ｈ）−オン（一般名：エブセレン、以下「エブセレン」ともいう）は抗酸化作用を有し、脳動脈硬化症、慢性脳循環不全症に有用であること、運動神経細胞のグルタミン酸輸送を活性化することが報告されている（非特許文献４、特許文献１〜２）。また、エブセレンがドライアイ、点状表層角膜症などの角結膜障害に有用であることが報告されている（特許文献３）。

エブセレンの網膜細胞に対する薬理作用を検討した報告として、非特許文献５ではウサギ虚血／再灌流モデルにおいて、エブセレンが虚血／再灌流後におけるＥＲＧ（ｅｌｅｃｔｒｏｒｅｔｉｎｏｇｒａｍ）のｂ波減弱を改善したことが報告されている。この報告は網膜組織の外側（脈絡膜組織側）に位置する光受容細胞（視細胞）に対するエブセレンの作用を報告しているに過ぎず、網膜組織の内側（硝子体側）に位置するＲＧＣに対するエブセレンの薬理作用については全く記載も示唆もされていない。ＲＧＣは網膜組織の中でも極一部であり、網膜を構成する神経細胞の約１％を占めるに過ぎない。また、網膜組織は２つの血管系から血液を供給されている。光受容細胞は脈絡膜毛細血管から血液の供給を受け、ＲＧＣは網膜中心動脈からの毛細血管で血液の供給を受けている。これらの点からも非特許文献５は網膜組織の外側の層に対するエブセレンの作用を検討しているに過ぎず、ＲＧＣに対するエブセレンの薬理作用は検討されていないと言える。

また、非特許文献６ではニワトリ胚生期網膜細胞を用いて、エブセレンが該細胞におけるグルタミン酸興奮毒性の細胞死を抑制したことが報告されている。前述のとおり、ＲＧＣは網膜組織の極一部を占めるに過ぎず、網膜組織全体に対するエブセレンの作用を検討したからと言って、実際にＲＧＣに対してエブセレンがどのような薬理作用を有するかは不明である。

以上のように、エブセレンのＲＧＣに対する薬理作用を検討した報告は存在しない。また、前述の先行技術文献についても、エブセレンの緑内障、緑内障性視神経症、緑内障性視野狭窄、緑内障性視神経萎縮、網膜血管閉塞症、網膜色素変性症、レーベル病などの視神経障害を伴う眼疾患の予防や治療に対する薬理作用を示唆するものではない。

特開２００１−２６１５５５号公報 国際公開２００４／０７１４１９号パンフレット 国際公開２００６／１２３６７６号パンフレット

眼科，４０，２５１−２７３，１９９８ 眼科，４４，１４１３−１４１６，２００２ Surv. Ophthalmol. 48，S38-S46，2003 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100(13), 7919-7924 (2003) Faseb Journal, 2004, 18, 4-5, abst. 429.13. Brain Research, 2005, 1039, 146-152

すなわち、エブセレンに関して、新たな医薬用途を探索することは興味深い課題である。

本発明者等は、エブセレンの新たな医薬用途を探索すべく鋭意研究を行ったところ、後述するように、エブセレンが、網膜神経細胞においてＮｒｆ２（ＮＦ−Ｅ２ ｒｅｌａｔｅｄ ｆａｃｔｏｒ ２）によって誘導制御されている異物代謝系第２相酵素又は抗酸化酵素の遺伝子発現量を増加させ、かつ、緑内障モデルとして汎用されている虚血再灌流モデルにおいてＲＧＣ層中の細胞数の減少を用量依存的に阻害することを見出し、本発明に至った。

すなわち、本発明は、エブセレン又はその塩を有効成分として含有する緑内障、緑内障性視神経症、緑内障性視野狭窄、緑内障性視神経萎縮、血流循環不全に起因する視神経障害、虚血性視神経障害、網膜血管閉塞症（網膜中心動脈閉塞症、網膜動脈分枝閉塞症、網膜中心静脈閉塞症、網膜静脈分枝閉塞症など）、網膜色素変性症、レーベル病、未熟児網膜症、網膜剥離、網膜色素上皮剥離、黄斑変性、糖尿病網膜症などの視神経障害を伴う眼疾患の予防又は治療剤である。特に、本発明は、ＲＧＣが選択的に障害を受け、視神経障害が引き起こされる緑内障、緑内障性視神経症、緑内障性視野狭窄、緑内障性視神経萎縮などの網膜神経節細胞の障害を伴う眼疾患の予防又は治療剤として有用である。

また、本発明の他の態様は、エブセレン又はその塩を有効成分として含有する緑内障、緑内障性視神経症、緑内障性視野狭窄、緑内障性視神経萎縮などの網膜神経節細胞の障害を伴う眼疾患の予防又は治療剤である。

また、本発明の他の態様は、エブセレン又はその塩を有効成分として含有する網膜神経細胞の保護剤である。

また、本発明の他の態様は、エブセレン又はその塩を有効成分として含有する網膜神経節細胞の保護剤である。

後述の試験を実施したところ、エブセレンは、ラット胎児由来網膜神経培養細胞死において、Ｎｒｆ２によって発現制御されている標的遺伝子グルタミン酸システインリガーゼ調節サブユニット（Ｇｌｕｔａｍａｔｅ−ｃｙｓｔｅｉｎｅ ｌｉｇａｓｅ， ｍｏｄｉｆｉｅｒ ｓｕｂｕｎｉｔ：以下「ＧＣＬＭ」ともいう）、チオレドキシンレダクターゼ（Ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ：以下「ＴＲｘＲ」ともいう）、ヘムオキシゲナーゼ１（Ｈｅｍｅ ｏｘｉｇｅｎａｓｅ 1：以下「ＨＯ１」ともいう）およびＮＡＤ（Ｐ）Ｈキノン酸化還元酵素（ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ ｑｕｉｎｏｎｅ ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ １：以下「ＮＱＯ１」ともいう）の遺伝子発現量を増加させることが示された。すなわち、エブセレンはＮｒｆ２活性化能を有し、ラット胎児由来網膜神経培養細胞において異物代謝系第２相酵素（例えば、ＮＱＯ１）および抗酸化酵素（例えば、ＨＯ１）の遺伝子発現を誘導制御する。さらに、後述する網膜虚血再灌流に誘発されるＲＧＣ死に対する作用を検討したところ、エブセレンは上記ＲＧＣ死を抑制した。

以上より、エブセレンはＮｒｆ２活性化能を有し、異物代謝系第２相酵素及び抗酸化酵素の遺伝子発現を誘導制御することによりＲＧＣ障害を改善することから、視神経障害又は網膜神経節細胞の障害を伴う眼疾患の予防又は治療剤として有用である。

本発明の有効成分であるエブセレンは、下記の化学構造式［Ｉ］で示される縮合複素環化合物である。

また、エブセレンの塩としては、医薬として許容される塩であれば特に制限はなく、塩酸、硝酸、硫酸等の無機酸との塩、酢酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸等の有機酸との塩などが挙げられる。なお、エブセレンは、溶媒和物の形態をとっていてもよい。

本発明において、「視神経障害を伴う眼疾患」とは、視神経障害を伴う眼疾患であれば特に制限はなく、緑内障、緑内障性視神経症、緑内障性視野狭窄、緑内障性視神経萎縮、血流循環不全に起因する視神経障害、虚血性視神経障害、網膜血管閉塞症（網膜中心動脈閉塞症、網膜動脈分枝閉塞症、網膜中心静脈閉塞症、網膜静脈分枝閉塞症など）、網膜色素変性症、レーベル病、未熟児網膜症、網膜剥離、網膜色素上皮剥離、黄斑変性、糖尿病網膜症などが挙げられる。特に緑内障、緑内障性視神経症、緑内障性視野狭窄及び緑内障性視神経萎縮が挙げられる。

本発明において、「網膜神経節細胞の障害を伴う眼疾患」とは、網膜神経節細胞の障害を伴う眼疾患であれば特に制限はなく、緑内障、緑内障性視神経症、緑内障性視野狭窄、緑内障性視神経萎縮、網膜血管閉塞症（網膜中心動脈閉塞症、網膜動脈分枝閉塞症、網膜中心静脈閉塞症、網膜静脈分枝閉塞症など）、網膜色素変性症などが挙げられる。特にＲＧＣが選択的に障害を受け、視神経障害が引き起こされる緑内障、緑内障性視神経症、緑内障性視野狭窄及び緑内障性視神経萎縮が挙げられる。

本発明において、「網膜神経細胞」とは視覚信号の脳への伝達に関与する神経細胞を意味する。具体的には視細胞、水平細胞、双極細胞、網膜神経節細胞、アマクリン細胞等を意味する。

本発明において、「網膜神経細胞の保護」とは、何らかの原因により生じる網膜神経細胞死及び／又は網膜神経細胞の機能低下を抑制することを意味するだけではなく、将来的に生じうる網膜神経細胞死及び／又は網膜神経細胞の機能低下を予防することをも意味する。

本発明において、「網膜神経節細胞の保護」とは、何らかの原因により生じる網膜神経節細胞死及び／又は網膜神経節細胞の機能低下を抑制することを意味するだけではなく、将来的に生じうる網膜神経節細胞死及び／又は網膜神経節細胞の機能低下を予防することをも意味する。

本発明において、「網膜神経細胞死」とは網膜神経細胞のアポトーシス及び／又はネクローシスを意味し、特に網膜神経細胞のアポトーシスを意味する。

本発明において、「網膜神経節細胞死」とは網膜神経節細胞のアポトーシス及び／又はネクローシスを意味し、特に網膜神経節細胞のアポトーシスを意味する。

エブセレンは、必要に応じて、医薬として許容される添加剤を加え、単独製剤又は配合製剤として汎用されている技術を用いて製剤化することができる。

エブセレンは、前述の眼疾患の予防若しくは治療に使用する場合、又は網膜神経節細胞等の網膜神経細胞の保護に使用する場合、患者に対して経口的又は非経口的に投与することができ、投与形態としては、経口投与、眼への局所投与（点眼投与、結膜嚢内投与、硝子体内投与、結膜下投与、テノン嚢下投与等）、静脈内投与、経皮投与等が挙げられ、必要に応じて、製薬学的に許容され得る添加剤と共に、投与に適した剤型に製剤化される。経口投与に適した剤型としては、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤等が挙げられ、非経口投与に適した剤型としては、例えば、注射剤、点眼剤、眼軟膏、貼布剤、ゲル、挿入剤等が挙げられる。これらは当該分野で汎用されている通常の技術を用いて調製することができる。また、エブセレンはこれらの製剤の他に眼内インプラント用製剤やマイクロスフェアー等のＤＤＳ（ドラッグデリバリーシステム）化された製剤にすることもできる。

例えば、錠剤は、乳糖、ブドウ糖、Ｄ−マンニトール、無水リン酸水素カルシウム、デンプン、ショ糖等の賦形剤；カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、クロスカルメロースナトリウム、クロスポピドン、デンプン、部分アルファー化デンプン、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース等の崩壊剤；ヒドロキシプロピルセルロース、エチルセルロース、アラビアゴム、デンプン、部分アルファー化デンプン、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール等の結合剤；ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、タルク、含水二酸化ケイ素、硬化油等の滑沢剤；精製白糖、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、ポリビニルピロリドン等のコーティング剤；クエン酸、アスパルテーム、アスコルビン酸、メントール等の矯味剤などを適宜選択して用い、調製することができる。

注射剤は、塩化ナトリウム等の等張化剤；リン酸ナトリウム等の緩衝化剤；ポリオキシエチレンソルビタンモノオレート等の界面活性剤；メチルセルロース等の増粘剤等から必要に応じて選択して用い、調製することができる。

点眼剤は、塩化ナトリウム、濃グリセリンなどの等張化剤；リン酸ナトリウム、酢酸ナトリウムなどの緩衝化剤；ポリオキシエチレンソルビタンモノオレート、ステアリン酸ポリオキシル４０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油等の界面活性剤；クエン酸ナトリウム、エデト酸ナトリウム等の安定化剤；塩化ベンザルコニウム、パラベン等の防腐剤等から必要に応じて選択して用い、調製することができ、ｐＨは眼科製剤に許容される範囲内にあればよいが、通常４〜８の範囲内が好ましい。また、眼軟膏は、白色ワセリン、流動パラフィン等の汎用される基剤を用い、調製することができる。

挿入剤は、生体分解性ポリマー、例えばヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシビニルポリマー、ポリアクリル酸等の生体分解性ポリマーをエブセレンとともに粉砕混合し、この粉末を圧縮成型することにより、調製することができ、必要に応じて、賦形剤、結合剤、安定化剤、ｐＨ調整剤を用いることができる。眼内インプラント用製剤は、生体分解性ポリマー、例えばポリ乳酸、ポリグリコール酸、乳酸・グリコール酸共重合体、ヒドロキシプロピルセルロース等の生体分解性ポリマーを用い、調製することができる。

エブセレンの投与量は、剤型、投与すべき患者の症状の軽重、年令、体重、医師の判断等に応じて適宜変えることができるが、経口投与の場合、一般には、成人に対し１日あたり０．０１〜５０００ｍｇ、好ましくは０．１〜２５００ｍｇ、より好ましくは０．５〜１０００ｍｇを１回又は数回に分けて投与することができ、注射剤の場合、一般には、成人に対し０．０００１〜２０００ｍｇを１回又は数回に分けて投与することができる。また、点眼剤又は挿入剤の場合には、０．０００００１〜１０％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．００００１〜１％（ｗ／ｖ）、より好ましくは０．０００１〜０．１％（ｗ／ｖ）の有効成分濃度のものを１日１回又は数回投与することができる。さらに、貼布剤の場合は、成人に対し０．０００１〜２０００ｍｇを含有する貼布剤を貼布することができ、眼内インプラント用製剤の場合は、成人に対し０．０００１〜２０００ｍｇ含有する眼内インプラント用製剤を眼内にインプラントすることができる。

以下に、試験１〜２及び製剤例の結果を示すが、これらの例は本発明をよりよく理解するためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。

試験１．ラット胎児由来網膜神経培養系を用いた異物代謝系第２相酵素および抗酸化酵素の遺伝子発現誘導能の検討
ラット胎児由来網膜神経培養系（Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ． ２００３；９６７：２５７−６６）を用いて、エブセレンの異物代謝系第２相酵素および抗酸化酵素の遺伝子発現誘導能を評価した。なお、ラット胎児由来網膜神経培養系は、網膜神経細胞を培養する技術として広汎に用いられており、緑内障等の視神経疾患を研究するツールの１つとして汎用されている。

（評価方法）
ラット胎児［Ｓｌｃ：Ｗｉｓｔａｒ／ＳＴ、１８日齢］の網膜神経細胞を単離し、ポリエチレンイミンコートされたプラスチックカバースリップ上に播種後、１０％ウシ胎児血清を含有させたイーグル基礎培地中にて３日間培養し、溶媒（０．１％エタノール）又はエブセレンを培養液中の濃度が２５μＭになるように添加し、培養培地中でインキュベートした。なお、培養は３７℃、５％ＣＯ_２条件下で行った。インキュベート開始４、８又は１２時間後の各時点で培地を除去した。ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（２５０）（ＱＩＡＧＥＮ製［カタログ番号：７４１０６］）に付属のＢｕｆｆｅｒ ＲＬＴに１％（Ｖ／Ｖ）のβ−メルカプトエタノール（ＢｉｏＲａｄ製［カタログ番号：１６１−０７１０］）を加えた混合溶液を作製し、その混合溶液でプラスチックカバースリップ上の網膜神経細胞を溶解した。得られた細胞溶解液からＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ （２５０）に添付されている説明書に従いｔｏｔａｌＲＮＡを抽出し、ＥｘＳｃｒｉｐｔ^ＴＭ ＲＴ ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ（ＴＡＫＡＲＡ製［カタログ番号：ＲＲ０３５Ｂ］）を用いてｃＤＮＡを合成した。ＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ（Ｐｅｒｆｅｃｔ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ）（ＴＡＫＡＲＡ製［カタログ番号：ＲＲ０４１Ｂ］）に添付されている説明書に従い、ＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ（Ｐｅｒｆｅｃｔ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ）、ＲＯＸ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｄｙｅ、合成したｃＤＮＡ、及びグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（以下、「ＧＡＰＤＨ」ともいう）、ＧＣＬＭ、ＴＲｘＲ、ＨＯ−１又はＮＱＯ−１の各プライマーペア（日本遺伝子研究所製）を混合し、定量的ＰＣＲ装置（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製［機器名：ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７０００］）でＰＣＲ反応を実施し、ＧＡＰＤＨ、ＧＣＬＭ、ＴＲｘＲ、ＨＯ−１又はＮＱＯ−１の各遺伝子発現量を測定した。得られた結果から、式１に従い、各目的遺伝子の発現量をハウスキーピング遺伝子であるＧＡＰＤＨの発現量で補正する事により、各目的遺伝子の相対発現量を算出した。さらに、式２に従い、２５μＭ エブセレン群の各遺伝子発現量の値を基剤群の各同一遺伝子発現量の平均値で除算することにより、基剤群に対する各目的遺伝子の誘導率（％）を求めた。各データは３回の実験の平均値±標準偏差で示した。

なお、本評価に用いた各プライマーの配列は以下の通り。

［式１］
各目的遺伝子の相対発現量＝
（各遺伝子発現量／ＧＡＰＤＨ発現量）
［式２］
基剤群に対する各目的遺伝子の誘導率（％）＝
（２５μＭ エブセレン群の各遺伝子発現量／基剤群の各遺伝子発現量）
（結果）
結果を表２に示す。表２から明らかなように、エブセレンが、ラット胎児由来網膜神経培養系において、異物代謝系第２相酵素又は抗酸化酵素であるＧＣＬＭ、ＴＲｘＲ、ＨＯ−１及びＮＱＯ−１の遺伝子発現量を増加させる事が示された。

試験２．ラット虚血再灌流誘発網膜障害モデルを用いた薬理試験
虚血再灌流誘発による網膜障害に対する効果を検討するモデルとして、ラット虚血再灌流誘発網膜障害モデル（Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｉｃａ． １９９１；２０３：１３８−１４７）を用いて、エブセレンの網膜の虚血再灌流障害に対する有用性を評価した。なお、ラット虚血際灌流誘発網膜障害モデルは、前眼部に水圧を負荷することにより網膜虚血を誘発し、一定時間の後に水圧を解除し血流を再灌流させるモデル動物であり、主に緑内障に起因する視神経障害のモデル動物の１つとして汎用されている。

（ラット虚血再灌流誘発網膜障害モデルの作製方法および評価方法）
ラット［Ｓｌｃ：ＳＤ、雄性、約７週齢］に１％（Ｗ／Ｖ）アトロピン硫酸塩水和物点眼液（日本点眼薬製［品名：日点アトロピン点眼液１％］）を点眼して散瞳させ、１００％（Ｖ／Ｖ）酸素 ０．５Ｌ／分と１００％（Ｖ／Ｖ）亜酸化窒素 １．５Ｌ／分の混合気体 ２Ｌ／分で、３％（Ｖ／Ｖ）ハロセン（武田薬品工業製［品名：フローセン］）を気化させたガスを吸入させて全身導入麻酔し、１％（Ｖ／Ｖ）ハロセンの条件で維持麻酔した。生理食塩液（大塚製薬製［品名：大塚生食注］）の点滴用容器を天井から吊るし、チューブを介して繋いだ３０Ｇの注射針を前房内に刺入することにより１３０ｍｍＨｇの水圧を負荷し、虚血を誘発した。４５分後に注射針を外し、網膜血流を再灌流させた。虚血再灌流処置７日後にラットに１００ｍｇ／ｋｇペントバルビタールナトリウム注射液（大日本住友製薬製［品名：ネンブタール注射液］）を腹腔内投与して全身麻酔し、眼球を摘出した。摘出した眼球を２５％（Ｗ／Ｖ）グルタルアルデヒド：１０％（Ｗ／Ｖ）中性緩衝ホルマリン＝１：９の混合液で固定した。固定した眼球をパラフィンで包埋した後に、薄切して網膜切片（３μｍ厚）を作製し、ヘマトキシリン−エオジンで染色した。網膜切片は１眼につき視神経乳頭部が入るように４５μｍ間隔で８切片作製した。その８切片から任意に３切片を選択し、選択した切片について、視神経乳頭から左右いずれかの１〜１．５ｍｍ間の網膜の写真撮影を行い、網膜神経節細胞層中の細胞数を計測した。その後、式３に従い、無処置群を１００％、虚血再灌流処置に基剤（１％（Ｗ／Ｖ）メチルセルロース液）経口投与を行った群を０％とした場合のエブセレンの虚血再灌流障害による網膜神経節細胞層中の細胞数の減少に対する抑制率（％）を算出した。なお、各群の例数は６−８匹（６−８眼）である。

［式３］
網膜神経節細胞層中の細胞数の減少に対する抑制率（％）＝
（Ｎ_Ｘ−Ｎ_Ｖ）／（Ｎ_Ｕ−Ｎ_Ｖ）×１００
Ｎ_Ｕ：無処置群の神経節細胞層中の細胞数
Ｎ_Ｖ：虚血再灌流処置に基剤経口投与を行った群の神経節細胞層中の細胞数
Ｎ_Ｘ：虚血再灌流処置に薬物経口投与を行った群の神経節細胞層中の細胞数
（投与方法）
基剤投与群：
１％（Ｗ／Ｖ）メチルセルロース液（メチルセルロースを精製水に溶解させて調製）を、虚血再灌流処置日の５日前より６日後まで１２日間１日２回反復経口投与した。

エブセレン投与群：
１％（Ｗ／Ｖ）メチルセルロース液に懸濁したエブセレンを３又は３０ｍｇ／ｋｇの用量で、虚血再灌流処置日の５日前より６日後まで１２日間１日２回反復経口投与した。

（結果）
結果を表３に示す。表３から明らかなように、エブセレンがラット虚血再灌流誘発網膜障害モデルにおいて、網膜における神経節細胞層中の細胞数の減少を用量依存的に阻害することが示された。

（考察）
以上の結果から、エブセレンが、網膜神経細胞においてＮｒｆ２によって誘導制御されている異物代謝系第２相酵素又は抗酸化酵素であるＧＣＬＭ、ＴＲｘＲ、ＨＯ−１及びＮＱＯ−１の遺伝子発現量を増加させ、かつ、緑内障モデルとして汎用されている虚血再灌流モデルにおいて網膜神経節細胞層中の細胞数の減少を用量依存的に阻害した。すなわち、エブセレンは網膜神経細胞死が生じる緑内障、緑内障性視神経症、緑内障性視野狭窄、緑内障性視神経萎縮、血液循環不全に起因する視神経障害、虚血性視神経障害、網膜中心動脈閉塞症、網膜動脈分枝閉塞症、網膜中心静脈閉塞症、網膜静脈分枝閉塞症、網膜色素変性症、レーベル病、未熟児網膜症、網膜剥離、網膜色素上皮剥離、黄斑変性、糖尿病網膜症などの視神経障害を伴う眼疾患に対して顕著な予防又は改善効果を有することが示された。また、エブセレンは網膜神経節細胞層中の細胞数の減少を用量依存的に阻害するので、ＲＧＣが選択的に障害を受ける緑内障、緑内障性視神経症、緑内障性視野狭窄、緑内障性視神経萎縮などの網膜神経節細胞の障害を伴う眼疾患に対して特に顕著な予防又は改善効果を有することが示された。

［製剤例］
製剤例を挙げて本発明の薬剤をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの製剤例にのみ限定されるものではない。

処方例１ 点眼剤
１００ｍｌ中
エブセレン １０ｍｇ
塩化ナトリウム ９００ｍｇ
ポリソルベート８０ 適量
リン酸水素二ナトリウム 適量
リン酸二水素ナトリウム 適量
滅菌精製水 適量
滅菌精製水にエブセレン及びそれ以外の上記成分を加え、これらを十分に混合して点眼液を調製する。エブセレンの添加量を変えることにより、濃度が０．０５％（ｗ／ｖ）、０．１％（ｗ／ｖ）、０．５％（ｗ／ｖ）又は１％（ｗ／ｖ）の点眼剤を調製できる。

処方例２ 眼軟膏
１００ｇ中
エブセレン ０．３ｇ
流動パラフィン １０．０ｇ
白色ワセリン 適量
均一に溶融した白色ワセリン及び流動パラフィンに、エブセレンを加え、これらを十分に混合して後に徐々に冷却することで眼軟膏を調製する。エブセレンの添加量を変えることにより、濃度が０．０５％（ｗ／ｗ）、０．１％（ｗ／ｗ）、０．５％（ｗ／ｗ）、１％（ｗ／ｗ）又は３％（ｗ／ｗ）の眼軟膏を調製できる。

処方例３ 錠剤
１００ｍｇ中
エブセレン １ｍｇ
乳糖 ６６．４ｍｇ
トウモロコシデンプン ２０ｍｇ
カルボキシメチルセルロースカルシウム ６ｍｇ
ヒドロキシプロピルセルロース ６ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム ０．６ｍｇ
エブセレン、乳糖を混合機中で混合し、その混合物にカルボキシメチルセルロースカルシウム及びヒドロキシプロピルセルロースを加えて造粒し、得られた顆粒を乾燥後整粒し、その整粒顆粒にステアリン酸マグネシウムを加えて混合し、打錠機で打錠する。また、エブセレンの添加量を変えることにより、１００ｍｇ中の含有量が０．１ｍｇ、１０ｍｇ又は５０ｍｇの錠剤を調製できる。

処方例４ 注射剤
１０ｍｌ中
エブセレン １０ｍｇ
塩化ナトリウム ９０ｍｇ
ポリソルベート８０ 適量
滅菌精製水 適量
エブセレン及び塩化ナトリウムを滅菌精製水に溶解して注射剤を調製する。エブセレンの添加量を変えることにより、１０ｍｌ中の含有量が０．１ｍｇ、１０ｍｇ又は５０ｍｇの注射剤を調製できる。

エブセレンはＮｒｆ２活性化能を有し、異物代謝系第２相酵素及び抗酸化酵素の遺伝子発現を誘導制御することによりＲＧＣ障害を改善することから、視神経障害又は網膜神経節細胞の障害を伴う眼疾患の予防又は治療剤として有用である。

Claims (10)

1. ２−フェニル−１，２−ベンズイソセレナゾール−３（２Ｈ）−オン又はその塩を有効成分として含有する視神経障害を伴う眼疾患の予防又は治療剤。
2. ２−フェニル−１，２−ベンズイソセレナゾール−３（２Ｈ）−オン又はその塩を有効成分として含有する網膜神経節細胞の障害を伴う眼疾患の予防又は治療剤。
3. 眼疾患が緑内障、緑内障性視神経症、緑内障性視野狭窄、緑内障性視神経萎縮、血流循環不全に起因する視神経障害、虚血性視神経障害、網膜中心動脈閉塞症、網膜動脈分枝閉塞症、網膜中心静脈閉塞症、網膜静脈分枝閉塞症、網膜色素変性症、レーベル病、未熟児網膜症、網膜剥離、網膜色素上皮剥離、黄斑変性又は糖尿病網膜症である請求項１記載の予防又は治療剤。
4. 眼疾患が緑内障、緑内障性視神経症、緑内障性視野狭窄又は緑内障性視神経萎縮である請求項２記載の予防又は治療剤。
5. ２−フェニル−１，２−ベンズイソセレナゾール−３（２Ｈ）−オン又はその塩を有効成分として含有する網膜神経細胞の保護剤。
6. ２−フェニル−１，２−ベンズイソセレナゾール−３（２Ｈ）−オン又はその塩を有効成分として含有する網膜神経節細胞の保護剤。
7. 投与形態が点眼投与、硝子体内投与、結膜下投与、結膜嚢内投与、テノン嚢下投与又は経口投与である請求項１〜４のいずれか１記載の予防又は治療剤。
8. 剤型が点眼剤、眼軟膏、挿入剤、貼布剤、注射剤、錠剤、細粒剤又はカプセル剤である請求項１〜４のいずれか１記載の予防又は治療剤。
9. 投与形態が点眼投与、硝子体内投与、結膜下投与、結膜嚢内投与、テノン嚢下投与又は経口投与である請求項５又は６記載の保護剤。
10. 剤型が点眼剤、眼軟膏、挿入剤、貼布剤、注射剤、錠剤、細粒剤又はカプセル剤である請求項５又は６記載の保護剤。