JP2009195239A - アルカリ性スフィンゴミエリナーゼを検出するための分析方法およびかかる方法に使用するキット - Google Patents
アルカリ性スフィンゴミエリナーゼを検出するための分析方法およびかかる方法に使用するキット Download PDFInfo
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Abstract
【解決手段】患者の便におけるアルカリ性スフィンゴミエリナーゼ(SMase)の存在を評価するための蛍光定量的分析方法およびかかる方法に使用されるキット。アルカリ性SMaseは大腸癌などの重篤な病状のマーカーである。
【選択図】なし
Description
−リソソーム酸性SMase(A−SMase);
−細胞基質Zn2+−依存性酸性SMase;
−膜中性マグネシウム−依存性SMase(N−SMase);
−細胞基質マグネシウム−非依存性N−SMase;および、
−アルカリ性SMase。
1)患者の便の試料を収集し、それを乾燥する工程;
2)乾燥させた試料から約3−4グラムを計量し、それを20mlのホモゲニゼーション・バッファー(0.25M スクロース、0.15M KCl、50mM KH2PO4含有、pH7.4)に懸濁する工程;
3)試料を4000rpm、+4℃で60分間遠心分離する工程;
4)上清を回収し、4000rpm、+4℃で15分間再び遠心分離する工程;
5)標準としてウシ血清アルブミンを用いてピアス・プロテイン・アッセイ(Pierce Protein Assay)により上清中のタンパク質含量を測定し、各試料についてタンパク質濃度範囲32mg/mlから40mg/mlを用い、そしてピペットにより25μlの各試料をウェルに移す工程;
6)25μlの各試料に、65μlのアッセイ・バッファー(50mM Tris/HCl、2mM EDTA、0.15M NaCl含有、pH9.0)および10μlの29μMスフィンゴミエリンを添加し、そしてアッセイ・バッファーに3mMの濃度で胆汁酸塩(TC、TDC、GC、GCDC)を添加する工程;
7)37℃で1時間インキュベートする工程;
8)ピペットにより100μlの各標準(以下を参照)および10μlのスフィンゴミエリン(29μM)を取り、試料と同様に37℃で1時間インキュベートする工程;
9)1時間後、100μlの反応バッファー(50mM Tris/HCl、pH7.4、10mM β−グリセロリン酸、750μM ATP、5mM EDTA、5mM EGTA、100μMアンプレックスレッド、8U/mlアルカリホスファターゼ、0.2U/mlコリンオキシダーゼ、2U/ml西洋わさびペルオキシダーゼ含有)を添加する工程;
10)反応物を1時間以上、37℃で光から保護してインキュベートする工程;
11)蛍光マイクロプレート・リーダーにおいて励起範囲530−560nmおよび発光検出590nmにて蛍光を測定する工程;
12)各点について、バックグラウンドの蛍光をスフィンゴミエリナーゼ非含有コントロールからの値を差し引くことにより補正する工程。
a)便または体液中のアルカリ性スフィンゴミエリナーゼによって、コリンリン酸へと加水分解されるべきスフィンゴミエリン;
b)コリンリン酸からコリンへの加水分解を触媒するアルカリホスファターゼ;
c)コリンを過酸化水素へと酸化するコリンオキシダーゼ;
d)過酸化水素とe)との反応を補助するための西洋わさびペルオキシダーゼ
e)その蛍光が便または体液に存在するアルカリ性SMaseのマーカーとなる蛍光化合物レゾルフィンをもたらす、アンプラー・レッド試薬(Ampler Red Reagent(10−アセチル−3.7−ジヒドロキシフェノキサジン));および、
f)濃度標準として用いる凍結乾燥した細菌スフィンゴミエリナーゼ。
スクロース;
塩化カリウム(KCl);
一塩基性リン酸カリウム(KH2PO4);
Trizma塩基;
EDTA;
塩化ナトリウム;
タウロコール酸(TC);
タウロデオキシコール酸(TDC);
グリココール酸(GC);
グリコケノ(Glycocheno)デオキシコール酸(GCDC);
β−グリセロリン酸;
ATP二ナトリウム塩;
EGTA;
BCAタンパク質アッセイ試薬;
ウシ血清アルブミン;
冷却遠心機;
550−562nmにて測定可能なマイクロプレート・リーダー、および、
蛍光測定マイクロプレート蛍光光度計。
キットにSMaseの標準調製物を与える。これは、pH9で作用するタイプのSMaseを含有する細菌抽出物からなる。以下の操作を行う。
SMase検量線の作成:濃度標準を希釈して段階希釈を作成する。
SMase標準を1mlのアッセイ・バッファー(pH9.0)により再構成する;この再構成により96mU/mlのストック溶液を作成する。
0.500mlのアッセイ・バッファーをピペットにより各試験管に移す。ストック溶液を用いて限界希釈を作成する。各試験管を次の工程へ移す前によく混合する。未希釈の標準を高濃度標準(96mU/ml)とし、検量線は以下の濃度の点を含むようにする(mU/ml):96−48−24−12−6−3。バッファーはゼロ標準とする(0mU/ml)。
図1に単に一例としての検量線を示す。検量線はアッセイする試料の各セットについて作成すべきである。
各標準と試料についての二連の読みを平均し、平均ゼロ標準蛍光を差し引く。
標準活性(mU/ml)に対して標準蛍光をプロットして最適曲線を引く。各試料のSMase活性を決定するために、まずy−軸上の蛍光値をみつけ、検量線まで水平線を引く。交差点において、x−軸まで垂直線を引き、対応するSMas活性を読み取る。
−ホモゲニゼーション・バッファーは中性のpHであるが、中性SMaseを排除するためにプロテアーゼおよびホスファターゼ・インヒビターを含まない。というのは中性SMaseはプロテアーゼおよびホスファターゼの活性に対して高感度であり、そのためこれらの酵素により阻害されるからである;
−ホモゲニゼーション・バッファーは、Mg依存性中性SMase活性を阻害するためにMgCl2を含まない;
−反応バッファーはβ−グリセロリン酸およびATPを含むため、中性pHでなお活性である酸性SMaseを妨げるために、この反応バッファーにおいて中性SMaseを阻害するための高濃度のEDTAとEGTAが存在する。
Claims (7)
- 以下の工程を含む患者の便におけるアルカリ性スフィンゴミエリナーゼの検出方法:
1)患者から得た患者の便試料を乾燥する工程;
2)乾燥させた試料から3−4グラムを計量し、それを20mlのホモゲニゼーション・バッファー(0.25M スクロース、0.15M KCl、50mM KH2PO4含有、pH7.4)に懸濁する工程;
3)試料を4000rpm、+4℃で60分間遠心分離する工程;
4)上清を回収し、4000rpm、+4℃で15分間再び遠心分離する工程;
5)標準としてウシ血清アルブミンを用いてピアス・プロテイン・アッセイにより上清中のタンパク質含量を測定し、各試料についてタンパク質濃度範囲32mg/mlから40mg/mlを用い、そしてピペットにより25μlの各試料をウェルに移す工程;
6)25μlの各試料に、65μlのアッセイ・バッファー(50mM Tris/HCl、2mM EDTA、0.15M NaCl含有、pH9.0)および10μlの29μMスフィンゴミエリンを添加し、そしてアッセイ・バッファーに3mMの濃度で胆汁酸塩(TC、TDC、GC、GCDC)を添加する工程;
7)37℃で1時間インキュベートする工程;
8)ピペットにより100μlの各標準凍結乾燥細菌スフィンゴミエリナーゼおよび10μlのスフィンゴミエリン(29μM)を取り、試料と同様に37℃で1時間インキュベートする工程;
9)1時間後、100μlの反応バッファー(50mM Tris/HCl、pH7.4、10mM β−グリセロリン酸、750μM ATP、5mM EDTA、5mM EGTA、100μMアンプレックスレッド、8U/mlアルカリホスファターゼ、0.2U/mlコリンオキシダーゼ、2U/ml西洋わさびペルオキシダーゼ含有)を添加する工程;
10)反応物を1時間以上、37℃で光から保護してインキュベートする工程;
11)蛍光マイクロプレート・リーダーにおいて励起範囲530−560nmおよび発光検出590nmにて蛍光を測定する工程;
12)各点について、バックグラウンドの蛍光をスフィンゴミエリナーゼ非含有コントロールから得た値を差し引くことにより補正する工程。 - 患者から得た体液に対して行う、請求項1の方法。
- 以下の試薬の試料を別々に含有する試験管を含む、患者の便または体液におけるアルカリ性スフィンゴミエリナーゼを検出するためのキット:
a)便または体液中に存在する、アルカリ性スフィンゴミエリナーゼによってコリンリン酸へと加水分解されるべきスフィンゴミエリン;
b)コリンリン酸からコリンへの加水分解を触媒するアルカリホスファターゼ;
c)コリンを過酸化水素へと酸化するコリンオキシダーゼ;
d)過酸化水素とe)との反応を補助するための西洋わさびペルオキシダーゼ
e)その蛍光が便または体液に存在するアルカリ性SMaseのマーカーとなる蛍光化合物レゾルフィンをもたらす、アンプレックス・レッド試薬((10−アセチル−3.7−ジヒドロキシフェノキサジン));および、
f)濃度標準として用いる凍結乾燥した細菌スフィンゴミエリナーゼ。 - 以下の工程を含む患者からの生物学的材料におけるアルカリ性スフィンゴミエリナーゼの検出方法:
1)患者から得た生物学的材料の試料をホモゲニゼーション・バッファー(0.24−0.26M スクロース、0.14−0.16M KCl、45−55mM KH2PO4含有、pH7.4に調整)に懸濁する工程;
2)試料を少なくとも1回遠心分離して上清を回収する工程;
3)上清中のタンパク質含量を測定する工程;
4)上清の試料に、アッセイ・バッファー(44−55mM Tris/HCl、1.9−2.2mM EDTA、0.14−0.16M NaCl含有、pH8.9−9.1)および28−30μMスフィンゴミエリンおよびアッセイ・バッファー(2.9−3.1mMの濃度の胆汁酸塩(TC、TDC、GC、GCDC)含有)を添加する工程;
5)アッセイ混合物を37℃で1時間インキュベートする工程;
6)工程5)からの試料と、28−31μMのスフィンゴミエリンを混合し、37℃で1時間インキュベートする工程;
7)反応バッファー(45−55mM Tris/HCl、pH7.3−7.5、9−11mM β−グリセロリン酸、745−755μM ATP、4−6mM EDTA、4−6mM EGTA、95−105μMアンプレックスレッド試薬、7−9U/mlアルカリホスファターゼ、0.1−0.3U/mlコリンオキシダーゼおよび1.5−2.5U/ml西洋わさびペルオキシダーゼ含有)を添加する工程;
8)反応混合物を少なくとも1時間、37℃で光から保護してインキュベートする工程;
9)励起範囲530−560nmおよび発光検出590nmにて蛍光を測定する工程。 - 各試料について、蛍光の読みをスフィンゴミエリナーゼ非含有コントロールから得た値を差し引くことによりバックグラウンドの蛍光について補正する、請求項4の方法。
- ピアス・プロテイン・アッセイによりタンパク質含量を測定する請求項4または5の方法。
- 以下を含む患者から得た生物学的試料におけるアルカリ性スフィンゴミエリナーゼを検出するためのキット:
a)スフィンゴミエリン
b)アルカリホスファターゼ,
c)コリンオキシダーゼ,
d)西洋わさびペルオキシダーゼ,
e)アンプレックス・レッド試薬
f)凍結乾燥した細菌スフィンゴミエリナーゼ。
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