BRPI0215045B1 - método analítico para detectar esfingomielinase alcalina e kit para uso em tal método - Google Patents

Abstract

"método analítico para detectar esfingomielinase alcalina e kit para uso em tal método". a presente invenção refere-se a um método fluorométrico analítico e um kit para uso em tal método para avaliar a presença de esfingomiclinase alcalina (smase) nas fezes de um paciente em necessidade de tal avaliação uma vez que smase alcalina é um marcador de estados patológicos sérios, tais como câncer de cólon.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODO ANALÍTICO PARA DETECTAR ESFINGOMIELINASE ALCALINA E KIT PARA USO EM TAL MÉTODO". A presente invenção refere-se a um método analítico para avaliar a presença de esfingomielinase alcalina nas fezes ou fluidos biológicos de pacientes em necessidade de uma tal avaliação. A invenção também ser refere a um kit para realizar o método analítico.

Mais particularmente o método da presente invenção é um método fluorométrico in vitro para detectar esfingomielinase alcalina que, como será descrito em detalhes mais abaixo, é um marcador de estados patológicos sérios como câncer de cólon e polipose adenomatosa familiar. A enzima esfingomielinase (esfingomielina fosfodiesterase, SMase) catalisa a hidrólise de esfingomielina em ceramida e fosfato de colina.

Três tipos diferentes de SMase (acídica, neutra e alcalina) foram identificados até agora, ocorrendo como várias isoformas como segue: - SMase acídica lisossomal (A-SMase); - SMase acídica Zn2+-dependente citosólica; - SMase magnésio-dependente neutra de membrana (N-SMase); - N-SMase magnésio-independente citosólica; e - SMase alcalina.

Mostrou-se que SMases representam um papel em uma ampla variedade de processos fisiológicos e patológicos, incluindo: hidrólise lisossomal de SM endocitosada, sinalização de célula mediada por ceramida, aterogênese, diferenciação terminal, parada dos ciclos celulares, apoptose, inflamação e a regulação de respostas de tensões eucarióticas.

Em contraste com SMase acídica e neutra, que estão correntemente presentes nas células como enzimas lisossomais e ligadas à membrana, respectivamente, SMase alcalina exibe diferença de tecido e espécie. Em seres humanos, a SMase alcalina é encontrada na mucosa intestinal e bílis. SMase alcalina começa a aparecer no duodeno, alcança um nível alto no intestino, especialmente na parte distai do jejuno, e ocorre em quantida- des consideráveis no cólon e reto. Esta SMase apresenta pH alcalino ótimo a 9,0, é independente de Mg2+, dependente de sal da bílis e resistente à trip-sina. A importância patológica de SMase alcalina foi apenas recentemente reconhecida e isto incitou vários estudos a serem realizados, principalmente pelas razões a seguir.

Primeiro, a enzima pode ser responsável pela hidrólise da esfin-gomielina dietética ocorrendo substancialmente em leite, ovos, carne e peixe. Segundo, esta enzima pode regular a absorção de colesterol. Terceiro, a presença de SMase alcalina ao longo do trato intestinal e sua diminuição seletiva detectada no carcinoma colorretal sugere que esta enzima representa um papel em carcinogênese intestinal, uma vez que sob condições fisiológicas, ela estimula apoptose e protege a mucosa intestinal contra carcinogênese.

Estudos anteriores também mostraram que, sob condições fisiológicas, SMase alcalina é dissociada pelos sais da bílis da membrana mucosa intestinal para o lúmen. Porém, sob condições patológicas, onde a concentração de sal da bílis é aumentada anormalmente, a dissociação de SMase alcalina pelos sais da bílis pode exceder a biogênese da enzima, resultando em um baixo nível de atividade de SMase alcalina na mucosa, e uma excreção anormalmente aumentada da enzima nas fezes ou em fluidos biológicos, isto é bílis. Por conseguinte, o excesso de SMase alcalina excretada nas fezes ou nos fluidos biológicos acima dos valores basais normais pode ser interpretado como um valioso marcador diagnóstico para carcinoma retal do cólon e polipose adenomatosa familiar, conseqüentemente; a necessidade de um ensaio seguro para detectar SMase alcalina nas fezes ou em fluidos biológicos dos pacientes prováveis de sofrer das patologias supracitadas do trato intestinal.

Além disso, algumas cepas de bactéria (por exemplo Strepto-coccus termophilus Lactobacilli) contêm níveis altos de SMase, e a avaliação de SMase alcalina pode fornecer um método para avaliar alterações no número das ditas bactérias, isto é após um tratamento com probióticos e/ou produtos com base em probióticos. Métodos anteriores para ensaiar SMase alcalina já são conhecidos. A atividade das SMases pode ser determinada ou in vivo através de célula marcada com um precursor radioativo de SM e depois determinando os níveis de produto de marcação ou in vitro usando SM radiomarcada ou um análogo cromogênico de SM ou derivados coloridos e fluorescentes de SM neutra.

Estes ensaios conhecidos comumente usados não são completamente satisfatórios uma vez que eles são potencialmente muito perigosos uma vez que eles são ensaios radioativos e menos sensíveis que um ensaio fluorométrico.

Um objetivo da presente invenção é fornecer um ensaio não-dispendioso seguro para SMase alcalina nas fezes ou fluidos biológicos de pacientes prováveis de sofrer de carcinoma colorretal e polipose adenoma-tosa familiar, ou vesícula biliar ou doenças do fígado, que supera os inconvenientes dos métodos conhecidos.

Um outro objetivo da presente invenção é fornecer um kit analítico para o uso no ensaio supracitado.

Outro objetivo da presente invenção é a avaliação de colonização bacteriana em diferentes condições de saúde ou seguindo doenças ou tratamento com drogas ou probióticos ou suplementos alimentares. O método de ensaio indireto fluorométrico da presente invenção é fundamentado na seqüência seguinte as reações.

Sob a ação de SMase alcalina, presente nas fezes ou outros fluidos biológicos, esfingomielina é hidrolisada em ceramida e fosforilcolina que, sob a ação de fosfatase alcalina, é hidrolisada rendendo colina. Na presença de colina oxidase, colina produz peróxido de hidrogênio (H202).

Este último composto, na presença de peroxidase de raiz forte, é levado a reagir com 10-acetil-3.7-diidroxifenoxazina, uma sonda fluorogênica sensível para H202 (mais abaixo referida como "Reagente Amplex Red") rendendo a resorufina de composto altamente fluorescente. Fluorescência é medida com um fluorômetro de microplaca de contagem de flúor usando ex- citação a 530-560 nm e detecção de fluorescência a 590 nm.

Com base na seqüência de reação supracitada e nos meios de detecção de fluorescência, o método de ensaio da presente invenção para avaliar SMase alcalina compreende as etapas a seguir que se referem a fezes. Porém, será evidente a alguém versado na técnica que este método pode ser facilmente aplicado também para fluidos biológicos como bílis com variações rotineiras apropriadas, 1) colher uma amostra das fezes de um paciente e secá-la; 2) pesar cerca de 3-4 gramas da amostra acima secada e colocá-los em suspensão em 20 ml de um tampão de homogeneização contendo 0,25 M sacarose, 0,15 M KCI, 50 mM KH2P04, pH 7,4; 3) centrifugar a amostra a 4000 rpm a +4° C durante 60 min; 4) restabelecer o sobrenadante e centrifugar novamente durante 15 min. a 4000 rpm a +4° C; 5) medir o teor de proteína no sobrenadante com o Ensaio de Proteína de Pierce com albumina de soro bovino como padrão usando para cada amostra uma faixa de concentração de proteína entre 32 mg/ml e 40 mg/ml e pipetar 25 μΙ de cada amostra dentro da cavidade; 6) adicionar a cada 25 μΙ de amostra 65 μΙ de tampão de ensaio contendo 50 mM Tris/HCI, 2 mM EDTA, 0,15 M NaCI pH 9,0 e 10 μΙ de 29 μΜ esfingomielina e em tampão de ensaio adicionando sais da bílis (TC, TDC, GC, GCDC) na concentração de 3 mM; 7) incubar a 37° C durante 1 h; 8) pipetar 100 μΙ de cada padrão (ver abaixo) e 10 μΙ de esfingomielina (29 μΜ), incubar durante 1 h a 37° C como as amostras; 9) após 1 hora, adicionar 100 μΙ de tampão de reação contendo 50 mM Tris/HCI pH 7,4, 10 mM β-glicerofosfato, 750 μΜ ATP, 5 mM EDTA, 5 mM EGTA, 100 μΜ Amplex Red, 8 U/ml fosfatase alcalina, 0,2 U/ml colina oxidase, 2 U/ml peroxidase de rábano silvestre; 10) incubar as reações durante 1 hora ou mais a 37° C, protegidas da luz; 11) medir a fluorescência em uma leitora de microplaca de fluo- rescência usando excitação na faixa de 530-560 nm e detecção de emissão a 590 nm; 12) para cada ponto, corrigir para fluorescência de base subtraindo os valores derivados do controle de não-esfingomielinase. A invenção também se refere a um kit para detectar esfingomie-linase alcalina nas fezes ou fluidos biológicos de um paciente de acordo com o método previamente descrito que compreende tubos de teste separadamente contendo as amostras dos reagentes a seguir: a) esfingomielina a ser hidrolisada por esfingomielinase alcalina presente nas fezes ou fluidos biológicos, para dar fosforilcolina; b) fosfatase alcalina para catalisar a hidrólise de fosforilcolina em colina; c) colina oxidase para oxidar colina em peróxido de hidrogênio; d) peroxidase de rábano silvestre para ajudar a reação de peróxido de hidrogênio com e) Reagente Ampler Red (10-acetil-3.7-diidroxifenoxazina) para dar a resorufina de composto fluorescente cuja fluorescência é um marcador da SMase alcalina presente nas fezes ou fluidos biológicos; e f) esfingomielinase bacteriana liofilizada para uso como concentrado padrão.

Para o método analítico da presente invenção para ser adequadamente realizado, além dos componentes supracitados do kit, os materiais e equipamentos a seguir são também requeridos: Sacarose;

Cloreto de potássio (KCI);

Fosfato de potássio, monobásico (KH2P04);

Base de trizma; EDTA;

Cloreto de sódio;

Taurocolato (TC);

Taurodeoxicolato (TDC);

Glicocolato (GC);

Glicoquenodeoxicolato (GCDC); β-glicerofosfato; sal de dissódio de ATP; EGTA;

Reagente de Ensaio de Proteína de BCA;

Albumina de soro bovino;

Uma centrífuga refrigerada;

Uma leitora de microplaca capaz de medir a 550-562 nm, e Um fluorômetro de microplaca de contagem de flúor.

Para realizar a quantificação de atividade de SMase, as medidas a seguir devem ser tomadas.

PREPARAÇÃO DA CURVA PADRÃO O kit é fornecido com uma preparação padrão de SMase, ele consiste em extrato bacteriano contendo um tipo de SMase que trabalha em pH 9. As operações a seguir devem ser executadas.

Gerar uma curva de calibração de SMase: diluir o concentrado padrão para fazer diluições seriais.

Reconstituir a SMase padrão com 1 ml de tampão de ensaio (pH 9,0); esta reconstituição produz uma solução de matéria-prima de 96 mU/ml.

Pipetar 0,500 ml de tampão de ensaio dentro de cada tubo. Usar a solução de matéria-prima para produzir uma série de diluição. Misturar cada tubo completamente antes da próxima transferência. O padrão não diluído serve como o padrão alto (96 mU/ml), e a curva padrão conterá as concentrações a seguir (mU/ml): 96-48-24-12-6-3. Tampão serve como o padrão zero (0 mU/ml).

CURVAS PADRÃO TÍPICAS

Na Figura 1 a curva padrão é mostrada para demonstração apenas. Uma curva padrão deve ser gerada para cada grupo de amostras ensaiadas.

CÁLCULO DOS RESULTADOS

Ponderar as leituras duplicadas para cada padrão e amostra e subtrair a fluorescência média do padrão zero.

Representar graficamente a fluorescência para os padrões versus a atividade (mll/ml) dos padrões e traçar a melhor curva. Determinar a atividade de SMase de cada amostra, primeiro encontrar o valor de fluorescência no eixo y e estender uma linha horizontal à curva padrão. No ponto de interseção, estender uma linha vertical ao eixo x e ler a atividade de SMase correspondente. O método descrito é capaz de ensaiar a atividade de SMase in vitro; ele foi desenvolvido com a intenção de detectar SMase alcalina em uma amostra orgânica.

Para ensaiar especificamente a SMase alcalina o método usa condições que detectam atividade de SMases ácida e neutra. De fato: - o tampão de homogeneização está em pH neutro, mas não tem inibidores de protease e fosfatase para excluir a SMase neutra uma vez que essa é sensível às atividades de proteases e fosfatases e é, por conseguinte inibida por estas enzimas; - no tampão de homogeneização o MgCI2 encontra-se ausente para bloquear a atividade de SMase neutra Mg-dependente; - o tampão de reação contém β-glicerofosfato e ATP para impedir SMase ácida além da atividade em pH neutro, neste tampão EDTA e EGTA estão presentes em concentração alta para inibir SMase neutra.

Claims (7)

1. Método para detectar in vitro esfingomielinase alcalina em uma amostra de um material biológico de um paciente, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: a) colocar em suspensão a amostra em um tampão de homogeneização contendo 0,24-0,26 M sacarose, 0,14-0,16 M KCI, 45-55 mM KH2PO4, ajustado em cerca de pH 7,4; b) centrifugar a amostra pelo menos uma vez e restabelecer o sobrenadante; c) medir o teor de proteína no sobrenadante; d) adicionar a uma amostra do sobrenadante um tampão de ensaio contendo 44-55 mM Tris/HCI, 1,9-2,2 mM EDTA, 0,14-0,16 M NaCI pH 8,9-9,1, 28-31 ocM esfingomielina e um tampão de ensaio contendo sais da bílis TC, TDC, GC, GCDC a uma concentração de 2,9-3,1 mM; e) incubar a mistura de ensaio a cerca de 37° C du rante cerca de 1 h; f) misturar uma amostra da etapa d) com 28-30 ocM esfingomielina, e incubar durante cerca de 1 h a cerca de 37°C; g) adicionar tampão de reação contendo 45-55 mM Tris/HCI pH 7,3-7,5, 9-11 mM β-glicerofosfato, 745-755 ocM ATP, 4-6 mM EDTA, 4-6 mM EGTA, 95-105 ocM reagente Amplex Red, 7-9 U/ml fosfatase alcalina, 0,1-0,3 U/ml colina oxidase e 1,5-2,5 U/ml peroxidase de raiz forte; h) incubar a mistura de reação por pelo menos 1 hora a cerca de 37°C, protegida da luz; i) medir a fluorescência usando excitação na faixa de 530-560 e emissão em cerca de 590 nm.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que, para cada amostra, a leitura da fluorescência é corrigida para fluorescência de base subtraindo os valores derivados de um controle de não-esfingomielinase.

3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o teor de proteína é medido pelo Ensaio de Proteína de Pi- erce.

4. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o material biológico é fezes de um paciente, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas a seguir: a) secar uma amostra das fezes de um paciente; b) pesar cerca de 3-4 gramas da amostra seca e colocá-la em suspensão em 20 ml de um tampão de homogeneização contendo 0,25 M sacarose, 0,15 M KCI, 50 mM KH2PO4, pH 7,4; c) centrifugar a amostra a 4000 rpm a +4°C durant e 60 min; d) recuperar o sobrenadante e centrifugar novamente durante 15 minutos a 4000 rpm a +4°C; e) medir o teor de proteína no sobrenadante com o Ensaio de Proteína de Pierce com albumina de soro bovino como padrão usando para cada amostra uma faixa de concentração de proteína entre 32 mg/ml e 40 mg/ml e pipetar 25 od de cada amostra dentro da cavidade; f) adicionar a cada 25 ocl de amostra 65 ocl de tampão de ensaio contendo 50 mM Tris/HCI, 2 mM EDTA, 0,15 M NaCI pH 9,0 e 10 od de 29 ocM esfingomielina e em tampão de ensaio adicionando sais da bílis TC, TDC, GC, GCDC na concentração de 3 mM; g) incubar a 37°C durante 1 h; h) pipetar 100 od de cada esfingomielinase bacteriana liofilizada padrão e 10 ocl de esfingomielina 29 ocM, incubar durante 1 h a 37° C como as amostras; i) após 1 hora, adicionar 100 ocl de tampão de reação contendo 50 mM Tris/HCI pH 7,4, 10 mM β-glicerofosfato, 750 ocM ATP, 5 mM EDTA, 5 mM EGTA, 100 ocM Amplex Red, 8 U/ml fosfatase alcalina, 0,2 U/ml colina oxidase, 2 U/ml peroxidase de rábano silvestre; j) incubar as reações durante 1 hora ou mais a 37° C, protegidas da luz; k) medir a fluorescência em uma leitora de microplaca de fluorescência usando excitação na faixa de 530-560 nm e emissão a 590 nm; l) para cada ponto, corrigir para fluorescência de base subtraindo os valores derivados do controle de não-esfingomielinase.

5. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que é aplicado em fluidos biológicos.

6.

Kit para detectar esfingomielinase alcalina em um material biológico de um paciente, caracterizado pelo fato de que compreende tubos de teste separadamente contendo amostras dos reagentes a seguir: a) esfingomielina a ser hidrolisada em um pH variando entre 8,9-9,1 por esfingomielinase alcalina presente nas fezes ou fluidos biológicos, para dar fosforilcolina; b) fosfatase alcalina para catalisar a hidrólise de fosforilcolina em colina; c) colina oxidase para oxidar colina em peróxido de hidrogênio; d) peroxidase de rábano silvestre para ajudar a reação de peróxido de hidrogênio com e) Reagente Amplex Red (10-acetil-3,7-diidroxifenoxazina) para resultar no composto resorufina fluorescente cuja fluorescência é um marcador da esfingomielinase alcalina presente nas fezes ou fluidos biológicos; e f) esfingomielinase bacteriana liofilizada para uso como concentrado padrão; g) um tampão de ensaio em pH 8,9-9,1 que contém EDTA; h) sais de bílis TD, TDC, GC.GCDC; i) um tampão de reação contendo EDTA e EGTA, β-glicerofosfato e ATP.