PL207876B1

PL207876B1 - Analityczny sposób wykrywania alkalicznej sfingomielinazy oraz zestaw do zastosowania w tym sposobie

Info

Publication number: PL207876B1
Application number: PL374085A
Authority: PL
Inventors: Simone Claudio De
Original assignee: Actial Farmaceutica
Priority date: 2001-12-21
Filing date: 2002-12-19
Publication date: 2011-02-28
Also published as: US7323317B2; HUP0402542A3; AU2002367123A1; NO20042992L; US20060141551A1; AU2002367123B2; CA2469796C; SI1456405T1; ATE408707T1; IL162513A; HRP20040632B1; ES2312666T3; CA2469796A1; BR0215045A; WO2003056031A3; EP1456405A2; MXPA04005919A; WO2003056031A2; NZ533806A; JP2005512601A

Description

Niniejszy wynalazek dotyczy analitycznego sposobu służącego do oceny poziomu występowania alkalicznej sfingomielinazy w stolcu lub płynach biologicznych pacjentów, w przypadku których taka ocena jest wskazana. Wynalazek związany jest również z zestawem do wykonania wspomnianego sposobu.

Bardziej szczegółowo, sposób według niniejszego wynalazku jest fluorymetryczną metodą in vitro do wykrywania obecności alkalicznej sfingomielinazy, która, jak opisano szczegółowo poniżej, jest markerem poważnych stanów patologicznych, takich jak rak okrężnicy i rodzinna polipowatość gruczolakowata.

Enzym sfingomielinaza (fosfodiesteraza sfingomieliny, SM-aza) katalizuje hydrolizę sfingomieliny do ceramidu i fosforanu choliny.

Dotychczas zidentyfikowano trzy różne typy SM-azy (kwaśna, obojętna i alkaliczna), występujące w następujących izo-formach:

- lizosomalna kwaś na SM-aza (A-SM-aza);

- cytozolowa, zależ na od Zn²⁺, kwaśna SM-aza;

- błonowa obojętna, zależna od magnezu, SM-aza (N-SM-aza);

- alkaliczna SM-aza.

Wykazano, że SM-azy odgrywają rolę w różnorodnych procesach fizjologicznych i patologicznych, włączając: lizosomalna hydrolizę endocytozowanej SM, ścieżkę sygnalizacyjną komórki, w której uczestniczy ceramid, miażdżycę, różnicowanie końcowe, zatrzymanie cyklu komórkowego, apoptozę, zapalenie i regulację eukariotyczych odpowiedzi na stres.

W przeciwień stwie do kwaś nej i oboję tnej SM-azy, które są obecne w komórkach, odpowiednio, jako lizosomalne i związane z błonami enzymy, alkaliczna SM-aza wykazuje zróżnicowanie tkankowe i gatunkowe. Alkaliczna SM-aza wystę puje u ludzi w bł onach ś luzowych jelita i w ż ó łci. Enzym ten pojawia się w dwunastnicy, osiąga wysoki poziom w jelicie, szczególnie w dystalnej części jelita czczego i występuje w znacznych ilościach w okrężnicy i odbytnicy. Wspomniana SM-aza przejawia optymalne pH alkaliczne przy pH 9.0, jest Mg²⁺-niezależna, zależna od soli żółciowych oraz odporna na działanie trypsyny.

Dopiero niedawno stwierdzono znaczenie alkalicznej SM-azy w procesach patologicznych. Zagadnienie to stało się przedmiotem kilku prac badawczych, przeprowadzonych głównie z następujących powodów.

Po pierwsze, enzym może być odpowiedzialny za hydrolizę pochodzącej z pożywienia sfingomieliny, występującej w znacznych ilościach w mleku, jajach, mięsie i rybach. Po drugie, enzym ten może regulować absorpcję cholesterolu. Po trzecie, obecność alkalicznej SM-azy w przewodzie jelitowym i selektywny spadek jej poziomu wykryty w przypadku raka jelita grubego wskazuje na to, że enzym ten odgrywa rolę w powstawaniu raka jelita, ponieważ w warunkach fizjologicznych stymuluje on apoptozę i chroni błony śluzowe jelita przed rozwojem raka.

Wcześniejsze badania wykazały również, że, w warunkach fizjologicznych, alkaliczna SM-aza ulega dysocjacji w obecności soli żółciowych, z błon śluzowych jelita do światła przewodu. Jednakże, w warunkach fizjologicznych, gdy stężenie soli żółciowych jest nienormalnie podwyższone, poziom dysocjacji alkalicznej SM-azy przez sole żółciowe może przekroczyć poziom biosyntezy enzymu, co z kolei, może spowodować niską aktywność alkalicznej SM-azy w błonach śluzowych i nienormalny wzrost wydzielania enzymu w stolcu lub płynach biologicznych, np., w żółci. W związku z tym, nadmierne, powyżej wartości normy, wydzielanie alkalicznej SM-azy w stolcu lub w płynach biologicznych, można interpretować jako cenny marker diagnostyczny procesu rozwoju raka okrężnicy i odbytnicy oraz rodzinnej polipowatości gruczolakowatej, co wywołuje potrzebę zastosowania wiarygodnego narzędzia analizy do wykrywania alkalicznej SM-azy w stolcu lub płynach biologicznych pacjentów prawdopodobnie cierpiących na wspomniane patologie dróg jelita.

Ponadto, pewne szczepy bakteryjne (np., Streptococcus termophilus, Lacobacilli) posiadają wysoki poziom SM-azy i ocena poziomu alkalicznej SM-azy może stanowić sposób oceny zmian w ilości wspomnianych bakterii, tj., po leczeniu probiotykami lub/i produktami na bazie probiotyków.

Wcześniejsze sposoby oceny poziomu alkalicznej SM-azy są już znane. Aktywność SM-azy może być określana in vivo poprzez komórki znakowane izotopowo prekursorem SM, a następnie przez określenie poziomu znakującego produktu lub in vitro z zastosowaniem znakowanej izotopowo SM lub tworzącego barwnik analogu SM, lub też barwnych i fluorescencyjnych pochodnych obojętnej SM.

PL 207 876 B1

Te znane, stosowane powszechnie metody analizy nie są w pełni satysfakcjonujące, ponieważ potencjalnie są bardzo niebezpieczne ze względu na zastosowane izotopy w analizie radioaktywnej, oraz mniej czułe niż analiza fluorymetryczną.

Celem niniejszego wynalazku jest zapewnienie wiarygodnej, taniej analizy poziomu alkalicznej SM-azy w stolcu lub płynach biologicznych pacjentów prawdopodobnie cierpiących na raka jelita grubego i rodzinną polipowatość gruczolakowata lub choroby pęcherzyka żółciowego czy wątroby, która nie niesie ze sobą wad znanych dotychczas metod.

Innym celem niniejszego wynalazku jest zapewnienie zestawu analitycznego do zastosowania we wspomnianej analizie.

Kolejnym celem niniejszego wynalazku jest ocena bakteryjnej kolonizacji w różnych stanach zdrowotnych lub w następstwie chorób lub leczenia lekami lub probiotykami lub dodatkami żywnościowymi.

Przedmiotem wynalazku jest, zatem sposób wykrywania alkalicznej sfingomielinazy w próbce biologicznej pobranej od pacjenta obejmujący następujące etapy:

a) zawieszenie próbki w buforze do homogenizacji zawierającym 0.24-0.26 M sacharozy, 0.14 -0.16 M KCl, 45-55 mM KH2PO4, doprowadzonym do pH 7.4;

b) przynajmniej jednokrotne odwirowanie próbki i zebranie supernatantu;

c) pomiar zawartości białka w supernatancie;

d) dodanie do próby supernatantu buforu do analizy zawierającego 44-55 mM Tris/HCl, 1.9-2.2 mM EDTA, 0.14-0.16 M NaCl o pH 8.9-9.1,28-31 μΜ sfingomieliny i buforu do analizy zawierającego sole żółciowe TC, TDC, GC, GCDC w stężeniu od 2.9 do 3.1 mM;

e) inkubacja mieszaniny do analizy korzystnie w 37°C przez korzystnie 1 godzinę;

f) wymieszanie próby uzyskanej w etapie d) z 28-30 μM sfingomielinazy i inkubacja 01 korzystnie przez 1 godz., korzystnie w 37°C;

g) dodanie buforu reakcyjnego zawierającego 45-55 mM Tris/HCl o pH 7.3-7.5, 9-11 mM β-glicerofosforanu, 745-755 μM ATP, 4-6 mM EDTA, 4-6 mM EGTA, 95-105 μM 10 acetylo-3.7-dihydroksyfenoksazyny (odczynnika Amplex Red), 7-9 U/ml alkalicznej fosfatazy, 0.1-0.3 U/ml oksydazy choliny oraz 1.5-2.5 U/ml peroksydazy chrzanowej;

h) inkubacja mieszaniny reakcyjnej przez co najmniej 1 godzinę, korzystnie w 37° C, bez dostępu światła;

i) pomiar fluorescencji przy użyciu długości fal wzbudzenia w zakresie 530-560 nm i emisji, korzystnie przy 590 nm;

Korzystnie, sposób według wynalazku charakteryzuje się tym, że dla każdej próby, odczyt fluorescencji obejmuje poprawkę uwzględniającą tło fluorescencji, uzyskaną poprzez odjęcie wartości pochodzących z kontroli niesfingomielinazowej.

Korzystnie, sposób według wynalazku charakteryzuje się tym, że zawartość białka mierzy się stosując metodę Pierce oznaczania stężenia białka.

Korzystnie, sposób według wynalazku charakteryzuje się tym, że materiałem biologicznym jest stolec pacjenta, przy czym wspomniany sposób obejmuje następujące etapy:

a) wysuszenie próby stolca pobranej od pacjenta;

b) odważenie korzystnie 3-4 gramów wysuszonej próby i zawieszenie jej w 20 ml buforu do homogenizacji, zawierającego 0.25 M sacharozy, 0.15 M KCl, 50 mM KH2PO4, pH 7.4;

c) wirowanie próby przy 4000 obr./min, w +4°C przez 60 min;

d) uzyskanie supernatantu i ponowne odwirowanie przez 15 min., przy 4000 obr./min, w +4°C;

e) pomiar poziomu zawartości białka w supernatancie za pomocą metody Pierce określania stężenia białka, z zastosowaniem albuminy surowicy wołowej jako standardu, dla każdej próby w zakresie stężenia białka między 32 mg/ml a 40 mg/ml i odmierzenie pipetą 25 μl każdej próby do studzienki;

f) dodanie do każdych 25 μl próby 65 μl buforu do analizy, zawierającego 50 mM Tris/HCl, 2 mM EDTA, 0.15 M NaCl, pH 9.0 oraz 10 μl z 29 μM sfingomieliny i dodanie w stężeniu 3 mM soli żółciowych TC, TDC, GC, GCDC w buforze do analizy;

g) inkubacja w 37° C przez 1 godz;

h) odmierzenie pipetą 100 μl każdego standardu liofilizowanej bakteryjnej sfingomielinazy i 10 μl z 29 μM sfingomieliny, inkubacja przez 1 godz. w 37°C, tak jak w przypadku próby;

i) po upływie 1 godz., dodanie 100 μl buforu reakcyjnego zawierającego 50 mM Tris/HCl o pH

7.4, 10 mM β-glicerofosforanu, 750 μM ATP, 5 mM EDTA, 5 mM EGTA, 100 μM 10 acetylo-3.74

PL 207 876 B1

-dihydroksyfenoksazyny (odczynnika Amplex Red) 8 U/ml alkalicznej fosfatazy, 0.2 U/ml oksydazy choliny, 2 U/ml peroksydazy chrzanowej;

j) inkubacja reakcji przez 1 godz. lub dłużej w 37°C, bez dostępu światła;

m) pomiar fluorescencji w mikropłytkowym czytniku fluorescencji, przy użyciu długości fali wzbudzenia w zakresie 530-560 nm i emisji przy 590 nm;

n) dokonanie dla każdego punktu poprawki uwzględniającej tło fluorescencji, uzyskanej przez odjęcie wartości pochodzących z niesfingomielinazowej kontroli.

Sposób według wynalazku korzystnie charakteryzuje się tym, że znajduje zastosowanie do badania płynów biologicznych.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zestaw do wykrywania alkalicznej sfingomielinazy w materiale biologicznym od pacjenta, charakteryzujący się tym, że obejmuje probówki testowe, zawierające oddzielnie następujące odczynniki:

a) sfingomielina, ulegająca hydrolizie w zakresie pH od 8.9 do 9.1 przez alkaliczną sfingomielinazę obecną w stolcu lub płynach biologicznych, dającej w wyniku fosforylocholinę;

b) alkaliczna fosfataza, katalizująca hydrolizę fosforylocholiny do choliny;

c) oksydaza choliny utleniająca cholinę do nadtlenku wodoru;

d) peroksydaza chrzanowa do pomocniczej reakcji nadtlenku wodoru z 10 acetylo-3.7-dihydroksyfenoksazyną (odczynniki Amplex Red);

e) 10 acetylo-3.7-dihydroksyfenoksazyna (odczynnik Amplex Red) która daje w wyniku związek fluorescencyjny rezorufinę, której fluorescencja jest markerem alkalicznej sfingomielinazy obecnej w stolcu lub pł ynach biologicznych;

f) liofilizowana bakteryjna sfingomielinaza do zastosowania jako stężony standard;

g) bufor do analizy o pH 8.9-9.1 zawierający EDTA;

h) sole żółciowe TD, TDC, GC, GCDC;

i) bufor reakcyjny zawierający EDTA i EGTA, β-glicerofosforan i ATP.

Fluorymetryczna, pośrednia metoda analizy według niniejszego wynalazku oparta jest na następujących reakcjach.

Pod wpływem działania alkalicznej SM-azy, obecna w stolcu lub płynach biologicznych, sfingomielina, ulega hydrolizie do ceramidu i fosforylocholiny, która, pod wpływem działania alkalicznej fosfatazy, jest hydrolizowana do choliny. W obecności oksydazy choliny, z choliny powstaje nadtlenek wodoru (H2O2).

Ten ostatni związek, w obecności peroksydazy chrzanowej, ulega reakcji z 10-acetylo-3.7dihydroksyfenoksazyną, czułą sondą fluoryzującą dla H2O2 (w niniejszym opisie dotyczy to „czerwonego odczynnika Ample”, „Amplex Red Reagent” dając w wyniku silnie fluorescencyjny związek rezorufinę. Fluorescencja mierzona jest mikropłytkowym czytnikiem fluorescencji fluorymetrem, przy wzbudzeniu 530-560 nm i wykryciu fluorescencji przy 590 nm.

W oparciu o wspomnianą wyżej sekwencję reakcji i narzędzia wykrywania fluorescencji, analizowana metoda według niniejszego wynalazku, do oceny alkalicznej SM-azy obejmuje następujące etapy, w odniesieniu do analizy stolca. Jednakże, dla specjalisty w dziedzinie jest oczywiste, że metoda ta może być łatwo zastosowana przy odpowiednich rutynowych modyfikacjach, wobec płynów biologicznych, takich jak żółć,

1) pobranie próbki ze stolca pacjenta i wysuszenie próby;

2) odważenie około 3-4 gramów wysuszonej próby i zawieszenie jej w 20 ml buforu do homogenizacji, zawierającego 0.25 M sacharozy, 0.15 M KCl, 50 mM KH2PO4, pH 7.4;

3) wirowanie próby przy 4000 obr./min. w +4°C przez 60 min.;

4) uzyskanie supernatantu i ponowne odwirowanie przez 15 min. przy 4000 obr./min. w +4°C;

5) pomiar zawartości białka w supernatancie z użyciem analizy Pierce Protein Assay z zastosowaniem jako standardu albuminy surowicy wołowej, dla każdej próby w zakresie stężenia białek między 32 mg/ml i 40 mg/ml i odmierzenie 25 μΐ każdej próby do studzienki;

6) dodanie do każdej (25 μθ próby 65 μl bufom do analizy, zawierającego 50 mM Tris/HCl, 2 mM EDTA, 0.15 M NaCl o pH 9.0 i 10 μl 29 μM sfingomieliny i dodanie soli żółciowych w buforze do analizy (TC, TDC, GC, GCDC) w stężeniu 3 mM;

7) inkubacja w 37°C przez 1 godz.;

8) dodanie 100 μl każdego standardu (patrz poniżej) i 10 μl sfingomieliny (29 μM), inkubacja przez 1 godz. w 37°C, jak w przypadku prób;

PL 207 876 B1

9) po upływie 1 godziny, dodanie 100 μΐ bufom do reakcji, zawierającego 50 mM Tris/HCl o pH

7.4, 10 mM β-glicerofosforanu, 750 μM ATP, 5 mM EDTA, 5 mM EGTA, 100 μM 10 acetylo-3.7-dihydroksyfenoksazyny (Amplex Red) 8 U/ml alkalicznej fosfatazy, 0.2 U/ml oksydazy choliny, 2 U/ml peroksydazy chrzanowej;

10) inkubacja reakcji przez 1 godz. lub dłużej w 37°C, bez dostępu światła;

11) pomiar fluorescencji w mikropłytkowym czytniku fluorescencji przy wzbudzeniu w zakresie 530-560 nm i wykryciu emisji przy 590 nm;

12) dokonanie dla każdego punktu korekty tła fluorescencji poprzez odjęcie wartości pochodzących z niesfingomielinazowej kontroli.

Wynalazek dotyczy również zestawu do wykrywania alkalicznej sfingomielinazy w stolcu pacjenta lub płynach biologicznych według wcześniej ujawnionego sposobu, który obejmuje test probówkowy zawierający oddzielne próby z następującymi odczynnikami:

a) sfingomielina, hydrolizowana przez alkaliczną sfingmielinazę obecną w stolcu lub płynach biologicznych, w wyniku czego powstaje fosforylocholina;

b) alkaliczna fosfataza do katalizy hydrolizy fosforylocholiny do choliny;

c) oksydaza choliny do utlenienia choliny do nadtlenku wodom;

d) peroksydaza chrzanowa do pomocniczej reakcji nadtlenku wodom z 10 acetylo-3.7-dihydroksyfenoksazyną (odczynnikiem Ample Red);

e) 10 acetylo-3.7-dihydroksyfenoksazyna (odczynnik Amplex Red) w celu uzyskania związku fluorescencyjnego rezorufiny, której fluorescencja jest markerem obecności alkalicznej SM-azy w stolcu lub płynach biologicznych; oraz

f) liofilizowana bakteryjna sfingomielinaza do zastosowania jako stężony standard. W celu odpowiedniego wykonania analitycznego sposobu według niniejszego wynalazku, oprócz wyżej wspomnianego zestawu składników, wymagane są następujące materiały i sprzęt:

Sacharoza;

Chlorek potasu (KCl);

Fosforan potasu, jednozasadowy (KH2PO4);

Zasada Trizma;

EDTA;

Chlorek sodu;

Taurocholan (TC);

Taurodezoksycholan (TDC);

Glikocholan (GC);

Glikochenodezoksycholan (GCDC);

β-glicerofosforan;

sól disodowa ATP;

EGTA;

Odczynnik do analizy białka BCA;

Albumina surowicy wołowej;

Wirówka z chłodzeniem;

Mikropłytkowy czytnik zdolny do pomiaru przy 50-562 nm oraz

Mikropłytkowy licznik fluoryscencji fluorymetr.

W celu uzyskania pomiaru aktywności SM-azy, powinny zostać dokonane następujące pomiary.

Otrzymanie krzywej standardowej

Zestaw umożliwia otrzymanie standardu dla SM-azy, obejmuje on ekstrakt bakteryjny zawierający typ SM-azy, aktywnej w pH 9. Powinno się wykonać następujące czynności:

Sporządzenie krzywej kalibracyjnej dla SM-azy: rozcieńczenie stężonego standardu w celu uzyskania kolejnych rozcieńczeń.

Otrzymanie standardu SM-azy w 1 ml buforu do analizy (pH 9.0); pozwala to na uzyskanie roztworu wyjściowego o 96 mU/ml.

Do każdej probówki należy odmierzyć pipetą 0.500 ml buforu do analizy. Do otrzymania seryjnych rozcieńczeń należy zastosować roztwór wyjściowy. Starannie wymieszać zawartość każdej probówki przed następnym przeniesieniem. Nierozcieńczony standard służy jako silnie stężony standard (96 mU/ml) a krzywa standardowa powinna obejmować następujące stężenia (mU/ml): 96-48-24-12-6-3. Bufor odpowiada standardowi na poziomie zera (0 mU/ml).

PL 207 876 B1

Typowe krzywe standardowe

Na Figurze 1 przedstawiono krzywą standardową jedynie dla przykładu. Krzywa standardowa powinna być sporządzona dla każdego zestawu badanych prób.

Obliczanie wyników

Obliczana jest średnia z dwóch odczytów dla każdego standardu i próby, od której odejmowana jest średnia dla standardu zerowej fluorescencji.

Wykres fluorescencji dla standardów względem aktywności (mU/ml) standardów i sporządzenie najlepszej krzywej. W celu określenia aktywności SM-azy dla każdej próby, na początku odczytywana jest wartość fluorescencji na osi Y i przedłużana linia pozioma jP do krzywej standardowej. W punkcie ich przecięcia, rzutowanie w linii pionowej do osi X pozwala na odczytanie odpowiedniej aktywności SM-azy.

Opisany sposób jest odpowiedni do pomiaru aktywności SM-azy in vitro; jest on stosowany w celu wykrywania alkalicznej SM-azy w próbach organicznych.

W celu specyficznego zbadania alkalicznej SM-azy, w sposobie stosuje się warunki, które pozwalają na wyeliminowanie aktywności kwaśnej i obojętnej SM-azy. W istocie:

- bufor do homogenizacji posiada oboję tne pH, lecz w celu usuni ę cia neutralnej SM-azy, nie obejmuje inhibitorów proteazy i fosfatazy, ze względu na fakt, że jest ona wrażliwa na aktywność proteaz i fosfataz oraz jest w związku z tym inhibitowana przez te enzymy;

- bufor do homogenizacji nie zawiera MgCl2 do blokady aktywnoś ci zależ nej od Mg oboję tnej SM-azy;

- bufor do reakcji zawiera β-glicerofosforan i ATP w celu wykluczenia dodatkowej aktywności kwaśnej SM-azy w obojętnym pH, w buforze tym obecny jest w wysokim stężeniu EDTA i EGTA w celu inhibicji obojętnej SM-azy.

Claims

1. Sposób wykrywania alkalicznej sfingomielinazy w próbce biologicznej pobranej od pacjenta obejmujący następujące etapy:

b) przynajmniej jednokrotne odwirowanie próbki i zebranie supernatantu;

c) pomiar zawartości białka w supernatancie;

f) wymieszanie próby uzyskanej w etapie d) z 28-30 μM sfingomielinazy i inkubacja korzystnie przez 1 godz., korzystnie w 37°C;

g) dodanie bufom reakcyjnego zawierającego 45-55 mM Tris/HCl o pH 7.3-7.5, 9-11 mM β-glicerofosforanu, 745-755 μM ATP, 4-6 mM EDTA, 4-6 mM EGTA, 95-105 μM 10 acetylo-3.7-dihydroksyfenoksazyny (odczynnika Amplex Re) 7-9 U/ml alkalicznej fosfatazy, 0.1-0.3 U/ml oksydazy choliny oraz 1.5-2.5 U/ml peroksydazy chrzanowej;

h) inkubacja mieszaniny reakcyjnej przez co najmniej 1 godzinę, korzystnie w 37°C, bez dostępu światła;

2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że dla każdej próby, odczyt fluorescencji obejmuje poprawkę uwzględniającą tło fluorescencji, uzyskaną poprzez odjęcie wartości pochodzących z kontroli niesfingomielinazowej.

3. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że zawartość białka mierzy się stosując metodę Pierce oznaczania stężenia białka.

4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że materiałem biologicznym jest stolec pacjenta, przy czym wspomniany sposób obejmuje następujące etapy:

a) wysuszenie próby stolca pobranej od pacjenta;

PL 207 876 B1

c) wirowanie próby przy 4000 obr./min, w +4° C przez 60 min;

e) pomiar poziomu zawartości białka w supernatancie za pomocą metody Pierce określania stężenia białka, z zastosowaniem albuminy surowicy wołowej jako standardu, dla każdej próby w zakresie stężenia białka między 32 mg/ml a 40 mg/ml i odmierzenie pipetą 25 μΐ każdej próby do studzienki;

g) inkubacja w 37°C przez 1 godz;

7.4, 10 mM β-glicerofosforanu, 750 μM ATP, 5 mM EDTA, 5 mM EGTA, 100 μM 10 acetylo-3.7-dihydroksyfenoksazyny (odczynnika Amplex Red) 8 U/ml alkalicznej fosfatazy, 0.2 U/ml oksydazy choliny, 2 U/ml peroksydazy chrzanowej;

5. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że znajduje zastosowanie do badania płynów biologicznych.

6. Zestaw do wykrywania alkalicznej sfingomielinazy w materiale biologicznym od pacjenta, znamienny tym, że obejmuje probówki testowe, zawierające oddzielnie następujące odczynniki:

b) alkaliczna fosfataza, katalizująca hydrolizę fosforylocholiny do choliny;

c) oksydaza choliny utleniająca cholinę do nadtlenku wodoru;

d) peroksydaza chrzanowa do pomocniczej reakcji nadtlenku wodoru z 10 acetylo-3.7-dihydroksyfenoksazyną (odczynnikiem Amplex Red);

e) 10 acetylo-3.7-dihydroksyfenoksazyna (odczynnik Amplex Red) która daje w wyniku związek fluorescencyjny rezorufinę, której fluorescencja jest markerem alkalicznej sfingomielinazy obecnej w stolcu lub płynach biologicznych;

g) bufor do analizy o pH 8.9-9.1 zawierający EDTA;

h) sole żółciowe TD, TDC, GC, GCDC;

i) bufor reakcyjny zawierający EDTA i EGTA, β-glicerofosforan i ATP.

PL 207 876 B1

Rysunek

Figura 1. Wykrycie sfingomielinazy z użyciem analizy fluorescencyjnej.

Każda reakcja obejmowała określoną ilość bakteryjnej sfingomielinazy w specyficznym buforze do analizy.

Reakcje poddawano inkubacji w37°C przez godzinę. Fluorescencję mierzono za pomocą mikropłytkowego czytnika fluorescencji, przy wzbudzeniu przy 530 nm i wykryciu fuorescencji przy 590 nm.