CN111289456A - 一种检测粪便及肠道组织中肠碱性粒氨酸酶iap的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种检测粪便及肠道组织中肠碱性粒氨酸酶IAP的方法，利用对溴四咪唑草酸及L‑苯丙氨酸对碱性磷酸酶和肠碱性粒氨酸酶的抑制作用，通过检测碱性磷酸酶家族对对硝基苯磷酸二钠的还原性原理，配置三种不同的检测溶液，在检测后进行公式计算，最后计算得出标本中的肠碱性磷酸酶含量。本发明可以排除标本中混杂的碱性磷酸酶家族其他同工酶对结果的影响，从而使检测结果更加精确、可靠。

Description

一种检测粪便及肠道组织中肠碱性粒氨酸酶IAP的方法
技术领域
本发明属于生物酶检测技术领域，具体涉及一种定量检测粪便及肠道组织匀浆标本中肠道碱性磷酸酶(IAP)活性含量的方法，通过酶催化作用并配合使用酶抑制剂，从而更加精确的检测IAP含量。
背景技术
IAP在人体内分布于从十二指肠到大肠的全部胃肠道，是一种由肠上皮细胞合成的磷酸水解酶。空腹状态下，IAP锚定与肠上皮细胞的极性面，于进食后释放入肠道内作用。IAP的作用主要主要包括：1、水解内毒素的磷酸基团，从而解毒肠道细菌的内毒素；2、可以通过维持肠上皮细胞间的紧密连接而维持肠道屏障功能，从而抑制肠道细菌移位所诱发的全身炎症；3、能够维持正常的肠道细菌微生态平衡。而IAP的降低也被发现同肠道多种炎症因子表达程负相关。因此粪便及肠道组织中IAP含量，也被认为是评价肠屏障损伤及肠道炎症的重要指标之一，并在炎性肠病、代谢综合症、高脂饮食、酒精摄入等情况所致的肠屏障受损及慢性炎症时降低。
IAP隶属于碱性磷酸酶家族，包括组织非特异性碱性磷酸酶(ALP)，肠道碱性磷酸酶，胎盘碱性磷酸酶及生殖细胞碱性粒氨酸酶。其不同的碱性磷酸酶分布位置不同，发挥的作用也不尽相同。其中粪便及肠道组织中含有的碱性粒氨酸酶绝大多数为IAP，此外还含有少量的ALP。肠道中的ALP主要来自于肝脏产生分泌，并经胆汁排泄进入肠道。此外大肠上皮细胞也被发现可以产生少量的ALP。
但是现有的对肠道标本中IAP检测方法主要通过对硝基苯磷酸二钠方法检测，该方法为检测所有碱性磷酸酶的方法，仅能同时检测标本中的ALP和IAP。由于大多数情况下ALP在粪便及肠道组织中含量较少且活性固定，因此有人将该检测结果认为是IAP活性。但在某些生理、病例情况下(如肝脏及胆道病变时)，标本中的ALP浓度可能出现变化，因此，传统的方法并不能精确提示标本中IAP含量。本发明针对该问题，对传统的方法进行改进，从而能够更加精确的检测标本中IAP的含量。
发明内容
针对现有肠道标本IAP技术中，无法排除ALP的混杂因素而无法精确检测IAP的浓度这一问题，本发明目的在于提供一种精确检测肠道源标本(粪便及肠道组织)中IAP的方法。通过应用对硝基苯磷酸二钠和标本的酶反应，同时应用IAP和ALP的特异性酶抑制剂，应用检测反应体系的OD值实现对IAP的更加精确的检测。
本发明提供了一种定量检测IAP活性的方法，其包括如下检测溶液的配制及以下步骤：
检测溶液1配方：100mM Tris盐酸(pH 8.0)、1M氯化镁、10mM氯化锌、1.86g/L对硝基苯磷酸二钠、水；
检测溶液2配方：100mM Tris盐酸(pH 8.0)、1M氯化镁、10mM氯化锌、1.86g/L对硝基苯磷酸二钠、水、对溴四咪唑草酸10mM；
检测溶液3配方：100mM Tris盐酸(pH 8.0)、1M氯化镁、10mM氯化锌、1.86g/L对硝基苯磷酸二钠、水、L-苯丙氨酸10mM；
检测标本预处理：检测标本应用水或PBS稀释10～50倍，震荡混匀后并离心后获得上清溶液。
在3个不同的检测孔中分别按照1：7比例加入检测样本，和3个不同检测溶液。
在另外一个检测孔中，按梯度加入不同浓度的IAP标准液1份及7份的检测溶液1。
分别在加入检测液后分别在两个不同时间点分别检测405nm的OD值。
计算每分钟时间OD检测值的变化量，并根据通过朗伯—比尔定律方程c＝A/εl计算出每一个检测空中检测的碱性磷酸酶浓度。其中c为标本浓度，A为矫正后的吸光度(样本吸光度-工作液吸光度)，ε为标本摩尔吸光系数(不同检测仪器根据标准样本浓度动态决定并调整)，l为吸光厚度；
应用以下公式计算出标本中IAP浓度：
IAP浓度＝(检测溶液1结果—检测溶液2结果+检测溶液3结果)÷2本发明有以下优点：
1.可以排除肠道标本中其他IAP同家族酶对结果的干扰，使加测结果更加真实可靠；
2.检测所需样本量少，方法简便，检测时间短，便于操作。
具体实施方式
实施例一：
应用该发明方法检测某患者粪便标本中IAP含量
a.称重标本10mg，加入PBS溶液49倍即490μl，震荡混匀后待检测；b.在96孔板的不同孔内，分别加入30μl待测标本及三种不同的检测溶液170μl。该检测酶标仪使用的标本吸光光程为0.5cm；该酶标仪应用标准浓度检测并矫正后，得到应用该机器检测按3:17比例加样检测IAP的摩尔吸光系数为0.016。应用酶标仪检测订加样后0分钟和5分钟的405nm时的OD值。此时检测溶液1的每分钟OD值变化为0.15；检测溶液2的每分钟OD值变化为0.06；检测溶液3的每分钟OD值变化为0.12；将OD值带入IAP的标准曲线方程式c＝A/εl，将各个参数带入公式，可计算出检测试剂1的全部碱性磷酸酶活性为0.15/(0.016*0.5)＝18.75/ml，检测试剂2的结果为0.06/(0.016*0.5)＝7.50u/ml，检测试剂3的结果为0.12/(0.016*0.5)＝15.00u/ml。c.应用计算式：(18.75-7.50+15.00)÷2，最终测得标本内的IAP活性浓度为13.13u/ml。
该患者标本如用传统方法检测结果为粪便IAP活性浓度为18.75u/ml，而用该发明的新方法检测，检测结果为8.22u/ml。原方法检测结果中包含了部分IAP外的其他各种碱性磷酸酶，而新方法则排除了该混杂因素，因此检测结果更加可靠。
实施例二：
应用该发明方法检测小鼠粪便标本中IAP含量
a.称重标本50mg，加入PBS溶液19倍即950μl，震荡混匀后待检测；b.在96孔板的不同孔内，分别加入10μl待测标本及三种不同的检测溶液190μl。该检测酶标仪使用的标本吸光光程为1cm；该酶标仪应用标准浓度检测并矫正后，得到应用该机器检测IAP的摩尔吸光系数为0.028。应用酶标仪检测订加样后2分钟和6分钟的405nm时的OD值。此时检测溶液1的每分钟OD值变化为0.35；检测溶液2的每分钟OD值变化为0.16；检测溶液3的每分钟OD值变化为0.27；将OD值带入IAP的标准曲线方程式c＝A/εl，将各个参数带入公式，可计算出检测试剂1的全部碱性磷酸酶活性为0.35/0.028*1＝12.50/ml，检测试剂2的结果为0.16/0.028*1＝5.71u/ml，检测试剂3的结果为0.27/0.028*1＝9.64u/ml。c.应用计算式：(12.50-5.71+9.64)÷2，最终测得标本内的IAP活性浓度为8.22u/ml。
该患者标本如用传统方法检测结果为粪便IAP活性浓度为12.50u/ml，而用该发明的新方法检测，则排除了标本中ALP对结果的影响后，检测结果为8.22u/ml。该结果更加真实，可信，并且简单快速，弥补了限行检测IAP浓度方法的不足。
实施例三：
应用该发明方法检测患者肠粘膜活检标本中IAP含量
a.称重标本100mg，加入RIPA裂解液9倍即900μl，震荡混匀后待检测；在酶标仪孔检测内，分别加入20μl待测标本及三种不同的检测溶液180μl。该检测酶标仪使用的标本吸光光程为1.5cm；该酶标仪应用标准浓度检测并矫正后，得到应用该机器检测按1:9比例加样检测IAP的摩尔吸光系数为0.048。应用酶标仪检测订加样后3分钟和5分钟的405nm时的OD值。此时检测溶液1的每分钟OD值变化为0.46；检测溶液2的每分钟OD值变化为0.16；检测溶液3的每分钟OD值变化为0.32；将OD值带入IAP的标准曲线方程式c＝A/εl，将各个参数带入公式，可计算出检测试剂1的全部碱性磷酸酶活性为0.46/(0.048*1.5)＝6.39u/ml，检测试剂2的结果为0.16/(0.048*1.5)＝2.22u/ml，检测试剂3的结果为0.32/(0.048*1.5)＝4.44u/ml。c.应用计算式：(6.39-2.22+4.44)÷2，最终测得标本内的IAP活性浓度为4.31u/ml。
该患者标本如用传统方法检测结果为粪便IAP活性浓度为6.39u/ml，而用该发明的方法检测，检测结果为4.44u/ml。

Claims (1)

1.一种检测粪便及肠道组织中肠碱性粒氨酸酶IAP的方法，其特征在于，所述检测IAP的方法包括以下步骤：
a、检测溶液1配方：10mM～1M Tris盐酸pH 7.5～8.0、0～10M氯化镁、0～100mM氯化锌、0.186～18.6g/L对硝基苯磷酸二钠、水；
检测溶液2配方：10mM～1M Tris盐酸pH 7.5～8.0、0～10M氯化镁、0～100mM氯化锌、0.186～18.6g/L对硝基苯磷酸二钠、水、对溴四咪唑草酸1mM～100mM；
检测溶液3配方：10mM～1M mM Tris盐酸pH 7.5～8.0、0～10M氯化镁、0～100mM氯化锌、0.186～18.6g/L对硝基苯磷酸二钠、水、L-苯丙氨酸1mM～100mM；
b.检测样本1:1～1:200体积比例分别加入检测溶液1，检测溶液2，检测溶液3；
c.通过朗伯—比尔定律方程c＝A/εl计算获得标本应用检测溶液1、2、3检测后所获得的结果，其中c为标本浓度，A为吸光度随时间的变化率，ε为标本摩尔吸光系数，不同检测仪器根据标准样本浓度动态决定并调整，l为吸光厚度；
d.应用以下计算公式计算后获得标本中IAP活性浓度：标本IAP浓度＝(检测溶液1结果－检测溶液2结果+检测溶液3结果)÷2。
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