JP2009137870A

JP2009137870A - 新規蛍光化合物およびその利用

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Publication number: JP2009137870A
Application number: JP2007314891A
Authority: JP
Inventors: Keiichi Yamada; 圭一山田; Keiji Yokoo; 圭司横尾; Toshitada Yoshihara; 利忠吉原; Hiroyuki Oku; 浩之奥; Shigefumi Hida; 成史飛田; Ryoichi Katagai; 良一片貝
Original assignee: Gunma University NUC
Current assignee: Gunma University NUC
Priority date: 2007-12-05
Filing date: 2007-12-05
Publication date: 2009-06-25

Abstract

【課題】新規な蛍光化合物を提供する。
【解決手段】下記一般式（I）で表される化合物またはその塩。

Ｒは炭素数１〜５のアルキルを示す。
【選択図】図１

Description

本発明は新規蛍光化合物に関する。本発明はまた、当該化合物を用いた、蛍光標識剤および物質の標識方法に関する。

現在、有機材料の吸光特性を活かした光デバイスが求められている。近年、短波長側の３５０〜５００ｎｍ付近（たとえば４０５ｎｍ前後）の青色レーザー光を用いて記録および再生が可能な光ディスクについて開発が行われている。これらの光ディスクは、有機色素化合物を光記録層に使用しており、レーザー光が短波長側になるほど、光過性基板、有機色素化合物の選定等に精密さがより要求される傾向にある。故にその記録層に用いる有機色素化合物として400nm前後の近紫外光領域に吸収極大を持つ有機材料が注目され、鋭意開発が進められてきた。
また、本発明者らは、蛍光物質として、フェニルアラニン型非天然蛍光性アミノ酸（特許文献１）を開示している。しかしながら、この化合物から酵素変換によって新規な蛍光化合物が得られるとは、予測できなかった。
特開2007-197406号公報

本発明は、光デバイスや蛍光標識剤などとして有用な、新規な蛍光化合物を提供することを課題とする。

本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討を行った。その結果、発明者らは、以前、独自に開発したフェニルアラニン型非天然蛍光性アミノ酸CDAPA（特開2007-197406）を酵素光学分割してL-CDAPA誘導体を調製する過程において、L-CDAPAが分子内付加環化して生成したと思われる新規二環性芳香族化合物が得られることを初めて見い出した。この化合物の紫外吸収及び蛍光スペクトルを測定したところ、384nm付近に吸収極大を持ち、530nm付近に発光極大を持つ蛍光性有機色素であることを見出し、本発明を完成させた。

すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）一般式（I）で表される化合物またはその塩。

Ｒは炭素数１〜５のアルキルを示す。
（２）Ｒがいずれもメチルである、（１）に記載の化合物。
（３）（１）または（２）に記載の化合物を含む、蛍光標識剤。
（４）（１）または（２）に記載の化合物を物質に結合する工程を含む、物質の標識方法
。
（５）一般式（II）で表される化合物にL-アミノアシラーゼを作用させる工程を含む、一般式（I）で表される化合物の製造方法。

一般式（I）、（II）において、Ｒは炭素数１〜５のアルキルを示す。

本発明の蛍光化合物は、近紫外部に吸収極大を持つため、光デバイスなどを開発する上で有用である。また、そのカルボキシル基やアミノ基を介してタンパク質、ペプチドやポリマーなどの種々の機能性分子と結合させることが可能であり、生命科学研究に資する蛍光標識化試薬など、幅広い応用が期待できる。また、本発明の蛍光化合物は環境負荷の少ない酵素反応を用いて製造することができる。

以下に本発明を詳しく説明する。
本発明の化合物は、以下の一般式（I）で表される(3S)-1-アミノ-(7-ジアルキルアミノ)-3,4-ジヒドロイソキノリン-3-カルボン酸である。

ここで、Ｒは炭素数１〜５のアルキルを示す。なお、Ｒは互いに異なっていてもよい。一般式（Ｉ）の化合物としては、Ｒがいずれもメチルである下記の化合物が特に好ましい。

本発明の化合物は下記の方法によって、(2-シアノ-4-ニトロベンジル)アセトアミドマロン酸アルキルジエチルを出発物質として合成することができる。なお、(2-シアノ-4-ニトロベンジル)アセトアミドマロン酸アルキルジエチルは特開2007-197406号公報に記載の方法によって得ることができる。そして、酵素分割に使用するL-アミノアシラーゼは特に制限されないが、コウジカビ由来のL-アミノアシラーゼなどを用いることができる。
ただし、本発明の化合物はこの方法によって合成されたものには限定されない。

式（I）の化合物は塩であってもよい。塩としては、無機酸付加塩（例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、リン酸塩等）、有機カルボン酸、スルホン酸付加塩（例えばギ酸塩、酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、メタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、トルエンスルホン酸塩等）、あるいは、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム等の金属塩が挙げられる。なお、式（I）の化合物は水和物であってもよい。

式（I）の化合物は、蛍光標識剤として使用することができる。式（I）の化合物によって蛍光標識される物質の種類は特に制限されないが、ペプチド、タンパク質、核酸、脂質や糖鎖などの生理活性物質、あるいは、アガロースやセルロースなどの高分子担体などであってもよい。
式（I）の化合物を上記物質に結合する方法としては、化学的結合や物理的結合が挙げられる。化学的結合の場合、式（I）の化合物の一部が物質と反応した結果、残基として結合したものであってもよい。例えば、式（I）の化合物のカルボキシル基やアミノ基を、上記物質が本来有する、あるいは、上記物質に導入された、カルボキシル基やアミノ基と反応する置換基に反応させる方法が挙げられる。また、式（I）の化合物は、リンカー
を介して物質に結合してもよい。例えば、式（I）の化合物を固相に結合させてそれ自体を蛍光発光のセンサーとして用いることもできる。

以下、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、以下の具体例は、限定されるものではなく、適宜変更できることは勿論である。なお、実施例において使用した略語は、次のとおりである。

（合成用試薬）
NaBH₃CN：水素化シアノホウ素ナトリウム（試薬特級、関東化学）
HCl：塩酸（試薬特級、和光純薬）
5%Pd-C：5%パラジウム-炭素（川研ファインケミカル）
NaHCO₃：炭酸水素ナトリウム（食品添加物用、旭硝子株式会社）
Na₂SO₄：硫酸ナトリウム（無水物、ナガオ株式会社）
NaOH：水酸化ナトリウム（試薬一級、関東化学）
L-AA：L-アミノアシラーゼ（コウジカビ由来、350 units）（関東化学）
濃NH₃水：濃アンモニア水（25％）（試薬一級、関東化学）
AcOH：酢酸（試薬特級、和光純薬）

（溶媒その他）
THF：テトラヒドロフラン（試薬一級、和光純薬）
EtOH：エタノール（試薬特級、和光純薬）
AcOEt：酢酸エチル（試薬一級、関東化学・和光純薬）
MeOH：メタノール（試薬一級、関東化学・和光純薬）
MeCN：アセトニトリル（試薬特級、和光純薬）
TLC：薄層クロマトグラフィー（メルク株式会社）

実施例 ((3S)-1-アミノ-7-ジメチルアミノ-3,4-ジヒドロイソキノリン-3-カルボン酸(7)の合成)
(7)の合成スキームを以下に示す。なお、実施例中に記載される化合物番号は、下記スキームにおける化合物番号と対応している。

(7)の合成スキーム

（１）(4-アミノ-2-シアノベンジル)アセトアミドマロン酸ジエチル(2)の合成
(2-シアノ-4-ニトロベンジル)アセトアミドマロン酸ジエチル(1)は、発明者らによる公知の方法（特許公開公報2007-197406）により合成した。500 mlのナスフラスコに(1)(1.76 g, 4.66 mmol)を入れ、MeOH 40 mlに溶解した。5%Pd-Cを加えて反応系内をH₂ガスで置換し、室温で4時間攪拌した。TLC分析にて原料スポットの消失を確認後、メンブランフィルター(日本ミリポア製, OMNIPORE^TM メンブランフィルター、フィルター形式0.45μm JH) にてPd-Cをろ去した。ろ液をエバポレーターで減圧濃縮後、残渣にTHF/ヘキサンを加えて結晶化させ、(2)を得た。（収量:1.53 g, 収率:94 %), m.p. 166-167.5 ℃, ¹H NMR (300MHz, CDCl₃): δ6.95 (d, 1H, J=8.4Hz), 6.85(d, 1H, J=2.5Hz), 6.77 (dd, 1H, J=2.5, 8.4Hz), 6.54 (s, 1H), 4.34-4.20 (m, 4H), 3.85 (s, 2H), 3.73 (s, 2H), 2.96 (s,
6H), 2.04 (s, 3H), 1.29(t, 6H, J=7.2Hz)

（２）[2-シアノ-4-(N,N-ジメチルアミノ)ベンジル]アセトアミドマロン酸ジエチル(3)の合成
500 mlのナスフラスコに(4-アミノ-2-シアノベンジル)アセトアミドマロン酸ジエチル(2) (8.25 g, 23.8 mmol)を取り、MeCN (40 ml)に溶解し、ホルマリン20 mlとNaBH₃CN 4.52 g (71.9 mmol)を加えた。この反応混合物を15分間攪拌し、その後、AcOH 22 mlを30分かけて少しずつ加えた。さらに2時間攪拌後、TLC分析にて原料スポットの消失を確認したので、攪拌を終了した。反応混合物をエバポレーターで減圧濃縮し、残渣をAcOEtに溶解して分液ロートに移した。有機相を飽和NaHCO₃水溶液、飽和食塩水にて洗浄し、無水Na₂SO₄にて乾燥させた。無機塩をろ去後、ろ液をエバポレーターで減圧留去し、粗精製物を得た。これにTHF/ヘキサンを加えて結晶化させ、(3)を得た。 (収量: 8.68 g, 収率: 97 %), m.p. 134-134.5 ℃, ¹H NMR (300MHz, CDCl₃): δ6.98 (d, 1H, J=8.4Hz), 6.82(d, 1H, J=2.7Hz), 6.80-6.77 (m, 1H), 6.57 (s, 1H), 4.31-4.27 (m, 4H), 3.73 (s, 2H), 2.96 (s, 6H), 2.06 (s, 3H), 1.30(t, 6H, J=7.2Hz)

（３）N-アセチル-[2-シアノ-4-(ジメチルアミノ)フェニル]- DL-アラニンエチルエステル (5)の合成
200 mlのナスフラスコに(3) (1.3 g, 3.53 mmol)を取り、EtOH (20 ml)に溶解した後、2M NaOH(2.7 ml)を加え攪拌を開始した。1時間後、TLC分析にて反応の終了を確認し、2M HCl水溶液(4.0 ml)を加え、中和して撹拌を終了した。反応混合物をエバポレーターで減圧濃縮し、残渣をAcOEtに溶解させた。これを分液ロートに移し、有機相を飽和NaHCO₃水溶液、飽和食塩水にて洗浄した。有機相を無水Na₂SO₄で乾燥した後、AcOEtをエバポレーターにて減圧留去してハーフエステル(4)を得た。なお、水相をTLC分析を行ったところ、目的物と思われるスポットが確認されたので、pHを4〜5に戻し、再度AcOEtにて抽出し先のものと合わせ、精製することなく次の反応に供した。(4)を1,4-ジオキサン(40 ml)に溶解させ、3時間加熱還流した。TLC分析にて原料スポットの消失を確認後、エバポレーターにて減圧濃縮した。得られた残渣にTHF/ヘキサンを加えて結晶化させ、得られた結晶をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(展開溶媒: AcOEt)にて精製し、(5)を得た。(収量: 0.85 g, 収率:80 %), m.p. 124.5-125 ℃, ¹H NMR (300MHz, CDCl₃): δ7.14 (d, 1H, J=9.0Hz), 6.86-6.81(m, 2H), 6.02 (d, 1H, J=9.0Hz), 4.86 (dd, 1H, J=6.0Hz, 9.0Hz), 4.30-4.15 (m, 4H), 3.28 (dd, 1H, J=6.0, 12.0Hz), 3.13 (dd, 1H, J=6.0, 12.0Hz), 2.96 (s, 6H), 2.00 (s, 3H), 1.29(t, 6H, J=6.0Hz)

（４）N-アセチル-[2-シアノ-4-(ジメチルアミノ)フェニル]- DL-アラニン(6)の合成
300 mlナスフラスコに(5) (1.63 g, 5.37 mmol)を取り、EtOH (40 ml)に溶解した後、1M NaOH水溶液 (8.0 ml)を加え、室温で2時間攪拌した。TLC分析にて原料スポットの消失を確認し、反応混合物に2M HCl水溶液 (10 ml)を加え、しばらく攪拌した。反応混合物をエバポレーターで減圧濃縮し、残渣を少量のEtOHとAcOEtにて溶解後、ヘキサンを加えて結晶化し、(6)を得た。(収量:1.36 g, 収率:92 %), m.p. 122.5-123 ℃, ¹H NMR (300MHz, CDCl₃): δ12.71 (br s, 1H), 8.23(d, 1H, J=9.0Hz), 7.23(d, 1H, J=9.0Hz), 6.92-6.98 (m, 2H), 4.65 (m, 1H), 3.13 (q, 2H, J=6.0Hz), 2.91 (s, 6H), 1.78 (s, 3H)

(3S)-1-アミノ-(7-ジメチルアミノ)-3,4-ジヒドロイソキノリン-3-カルボン酸 (7)の合成
100 mlのナスフラスコに(6) (101 mg, 0.367 mmol)を取り、蒸留水(10 ml)に溶解した後、濃NH₃水1滴を加えpH 8に調整した。ここにL-AA (10 mg)を加え、38℃の湯浴にて撹拌を開始した。60時間後、TLC分析にて反応の進行を確認したところ、原料と異なるスポットが確認できたため、AcOHを加えpH 5に調整し、湯浴の温度を60℃にして1時間撹拌した。生じた沈殿物をメンブランフィルターにてろ別した後、ろ液をエバポレーターにて減圧濃縮した。得られた残渣に蒸留水(5 ml)を加え、生じた沈殿をメンブランフィルターにてろ別し、ろ液を再度エバポレーターにて減圧濃縮した。同様の操作をろ液のTLC分析が単一スポットになるまで繰り返し行った。生じた沈殿をすべて集め、少量の蒸留水に溶解させた。1M HCl水溶液にてpH 3に調整した後、減圧濃縮し、残渣にMeOH/ヘキサン加えて淡黄色固体(7)を得た。(収量:13.0 mg)単結晶X線結晶構造解析の結果、(7)は、当初推定していた[2-シアノ-4-(ジメチルアミノ)フェニル]-L-アラニンではなく、(3S)-1-アミノ-(7-ジメチルアミノ)-3,4-ジヒドロイソキノリン-3-カルボン酸であることが明らかとなった。また、得られたろ液を減圧濃縮後、EtOH/ヘキサンを加えて結晶化させて (8)を得た。 (収量:48.8 mg) (8)のESI-MS及び¹H-NMRスペクトルは、(6)と同一であり、比旋光度測定において左旋性を示したことから、(8) は、酵素加水分解を受けなかったN-アセチル-[2-シアノ-4-(ジメチルアミノ)フェニル]-D-アラニンであることがわかった。

化合物 (7)の分析結果を以下に示す。
(7): 淡黄色固体, 分子式：C₁₂H₁₅N₃O₂ (分子量：233.27), 融点：>300 ℃（分解）, MS(ESI)：m/z 234.3 ([M+H]⁺), 比旋光度： [α]_D ²⁰+39.6 (c 0.1, 1M HClaq.), ¹H NMR (500MHz, D₂O)（図２）: δ7.97 (d, 1H, J=2.4Hz), 7.71(dd, 1H, J=2.4, 8.4Hz), 7.49 (d, 1H, J=8.4Hz), 4.42 (dd, 1H, J=5.7, 6.2Hz), 3.32 (dd, 1H, J=6.4, 16.7Hz), 3.32
(dd, 1H, J=5.5, 16.7Hz), 3.12 (s, 6H), UVスペクトル (EtOH): λ_max=380 nm (ε₃₈₀=760 M^-1cm^-1), 蛍光スペクトル(EtOH)（図１）: λ_em=533 nm (λ_ex=380 nm), 蛍光量子収率: Φ_f=0.067
また、X線結晶構造解析の結果を図３に、FT-IRスペクトル（KBr法）を図４に示した。図４では、CN基に由来するピークが消失しており、先の結晶構造解析の結果からも環状構造を形成していることがわかる。

化合物 (8)の分析結果を以下に示す。
(8): 無色針状結晶, 分子式：C₁₄H₁₇N₃O₃ (分子量：275.30), 融点：175-176 ℃, MS(ESI)：m/z 298.2 ([M+Na]⁺), 比旋光度： [α]_D ²⁰-51.8 (c 0.1, H₂O)

新規色素(7)の紫外吸収・蛍光スペクトルを示す図。溶媒は、(a)EtOH, (b)0.05M Tris-HCl buffer (pH7.0)である。新規色素(7)の¹H NMRスペクトル (500MHz, D₂O, 25℃) を示す図。新規色素(7)のX線結晶構造を示す図。新規色素(7)のFT-IRスペクトル（KBr法）を示す図。

Claims

一般式（I）で表される化合物またはその塩。

Ｒは炭素数１〜５のアルキルを示す。
Ｒがいずれもメチルである、請求項１に記載の化合物。
請求項１または２に記載の化合物を含む、蛍光標識剤。
請求項１または２に記載の化合物を物質に結合する工程を含む、物質の標識方法。
一般式（II）で表される化合物にL-アミノアシラーゼを作用させる工程を含む、一般式（I）で表される化合物の製造方法。

一般式（I）、（II）において、Ｒは炭素数１〜５のアルキルを示す。