JP2009103687A - 細胞分析装置及び細胞分析方法 - Google Patents

Abstract

【課題】フローサイトメトリー法を用いて、２０〜１００μｍ程度の大きさを有する細胞を高精度に測定することができる細胞分析装置を提供する。
【解決手段】測定対象細胞を含む測定試料を流すフローセル５１と、このフローセル５１を流れる測定試料にレーザ光を照射する光源部５３と、前記測定試料の流れ方向の径が３〜８μｍであり、当該測定試料の流れに直交する方向の径が３００〜６００μｍであるビームスポットを、前記フローセル５１を流れる測定試料上に形成し得る光学系５２と、レーザ光が照射された測定試料からの光を受光する受光部５５、５８、５９とを備えている。
【選択図】 図５

Description

本発明は細胞分析装置及び細胞分析方法に関する。さらに詳しくは、フローセルを流れる測定試料にレーザ光を照射し、当該測定試料からの光を利用して測定試料に含まれる細胞の分析を行う細胞分析装置及び細胞分析方法に関する。

フローサイトメトリー法を用いて、血球を含む測定試料にレーザ光を照射し、測定試料からの散乱光や蛍光を利用して、血液中の白血球および当該白血球の核を測定する分析装置が知られている（例えば、特許文献１参照）。
前記特許文献１に記載のフローサイトメトリー法は、１０μｍ前後の大きさの白血球を測定するために用いられている。したがって、特許文献１に記載の分析装置においては、例えば子宮頸部の上皮細胞のように、２０〜１００μｍ程度の大きさを有する細胞を高精度に測定することは困難であった。

特開平２−９３３４２号公報

本発明は、このような事情に鑑みてなされたものであり、フローサイトメトリー法を用いて、２０〜１００μｍ程度の大きさを有する細胞を高精度に測定することができる細胞分析装置及び細胞分析方法を提供することを目的としている。

本発明の細胞分析装置は、測定対象細胞を含む測定試料を流すフローセルと、このフローセルを流れる測定試料に光を照射する光源部と、前記測定試料の流れ方向の径が３〜８μｍであり、当該測定試料の流れに直交する方向の径が３００〜６００μｍであるビームスポットを、前記フローセルを流れる測定試料上に形成し得る光学系と、前記測定試料からの光を受光する受光部とを備えていることを特徴としている。

本発明の細胞分析方法は、フローセルを流れる測定試料に光を照射して、当該測定試料からの光を利用して測定試料に含まれる測定対象細胞を分析する細胞分析方法であって、前記測定試料の流れ方向の径が３〜８μｍであり、当該測定試料の流れに直交する方向の径が３００〜６００μｍであるビームスポットを、前記フローセルを流れる測定試料上に形成することを特徴としている。

本発明の細胞分析装置及び細胞分析方法によれば、フローサイトメトリー法を用いて、２０〜１００μｍ程度の大きさを有する細胞を高精度に測定することができる。

以下、添付図面を参照しつつ、本発明の細胞分析装置及び細胞分析方法の実施の形態を詳細に説明する。
［細胞分析装置の全体構成］
図１は、本発明の一実施の形態に係る細胞分析装置１０の斜視説明図である。この細胞分析装置１０は、患者から採取した細胞を含む測定試料をフローセルに流し、このフローセルを流れる測定試料にレーザ光を照射し、測定試料からの光（前方散乱光、側方蛍光など）を検出・分析することで、前記細胞に癌・異型細胞が含まれているか否かを判断するのに用いられ、具体的には、子宮頸部の上皮細胞を用いて子宮頸癌をスクリーニングするのに用いられる。細胞分析装置１０は、試料の測定などを行う装置本体１２と、この装置本体１２に接続され、測定結果の分析などを行うシステム制御部１３とを備えている。

図２は、図１に示される細胞分析装置１０の構成を示すブロック図である。細胞分析装置１０の装置本体１２は、測定試料から細胞や核のサイズなどの情報を検出するための光学検出部３と、信号処理回路４と、測定制御部１６と、モータ、アクチュエータ、バルブなどの駆動部１７と、各種センサ１８とを備えている。信号処理回路４は、光学検出部３の出力をプリアンプ（図示せず）により増幅したものに対して増幅やフィルタ処理等を行うアナログ信号処理回路と、アナログ信号処理回路の出力をデジタル信号に変換するＡ／Ｄコンバータと、デジタル信号に対して所定の波形処理を行うデジタル信号処理回路とを備えている。また、測定制御部１６が、センサ１８の信号を処理しつつ駆動部１７の動作を制御することにより、測定試料の吸引や測定が行われる。子宮頸癌をスクリーニングする場合、測定試料としては、患者の子宮頸部から採取した細胞（上皮細胞）に遠心（濃縮）、希釈（洗浄）、攪拌（タッピング）、ＰＩ染色などの公知の処理を施して調製されたものを用いることができる。調製された測定試料は試験管に収容され、装置本体１２のピペット（図示せず）下方位置に設置され、当該ピペットにより吸引されてフローセルに供給される。上記ＰＩ染色は、蛍光染色液であるヨウ化プロピジウム（ＰＩ）により行われる。ＰＩ染色では核に選択的に染色が施されるため、核からの蛍光が検出可能となる。

［測定制御部の構成］
測定制御部１６は、マイクロプロセッサ２０、記憶部２１、Ｉ／Ｏコントローラ２２、センサ信号処理部２３、駆動部制御ドライバ２４、及び外部通信コントローラ２５などを備えている。記憶部２１は、ＲＯＭ、ＲＡＭなどからなり、ＲＯＭには、駆動部１７を制御するための制御プログラム、及び、制御プログラムの実行に必要なデータが格納されている。マイクロプロセッサ２０は、制御プログラムをＲＡＭにロードし、又はＲＯＭから直接実行することが可能である。

マイクロプロセッサ２０には、センサ１８の信号がセンサ信号処理部２３及びＩ／Ｏコントローラ２２を通じて伝達される。マイクロプロセッサ２０は、制御プログラムを実行することにより、センサ１８の信号に応じて、Ｉ／Ｏコントローラ２２及び駆動部制御ドライバ２４を介して駆動部１７を制御することができる。
マイクロプロセッサ２０が処理したデータや、マイクロプロセッサ２０の処理に必要なデータは、外部通信コントローラ２５を介してシステム制御部１３などの外部の装置との間で送受信される。

［システム制御部の構成］
図３は、システム制御部１３のブロック図である。システム制御部１３は、パーソナルコンピュータなどからなり、本体２７と、表示部２８と、入力部２９とから主に構成されている。本体２７は、ＣＰＵ２７ａと、ＲＯＭ２７ｂと、ＲＡＭ２７ｃと、ハードディスク２７ｄと、読出装置２７ｅと、入出力（Ｉ／Ｏ）インターフェース２７ｆと、画像出力インターフェース２７ｇと、から主に構成されている。これらの間は、バス２７ｈによって通信可能に接続されている。

ＣＰＵ２７ａは、ＲＯＭ２７ｂに記憶されているコンピュータプログラム及びＲＡＭ２７ｃにロードされたコンピュータプログラムを実行することが可能である。ＲＯＭ２７ｂは、マスクＲＯＭ、ＰＲＯＭ、ＥＰＲＯＭ、ＥＥＰＲＯＭなどによって構成されており、ＣＰＵ２７ａに実行されるコンピュータプログラム及びこれに用いるデータなどが格納されている。ＲＡＭ２７ｃは、ＳＲＡＭ又はＤＲＡＭなどによって構成されている。ＲＡＭ２７ｃは、ＲＯＭ２７ｂ及びハードディスク２７ｄに記録されているコンピュータプログラムの読み出しに用いられる。また、これらのコンピュータプログラムを実行するときに、ＣＰＵ２７ａの作業領域として利用される。

ハードディスク２７ｄは、オペレーティングシステム及びアプリケーションプログラムなど、ＣＰＵ２７ａに実行させるための種々のコンピュータプログラム及びそのコンピュータプログラムの実行に用いるデータがインストールされている。例えば、ハードディスク２７ｄには、米マイクロソフト社が製造販売するWindows（登録商標）などのグラフィカルユーザーインターフェース環境を提供するオペレーティングシステムがインストールされている。
また、ハードディスク２７ｄには、細胞分析装置１０の測定制御部１６への測定オーダ（動作命令）の送信、装置本体１２で測定した測定結果の受信及び処理、処理した分析結果の表示などを行う操作プログラムがインストールされている。この操作プログラムは、当該オペレーティングシステム上で動作するものとしている。

読出装置２７ｅは、フレキシブルディスクドライブ、ＣＤ−ＲＯＭドライブ、又はＤＶＤ−ＲＯＭドライブなどによって構成されており、可搬型記録媒体に記録されたコンピュータプログラム又はデータを読み出すことができる。Ｉ／Ｏインターフェース２７ｆは、例えば、ＵＳＢ、ＩＥＥＥ１３９４、ＲＳ−２３２Ｃなどのシリアルインタフェース、ＳＣＳＩ、ＩＤＥ、ＩＥＥＥ１２８４などのパラレルインタフェース、及びＤ／Ａ変換器、Ａ／Ｄ変換器などからなるアナログインタフェースなどから構成されている。Ｉ／Ｏインターフェース２７ｆには、キーボード及びマウスからなる入力部２９が接続されており、ユーザーが入力部２９を使用することにより、パーソナルコンピュータにデータを入力することが可能である。また、Ｉ／Ｏインターフェース２７ｆは、装置本体１２と接続されており、装置本体１２との間でデータ等の送受信を行うことが可能である。
画像出力インターフェース２７ｇは、ＬＣＤ又はＣＲＴなどで構成された表示部２８に接続されており、ＣＰＵ２７ａから与えられた画像データに応じた映像信号を表示部２８に出力するようになっている。表示部２８は、入力された映像信号にしたがって、画像（画面）を表示する。

［光学検出部の構成］
図４は、光学検出部３の構成を示す図である。図において、レンズ系（光学系）５２は、光源である半導体レーザ５３から放射されたレーザ光を、フローセル５１を流れる測定試料に集光し、集光レンズ５４は測定試料中の細胞の前方散乱光を散乱光検出器であるフォトダイオード５５に集光する。上記レンズ系５２は、簡単のために単一のレンズとして図示しているが、より詳細には、図８及び図９に示すように、半導体レーザ５３側からコリメータレンズ５２ａ、シリンダーレンズ系（平凸シリンダーレンズ５２ｂ＋両凹シリンダーレンズ５２ｃ）及びコンデンサレンズ系（コンデンサレンズ５２ｄ＋コンデンサレンズ５２ｅ）からなるレンズ群として構成することができる。

図８に示されるように、光学検出部３を側面から見ると、半導体レーザ５３から発せられた放射状のレーザ光は、コリメータレンズ５２ａで平行光に変換され、平凸シリンダーレンズ５２ｂ及び両凹シリンダーレンズ５２ｃを屈折することなく通過し、コンデンサレンズ５２ｄ及びコンデンサレンズ５２ｅによりフローセル５１を流れる測定試料中の第１集光点Ａに集光される。

一方、図９に示されるように、光学検出部３を上方から見ると、半導体レーザ５３から発せられた放射状のレーザ光は、コリメータレンズ５２ａで平行光に変換され、平凸シリンダーレンズ５２ｂにより測定試料の流れに直交する方向に収束され、両凹シリンダーレンズ５２ｃにより測定試料の流れに直交する方向に発散され、コンデンサレンズ５２ｄ及びコンデンサレンズ５２ｅによりフローセル５１の後方の第２集光点Ｂに集光される。

このようなレンズ系５２により、第１集光点Ａにおけるビーム形状（半導体レーザ５３側から見たビーム形状）は、測定試料の流れ方向に収束し、測定試料の流れに直交する方向に延びた長楕円形状となる。具体的には、フローセル５１を流れる測定試料の流れ方向の径が３〜８μｍであり、測定試料の流れに直交する方向の径が３００〜６００μｍであるビームスポットが、その第１集光点Ａを測定試料の流れ方向を通る平面上に形成しつつ、フローセル５１を流れる測定試料に照射される。

なお、フローセル５１を流れる測定試料上に形成される光（ビームスポット）を、測定試料の流れ方向の径を３〜８μｍに形成し、測定試料の流れに直交する方向の径を３００〜６００μｍに形成することができるのであれば、レンズ系５２は上記の構成に限定されるものではなく、適宜変更してもよい。

他の集光レンズ５６は前記細胞又は細胞中の核の側方散乱光と側方蛍光とをダイクロイックミラー５７に集光する。ダイクロイックミラー５７は、側方散乱光を散乱光検出器であるフォトマルチプライヤ５８へ反射し、側方蛍光を蛍光検出器であるフォトマルチプライヤ５９の方へ透過させる。これらの光は、測定試料中の細胞や核の特徴を反映したものとなっている。そして、フォトダイオード５５、フォトマルチプライヤ５８及びフォトマルチプライヤ５９は、検出した光を電気信号に変換し、それぞれ、前方散乱光信号（ＦＳＣ）、側方散乱光信号（ＳＳＣ）及び側方蛍光信号（ＳＦＬ）を出力する。これらの出力は、図示しないプリアンプにより増幅された後、前述した信号処理回路４（図２）に供される。

信号処理回路４でフィルタ処理やＡ／Ｄ変換処理等の信号処理が施されて得られた前方散乱光データ、側方散乱光データ及び側方蛍光データ（ＳＦＬ）は、マイクロプロセッサ２０によって、外部通信コントローラ２５を介して、前述したシステム制御部１３へ送られる。システム制御部１３では、前方散乱光データ、側方散乱光データ及び側方蛍光データに基づいて、細胞や核を分析するためのスキャッタグラムが作成される。また、システム制御部１３は、信号処理回路４から受信した測定データを用いて、測定試料中の細胞が異常であるか否か、具体的には、癌化した細胞又は異型細胞であるか否かを判断する。
なお、光源として、前記半導体レーザに代えてガスレーザを用いることもできるが、低コスト、小型、且つ低消費電力である点で半導体レーザを採用することが好ましく、半導体レーザの採用により製品コストを低減させるとともに、装置の小型化及び省電力化を図ることができる。本実施の形態では、ビームを狭く絞ることに有利な波長の短い青色半導体レーザを用いている。青色半導体レーザは、ＰＩ等の蛍光励起波長に対しても有効である。なお、半導体レーザのうち、低コスト且つ長寿命であり、メーカーからの供給が安定している赤色半導体レーザを用いてもよい。

本発明では、光学系である前記レンズ系５２によって、特定の大きさのビームスポットが形成される。具体的には、フローセル５１を流れる測定試料の流れ方向の径が３〜８μｍであり、測定試料の流れに直交する方向の径が３００〜６００μｍである、略楕円形のビームスポットが測定試料上に形成される。図５はビームスポットを通過する細胞の説明図であり、図において上下方向がフローセルを流れる測定試料の流れ方向である。図５において、右側のビームスポットは血液中の赤血球や白血球を検出するのに用いられている従来の一般的装置におけるビームスポットであり、左側のビームスポットは本発明の細胞分析装置の光学系により形成されるビームスポットである。作図上、ビームスポットの長手方向の寸法は、これと直交する方向（図において上下方向）の寸法に比べて縮小して描いているが、本発明の実際のビームスポットは、非常に細長い断面形状を呈している。

子宮頸部の上皮細胞の大きさは約６０μｍであり、また核の大きさは５〜７μｍである。この細胞が癌化・異型化すると細胞分裂の頻度が異常に多くなり、核は１０〜１５μｍの大きさとなる。これにより、Ｎ／Ｃ比（核の大きさ／細胞の大きさ）が正常な細胞に比べて大きくなる。したがって、細胞と核の大きさを検出することによって、細胞が癌化・異型化したか否かの判断指標とすることができる。

そこで、本実施の形態では、フローセルを流れる測定試料からの散乱光をフォトダイオード５５で検出するとともに、フローセルを流れる測定試料からの蛍光をフォトマルチプライヤ５９で検出し、信号処理回路４で、フォトダイオード５５から出力された散乱光信号から測定対象細胞の大きさを反映した値である散乱光信号のパルス幅を取得するとともに、フォトマルチプライヤ５９から出力された蛍光信号から測定対象細胞の核の大きさを反映した値である蛍光信号のパルス幅を取得している。図１０は光学検出部３により検出された光の信号波形を示す図であり、縦軸は検出された光の強度を示し、横軸は光の検出時間を示している。図１０に示されるように、パルス幅とは信号波形の幅を表し、本実施の形態では、ベースラインより大きい強度を示す信号波形の幅をパルス幅として用いている。ベースラインは適宜設定することができる。散乱光信号のパルス幅は、測定対象細胞がフローセル中の感知領域を通過している間の通過時間を示し、蛍光信号のパルス幅は、測定対象細胞の核がフローセル中の感知領域を通過している間の通過時間を示す。この信号処理回路４で得られた、測定対象細胞の大きさを反映した値（散乱光信号のパルス幅）及び測定対象細胞の核の大きさを反映した値（蛍光信号のパルス幅）に基づいて、測定対象細胞が異常であるか否かを分析部であるシステム制御部１３で行うように構成されている。具体的には、システム制御部１３は、蛍光信号のパルス幅を散乱光信号のパルス幅で除した値が所定の閾値より大きい場合に、測定対象細胞が異常であると判定する。

ビームスポットにおける、測定試料の流れ方向の径を３〜８μｍとしていることから、核検出のＳ／Ｎ比を向上させることができ、核の大きさを高精度に検出することができる。本実施の形態では、核にＰＩ染色を施し、核の大きさを反映した値として核からの蛍光信号のパルス幅を用いているが、ＰＩ染色では、核以外に細胞膜も若干染色され、また、染色に用いた染料の残りがフローセルを流れることから、核以外からも蛍光が生じる。そのため、蛍光検出器であるフォトマルチプライヤ５９は、核以外からのノイズとなる蛍光も検出することになる。しかしながら、光学検出部３のレンズ系５２によりビームスポットにおける測定試料の流れ方向の径が３〜８μｍと小さくされるため、核から生じる蛍光と核以外から生じる蛍光とをより明確に峻別することができる。すなわち、核の大きさ（５〜７μｍ）を考慮してビームスポットの径を３〜８μｍと小さくすることによって、ノイズを減らして蛍光信号のパルスの立ち上がりをシャープにしてパルス幅を精度よく測定することができる。その結果、核の大きさを高精度に検出することができる。

ビームスポットにおける前記流れ方向の径を３μｍよりも小さくしようとすると、レンズ系５２の焦点距離を短くする必要があり、レーザ光の強度が安定な領域（焦点深度）が浅くなる。図１１は、測定試料の流れ方向におけるビーム形状を示す図である。図１１に示されるように、焦点深度は、ビーム径がビームスポットにおけるビーム径Ｄの１．１倍になるまでの領域を示し、ビーム径が大きくなるにつれて光の強度は弱くなる。焦点深度が浅くなると、２０〜１００μｍ程度の大きさを有する細胞の核にレーザ光を安定的に照射することができなくなる。一方、前記流れ方向の径が８μｍよりも大きくなると、核以外から生じるノイズとなる蛍光の検出割合が大きくなる。そのため、蛍光信号のパルスの立ち上がりがなだらかになり、蛍光信号のパルス幅の範囲がぼやけてしまうため、測定精度が低下する。また、複数の細胞の核がビームスポット内を同時に通過する頻度が多くなり、この点からも測定精度が低下する。そのため、上記の焦点深度を考慮して、ビームスポットにおける、測定試料の流れ方向の径を選定するのが好ましい。具体的には、測定試料の流れ方向に絞られたレーザ光の焦点深度が２０〜１１０μｍとなるようにビームスポットを形成するのが好ましい。なお、レーザ光を安定的に核に照射するためには、ビームスポットの上記流れ方向の径は、３．５〜７．５μｍであることが好ましく、より好ましいのは４〜７μｍである。

また、ビームスポットにおける、測定試料の流れに直交する方向の径が３００〜６００μｍの範囲にあることから、子宮頸部の上皮細胞（約６０μｍ程度）全体をレーザビームの安定領域（ガウス分布をなすレーザ光のピーク強度を１とすると、強度が０．９５以上となる領域のこと）を通過させることができる。これにより、細胞から安定した散乱光を得ることができ、細胞の大きさを高精度に測定することができる。流れに直交する方向の径が３００μｍよりも小さくなると、レーザビームの安定領域が狭くなり、細胞からの安定した散乱光が得られなくなる。一方、流れに直交する方向の径が６００μｍよりも大きくなると、中心付近のレーザ光の強度が弱くなり、やはり安定した散乱光が得られなくなる。なお、細胞から安定した散乱光を得るためには、測定試料の流れに直交する方向の径は、３５０〜５５０μｍであることが好ましい。

［細胞分析方法］
つぎに、細胞分析装置１０（図１）を用いた細胞分析方法の実施の形態について説明する。

まず、フローセルに流す測定試料の調製が使用者の手動により行われる。具体的には、患者の子宮頸部から採取した細胞（上皮細胞）に遠心（濃縮）、希釈（洗浄）、攪拌、ＰＩ染色などの公知の処理を施すことで測定試料が調製される。ついで、使用者により、調製された測定試料が試験管（図示せず）に収容され、試験管が装置本体のピペット（図示せず）下方位置に設置される。

次に、図１２及び図１３を参照して、システム制御部１３の処理の流れについて説明する。まず、システム制御部１３の電源が入れられると、システム制御部１３のＣＰＵ２７ａは、システム制御部１３に格納されているコンピュータプログラムの初期化を行う（ステップＳ１）。次に、ＣＰＵ２７ａは、使用者からの測定指示を受け付けたか否かを判断し（ステップＳ２）、測定指示を受け付けた場合には、Ｉ／Ｏインターフェイス２７ｆを介して、測定開始信号を装置本体１２に送信する（ステップＳ３）。測定指示を受け付けなかった場合には、ＣＰＵ２７ａは、ステップＳ６の処理に移行する。

測定開始信号が装置本体１２に送信されると、装置本体１２において、試験管に収容された測定試料がピペットにより吸引されて図４に示すフローセル５１に供給される。そして、フローセル５１を流れる測定試料にレーザ光が照射され、測定試料からの前方散乱光がフォトダイオード５５により検出され、側方散乱光がフォトマルチプライヤ５８で検出され、側方蛍光がフォトマルチプライヤ５９により検出される。

ついで、光学検出部３から出力された前方散乱光信号（ＦＳＣ）、側方散乱光信号（ＳＳＣ）、蛍光信号（ＳＦＬ）が信号処理回路４に供され、信号処理回路４で所定の処理が施されて得られた測定データは、外部通信コントローラ２５を介して、システム制御部１３に送信される。

一方、システム制御部１３のＣＰＵ２７ａは、装置本体１２から、外部通信コントローラ２５を介して測定データを受信したか否かを判断し（ステップＳ４）、測定データを受信した場合には、細胞分析処理を実行する（ステップＳ５）。測定データを受信しなかった場合には、ＣＰＵ２７ａは、ステップＳ６の処理に移行する。

細胞分析処理の後、ＣＰＵ２７ａは、シャットダウン指示を受け付けたか否かを判断し（ステップＳ６）、シャットダウン指示を受け付けた場合には、処理を終了する。シャットダウン指示を受け付けなかった場合には、ＣＰＵ２７ａは、ステップＳ２の処理に戻る。

次に、図１３を参照して、ステップＳ５の細胞分析処理について説明する。まず、ＣＰＵ２７ａは、装置本体１２から受信した測定データをハードディスク２７ｄに記憶する（ステップＳ５１）。

次に、ＣＰＵ２７ａは、測定データに含まれる前方散乱光データの特徴パラメータ情報（散乱光信号のパルス幅（ＦＳＣＷ））及び側方蛍光データの特徴パラメータ情報（蛍光信号のパルス幅（ＳＦＬＷ））から、蛍光信号のパルス幅を散乱光信号のパルス幅で除した値（ＦＳＣＷ／ＳＦＬＷ）を取得し（ステップＳ５２）、取得した値をＲＡＭ２７ｃに記憶する（ステップＳ５３）。

そして、ＣＰＵ２７ａは、蛍光信号のパルス幅を散乱光信号のパルス幅で除した値（ＦＳＣＷ／ＳＦＬＷ）を、所定の閾値Ｔと比較することにより、細胞が異常細胞か否かを判別する（ステップＳ５４）。ここで、次の式（１）が成立している場合は、対象の細胞は異常細胞であり、式（１）が成立していない場合は、対象の細胞は正常細胞である。
ＦＳＣＷ／ＳＦＬＷ≦Ｔ・・・（１）

以上の実施の形態では、散乱光から求められる細胞の大きさを反映する値と、蛍光から求められる核の大きさを反映する値とから、細胞の癌化・異型化を判断しているが、核の大きさと、この核に含まれるＤＮＡ量とから細胞の癌化・異型化を判断することもできる。以下、核の大きさと、核中のＤＮＡ量とから細胞の癌化・異型化を判断する第２実施形態について説明する。

第２実施形態では、装置本体１２において、フローセルを流れる測定試料からの蛍光がフォトマルチプライヤ５９で検出され、信号処理回路４で、フォトマルチプライヤ５９から出力された蛍光信号に基づいて、測定対象細胞の核の大きさを反映した値と、核中のＤＮＡ量を反映した値とが取得される。細胞の核の大きさを反映する値としては、前述したように、蛍光信号のパルス幅（ＳＦＬＷ）とすることができ、また、核中のＤＮＡ量を反映する値としては蛍光信号のパルスの面積（ＳＦＬＩ）とすることができる。図１０に示されるように、蛍光信号のパルスの面積（蛍光量）は、ベースラインと蛍光信号波形とで囲まれた部分の面積を表す。ベースラインは適宜設定することができる。細胞が癌化・異型化すると、細胞分裂が活発化する結果、ＤＮＡ量が多くなるとともに核自体の大きさが大きくなる。したがって、核の大きさとＤＮＡ量の両者を癌化・異型化の指標とすることにより、細胞が癌化・異型化したか否かを高精度に判断することができる。

図６は、大部分が癌化・異型化していない正常な細胞である測定試料を測定することにより得られたＤＮＡ量の分布例を示しており、横軸において、出現頻度がピークを迎えるＤＮＡ量を「１」とし、その２倍のＤＮＡ量を「２」としている。右側のピークは正常な細胞分裂をしている細胞によるものである。細胞が癌化・異型化して異常な細胞分裂が行われるようになると、上記「２」で示される位置よりも右側のＤＮＡ量を有する細胞の分布が多くなる。

システム制御部１３のＣＰＵ２７ａは、信号処理回路４で得られた、核の大きさを反映した蛍光信号のパルス幅（ＳＦＬＷ）及び核のＤＮＡ量を反映した蛍光信号のパルスの面積（ＳＦＬＩ）を含む測定データを外部通信コントローラ２５を介して装置本体１２から受信すると、第２細胞分析処理を実行する。

図１４は、システム制御部１３のＣＰＵ２７ａによる第２細胞分析処理を示すフローチャートである。以下、図１４を参照して、第２細胞分析処理について説明する。まず、ＣＰＵ２７ａは、装置本体１２から受信した測定データをハードディスク２７ｄに記憶する（ステップＳ５０１）。

次に、ＣＰＵ２７ａは、測定データに含まれる側方蛍光データの特徴パラメータ情報（蛍光信号のパルス幅（ＳＦＬＷ）及び蛍光信号のパルスの面積（ＳＦＬＩ））をＲＡＭ２７ｃに読み出す（ステップＳ５０２）。

次に、ＣＰＵ２７ａは、蛍光信号のパルス幅（ＳＦＬＷ）を縦軸にとり、蛍光信号のパルスの面積（ＳＦＬＩ）を横軸にとったＳＦＬＷ−ＳＦＬＩスキャッタグラムを作成する（ステップＳ５０３）。ＳＦＬＷ−ＳＦＬＩスキャッタグラムの一例を図７に示す。図７は、ＤＮＡ量と核の大きさとの関係を示しており、左下の領域に分布しているのが正常な細胞群である。細胞が癌化・異型化すると、核が大きくなるとともに、ＤＮＡ量も多くなることから、癌化・異型化した細胞は、図７において右上の領域に分布する。したがって、ＤＮＡ量及び核の大きさについて領域Ｇに含まれる細胞を癌・異型細胞と判断することができる。

続いて、ＣＰＵ２７ａは、蛍光信号のパルス幅（ＳＦＬＷ）を所定の閾値Ｍと比較し、蛍光信号のパルスの面積（ＳＦＬＩ）を所定の閾値Ｎと比較することにより、細胞が異常細胞か否かを判別する（ステップＳ５０４）。具体的には、ＣＰＵ２７ａは、次の式（２）(３)の両方が成立している場合は、対象の細胞を異常細胞と判定し、式（２）(３)の少なくとも一方が成立していない場合は、対象の細胞を正常細胞と判定する。
ＳＦＬＷ≧Ｍ・・・（２）
ＳＦＬＩ≧Ｎ・・・（３）

なお、今回開示された実施の形態は、すべての点で例示であって制限的なものではないと考えられるべきである。本発明の範囲は、上記した実施の形態の説明ではなく特許請求の範囲によって示され、さらに特許請求の範囲と均等の意味および範囲内でのすべての変更が含まれる。

たとえば、本実施の形態では、子宮頸部の細胞の癌化・異型化を検出しているが、本発明はこれに限られない。口腔細胞、膀胱や咽頭など他の上皮細胞、さらには臓器の細胞の癌化・異型化を検出するのに用いてもよい。

また、本実施の形態では、測定対象細胞の大きさを反映した値として散乱光信号のパルス幅を用い、測定対象細胞の核の大きさを反映した値として蛍光信号のパルス幅を用いているが、本発明はこれに限られない。測定対象細胞の大きさを反映した値として散乱光信号のパルスの高さを用い、測定対象細胞の核の大きさを反映した値として蛍光信号のパルスの高さを用いてもよい。

また、本実施の形態では、測定対象細胞の核の大きさを示す値を測定対象細胞の大きさを示す値で除した値が所定の閾値よりも大きい場合に、測定対象細胞を異常と判定しているが、本発明はこれに限られない。測定対象細胞の大きさを示す値を測定対象細胞の核の大きさを示す値で除した値が所定の閾値よりも小さい場合に、測定対象細胞を異常と判定してもよい。

本発明の細胞分析装置の一実施の形態の斜視説明図である。 図１に示される細胞分析装置の構成を示すブロック図である。 システム制御部を構成するパソコンのブロック図である。 光学検出部の構成を示す図である。 ビームスポットを通過する細胞の説明図である。 ＤＮＡ量の分布例を示す図である。 ＤＮＡ量と核の大きさとの関係を示すスキャッタグラムである。 光学検出部の側面図である。 光学検出部の平面図である。 信号波形と特徴パラメータとの関係を示す説明図である。 測定試料の流れ方向におけるビーム形状を示す図である。 システム制御部のＣＰＵによる処理の流れを示すフローチャートである。 システム制御部のＣＰＵにより細胞分析処理を示すフローチャートである。 システム制御部のＣＰＵによる第２細胞分析処理を示すフローチャートである。

符号の説明

３ 光学検出部
４ 信号処理回路
１０ 細胞分析装置
１２ 装置本体
１３ システム制御部
１６ 測定制御部
２７ 本体
２８ 表示部
２９ 入力部
５１ フローセル
５２ レンズ系
５３ 半導体レーザ
５４ 集光レンズ
５５ フォトダイオード
５６ 集光レンズ
５７ ダイクロイックミラー
５８ フォトマルチプライヤ
５９ フォトマルチプライヤ

Claims (11)

1. 測定対象細胞を含む測定試料を流すフローセルと、
   このフローセルを流れる測定試料に光を照射する光源部と、
   前記測定試料の流れ方向の径が３〜８μｍであり、当該測定試料の流れに直交する方向の径が３００〜６００μｍであるビームスポットを、前記フローセルを流れる測定試料上に形成し得る光学系と、
   前記測定試料からの光を受光する受光部と
   を備えていることを特徴とする細胞分析装置。
2. 前記受光部が、フローセルを流れる測定試料からの散乱光を検出する散乱光検出器と、フローセルを流れる測定試料からの蛍光を検出する蛍光検出器とを備えており、
   前記細胞分析装置が、
   前記散乱光検出器から出力される散乱光信号から測定対象細胞の大きさを反映した値を取得するとともに、前記蛍光検出器から出力される蛍光信号から測定対象細胞の核の大きさを反映した値を取得する信号処理部と、
   この信号処理部で得られた、測定対象細胞の大きさを反映した値及び測定対象細胞の核の大きさを反映した値に基づいて、当該測定対象細胞が異常であるか否かを判定する分析部と
   をさらに備えている請求項１に記載の細胞分析装置。
3. 前記信号処理部が、測定対象細胞の大きさを反映した値として、散乱光信号のパルス幅を取得するとともに、測定対象細胞の核の大きさを反映した値として、蛍光信号のパルス幅を取得し、且つ
   前記分析部が、蛍光信号のパルス幅を散乱光信号のパルス幅で除した値が所定の閾値より大きい場合に、測定対象細胞が異常であると判定するように構成されている請求項２に記載の細胞分析装置。
4. 前記受光部が、フローセルを流れる測定試料からの蛍光を検出する蛍光検出器を備えており、
   前記細胞分析装置が、
   前記蛍光検出器から出力された蛍光信号から、測定対象細胞の核の大きさを反映した値と、測定対象細胞の核のＤＮＡ量を反映した値とを取得する信号処理部と、
   この信号処理部で得られた、測定対象細胞の核の大きさを反映した値及び測定対象細胞の核のＤＮＡ量を反映した値に基づいて、当該測定対象細胞が異常であるか否かを判定する分析部と
   をさらに備えている請求項１に記載の細胞分析装置。
5. 測定試料の流れ方向に絞られた光の焦点深度が２０〜１１０μｍとなるようにビームスポットが形成される請求項１〜４のいずれかに記載の細胞分析装置。
6. 前記測定対象細胞が、上皮細胞である請求項１〜５のいずれかに記載の細胞分析装置。
7. フローセルを流れる測定試料に光を照射して、当該測定試料からの光を利用して測定試料に含まれる測定対象細胞を分析する細胞分析方法であって、
   前記測定試料の流れ方向の径が３〜８μｍであり、当該測定試料の流れに直交する方向の径が３００〜６００μｍであるビームスポットを、前記フローセルを流れる測定試料上に形成することを特徴とする細胞分析方法。
8. フローセルを流れる測定試料から、散乱光及び蛍光を検出する検出工程と、
   前記散乱光から生成された散乱光信号から測定対象細胞の大きさを反映した値を取得するとともに、前記蛍光から生成された蛍光信号から測定対象細胞の核の大きさを反映した値を取得する取得工程と、
   測定対象細胞の大きさを反映した値及び測定対象細胞の核の大きさを反映した値に基づいて、当該測定対象細胞が異常であるか否かを判定する判定工程と
   を含む請求項７に記載の細胞分析方法。
9. 前記取得工程が、測定対象細胞の大きさを反映した値として、散乱光信号のパルス幅を取得するとともに、測定対象細胞の核の大きさを反映した値として、蛍光信号のパルス幅を取得することにより実行され、且つ
   前記判定工程が、蛍光信号のパルス幅を散乱光信号のパルス幅で除した値が所定の閾値より大きい場合に、測定対象細胞が異常であると判定することにより実行される請求項８に記載の細胞分析方法。
10. フローセルを流れる測定試料から、蛍光を検出する検出工程と、
    前記蛍光から生成された蛍光信号から測定対象細胞の核の大きさを反映した値及び測定対象細胞の核のＤＮＡ量を反映した値を取得する取得工程と、
    測定対象細胞の核の大きさを反映した値及び測定対象細胞の核のＤＮＡ量を反映した値に基づいて、当該測定対象細胞が異常であるか否かを判定する判定工程と
    を含む請求項７に記載の細胞分析方法。
11. 前記測定対象細胞が、上皮細胞である請求項７〜１０のいずれかに記載の細胞分析方法。

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