JP2009027973A - 卵細胞の培養装置及びその方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】培養器としてのシャーレ20を保持する保持部としての揺動プレート3と、この揺動プレート3を揺動させる揺動部としてのモータ13と、このモータ13の動作を制御する制御部15と、を備え、この制御部15は、シャーレ20中の卵細胞へ物理的刺激を負荷させるように、モータ13を制御して揺動プレート3を揺動させる
【選択図】図1
Description
これらの文献で紹介されている技術は、いずれも卵細胞に物理的刺激(メカニカルストレス)を負荷させることにより、その培養促進を図っている。
即ち、この発明の第1の局面の発明は次のように規定される。
培養器を保持する保持部と、
該保持部を揺動させる揺動部と、
該揺動部の揺動を制御する制御部と、を備え、
該制御部は、前記培養器中の卵細胞へ物理的刺激を負荷させるように、前記揺動部を制御して前記保持部を揺動させる、ことを特徴とする卵細胞の培養装置。
更には、この発明の第3の局面で規定されるように、培養器中の卵細胞が2 mm/sec以下の速度で移動し、かつ1.2 dynes/cm2以下のずり応力が卵細胞に負荷されるように、保持部を揺動させることが好ましい。
図2及び図3に培養装置1の構成を示す。
この培養装置1は揺動プレート3と本体部11とを備えて成る。
保持部としての揺動プレート3は樹脂製のプレートからなり、その上面に防滑層としてシリコンラバー5が貼付されている。このシリコンラバー5はシャーレ等の培養器20に吸着する。これにより、揺動プレート3が傾斜しても培養器20は不動であり、揺動プレート3から滑り落ちることはない。なお、培養器20の滑落をより確実に防止するためには、培養器20の底壁を挟む凸部を揺動プレート3に形成することができる。
図2及び図3に示す例では、揺動プレート3のほぼ中央にモータの回転軸14が固定され、揺動プレート3はその中央を中心にして揺動する構成を採用しているが、揺動プレート3の端部へモータの回転軸14を連結してもよい。
また、その可動子が上下方向へ移動可能なリニアモータを一対準備して、その一対の可動子で揺動プレート3の両端を支持し、可動子の上下移動を制御することにより揺動プレートの揺動を制御することもできる。
更には、揺動プレートを下方から複数の柱で支え、各柱の高さを変えることで揺動プレートの揺動を制御することもできる。この場合、少なくとも3つの柱で揺動プレートを支持すれば、揺動プレートを任意の方向へ傾斜させることができる。
本培養法は、哺乳類卵細胞の受精前の体外成熟、体外受精、単為発生、体外培養などに適用できる。更には、胚性幹細胞その他の細胞の培養にも適用することができる。
受精卵としては、接合子、卵割、桑実胚、胞胚のいずれの段階のものでもよいが、受精卵以外のライフサイクルにある卵子(例えば、卵胞内卵子、排卵卵子など)を培養容器内で培養し、受精させて用いてもよい。さらに、凍結・融解後の受精卵を用いてもよい。
好ましくは、哺乳動物由来の受精卵が用いられる。哺乳動物としては、例えば、ヒト、サル、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ヒヒ、ブタ、イヌ、ネコ、ウサギ、モルモット、ラット、マウスなどが挙げられる。
以下、この発明の実施例について説明する。
回収したOCCsは、直径35mmの培養用シャーレ(グライナー社製)内の3mlの修正POM でさらに洗浄した後、ウェル(500μl)あたり45〜50個となるように、一晩平衡させた成熟培地に入れ、その後、純水中にeCG(1,000iu/ml濃度)、hCG(1,000iu/ml濃度)およびジブチリルサイクリックAMP(100mM)を溶解した液をウェル(500μl)あたり5μl添加後、5%二酸化炭素炭酸、95%空気の気相条件、39℃に保たれているガス培養器内に入れることで成熟培養を開始した。
対照区の静置培養区は、5%二酸化炭素炭酸、95%空気の気相条件、39℃に保たれているガス培養器内の揺動培養器と同じトレイ上に静置することとした。
OCCsは、これらの条件下で20時間培養後、卵丘細胞塊の構造を壊さないように注意しながら、eCG(1,000iu/ml濃度)、hCG(1,000iu/ml濃度)およびジブチリルサイクリックAMP(100mM)を添加していない新鮮な修正POM3ml(直径35mmの培養用シャーレ内)で3回洗浄後に、4-well培養プレートにeCG(1,000iu/ml濃度)、hCG(1,000iu/ml濃度)およびジブチリルサイクリックAMP(100mM)を添加していない新鮮な修正POM を500μlずつ分注した培地(5%二酸化炭素炭酸、95%空気の気相条件、39℃に保たれているガス培養器内で一晩平衡したもの)に移し、同様の培養条件下でさらに24時間培養した。
図5に、平均卵丘径および平均卵母細胞径を測定したグラフを示す。静置培養区と比較して、揺動培養区では、平均卵丘径は増加しており、平均卵母細胞径は静置培養区とほぼ同じであった。従って、揺動培養によって卵丘細胞膨化が促進されることが示唆された。
その後、それらの卵母細胞を2.2μg/ml サイトカラシンBを含むNCSU37培養液500μl(4-well培養プレート中、5%二酸化炭素炭酸、95%空気の気相条件、39℃に保たれているガス培養器内で一晩平衡したもの)に移して2時間培養することで、活性化された卵の第2極体の放出を抑制して2倍体化した。
その結果を表2に示す。揺動培養区では卵割率および胚盤胞到達率が上昇した。χ2検定により有意確率を計算したところ、有意差があると判断した。
Pcd<0.05 (χ2検定)
Claims (7)
- 培養器を保持する保持部と、
該保持部を揺動させる揺動部と、
該揺動部の動作を制御する制御部と、を備え、
該制御部は、前記培養器中の卵細胞へ物理的刺激を負荷させるように、前記揺動部を制御して前記保持部を揺動させる、ことを特徴とする卵細胞の培養装置。 - 前記制御部は、前記保持部を一方向へ傾斜させ、その後一定時間静止させ、その後反対方向へ傾斜させ、その後一定時間静止させ、以下これを繰返す、ことを特徴とする請求項1に記載の卵細胞の培養装置。
- 前記制御部は、前記培養器中の卵細胞が2 mm/sec以下の速度で移動し、かつ1.2 dynes/cm2以下のずり応力が前記卵細胞に負荷されるように、前記保持部を揺動させることを特徴とする請求項1又は2に記載の卵細胞の培養装置。
- 前記保持部は板状であり、その表面に防滑層が形成され、該防滑層の上に載置された前記培養器は、前記保持部が傾斜状態においても、前記保持部に対して不動である、ことを特徴とする請求項1〜3のいずれかに記載の卵細胞の培養装置。
- 卵細胞を充填した培養器を保持部に保持し、該保持部を揺動させることにより前記卵細胞へ物理的刺激を負荷させる、ことを特徴とする卵細胞の培養方法。
- 前記保持部を一方向へ傾斜させ、その後一定時間静止させ、その後反対方向へ傾斜させ、その後一定時間静止させ、以下これを繰返す、ことを特徴とする請求項5に記載の卵細胞の培養方法。
- 前記培養器中の卵細胞が2 mm/sec以下の速度で移動し、かつ1.2 dynes/cm2以下のずり応力が前記卵細胞に負荷されるように、前記保持部を揺動させることを特徴とする請求項5又は6に記載の卵細胞の培養方法。
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