JP2008542309A - ペプチドベースのインフルエンザワクチン製剤 - Google Patents

ペプチドベースのインフルエンザワクチン製剤 Download PDF

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Abstract

インフルエンザＡ型及びＢ型に対するペプチドベースの抗インフルエンザ製剤を開示する。ペプチドはインフルエンザベースのエピトープに由来する。本製剤は、特定残基に変異性が存在するように処方することができるペプチド混合物に基づく。本製剤は、ヒト、トリ、マウス又はウマにおけるインフルエンザを予防するためのワクチンの製造に使用することができる。
【選択図】 なし

Description

発明の詳細な説明
［関連出願の相互参照］
本願は、２００５年６月１日に出願された米国仮特許出願第６０／６８６，０４１号の優先権の利益を主張し、この仮特許出願は参照により本明細書に組み入れられる。
［発明の分野］
本発明は、概して抗ウイルス製剤に関し、特にペプチドベースのインフルエンザワクチン製剤に関する。
［発明の背景］
インフルエンザは、オルトミクソウイルス科のウイルスに関連する呼吸器系の一般的な感染性疾患である。このウイルスは変異性が高いので、ワクチン接種は通例、株変異を考慮に入れた処方変更済のワクチンを使って、毎年行う必要がある。そのような処方変更にもかかわらず、ある特定シーズン中に世界中の人々に活発に感染するさまざまな株の全てを包含することは、ワクチンには不可能である。
インフルエンザに対して有効なワクチンは現在も入手可能であるが、それらのワクチンは、ウイルスの表面タンパク質における抗原変異のせいで、毎年処方を変更しなければならない。処方変更にとって障害の一つは、インフルエンザ感染の季節的増加に対応するために、十分な量のワクチン量を処方し、製造するには、比較的長い期間が必要なことである。通例、ワクチンの製造には６ヶ月を超える期間が必要な場合があり、時には、その６ヶ月の間に新しいインフルエンザ株又は見過ごしたインフルエンザ株が顕著になって、流行をもたらす。
赤血球凝集素（ＨＡ）はインフルエンザウイルスの主要表面糖タンパク質であり、ウイルス中和抗体がその標的とする強力な免疫原である。インフルエンザウイルスは比較的安定な細胞内核タンパク質及びエンベロープ関連マトリックスタンパク質に基づいて、Ａ型又はＢ型に分類される。ウイルスサブタイプは、絶え間なく抗原変化を起こすウイルスエンベロープ中の２つのタンパク質、ＨＡ及びノイラミニダーゼ（ＮＡ）に基づく。インフルエンザＡ型の場合、ＨＡは１５個の異なるサブタイプ、ＮＡは９個のサブタイプが認識されている（Ｄｅ Ｊｏｎｇ， Ｒｉｍｍｅｌｚｗａａｎ， Ｇ．Ｆ．， Ｆｏｕｃｈｉｅｒ， Ｒ．Ａ．Ｍ．及びＯｓｔｅｒｈａｕｓ， Ａ．Ｄ．Ｍ．Ｅ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ， ２０００；４０：２１８−２２８）。新しいサブタイプが突然出現すること（抗原シフト）により、前世紀には３回の大きな感染爆発が起こっている：１９１８年（スペイン風邪、Ｈ１Ｎ１）、１９５７年（アジア風邪、Ｈ２Ｎ２）及び１９６８年（香港風邪、Ｈ３Ｎ２）。最近は、トリインフルエンザ、ウマインフルエンザ、及び人間における感受性にも関心が持たれている。
ＨＡはインフルエンザウイルスの主要エンベロープ糖タンパク質であり、宿主細胞へのウイルスの侵入を媒介する（Ｗｉｌｅｙ， Ｄ．Ｃ．ら， Ｎａｔｕｒｅ １９８１；２８９（２９）：３７３−３７７；Ｗｉｌｓｏｎ， ＩＡ，ら， Ｎａｔｕｒｅ １９８１；２８９， ３６６−３７３；Ｃａｔｏｎら， Ｃｅｌｌ １９８２：４１７−４２７）。ネイティブＨＡは、３つのＨＡモノマーが会合することによって形成され、それらのモノマーは、ウイルス感染性の前提条件として、アミノ末端ＨＡ１及びカルボキシ末端ＨＡ２に酵素的に切断される。ＨＡ１の三次元構造に基づき、抗原変異体のアミノ酸変化を決定することによって、抗原部位がマッピングされている（Ｗｉｌｅｙ， 前掲）。抗原変異は大半が、抗体が接近することのできない受容体結合ポケット付近の残基を含む、ＨＡの受容体結合領域周辺に見られた。したがって、免疫学的治療法として、ペプチドベースのアプローチを解明することが望まれてきた。しかし、ペプチドベースのサブユニットワクチンの大きな問題は、コンフォメーショナルなＢ細胞及びＴ細胞エピトープを認識することができる抗体の誘導に関する直鎖ペプチドの能力である。これらの抗原部位に対するモノクローナル抗体は、まさにその配列が存在する場合には、インフルエンザウイルスの感染性を中和する。これらの部位にはＴ細胞エピトープとＢ細胞エピトープがどちらも見出される（Ａｔａｓｓｉら， Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ， １９８９；２５１：４９−６３５−６；Ｔｏｒｒｅｓら， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ， １９８８；１９（１）：４９−５３）。
ＨＡ上の抗原部位の一つに対するモノクローナル抗体の存在下でのインフルエンザウイルスの増殖は、親ウイルスでは非常に小さな少数集団であったエスケープ変異体の選択をもたらす（Ｗｅｂｓｔｅｒら， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９８３；１２６（２）：５８７−９９；Ｗｅｂｓｔｅｒら， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９８０；１０４（１）：１３９−４８；Ｙｅｗｄｅｌｌら， Ｎａｔｕｒｅ １９７９；２７９（５７１０）：２４６−８）。これらのインビトロデータと合致して、あるウイルス株に対して免疫し、別のウイルス株に感染された個体は、多様な抗原変異体を産生する。これらのデータは、それらのエピトープに対する集団免疫が、新しいインフルエンザウイルス株の選択にとって、推進力であることを示唆している。
米国において毎年開発されるワクチン製剤は、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ Ａｄｖｉｓｏｒｙ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって決定される。世界保健機関（ＷＨＯ）も同様に、新しいインフルエンザ変異体を検出するために、研究室の世界的監視ネットワークを運営している（Ｌａｖａｎｃｈｙ， Ｖａｃｃｉｎｅ １９９９；１７：Ｓ２４−Ｓ２５）。選択は、最近単離されたインフルエンザウイルスの抗原性解析、抗原変異体の伝播パターン、及び最近ワクチン接種された個体の抗体応答に基づいて行われる。しかし、変化していく免疫戦略の要求を満たすために十分な量のワクチンを効果的に効率よく生産することは、上に概説したワクチン製剤の遅延ゆえに困難だった。したがって、より有効なインフルエンザワクチン製剤を効率よく提供することが望ましい。
［発明の概要］
従来のインフルエンザワクチン製剤の少なくとも一つの欠点を除去又は軽減することが、本発明の目的である。
本発明は、インフルエンザＨＡのエピトープに由来するペプチドベースのインフルエンザワクチン製剤を提供する。有利なことに、本発明のワクチン製剤は、市販のワクチンと比較して、動物モデルにおける体液性応答を改善する。製剤中のペプチド変異体ゆえに、本発明は、さまざまなインフルエンザウイルス株に対する幅広い防御を与えることができる。
驚くべきことに、防御ＨＡエピトープにおけるインフルエンザウイルスの抗原多様性を表現する、本発明によるペプチドベースのインフルエンザワクチン製剤は、インフルエンザの数少ない分離株に基づく市販のワクチンを使って誘導される防御免疫よりも広く反応する防御免疫を誘発する。
第一の態様として、本発明は、配列番号１〜２４８からなる群より選択される少なくとも１個のペプチドを含む、ペプチドベースの抗インフルエンザ製剤を提供する。
本発明のある実施形態では、配列番号１〜２４８からなる群より選択される少なくとも４個のペプチド配列を含む製剤が提供される。別の実施形態では、製剤は、配列番号１〜６４からなる群より選択される少なくとも２個のペプチドと、配列番号１３３〜１８０からなる群より選択される少なくとも２個のペプチドとを含むことができる。この製剤は、配列番号１〜６４と配列番号１３３〜１８０とを含むこともできる。
本発明は、配列番号１８５〜２４８からなる群より選択される少なくとも１個のペプチド配列を含む製剤も提供する。ある実施形態では、製剤は、以下に挙げる群のうち少なくとも２つの群のそれぞれから選択される少なくとも２個のペプチド配列を含むことができる：配列番号１８５〜２００；配列番号２０１〜２１６；配列番号２１７〜２３２；又は配列番号２３３〜２４８。
本発明は、配列番号６５〜１２８からなる群より選択される少なくとも１個のペプチド配列を含む製剤も提供する。ある実施形態では、製剤は、以下に挙げる群のうち少なくとも２つの群のそれぞれから選択される少なくとも２個のペプチド配列を含むことができる：配列番号６５〜８０；配列番号８１〜９６；配列番号９７〜１１２；又は配列番号１１３〜１２８。
本発明の製剤はワクチンの製造に使用することができる。ワクチンの製造にはミョウバン又は他の置換成分などのアジュバントを使用してよい。本ワクチンは、ヒト、マウス、ウマ又はトリなどの動物におけるインフルエンザの治療に使用することができる。
本発明の製剤はインフルエンザＡ型及びＢ型に対して広く反応する。有利なことに、本発明の製剤は、わずか６週間で合成的に製造することができる。
本発明の他の態様及び特徴は、本発明の具体的実施形態に関する以下の説明を添付の図面と合わせて概観することにより、当業者には明白になるだろう。
ほんの一例として、本発明の実施形態を、添付の図面を参照しながら以下に説明する。
［詳細な説明］
本発明は、概して抗ウイルス製剤を提供し、より具体的には、配列番号１〜２４８からなる群より選択される少なくとも１個のペプチドを含むペプチドベースの抗インフルエンザ製剤を提供する。
本発明の製剤は、１個以上のペプチドを含むカクテルである。本製剤は、配列番号１〜２４８からなる群より選択される少なくとも４個のペプチド配列を含むことができる。一例として、本製剤は、配列番号１〜６４からなる群より選択される少なくとも２個のペプチドと、配列番号１３３〜１８０からなる群より選択される少なくとも２個のペプチドとを含むことができる。ある具体例は配列番号１〜６４と配列番号１３３〜１８０とを含む。別の具体例では、製剤が配列番号１〜６４を含む。さらに別の具体例では、製剤が配列番号１８５〜２４８を含む。
別の例として、本製剤は、以下に挙げる群のうち少なくとも２つの群のそれぞれから選択される２ｎ個のペプチド配列を含むことができる：ａ）配列番号１〜１６；ｂ）配列番号１７〜３２；ｃ）配列番号３３〜４８；又はｄ）配列番号４９〜６４（ただし、ｎは１〜４である）。さらに本製剤は、群ａ）〜ｄ）のうち少なくとも２つの群を含むことができる：ａ）配列番号１３３〜１４０から選択される２ｍ個のペプチド配列；ｂ）配列番号１４１〜１５６から選択される２ｎ個のペプチド配列；ｃ）配列番号１５７〜１７２から選択される２ｎ個のペプチド配列；又はｄ）配列番号１７３〜１８０から選択される２ｍ個のペプチド配列（ただし、ｍは１〜３であり、ｎは１〜４である）。この製剤は、ヒト抗インフルエンザワクチンの製造に使用することができる。
本明細書に記載するヒト抗インフルエンザ製剤は単独で使用するか、組み合わせて使用することができる。
別の例として、本発明の製剤は、配列番号１８５〜２４８からなる群より選択される少なくとも１個のペプチド配列を含むことができる。一例として、本製剤は、以下に挙げる群のうち少なくとも２つの群のそれぞれから選択される２ｎ個のペプチド配列を含むことができる：ａ）配列番号１８５〜２００；ｂ）配列番号２０１〜２１６；ｃ）配列番号２１７〜２３２；又はｄ）配列番号２３３〜２４８（ただし、ｎは１〜４である）。この製剤はウマ抗インフルエンザワクチンの製造に使用することができる。
別の例として、本発明の製剤は、配列番号６５〜１２８からなる群より選択される少なくとも１個のペプチド配列を含むことができる。一例として、本製剤は、以下に挙げる群のうち少なくとも２つの群のそれぞれから選択される２ｎ個のペプチド配列を含むことができる：ａ）配列番号６５〜８０；ｂ）配列番号８１〜９６；ｃ）配列番号９７〜１１２；又はｄ）配列番号１１３〜１２８（ただし、ｎは１〜４である）。この製剤はトリ抗インフルエンザワクチンの製造に使用することができる。
ペプチド配列によって表現される変異性がない製剤の一例として、本製剤は、配列番号１２９〜１３２又は配列番号１８１〜１８４の少なくとも一方を含むことができる。具体例の一つとして、本製剤は配列番号１２９〜１３２を含むことができる。別の具体例として、本製剤は、配列番号１８１〜１８４を含むことができる。
本発明は、配列番号１〜２４８からなる群より選択される少なくとも１個のペプチドを含む製剤を薬学的に許容できる希釈剤又は担体と共に含むワクチンも提供する。本ワクチンはさらにアジュバントを含むことができ、そのアジュバントは例えばミョウバンであることができる。
本製剤は、インフルエンザを予防又は治療する必要がある動物におけるインフルエンザを予防又は治療するためのワクチンの製造に使用することができる。動物はヒト、マウス、ウマ又はトリであることができる。
本発明は、配列番号１〜６４からなる群より選択される少なくとも２個のペプチドと、配列番号１３３〜１８０からなる群より選択される少なくとも２個のペプチドとを含む製剤の、ヒトインフルエンザを治療するためのワクチンの製造のための使用に関する。
また本発明は、配列番号１８５〜２４８からなる群より選択される少なくとも１個のペプチド配列を含む製剤の、ウマインフルエンザを治療するためのワクチンの製造のための使用に関する。
さらに本発明は、配列番号６５〜１２８からなる群より選択される少なくとも１個のペプチド配列を含む製剤の、トリインフルエンザを治療するためのワクチンの製造のための使用に関する。
本発明に従って製造されるワクチンは、インフルエンザの予防又は治療に使用することができる。
これらのペプチドの配列は、ペプチドエピトープを決定するためのインフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）タンパク質の結晶構造の解析に基づいて決定される。赤血球凝集素はインフルエンザウイルスの主要表面糖タンパク質であり、ウイルス中和抗体がその標的とする強力な免疫原である。カクテル中の直鎖ペプチドエピトープは、ＨＡタンパク質表面上の不連続エピトープを模倣する。何千ものヒトインフルエンザ単離株から得られるＨＡタンパク質の抗原変異を解析するバイオインフォマティクスソフトウェアを使って、これらのエピトープ内でのＨＡの抗原変異を表現する、これらのエピトープに基づく変性ペプチドカクテルを製造することができる。したがって、本発明のインフルエンザワクチン製剤は、ＨＡタンパク質の主要エピトープを表現するペプチドのカクテルを含む。
ワクチンは、ペプチドごとに、特定残基における変異を表現して、又は特定残基における変異を表現せずに、処方することができる。変異が表現されない場合、形成されるペプチドを、本明細書では、Ｄｉｓｃｏｔｏｐｅ（商標）コンストラクトと呼ぶことができる。ｄｉｓｃｏｔｏｐｅコンストラクトは、不連続エピトープを構成する一次配列断片の位置をまねる直鎖配列合成コンストラクトである。元の完全なタンパク質中に見出される不連続エピトープを認識する免疫応答を誘発するために、個々の断片が順に構築される。
不連続エピトープは、タンパク質の一次配列の２個以上のセグメントから構成され、それらのセグメントは、適正にフォールディングされると一体となって、特異的抗体に結合される。不連続エピトープは二次構造を失うと抗体によって認識されなくなるので、不連続エピトープは、連続的な直鎖ペプチドでは表現されていなかった。
特定の病原体の異なる配列に従って表現される異なるアミノ酸配列を持つことが知られている特定の残基に変異が存在する場合、本製剤はいくつかのペプチドを含み、それらのペプチドを、本明細書では、Ｄｉｓｃｏｓｉｔｅ（商標）コンストラクトと総称することができる。
ペプチドの混合物を処方するには、参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願第１０／０７２，０８４号に概説されているＴｏｒｒｅｓの方法を使用することができる。
Ｄｉｓｃｏｔｏｐｅ／Ｄｉｓｃｏｓｉｔｅコンストラクトの設計
本発明のワクチン製剤では、インフルエンザ赤血球凝集素を使って、四つの不連続エピトープを表現する直鎖配列を設計する。ＨＡの四つの抗原部位にある不連続Ｂ細胞エピトープ及び不連続Ｔ細胞エピトープを模倣する四つのペプチド（ｄｉｓｃｏｔｏｐｅコンストラクト）を設計した。各ｄｉｓｃｏｔｏｐｅコンストラクトは、固相ペプチド合成法を使って合成される。インフルエンザＡ型の２００株を越えるヒト分離株の配列を、Ｇｅｎｂａｎｋ（商標）データベース及びＳｗｉｓｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ（商標）データベースから入手し、これらのエピトープの組成を調べるために整列した。
インフルエンザワクチン製剤は、配列番号１２９〜１３２及び／又は配列番号１８１〜１８４の１個以上のｄｉｓｃｏｔｏｐｅコンストラクトを含むことができる。
ワクチン製剤の設計
本発明の文脈において、ワクチン製剤は、インフルエンザワクチンの製造に用いられるペプチドのカクテルである。このワクチンは、ペプチドのカクテルと、添加が許容されるであろう当分野において既知の他の置換成分とを含むことができる。これらの置換成分としては、アジュバント、希釈剤及び／又は担体を挙げることができるが、これらに限定されるわけではない。
本発明のワクチン製剤は、ヒト、ウマ及び／又はトリインフルエンザの治療において、ワクチンを製造するのに、とりわけ適している。しかし、ペプチド配列の任意の組み合わせ、又はこれらのペプチド配列を含む製剤を、他のインフルエンザ表現型に使用してもよいことは、理解されるだろう。
ペプチドワクチンは、ＨＡの三次元構造に含まれるエピトープを表現する１個以上のペプチド配列のプール（配列番号１〜２４８）を使って製造することができる。ワクチンは、１個以上のｄｉｓｃｏｔｏｐｅコンストラクト（非可変アミノ酸残基を含有するペプチド）又は１個以上のｄｉｓｃｏｓｉｔｅコンストラクト（可変アミノ酸残基を含有するペプチド）を含む。本発明のｄｉｓｃｏｓｉｔｅコンストラクトはこれらのエピトープの１つに由来する。したがって、ｄｉｓｃｏｓｉｔｅコンストラクト製剤は、可変残基を含有するエピトープから誘導される１個以上のペプチド配列を含む。
本発明の各ｄｉｓｃｏｓｉｔｅコンストラクトは、ｘ個の変異残基に基づく２ｘ個の考えうるペプチド配列を表現する。例えば、３個又は４個の可変残基を持つｄｉｓｃｏｓｉｔｅコンストラクトは、それぞれ２３＝８個又は２４＝１６個の配列を表現する。したがって本発明の文脈において、本明細書にいうｄｉｓｃｏｓｉｔｅコンストラクトは、可変残基を含有するエピトープ配列と、それに由来する１個以上の考えうる配列とを含む。
本発明のワクチンは、そのワクチンに含まれる少なくとも２個のエピトープに由来する、与えられたｄｉｓｃｏｓｉｔｅコンストラクトから選択される少なくとも２個のペプチド配列、合わせて少なくとも４個のペプチド配列（配列番号１〜２４８から選択されるもの）を、そのワクチン中に含むことができる。本発明のいくつかの実施形態では、ヒトインフルエンザワクチン製剤が、少なくとも４個のヒトインフルエンザＡ型ＨＡ ｄｉｓｃｏｓｉｔｅコンストラクト配列（ＩＮＦ−ＨＡ−１−Ｖ１−Ｖ４）及び／又はヒトインフルエンザＢ型ＨＡ ｄｉｓｃｏｓｉｔｅコンストラクト配列（ＩＮＦ−ＨＢ−１−Ｖ１−Ｖ４）を含むことができる。この製剤は、配列番号１〜６４から選択される少なくとも２個のペプチド及び／又は配列番号１３３〜１８０から選択される少なくとも２個のペプチドを含むことができる。
あるいは、この製剤は、以下に挙げる群のうち少なくとも２つの群のそれぞれから選択される少なくとも２個のペプチド配列：配列番号１〜１６；配列番号１７〜３２；配列番号３３〜４８；又は配列番号４９〜６４；及び／又は以下に挙げる群のうち少なくとも２つの群のそれぞれから選択される少なくとも２個のペプチド配列：配列番号１３３〜１４０；配列番号１４１〜１５６；配列番号１５７〜１７２；及び／又は配列番号１７３〜１８０を含むことができる。
ウマインフルエンザワクチンの実施形態は、４個のウマｄｉｓｃｏｓｉｔｅコンストラクト（ＩＮＦＥ−ＨＡ−１−Ｖ１−Ｖ４；配列番号１８５〜２４８）に由来する少なくとも１個のペプチド配列を含むことができる。いくつかの実施形態では、ウマワクチン製剤は、以下に挙げる群のうち少なくとも２つの群のそれぞれから選択される少なくとも２個のペプチド配列を含むことができる：配列番号１８５〜２００；配列番号２０１〜２１６；配列番号２１７〜２３２；及び／又は配列番号２３３〜２４８。
トリインフルエンザワクチンの実施形態は、４個のトリｄｉｓｃｏｓｉｔｅコンストラクト（ＩＮＦ−ＨＡ−２−Ｖ１−Ｖ４；配列番号６５〜１２８）の１個以上のペプチド配列を含むことができる。いくつかの実施形態では、トリワクチン製剤は、以下に挙げる群のうち少なくとも２つの群のそれぞれから選択される少なくとも２個のペプチド配列を含むことができる：配列番号６５〜８０；配列番号８１〜９６；配列番号９７〜１１２；及び／又は配列番号１１３〜１２８。
必要に応じて追加配列を加えても加えなくてもよいことは、当業者には容易に理解されるだろう。本発明のワクチン製剤に使用されるペプチド配列は、ｄｉｓｃｏｓｉｔｅコンストラクト（表１〜１６）又はｄｉｓｃｏｔｏｐｅコンストラクト（表１７〜１８）に従って分類される。
表１〜４にはインフルエンザＡ型（ヒトＨＡ−１）エピトープ配列のｄｉｓｃｏｓｉｔｅコンストラクトを列挙する。
表５〜８にはインフルエンザＡ型（トリＨＡ−２）エピトープ配列のｄｉｓｏｓｉｔｅコンストラクトを列挙する。
表９〜１２にはインフルエンザＢ型（ヒトＨＢ−１）エピトープ配列のｄｉｃｏｓｉｔｅコンストラクトを列挙する。
表１３〜１６にはウマインフルエンザ（ウマＨＡ−１）エピトープ配列のｄｉｓｃｏｓｉｔｅコンストラクトを列挙する。
以下の表に列挙するｄｉｃｏｓｉｔｅコンストラクトのそれぞれにおいて、可変残基は、そのコンストラクト中の対応する残基の下に示してある。
Figure 2008542309
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表１７及び表１８には、本発明によるワクチンの製造に使用することができる（それぞれインフルエンザＡ型及びＢ型用の）ｄｉｓｃｏｔｏｐｅコンストラクト配列を列挙する。
Figure 2008542309
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ペプチド合成
標準的な固相ペプチド化学を使ってペプチドを合成した。ペプチドは、９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）化学を用いる固相ペプチド合成法（ＳＰＰＳ）により、Ｐｉｏｎｅｅｒ（商標）自動ペプチド合成装置で、担持済（ｐｒｅ−ｌｏａｄｅｄ）Ｆｍｏｃ保護ＮｏｖａＳｙｎ（商標）ＴＧＴ樹脂（ＮｏｖａＢｉｏｃｈｅｍ）を記述されているとおりに使用して合成した。与えられた位置で変異性が望まれる場合は、その位置に２つのアミノ酸の混合物を入れる。合成の間、変異性が望まれる位置ではいつでも、この操作を繰り返す。アミノ酸のカップリングには２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（ＴＢＴＵ）及びＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）の１Ｍジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）溶液、並びにジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）の１Ｍ ＤＭＦ溶液を使用し、合成中のアミノ酸の脱保護には２０％ピペリジン／ＤＭＦを使用した。
カップリングは室温で１時間行った。最後のアミノ酸をカップリングした後、樹脂を合成装置から取り出し、焼結ガラス漏斗上で、ＤＭＦ、２−プロパノール及びジクロロメタン（ＤＣＭ）で数回洗浄し、高真空下で乾燥した。ＴＦＡ／水／フェノール／チオアニソール／ＥＤＴ／ＴＩＳ［８２：５：５：５：２：１］を含有する溶液を添加することによって、ペプチド混合物を切断し、脱保護した。樹脂を室温で４時間インキュベートした。次に、１０倍体積の冷エーテルを含有するフラスコ中に、切断混合物を減圧濾過した。同じエーテル溶液に、樹脂をＴＦＡで２回洗い込んだ。
沈殿をさらに助長するために冷凍庫で３０分間インキュベートした後、試料を１，０００×ｇで５分間遠心分離し、エーテルを除去した。この抽出工程を３回繰り返した。最後のエーテル抽出後に、残留有機溶媒を窒素ガス下で蒸発させ、ペプチド混合物を水に再溶解し、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使って精製した。ロータリーエバポレーターを使って過剰な溶媒を除去し、最後に凍結乾燥して乾燥粉末を得た。質量分析（ＭＳ）及びアミノ酸分析を、全てのｄｉｓｃｏｔｏｐｅコンストラクトについて行うことにより、各コンストラクトが適切なペプチド含量を持つことを確認した。
図１〜４に、本発明のｄｉｓｃｏｓｉｔｅコンストラクトから得られる典型的なＨＰＬＣデータを図示する。各ＨＰＬＣプロットは、各ｄｉｓｃｏｓｉｔｅコンストラクト中のペプチドのカクテルを含有する特定のｄｉｃｏｓｉｔｅコンストラクト製剤に対応する。図１Ａ〜１Ｄは、それぞれｄｉｓｃｏｓｉｔｅコンストラクトＩＮＦＥ−ＨＡ−１−Ｖ１〜Ｖ４（配列番号１８５〜２４８）に対応する。図２Ａ〜２Ｄは、それぞれｄｉｓｃｏｓｉｔｅコンストラクトＩＮＦ−ＨＡ−１−Ｖ１〜Ｖ４（配列番号１〜６４）に対応する。図３Ａ〜３Ｄは、それぞれｄｉｓｃｏｓｉｔｅコンストラクトＩＮＦ−ＨＡ−２−Ｖ１〜Ｖ４（配列番号６５〜１２８）に対応する。図４Ａ〜４Ｄは、それぞれｄｉｓｃｏｓｉｔｅコンストラクトＩＮＦ−ＨＢ−１−Ｖ１〜Ｖ４（配列番号１３３〜１８０）に対応する。
図５〜８に、本発明のｄｉｓｃｏｓｉｔｅコンストラクトのＭＳデータを図示する。ＨＰＬＣプロットの場合と同様に、各ＭＳプロットは、各ｄｉｓｃｏｓｉｔｅコンストラクト中のペプチドのカクテルを含有する特定のｄｉｓｃｏｓｉｔｅコンストラクト製剤に対応する。図５Ａ〜５Ｄは、それぞれｄｉｓｃｏｓｉｔｅコンストラクトＩＮＦＥ−ＨＡ−１−Ｖ１〜Ｖ４（配列番号１８５〜２４８）に対応する。図６Ａ〜６Ｄは、それぞれｄｉｓｃｏｓｉｔｅコンストラクトＩＮＦ−ＨＡ−１−Ｖ１〜Ｖ４（配列番号１〜６４）に対応する。図７Ａ〜７Ｄは、それぞれｄｉｓｃｏｓｉｔｅコンストラクトＩＮＦ−ＨＡ−２−Ｖ１〜Ｖ４（配列番号６５〜１２８）に対応する。図８Ａ〜８Ｄは、それぞれｄｉｓｃｏｓｉｔｅコンストラクトＩＮＦ−ＨＢ−１−Ｖ１〜Ｖ４（配列番号１３３〜１８０）に対応する。
２つの典型的ワクチンＩＮＦ−０１Ｐ（ＩＮＦ−ＨＡ−１−Ｖ１−Ｖ４）及びＩＮＦＥ−０１Ｐ（ＩＮＦＥ−ＨＡ−Ｖ１−Ｖ４）を本発明に従って製造した。これらのワクチンは、表１〜４（配列番号１〜６４）及び表１３〜１６（配列番号１８５〜２４８）に列挙し、下記の表１９及び２０に要約する、インフルエンザＡ型のエピトープに由来するペプチド配列を含む製剤に基づいて製造された。ａ）アジュバントの添加が曝露に対する免疫を強化するかどうかを決定するため、ｂ）マウスモデルにおいて候補ワクチンが誘導する体液性応答を市販のワクチンと比較して判定するため、及びｃ）さまざまなインフルエンザウイルス株を使ったインフルエンザ曝露に対して、ワクチンが誘発する防御の範囲を評価するために、マウスモデルを使って、これらのワクチンを試験した。
ワクチン接種スケジュール：マウス群に対して尾の根本の皮下にワクチンを接種した。市販のワクチンを投与するマウスでは、筋肉内に免疫処置した（推奨どおり）。マウスをさらに２回、３週間間隔で、同様に追加免疫した。最後の免疫処置の２週間後に、マウスを致死量のＨ３Ｎ２に曝露させた。曝露後は体重及び感染の徴候についてマウスを毎日監視した。
アジュバント：免疫応答を増強するために、以下のアジュバントをワクチンと組み合わせて使用した：Ｒｉｂｉ（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ、Ｒｉｂｉ：ワクチン比１：１）、ミョウバン（Ｓｉｇｍａ、５００ｎｇ／ｍｌをワクチンと等体積ずつ）、及びＭｏｎｔａｎｉｄｅ（Ｓｅｐｐｉｃ、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ：ワクチン比１：１）。本実施例ではミョウバンをアジュバントとして使用したが、適切なアジュバントであればどれでも使用することができる。
［実施例１］
本実施例では、Ｂ６マウスを、ＩＮＦ−０１Ｐワクチン＋ミョウバン、Ｒｉｂｉ若しくはＭｏｎｔａｎｉｄｅ、又は市販のワクチン（２００４〜２００５シーズン）で免疫処置した。ウイルスへの曝露の前日に、ワクチン接種したマウスから血清を得た。マウスを病原性Ａ／ＨＫ／１／６８−ＭＡ２０ｃウイルスに曝露し、曝露後３週間にわたって追跡した。
ＩＦＮ−０１Ｐワクチンは表１９に示す四つのヒトインフルエンザ配列ｄｉｓｃｏｓｉｔｅコンストラクト製剤に基づく。
Figure 2008542309
図９は、ＨＡＩ価によって測定される、ＩＮＦ−０１Ｐワクチン接種による体液性免疫の誘導を示している。この実施例で示すように、ＩＮＦ−Ｏ１Ｐ＋ミョウバンワクチンで免疫処置したマウスは、ＩＮＦ−０１Ｐ＋Ｒｉｂｉ又はＩＦＮ−０１Ｐ＋Ｍｏｎｔａｎｉｄｅで免疫処置したマウスと比較して、そしてまた現行のインフルエンザワクチンと比較して、増加した体液性免疫を持っていた。
図１０は、Ｈ３Ｎ２への曝露に対する、ＩＮＦ−０１Ｐをワクチン接種したマウスの生存率プロットを示している。この実施例では、ＩＮＦ−０１Ｐ＋ミョウバンワクチンで免疫処置したマウスが、ＩＮＦ−０１Ｐ＋Ｒｉｂｉ又はＩＮＦ−０１Ｐ＋Ｍｏｎｔａｎｉｄｅと比較して、曝露に対して、より良く保護され、より良い生存率を持つ。
図１１は、ＩＮＦ−０１Ｐをワクチン接種した曝露マウスにおける体重減少率を図示している。本実施例に示すように、ＩＮＦ−０１Ｐ＋ミョウバンで免疫処置したマウスは、ＩＮＦ−０１Ｐ＋Ｒｉｂｉ又はＩＮＦ−０１Ｐ＋Ｍｏｎｔａｎｉｄｅで免疫処置したマウスよりも、体重減少に対して、より良く保護された。
［実施例２］
Ｂ６マウスをＩＮＦＥ−０１Ｐ（ウマインフルエンザ）ワクチン＋ミョウバンで免疫処置するか、市販のワクチン（２００４〜２００５シーズン）で免疫処置した。そのマウスから得た血清を、いくつかのインフルエンザ株（Ｈ３Ｎ２ Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／１／６８ｇ、Ｈ１Ｎ１ Ａ／ＦＭ／１／４７、Ｈ５Ｎ１ Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／２１３／２００３、Ｂ／Ｍａｓｓ／３／６６、及びＨ１Ｎ１ Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／１９９９）に対するＨＡＩ活性について試験した。血清は最初のワクチン接種後に得た。
ＩＮＦＥ−０１Ｐワクチンは、表２０に示す四つのウマインフルエンザ配列ｄｉｓｃｏｓｉｔｅコンストラクト製剤に基づく。
Figure 2008542309
図１２は、ＨＡＩ価によって測定される、ＩＮＦＥ−０１Ｐで免疫処置したマウスにおける体液性免疫を図示している。図示するように、この典型的ウマワクチン製剤で免疫処置されたマウスでは、市販のワクチン又はアジュバントのみ（対照）のマウスと比較して、インフルエンザウイルスのいくつかの株に対して、体液性免疫が誘導された。
［実施例３］
赤血球凝集（ＨＡＩ）アッセイ
個々のｄｉｓｃｏｔｏｐｅコンストラクト及び組み合わされたｄｉｓｃｏｔｏｐｅコンストラクトの免疫原性をマウスで評価した。四つのｄｉｓｃｏｔｏｐｅコンストラクトで免疫処置したマウスは、全体として、ウイルスの赤血球凝集活性を抑制することができる抗体を発生させた。インフルエンザに基づくｄｉｓｃｏｔｏｐｅコンストラクトは、インフルエンザウイルスによる赤血球の血球凝集反応を抑制する抗体が誘発されたという点で、不連続エピトープをうまく模倣することが示された。
標準的なＨＡＩアッセイを使って、機能的に関連する抗ＨＡ抗体の誘導を測定した。ワクチン製剤によって誘導される免疫の幅を決定するために、数多くの異なるインフルエンザ株を使って、ワクチン候補によって誘導されるＨＡＩ価を調べた。
図１３は、マウスワクチン試験で行った赤血球凝集アッセイの結果を図示している。各ワクチン群に異なるワクチン製剤又はリン酸緩衝食塩水（陰性対照）を与えた。ウイルス（Ｈ３サブタイプインフルエンザ）と共にインキュベートすると、血液が赤血球凝集を起こす（濁る）；赤血球凝集が防御又は抑制されると、ＲＢＣはペレットのままである（暗い円）。
これらの結果は、ＶＢＩ候補ワクチンが示す赤血球凝集抑制の強さを、認可された市販のインフルエンザ用ワクチンと比較して示している。ＶＢＩ候補ワクチンとアジュバントの組み合わせのそれぞれが、市販ワクチン（１／４０〜１／８０まで）と同等以上の赤血球凝集抑制（ＨＩ）を示すことに注目されたい。ｄｉｓｃｏｓｉｔｅコンストラクト免疫原とミョウバンアジュバント（列１２）は、最高１／３２０の希釈率でも検出可能なＨＩを示す。
Figure 2008542309
図１４は、インフルエンザワクチンＥＬＩＳＡ試験の結果を示している。この図は表２２に記載するデータに基づいている。
Figure 2008542309
Ｇ１＝ｄｉｃｏｓｉｔｅコンストラクトＩＦＮ−１（配列番号１〜１６）＋Ｒｉｂｉ；Ｇ２＝ｄｉｃｏｓｉｔｅコンストラクトＩＦＮ−２（配列番号１７〜３２）＋Ｒｉｂｉ；Ｇ３＝ｄｉｃｏｓｉｔｅコンストラクトＩＦＮ−３（配列番号３３〜４８）＋Ｒｉｂｉ；Ｇ４＝ｄｉｃｏｓｉｔｅコンストラクトＩＦＮ−４（配列番号４９〜６４）＋Ｒｉｂｉ；Ｇ５＝ｄｉｃｏｔｏｐｅコンストラクト１（配列番号１２９）＋Ｒｉｂｉ；Ｇ６＝ｄｉｃｏｔｏｐｅコンストラクト２（配列番号１３０）＋Ｒｉｂｉ；Ｇ７＝ｄｉｃｏｔｏｐｅコンストラクト３（配列番号１３１）＋Ｒｉｂｉ；Ｇ８＝ｄｉｃｏｔｏｐｅコンストラクト４（配列番号１３２）＋Ｒｉｂｉ；Ｇ９＝対照（Ｒｉｂｉのみ）；Ｇ１０＝ｄｉｓｃｏｓｉｔｅコンストラクトＩＦＮ−１−４＋Ｒｉｂｉ；Ｇ１１＝ｄｉｓｏｔｏｐｅコンストラクト１−４＋Ｒｉｂｉ；Ｇ１２＝ｄｉｓｃｏｓｉｔｅコンストラクトＩＦＮ−１−４＋Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ；及びＧ１３＝市販ワクチン。
これらのデータは、全体として、現行のインフルエンザワクチンよりも迅速なワクチン生産及び幅広い防御をもたらす、インフルエンザワクチン開発への根本的に新しいアプローチを示唆している。このアプローチは感染爆発インフルエンザワクチンの開発に有益だろう。
本発明の上述した実施形態はほんの一例に過ぎない。当業者は、本願特許請求の範囲のみによって定義される本発明の範囲から逸脱することなく、特定の実施形態に改変、変更及び変形を加えることができる。
全ての参考文献は参照により本明細書に組み入れられる。
図１は、本発明のウマインフルエンザｄｉｓｃｏｓｉｔｅコンストラクト（ＩＮＦＥ−ＨＡ−１−Ｖ１〜Ｖ４；Ａ〜Ｄ）のＨＰＬＣ分析を示す。 図２は、本発明のヒトインフルエンザＡ型ｄｉｓｃｏｓｉｔｅコンストラクト（ＩＮＦ−ＨＡ−１−Ｖ１〜Ｖ４；Ａ〜Ｄ）のＨＰＬＣ分析を示す。 図３は、本発明のヒト及びトリインフルエンザｄｉｓｃｏｓｉｔｅコンストラクト（ＩＮＦ−ＨＡ−２−Ｖ１〜Ｖ４；Ａ〜Ｄ）のＨＰＬＣ分析を示す。 図４は、本発明のインフルエンザＢ型ｄｉｓｃｏｓｉｔｅコンストラクト（ＩＮＦ−ＨＢ−１−Ｖ１〜Ｖ４；Ａ〜Ｄ）のＨＰＬＣ分析を示す。 図５Ａ〜図５Ｄは、本発明のウマインフルエンザｄｉｓｃｏｓｉｔｅコンストラクト（ＩＮＦＥ−ＨＡ−１−Ｖ１〜Ｖ４；図５Ａ〜図５Ｄ）の質量分析データを図示する。 図５Ａ〜図５Ｄは、本発明のウマインフルエンザｄｉｓｃｏｓｉｔｅコンストラクト（ＩＮＦＥ−ＨＡ−１−Ｖ１〜Ｖ４；図５Ａ〜図５Ｄ）の質量分析データを図示する。 図５Ａ〜図５Ｄは、本発明のウマインフルエンザｄｉｓｃｏｓｉｔｅコンストラクト（ＩＮＦＥ−ＨＡ−１−Ｖ１〜Ｖ４；図５Ａ〜図５Ｄ）の質量分析データを図示する。 図５Ａ〜図５Ｄは、本発明のウマインフルエンザｄｉｓｃｏｓｉｔｅコンストラクト（ＩＮＦＥ−ＨＡ−１−Ｖ１〜Ｖ４；図５Ａ〜図５Ｄ）の質量分析データを図示する。 図６Ａ〜図６Ｄは、本発明のヒトインフルエンザＡ型ｄｉｓｃｏｓｉｔｅコンストラクト（ＩＮＦ−ＨＡ−１−Ｖ１〜Ｖ４；図６Ａ〜図６Ｄ）の質量分析データを図示する。 図６Ａ〜図６Ｄは、本発明のヒトインフルエンザＡ型ｄｉｓｃｏｓｉｔｅコンストラクト（ＩＮＦ−ＨＡ−１−Ｖ１〜Ｖ４；図６Ａ〜図６Ｄ）の質量分析データを図示する。 図６Ａ〜図６Ｄは、本発明のヒトインフルエンザＡ型ｄｉｓｃｏｓｉｔｅコンストラクト（ＩＮＦ−ＨＡ−１−Ｖ１〜Ｖ４；図６Ａ〜図６Ｄ）の質量分析データを図示する。 図６Ａ〜図６Ｄは、本発明のヒトインフルエンザＡ型ｄｉｓｃｏｓｉｔｅコンストラクト（ＩＮＦ−ＨＡ−１−Ｖ１〜Ｖ４；図６Ａ〜図６Ｄ）の質量分析データを図示する。 図７Ａ〜図７Ｄは、本発明のヒト及びトリインフルエンザｄｉｓｃｏｓｉｔｅコンストラクト（ＩＮＦ−ＨＡ−２−Ｖ１；図７Ａ〜図７Ｄ）の質量分析データを図示する。 図７Ａ〜図７Ｄは、本発明のヒト及びトリインフルエンザｄｉｓｃｏｓｉｔｅコンストラクト（ＩＮＦ−ＨＡ−２−Ｖ１；図７Ａ〜図７Ｄ）の質量分析データを図示する。 図７Ａ〜図７Ｄは、本発明のヒト及びトリインフルエンザｄｉｓｃｏｓｉｔｅコンストラクト（ＩＮＦ−ＨＡ−２−Ｖ１；図７Ａ〜図７Ｄ）の質量分析データを図示する。 図７Ａ〜図７Ｄは、本発明のヒト及びトリインフルエンザｄｉｓｃｏｓｉｔｅコンストラクト（ＩＮＦ−ＨＡ−２−Ｖ１；図７Ａ〜図７Ｄ）の質量分析データを図示する。 図８Ａ〜図８Ｄは、本発明のヒトインフルエンザＢ型ｄｉｓｃｏｓｉｔｅコンストラクト（ＩＮＦ−ＨＢ−１−Ｖ１〜Ｖ４；図８Ａ〜図８Ｄ）の質量分析データを図示する。 図８Ａ〜図８Ｄは、本発明のヒトインフルエンザＢ型ｄｉｓｃｏｓｉｔｅコンストラクト（ＩＮＦ−ＨＢ−１−Ｖ１〜Ｖ４；図８Ａ〜図８Ｄ）の質量分析データを図示する。 図８Ａ〜図８Ｄは、本発明のヒトインフルエンザＢ型ｄｉｓｃｏｓｉｔｅコンストラクト（ＩＮＦ−ＨＢ−１−Ｖ１〜Ｖ４；図８Ａ〜図８Ｄ）の質量分析データを図示する。 図８Ａ〜図８Ｄは、本発明のヒトインフルエンザＢ型ｄｉｓｃｏｓｉｔｅコンストラクト（ＩＮＦ−ＨＢ−１−Ｖ１〜Ｖ４；図８Ａ〜図８Ｄ）の質量分析データを図示する。 図９は、本発明のワクチンによる免疫処置後の体液性免疫の誘導を図示する。 図１０は、Ｈ３Ｎ２の曝露に対するワクチン接種マウスの生存率プロットを示す。 図１１は、本発明のワクチンＩＮＦ−０１Ｐ（ＩＮＦ−ＨＡ−１−Ｖ１−Ｖ４）を使ってワクチン接種した曝露マウスにおける体重減少率を示す。 図１２は、ＨＡＩ価によって測定されるマウスにおけるＩＮＦＥ−０１Ｐ（ＩＮＦＥ−ＨＡ−１−Ｖ１−Ｖ４）ワクチン接種による体液性免疫の誘導を示す。 図１３は、マウスワクチン試験で行った赤血球凝集アッセイの結果を図示する。 図１４は、表２２に記載するデータに基づくインフルエンザワクチンＥＬＩＳＡ試験の結果を示す。

Claims (28)

  1. 配列番号１〜２４８からなる群より選択される少なくとも１個のペプチドを含むペプチドベースの抗インフルエンザ製剤。
  2. 配列番号１〜２４８からなる群より選択される少なくとも４個のペプチド配列を含む、請求項１に記載の製剤。
  3. 配列番号１〜６４からなる群より選択される少なくとも２個のペプチドと、配列番号１３３〜１８０からなる群より選択される少なくとも２個のペプチドとを含む、請求項１に記載の製剤。
  4. 配列番号１〜６４及び配列番号１３３〜１８０を含む、請求項３に記載の製剤。
  5. 請求項１８５〜２４８からなる群より選択される少なくとも１個のペプチド配列を含む、請求項１に記載の製剤。
  6. 配列番号６５〜１２８からなる群より選択される少なくとも１個のペプチド配列を含む、請求項１に記載の製剤。
  7. 以下に挙げる群のうち少なくとも２つの群のそれぞれから選択される２ｎ個のペプチド配列を含む、請求項１に記載の製剤。
    ａ）配列番号１〜１６；
    ｂ）配列番号１７〜３２；
    ｃ）配列番号３３〜４８；及び
    ｄ）配列番号４９〜６４
    ［ただし、ｎは１〜４である。］
  8. 以下に挙げる群ａ）〜ｄ）のうち少なくとも２つの群を含む、請求項１に記載の製剤。
    ａ）配列番号１３３〜１４０から選択される２ｍ個のペプチド配列；
    ｂ）配列番号１４１〜１５６から選択される２ｎ個のペプチド配列；
    ｃ）配列番号１５７〜１７２から選択される２ｎ個のペプチド配列；及び
    ｄ）配列番号１７３〜１８０から選択される２ｍ個のペプチド配列
    ［ただし、ｍは１〜３であり、ｎは１〜４である。］
  9. 以下に挙げる群のうち少なくとも２つの群のそれぞれから選択される２ｎ個のペプチド配列を含む、請求項１に記載の製剤。
    ａ）配列番号１８５〜２００；
    ｂ）配列番号２０１〜２１６；
    ｃ）配列番号２１７〜２３２；及び
    ｄ）配列番号２３３〜２４８
    ［ただし、ｎは１〜４である。］
  10. 以下に挙げる群のうち少なくとも２つの群のそれぞれから選択される２ｎ個のペプチド配列を含む、請求項１に記載の製剤。
    ａ）配列番号６５〜８０；
    ｂ）配列番号８１〜９６；
    ｃ）配列番号９７〜１１２；及び
    ｄ）配列番号１１３〜１２８
    ［ただし、ｎは１〜４である。］
  11. 配列番号１２９〜１３２又は配列番号１８１〜１８４の少なくとも一方を含む、請求項１に記載の製剤。
  12. 配列番号１２９〜１３２を含む、請求項１１に記載の製剤。
  13. 配列番号１８１〜１８４を含む、請求項１１に記載の製剤。
  14. 配列番号１〜６４を含む、請求項１に記載の製剤。
  15. 配列番号１８５〜２４８を含む、請求項１に記載の製剤。
  16. 請求項１に記載の製剤を、薬学的に許容できる希釈剤又は担体と共に含むワクチン。
  17. 更にアジュバントを含む、請求項１６に記載のワクチン。
  18. 前記アジュバントがミョウバンである、請求項１７に記載のワクチン。
  19. インフルエンザを予防又は治療する必要がある動物におけるインフルエンザを予防又は治療するためのワクチンの製造のための、請求項１に記載の製剤の使用。
  20. 前記動物がヒト、マウス、ウマ又はトリである、請求項１９に記載の使用。
  21. ヒトインフルエンザを治療するためのワクチンの製造のための、請求項３に記載の製剤の使用。
  22. ウマインフルエンザを治療するためのワクチンの製造のための、請求項５に記載の製剤の使用。
  23. トリインフルエンザを治療するためのワクチンの製造のための、請求項６に記載の製剤の使用。
  24. インフルエンザの予防又は治療のための、請求項１６に記載のワクチンの使用。
  25. 請求項３に記載の製剤を含むワクチン。
  26. 更にアジュバントを含む、請求項２５に記載のワクチン。
  27. 前記アジュバントがミョウバンである、請求項２６に記載のワクチン。
  28. インフルエンザを予防又は治療する必要がある動物におけるインフルエンザを予防又は治療する方法であって、請求項１６に記載のワクチンの有効量を当該動物に投与することを含む方法。
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