MX2007015105A - Formulacion de vacuna de influenza a base de peptido. - Google Patents

Formulacion de vacuna de influenza a base de peptido.

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Abstract

Se describen formulaciones anti-influenza a base de peptido contra influenza A y B. Los peptidos son derivados de epitopos a base de influenza. Las formulaciones estan basadas en mezclas de peptidos que son formulados de tal manera que esta presente variabilidad en residuos particulares. Las formulaciones pueden ser usadas para preparar vacunas para impedir influenza en animales humanos, aviares murinos o equinos.

Description

FORMULACIÓN DE VACUNA DE INFLUENZA A BASE DE PEPTIDO Campo de la Invención La presente invención es concerniente en general con una formulación antiviral y en particular es concerniente con una formulación de vacuna para influenza a base de péptido.
Antecedentes de la Invención la influenza es una enfermedad infecciosa común del sistema respiratorio asociada con la familia de virus de Ortomixoviridae . Debido al alto grado de variabilidad del virus, se requiere comúnmente vacunación en una base anual con una vacuna reformulada que toma en cuenta variaciones de cepas. A pesar de la reformulación, no es posible que una vacuna incluya todas las diferentes cepas que infectan activamente a la gente en el mundo durante una estación o época particular. En tanto que están disponibles actualmente vacunas eficaces contra influenza, deben ser reformuladas cada año debido a la variación antigénica en la superficie de las proteínas del virus. Un obstáculo a la reformulación es la cantidad de tiempo relativamente grande requerida para formular y preparar cantidades suficientes de dosis de vacuna para responder a incrementos estacionales en infecciones de gripa. Comúnmente, puede tomar más de 6 meses preparar una vacuna; ocasionalmente, una nueva cepa de influenza o cepa de influenza pasada por alto se vuelve prominente durante aquel período de 6 meses, conduciendo a una epidemia. La hemaglutinina (HA) es la glicoproteína de superficie principal de virus de influenza y un inmunógeno potente contra el cual anticuerpos neutralizantes virales son dirigidos. Los virus de influenza son del tipo "A" o "B" en base a las nucleoproteínas intracelulares relativamente estables y proteínas de matriz asociadas a envolventes. Los subtipos de virus están basados en dos proteínas en la envolvente viral (HA) y neuraminidasa (NA) , que sufren cambio antigénico constante. Quince subtipos distintos de las HA y nueve subtipos de NA son reconocidos para virus de influenza A (De Jong, Rimmelz aan, G.F., Fouchier, R.A.M. y Osterhaus, A.D. M.E. Journal of Infection, 2000; 40: 218-228). La aparición repentina de un nuevo subtipo (desplazamiento antigénico) ha provocado tres pandemias principales en el siglo pasado: 1918 (Gripa Española, HlNl), 1957 (Gripa Asiática H2N2) y 1968 (Gripa de Hong Kong, H3N2) . También ha habido reciente preocupación con la gripa aviar, gripa equina y susceptibilidad en humanos: HA es la glicoproteína de envolvente principal del virus de influenza y modera la penetración del virus a células huésped (Wiley, C.S., et al., Na ture 1981; 289(29): 373-377; Wilson, IA, et al., Na ture 1981; 289, 366-373; Catón et al., Cell : 417-427) . La HA natural es formada mediante la asociación de tres monómeros de HA que, como precondición de infectividad de virus, son escindidos enzimáticamente al HAl amino-terminal y HA2 carboxi-terminal. En base a la estructura tridimensional de HAl, los sitios antigénicos han sido mapeados al determinar los cambios de aminoácidos de variantes antigénicas (Wiley, supra ) . Las variaciones antigénicas fueron en su mayoría vistas rodeando la región de enlace de receptor de HA, incluyendo residuos alrededor de las cavidades de enlace de receptor inaccesibles de anticuerpo. Así, ha habido el deseo de elucidar procedimientos a base de péptido como terapias inmunológicas. Sin embargo, una preocupación principal de las vacunas de subunidad a base de péptido es la habilidad de péptido lineales para inducir anticuerpos que pueden reconocer epítopos de célula B y célula T conformacionales. Los anticuerpos monoclonales a estos sitios antigénicos neutralizan la infectividad del virus de influenza cuando las secuencias exactas están presentes. Tanto epítopos de célula T como de célula B son encontrados en estos sitios (Atassi et al., Advances in Experimental Medicine and Biology, 1989; 251: 49-635-6; Torres et al., Immunology Letters, 1988; 19(1) : 49-53) . La multiplicación del virus de influenza en presencia de anticuerpo monoclonal dirigido contra uno de los sitios antigénicos sobre HA da como resultado la producción de variantes de escape, que eran una minoría muy pequeña en el virus original (Webster et al., Virology 1983; 126(2): 587-99; Webster et al., Virology 1980; 104(1): 139-48; Yewdell et al., Na ture 1979; 279(5710): 246-8). Consistente con estos datos in vi tro, individuos inmunizados contra una cepa de virus e infectados con otra producen una amplia disposición de variantes antigénicas. estos datos sugieren que la inmunidad de la población contra aquellos epítopos fueron una fuerza impulsora para la selección de nuevas cepas de virus de influenza. La formulación de vacuna desarrollada cada año en los Estados Unidos de América es determinada por el Departamento de Vacunas de la Administración de Alimentos y Fármacos y el Comité de Recomendación de Biológicos Relacionados. La Organización Mundial de la Salud (WHO) pone en operación similarmente una red de estudio global de laboratorios para la detección de nuevas variantes de influenza (Lavanchy, Va ccine 1999; 17: S24-S25) . La selección está basada en análisis antigénicos de virus de influenza recién aislados, los patrones de dispersión de variantes antigénicas y la respuesta de anticuerpo de individuos recién vacunados. Sin embargo, debido a los retardos en la formulación de vacuna referidos anteriormente, ha sido difícil producir efectiva y eficientemente cantidades suficientes de vacuna para cumplir con los requerimientos cambiantes en estrategias de inmunización. Por consiguiente, es deseable proporcionar eficientemente una formulación de vacuna contra influenza más eficaz .
Breve descripción de la Invención Es un objeto de la presente invención eliminar o mitigar por lo menos una desventaja de las formulaciones de vacuna para influenza previas. La presente invención proporciona formulaciones de vacuna contra influenza a base de péptido derivadas de epítopos de HA de influenza. Ventajosamente, las formulaciones de vacuna de la presente invención mejoran la respuesta humoral en modelos de animal cuando se compara con vacunas comerciales. Debido a las variantes de péptido en las formulaciones, la presente invención puede proporcionar amplia protección contra diferentes cepas de virus de influenza . Sorprendentemente, se encontró que las formulaciones de vacuna contra influenza a base de péptido de acuerdo con la presente invención, que representan la diversidad antigénica de virus de influenza en epítopos de HA protectores, producen inmunidad protectora que es más ampliamente reactiva que aquella inducida con una vacuna comercial que está basada solamente en pocos aislados de influenza. En un primer aspecto, la presente invención proporciona una formulación anti-influenza a base de péptido que comprende por lo menos un péptido seleccionado del grupo que consiste de SEQ ID Nos: 1 a 248. En una modalidad de la presente invención, se proporciona una formulación que comprende por lo menos cuatros secuencias de péptidos seleccionadas del grupo que consiste de SEQ ID Nos: 1 a 248. En otra modalidad, la formulación puede comprender por lo menos dos péptidos seleccionados del grupo que consiste de SEQ ID Nos: 1 a 64 y por lo menos dos péptidos seleccionados del grupo que consiste de SEQ ID Nos: 133 a 180. La formulación puede también comprender SEQ ID Nos: 1 a 64 y SEQ ID Nos: 133 a 180. La presente invención también proporciona una formulación que comprende por lo menos una secuencia de péptido seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID Nos: 185 a 248. En una modalidad, la formulación puede comprender por lo menos dos secuencias de péptido de cada uno de por lo menos dos de los siguientes grupos: SEQ ID Nos: 185 a 200; SEQ ID Nos: 201 a 216; SEQ ID Nos: 217 a 232; o SEQ ID Nos: 233 a 248. La presente invención también proporciona una formulación que comprende por lo menos una secuencia de péptidos seleccionado del grupo que consiste de SEQ ID Nos: 65 a 128. En una modalidad, la formulación puede comprender por lo menos dos secuencias de péptido a partir de cada uno de por lo menos dos de los siguientes grupos: SEQ ID Nos: 65 a 80; SEQ ID Nos: 81 a96; SEQ ID Nos: 97 a 112; o SEQ ID Nos: 113 a 128. Las formulaciones de la presente invención pueden ser usadas para preparar vacunas. Un adyuvante, tal como alumbre u otro sustituyente puede ser usado en la preparación de la vacuna. La vacuna puede ser usada en el tratamiento de influenza en animales tales como humanos, ratones, caballos o aves. La formulación de la presente invención es reactiva ampliamente contra influenza A y B. Ventajosamente, la formulación de la presente invención puede ser preparada científicamente en un tiempo tan corto como de 6 semanas. Otros aspectos y elementos de la presente invención se harán evidentes para aquellos experimentados en el arte después de la revisión de la presente descripción de modalidades específicas de la invención en conjunción con las Figuras adjuntas.
Breve descripción de las Figuras Ahora se describirán modalidades de la presente invención a manera de ejemplos solamente, con referencia a las Figuras adjuntas, en donde: La Figura 1 muestra el análisis HPLC de constructos de discosite de influenza equina (INFE-HA-1-Vl a V4 ; A a D) de la presente invención. La Figura 2 muestra el análisis HPLC de constructo de discosite de influenza A humana (INF-HA-1-V1 a V4; A a D) de la presente invención. La Figura 3 muestra análisis HPLC de constructos de discosite de influenza humana y aviar (INF-HA-2-V1 a V4; A a D) de la presente invención. La Figura 4 muestra el análisis HPLC de constructos de discosite de influenza B (INF-HB-1-V1 a V4 ; A a D) de la presente invención. Las Figuras 5A a 5D ilustran datos de espectrometría de masas para constructos de discosite de influenza equina (INFE-HA-1-V1 a V4; Figuras 5A a 5D) de la presente invención. Las Figuras 6A a 6D ilustran datos de espectrometría de masas para constructos de discosite de influenza A humana (INF-HA-1-V1 a V4 ; Figuras 6A a 6D) de la presente invención.
Las Figuras 7A a 7D ilustran datos de espectrometría de masas para constructos de discosite de influenza humana y aviar (INF-HA-2-V1 ; Figuras 7A a 7D) de la presente invención . Las Figuras 8A a 8D ilustran datos de espectrometría de masas para constructos de discosite de influenza B humana (INF-HB-1-V1 a V4 ; Figuras 8A a 8D) de la presente invención.
La Figura 9 ilustra la inducción de inmunidad humoral medíante una vacuna de la presente invención después de la inmunización . La Figura 10 muestra una gráfica de supervivencia de ratones vacunados contra el tratamiento contra H3N2. La Figura 11 muestra el porciento de pérdida de peso en ratones tratados vacunados con una vacuna de la presente invención INF-01P (INF-HA-1-V1-V4) . La Figura 12 ilustra la inducción de inmunidad humoral mediante INFE-01P (INFE-HA-1-V1-V ) vacunación en ratones tal como se mide mediante el título HAl. La Figura 13 ilustra los resultados de un análisis de hemaglutinación efectuado en un estudio de vacuna de ratones .
La Figura 14 muestra resultados de la prueba de ELISA de vacunas de influenza a base de datos presentados en la tabla 22.
Descripción detallada de la Invención En general, la presente invención proporciona una formulación antiviral y más específicamente una formulación anti-influenza a base de péptido que comprende por lo menos un péptido seleccionado del grupo que consiste de SEQ ID Nos: 1 a 248. La formulación de la presente invención es un coctel que comprende uno o más péptidos . La formulación puede comprender por lo menos cuatro secuencias de péptidos seleccionados del grupo que consiste de SEQ ID Nos: 1 a 248. En un ejemplo, la formulación puede comprender por lo menos dos péptidos seleccionados del grupo que consiste de SEQ ID Nos: la 64 y por lo menos dos péptidos seleccionados del grupo que consiste de SEQ ID Nos: 133 a 180. Un ejemplo específico comprende SEQ ID Nos: 1 a 64 y SEQ ID Nos: 133 a 180. En otro ejemplo específico, la formulación comprende SEQ ID Nos: 1 a 64. En todavía otro ejemplo específico, la formulación comprende SEQ ID Nos: 185 a 248. En otro ejemplo, la formulación puede comprender 2n secuencias de péptido de cada uno de por lo menos dos de los siguientes grupos: a) SEQ ID Nos: 1 a 16; b) SEQ ID Nos: 17 a 32; c) SEQ ID Nos: 33 a 48; o d) SEQ ID Nos: 49 a 64, en donde n es 1 a 4. Además, la formulación puede comprender de por lo menos dos grupos a) a d) : a) 2m secuencias de péptidos de SEQ ID Nos: 157 a 172; b) 2n secuencias de péptido de SEQ ID Nos: 141 a 156; c) 2n secuencias de péptidos de SEQ ID Nos: 157 a 172; d) 2ra secuencias de péptidos de SEQ ID Nos: 173 a 180, en donde m es l a 3 y n es l a 4. Esta formulación puede ser usada en la preparación de una vacuna antiinfluenza humana. Las formulaciones anti-influenza humanas descritas en la presente pueden ser usadas solas o en combinación. En otro ejemplo, las formulaciones de la presente invención pueden comprender por lo menos una secuencia de péptidos seleccionado del grupo que consiste de SEQ ID Nos: 185 a 248. Como un ejemplo, la formulación puede comprender 2n secuencias de péptidos de cada uno de por lo menos dos de los siguientes grupos: a) SEQ ID Nos: 185 a 200; b) SEQ ID Nos: 201 a 216; c) SEQ ID Nos: 217 a 232; o d) SEQ ID Nos: 233 a 248, en donde n es de 1 a 4. Esta formulación puede ser usada en la preparación de una vacuna anti-influenza equina.
En otro ejemplo, la formulación de la presente invención puede comprender al menos una secuencia de péptidos seleccionado del grupo que consiste de SEQ ID Nos: 65 a 128. Como un ejemplo, la formulación puede comprender 2n secuencias de péptido de cada uno de por lo menos dos de los siguientes grupos: a) SEQ ID Nos: 65 a 80; b) SEQ ID Nos: 81 a 96; c) SEQ ID Nos: 97 a 112; o d) SEQ ID Nos: 113 a 128, en donde n es de 1 a 4. Esta formulación puede ser usada en la preparación de una vacuna anti-influenza aviar. En un ejemplo de una formulación en donde no hay variabilidad representada por las secuencias de péptido, la formulación puede comprender por lo menos una de SEQ ID Nos: 139 a 132 o SEQ ID Nos: 181 a 184. Como un ejemplo específico, la formulación puede comprender SEQ ID Nos: 129 a 132. En otro ejemplo específico, la formulación puede comprender SEQ ID Nos: 181 a 184. La presente invención también proporciona una vacuna que comprende una formulación que incluye por lo menos un péptido seleccionado del grupo que consiste de SEQ ID Nos: 1 a 248, junto con un diluyente o portador aceptable farmacéuticamente. La vacuna puede comprender además un adyuvante que puede ser por ejemplo alumbre. La formulación puede ser usada para la preparación de una vacuna para prevenir o tratar influenza en un animal en necesidad de la misma. El animal puede ser humano, murino, equino o aviar. La invención es concerniente con el uso de una formulación que comprende por lo menos dos péptidos seleccionados del grupo que consiste de SEQ ID Nos: 1 a 64 y por lo menos dos péptidos seleccionados del grupo que consiste de SEQ ID Nos: 133 a 180 para la preparación de una vacuna para el tratamiento de influenza humana. La invención también es concerniente con el uso de una formulación que comprende por lo menos una secuencia de péptidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID Nos: 185 a 248 para la preparación de una vacuna para el tratamiento de influenza equina. La invención es concerniente además con el uso de la formulación que comprende por lo menos una secuencia de péptido seleccionado del grupo que consiste de SEQ ID Nos: 65 a 128 para la preparación de una vacuna para el tratamiento de influenza aviar.
Las vacunas preparadas de acuerdo con la presente invención pueden ser usadas para prevenir o tratar influenza. Las secuencias de estos péptidos son determinadas en base al análisis de la estructura cristalina de la proteína de hemaglutinina de influenza (HA) para determinar epítopos de péptido. La hemaglutinina es la glicoproteína de superficie principal del virus de influenza y un potente inmunógeno contra el cual anticuerpos neutralizantes virales son dirigidos. Los epítopos de péptido lineales en el coctel imitan epítopos discontinuos sobre la superficie de proteína HA. Utilizando elementos de programación de bioinformática que analiza la variación antigénica de proteínas HA de miles de aislados de influenza humanos, cocteles de péptido degenerativos basados en estos epítopos pueden ser preparados que representan la variación antigénica HA dentro de estos epítopos. Así, las poblaciones de vacuna contra influenza de la presente invención comprenden un coctel de péptido que representan epítopos mayores de la proteína HA. La vacuna puede ser formulada con o sin representar variación en residuos específicos para cada péptido. Cuando la variación no es representada, el péptido formado puede ser referido en la presente como un constructo de Discotope™. Un constructo de discotope es un constructo sintético de secuencia lineal que aproxima la posición de secciones de secuencia primaria que componen epítopos discontinuos. Las secciones individuales son construidas en secuencia para producir respuestas inmunes que reconocen los epítopos discontinuos encontrados en la proteína intacta original. Los epítopos discontinuos son compuestos de dos o más segmentos de la secuencia primaria de una proteína que cuando son plegados adecuadamente vienen conjuntamente y son enlazados mediante anticuerpos específicos. No son reconocidos por anticuerpos cuando la estructura secundaria es perdida y por consiguiente, no han sido representados mediante un péptido lineal continuo. Cuando la variación está presente en residuos particulares que se sabe que tienen diferentes aminoácidos representados de acuerdo con diferentes secuencias para aquel patógeno particular, la formulación comprende un número de péptidos, que pueden ser denominados colectivamente en la presente como constructo de Discosite™. Con el fin de formular una mezcla de péptidos, es posible usar el método de Torres tal como se resume en la Solicitud de Patente estadounidense NO: 10/072,084, que es incorporada en la presente por referencia.
Diseño de constructos de Discotope/Discosite En las formulaciones de vacuna de la presente invención, se usa hemaglutinina de influenza para diseñar secuencias lineales que representan cuatro epítopos discontinuos. Cuatro péptidos (constructos de discotope) que imitan epítopos de células B y T discontinuos sobre cuatro sitios antigénicos HA fueron diseñados. Cada constructo de discotope es sintetizado utilizando síntesis de péptido en fase sólida. Secuencias de más de 200 aislados humanos de influenza A fueron obtenidas de bases de datos de GenBank™ y Swiss Protein™ y alineadas para estudiar la composición de estos epítopos. Una formulación de vacuna de influenza puede comprender uno o más constructos de discotope de SEQ ID Nos: 139 a 132 y/o SEQ ID Nos: 181 a 184.
Diseño de formulaciones de vacuna En el contexto de la presente invención, una formulación de vacuna es un coctel de péptidos que son usados en la preparación de una vacuna de influenza. La vacuna puede comprender el coctel de péptidos y otros sustituyentes conocidos en el arte que se encontrarían aceptables para inclusión. Estos sustituyentes se pueden incluir pero no están limitados a adyuvantes, diluyentes y/o portadores. Las formulaciones de vacuna de la presente invención son particularmente apropiadas para preparar vacunas en el tratamiento de influenza humana, equina y/o aviar. Sin embargo, se apreciará que cualquier combinación de secuencia de péptido o formulaciones que comprenden esta secuencia de péptido, pueden ser usadas en otros fenotipos de influenza.
Las vacunas de péptido pueden ser preparadas con una acumulación de una o más secuencias de péptido que representan epítopos contenidos en la estructura tridimensional de HA (SEQ ID Nos: 1-248). Las vacunas comprenden uno o más constructos de discotope (péptidos que contienen residuos de aminoácidos no variables) o uno o más constructos de discosite (péptidos que contienen residuos de aminoácido variables) . Un constructo de discosite de la presente invención es derivado de uno de estos epítopos. Así, una formulación de constructo de discosite comprende una o más secuencias de péptidos derivadas del epítopo que contiene los residuos variables. Cada constructo de discosite de la presente invención representa 2X secuencias de péptido posibles basadas en x residuos variados. Por ejemplo, un constructo de discosite que tiene tres o cuatro residuos variables representa 23 = 8 24 = 16 secuencias, respectivamente. Por consiguiente, en el contexto de la presente invención, un constructo de discosite como se hace referencia en la presente incluye la secuencia de epítopos que contiene los residuos variables y la una o más secuencias posibles derivadas del mismo. Las vacunas de la presente invención pueden comprender por lo menos dos secuencias de péptido de un constructo de discosite dado, derivado de por lo menos dos epítopos contenidos en la vacuna para un total de por lo menos 4 secuencias de péptido (de SEQ ID Nos: 1 a 248) en la vacuna. En algunas modalidades de la presente invención, la formulación de vacuna contra la influenza humana puede comprender por lo menos cuatro secuencias de constructo de influenza-A (INF-HA-1-V1-V4 ) y/o cuatro secuencias de constructo de discosite HA de influenza B (INF-HB-1-V1-V4 ) . Esta puede incluir por lo menos dos péptidos de SEQ ID Nos: 1 a 64 y/o por lo menos dos péptidos de SEQ ID Nos: 133 a 180.
Alternativamente, esta puede incluir por lo menos dos secuencias de péptido de cada uno de por lo menos dos de los siguientes grupos: SEQ ID Nos: 1 a 16; SEQ ID Nos: 17 a 32; SEQ ID Nos: 33 a 48; o SEQ ID Nos: 49 a 64; y/o por lo menos dos secuencias de péptidos de cada una de por lo menos dos de los siguientes grupos: SEQ ID Nos: 133 a 140; SEQ ID Nos: 141 a 156; SEQ ID Nos: 157 a 172; y/o SEQ ID Nos: 173 a 180. Las modalidades de la vacuna de influenza equina pueden comprender por lo menos una secuencia de péptido derivada de los cuatro constructos de discosite equinos ( INFE-A-1-V1-V4 ; SEQ ID Nos: 185 a 248) . En algunas modalidades, la formulación de vacuna equina puede comprender por lo menos dos secuencias de péptidos de cada uno de por lo menos dos de los siguientes grupos: SEQ ID Nos: 185 a 200; SEQ ID Nos: 201 a 216; SEQ ID Nos: 217 a 232; y/o SEQ ID Nos: 233 a 248. Modalidades de la vacuna de influenza aviar pueden comprender una o más secuencias de péptidos de los cuatro constructos de discosite aviares ( INF-HA-2-V1-V4 ; SEQ ID Nos: 65 a 128) . En algunas modalidades, la formulación de vacuna aviar puede comprender por lo menos dos secuencias de péptidos de cada uno de por lo menos dos de los siguientes grupos: SEQ ID Nos: 65 a 80; SEQ ID Nos: 81 a 96; SEQ ID Nos: 97 a 112; y/o SEQ ID Nos: 113 a 128. Se apreciará por la persona de habilidad en el arte que secuencias adicionales pueden o pueden no ser agregadas como se requiera. Las secuencias de péptido para uso en las formulaciones de vacuna de la presente invención son agrupadas de acuerdo con el constructo de discosite (Tablas 1 a 16) o constructo de discotope (Tablas 17 a 18). Las Tablas 1 a 4 enlistan constructos de discosite de la secuencia de epítopo de influenza A (HA-1 humana) . Las Tablas 5 a 8 enlistan constructos de discosite de secuencias de epítopos de influenza A (HA-2 aviar) . Las Tablas 9 a 12 enlistan constructos de discosite de secuencias de epítopo de influenza B (HB-1 humana) . Las Tablas 13 a 16 enlistan constructos de discosite de secuencias de epítopo de influenza equina (HA-1 equina) . En cada uno de los constructos de discosite enlistados en las Tablas, el (los) residuo(s) variable(s) es/son mostrados a continuación el residuo correspondiente en el constructo .
TABLA 1 Constructos de discosite para INF-HA-1-V1 YACKRGGKSSGSSYPVLNVSY (SEQ ID No 1) -S-TM Nombre del peptido Secuencia PM INF-HA-l-Vl/1 YACKRGGKSSGSSYPVLNVSY (SEQ ID NO 1) 2223 47 INF-HA-1-V1/2 YACKRGGKSSGSSYPVLNVS (SEQ ID NO 2) 2191 49 INF-HA-l-Vl/3 YACKRGGKSSGSSYPVLNVTY (SEQ ID NO 3) 2237 5 INF-HA-1-V1/4 YACKRGGKSSGSSYPVLNVTM (SEQ ID NO 4) 2205 52 INF-HA-1-V1/5 YACKRGGKSSGSSYPVLSVSY (SEQ ID NO 5) 2196 44 INF-HA-1-V1/6 YACKRGGKSSGSSYPVLSVSN (SEQ ID NO 6) 2164 47 INF-HA-1-V1/7 YACKRGGKSSGSSYPVLSVTY (SEQ ID NO 7) 2210 47 INF-HA-1-V1/8 YACKRGGKSSGSSYPVLSVTM (SEQ ID NO 8) 2178 49 INF-HA-1-V1/9 YACKHGGKSSGSSYPVLNVSY (SEQ ID NO 9) 2204 42 INF-HA-l-Vl/10 YACKHGGKSSGSSYPVLNVSM (SEQ ID NO 10) 2172 45 INF-HA-l-Vl/11 YACKHGGKSSGSSYPVLNVTY (SEQ ID NO 11) 2218 45 INF-HA-1-V1/12 YACKHGGKSSGSSYPVLNVTM (SEQ ID NO 12) 2186 47 INF-HA-1-V1/13 YACKHGGKSSGSSYPVLSVSY (SEQ ID NO 13) 2177 4 INF-HA-1-V1/14 YACKHGGKSSGSSYPVLSVSM (SEQ ID NO 14) 2145 42 INF-HA-1-V1/15 YACKHGGKSSGSSYPVLSVTY (SEQ ID NO 15) 2191 42 INF-HA-1-V1/16 YACKHGGKSSGSSYPVLSVTM (SEQ ID NO 16) 2159 45 TABLA 2 Constructos de discosite para INF-HA-1-V2 KKGSVHHPSTITEQRSLYVNA (SEQ ID No 17) -T-QQ Nombre del peptido Secuencia PM INF-HA-1-V2/1 KKGSVHHPSTITEQTSLYVNA (SEQ ID NO 17) 2297 53 INF-HA-1-V2/2 KKGSVHHPSTITEQTSLYVQA (SEQ ID NO 18) 2311 55 INF-HA-l-V2/3 KKGSVHHPSTITEQTSLYQNA (SEQ ID NO 19) 2326 53 INF-HA-1-V2/4 KKGSVHHPSTITEQTSLYQQA (SEQ ID NO 20) 2340 55 INF-HA-1-V2/5 KKGSVHHPSTITEQTTLYVNA (SEQ ID NO 21) 2311 55 INF-HA-1-V2/6 KKGSVHHPSTITEQTTLYVQA (SEQ ID NO 22) 2325 58 INF-HA-1-V2/7 KKGSVHHPSTITEQTTLYQNA (SEQ ID NO 23) 2340 55 INF-HA-1-V2/8 KKGSVHHPSTITEQTTLYQQA (SEQ ID NO 24) 2354 58 INF-HA-1-V2/9 KKGSVHHPSTITEQTSLYVNA (SEQ ID NO 25) 2256 43 INF-HA-1-V2/10 KKGSVHHPSTITEQTSLYVQA (SEQ ID NO 26) 2270 46 INF-HA-1-V2/11 KKGSVHHPSTITEQTSLYQNA (SEQ ID NO 27) 2285 43 INF-HA-1-V2/12 KKGSVHHPSTITEQTSLYQQA (SEQ ID NO 28) 2299 46 INF-HA-1-V2/13 KKGSVHHPSTITEQTTLYVNA (SEQ ID NO 29) 2270 46 INF-HA-1-V2/14 KKGSVHHPSTITEQTTLYVQA (SEQ ID NO 30) 2284 48 INF-HA-1-V2/15 KKGSVHHPSTITEQTTLYQNA (SEQ ID NO 31) 2299 46 INF-HA-1-V2/16 KKGSVHHPSTITEQTTLYQQA (SEQ ID NO 32) 2313 48 TABLA 3 Constructos de discosite para INF-HA-1-V3 DVLFSVESPNNKNKDPIDTCD (SEQ ID NO 33) -K-V ES- TABLA 4 Constructos de discotope para INF-HA-1-V4 YVSVSTSRIASRPKVRGQSGR (SEQ ID NO 49) -T—T G SÍ- Nombre del peptido Secuencia PM INF-HA-1-V3/1 YVSVSTSRIASRPKVRGQSGR (SEQ ID NO 49) 2291 57 INF-HA-l-V-S/2 YVSVSTSRIASRP VRGQSGR (SEQ ID NO 50) 2349 61 INF-HA-1-V3/3 YVSVSTSRIGSRPKVRGQSGR (SEQ ID NO 51) 2277 55 INF-HA-1-V3/4 YVSVSTSRIGSRPWVRGQSGR (SEQ ID NO 52) 2335 58 INF-HA-1-V3/5 YVSVSSSRIASRPKVRGQSGR (SEQ ID NO 53) 2277 55 INF-HA-1-V3/6 YVSVSSSRIASRP VRGQSGR (SEQ ID NO 54) 2335 58 INF-HA-1-V3/7 YVSVSSSRIGSRPKVRGQSGR (SEQ ID NO 55) 2263 52 INF-HA-1-V3/8 YVSVSSSRIGSRPWVRGQSGR (SEQ ID NO 56) 2321 56 INF-HA-l-V3/9 YVSVSTSRIASRPKVRGQSGR (SEQ ID NO 57) 2305 6 INF-HA-1-V3/10 YVSVSTSRIASRP VRGQSGR (SEQ ID NO 58) 2363 64 INF-HA-1-V3/11 YVSVSTSRIGSRPKVRGQSGR (SEQ ID NO 59) 2291 57 INF-HA-1-V3/12 YVSVSTSRIGSRPWVRGQSGR (SEQ ID NO 60) 2349 61 INF-HA-1-V3/13 YVSVSSSRIASRPKVRGQSGR (SEQ ID NO 61) 2291 57 INF-HA-1-V3/14 YVSVSSSRIASRPWVRGQSGR (SEQ ID NO 62) 2349 61 INF-HA-1-V3/15 YVSVSSSRIGSRPKVRGQSGR (SEQ ID NO 63) 2277 55 INF-HA-1-V3/16 YVSVSSSRIGSRPWVRGQSGR (SEQ ID NO 64) 2335 58 TABLA 5 Constructos de discotope de influenza A aviar para INF-HA-2-V1 YACKRGGKSSGSSYPVLNVSY (SEQ ID No 65) Y SRT_ Nombre del peptido Secuencia PM INF-HA-2-V1/1 YACKRGGKSSGSSYPVLKVSY (SEQ ID NO 65) 2237 54 INF-HA-2-V1/2 YACKRGGKSSGSSYPVLKVTY (SEQ ID NO 66) 2251 57 INF-HA-2-Vl/3 YACKRGGKSSGSSYPVLKRSY (SEQ ID NO 67) 2294 6 INF-HA-2-V1/4 YACKRGGKSSGSSYPVLKRTY (SEQ ID NO 68) 2308 62 INF-HA-2-V1/5 YACKRGGKSSGSSYPVLSVSY (SEQ ID NO 69) 2196 44 INF-HA-2-V1/6 YACKRGGKSSGSSYPVLSVTY (SEQ ID NO 70) 2210 47 INF-HA-2-V1/7 YACKRGGKSSGSSYPVLSRSY (SEQ ID NO 71) 2253 5 INF-HA-2-V1/8 YACKRGGKSSGSSYPVLSRTY (SEQ ID NO 72) 2267 53 INF-HA-2-V1/9 YACKHGGKSSGSSYPVLKVSY (SEQ ID NO 73) 2244 53 INF-HA-2-V1/10 YACKHGGKSSGSSYPVLKVTY (SEQ ID NO 74) 2258 56 INF-HA-2-V1/11 YACKHGGKSSGSSYPVLKRS (SEQ ID NO 75) 2301 58 INF-HA-2-V1/12 YACKHGGKSSGSSYPVLKRTY (?EQ ID NO 76) 2315 61 INF-HA-2-Vl/l3 YACKHGGKSSGSSYPVLSVSY (SEQ ID NO 77) 2203 43 INF-HA-2-V1/14 YACKHGGKSSGSSYPVLSVTY (SEQ ID NO 78) 2217 46 INF-HA-2-V1/15 YACKHGGKSSGSSYPVLSRSY (SEQ ID NO 79) 2260 49 INF-HA-2-V1/16 YACKHGGKSSGSSYPVLSRTY (SEQ ID NO 80) 2274 51 TABLA 6 Constructos de d scotope de influenza A aviar para INF-HA-2-V2 (Discosite B2) KKGSVHHPSTITEQTSLYVNA (SEQ ID NO 81) K--QQ- Nombre del peptido Secuencia PM INF-HA-2-V2/1 KKGSVHHPSTITEQTSLYVNA (SEQ ID NO 81) 2297 53 INF-HA-2-V2/2 KKGSVHHPSTITEQTSLYVQA (SEQ ID NO 82) 2311 55 INF-HA-2-V2/3 KKGSVHHPSTITEQTSLYQNA (SEQ ID NO 83) 2326 53 INF-HA-2-V2/4 KKGSVHHPSTITEQTSLYQQA (SEQ ID NO 84) 2340 55 INF-HA-2-V2/5 KKGSVHHPSTITEQTKLYVNA (SEQ ID NO 85) 2338 62 INF-HA-2-V2/6 KKGSVHHPSTITEQTKLYVQA (SEQ ID NO 86) 2352 65 INF-HA-2-V2/7 KKGSVHHPSTITEQTKLYQNA (SEQ ID NO 87) 2367 62 INF-HA-2-V2/8 KKGSVHHPSTITEQTKLYQQA (SEQ ID NO 88) 2381 65 INF-HA-2-V2/9 KSGSVHHPSTITEQTSLYVNA (SEQ ID NO 89) 2256 43 INF-HA-2-V2/10 KSGSVHHPSTITEQTSLYVQA (SEQ ID NO 90) 2270 46 INF-HA-2-V2/11 KSGSVHHPSTITEQTSLYQNA (SEQ ID NO 91) 2285 43 INF-HA-2-V2/12 KSGSVHHPSTITEQTSLYQQA (SEQ ID NO 92) 2299 46 INF-HA-2-V2/13 KSGSVHHPSTITEQTKLYVNA (SEQ ID NO 93) 2297 53 INF-HA-2-V2/14 KSGSVHHPSTITEQTKLYVQA (SEQ ID NO 94) 2311 55 INF-HA-2-V2/15 KSGSVHHPSTITEQTKLYQNA (SEQ ID NO 95) 2326 53 INF-HA-2-V2/16 KSGSVHHPSTITEQTKLYQQA (SEQ ID NO 96) 2340 55 TABLA 7 Constructos de discotope de influenza A aviar para INF-HA-2-V3 DVLFSVESPNNKNKDPIDTCD (SEQ ID NO 97) -EE TABLA 8 Constructos de discotope de influenza A aviar para INF-HA-2-V4 YVSVSTSRIASRPKVRGQSGR (SEQ ID NO 113) —T—T G W Nombre del peptido Secuencia PM INF-HA-2-V4/1 YVSVSTSRIASRPKVRGQSGR (SEQ ID NO 113) 2291 57 INF-HA-2-V4/2 YVSVSTSRIASRPWVRGQSGR (SEQ ID NO 114) 2349 61 INF-HA-2-V4/3 YVSVSTSRIGSRPKVRGQSGR (SEQ ID NO 115) 2277 55 INF-HA-2-V4/4 YVSVSTSRIGSRPWVRGQSGR (SEQ ID NO 116) 2335 58 INF-HA-2-V4/5 YVSVSSSRIASRPKVRGQSGR (SEQ ID NO 117) 2277 55 INF-HA-2-V4/6 YVSVSSSRIASRPWVRGQSGR (SEQ ID NO 118) 2335 58 INF-HA-2-V4/7 YVSVSSSRIGSRPKVRGQSGR (SEQ ID NO 119) 2263 52 INF-HA-2-V4/8 YVSVSSSRIGSRPWVRGQSGR (SEQ ID NO 120) 2321 56 INF-HA-2-V4/9 YVSVSTSRIASRPKVRGQSGR (SEQ ID NO 121) 2305 6 INF-HA-2-V4/10 YVSVSTSRIASRPWVRGQSGR (SEQ ID NO 122) 2363 64 INF-HA-2-V4/11 YVSVSTSRIGSRPKVRGQSGR (SEQ ID NO 123) 2291 57 INF-HA-2-V4/12 YVSVSTSRIGSRPWVRGQSGR (SEQ ID NO 124) 2349 61 INF-HA-2-V4/13 YVSVSSSRIASRPKVRGQSGR (SEQ ID NO 125) 2291 57 INF-HA-2-V4/14 YVSVSSSRIASRPWVRGQSGR (SEQ ID NO 126) 2349 61 INF-HA-2-V4/15 YVSVSSSRIGSRPKVRGQSGR (SEQ ID NO 127) 2277 55 INF-HA-2-V4/16 YVSVSSSRIGSRPWVRGQSGR (SEQ ID NO 128) 2335 58 TABLA 9 Constructos de discotope de influenza B humana para INF-B-1-V1 GSCPNATNRNGDNNKTAINPLTVEVPY (SEQ ID NO 133) -S-S- Nombre del peptido Secuencia PM INF-HB-l-Vl/1 GSCPNATNRNGDNNKTAINPLTVEVPY (SEQ ID NO 133) 2860 08 INF-HB-1-V1/2 GSCPNATNRNGDNNKTATNPLTVEVPY (SEQ ID NO 134) 2848 03 INF-HB-1-V1/3 GSCPNATNRSGDNNKTAINPLTVEVPY (SEQ ID NO 135) 2833 06 INF-HB-1-V1/4 GSCPNATNRSGDNNKTATNPLTVEVPY (SEQ ID NO 136) 2821 INF-HB-1-V1/5 GSCPNATSRNGDNNKTAINPLTVEVPY (SEQ ID NO 137) 2833 06 INF-HB-1-V1/6 GSCPNATSRNGDNNKTATNPLTVEVPY (SEQ ID NO 138) 2821 INF-HB-1-V1/7 GSCPNATSRSGDNNKTAINPLTVEVPY (SEQ ID NO 139) 2806 03 INF-HB-1-V1/8 GSCPNATSRSGDNNKTATNPLTVEVPY (SEQ ID NO 140) 2793 98 TABLA 10 Constructos de discotope de influenza B humana para INF-HB-1-V2 PKDNFHSDNKTQMERLYGDSN (SEQ ID NO 141) RN- -KN- Nombre del peptido Secuencia PM INF-HB-1-V2/1 PKDNFHSDNKTQMERLYGDSN (SEQ ID NO 141) 2496 63 INF-HB-1-V2/2 PKDNFHSDNKTQMENLYGDSN (SEQ ID NO 142) 2454 55 INF-HB-1-V2/3 PKDNFHSDNKTQMKRLYGDSN (SEQ ID NO 143) 2495 69 INF-HB-1-V2/4 PKDNFHSDNKTQMKNLYGDSN (SEQ ID NO 144) 2453 61 INF-HB-1-V2/5 PNDNFHSDNKTQMERLYGDSN (SEQ ID NO 145) 2482 56 INF-HB-1-V2/6 PNDNFHSDNKTQMENLYGDSN (SEQ ID NO 146) 2440 48 INF-HB-1-V2/7 PNDNFHSDNKTQMKRLYGDSN (SEQ ID NO 147) 2481 62 INF-HB-1-V2/8 PNDNFHSDNKTQMKNLYGDSN (SEQ ID NO 148) 2439 54 INF-HB-1-V2/9 PKDNFHSDNKTQMERLYGDSN (SEQ ID NO 149) 2555 7 INF-HB-1-V2/10 PKDNFHSDNKTQMENLYGDSN (SEQ ID NO 150) 2513 62 INF-HB-1-V2/11 PKDNFHSDNKTQMKRLYGDSN (SEQ ID NO 151) 2554 76 INF-HB-1-V2/12 PKDNFHSDNKTQMKNLYGDSN (SEQ ID NO 152) 2512 68 INF-HB-1-V2/13 PNDNFHSDNKTQMERLYGDSN (SEQ ID NO 153) 2541 63 INF-HB-1-V2/14 PNDNFHSDNKTQMENLYGDSN (SEQ ID NO 154) 2499 55 INF-HB-1-V2/15 PNDNFHSDNKTQMKRLYGDSN (SEQ ID NO 155) 2540 69 INF-HB-1-V2/16 PNDNFHSDNKTQMKNLYGDSN (SEQ ID NO 156) 2498 61 TABLA 11 Constructos de discotope de influenza humana para INF-HB-1-V3 RGKLCPNCFNCTDIICSEGEDLPLIGE (SEQ ID NO 157) Nombre del peptido Secuencia PM INF-HB-1-V3/1 RGKLCPNCFNCTDIICSEGEDLPLIGE (SEQ ID NO 157) 2940 INF-HB-1-V3/2 RGKLCPNCFNCTDIICSKGEDLPLIGE (SEQ ID NO 158) 2939 INF-HB-1-V3/3 RGKLCPNCFNCTDIICTEGEDLPLIGE (SEQ ID NO 159) 2954 INF-HB-1-V3/4 RGKLCPNCFNCTDIICTKGEDLPLIGE (SEQ ID NO 160) 2953 INF-HB-1-V3/5 RGKLCPNCFNCTDIICSEGEDLPLIGE (SEQ ID NO 161) 2940 INF-HB-1-V3/6 RGKLCPNCFNCTDIICSKGEDLPLIGE (SEQ ID NO 162) 2939 INF-HB-l-V3/7 RGKLCPNCFNCTDIICTEGEDLPLIGE (SEQ ID NO 163) 2954 INF-HB-l-V3/8 RGKLCPNCFNCTDIICTKGEDLPLIGE (SEQ ID NO 164) 2953 INF-HB-l-V3/9 RGKLCPNCLNCTDIICSEGEDLPLIGE (SEQ ID NO 165) 2906 INF-HB-1-V3/10 RGKLCPNCLNCTDIICSKGEDLPLIGE (SEQ ID NO 166) 2905 INF-HB-1-V3/11 RGKLCPNCLNCTDIICTEGEDLPLIGE (SEQ ID NO 167) 2920 INF-HB-1-V3/12 RGKLCPNCLNCTDIICTKGEDLPLIGE (SEQ ID NO 168) 2919 INF-HB-1-V3/13 RGKLCPNCLNCTDIICSEGEDLPLIGE (SEQ ID NO 169) 2906 INF-HB-1-V3/14 RGKLCPNCLNCTDIICSKGEDLPLIGE (SEQ ID NO 170) 2905 INF-HB-1-V3/15 RGKLCPNCLNCTDIICTEGEDLPLIGE (SEQ ID NO 171) 2920 INF-HB-1-V3/16 RGKLCPNCLNCTDIICTKGEDLPLIGE (SEQ ID NO 172) 2919 TABLA 12 Constructos de influenza B humana para INF-HB-1-V4 KFTSSANGIGGFPNQTEDEGLKQSGR (SEQ ID NO 173) -D G—P- TABLA 13 Constructos de discotope de influenza equina para INFE-HA-1-V1 SCAKRRSASSNAAFPQMNKTM (SEQ ID NO 185) ?_ —T-SY Nombre del peptido Secuencia PM INF-HA-l-Vl/1 SCAKRRSASSNAAFPQMNKTM (SEQ ID NO 185) 2286 62 INF-HA-1-V1/2 SCAKRRSASSNAAFPQMNKTY (SEQ ID NO 186) 2318 6 INF-HA-1-V1/3 SCAKRRSASSNAAFPQMNKSM (SEQ ID NO 187) 2272 6 INF-HA-1-V1/4 SCAKRRSASSNAAFPQMNKSY (SEQ ID NO 188) 2304 57 INF-HA-1-V1/5 SCAKRRSASSNAAFPQMNKTM (SEQ ID NO 189) 2273 62 INF-HA-1-V1/6 SCAKRRSASSNAAFPQMNKTY (SEQ ID NO 190) 2305 6 INF-HA-1-V1/7 SCAKRRSASSNAAFPQMNKSM (SEQ ID NO 191) 2259 6 INF-HA-1-V1/8 SCAKRRSASSNAAFPQMNKSY (SEQ ID NO 192) 2291 57 INF-HA-1-V1/9 SCAKRRSASSNAAYPQMTKTM (SEQ ID NO 193) 2302 62 INF-HA-l-Vl/10 SCAKRRSASSNAAYPQMTKTY (SEQ ID NO 194) 2334 6 INF-HA-l-Vl/11 SCAKRRSASSNAAYPQMTKSM (SEQ ID NO 195) 2288 6 INF-HA-1-V1/12 SCAKRRSASSNAAYPQMTKSY (SEQ ID NO 196) 2320 57 INF-HA-1-V1/13 SCAKRRSASSNAAYPQMTKTM (SEQ ID NO 197) 2289 62 INF-HA-1-V1/14 SCAKRRSASSNAAYPQMTKTY (SEQ ID NO 198) 2321 6 INF-HA-1-V1/15 SCAKRRSASSNAAYPQMTKSM (SEQ ID NO 199) 2275 6 INF-HA-1-V1/16 SCAKRRSASSNAAYPQMTKSY (SEQ ID NO 200) 2307 57 TABLA 14 Constructos de discotope de influenza equina para INFE-HA-1-V2 SSTDNAIHHSSSNQEQTKLYVQE (SEQ ID NO 201) - P T S- Nombre del peptido Secuencia PM INF-HA-1-V2/1 SSTDNAIHHSSSNQEQTKLYVQE (SEQ ID NO 201) 2603 67 INF-HA-1-V2/2 SSTDNAIHHS?SNQEQTKLYVSE (SEQ ID NO 202) 2562 62 INF-HA-1-V2/3 SSTDNAIHHSSSNTEQTKLYVQE (SEQ ID NO 203) 2576 64 INF-HA-1-V2/4 SSTDNAIHHSSSNTEQTKLYVSE (SEQ ID NO 204) 2535 59 INF-HA-1-V2/5 SSTDNAIHHSSSNQEQTKLYVQE (SEQ ID NO 205) 2613 71 INF-HA-1-V2/6 SSTDNAIHHSSSNQEQTKLYVSE (SEQ ID NO 206) 2572 66 INF-HA-1-V2/7 SSTDNAIHHSSSNTEQTKLYVQE (SEQ ID NO 207) 2586 68 INF-HA-1-V2/8 SSTDNAIHHSSSNTEQTKLYVSE (SEQ ID NO 208) 2545 63 INF-HA-1-V2/9 SSTDNAIHHSSSNQEQTKLYVQE (SEQ ID NO 209) 2630 69 INF-HA-1-V2/10 SSTDNAIHHSSSNQEQTKLYVSE (SEQ ID NO 210) 2589 64 INF-HA-1-V2/11 SSTDNAIHHSSSNTEQTKLYVQE (SEQ ID NO 211) 2603 67 INF-HA-1-V2/12 SSTDNAIHHSSSNTEQTKLYVSE (SEQ ID NO 212) 2562 62 INF-HA-1-V2/13 SSTDNAIHHSSSNQEQTKLYVQE (SEQ ID NO 213) 2640 73 INF-HA-1-V2/14 SSTDNAIHHSSSNQEQTKLYVSE (SEQ ID NO 214) 2599 68 INF-HA-1-V2/15 SSTDNAIHHS?SNTEQTKLYVQE (SEQ ID NO 215) 2613 71 INF-HA-1-V2/16 SSTDNAIHHSSSNTEQTKLYVSE (SEQ ID NO 216) 2572 66 TABLA 15 Constructos de discotope de influenza equina para INFE-HA-1-V3 DQFQEESPNNRNFDPDDNCE (SEQ ID NO 217) Nombre del peptido Secuencia PM INF-HA-1-V3/1 DQFQEESPNNRNFDPDDNCE (SEQ ID NO 217) 2413 36 INF-HA-1-V3/2 DQFQEESPNNRNFPPDDNCE (SEQ ID NO 218) 2395 39 INF-HA-l-V3/3 DQFQEESPNTRNFDPDDNCE (SEQ ID NO 219) 2400 36 INF-HA-1-V3/4 DQFQEESPNTRNFPPDDNCE (SEQ ID NO 220) 2382 39 INF-HA-l-V3/5 DQFQEFSPNNRNFDPDDNCE (SEQ ID NO 221) 2431 32 INF-HA-l-V3/6 DQFQEFSPNNRNFPPDDNCE (SEQ ID NO 222) 2413 45 INF-HA-l-V3/7 DQFQEFSPNTRNFDPDDNCE (SEQ ID NO 223) 2418 42 INF-HA-l-V3/8 DQFQEFSPNTRNFPPDDNCE (SEQ ID NO 224) 2400 45 INF-HA-l-V3/9 DQFLEESPNNRNFDPDDNCE (SEQ ID NO 225) 2398 39 INF-HA-1-V3/10 DQFLEESPNNRNFPPDDNCE (SEQ ID NO 226) 2380 42 INF-HA-1-V3/11 DQFLEESPNTRNFDPDDNCE (SEQ ID NO 227) 2385 39 INF-HA-1-V3/12 DQFLEESPNTRNFPPDDNCE (SEQ ID NO 228) 2367 42 INF-HA-1-V3/13 DQFLEFSPNNRNFDPDDNCE (SEQ ID NO 229) 2416 45 INF-HA-1-V3/14 DQFLEFSPNNRNFPPDDNCE (SEQ ID NO 230) 2398 48 INF-HA-1-V3/15 DQFLEFSPNTRNFDPDDNCE (SEQ ID NO 2_¡1) 2403 45 INF-HA-1-V3/16 DQFLEFSPNTRNFPPDDNCE (SEQ ID NO 232) 2385 48 TABLA 16 Constructos de discotope de influenza equina para INFE-HA-1-V4 RITVSTSRPGARPWVRSQSGR (SEQ ID NO 233) S S--Q-N Nombre del Secuencia PM peptido INF-HA-1-V4/1 RITVSTSRPGARPWVRSQSGR (SEQ ID NO 233) 2324 61 INF-HA-1-V4/2 RITVSTSRPGARPWVNSQSGR (SEQ ID NO 234) 2282 52 INF-HA-1-V4/3 RITVSTSRPGARPQVRSQSGR (SEQ ID NO 235) 2266 53 INF-HA-1-V4/4 RITVSTSRPGARPQVNSQSGR (SEQ ID NO 236) 2224 44 INF-HA-1-V4/5 RITVSTSRPGSRPWVRSQSGR (SEQ ID NO 237) 2340 61 INF-HA-1-V4/6 RITVSTSRPGSRPWVNSQSGR (SEQ ID NO 238) 2298 52 INF-HA-1-V4/7 RITVSTSRPGSRPQVRSQSGR (SEQ ID NO 239) 2282 52 INF-HA-1-V4/8 RITVSSSRPGSRPQVNSQSGR (SEQ ID NO 240) 2240 44 INF-HA-1-V4/9 RITVSSSRPGARPWVRSQSGR (SEQ ID NO 241) 2310 58 INF-HA-1-V4/10 RITVSSSRPGARPWVNSQSGR (SEQ ID NO 242) 2268 5 INF-HA-1-V4/11 RITVSSSRPGARPQVRSQSGR (SEQ ID NO 243) 2252 5 INF-HA-1-V4/12 RITVSSSRPGARPQVNSQSGR (SEQ ID NO 244) 2210 42 INF-HA-1-V4/13 RITVSSSRPGSRPWVRSQSGR (SEQ ID NO 245) 2326 58 INF-HA-1-V4/14 RITVSSSRPGSRPWVNSQSGR (SEQ ID NO 246) 2284 5 INF-HA-1-V4/15 RITVSSSRPGSRPQVRSQSGR (SEQ ID NO 247) 2268 5 INF-HA-1-V4/16 RITVSSSRPGSRPQVNSQSGR (SEQ ID NO 248) 2226 42 Las tablas 17 y 18 enlistan secuencias de constructo de discotope (para influenzas A y B, respectivamente) que pueden ser usadas en la preparación de una vacuna de acuerdo con la presente invención.
TABLA 17 Constructos de Discotope de influenza A TABLA 18 Constructos de Discotope de influenza B Sintesis de péptidos Los péptidos fueron sintetizados utilizando química de péptidos en fase sólida estándar. Los péptidos fueron sintetizados utilizando química de péptidos en fase sólida (SPPS) utilizando química de 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) en el sintetizado de péptidos automatizado Pioneer™, utilizando resina de TGT de NovaSyn™ (NovaBiochem) protegida por Fmoc precargada como se describe. En donde se desea variabilidad en una posición dada, la mezcla de dos aminoácidos es colocada en aquella posición. Esto es repetido cada vez durante la síntesis siempre que se desea variabilidad. En tanto que una solución 1 M de tetrafluoroborato de 2- ( lH-benzotriazol-1-il) -1, 1, 3, 3-tetrametilamonio (TBTU) y N-hidroxibenzotriazol (HOBt) en dimetilformamida (DMF) y una solución 1 M de diisopropiletilamina (DIPEA) en DMF fue usada para el acoplamiento de aminoácidos, piperidina al 20% en DMF fue usada para desbloquear aminoácidos durante la síntesis. Se permite que ocurra el acoplamiento por una hora a temperatura ambiente. Después que el último aminoácido fue acoplado, la resina fue tomada del sintetizador y lavada sobre un embudo de vidrio sinterizado varias veces con DMF, con 2- propanol y con diclorometileno (DCM) y secada bajo alto vacío. Las mezclas de péptidos son escindidas y desprotegidas mediante la adición de una solución que contiene TFA/agua/fenol/EDT/TIS [ 82 : 5 : 5 : 5 : 2 : 1] . La resina fue incubada a temperatura ambiente durante 4 horas. Luego la mezcla de escisión fue filtrada bajo presión reducida a un matraz que contiene un volumen de 10 veces de éter frío. La resina fue también enjuagada dos veces con TFA en la misma solución de éter. El siguiente a incubación durante 30 minutos en un congelador para ayudar a la precipitación, la muestra fue centrifugada a 1,000 x g durante 5 minutos y el éter fue removido. Este proceso de extracción fue repetido tres veces. Enseguida de una extracción de éter final, el solvente orgánico residual fue evaporado bajo gas hidrógeno y la mezcla de péptidos fue re-disuelta en agua y purificada utilizando cromatografía líquida de alto desempeño (HPLC) . El exceso del solvente fue removido al usar un evaporador rotativo y finalmente liofilizado a un polvo seco. Se efectuó la espectrometría de masas (MS) y análisis de aminoácidos en todos los constructos de discotope para asegurar que tengan el contenido de péptido apropiado. Las Figuras 1 a 4 ilustran datos de HPLC de los constructos de discosite de la presente invención. Cada gráfica de HPLC corresponde a una formulación de constructo de discosite particular, que contiene un coctel de péptidos en el constructo de discosite respectivo. Las Figuras ÍA a ID corresponden a constructos de discosite INFE-HA-1-V1 a V4 (SEQ ID Nos: 185 a 248), respectivamente. Las Figuras 2A a 2D corresponden a constructos de discosite INF-HA-1-V1 a V4 (SEQ ID Nos: 1 a 64), respectivamente. Las Figuras 3A a 3D corresponden a constructos de discosite INF-HA-2-V1 a V4 , (SEQ ID Nos: 65 a 128), respectivamente. Las Figuras 4A a 4D corresponden a constructos de discosite INF-HB-1-V1 a V4 (SEQ ID Nos: 133 a 180), respectivamente. Las Figuras 5 a 8 ilustran datos de MS de los constructos de discosite de la presente invención. Como con las gráficas de HPLC, cada gráfica de MS corresponde a una formulación de constructo de discosite particular, que contiene un coctel de péptidos en el constructo de discosite respectivo. Las Figuras 5A a 5D corresponden a constructos de discosite INFE-HA-1-V1 a V4 (SEQ ID Nos: 185 a 248), respectivamente. Las Figuras 6A a 6D corresponden a constructos de discosite INF-HA-1-V1 a V4 (SEQ ID Nos: 1 a 64), respectivamente. Las Figuras 7A a 7D corresponden a constructos de discosite INF-HA-2-V1 a V4 , (SEQ ID Nos: 65 a 128), respectivamente. Las Figuras 8A a 8D corresponden a constructos de discosite INF-HB-1-V1 a V4 (SEQ ID Nos: 133 a 180), respectivamente.
Ejemplos Dos vacunas ejemplares, INF-01P (INF-HA-1-V1-V ) e INFE-01P (INFE-HA-V1-V4) , fueron preparadas de acuerdo con la presente invención. Las vacunas fueron preparadas basadas en formulaciones que comprenden secuencias de péptidos derivadas de epítopos de influenza A y como se enlista en las Tablas 1 a 4 (SEQ ID Nos: 1 a 64) y Tablas 13 a 16 (SEQ ID Nos: 185 a 248) y resumidas en las Tablas 19 y 20 a continuación. Utilizando un modelo murino, las vacunas fueron probadas: a) para determinar que la adición de adyuvantes mejora la inmunidad contra el desafío; b) para determinar la respuesta humoral inducida por vacunas candidatas en comparación con vacuna comercial en un modelo murino y c) para determinar el intervalo de protección producido por la vacuna contra el tratamiento de influenza utilizando diferentes cepas de virus de influenza. Programación de vacuna : Los grupos de ratones fueron vacunados subcutáneamente en la base la cola; los ratones que reciben la vacuna comercial fueron inmunizados intramuscularmente (como es recomendado) . Los ratones fueron reforzados similarmente dos veces adicionales, a intervalos de tres semanas. Dos semanas después de la última inmunización, los ratones fueron desafiados con una dosis mortal de H3N2. Los ratones fueron monitoreados diariamente después del desafío en cuanto a peso y signos de infección. Adyuvantes : Los siguientes adyuvantes fueron usados para reforzar respuestas inmunes en combinación con la vacuna: Ribi (Cedarlane, proporción 1:1 de Ribi : vacuna) , Alumbre (Sigma, volúmenes iguales de 500 ng/ml y vacuna) y Montanide (Seppic, proporción 1:1 de Montanide : acuna) . En el ejemplo presente, se usó Alumbre como adyuvante, aunque cualquier adyuvante apropiado puede ser usado.
EJEMPLO 1 En el ejemplo presente, ratones B6 fueron inmunizados con vacuna INF-01P más ya sea Alum, Ribi o Montanide o la vacuna comercial (temporada 2004-2005) . El suero se obtuvo de ratones vacunados un día antes del desafío con el virus. Los ratones fueron desafiados con el virus A/HK/l/68-MA20c patógeno y seguido por tres semanas post-desafío. La vacuna INF-01P está basada en cuatro formulaciones de constructo de discosite de secuencia de influenza humana como se muestra en la Tabla 19: TABLA 19 Formulación de vacuna para influenza INF-01P INF-HA-l-Vl (SEQ ID NO 1) YACKRGGKS?GSSYPVLNVSY (SEQ ID Nos 1 a 16) H S-TM INF-HA-1-V2 (SEQ ID NO 17) KKGSVHHPSTITEQTSLYVNA (SEQ ID Nos 17 a 32) -S T--QQ- INF-HA-1-V3 (SEQ ID NO 33) DVLFSVESPNNKNKDPIDTCD (SEQ ID NO 33 A 48) K-V ES INF-HA-1-V4 (SEQ ID NO 49) YVSVSTSRIASRPKVRGQSGR (SEQ ID NO 49 a 64) —T—T G W La Figura 9 muestra la inducción de inmunidad humoral mediante vacunación de INF-01P tal como se mide mediante títulos HAl. Como se muestra en este ejemplo, los ratones inmunizados con INF-01P más vacuna de Alum tuvieron inmunidad humoral incrementada en comparación con ratones inmunizados con INF-01P más Ribi o INF-01P más Montanide y en comparación con la vacuna de influenza actual. La Figura 10 muestra una gráfica de supervivencia de ratones vacunados con INF-01P contra el desafío con H3N2. En este ejemplo, los ratones inmunizados con INF-01P más vacuna de Alum están mejor protegidos y tienen una mejor proporción de supervivencia contra el desafío en comparación con INP-01P más Robo o INF-01P más Montanide. La Figura 11 ilustra el porciento de pérdida de peso en ratones desafiados vacunados con INF-01P. Como se muestra en el ejemplo presente, los ratones inmunizados con INF-01P más Alum fueron más protegidos contra la pérdida de peso de ratones inmunizados con INF-01P más Ribi o INF-01P más Montanide .
EJEMPLO 2 Ratones B6 fueron inmunizados con vacuna INFE-01P (gripa equina) más ya sea Alum o la vacuna comercial (temporada 2004-2005). El suero de los ratones fueron probados en cuanto a actividad HAl contra varias cepas de influenza (H3N2 A/Hong Kong/68g, H1N1 A/FM/1/47, H5N1 A/Hong Kong/213/2003, B/Masa/3/66 y H1N1 A/Nueva Caledonia/20/1999) . Los sueros fueron obtenidos después de la primera vacunación. La vacuna INFE-01P está basada en cuatro formulaciones de constructo de discosite de secuencia de influenza equina como se muestra en la Tabla 20: TABLA 20: Formulación de vacuna para infj uenza equina INFE-01P INFE-HA-1-V1 (SEQ ID NO. 185) SACKRRSASSNAAFPQMNKTM (SEQ ID Nos 185 a 200) Y t_s? INFE-HA-1-V2 (SEQ ID NO: 201) SSRDNAIHHSSSNQEQTKLYVQE (SEQ ID Nos. 201 a 216) -N P T S- INFE-HA-1-V3 (SEQ ID NO. 217) DQFQEESPNNRNFDPDDNCE (SEQ ID Nos: 217 a 232) L-F T P INFE-HA-1-V4 (SEQ ID NO: 233) RITVSTSRPGARPWVRGQSGR (SEQ ID NO: 233 a 248) S S Q-N La Figura 12 ilustra inmunidad humoral en ratones inmunizados con INFE-01P, tal como se mide mediante títulos de HAl. Como se ilustra, se indujo inmunidad humoral en ratones inmunizados con esta formulación de vacuna equina ejemplar contra varias cepas de virus de influenza y en comparación con la vacuna comercial o ratones con adyuvantes solamente (control).
EJEMPLO 3 Análisis de hemaglutinación (HAl) : La inmunogenicidad de los constructos de discotope individuales y combinados fue evaluada en ratones. Ratones inmunizados con los cuatro constructos de discotope desarrollaron colectivamente anticuerpos que podrían inhibir la actividad de hemaglutinación viral. Constructos de discotope a base de influenza se mostró que emitan exitosamente epítopos discontinuos en que anticuerpos fueron producidos que inhibieron la hemaglutinación de células de sangre roja por virus de influenza. Un análisis de HAl estándar fue usado para medir la inducción de anticuerpos funcionalmente relevantes contra HA. Numerosas cepas distintas de influenza fueron usadas para probar títulos de HAl inducidos por candidatos de vacuna a fin de determinar el espectro de inmunidad inducido por las preparaciones de vacuna. La Figura 13 ilustra los resultados de un análisis de hemaglutinación efectuado en un estudio de vacuna murino. Cada grupo de vacuna recibió una formulación de vacuna de influenza diferente o solución salina de pH regulado de fosfato (control negativo) . Cuando son incubados con virus (influenza subtipo H3), sangre con hemaglutinato (turbio); cuando la aglutinación es protegida o inhibida, el RBC permanece en una pelotilla (circulo oscuro) . Estos resultados exhiben la intensidad de inhibición de hemaglutinación exhibida por las vacunas candidatas de VBl, en comparación con una vacuna comercial con licencia para influenza. Nótese que cada una de las vacunas candidatas de VBl y combinaciones de adyuvantes exhiben inhibición de hemaglutinación (Hl) igual o mayor como la vacuna comercial (hasta 1/40 - 1/80) . Los inmunógenos de constructo de discosite con adyuvante de Alum (hilera 12) demostraron Hl detectable a unas diluciones de hasta 1/320.
Tabla 21 Título reciproco para diferentes tratamientos Inmunógeno Título reciproco Control sin vacunar 10 Vacuna comercial 80 Inmunogenos Discosite + Montanide 80 Inmunógenos Discotope + Ribi 160 Inmunógenos Discosite + Alum 320 La Figura 14 muestra los resultados de la prueba de ELISA de Vacuna de Influenza. Estos están basados en datos presentados en la Tabla 22.
Tabla 22: Resultados de prueba de ELISA de Vacuna de Influenza 1/50 í/ioo 1/300 1/900 1/2700 í/ßioo Gl 1.538 1.295 0.921 0.665 0.358 0.134 G2 1.965 1.319 0.818 0.595 0.455 0.145 G3 1.559 1.321 0.771 0.583 0.367 0.121 G4 1.427 1.24 0.854 0.564 0.446 0.149 G5 1.258 1.13 0.667 0.456 0.335 0.141 G6 1.298 0.926 0.623 0.45 0.329 0.13 G7 1.416 0.912 0.571 0.421 0.251 0.135 G8 1.4 1.177 0.753 0.453 0.271 0.16 G9 1.686 1.355 0.795 0.477 0.291 0.193 G10 1.21 0.95 0.613 0.475 0.296 0.176 Gil 2.82 2.29 1.467 0.77 0.455 0.236 G12 2.959 2.944 2.699 2.174 1.146 0.559 G13 0.694 0.547 0.343 0.289 0.253 0.16 Gl = IFN-1 de constructo discosite (SEQ ID Nos: 1 a 16)+R?b?, G2 = IFN-2 de constructo discosite (SEQ ID Nos: 17 a 32)+R?b?; G3 = IFN-3 de constructo discosite (SEQ ID Nos: 33 a 48)+R?b?; G4 = IFN-4 de constructo discosite (SEQ ID Nos: 49 a 64)+R?b?; G5 = Constructo discotope 1 (SEQ ID NO: 129)+R?b?; G6 = Constructo discotope 2 (SEQ ID NO- 130)+R?b?; G7 = Constructo discotope 3 (SEQ ID NO. 131)+ Ribi; G8 = Constructo discotope 4 ()SEQ ID NO: 132)+R?b?; G9 = Control (Ribi solo) ; G10 = Constructo discosite IFN-l-4+R?b?; Gil = Constructo discotope 1-4+R?b?; G12 = Costructo discosite IFN-l-4+Montan?de; y G13 = Vacuna comercial.
Colectivamente, estos datos sugieren un procedimiento fundamentalmente nuevo al desarrollo de vacuna de influenza que da como resultado una producción de vacuna más rápida y producción más amplia que vacuna de influenza actuales. Este procedimiento puede ser de valor al desarrollo de una vacuna de influenza pandémica. Las modalidades descritas anteriormente de la presente invención pretenden ser ejemplos solamente. Alteraciones, modificaciones y variaciones pueden ser efectuadas a las modalidades particulados por aquellos de habilidad en el arte sin desviarse del alcance de la invención, que es definido solamente por las reivindicaciones adjuntas a la presente. Todas las referencias son incorporadas en la presente por referencia.

Claims (12)

  1. REIVINDICACIONES 1. Una formulación anti-influenza a- base de péptido caracterizada porque comprende por lo menos dos péptidos seleccionados del grupo que consiste de SEQ ID Nos: 1 a 248.
  2. 2. La formulación de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque comprende SEQ ID Nos: 1 a 248.
  3. 3. Una formulación anti-influenza a base de péptido caracterizada porque comprende 2n secuencias de péptido de cada una de por lo menos dos de los siguientes grupos: a) SEQ ID Nos: 1 a 16; b) SEQ ID Nos: 17 a 32; c) SEQ ID Nos: 33 a 48; o d) SEQ ID Nos: 49 a 64, en donde n es 1 a 4. 4. Una formulación anti-influenza a base de péptido caracterizada porque comprende de por lo menos dos grupos a) a) 2n secuencias de péptidos de SEQ ID Nos: 141 a 156; b) 2m secuencias de péptidos de SEQ ID Nos: 133 a 140; c) 2n secuencias de péptidos de SEQ ID Nos: 157 a 172; o d) 2m secuencias de péptidos de SEQ ID Nos: 173 a 180, en donde m es l a 3 y n es l a
  4. 4 .
  5. 5. Una formulación anti-influenza a base de péptido caracterizada porque comprende 2n secuencias de péptido de cada uno de por lo menos dos de los siguientes grupos: a) SEQ ID Nos: 185 a 200; b) SEQ ID Nos: 201 a 216; c) SEQ ID Nos: 217 a 232; o d) SEQ ID Nos: 233 a 248, en donde n es de 1 a 4.
  6. 6. Una formulación anti-influenza a base de péptido caracterizada porque comprende 2n secuencias de péptido de cada uno de por lo menos dos de los siguientes grupos: a) SEQ ID Nos: 65 a 80; b) SEQ ID Nos: 81 a 96; c) SEQ ID Nos: 97 a 112; o d) SEQ ID Nos: 113 a 128, en donde n es de 1 a .
  7. 7. La formulación de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada porque comprende además SEQ ID Nos: 129 a 132 o SE ID Nos: 181 a 182.
  8. 8. La formulación de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque comprende SEQ ID Nos: 1 a 64.
  9. 9. La formulación de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque comprende SEQ ID Nos: 185 a 248.
  10. 10. La formulación de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque comprende SEQ ID Nos: 65 a 128.
  11. 11. La formulación de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada porque comprende SEQ ID Nos: 133 a 180. 12. Una vacuna caracterizada porque comprende la formulación de conformidad con la reivindicación 1 junto con un diluyente o portador aceptable farmacéuticamente. 13. La vacuna de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada porque comprende además un adyuvante. 14. La vacuna de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada porque el adyuvante es alumbre. 15. El uso de la formulación de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque es para la preparación de una vacuna para prevenir o tratar influenza en un animal en necesidad de la misma. 16. El uso de la formulación de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el animal es humano, murino, equino o aviar. 17. El uso de la formulación de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque es para la preparación de una vacuna para el tratamiento de influenza humana. 18. El uso de la formulación de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque es para la preparación de una vacuna para el tratamiento de influenza equina. 19. El uso de la formulación de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque es para la preparación de una vacuna para el tratamiento de influenza aviar. 20. El uso de la formulación de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque es para prevenir o tratar influenza. 21. Un método para prevenir o tratar influenza en un animal en necesidad del mismo caracterizado porque comprende administrar al animal una cantidad efectiva de la vacuna de conformidad con la reivindicación
  12. 12.
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