JP2008542259A - 2−インドリルイミダゾ[4,5‐d]フェナントロリン派生物および癌治療におけるそれらの使用 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、癌療法の分野に関し、特に癌の治療における2‐インドリルイミダゾ[4,5‐d]フェナトリン派生物の使用に関する。
[発明の背景]
この参考資料は、出願者が考える周知の情報が本発明と関連性があるという可能性を示すために提供される。必ずしも承認を目的とせず、これまでのいかなる情報が本発明に反対して先行技術を構成していると解釈されるべきではない。
本発明の目的は、2‐インドリルイミダゾ[4,5‐d]フェナトリン派生物および癌の治療におけるその使用の提供である。本発明の一形態によると、癌細胞の増殖を阻害する際の、構造式(I)を有する化合物、またはその塩の使用が提供され、
R5はH、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アシル、‐CH2‐アリール、‐CH2‐ヘテロアリールである。
本発明のもう1つの形態によると、細胞において遷移金属イオンをキレートする際の、構造式(I)を有する化合物、またはその塩の使用が提供される。
式中、R1、R2、R3、R4は、単独で水素、ハロゲン、C1‐C4アルキル、C1‐C4アルコキシ、またはC6‐C14アリールであり、
R5は、水素、C1‐C4アルキル、C6‐C14アリールで置換されたC1‐C4アルキル、またはC4‐C6シクロアルキルであり、
R6は、水素、ハロゲン、C1‐C4アルキル、ヘテロ原子がNであるC5‐C6ヘテロシクロアルキルで置換されたC1‐C4アルキル、C6‐C14アリール、C1‐C4アルキルまたはハロで置換されたC6‐C14アリール、C5‐C6シクロアルキル、C5‐C6ヘテロシクロアルキル、またはポリシクロアルキルである。
式中、R1、R2、R3、R4が、単独で水素、ハロゲン、C1‐C4アルキル、C1‐C4アルコキシ、またはフェニルであり、
R5は、水素、C1‐C4アルキル、フェニルで置換されたC1‐C4アルキル、またはシクロペンチルであり、
R6は、水素、ハロゲン、C1‐C4アルキル、ヘテロ原子がNであるC5‐C6ヘテロシクロアルキルで置換されたC1‐C4アルキル、フェニル、C1‐C4アルキルまたはハロで置換されたフェニル、C5‐C6シクロアルキル、C5‐C6ヘテロシクロアルキル、またはアダマンタンであり、およびR7は、Hである。
[発明の詳細な説明]
別に定義されていない限り、本明細書で使用されるすべての専門用語および科学用語は、本発明が所属する分野の当業者によって共通に理解される意味と同じである。
本発明の1つの実施例において、式Iの化合物の抗癌活性に関して本明細書において使用される「選択的阻害」は、NCI‐NIH開発治療プログラムin vitroスクリーン(以下の表1)で使用される60の癌細胞株のうち少なくとも50から構成される癌細胞株のパネルを使用して定義可能であり、パネルは、挙げられる前立腺癌細胞株と挙げられるその他の癌両方のそれぞれからの少なくとも4つの培養細胞株で構成される。化合物は、化合物が乳癌、中枢神経系癌、黒色腫、卵巣癌および腎臓癌のそれぞれからの培養細胞株の阻害に対する平均GI50より少なくとも10%低い平均GI50を有する選択された癌(すなわち、前立腺癌、大腸癌、非小細胞肺癌および/または白血病)からの培養細胞株の増殖を阻害するとき、選択された癌の選択的阻害を示すと言われている。
一例として、大腸癌細胞は正常の結腸細胞と比べてKLF4遺伝子の発現減少を示し、前立腺癌細胞は正常の前立腺癌細胞を比べると同レベルのKLF4発現を示すが、発現レベルは、KLF4を過剰発現する乳癌細胞より低い。
用語「ヒドロキシル」は、‐OHの基を言及する。
用語「チオール」または「メルカプト」は、‐SH、および‐S(O)0‐2の基を言及する。
用語「低アルキル」は、1から8の炭素原子の直鎖または分鎖、または環状、アルキル基を言及する。
用語「置換低アルキル」は、ヒドロキシル、チオール、アルキルチオール、ハロゲン、アルコキシ、アミノ、アミド、カルボキシル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、ヘテロサイクル、置換ヘテロサイクル、シクロへテロアルキル、置換シクロへテロアルキル、アシル、アリール、置換アリール、アリールオキシ、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アラルキル、ヘテロアラルキル、アルキルアルケニル、アルキルアルキニル、アルキルシクロアルキル、アルキルシクロへテロアルキル、ニトロ、シアノなどの、1つ以上の基を含む、記述どおりの低アルキルを言及する。これらの基は、低アルキル部分の任意の炭素原子に付着している場合がある。
用語「置換低アルケニル」は、ヒドロキシル、チオール、アルキルチオール、ハロゲン、アルコキシ、アミノ、アミド、カルボキシル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、ヘテロサイクル、置換ヘテロサイクル、シクロへテロアルキル、置換シクロへテロアルキル、アシル、アリール、置換アリール、アリールオキシ、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アラルキル、ヘテロアラルキル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルキル アルケニル、アルキルアルキニル、アルキルシクロアルキル、アルキルシクロへテロアルキル、ニトロ、シアノなどの、1つ以上の基を含む、記述どおりの低アルケニルを言及する。これらの基は、安定化合物を生成するために任意の炭素原子に付着している場合がある。
用語「低アルキニル」は、少なくとも1つの炭素三重結合を有する2から8の炭素原子の直鎖または分鎖炭化水素を言及する。
用語「アルキルチオ」は、 Rが低アルキル、置換低アルキル、以下で定義されているアリール、置換アリール、アラルキルまたは置換アラルキルである‐SR、‐S(O)n=1‐2‐Rの基を意味する。
用語「アシル」は、Rが水素、低アルキル、置換低アルキル、アリール、置換アリールである‐C(O)Rの基を言及する。
用語「アリールオキシ」は、以下で定義されているように、Arがアリール、置換アリール、ヘテロアリール、または置換ヘテロアリール基である‐OArの基を言及する。
用語「アミド」は、 RおよびR’が単独で水素、低アルキル、置換低アルキル、以下で定義されているシクロアルキル、置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、ヘタリール、置換ヘヘタリールである‐C(O)NRR’の基を言及する。
用語「カルボキシル」は、定義されているように、Rが単独で水素、低アルキル、置換低アルキル、アリール、置換アリール、ヘタリール、置換ヘタリールなどである‐C(O)ORの基を言及する。
用語「アリール」または「Ar」は、少なくとも1つの環が芳香族(例えば、1,2,3,4‐テトラヒドロナフチル、ナフチル、アントリル、またはフェナントリル、9‐フルオレニル、など)である少なくとも1つの芳香環(例えば、フェニルまたはビフェニル)または複数の縮合環を有する芳香族カルボサイクリック族を言及する。
用語「置換ヘテロサイクル」は、ハロゲン、ヒドロキシル、チオール、低アルキル、置換低アルキル、トリフルオロメチル、低アルケニル、置換低アルケニル、低アルキニル、置換低アルキニル、アルキルアルケニル、アルキルアルキニル、アルコキシ、アルキルチオ、アシル、アリールオキシ、アミノ、アミド、カルボキシル、アリール、置換アリール、ヘテロサイクル、置換ヘテロサイクル、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、ヘテロアルキル、置換ヘテロアルキル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アルキルシクロアルキル、アルキルシクロへテロアルキル、ニトロ、スルフォアミドまたはシアノなどで任意に置換されたヘテロサイクルを言及する。
用語「置換ヘテロアリール」は、例えば、ハロゲン、ヒドロキシル、チオール、低アルキル、置換低アルキル、トリフルオロメチル、低アルケニル、置換低アルケニル、低アルキニル、置換低アルキニル、アルキルアルケニル、アルキルアルキニル、アルコキシ、アルキルチオ、アシル、アリールオキシ、アミノ、アミド、カルボキシル、アリール、置換アリール、ヘテロサイクル、置換ヘテロサイクル、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、ヘテロアルキル、置換ヘテロアルキル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アルキルシクロアルキル、アルキルシクロへテロアルキル、ニトロ、スルフォアミドまたはシアノなどの1つ以上の機能基で任意に一置換または多置換されたヘテロサイクルを言及する。
用語「シクロアルキル」は、3から15の炭素を含有する環状または多環アルキル基を言及する。多環基では、これらは末端環の1つが芳香族(例えば、テトラリン、など)である場合がある複数の縮合環である場合がある。
1つ以上のさらなる治療薬との「併用」での本発明の化合物の投与は、同時(併用)投与および継続的投与を含むことを目的とする。継続的投与は、治療薬および本発明の化合物の被検体への様々な投与順を含むことを目的とする。
R5は、H、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アシル、‐CH2‐アリール、‐CH2‐ヘテロアリールである。
式中、R1、R2、R3、R4は、単独で水素、ハロゲン、C1‐C4アルキル、C1‐C4アルコキシ、またはC6‐C14アリールであり、
R5は、水素、C1‐C4アルキル、C6‐C14アリールで置換されたC1‐C4アルキル、またはC4‐C6シクロアルキルであり、
R6は、水素、ハロゲン、C1‐C4アルキル、ヘテロ原子がNであるC5‐C6ヘテロシクロアルキルで置換されたC1‐C4アルキル、C6‐C14アリール、C1‐C4アルキルまたはハロで置換されたC6‐C14アリール、C5‐C6シクロアルキル、C5‐C6ヘテロシクロアルキル、またはポリシクロアルキルである化合物である。
式中、R1、R2、R3、R4は、単独で水素、ハロゲン、C1‐C4アルキル、C1‐C4アルコキシ、またはフェニルであり、
R5は、水素、C1‐C4アルキル、フェニルで置換されたC1‐C4アルキル、またはシクロペンチルであり、
R6は、水素、ハロゲン、C1‐C4アルキル、ヘテロ原子がNであるC5‐C6ヘテロシクロアルキルで置換されたC1‐C4アルキル、フェニル、C1‐C4アルキルまたはハロで置換されたフェニル、C5‐C6シクロアルキル、C5‐C6ヘテロシクロアルキル、またはアダマンタンであり、および
R7は、Hである化合物である。
式中、R1、R2、R3、R4は、単独で水素、ハロゲン、またはC1‐C4アルキルであり、
R5は、水素、C1‐C4アルキル、フェニルで置換されたC1‐C4アルキル、またはC4‐C6シクロアルキルであり、
R6は、C1‐C4アルキル、ヘテロ原子がNであるC5‐C6ヘテロシクロアルキルで置換されたC1‐C4アルキル、C5‐C6シクロアルキル、アダマンタン、フェニル、またはC1‐C4アルキルまたはハロで置換されたフェニルであり、および
R7は、Hである化合物である。
式中、R1、R2、R3、R4は、単独で水素、ハロゲン、またはC1‐C4アルキルであり、
R5は、水素、C1‐C4アルキル、またはC4‐C6シクロアルキルであり、
R6は、C1‐C4アルキル、アダマンタン、フェニル、または C1‐C4アルキルまたはハロで置換されたフェニルであり、および
R7は、Hである化合物である。
式中、R1、R2、R3、R4は、単独で水素、ハロゲン、またはC1‐C4C1‐C4アルキルであり、
R5は、水素であり、
R6は、C1‐C4アルキル、またはアダマンタンであり、および
R7は、Hである化合物である。
式中、R1、R2、R3、R4は、単独で水素、ハロゲン、またはC1‐C4アルキルであり、
R5は、水素であり、
R6は、C1‐C4アルキルであり、および
R7は、Hである化合物である。
式中、R1、R2、R3、R4は、単独で水素、C1‐C4アルキル、またはC1‐C4アルコキシであり、
R5は、C1‐C4アルキル、またはC4‐C6シクロアルキルであり、
R6は、水素、C1‐C4アルキル、アダマンタン、フェニル、またはC1‐C4アルキルまたはハロで置換されたフェニルであり、および
R7は、Hである化合物である。
式中、R1、R2、R3、R4は、単独で水素、C1‐C4アルキル、またはC1‐C4アルコキシであり、
R5は、C1‐C4アルキル、フェニルで置換されたC1‐C4アルキル、またはC4‐C6シクロアルキルであり、
R6は、水素、C1‐C4アルキル、またはC5‐C6ヘテロシクロアルキルであり、および
R7は、Hである化合物である。
当技術分野で周知のように、本発明の化合物は、多数の標準的方法で調製することがきる。したがって、式Iの化合物は、例えば、Grimmett、(Grimmett,M.R.、Comprehensive Heterocyclic Chemistry:The Structure, Reaction, Synthesis and Uses of Heterocyclic Compounds、A.R.KatrizkyおよびC.W.Rees、eds.、Vol.5、Pergamon Press.Oxford、1984、pp.457‐498;Grimmett,M.R.、Imidazole and Benzimidazole Synthesis、Academic Press、San Diego CA、1997)によって記述されるように、いくつかの一般的合成法で調製することがきる。
上述のように、本発明の方法で使用することを意図した式Iの化合物は、遷移金属をキレートし、癌細胞の増殖を阻害することができる。さらに、本発明の1つの実施例では、式Iの化合物は、癌細胞において、KLF4などの遷移金属制御腫瘍抑制遺伝子の発現を増加させることができる。本発明のさらなる実施例では、式Iの化合物は、癌細胞においてアポトーシスを誘導し、癌細胞に対して細胞毒性効果を及ぼす。
本発明によると、式Iの化合物は、細胞環境において遷移金属イオンをキレートすることができる。1つの実施例では、式Iの化合物は、鉄、亜鉛、銅、ルテニウムおよびコバルトイオンをキレートすることができる。さらなる実施例では、式Iの化合物は、第1遷移金属イオンをキレートすることができる。さらなる実施例では、式Iの化合物は、鉄、亜鉛および銅イオンをキレートすることができる。本発明のもう1つの実施例では、式Iの化合物は、亜鉛イオンをキレートすることができる。もう1つの実施例では、式Iの化合物は、銅イオンをキレートすることができる。
金属イオンを含有する溶液における非キレート金属イオンの測定およびキレート化合物の測定を含む。つまり、金属を含有する溶液はキレート化合物を含有する溶液で滴定され、その後、非キレート金属イオンの量を判断するために金属選択電極で測定し、それによって、式Iの化合物の金属キレート能力が表れる。
i)癌細胞増殖の阻害
式Iの候補化合物は、標準的方法を使用して癌細胞の増殖を阻害するそれらの能力に対して、まずはin vitroで測定することができる。
100×(T−TO)(C−TO)=50
そして、試験薬への48時間の暴露後の試験ウェルの光学濃度はT、ゼロ時間の光学濃度はTO、および対照光学濃度はCである。
本発明の1つの実施例によると、式Iの化合物は、癌細胞において遷移金属制御腫瘍抑制遺伝子の発現を増加させる。もう1つの実施例では、式Iの化合物は、腫瘍抑制遺伝子の発現が下方制御された癌細胞において、遷移金属制御腫瘍抑制遺伝子の発現を増加させる。癌細胞における遷移金属制御腫瘍抑制遺伝子の発現増加または上方制御された発現は、処理した細胞に対する非処理の細胞における遺伝子の発現の増加パーセントとして判断することができる。1つの実施例では、式Iの化合物は、遷移金属制御腫瘍抑制遺伝子の発現を約10%増加させる。もう1つの実施例では、式Iの化合物は、遷移金属制御腫瘍抑制遺伝子の発現を約20%増加させる。他の実施例では、式Iの化合物は、遷移金属制御腫瘍抑制遺伝子の発現を約25%、50%、75%または100%増加させることができる。
本発明によるとのもう1つの実施例では、式Iの化合物は、癌細胞においてアポトーシスを誘導することができる。アポトーシスを誘導する候補化合物の能力の評価方法は、当技術分野で周知であり(例えば、Current Protocols in Cell Biology、2000および最新版、K.Morgan、ed.、J.Wiley&Sons、New York、NY参照)、例えば、DNAフラグメンテーション解析、アネキシンV‐FITCおよびヨウ化プロピジウム染色法を併用するフローサイトメトリー、末端デオキシヌクレオチド転移酵素(TdTアッセイ)によるDNA鎖切断の蛍光色素標識およびフローサイトメトリーによる分析、フローサイトメトリーによる検出、末端デオキシヌクレオチド転移酵素(TdT)媒介dUTPニックエンドラベリング(TUNEL)アッセイを用いての免疫細胞化学による原位置での検出、ポリ(ADP‐ribose)ポリメラーゼ(PARP)のタンパク質分解的切断またはタンパク質分解の免疫組織化学的またはフローサイトメトリー検出、および/またはシステイニル‐アスパラギン酸プロテアーゼ(カスパーゼ)の活性化の検出を含む。
in vivoでの腫瘍成長、増殖および/または転移を阻害する候補化合物の能力は、当技術分野で周知の標準的方法を使用する適切な動物モデルにおいて判断することができる(例えば、Ennaら、Current Protocols in Pharmacology、J.Wiley&Sons,Inc.、New York、NY参照)。例となる手順は、以下または実施例において提供される。
式Iの化合物は、必要に応じて、毒性試験も行うことができる。潜在的な薬剤に対する毒性試験は、当技術分野で周知である(例えば、Hayes,A.W.、ed.、(1994)、Principles and Methods of Toxicology、3rd.ed.、Raven Press、NY;Maines,M.、ed.、Current Protocols in Toxicology、John Wiley&Sons,Inc.、NY参照)。
式Iの化合物は、被検体における癌の治療、安定または予防に使用することができる。これに関連して、化合物は、細胞毒性または細胞静止効果を及ぼし、腫瘍の大きさの減少、腫瘍拡大の減速または予防、腫瘍の消失または切除からその再発までの無病生存時間の延長、腫瘍初発または続発の予防(例えば、転移)、進行時間の延長、腫瘍に伴う1つ以上の悪い症状の軽減、または癌にかかっている被検体の全生存時間を延長させる。本発明の1つの実施例によると、式Iの化合物は、癌細胞におけるアポトーシスの誘導により癌細胞に対する細胞毒性効果を及ぼす。
化学療法薬治療、放射線療法、遺伝子療法、ホルモン処置、免疫療法およびアンチセンスオリゴヌクレオチド療法を含む。有用な化学療法薬の例として、これらに限定されないが、ヒドロキシウレア、ブスルファン、シスプラチン、カルボプラチン、クロラムブシル、メルファラン、シクロホスファミド、イホスファミド、ダノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、ミトキサントロン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ナベルビン(登録商標)(酒石酸ビノレルビン)、エトポシド、テニポシド、パクリタキセル、ドセタキセル、ゲムシタビン、シトシン、アラビノシド、ブレオマイシン、ネオカルチノスタチン、スラミン、タクソール、マイトマイシンCなどがある。本発明の化合物は、2つ以上の化学療法薬を使用する標準併用療法との併用にも適している。当然のことながら、本発明における使用に対する治療法は、将来開発される新しい化合物または治療も含む。
本発明の化合物は、通常、投与の前に調製する。したがって、本発明は、1つ以上の式Iの化合物および薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤から成る薬剤組成物を提供する。薬剤組成物は、周知で容易に入手可能な原料を使用して周知の方法によって調製する。周知の癌に対する化学療法と併用して1つ以上の式Iの化合物から成る薬剤組成物は、本発明の目的ともなる。
式Iの化合物は、治療する癌によって様々な投与法で被検体に投与してよく、例えば、化合物は、用量単位の製剤で、経口、局所、非経口、吸入やスプレー、または経直腸的に投与してよい。1つの実施例では、化合物は、例えば被検体の血流へのボーラス注射または注入、または経口投与によって被検体へ全身的に投与する。1つ以上の周知の化学治療薬と併せて使用する際、化合物は化学治療薬の投与の前または後、あるいは同時に投与することができる。1つ以上の化学療法薬は、例えば、ボーラス注射、注入または経口投与によって全身的に投与してもよい。
当業者は、in vitroおよび動物モデルにおける式Iの化合物の証明された有効性に続き、標準GLP動物毒性および薬物動態学的研究のために提出し、その後、癌の治療におけるその効果をさらに評価し、治療的使用に対する規制機関の承認を得るため、臨床試験に参入することができるということを認識する。当技術分野で周知のように、臨床試験は、第一、二、三および四相とされる、試験の相を通して行われる。
参加者の適格基準は、一般的なもの(例えば、年齢、性別、癌の種類)から特定のもの(例えば、前治療の種類及び回数、腫瘍の特性、血球数、臓器機能)まである。適格基準は、試験相によっても変化する場合がある。例えば、第一および二相試験では、多くの場合、異常臓器機能または他の要因のため、治験中の治療により危険にさらされるかもしれない患者は基準によって除外する。第二および三相試験では、多くの場合、病気の種類や病期、および前治療の回数および種類に関して追加基準を含むる。
当技術分野で周知のいくつかの測定は、試験開始前に、まず患者を分類するために使用することができる。患者は、例えば、米国東海岸癌臨床試験グループ(ECOG:Eastern Cooperative Oncology Group)の癌の状態を表す指標(PS)などを使用して、最初に評価することができる。ECOG PSは、患者の機能障害によって測定されるように、患者の病気の進行を評価するための広く受け入れられている基準であり、ECOG PS0は機能障害がないことを示し、ECOG PS1および2は患者の機能障害は徐々に増大しているがまだ歩行可能であることを示し、ECOG PS3および4は進行性障害および運動不能を示す。
第一相の基準を満たすため、化合物の分布は、例えば、一定間隔で収集された血液や尿などのサンプルを化学分析することによって観察する。例えばサンプルは、注入開始後約72時間まで、一定間隔で得ることができる。1つの実施例では、サンプルは、化合物の各注入開始後0、0.33、0.67、1、1.25、1.5、2、4、6、8、12、24、48および72時間で得られる。
臨床試験の評価項目は、評価段階にある化合物の有効性を示す測定可能な転帰である。評価項目は試験開始前に確立され、臨床試験の種類や相によって異なる。評価項目の例として、例えば、腫瘍反応率(通常、パーセントで表示される、特定の量だけ腫瘍が小さくなる試験参加者の割合)、無病生存期間(通常、月数で測定される、癌の発症または再発がない参加者の生存期間)、全生存(通常、臨床試験開始から死亡時刻までで測定される参加者の生存期間)である。進行および/または転移癌に関して、病気の安定(例えば、腫瘍の成長および/または転移が停止したなど、病気が安定した試験参加者の比率)は、評価項目として使用することができる。他の評価項目として毒性および生活の質がある。
本発明は、1つ以上の式Iの化合物を含む治療用キットをさらに提供する。1つの実施例では、治療用キットは、癌の治療において使用するものである。キットの内容物は凍結乾燥でき、キットは凍結乾燥成分を再構成するための適当な溶剤をさらに含むことができる。キットの個々の成分は、別の容器で包装され、当該容器に付随して、医薬品または生物学的製剤の製造、使用および販売を規制する政府機関によって規定された形での通知を含むことができ、その通知はヒトまたは動物への投与のための使用または販売に対する製造機関による承認を反映する。
産出0.70g。(85%)。融点>400℃。
DMFにおける0.200gの化合物2(0.483mmol)の溶液は、沈殿が見られなくなるまでHCL(g)で処理した。その後、溶液はろ過し、ジクロロメタンおよびヘキサンで洗浄し、真空中で乾燥させた。結果として得られた望ましいHCl塩は水溶性であった。
フェナントロキノリン(0.210g)と2‐メチル‐5‐クロロインドール‐3‐カルボキサルデヒド(0.203g)の混合物は、酢酸アンモニウム(0.77g)の存在下、酢酸(5mL)において1.5時間還流した。化合物5の分離沈殿物はろ過し、AcOH、EtOH+H2OおよびEtOH+EtOAcで洗浄した。産出0.230g(60%)。
フェナントロキノリン(0.210g)と2‐メチル‐5‐フルオロインドール‐3‐カルボキサルデヒド(0.177g)の混合物は、酢酸アンモニウム(0.77g)の存在下、酢酸(5ml)において1.5時間還流し、1%HClに注ぎ、DCMで抽出した。水層はNa2CO3で塩基性化し、化合物7の沈殿物はろ過し、EtOHから結晶化した。純正産物の産出0.19g(52%)。
フェナントロキノリン(0.105g)と2‐フェニルインドール‐3‐カルボキサルデヒド(0.111g)の混合物は、0.39gの酢酸アンモニウムの存在下、3mLの酢酸において1.5時間還流した。赤い溶液は、水(100ml)に注ぎ、DCMで洗浄した(3×40ml)。その後、水層はNa2CO3の飽和溶液で中和し、得られた個体はろ過し、EtOHで洗浄し、DMF:EtOH :H2O=1:1:1から結晶化した。0.12gの精製固体が得られ、58%の産出率であった。
フェナントロキノリン(0.105g)と2(4‐フルオロフェニル)‐インドール‐3‐カルボキサルデヒド(0.120g)の混合物は、酢酸アンモニウム(0.38g)の存在下、酢酸(3mL)において1.5時間還流し、DCM(50ml)で希釈し、50mlの5%HClで処理した。黄色い分離沈殿物はろ過し、水性Na2CO3で処理後、EtOAcで抽出し、溶媒を除去した。残留物はDCMで処理した。化合物10の分離した個体はろ過し、ヘキサンで洗浄した。産出0.08g(37%)。
ヒドラゾン(3.10g)とポリリン酸(PPA)(18g)の混合物は、徐々に温度を上げて、温度計で撹拌しながらビーカーで加熱した。混合物は、10分間180〜190℃に維持し、冷却後、Na2CO3水溶液で希釈し、EtOAcで抽出した。有機層は濃縮し、シリカゲルでろ過し、EtOAcで洗浄した。ろ液は蒸発させ、4(2‐インドリル)ピリジンの残留物をトルエンから結晶化した。
フェナントロキノリン(0.210g)と2(4‐ピリジル)インドール‐3‐カルボキサルデヒド(0.212g)の混合物は、酢酸アンモニウム(0.77g)の存在下、酢酸(5ml)において1.5時間還流した。沈殿物はろ過し、EtOHに溶解させ、0.1mlのNH4OHで処理し、溶媒はほとんど乾燥状態になるまで除去した。残留物はEtOAcで処理した。化合物11の沈殿物はろ過した。産出0.25g(61%)。
化合物2および3は、U.S.国立癌研究所(NCI)のDTP(開発治療プログラム)によって提供されたin vitro抗癌スクリーニング業務の一環として、60のヒト癌細胞株のパネルにおけるそれらの増殖抑制効果に対して評価した。これらの化合物は、NSCLC、白血病、大腸癌、前立腺癌、黒色腫、卵巣癌、腎臓癌、中枢神経系癌および乳癌を含むほとんどのヒト腫瘍細胞株に対して増殖抑制活性を示し、平均GI50(50%の成長阻害)値は2μM未満であった(図1)。
ヒト大腸腫瘍HT‐29細胞の増殖を阻害する式Iの化合物の能力は、以下のように試験した。本実施例および後続の実施例で使用したHT‐29大腸腫瘍細胞は、2mMのL‐グルタミン(Gibco、Grand Island、NY)、10%ウシ胎仔血清(FBS)(Multicell、WISENT Inc.、St‐Bruno、QC)、抗生物質‐抗真菌剤(Multicell)を添加した成長培地で単分子層として37℃の5%CO2の加湿インキュベーターで維持した。細胞は150mmの組織培養プレート上に移動させ、使用前にサブコンフルーエント(70〜80%)になるまで成長させた。化合物のin vitro増殖抑制活性は、6〜7日間、表1に示す様々な濃度の化合物で細胞を培養することによって評価した。この細胞増殖アッセイにおけるこれらの化合物の効果は、テトラゾリウム塩XTTをホルマザン(XTT細胞増殖キットII、Roche Applied Science、Montreal、QC)の橙色の化合物まで還元させる生細胞の能力に基づいて測定した。この実験結果は表3に示す。
金属キレート化が式Iの化合物の成長阻害活性に関与するかどうかど判断するため、外因性金属(100μMのZnCl2、FeCl2.4H2O、FeCl3.4H2O、MgCl2)は、対照媒体DMSO、化合物3(5μM)、または化合物13(25μM)と同時にHT‐29細胞とともに5日間培養した。化合物13(以下の構造を参照)は、化合物3ほど強力な化合物ではなく、化合物3とは構造的に密接に関係しているが、フェナントロリン環において不可欠なキレート窒素を不足している。化合物13の成長阻害は、化合物3とは異なる機序で生じると予測される。
銅のキレート化が式Iの化合物の成長阻害活性に関与するかどうかを判断するため、HT‐29細胞は、25μMのCuSO4.5H2Oの存在下または非存在下において、5μMまでの化合物3とともに5日間培養した。図4に示すように、25μMの外因性銅をHT‐29細胞に添加することによって、HT‐29細胞に対する化合物3の成長阻害活性は、低濃度の化合物3(2μM未満)のみで損なわれた。反対に、高濃度の化合物3(>2.5μM)では、化合物3の活性は外因性銅の添加によって有意に強化した。銅は化合物13による成長阻害、または細胞の自力での成長に対して影響を示さなかった。100μMまでの濃度の銅で同様の結果が得られた。これらの結果は、この化合物は銅のキレート剤として機能することができ、細胞毒性を有するキレート錯体を銅で形成することもできるということを示す。
金属キレート化が化合物3の成長阻害活性に関与するかどうかを判断するため、様々な濃度の外因性金属は、様々な濃度の化合物3と同時にHT‐29細胞とともに5日間培養した。試験した外因性金属は、ZnCl2(亜鉛)、CuSO4.5H2O(銅)、FeCl2(鉄II)、FeCl3.4H2O(鉄III)、MgCl2(マグネシウム)、およびCaCl2.2H2O(カルシウム)である。体積100μLの成長培地にあるHT‐29細胞(4×103/ウェル)は96ウェルの細胞培養プレートに播種し、37℃で一晩培養した。培地は除去し、化合物3または0.1%DMSO媒体対照とともに、図5に示すようにいくつかの濃度の金属イオンを含有する総体積100μLの成長培地と入れ替えた。37℃で5日間細胞を培養した後、細胞生存能力はXTT(ナトリウム3’‐[l(フェニルアミノ‐カルボニル)‐3,4‐テトラゾリウム]‐ビス(4‐メトキシ‐6‐ニトロ)ベンゼンスルホン酸水和物)を使用して定量した。XTT標識試薬(1mg/mL)はメーカーの使用説明書に従い電子結合試薬と混合し、50μLの混合物は100μLの成長培地で培養した細胞に直接加えた。プレートはさらに37℃で4時間さらに培養し、各ウェルの吸収度は460nmのマルチウェル分光光度計(Bio‐Tek Instruments Inc.)で測定した。データは空欄に対して調節し、DMSO対照と比較して細胞成長の%として表記した。
細胞において金属をキレートする化合物5および7の能力を判断するため、外因性金属は様々な濃度の化合物5および7と同時に、HT‐29細胞に加えた。つまり、HT‐29細胞は様々な濃度の化合物5および7、銅(25μMのCuSO4.5H2O)または亜鉛(100μMのZnCl2)の有無で5日間処理した。細胞生存能力は、XTTアッセイによって判断した。HT‐29細胞の成長阻害に対する銅および亜鉛の効果は、化合物5に関しては図6Aに、化合物7に関しては図6Bに示す。化合物3と同様に、亜鉛によって化合物5および7の成長阻害活性は損なわれたが、銅によって低濃度の化合物5および7でのみ活性が損なわれた。結果は、化合物5および7が亜鉛および銅のキレート剤として機能し、余分なこれらの金属の存在によって、化合物5および7の成長阻害効果が遮断されるということを示す。
式Iの化合物が正常細胞の増殖と比べて癌細胞の増殖を選択的に阻害したかを判断するため、化合物3および9に対する増殖のIC90値を正常細胞株および癌細胞株において測定した。使用した正常細胞株はPrEC(前立腺)、HMEC(胸)、およびWD8(肺線維芽細胞)細胞株で、癌細胞株はDU145(前立腺)、MDA‐MB‐435(胸)、HT‐29(結腸)である。IC90値は、対照であるドキソルビシンおよびエトポシドに関しても判断した。細胞は、実施例13において概して記述されるように培養した。様々な濃度の化合物は、細胞とともに6〜7日間培養し、増殖性細胞数はXTTアッセイを使用して測定した。癌細胞の選択性は、すべての正常細胞に対する平均IC90とすべての癌細胞株に対する平均IC90の割合をして計算した。化合物3および9の両方とも、>4のIC90率(正常/癌)であり、これらの化合物は癌細胞に対して選択的であることを示す。
細胞において亜鉛をキレートする式Iの化合物の能力を判断するため、ヒト大腸腫瘍HT‐29細胞における亜鉛制御された遺伝子、メタロチオネイン1A(MT1A)の発現レベルに対する化合物の効果を判断した。体積10mLの成長培地にある1×106細胞のHT‐29細胞は100mmの皿に播種し、37℃で一晩培養した。培地は取り除き、35μMのZnCl2、1μMまたは4μMのTPEN(NNNN‐四リン(2‐ピリジル‐メチル)エチレンジアミン)、あるいは1μMまたは4μMの化合物3、または0.1%DMSO媒体対照を含有する成長培地と入れ替えた。16時間の培養後、細胞はトリプシン処理によって分離させ、遠心分離で収集し、PBSで一度洗浄した。総RNAは、メーカーの使用説明書に従って、TRIZOL(Invitrogen、Life Technologies、Carlsbad、CA)を使用して抽出し、MT1AmRNAのレベルは、以下のように、比較CT法を使用してリアルタイムPCRで測定した。第一鎖cDNAは、メーカーの手順に従ってpd(N)6ランダムへキサマー(Amersham Biosciences、Piscataway、NJ)およびスーパースクリプト(登録商標)II逆転写酵素キット(Invitrogen)を使用して、Biometra Tpersonal Thermal Cycler(Abgene、UK)において200ngの総RNAから合成した。リアルタイムPCRは、上記の手順に従って合成した5μLのcDNA、およびABI TaqMan(登録商標)ユニバーサルPCRマスターミックスの手順に従い個々のTaqMan(登録商標)遺伝子発現アッセイ(ABI)を使用して、ABIプリズム7000配列検出システム(Applied Biosystems Inc.、ABI、Foster City、CA)で行った。
遷移金属制御腫瘍抑制遺伝子のRNAレベルを調節する式Iの化合物の能力は、以下のようにin vitroで判断した。化合物3は、大腸腫瘍HT‐29細胞において亜鉛制御された腫瘍抑制因子KLF4mRNAの発現を増加させるその能力を判断するため試験した。 過去にKLF4の発現は細胞内の亜鉛濃度の変化によって誘導されるとみられている。HT‐29細胞は、媒体対照としてのDMSO、35μMのZnCl2、1μMまたは4μMの化合物3、あるいは1μMまたは4μMのTPENとともに16時間培養し、mRNAは、実施例19に記述するように細胞から抽出した。KLF4mRNAの発現も実施例19に記述するように、比較CT法を使用してリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応によって分析した。化合物3は、媒体のみで処理したHT‐29細胞と比較して、HT‐29細胞においてKLF4mRNAの発現(約8倍)を誘導した(図8参照)。
KLF4タンパク質の発現を調節する式Iの化合物の能力は、以下のように判断した。HT‐29細胞は、媒体対照(DMSO)、TPEN(4μM)、ZnCl2(100μM)、または化合物3(2.5、5、7.5および10μM)で16時間処理した。細胞は溶解し、同等のタンパク質負荷を確保するため、抗KLF4抗体、またはGAPDH抗体でウエスタンブロット法を行った。図9に示すように、16時間の治療後、化合物3はHT‐29細胞においてKLF4タンパク質のレベルを増加させることができた。
KLF4によって制御される遺伝子の発現に対する式Iの化合物の効果は、以下のように判断した。化合物3は、HT‐29大腸腫瘍細胞における細胞周期制御因子p21(サイクリン依存性のキナーゼ阻害因子)の発現を増加させるその能力を判断するため試験した。腫瘍抑制因子KLF4は、p21の抑制によって細胞周期停止を調節するとみられている。HT‐29細胞は、DMSO(媒体対照)、35μMのZnCl2、1μMまたは4μMのTPEN、または0.5μM、1μM、4μM、または7.5μMの化合物3とともに16時間培養し、mRNAを細胞から抽出した。p21mRNAの発現は、比較CT法を使用してリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応によって分析した。このアッセイは、実施例19に記述される方法を使用して実施した。化合物3は媒体のみで処理されたHT‐29細胞と比較して、HT‐29細胞において30〜60倍のp21の発現を誘導した(図10参照)。
細胞周期進行を遮断する式Iの化合物の能力を試験するため、化合物3はヒト大腸腫瘍HT‐29またはヒト白血病CCRF‐CEM細胞とともに培養し、フローサイトメトリー分析を使用して細胞周期の異なる段階での細胞集団における変質を判断した。HT‐29細胞は、実施例13に記述するように維持した。本実施例および後続の実施例で使用したCCRF‐CEM細胞は、2mMのL‐グルタミン(Gibco、Grand Island、NY)、10%ウシ胎仔血清(FBS)(Multicell、WISENT Inc.、St‐Bruno、QC)、抗生物質‐抗真菌剤(Multicell)を添加した成長培地で懸濁細胞として37℃の5%CO2の加湿インキュベーターで維持した。
アポトーシスの異なる段階で細胞集団を変質させる化合物3の能力は、媒体(DMSO)、0.1μM、0.25μM、0.5μMまたは1μMの化合物3で24時間処理したCCRF‐CEM白血病細胞集団における化合物3の効果を判断することによって測定した。CCRF‐CEM細胞は播種し、実施例23に記述するように、上記の濃度の化合物3または0.1%DMSO媒体対照で処理した。24時間後、細胞は遠心分離によって収集し、成長培地において約1×106細胞/mlになるまで再懸濁した。その後、細胞は、メーカーのRAPIDアネキシンV結合手順に従い、アネキシンV‐FITCアポトーシス検出キット(ONCOGENE(登録商標)research products、MA)を使用して、アネキシンV結合およびPI染色に対して染色した。染色した細胞の蛍光性は、FACScanフローサイトメーターおよびセルクエストプログラム(BD Biosciences、San Jose、CA)を使用して分析した。データは、象限統計を得るためModfitソフトウェア(Verity software House、Topsham、ME)を使用して評価した。アネキシンVのみで染色された細胞は、初期アポトーシスであると考えられ、一方、アネキシンVおよびヨウ化プロピジウムの両方で染色された細胞は後期アポトーシスであると考えられた。ヨウ化プロピジウムのみで染色された細胞は非生存細胞であり、染色されないものは生存細胞である。MOLT‐4白血病細胞は同様に処理した。
式Iによる化合物のin vivoでの効果は、ホローファイバーアッセイにおける化合物3の効果を判断することによって試験した。本アッセイは、Deckerら、Eur.J.of Cancer、40:821‐826(2004)に記述され、以下のように、12ヒト腫瘍細胞株(胸;MDA‐MB‐231、MDA‐MB‐435、神経膠腫;U251、SF‐295、卵巣;OVCAR3、OVCAR5、結腸;COLO‐205、SW‐620、黒色腫;LOX‐IMVI、UACC‐62、および肺;NCI‐H23、NCI‐H522)を無胸腺マウスに移植することによって実施した。細胞培養は、10%FBSおよび2mMのグルタミンを含有するRPMI‐1640において培養した。細胞は標準的トリプシン処理によって採取し、再懸濁し(2〜10×106細胞/ml)、内径1mmのポリビニリデンホローファイバーへ流し入れた(500,000Da.のMW排除)。PVDFファイバーに付着した培養は、移植前に24〜48時間5%CO2において37℃で培養した。各マウスは計6つの移植片を受け、腹膜に3つのファイバー、皮下区画に3つのファイバーが置かれ、1匹のマウスにつき3つの細胞株、各群に3匹のマウス、媒体のみで処理した対照は6匹とした。薬剤は、4日の治療において2つの異なる用量および2つの投与法(I.P.およびS.C.)で試験した。ファイバーは移植後6〜8日で収集し、細胞の生存能力はMTT法によって評価し、対照と比較して成長において50%以上の減少がある場合、薬剤は有効であるとみなした。細胞殺滅は、移植片における最初の生存能力と比較した細胞生存能力の減少によって評価した。結果は、阻害された細胞株の数×2つの部位×2つの化合物の用量×因数2=最大96に基づいて記録した。合計スコア20、SCスコア8または1つ以上の細胞株の正味の細胞殺滅を有する化合物は、陽性とみなした。
in vivoでの結腸腫瘍成長を阻害する化合物3の能力は、以下のように試験した。CD‐1雌ヌードマウス(1つの治療群につきマウス7匹、6〜7週)の腹腔内に、ヒト結腸腺癌細胞HT‐29細胞(0.1mlのPBSに3×106細胞)を注射した。媒体または50mg/kg/dの化合物3でのマウスの治療は5週間、5日の後に2日間の中断が続く7日周期で、接種(腫瘍の大きさ=20〜40mm3)後5日で開始した。腫瘍の大きさは、キャリパーを使用して実験期間にわたって測定し、腫瘍の重さは動物を死亡させた後に測定した。化合物3は、腫瘍の大きさおよび重さによって測定されたように、媒体処理された対照の動物と比較して、腫瘍成長を阻害することができた(図13Aおよび13B参照)。
in vivoでの大細胞肺腫瘍成長を阻害する式Iの化合物の能力は、以下に記述するように、異種移植モデルにおける化合物3の効果を判断することによって試験した。化合物3は、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン‐ポリエチレングリコール2000(DSPE‐PEG/5%モル)および卵ホスファチジルコリン(ePC/95%モル)の組成物を有する脂質ベースの製剤として試験した。製剤は次のように調製した。化合物3および脂質(ePCおよびDSPE‐PEG)の原液は、DMFにおいて調製した。その後、一定の体積の化合物3および脂質の原液は、25mg/mLの脂質濃度(ePC:DSPE‐PEG=95:5(モル%)および化合物3:総脂質率=1:10(w/w)を得るため混合した。混合物は、4時間撹拌し、窒素下で十分に乾燥させ、真空下で一晩放置した。その後、60℃に加熱したHEPES緩衝食塩水(HBS0.01M、pH=7.4)は乾燥膜を再水和するために加えた。溶液はボルテックスし、室温で48時間撹拌し、2時間半、超音波で分解した。その後、製剤は任意の遊離化合物3を除去するため、5分間1000rpmで遠心分離させた。
in vivoでの大腸腫瘍細胞成長を阻害する化合物3、5および7の能力は、実施例26に記述するように、マウス異種移植モデルにおいて試験した。化合物は、ルトロール製剤(i.p.投与)、脂質ベースの製剤ミセル(i.v.投与)、または水性製剤(i.p.投与)として試験した。媒体対照は、ルトロール対照(i.p.投与)、脂質ミセル対照(i.v.投与)、および水対照(i.p.投与)を含んだ。ルトロール製剤は、15%ルトロールおよび10%DMSOを含有した。脂質ベースの製剤および同様の製剤の組成物は、上記の実施例27に記述される。
結果は(図15)、これらの化合物によって、HT‐29細胞由来の腫瘍の大きさ(図15A)および重さ(図15B)が減少したことを示した。
in vivoでの肺大細胞癌細胞成長を阻害する化合物3、5および7の能力は、
実施例27に記述するように、マウス異種移植モデルにおいて試験した。化合物は、ルトロール製剤(i.p.投与)、脂質ベースの製剤ミセル(i.v.投与)、または水性製剤(i.p.投与)として試験した。媒体対照は、ルトロール対照(i.p.投与)、脂質ミセル対照(i.v.投与)、および水対照(i.p.投与)を含んだ。ルトロール製剤は、15%ルトロールおよび10%DMSOを含有した。脂質ベースの製剤および同様の製剤の組成物は、上記の実施例27に記述される。
結果は(図16)、化合物3、5および7によってNCI‐H460細胞由来の腫瘍の大きさ(図16A)および重さ(図16B)が減少したことを示した。
HT‐29結腸腫瘍異種移植片においてKLF4の発現を調節する化合物3の能力は、以下のように判断した。10匹のCD‐1雌ヌードマウス(6〜7週)の群の背中の中央下部にヒト結腸腺癌細胞HT‐29細胞(0.1mlのPBSに3×106細胞)を皮下注射した。媒体または50mg/kg/dの化合物3でのマウスの治療は、実験期間中(35日間)、5日と2日の周期で、接種(腫瘍の大きさ=20〜40mm3)後5日で開始した。治療期間後、動物は死亡させ、腫瘍は切除し、総RNAはRneasyミニキット(QIAGEN、Valencia、CA)を使用して30mgの腫瘍組織から抽出した。KLF4mRNAの発現は、実施例19に記述されるように、比較CT法を使用してリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応によって分析した。化合物3は、媒体のみで処理した腫瘍異種移植片と比べて約1.5倍であり、化合物3で処理したすべてのマウスからの腫瘍異種移植片においてKLF4の発現を誘導した(図17)。
in vivoでのP21の発現を調節する化合物3の能力は、実施例26に記述するように、HT‐29結腸腫瘍異種移植モデルを使用して判断した。p21mRNAの発現は、実施例30に記載するように、比較CT法を使用してリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応によって分析した。化合物3は、媒体のみで処理した腫瘍異種移植片と比べて、化合物3で処理したすべてのマウスからの腫瘍異種移植片においてp21の発現を誘導した(図18)。
サイクリンD1の発現を調節する化合物3の能力は、実施例26に記述するように、HT‐29結腸腫瘍異種移植モデルを使用して判断した。サイクリンD1mRNAの発現は、実施例30に記載するように、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応によって分析した。化合物3は、媒体のみで処理した腫瘍異種移植片と比べて、化合物3で処理したマウスからの腫瘍異種移植片においてサイクリンD1の発現を一貫して減少させた(図19)。この実験結果は、実施例30および31に記述するように、KLF4およびP21発現に対するin vivoでの化合物3の効果に関して記述した結果ともに、図20に示す。
式Iの化合物の亜急性毒性を試験するため、雌マウスに化合物を注射し、死亡率、行動、外観、体重の変化に基づいて毒性を評価した。つまり、体重が約0.020kgのICR正常雌マウス(5〜6週齢;n=33)に100mg/kgおよび50mg/kgの様々な化合物または媒体のみ(ルトロール(M68、微粉末))を注射した。3匹ずつのICR雌マウスの群に、1日2回、4.0mg/mlの各化合物の1回250μLの腹腔内(i.p.)注射を(100mg/kg)を1週間(群I)、または1日2回、2.0mg/mlの各化合物の1回250μLの腹腔内(i.p.)注射を(50mg/kg)を1週間(対照群)与えた。
癌細胞における式Iの化合物の細胞内局在性は、以下のように判断した。化合物3は本質的に蛍光性であるため、HT‐29大腸腫瘍細胞において蛍光顕微鏡法によって癌細胞におけるその細胞内局在性を調べることは可能であった。細胞は5分間(図21A)または4時間(図21Bおよび21C)10または25μMの化合物3で処理し、PBSで一度洗浄し、10分間3.7%ホルムアルデヒド/PBSで固定し、再度3回洗浄し、サイトシールを付けた。画像は励起フィルターが360〜370nmのZeissレーザースキャン蛍光顕微鏡で得た。結果を図21A〜Cに示す。図21Aおよび21Bに関しては、蛍光像を微分干渉コントラスト画像に重ねた。図21BおよびCは同じ画像である。化合物3は治療から5分以内で細胞に入り込み、細胞核および細胞質へ均等に分布したが、HT‐29細胞の原形質膜から除外された(図21A)。4時間の治療までに、化合物3は主に細胞核(核周辺領域)の外側に局在したが、一部はまだ細胞核内に位置していた(図21Bおよび21C)。
化合物3は、銅および還元剤であるアスコルビン酸の存在下においてin vitroでプラスミドDNAを切断するその能力に対して試験した。実験は、10mMのNaH2PO4/Na2HPO4バッファ(pH6.7)、1μgの超螺旋プラスミドDNA、100μMのアスコルビン酸、25μMの薬剤化合物(または媒体)、および10μMのCuSO4.5H2Oを含有する計20μLにおいて行った。反応混合物は37℃で30分間培養し、反応を止めるため1μlの0.1MのEDTAを加えた。DNAローディングバッファーを加え、反応は、臭化エチジウムを含有する1%アガロースゲルにおいて80Vで80分行った。化合物3および陽性対照である1,10‐フェナントロリン(OP)は両方ともプラスミドDNAを切断することができ、超螺旋型および開環型を低分子量のDNA断片に変換した。非キレート化合物13、および媒体対照DMSOは、DNAを切断できなかった(図22A)。化合物3もOPも、銅または還元剤の非存在下においてNDAを切断できなかった。
ヒト大腸腫瘍HT‐29細胞の増殖を阻害する式Iの化合物の能力は、実施例13の記述のように試験した。本実験の結果を表7に示す。
金属転写因子‐1(MTF‐1)は、亜鉛による活性化によって構成的に発現する転写因子であり、金属応答配列と結合することによって標的遺伝子を制御する。低酸素誘導性酸化的ストレスおよび細胞内貯蔵からの亜鉛放出後の急速に増殖する腫瘍細胞の低酸素微環境におけるMTF‐1の活性化は、腫瘍の成長および進行に関与している。Kr(upsion)ppel様因子4(KLF4)は、Sp/KLF族転写因子の一員であり、GCボックスおよびCACCCボックスのDNA配列と結合することによって標的遺伝子を制御する。KLF4は、p21waf1/cip1の活性化およびサイクリンD1プロモーターと結合する正の制御因子Sp1を無効にすることによるサイクリンD1発現の抑制などの機序による、細胞成長の負の制御因子である。KLF4の腫瘍抑制の役割は、T細胞白血病、消化器、膀胱および前立腺の癌において認められる。MTF‐1、Sp1およびKLF4による自己制御能は、KLF4の上流の正の制御因子である。MTF‐1を下方制御する一連の新規の小分子が開発され、それらのin vitroおよびin vivoでの抗腫瘍活性は選別されている。式Iの化合物は、図24で示すようにリガンドベースの構造設計による3000以上のイミダゾール‐フェナントロリン構造から選択された。
腫瘍細胞成長阻害は、異なる癌細胞型における式Iの化合物によって、癌細胞増殖アッセイにおいてはin vitroで見られ、ホローファイバーアッセイおよびマウス腫瘍異種移植モデルにおいてはin vivoで見られた。
式Iの化合物による細胞成長阻害IC50(μM)は、XTT細胞増殖アッセイによって様々な癌細胞型に関して試験した。低ミクロモルまたはミクロモル以下のIC50は、表8に示すように、異なる癌の種類において見られた。黒色腫細胞株K‐MEL‐2に対する以下に示される式Iの化合物の成長阻害効果は、Lorus Therapeutics Inc.によって再現可能であった。
乳癌細胞株MDA‐MB‐435における式Iの化合物のIC50値は、表8に示すように0.2μM〜0.6μMであった。
Fox JC(2002)MoI Pathol、55(5):294‐299)。乳癌細胞株MDA‐MB‐435は、他の乳癌細胞株とは異なって機能することが予想されるかもしれない。
マウス異種移植モデルにおける式Iの化合物による腫瘍成長阻害を図25に示す。非小細胞肺癌(H460)(図25A)および結腸腺癌(HT‐29)(図25B)に対する投与法およびスケジュールの研究、非小細胞肺癌(H460)に対する最小有効量(図25C)、および非小細胞肺癌(H460)における式Iの最適化した化合物の効果(図25D)。
亜鉛減少誘導の細胞成長阻害を図26に示す。HT‐29細胞の化合物3媒介の細胞成長阻害に対する金属イオン補給剤の効果は、XTT細胞増殖アッセイによって調べた。細胞成長阻害は、図26Aおよび26Bに示すように亜鉛のみで完全に覆された。
細胞周期解析は、図27Aに示すように化合物3で処理したHT‐29細胞、または図27Bに示すように化合物7で処理したHT‐29細胞においてフローサイトメトリーによって評価した。G1/S相での細胞周期停止は治療後に見られた。
化合物3および化合物7の金属キレート化の性質を図28に示す。in vitroでの4(2‐ビリジルアゾ)レゾルシノール(PAR)金属結合アッセイは、PARと結合するZnおよびCu+2は化合物3によって弱まったことを示し、化合物3のin vitroでのZnおよびCu+2をキレートする性質が示された。結果を図28A(ZnCl2)、28B(CuCl2)および28C(FeCl2)に示す。in vitroでの4(2‐ビリジルアゾ)レゾルシノール(PAR)亜鉛結合アッセイは、以下のように行った。三重ウェルの96ウェルプレート(Sarstedt、Newton、NC)に、0.2Mのトリス‐HCl、pH7.5における体積10μLの指定された最終濃度のZnCl2を10μLの80%アセトニトリル‐20%DMSO媒体対照とともに、または80% アセトニトリル‐20% DMSOに溶解した指定された最終濃度式Iの化合物とともに、室温で15分培養した。その後、0.2Mのトリス‐HCl、pH7.5における200μMの最終濃度での80μLのPARを加え、PAR‐Zn+2錯体の着色を500nmのマルチウェル分光光度計(Bio‐Tek Instruments Inc.)で測定した。
個々の金属特異性キレート剤と比較して、HT‐29細胞における金属感受性遺伝子の発現の変化は、図29A、29Bおよび29Cに示すようにRT‐PCRによって調べた。
亜鉛貯蔵タンパク質メタロチオネイン1A(MT1A)(図29A)、銅輸送体、SLC31A1としても知られるCtr1(図29B)および鉄輸送体トランスフェリン受容体1(TfR1)(図29C)の発現に対する化合物3および化合物7での治療の効果は測定し、それぞれ周知の亜鉛キレート剤TPEN、銅キレート剤テトラミンおよび鉄キレート剤DFOと比較した。Cu+2のin vitroでのキレート化に関わらず、化合物3での治療後の銅感受性遺伝子の増加は一時的なものであった。対照的に、亜鉛感受性遺伝子における持続的な減少は、化合物3での治療の有意な結果として細胞内の亜鉛減少を示した。
HT‐29大腸癌異種移植組織における亜鉛感受性の転写因子MTF‐1と細胞周期の制御因子サイクリンD1発現の間の相関を図30に示す。サイクリンD1遺伝子プロモーター領域(図30Aに示す)における推定のMTF‐1結合DNA配列の存在に基づき、異種移植組織におけるMTF‐1およびサイクリンD1の発現レベルは、組織RNA抽出物を使用してRT‐PCRによって調べた。MTF‐1発現の減少は、図30Bに示すように化合物3、図30Cに示すように化合物7で、サイクリンD1発現の減少と相関した。
HT‐29細胞におけるMTF‐1とサイクリンD1の遺伝子発現の間の相関を図31に示す。RT‐PCRによって測定した、MTF‐1(図31A)およびサイクリンD1(図31B)発現における時間依存性の減少は、化合物3での治療後に見られた。サイクリンD1(図31D)発現の減少は、siRNAによるMTF‐1遺伝子ノックダウンの後に見られた。siRNAによるMTF‐1遺伝子ノックダウンの後のMTF‐1レベルを図31Cに示す。
MTF‐1の発現および活性は、式Iの化合物によって減少した。MTF‐1の下方制御は、サイクリンD1発現の減少と相関した。
腫瘍抑制因子KLF4の誘導を引き起こすMTF‐1発現の減少を図32に示す。KLF4遺伝子プロモーター領域上の部位に結合する重複転写因子(図32Aに示す)に基づき、MTF‐1結合は、他のKLF4誘導因子であるSp1およびKLF4の結合増加を助ける場合がある。HT‐29細胞核抽出物からのSp1(図32B)およびKLF4(図32C)のDNA結合活性の増加は、電気泳動移動度シフトアッセイ(EMSA)によって示された。
電気泳動移動度シフトアッセイ(EMSA)は以下のように行った。HT‐29細胞からの核抽出物(各実験群において100mmの培養皿に107細胞)は、核抽出物イオンキット(Panomics、Redwood City、CA)を使用して調製した。
MTF‐1活性の減少は、正の制御因子であるSpIおよびKLF4自己制御能によるKLF4の誘導を助ける。
HT‐29細胞においてサイクリンD1の抑制を引き起こすKLF4発現の減少を図33に示す。サイクリンD1遺伝子プロモーター領域(図33A)上の部位に結合する重複転写因子に基づき、負の制御因子KLF4の結合増加は、正の制御因子 Sp1の結合に取って代わる場合がある。サイクリンD1プロモーターとのin vivoでのKLF4およびSp1結合は、クロマチン免疫沈降アッセイ(ChIP)によって示された。KLF4結合の増加およびSp1結合の減少は、化合物3での治療後に見られた。
サイクリンD1プロモーターとのKLF4(負の制御因子)結合の減少は、Sp1(正の制御因子)結合を阻害し、サイクリンD1発現を抑制する。
HT‐29細胞成長におけるKLF4発現の有意性を図34に示す。RT‐PCRで測定したKLF4遺伝子発現は、siRNAによるKLF4遺伝子の有効なノックダウンを示した(図34A)。XTTアッセイで測定した細胞増殖は、siRNAによるKLF4遺伝子のノックダウン後の化合物3媒介の細胞成長阻害の損失を示した(図34B)。
(5’R(CUAGGGUAGACGAUGAGAG)d(TT)3’)[SEQ ID NO:3]および
(3’d(TT)R(GAUCCCAUCUGCUACUCUC)5’)[SEQ ID NO:4]
は、無関係の遺伝子の配列に基づいて、Qiagen (Cambridge、MA)において合成した。HT‐29細胞(35mmの培養皿に3×105細胞)は、Lipofectamine(登録商標)2000トランスフェクション試薬(Invitrogen)を使用して、メーカーの使用説明書に従い、指定された濃度のsiRNAまたはスクランブルRNA対照で6時間トランスフェクトした。培養期間の最後では、トランスフェクション培地に完全な成長培地を添加し、指定された実験の前に細胞を37℃で24時間培養した。
ヒト肺大細胞癌(H460)のマウス異種移植モデルにおける式Iの化合物による腫瘍成長阻害は、上記の実施例で記述するように実施した。結果を図35に示す。
in vitroにおいて亜鉛イオンで化合物3のキレート化の性質を判断するため、異なる濃度の化合物3とともにZnCl2を前培養した後、亜鉛感受性の蛍光染料Zinquinを使用して、遊離亜鉛イオンを蛍光分光分析によって測定した(図36)。2μMのZnCl2は、リン酸緩衝食塩水(PBS)において指示された濃度の化合物3とともに培養し、その後、10μMの最終濃度のZinquinを30分間加えた。亜鉛結合後のZinquinの蛍光性は、364nmの励起および485nmの発光波長でFluoroskan Ascent発光蛍光分光計において測定した。
Zinquinの蛍光性の用量依存的減少が見られ、亜鉛イオンでの化合物3のキレート化の結果として、Zinquinとの程度の少ない亜鉛イオン結合が示された。FeCl2およびCuSO4での同様の実験は、Zinquinの蛍光性を示さず、亜鉛イオンのみに対するZinquinの蛍光性の特異性を示した。
細胞内の亜鉛イオンでの化合物3のキレート化の性質を判断するため、35μMのZnCl2が最初から組み込まれているHT‐29細胞、または最初から組み込まれていないHT‐29細胞を化合物3、周知の亜鉛キレート剤TPENまたは媒体対照(DMSO)で処理し、前記の実施例に記述するようにZinquinの蛍光性を測定することによって、細胞内の遊離亜鉛を判断した。HT‐29細胞(4×105細胞/群)は、35μMのZnCl2で20分間前処理し、その後、指示された濃度の化合物3またはTPENおよび10μMのZinquinを37℃で30分間加え、蛍光数を測定した(図37A)。HT‐29細胞における内因性亜鉛イオンのキレート化の測定に関して、HT‐29細胞(1.5×106細胞/群)は、指示された濃度の化合物3および10μMのZinquinで37℃で30分間処理し、蛍光数を測定した(図37B)。
最初から組み込まれている亜鉛および内因性亜鉛レベルの両方の用量依存的減少は、化合物3またはTPENでの治療後に見られた。
化合物3での治療後の細胞内の亜鉛レベルの減少を確認するため、亜鉛貯蔵タンパク質メタロチオネイン1A(MT1A)の遺伝子発現の変化を細胞内の亜鉛状態マーカーとして測定した。
MT1A遺伝子発現が細胞内の亜鉛レベルを反映したことを検証するため、HT‐29細胞を、1μMの化合物3、35μMのZnCl2または化合物3とZnCl2の併用で16時間処理した(図38B)。MT1A遺伝子発現は、上述のようにRT‐PCRで判断した。MT1A遺伝子発現は、ZnCl2で処理した細胞における細胞内の亜鉛イオンの増加に反応して上昇した。化合物3での治療後に細胞内の亜鉛減少へ反応したMT1A発現の減少は、亜鉛補給物の添加によって逆転した(図38B)。
化合物3での治療後の亜鉛減少によるKLF4遺伝子発現の変化は、以下のようにRT‐PCRによって判断した。HT‐29細胞は、指示された時間、1μMの化合物3で処理(図39A)、またはHT‐29細胞は1μMの化合物3、35μMのZnCl2または化合物3とZnCl2の併用で16時間処理した(図39B)。総RNAは抽出し、遺伝子発現レベルをRT‐PCRで判断した。
KLF4の時間依存的増加は、1μMの化合物3でHT‐29細胞を4時間治療した後に見られ、最大増加は16時間の時点であった(図39A)。KLF4遺伝子発現の増加は亜鉛補給物の添加によって逆転し(図39B)、細胞内の亜鉛状態に反応したKLF4遺伝子発現の変更の有意性が示された。
MTF‐1の遺伝子発現は、1μMの化合物3でHT‐29細胞を指示された時間治療した後、RT‐PCRによって調べた。MTF‐1発現の減少は、化合物3での8時間の治療の後に見られた(図40A)。
KLF4および5は、KLF族転写因子の近似する2つの員であるが、KLF5は細胞増殖を刺激し、一方、KLF4は細胞成長を阻害する(Ghalebら(2005)Cell Res.15(2):92‐96)。KLF4および5は同様のGC‐リッチDNA共通配列と結合するが、反対の転写活性を示す。KLF4は、KLF4プロモーターにおけるGC‐リッチ領域と結合することによって自己の遺伝子を自動的に活性化することができるが、一方、KLF5は、同じDNA要素と結合することによってKLF4転写を抑制する(Dangら(2002)Nucleic Acids Res.30(13):2736‐2741)。
p21遺伝子およびタンパク質の発現は、化合物3での治療後に調べた。1μMの化合物3で処理したHT‐29細胞におけるp21の遺伝子発現は、以下のように指示された時間に判断した。
総RNAは抽出し、遺伝子発現レベルをRT‐PCRで判断した(図42A)。細胞溶解物におけるp21タンパク質のレベルは、ELISAによって(図42B)以下のように測定した。HT‐29細胞は、20μMのMG‐132(プロテアソーム阻害剤)の存在下または非存在下で1μMの化合物3で指示された時間処理した。
化合物3での治療後のサイクリンD1の遺伝子およびタンパク質発現は、それぞれ図43Aおよび43Bにおいて示すように、以下のようにRT‐PCRおよびエスタンブロット法によって判断した。HT‐29細胞は1μMの化合物3で指示された時間処理した。総RNAは抽出し、遺伝子発現レベルをRT‐PCRで判断した。HT‐29細胞溶解物におけるサイクリンD1タンパク質発現は、SDS‐PAGE、それに続くエスタンブロット法によって判断した。
サイクリンD1の遺伝子(図43A)およびタンパク質(図43B)レベルの両方における減少は、化合物3での8時間の治療後に見られた。
Sp1のように、Egr‐1も亜鉛フィンガーDNA結合ドメインとの転写因子であり、標的化遺伝子の制御プロモーター領域におけるGC‐リッチ配列を認識する(Al‐Sarrajら(2005)J.Cell Biochem.94(1):153‐167)。Egr‐1遺伝子発現の変化は、以下のように、RT‐PCRによって化合物3で処理したHT‐29細胞において見られた(図44A)。HT‐29細胞は、1μMの化合物3で指示された時間処理した。総RNAは抽出し、遺伝子発現レベルをRT‐PCRで判断した。亜鉛補給物の効果を判断するため、HT‐29細胞を1μMの化合物3、35μMのZnCl、または化合物3とZnCl2の併用で8時間処理した。Egr‐1遺伝子発現はRT‐PCRで判断した(図44B)。
Egr‐1遺伝子発現における有意な増加は、図44Aに示すように化合物3での治療後、早くて2時間で見られ、図44Bに示すように亜鉛補給物の添加によって可逆であった。
化合物3および化合物7に反応した遺伝子発現パターンは、以下のようにRT‐PCRで検証した(図45)。HT‐29細胞は、1μMの化合物3または化合物7で8時間処理した。総RNAは抽出し、遺伝子発現レベルをRT‐PCRで判断した。関連する遺伝子の同様の発現が見られた。
in vivoでのKLF4およびサイクリンD1発現における化合物3媒介の変化の効果を調べるため、媒体対照(ルトロール)および化合物3で処理したHT‐29大腸癌細胞を移植したマウスの異種移植組織における個々の遺伝子の発現をRT‐PCRで分析した(図46)。つまり、以下のように、化合物3での14日間の治療後のHT‐29異種移植組織におけるKLF4およびサイクリンD1遺伝子発現を測定した。HT‐29細胞を皮下移植したマウスは、媒体対照(i.p.投与)または100mg/kgの化合物3(i.p.投与)で14日間処理した(各群n=6)。総RNAは抽出し、遺伝子発現レベルをRT‐PCRで判断した。KLF4およびサイクリンD1遺伝子発現は、同じサンプルにおいてβ‐アクチン遺伝子発現で正規化した。KLF4およびサイクリンD1における倍変化は、ルトロールで処理した6匹の対照マウスからの個々の遺伝子発現の平均に対して示された。
in vitroでのHT‐29培養細胞株における発現パターンと一致して、KLF4遺伝子発現の増加およびサイクリンD1遺伝子発現の減少は、in vivoで見られた(図46)。
細胞内の亜鉛は、1分子につき7または8つの亜鉛を貯蔵する貯蔵タンパク質メタロチオネイン(MT)と緩く結合した不安定なプールとして存在する。不安定な亜鉛プールは、完全活性化のために亜鉛との可逆的結合を必要とする酵素または転写因子に亜鉛を提供する(Tapiero and Tew(2003)Biomed Pharmacother、57(9):399‐411)。MTから亜鉛を除去する化合物3の効率性を調べた。>95%のMTにおいて1分子につき7つまでの亜鉛を有するMT‐1aおよびMT‐2eを主に含有するウサギの肝臓から分離したMT‐1は、Alexis Biochemicals(Lausen、Switzerland)から購入した。MTにおける亜鉛の含有量は、前の実施例に記述するように、4(2‐ビリジルアゾ)レゾルシノール(PAR)比色亜鉛アッセイを使用して、in vitroで測定した。PAR‐亜鉛イオン錯体形成後のPARの吸収度における変化は、500nmで測定した(Dinkova‐Kostovaら(2005)Biochemistry、44(18):6889‐6899)。in vitroで化合物3によるMT‐1からの亜鉛のキレート化を判断するため、体積100mlの0.2Mトリス‐HCl、pH7.5における25μMのMT‐1を96ウェルプレートに加えた。80%アセトニトリル/20%DMSOにおける化合物3(0.15〜60μM)を室温で15分間MT‐1に加えた。PAR(0.2Mトリス‐HCl、pH7.5において200μM)を加え、PAR‐亜鉛錯体の着色を、図47に示すように500nmのマルチウェル分光光度計で測定した。
亜鉛フィンガーを含有する転写因子である金属応答配列(MRE)結合転写因子(MTF‐1)のDNA結合活性を不活性化する化合物3の効率性を調べた。亜鉛のMTF‐1の活性化亜鉛フィンガーとの可逆的結合は、MTF‐1の核転座およびMTF‐1のMREとの最大結合に必要とされる(LichtlenおよびSchaffner(2001)Bioessays、23(11):1010‐1017)。
細胞における化合物3によるMTF‐1の不活性化を調べるため、HT‐29細胞は化合物3で1〜4時間処理し、核抽出物におけるMTF‐1のDNA結合活性はEMSAで試験した。MTF‐1活性の有意な減少は、化合物3でのHT‐29細胞の治療後4時間で見られた(図48B)。
MTF‐1標的化遺伝子のプロモーター領域、細胞周期制御遺伝子サイクリンD1とのMTF‐1結合の減少を調べるため、HT‐29細胞は化合物3で16時間処理し、サイクリンD1プロモーターとのMTF‐1結合は、クロマチン免疫沈降アッセイ(ChIP)(Active Motif、Carlsbad、CA)によって試験した。化合物3での16時間の治療の終了時、細胞は1%ホルムアルデヒドで架橋転写因子およびそれらの標的クロマチンに固定した。クロマチン錯体はせん断され、MTF‐1で結合したクロマチンはMTF‐1に対する抗体(Santacruz Biotechnology Inc.)によって破壊した。架橋は逆転し、MTF‐1関連DNAはサイクリンD1プロモーターの‐231〜‐92領域を含むプライマーを使用してポリメラーゼ連鎖反応によって増幅した。5’プライマー(5’‐CGGACTACAGGGGCAAS’)[SEQ ID NO:1]および3’プライマー(5’‐GCTCCAGGACTTTGCA‐S’)[SEQ ID NO:2]は、Invitrogenにおいて合成した。サイクリンD1プロモーターとのMTF‐1結合の増加は、図49に示すように35μMのZnCl2での治療後に見られ、サイクリンD1がMTF‐1標的化遺伝子であることが示された。基礎レベルのMTF‐1結合と比較して、化合物3後にサイクリンD1プロモーターとのMTF‐1結合の減少が見られ、化合物3がMTF‐1による構造性のサイクリンD1遺伝子転写活性化を阻害したことが示された(図49)。
特にG1/S相に関連する、実施例23及び41に示すように化合物3媒介の細胞周期停止に関与する細胞周期制御経路を検証するため、G1/S位相進行の主要な細胞周期制御因子サイクリンD1の発現を調べた。RT‐PCRで測定によると、サイクリンD1遺伝子発現は、1μMの化合物3でのHT‐29細胞の16時間の治療の後、有意に減少し、25μMのZnCl2の存在下で逆転し、サイクリンD1発現の減少は亜鉛減少の結果であったことが確認された(図50A)。サイクリンD1のタンパク質発現の減少は、SDS‐PAGE、それに続くウエスタンブロット法によっても確認された(図50B)。さらに、他の種類のサイクリンの発現の測定によって、サイクリンEの発現の減少が確認された(図50B)。
亜鉛減少に対する細胞反応を評価するため、亜鉛感受性の転写因子MTF‐1の遺伝子発現を調べた。RT‐PCRで測定すると、MTF‐1の遺伝子発現の有意な減少(図51)は1μMの化合物3でHT‐29細胞を8時間治療した後に見られ、それは亜鉛補給物の添加によって回復し、化合物3での治療によるMTF‐1の発現減少は亜鉛減少の結果であったことが確認された。
対照またはMTF‐1siRNAで処理したHT‐29細胞は、ZnCl2で、またはZnCl2なしで処理し、サイクリンD1遺伝子の発現をRT‐PCRで測定した。遺伝子発現の倍変化は、対照群においてはトランスフェクションなしで対照細胞のサイクリンD1遺伝子の発現に対して示され、トランスフェクション群では非特異性siRNAトランスフェクト細胞におけるサイクリンD1遺伝子の発現に対して示された。サイクリンD1発現の亜鉛依存性増加は、MTF‐1遺伝子が化合物3の添加の前にsiRNAによって分解された時になくなった(図51C)。
KLF4誘導に対するMTF‐1発現の減少の有意性を評価するため、化合物3での治療に反応によるKLF4遺伝子発現は、MTF‐1siRNAでトランスフェクトしたHT‐29細胞においてRT‐PCRで測定した。KLF4遺伝子発現の倍変化は、媒体対照で処理した非特異的siRNAでトランスフェクトした細胞におけるKLF4発現に対して示された。KLF4の基本的発現遺伝子は、MTF‐1遺伝子ノックダウンの後、有意に減少し、構造性のMTF‐1依存的KLF4遺伝子転写が示された(図52)。しかしながら、KLF4遺伝子発現は、siRNAによるMTF‐1遺伝子のノックダウンにかかわらず、化合物3での治療の後、増加し続け(図52)、化合物3での治療によるKLF4遺伝子のMTF‐1に依存しない活性化が示唆された。
他の潜在的な腫瘍抑制因子であるKLF2(肺KLF)(Wangら(2005)ONCOGENE、22(24):3878‐3885)およびKLF6(Itoら(2004)Cancer Res、64(11):3838‐3843)の発現レベルは、非小細胞癌細胞株であるH‐460において評価した。対照H−460細胞におけるKLF2、4および6の発現は、RT‐PCRで測定した。遺伝子発現は、「1」とするKLF4発現に対して示された(図53A)。KLF4発現が最も高く、「1」とするKLF4発現に対して、KLF2および6の0.05および0.3倍のみの発現が検出された(図53A)。
化合物3の腫瘍抑制効果は、化合物3で処理したHT‐29を移植した無胸腺マウス(図54A)において評価し、HT‐29異種移植組織におけるMTF‐1、KLF4およびサイクリンD1の遺伝子発現と相関させた(図54B)。CD‐1無胸腺ヌードマウス(各群4匹)は、HT‐29細胞(0.1mLのPBSに3×106細胞)を皮下に注射した。腫瘍細胞の接種後5日目から5日間、200μLの媒体対照または100mg/kgの化合物3をマウスの腹腔内に注射し、その後10日間の間隔をあけ、それを2周期(第1周期の注射は5日目〜9日目、第2周期の注射は20日目〜24日目)行った。腫瘍の大きさは、キャリパーを使用して治療の期間中測定した(図54A)。マウスは、腫瘍細胞の接種後34日目に死亡させた。腫瘍組織は切除し、直ちに凍結し、RNA抽出および遺伝子発現をRT‐PCRで分析するまで−80℃で保存した(図54B)。遺伝子発現の倍変化は、ルトロール媒体対照を注射した4匹の対照マウスの平均値に対して示された。
MT1A(図55A)、MTF‐1(図55B)、サイクリンD1(図55C)およびKLF4(図55D)の遺伝子発現を調節する式Iの化合物の能力は、RT‐PCRで判断した。HT‐29細胞は、1μMの化合物3または化合物7、35μMのZnCl2、化合物3とZnCl2の併用、または化合物7とZnCl2の併用で8〜16時間処理した。個々の遺伝子発現は、同じサンプルにおいてβ‐アクチン遺伝子発現で正規化した。遺伝子発現の倍変化は、DMSO対照の個々の遺伝子レベルに対して示された。1μMの化合物3で見られたように、MT1A、MTF‐1およびサイクリンD1の発現減少およびKLF4の発現増加は、化合物7でも検出された。遺伝子発現変化が細胞内の亜鉛枯渇の結果であることを強調するように、化合物3または化合物7の治療後のMT1A(8時間)(図55A)、MTF‐1(8時間)(図55B)およびサイクリンD1(8時間)(図55C)の減少およびKLF4(16時間)(図55D)の増加は、亜鉛補給物の添加によって逆転した。
化合物64の金属キレート化の性質および異なる金属イオンに対する相対的親和力は前記の実施例に記述する手順を使用して、4(2‐ビリジルアゾ)レゾルシノール(PAR)比色亜鉛アッセイで評価し、in vitroでの化合物3の効果と比較した。ZnCl2(図56A)、CuCl2(図56B)またはFeCl2(図56C)の指示された最終濃度は、80%アセトニトリル‐20%DMSO媒体対照または200μMの式Iの化合物とともに培養した。PAR‐金属イオン錯体の着色は、500nmのマルチウェル分光光度計で測定した。
HT‐29細胞におけるMT1A(図57A)、MTF‐1(図57B)、サイクリンD1(図57C)およびKLF4(図57D)の遺伝子発現に対する化合物3および化合物64の効果は、RT‐PCRで判断した。HT‐29細胞は、1μMの化合物3または化合物64、35μMのZnCl2、化合物3とZnCl2の併用、または化合物64とZnCl2の併用で8〜16時間処理した。個々の遺伝子発現は、同じサンプルにおいてβ‐アクチン遺伝子発現で正規化した。遺伝子発現の倍変化は、DMSO対照の個々の遺伝子レベルに対して示された。
Claims (54)
- 必要とする被検体の癌細胞の増殖を阻害する際に使用するための、式(I)の化合物、
式中、R1、R2、R3、R4、R6およびR7は、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、チオール、低アルキル、置換低アルキル、低アルケニル、置換低アルケニル、低アルキニル、置換低アルキニル、アルコキシ、アルキルチオ、アシル、アリールオキシ、アミノ、アミド、カルボキシル、アリール、置換アリール、ヘテロサイクル、置換ヘテロサイクル、ヘテロアルキル、置換ヘテロアルキル、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、シクロアルキル、置換シクロアルキル、ニトロ、シアノ、または‐S(O)1‐2R(式中、Rはアルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、ヘテロサイクル、ヘテロアリール、置換ヘテロサイクル、または置換ヘテロアリールである)から単独で選択され、
R5は、H、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アシル、‐CH2‐アリール、‐CH2‐ヘテロアリールである、
式(I)の化合物、またはその塩。 - 前記癌が白血病、前立腺癌、非小細胞肺癌、腎臓癌、膀胱癌および消化管癌の群から選択される、請求項1に記載の化合物。
- 前記消化管癌が大腸癌または結腸直腸癌である、請求項2に記載の化合物。
- 前記癌が白血病、前立腺癌、非小細胞肺癌または大腸癌である、請求項1に記載の化合物。
- 前記癌が白血病である、請求項4に記載の化合物。
- R1、R2、R3、R4が単独で水素、ハロゲン、C1‐C4アルキル、C1‐C4アルコキシ、またはC6‐C14アリールであり、
R5が水素、C1‐C4アルキル、C6‐C14アリールで置換されたC1‐C4アルキル、またはC4‐C6シクロアルキルであり、
R6が水素、ハロゲン、C1‐C4アルキル、ヘテロ原子がNであるC5‐C6ヘテロシクロアルキルで置換されたC1‐C4アルキル、C6‐C14アリール、C1‐C4アルキルまたはハロで置換されたC6‐C14アリール、C5‐C6シクロアルキル、C5‐C6ヘテロシクロアルキル、またはポリシクロアルキルであり、および
R7がHである、
請求項1から5のいずれかに記載の化合物。 - R1、R2、R3、R4が単独で水素、ハロゲン、C1‐C4アルキル、C1‐C4アルコキシ、またはフェニルであり、
R5が水素、C1‐C4アルキル、フェニルで置換されたC1‐C4アルキル、またはシクロペンチルであり、
R6が水素、ハロゲン、C1‐C4アルキル、ヘテロ原子がNであるC5‐C6ヘテロシクロアルキルで置換されたC1‐C4アルキル、フェニル、C1‐C4アルキルまたはハロで置換されたフェニル、C5‐C6シクロアルキル、C5‐C6ヘテロシクロアルキル、またはアダマンタンであり、および
R7がHである、
請求項1から5のいずれかに記載の化合物。 - R1、R2、R3、R4が単独で水素、ハロゲン、またはC1‐C4アルキルであり、R5がC1‐C4水素、C1‐C4アルキル、フェニルで置換されたC1‐C4アルキル、またはC4‐C6シクロアルキルであり、
R6がC1‐C4アルキル、ヘテロ原子がNであるC5‐C6ヘテロシクロアルキルで置換されたC1‐C4アルキル、C5‐C6シクロアルキル、アダマンタン、フェニル、またはC1‐C4アルキルまたはハロで置換されたフェニルであり、および
R7がHである、
請求項1から5のいずれかに記載の化合物。 - R1、R2、R3、R4が単独で水素、ハロゲン、またはC1‐C4アルキルであり、R5が水素、C1‐C4アルキル、またはC4‐C6シクロアルキルであり、
R6がC1‐C4アルキル、アダマンタン、フェニル、またはC1‐C4アルキルまたはハロで置換されたフェニルであり、およびR7がHである、
請求項1から5のいずれかに記載の化合物。 - R1、R2、R3、R4が単独で水素、ハロゲン、またはC1‐C4アルキルであり、
R5が水素であり、
R6がC1‐C4アルキルまたはアダマンタンであり、および
R7がHである、
請求項1から5のいずれかに記載の化合物。 - R1、R2、R3、R4が単独で水素、C1‐C4アルキル、またはC1‐C4アルコキシであり、
R5がC1‐C4アルキル、またはC4‐C6シクロアルキルであり、R6が水素、C1‐C4アルキル、アダマンタン、フェニル、またはC1‐C4アルキルまたはハロで置換されたフェニルであり、および
R7がHである、
請求項1から5のいずれかに記載の化合物。 - R1、R2、R3、R4が単独で水素、C1‐C4アルキル、またはC1‐C4アルコキシであり、R5がC1‐C4アルキル、フェニルで置換されたC1‐C4アルキル、またはC4‐C6シクロアルキルであり、
R6が水素、C1‐C4アルキル、またはC5‐C6ヘテロシクロアルキルであり、および
R7がHである、
請求項1から5のいずれかに記載の化合物。 - 癌細胞においてアポトーシスを誘導する際に使用するための、式(I)の化合物、
式中、R1、R2、R3、R4、R6およびR7は、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、チオール、低アルキル、置換低アルキル、低アルケニル、置換低アルケニル、低アルキニル、置換低アルキニル、アルコキシ、アルキルチオ、アシル、アリールオキシ、アミノ、アミド、カルボキシル、アリール、置換アリール、ヘテロサイクル、置換ヘテロサイクル、ヘテロアルキル、置換ヘテロアルキル、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、シクロアルキル、置換シクロアルキル、ニトロ、シアノ、または‐S(O)1‐2R(式中、Rはアルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、ヘテロサイクル、ヘテロアリール、置換ヘテロサイクル、または置換ヘテロアリールである)から単独で選択され、
R5は、H、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アシル、‐CH2‐アリール、‐CH2‐ヘテロアリールである、
式(I)の化合物、またはその塩。 - 前記癌細胞が白血病細胞、前立腺癌細胞、非小細胞肺癌細胞、腎臓癌細胞、膀胱癌細胞および消化管癌細胞の群から選択される、請求項14に記載の化合物。
- 前記消化管癌細胞が大腸癌細胞または結腸直腸癌細胞である、請求項15に記載の化合物。
- 前記癌細胞が白血病細胞、前立腺癌細胞、非小細胞肺癌細胞または大腸癌細胞である、請求項14に記載の化合物。
- 前記癌細胞が白血病細胞である、請求項17に記載の化合物。
- R1、R2、R3、R4が単独で水素、ハロゲン、C1‐C4アルキル、C1‐C4アルコキシ、またはC6‐C14アリールであり、
R5が水素、C1‐C4アルキル、C6‐C14アリールで置換されたC1‐C4アルキル、またはC4‐C6シクロアルキルであり、
R6が水素、ハロゲン、C1‐C4アルキル、ヘテロ原子がNであるC5‐C6ヘテロシクロアルキルで置換されたC1‐C4アルキル、C6‐C14アリール、C1‐C4アルキルまたはハロで置換されたC6‐C14アリール、C5‐C6シクロアルキル、C5‐C6ヘテロシクロアルキルまたはポリシクロアルキルであり、および
R7がHである、
請求項14から18のいずれかに記載の化合物。 - R1、R2、R3、R4が単独で水素、ハロゲン、C1‐C4アルキル、C1‐C4アルコキシ、またはフェニルであり、
R5が水素、C1‐C4アルキル、フェニルで置換されたC1‐C4アルキル、またはシクロペンチルであり、R6が水素、ハロゲン、C1‐C4C1‐C4アルキル、ヘテロ原子がNであるC5‐C6ヘテロシクロアルキルで置換されたC1‐C4アルキル、フェニル、C1‐C4アルキルまたはハロで置換されたフェニル、C5‐C6シクロアルキル、C5‐C6ヘテロシクロアルキルまたはアダマンタンであり、および
R7がHである、
請求項14から18のいずれかに記載の化合物。 - R1、R2、R3、R4が単独で水素、ハロゲン、またはC1‐C4アルキルであり、
R5が水素、C1‐C4C1‐C4アルキル、フェニルで置換されたC1‐C4アルキル、またはC4‐C6シクロアルキルであり、R6がC1‐C4アルキル、ヘテロ原子がNであるC5‐C6ヘテロシクロアルキルで置換されたC1‐C4アルキル、C5‐C6シクロアルキル、アダマンタン、フェニル、またはC1‐C4アルキルまたはハロで置換されたフェニルであり、およびR7がHである、請求項14から18のいずれかに記載の化合物。 - R1、R2、R3、R4が単独で水素、ハロゲン、またはC1‐C4アルキルであり、R5が水素、C1‐C4アルキル、またはC4‐C6シクロアルキルであり、
R6がC1‐C4アルキル、アダマンタン、フェニル、またはC1‐C4アルキルまたはハロで置換されたフェニルであり、および
R7がHである、
請求項14から18のいずれかに記載の化合物。 - R1、R2、R3、R4が単独で水素、ハロゲン、またはC1‐C4アルキルであり、R5が水素であり、
R6がC1‐C4アルキルまたはアダマンタンであり、
R7がHである、
請求項14から18のいずれかに記載の化合物。 - R1、R2、R3、R4が単独で水素、C1‐C4アルキル、またはC1‐C4アルコキシであり、
R5がC1‐C4アルキル、またはC4‐C6シクロアルキルであり、
R6が水素、C1‐C4アルキル、アダマンタン、フェニル、またはC1‐C4アルキルまたはハロで置換されたフェニルであり、および
R7がHである、
請求項14から18のいずれかに記載の化合物。 - R1、R2、R3、R4が単独で水素、C1‐C4アルキル、またはC1‐C4アルコキシであり、
R5がC1‐C4アルキル、フェニルで置換されたC1‐C4アルキル、またはC4‐C6シクロアルキルであり、
R6が水素、C1‐C4アルキル、またはC5‐C6ヘテロシクロアルキルであり、およびR7がHである、
請求項14から18のいずれかに記載の化合物。 - 細胞において遷移金属イオンをキレートする際に使用するための、式(I)の化合物、
式中、R1、R2、R3、R4、R6およびR7は、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、チオール、低アルキル、置換低アルキル、低アルケニル、置換低アルケニル、低アルキニル、置換低アルキニル、アルコキシ、アルキルチオ、アシル、アリールオキシ、アミノ、アミド、カルボキシル、アリール、置換アリール、ヘテロサイクル、置換ヘテロサイクル、ヘテロアルキル、置換ヘテロアルキル、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、シクロアルキル、置換シクロアルキル、ニトロ、シアノ、または‐S(O)1‐2R(式中、Rはアルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、ヘテロサイクル、ヘテロアリール、置換ヘテロサイクル、または置換ヘテロアリールである)から単独で選択され、
R5は、H、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アシル、‐CH2‐アリール、‐CH2‐ヘテロアリールである、
式(I)の化合物、またはその塩。 - 前記遷移金属イオンが亜鉛イオン、鉄イオンまたは銅イオンである、請求項27に記載の化合物。
- 前記遷移金属イオンが亜鉛イオンである、請求項27または28に記載の化合物。
- 前記遷移金属イオンが銅イオンである、請求項27または28に記載の化合物。
- 前記細胞がin vivoである、請求項27から30のいずれかに記載の化合物。
- 前記細胞がin vitroである、請求項27から30のいずれかに記載の化合物。
- 前記細胞が癌細胞である、請求項27から32のいずれかに記載の化合物。
- 前記癌細胞が白血病細胞、前立腺癌細胞、非小細胞肺腫瘍細胞、腎臓癌細胞、膀胱癌細胞および消化管癌細胞の群から選択される、請求項33に記載の化合物。
- R1、R2、R3、R4が単独で水素、ハロゲン、C1‐C4アルキル、C1‐C4アルコキシ、またはC6‐C14アリールであり、
R5が水素、C1‐C4アルキル、C6‐C14アリールで置換されたC1‐C4アルキル、またはC4‐C6シクロアルキルであり、
R6が水素、ハロゲン、C1‐C4アルキル、ヘテロ原子がNであるC5‐C6ヘテロシクロアルキルで置換されたC1‐C4アルキル、C6‐C14アリール、C1‐C4アルキルまたはハロで置換されたC6‐C14アリール、C5‐C6シクロアルキル、C5‐C6ヘテロシクロアルキル、またはポリシクロアルキルであり、および
R7がHである、
請求項27から34のいずれかに記載の化合物。 - R1、R2、R3、R4が単独で水素、ハロゲン、C1‐C4C1‐C4アルキル、C1‐C4アルコキシ、またはフェニルであり、
R5が水素、C1‐C4アルキル、フェニルで置換されたC1‐C4アルキル、またはシクロペンチルであり、
R6が水素、ハロゲン、C1‐C4アルキル、ヘテロ原子がNであるC5‐C6ヘテロシクロアルキルで置換されたC1‐C4アルキル、フェニル、C1‐C4アルキルまたはハロで置換されたフェニル、C5‐C6シクロアルキル、C5‐C6ヘテロシクロアルキルまたはアダマンタンであり、および
R7がHである、
請求項27から34のいずれかに記載の化合物。 - R1、R2、R3、R4が単独で水素、ハロゲン、またはC1‐C4アルキルであり、
R5が水素、C1‐C4アルキル、フェニルで置換されたC1‐C4アルキル、またはC4‐C6シクロアルキルであり、
R6がC1‐C4アルキル、ヘテロ原子がNであるC5‐C6ヘテロシクロアルキルで置換されたC1‐C4アルキル、C5‐C6シクロアルキル、アダマンタン、フェニル、またはC1‐C4アルキルまたはハロで置換されたフェニルであり、および
R7がHである、
請求項27から34のいずれかに記載の化合物。 - R1、R2、R3、R4が単独で水素、ハロゲン、またはC1‐C4アルキルであり、
R5が水素、C1‐C4アルキル、またはC4‐C6シクロアルキルであり、
R6がC1‐C4アルキル、アダマンタン、フェニル、またはC1‐C4アルキルまたはハロで置換されたフェニルであり、および
R7がHである、
請求項27から34のいずれかに記載の化合物。 - R1、R2、R3、R4が単独で水素、ハロゲン、またはC1‐C4アルキルであり、
R5が水素であり、
R6がC1‐C4アルキルまたはアダマンタンであり、および
R7がHである、
請求項27から34のいずれかに記載の化合物。 - R1、R2、R3、R4が単独で水素、C1‐C4アルキル、またはC1‐C4アルコキシであり、
R5がC1‐C4アルキル、またはC4‐C6シクロアルキルであり、
R6が水素、C1‐C4アルキル、アダマンタン、フェニル、またはC1‐C4アルキルまたはハロで置換されたフェニルであり、および
R7がHである、
請求項27から34のいずれかに記載の化合物。 - R1、R2、R3、R4が単独で水素、C1‐C4アルキル、またはC1‐C4アルコキシであり、
R5がC1‐C4アルキル、フェニルで置換されたC1‐C4アルキル、またはC4‐C6シクロアルキルであり、
R6が水素、C1‐C4アルキル、またはC5‐C6ヘテロシクロアルキルであり、
R7がHである、
請求項27から34のいずれかに記載の化合物。 - 癌細胞においてKr(upsion)ppel様因子4(KLF4)の発現を増加させる際に使用するための、式(I)の化合物、
式中、R1、R2、R3、R4、R6およびR7は、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、チオール、低アルキル、置換低アルキル、低アルケニル、置換低アルケニル、低アルキニル、置換低アルキニル、アルコキシ、アルキルチオ、アシル、アリールオキシ、アミノ、アミド、カルボキシル、アリール、置換アリール、ヘテロサイクル、置換ヘテロサイクル、ヘテロアルキル、置換ヘテロアルキル、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、シクロアルキル、置換シクロアルキル、ニトロ、シアノ、または‐S(O)1‐2R(式中、Rはアルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、ヘテロサイクル、ヘテロアリール、置換ヘテロサイクル、または置換ヘテロアリールである)から単独で選択され、
R5は、H、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アシル、‐CH2‐アリール、‐CH2‐ヘテロアリールであり、
式Iの前記化合物がKLFの発現を増加させることができる、
式(I)の化合物、またはその塩。 - 前記癌細胞が白血病細胞、膀胱癌細胞および消化管癌細胞の群から選択される、請求項43に記載の化合物。
- 前記消化管癌細胞が大腸癌細胞または結腸直腸癌細胞である、請求項44に記載の化合物。
- 前記癌細胞が白血病細胞である、請求項43から45に記載の化合物。
- R1、R2、R3、R4が単独で水素、ハロゲン、C1‐C4アルキル、C1‐C4アルコキシ、またはC6‐C14アリールであり、
R5が水素、C1‐C4アルキル、C6‐C14アリールで置換されたC1‐C4アルキル、またはC4‐C6シクロアルキルであり、
R6が水素、ハロゲン、C1‐C4アルキル、ヘテロ原子がNであるC5‐C6ヘテロシクロアルキルで置換されたC1‐C4アルキル、C6‐C14アリール、C1‐C4アルキルまたはハロで置換されたC6‐C14アリール、C5‐C6シクロアルキル、C5‐C6ヘテロシクロアルキル、またはポリシクロアルキルであり、および
R7がHである、
請求項43から46のいずれかに記載の化合物。 - R1、R2、R3、R4が単独で水素、ハロゲン、C1‐C4アルキル、C1‐C4アルコキシ、またはフェニルであり、
R5が水素、C1‐C4C1‐C4アルキル、フェニルで置換されたC1‐C4アルキル、またはシクロペンチルであり、
R6が水素、ハロゲン、C1‐C4アルキル、ヘテロ原子がNであるC5‐C6ヘテロシクロアルキルで置換されたC1‐C4アルキル、フェニル、C1‐C4アルキルまたはハロで置換されたフェニル、C5‐C6シクロアルキル、C5‐C6ヘテロシクロアルキルまたはアダマンタンであり、および
R7がHである、
請求項43から46のいずれかに記載の化合物。 - R1、R2、R3、R4が単独で水素、ハロゲン、またはC1‐C4C1‐C4アルキルであり、
R5が水素、C1‐C4アルキル、フェニルで置換されたC1‐C4アルキル、またはC4‐C6シクロアルキルであり、
R6がC1‐C4アルキル、ヘテロ原子がNであるC5‐C6ヘテロシクロアルキルで置換されたC1‐C4アルキル、C5‐C6シクロアルキル、アダマンタン、フェニル、またはC1‐C4アルキルまたはハロで置換されたフェニルであり、および
R7がHである、
請求項43から46のいずれかに記載の化合物。 - R1、R2、R3、R4が単独で水素、ハロゲン、またはC1‐C4アルキルであり、
R5が水素、C1‐C4アルキル、またはC4‐C6シクロアルキルであり、
R6がC1‐C4アルキル、アダマンタン、フェニル、またはC1‐C4アルキルまたはハロで置換されたフェニルであり、および
R7がHである、
請求項43から46のいずれかに記載の化合物。 - R1、R2、R3、R4が単独で水素、ハロゲン、またはC1‐C4アルキルであり、
R5が水素であり、
R6がC1‐C4アルキルまたはアダマンタンであり、および
R7がHである、
請求項43から46のいずれかに記載の化合物。 - R1、R2、R3、R4が単独で水素、C1‐C4アルキル、またはC1‐C4アルコキシであり、
R5がC1‐C4アルキル、またはC4‐C6シクロアルキルであり、
R6が水素、C1‐C4アルキル、アダマンタン、またはC1‐C4アルキルまたはハロで任意に置換されたフェニルであり、および
R7がHである、
請求項43から46のいずれかに記載の化合物。 - R1、R2、R3、R4が単独で水素、C1‐C4アルキル、またはC1‐C4アルコキシであり、
R5がC1‐C4アルキル、フェニルで置換されたC1‐C4アルキル、またはC4‐C6シクロアルキルであり、
R6が水素、C1‐C4アルキル、またはC5‐C6ヘテロシクロアルキルであり、および
R7がHである、
請求項43から46のいずれかに記載の化合物。
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