JP2008537752A5 - - Google Patents
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Description
本出願は、2005年4月12日に出願された米国特許出願第60/670,717号の利益を請求しており、その内容は、その全体が本明細書中に参考として援用される。本出願はまた、以下の出願に関連し、その内容もまた、その全体が参考として援用される:PCT/US03/24587、Methods Of Down Regulating Target Gene Expression In Vivo By Introduction Of Interfering RNA;PCT/US2005/003857、RNAi Therapeutics for Treatment of
Eye Neovascularization Diseases;PCT/US2005/003858、Compositions and Methods for Combination RNAi Therapeutics。
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(発明の分野)
本発明は、望ましくない新脈管構造(NV)、しばしば、血管の異常または過剰な増殖および成長を含む疾患の治療のための組成物および方法を提供する。NV自体の発達は、多くの場合、不都合な結果を招くか、疾患の初期段階であり得る。血管形成の新規の治療アンタゴニスト(VEGF経路のアンタゴニストを含む)の導入にもかかわらず、NVを調節するための眼の治療は不十分であり、疾患の進行を阻害するか望ましくない血管形成を逆転するためのNVの有効な治療法に対するニーズ満たされていないものが多くあり、これが増大しつつある。NVが正常な生物学的過程でもあり得るので、好ましくは、望ましくないNVの阻害は罹患組織に対して選択的に行われ、好ましくは、罹患組織への治療分子の選択的送達が必要である。
本発明は、望ましくない新脈管構造(NV)、しばしば、血管の異常または過剰な増殖および成長を含む疾患の治療のための組成物および方法を提供する。NV自体の発達は、多くの場合、不都合な結果を招くか、疾患の初期段階であり得る。血管形成の新規の治療アンタゴニスト(VEGF経路のアンタゴニストを含む)の導入にもかかわらず、NVを調節するための眼の治療は不十分であり、疾患の進行を阻害するか望ましくない血管形成を逆転するためのNVの有効な治療法に対するニーズ満たされていないものが多くあり、これが増大しつつある。NVが正常な生物学的過程でもあり得るので、好ましくは、望ましくないNVの阻害は罹患組織に対して選択的に行われ、好ましくは、罹患組織への治療分子の選択的送達が必要である。
本発明は、血管形成促進性生化学経路の選択的阻害(VEGF経路遺伝子発現の阻害および罹患NV組織に局在化した阻害を含む)によってNVを調節する治療を提供することによってこの困難を克服する。本発明は、ポリマー抱合体を含み、RNA干渉(RNAi)を誘導する核酸分子をさらに含む組織標的化ナノ粒子組成物およびその使用方法を提供する。本発明は、NV、より好ましくはVEGF経路で活性な各遺伝子または遺伝子の組み合わせの阻害のための組成物および方法を提供する。本発明のdsRNAナノ粒子組成物を、単独または他の治療薬(標的化治療薬(モノクローナル抗体および小分子インヒビターなどのVEGF経路アンタゴニストを含む)ならびにEGFおよびその受容体、PDGFおよびその受容体、MEK、またはBcr−Ablを阻害する標的化治療薬)、免疫療法、および化学療法と組み合わせて使用することができる。本発明はまた、被験体のNV疾患(癌、眼疾患、関節炎、および炎症性疾患を含む)の治療のための組成物および方法を提供する。
(発明の背景)
最近の米国FDA承認治療薬(アバスチンおよびマキュゲン(Macugen)を含む)は、NV疾患にいくらかの利点がある。いくつかのこれらの薬剤は、血管内皮成長因子(VEGF)への結合およびその作用の阻害によって作用するが、これらの薬剤は多くの患者で有効ではない。臨床研究で評価された他の薬剤は、VEGFの受容体またはシグナル伝達のためにこれらの受容体によって使用される「下流」タンパク質への結合およびその作用の阻害によっていくつかの利点を得ることができるという徴候を示す。このVEGF「経路」を調節するための手段によってNVレベルを調製することができ、患者によっては利点が得られるというのが現状である。さらに、一連の小分子キナーゼインヒビターについての研究により、複数のキナーゼタンパク質、VEGF受容体、PDGF受容体、FLT3、およびKitに活性を有するスニチニブと呼ばれるインヒビターがNV疾患に対してより良好な臨床的利点を付与することが見出された。しかし、これらの利点は、ほとんどの患者で依然として不適切であり、VEGF経路を調節するためのより良好な治療手段が依然として必要である。現在開発されている薬剤のほとんどがVEGFまたはその受容体(VEGFR1およびVEGFR2)のアンタゴニストである。アンタゴニストの使用によって生じる1つの問題は、VEGF産生を増加させるための、罹患組織による応答のようである。したがって、NVの治療的調節を改良するための魅力的な手段は、VEGF経路のタンパク質の産生を阻害する、すなわち、その遺伝子発現を下方制御することであり、小さな干渉dsRNAオリゴヌクレオチド(siRNA)のインビボ送達によるRNA干渉の誘導によってこれを行う。
最近の米国FDA承認治療薬(アバスチンおよびマキュゲン(Macugen)を含む)は、NV疾患にいくらかの利点がある。いくつかのこれらの薬剤は、血管内皮成長因子(VEGF)への結合およびその作用の阻害によって作用するが、これらの薬剤は多くの患者で有効ではない。臨床研究で評価された他の薬剤は、VEGFの受容体またはシグナル伝達のためにこれらの受容体によって使用される「下流」タンパク質への結合およびその作用の阻害によっていくつかの利点を得ることができるという徴候を示す。このVEGF「経路」を調節するための手段によってNVレベルを調製することができ、患者によっては利点が得られるというのが現状である。さらに、一連の小分子キナーゼインヒビターについての研究により、複数のキナーゼタンパク質、VEGF受容体、PDGF受容体、FLT3、およびKitに活性を有するスニチニブと呼ばれるインヒビターがNV疾患に対してより良好な臨床的利点を付与することが見出された。しかし、これらの利点は、ほとんどの患者で依然として不適切であり、VEGF経路を調節するためのより良好な治療手段が依然として必要である。現在開発されている薬剤のほとんどがVEGFまたはその受容体(VEGFR1およびVEGFR2)のアンタゴニストである。アンタゴニストの使用によって生じる1つの問題は、VEGF産生を増加させるための、罹患組織による応答のようである。したがって、NVの治療的調節を改良するための魅力的な手段は、VEGF経路のタンパク質の産生を阻害する、すなわち、その遺伝子発現を下方制御することであり、小さな干渉dsRNAオリゴヌクレオチド(siRNA)のインビボ送達によるRNA干渉の誘導によってこれを行う。
RNA干渉(RNAi)は、二本鎖RNAが配列特異的様式で遺伝子発現を阻害する転写後過程である。RNAi過程は、少なくとも以下の2つの工程で起こる。第1の工程中に、内因性リボヌクレアーゼによって長いdsRNAがより短い21または23ヌクレオチド長のdsRNAに切断される。他方の第2の工程では、より小さなdsRNAが適合配列を有するmRNA分子の分解を媒介し、結果として、この遺伝子の発現が選択的に下方制御される。このRNAi効果を、細胞内の標的配列へのより長い二本鎖RNA(dsRNA)またはより短い小さな干渉RNA(siRNA)のいずれかの導入によって達成することができる。最近、標的遺伝子に相補的なdsRNAを生成するプラスミドの導入によってRNAiを達成することもできることが証明された。
RNAi法は、ショウジョウバエ(20、22、23、25)、線虫(14、15、16)、およびゼブラフィッシュ(20)の遺伝子融合決定実験で首尾よく使用されている。これらのモデル生物では、化学合成されたより短いsiRNAまたはインビトロで転写されたより長いdsRNAの両方が標的遺伝子配列を有効に阻害することができると報告されている。非ヒト哺乳動物およびヒトの細胞培養物でRNAi効果が首尾よく達成される方法が報告されている(39〜56)。しかし、RNAi効果は、成体動物モデルで見出すのが困難であった(57)。これはいくつかの理由:哺乳動物細胞への長い二本鎖RNAの導入によって抗ウイルス免疫応答(インターフェロンの上方制御を含む)を誘発し、所望の治療効果に対して有害または有利であり得る細胞のアポトーシスおよび死滅が起こり得ること:標的細胞(特に、動物)へのdsRNA侵入効果が低いこと;短いdsRNA分子が血液から尿に急速に排出されること;RNアーゼのヌクレアーゼ活性によってRNA分子を分解することができることを含む;のためである。RNAiが遺伝子標的の確認および核酸療法の両方に適用される可能性があるにも関わらず、動物疾患モデルへのRNAi分子の不十分な送達により、テクノロジーの進行の妨げとなっている。
したがって、インビボでのRNAi分子の送達方法の改良が非常に重要であることが明らかである。RNAiを誘導する核酸分子の組織標的化送達が非常に重要であることも明らかである。VEGF経路遺伝子に対して選択的なRNAiを誘導する核酸分子の送達方法がNV疾患の治療に非常に有利であることも明らかである。本発明の組成物および方法によってこれらのニーズに対処する。
(発明の要旨)
したがって、本発明の目的は、NV病理発生に関連する遺伝子発現、より詳細には、VEGF経路中の遺伝子発現の下方制御によって疾患の進行を逆転するために血管形成過程を調整するためにRNAiを利用することである。
したがって、本発明の目的は、NV病理発生に関連する遺伝子発現、より詳細には、VEGF経路中の遺伝子発現の下方制御によって疾患の進行を逆転するために血管形成過程を調整するためにRNAiを利用することである。
したがって、本発明の目的は、哺乳動物における1つまたは複数のVEGF経路遺伝子の発現を阻害するための組成物および方法を提供することである。本発明のさらなる目的は、1つまたは複数のVEGF経路遺伝子のみまたは他の薬剤(同一のVEGF経路のアンタゴニストを含む)との組み合わせの発現の阻害によってNV疾患を治療するための組成物および方法を提供することである。
これらの目的の達成のために、二本鎖RNA分子を含む組成物を哺乳動物の組織に投与する工程と、前記RNA分子が内因性VEGF経路遺伝子の発現を特異的に減少または阻害することとを含む、内因性VEGF経路遺伝子を下方制御するための組成物および方法を提供した。内因性遺伝子のこの下方制御を、VEGF経路の活性に起因するかこれによって悪化する疾患の治療に使用することができる。疾患は、ヒト疾患においてであり得る。
医薬品有効成分(API)として処方物に関連するdsRNAオリゴヌクレオチドを含む核酸組成物を適用する工程を含み、処方物がポリマーを含むことができ、核酸組成物がVEGF経路遺伝子発現を減少させて疾患におけるNVを阻害することができる、望ましくないVEGF経路遺伝子発現に関連する哺乳動物疾患を治療する方法も提供した。疾患は、癌または前癌状態の成長であり得、組織は、例えば、腎臓組織、乳房組織、結腸組織、前立腺組織、肺組織、または卵巣組織であり得る。
本明細書中で使用するとき、「オリゴヌクレオチド」およびこれに基づいた類似の用語は、天然に存在するヌクレオチドから構成される短いオリゴおよび合成または修飾されたヌクレオチドから構成されるオリゴに関する。オリゴヌクレオチドは、10またはそれを超えるヌクレオチド長、15、16、17、18、19、20、またはそれを超えるヌクレオチド長、21、22、23、24、またはそれを超えるヌクレオチド長、25、26、27、28、29、30、またはそれを超えるヌクレオチド長、35またはそれを超えるヌクレオチド長、40またはそれを超えるヌクレオチド長、45またはそれを超えるヌクレオチド長、約50までのヌクレオチド長であり得る。
siRNAであるオリゴヌクレオチドは、15ヌクレオチドと30ヌクレオチドとの間の任意の数のヌクレオチドを有し得る。多くの実施形態では、siRNAは、19ヌクレオチドと27ヌクレオチドとの間の任意の数のヌクレオチドを有し得る。
多くの実施形態では、siRNAは、2つの平滑末端、2つの付着末端、または1つの付着末端を含む1つの平滑末端を有し得る。付着末端のオーバーハングヌクレオチドは、1〜4つまたはそれを超えるヌクレオチドの範囲であり得る。
好ましい実施形態では、本発明は、平滑末端を有する25塩基対のsiRNAを提供する。
用語「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」を、本明細書中で同意語として使用する。
組成物は、高分子キャリアをさらに含み得る。高分子キャリアは、RNA分子に結合してナノ粒子を形成するカチオン性ポリマーを含み得る。カチオン性ポリマーは、例えば、ヒスチジン残基およびリジン残基を含むアミノ酸コポリマーであり得る。ポリマーは、分岐ポリマーを含み得る。組成物は、標的化合成ベクターを含み得る。合成ベクターは、核酸キャリアとしてカチオン性ポリマー、立体保護物質として親水性ポリマー、標的細胞選択薬として標的化(またはターゲティング(targeting))リガンドを含み得る。ポリマーは、ポリエチレンイミンもしくはポリヒスチジン−リジンコポリマー、または
核酸キャリアモジュールとして使用することができるポリリジン修飾された化学的ポリカチオン性キャリアもしくは他の有効なポリカチオン性キャリアを含み得る。親水性ポリマーは、ポリエチレングリコール、ポリアセタール、またはポリオキサゾリンを含み得る。標的化リガンドは、RGD配列、糖、もしくは糖アナログ、mAbもしくはmAbのフラグメント、または任意の他の有効な標的化部分を含むペプチドを含み得る。
核酸キャリアモジュールとして使用することができるポリリジン修飾された化学的ポリカチオン性キャリアもしくは他の有効なポリカチオン性キャリアを含み得る。親水性ポリマーは、ポリエチレングリコール、ポリアセタール、またはポリオキサゾリンを含み得る。標的化リガンドは、RGD配列、糖、もしくは糖アナログ、mAbもしくはmAbのフラグメント、または任意の他の有効な標的化部分を含むペプチドを含み得る。
これらの方法のいずれかでは、組織に組成物と実質的に同時に、または組成物の適用の後で電場を印可することができる。本発明の組成物および方法は、内因性VEGF経路遺伝子または変異内因性遺伝子と適合する配列を有するdsRNAオリゴヌクレオチドを含み、変異遺伝子中の少なくとも1つの変異が遺伝子のコード領域または調節領域中に存在し得る。これらの方法のいずれかでは、内因性遺伝子は、VEGF経路遺伝子(成長因子遺伝子、タンパク質セリン/トレオニンキナーゼ遺伝子、タンパク質チロシンキナーゼ遺伝子、タンパク質セリン/トレオニンホスファターゼ遺伝子、タンパク質チロシンホスファターゼ遺伝子、受容体遺伝子、および転写因子遺伝子を含む)からなる群から選択され得る。選択された遺伝子は、VEGF、VEGF−R1、VEGF−R2、VEGF−R3、VEGF121、VEGF165、VEGF189、VEGF206、RAF−a、RAF−c、AKT、Ras、NF−Kbからなる群から選択される1つまたは複数の遺伝子を含み得る。選択された遺伝子は、NVに関連する他の生化学経路由来の1つまたは複数の遺伝子(HIF、EGF、EGFr、bFGF、bFGFr、PDGF、およびPDGFrを含む)を含み得る。選択された遺伝子は、NVと組み合わせて操作される他の生化学経路由来の1つまたは複数の遺伝子(Her−2、c−Met、c−Myc、およびHGFを含む)を含み得る。
本発明はまた、複数の遺伝子(siRNAのカクテル(siRNA−OC)を含む)を阻害するためにRNAiを誘導する核酸薬(nucleic acid agent)のための組成物および方法を提供する。本発明の組成物および方法は、実質的に同時に複数の遺伝子を阻害することができるか、複数の遺伝子を連続的に阻害することができる。好ましい実施形態では、siRNA−OC薬は、3つのVEGF経路遺伝子(VEGF、VEGF受容体1、VEGF受容体2)を阻害する。別の好ましい実施形態では、siRNA−OCを、実質的に同時に投与する。本発明は、標的化された遺伝子mRNA中の配列とのsiRNA配列の広範な適合に由来する遺伝子阻害選択性を有する薬剤を提供する。VEGF経路中の異なる遺伝子を阻害する実質的に類似の物理化学的性質を有するsiRNA薬も提供する。siRNA配列と大きく異なるナノ粒子組成物も提供する。複数の内因性遺伝子のインヒビターで治療することができるヒト疾患、具体的にはNV関連疾患の治療方法も提供する。ある場合には実質的に同時に投与し、他の場合には連続的に投与する治療薬の組み合わせによるヒト疾患の治療方法も提供する。
本発明の1つの態様は、癌、関節炎、失明、感染症、および炎症性疾患のための組成物および方法を提供する。本発明の別の態様では、RNAi誘導する核酸薬を、同一の治療レジメンで他の治療薬(小分子およびモノクローナル抗体(mAb)などであるが、これらに限定されない)と組み合わせて使用する。
本発明の他の目的、特徴、および利点は、以下の詳細な説明から明らかとなるであろう。しかし、詳細な説明および特定の例は、本発明の好ましい実施形態を示しているが、本発明の精神および意図の範囲内での種々の変更および修飾がこの詳細な説明から当業者に明らかとなるので、例示のみを目的として記載していると理解すべきである。
(詳細な説明)
本発明は、典型的には、複数のタンパク質の特性、異常に過剰発現した病因因子、および病因タンパク質の複数の機能障害によって特徴づけられるNV疾患の治療のための組成物および方法を提供する。本発明は、RNA干渉(RNAi)を活性化するsiRNAオリゴヌクレオチドなどの核酸薬を提供し、この核酸薬は配列特異的様式の遺伝子発現の高選択的インヒビターである。本発明は、タンパク質活性の調整(タンパク質発現レベルおよびタンパク質の転写後修飾の減少を含む)によるNV阻害を提供する。
本発明は、典型的には、複数のタンパク質の特性、異常に過剰発現した病因因子、および病因タンパク質の複数の機能障害によって特徴づけられるNV疾患の治療のための組成物および方法を提供する。本発明は、RNA干渉(RNAi)を活性化するsiRNAオリゴヌクレオチドなどの核酸薬を提供し、この核酸薬は配列特異的様式の遺伝子発現の高選択的インヒビターである。本発明は、タンパク質活性の調整(タンパク質発現レベルおよびタンパク質の転写後修飾の減少を含む)によるNV阻害を提供する。
癌では、腫瘍形成過程は、他のタンパク質の過小発現も重要な役割を果たすが、癌遺伝子、血管形成因子、成長因子、および変異腫瘍抑制因子の異常な過剰発現の結果であると考えられている。siRNA分子がインビトロおよびインビボの両方で腫瘍形成遺伝子を「ノックダウンする」ことができ、有意な抗腫瘍効果が得られるという概念が多くの証拠によって支持される。本発明の組成物および方法は、ヒトVEGF経路遺伝子配列を特異的に標的化するsiRNAの腫瘍内送達を使用して、40〜80%の腫瘍成長阻害が達成される、MCF−7細胞、MDA−MB−435細胞、および1483細胞誘導性異種移植片腫瘍モデルにおけるヒトVEGFの実質的ノックダウンを証明する。VEGF経路遺伝子発現の阻害は、腫瘍の微小血管系を変化させ、腫瘍細胞のアポトーシスを活性化し、細胞傷害性化学療法薬の有効性を増強することができる抗血管形成効果を誘導することが認識される。しかし、抗血管形成薬および化学療法薬の抗腫瘍有効性を有意に改良するために、多くの場合に全身投与によって高濃度の薬物が局所的に腫瘍組織に蓄積するような有効性の高い送達方法が必要である。
本発明者らは、どの標的が疾患経路を調節するのかを決定し、それによって薬物開発の試みを有効にする薬物の標的を立証する方法を記載している(PCT/US02/31554を参照のこと)。本発明者らはまた、動物組織への核酸の送達に適切なテクノロジーを記載している。WO01/47496号(その内容全体が本明細書中で参考として援用される)を参照のこと。これらの方法は、核酸を投与し、「標準」ヌクレオチド送達試薬と比較して、有効性を有意に増加させる(例えば、7倍)ことができる。したがって、本方法は、組織中で強い核酸活性(候補標的タンパク質活性を含む)を提供する。このプラットフォームは、組織中の候補遺伝子を立証するための強力なツールである。
さらに、本発明者らは、動物組織で遺伝子サイレンシングを行うためにこれらの方法を使用した。遺伝子サイレンシングは、候補標的遺伝子の立証および治療方法として非常に望ましい。最近、二本鎖RNAが、RNA干渉(RNAi)と呼ばれる現象によって遺伝子特異的サイレンシングを誘導することが証明された。RNAiの機構は依然として完全に理解されていないが、初期の結果により、種々の細胞型(哺乳動物細胞を含む)においてインビトロでRNAi効果を達成することができることを示唆している。標的mRNAに対して標的化された二本鎖RNAにより、標的を分解し、それにより、対応する遺伝子のサイレンシングを引き起こす。巨大な二本鎖RNAは、酵素ダイサーを含むRNアーゼIII様活性によって21〜23ヌクレオチド長のより小さなフラグメントに切断される。siRNAとして公知のこれらのより短いフラグメント(小さな干渉RNA)がmRNAの切断を媒介すると考えられている。
最近、RNAi機構による遺伝子の下方制御が線虫および他の下等生物で研究されているにも関わらず、培養物中での哺乳動物におけるその有効性についてはごく最近になって証明された。ホタルルシフェラーゼ遺伝子レポーター系を使用してマウスにおいてRNAi効果が最近証明された。ヒト疾患を治療するための核酸治療薬の研究および臨床応用のためにインビボでの遺伝子阻害についてのRNAiテクノロジープラットフォームを開発するために、本発明者らは、マウス疾患モデルにおいていくつかのインビボ研究を行った。これらの実験では、腫瘍関連リガンド(ヒトVEGF)または受容体(マウスVEGFR2)を標的化するsiRNAまたはdsRNAのいずれかを、異種移植されたヒトMCF−7由来腫瘍またはヒトMDA−MB−435腫瘍を保有するヌードマウスに送達した。本発明者らは、初めて、RNAiが腫瘍細胞中の標的遺伝子をインビボで有効にサイレンシングし、結果として、腫瘍成長を阻害することができることを証明することができた。
本発明者らは、VEGF経路遺伝子を阻害するdsRNAオリゴヌクレオチドを使用した広範な種々のNV疾患の治療のための組成物および治療方法を初めて得た。発明を本明細書中に詳述するが、当業者は発明の全範囲を認識するだろう。
A.VEGF経路遺伝子阻害のための強力なsiRNA
本発明は、種々の物理化学的構造を有するVEGF経路遺伝子配列を標的化して阻害する核酸薬を提供する。本発明の1つの好ましい実施形態は、3’オーバーハングを有する19塩基対のdsRNAおよび平滑末端を有する25塩基対のdsRNAを含むsiRNAと呼ばれる核酸薬を使用する。平滑末端を有する25塩基対のdsRNAを含む本発明のsiRNAは、最も強力なインヒビターのうちのいくつかであり、最も長い阻害持続時間を有することが多い。したがって、天然に存在しない化学的アナログ(RNA、DNA、およびRNAキメラオリゴヌクレオチドの2’−O−メチルリボースアナログ、ならびに核酸オリゴヌクレオチドの他の化学的アナログを含む)の組み込みが本発明で有用である。siRNAのセンス鎖中に2’−O−メチルリボースを含むか含まず、且つヒトVEGF配列を標的化する25塩基対のsiRNAは、MCF−7/VEGF165細胞および動物における腫瘍成長において70〜80%までの強力且つ持続可能な効果を示す。MCF−7/VEGF165細胞培養物におけるこの阻害効果は、5日間持続した。本発明によって提供された1つの態様は、ヒト遺伝子を標的化するsiRNAであり、コードされた配列も他の哺乳動物種(他の霊長類、マウス、およびラットなどであるが、これらの種に限定されない)を標的化する。当業者に周知の方法を使用して、本発明によって提供されるsiRNAを同定および選択することができる。VEGF経路遺伝子を標的化する多くの他のsiRNA型が本発明によって提供され、他のsiRNA型が当業者に理解される。
a.ヒトVEGF特異的siRNA:
25塩基対の平滑末端:
本発明は、種々の物理化学的構造を有するVEGF経路遺伝子配列を標的化して阻害する核酸薬を提供する。本発明の1つの好ましい実施形態は、3’オーバーハングを有する19塩基対のdsRNAおよび平滑末端を有する25塩基対のdsRNAを含むsiRNAと呼ばれる核酸薬を使用する。平滑末端を有する25塩基対のdsRNAを含む本発明のsiRNAは、最も強力なインヒビターのうちのいくつかであり、最も長い阻害持続時間を有することが多い。したがって、天然に存在しない化学的アナログ(RNA、DNA、およびRNAキメラオリゴヌクレオチドの2’−O−メチルリボースアナログ、ならびに核酸オリゴヌクレオチドの他の化学的アナログを含む)の組み込みが本発明で有用である。siRNAのセンス鎖中に2’−O−メチルリボースを含むか含まず、且つヒトVEGF配列を標的化する25塩基対のsiRNAは、MCF−7/VEGF165細胞および動物における腫瘍成長において70〜80%までの強力且つ持続可能な効果を示す。MCF−7/VEGF165細胞培養物におけるこの阻害効果は、5日間持続した。本発明によって提供された1つの態様は、ヒト遺伝子を標的化するsiRNAであり、コードされた配列も他の哺乳動物種(他の霊長類、マウス、およびラットなどであるが、これらの種に限定されない)を標的化する。当業者に周知の方法を使用して、本発明によって提供されるsiRNAを同定および選択することができる。VEGF経路遺伝子を標的化する多くの他のsiRNA型が本発明によって提供され、他のsiRNA型が当業者に理解される。
a.ヒトVEGF特異的siRNA:
25塩基対の平滑末端:
センス鎖:5’−r(CCUGAUGAGAUCGAGUACAUCUUCA)−3’ (配列番号1)
アンチセンス鎖:5’−r(UGAAGAUGUACUCGAUCUCAUCAGG)−3’ (配列番号2)
hVEGF−25−siRNA−b:
センス鎖:5’−r(GAGAGAUGAGCUUCCUACAGCACAA)−3’ (配列番号3)
アンチセンス鎖:5’−r(UGAAGAUGUACUCGAUCUCAUCAGG)−3’ (配列番号2)
hVEGF−25−siRNA−b:
センス鎖:5’−r(GAGAGAUGAGCUUCCUACAGCACAA)−3’ (配列番号3)
アンチセンス鎖:5’−r(UUGUGCUGUAGGAAGCUCAUCUCUC)−3’ (配列番号4)
hVEGF−25−siRNA−c:
センス鎖:5’−r(CACAACAAAUGUGAAUGCAGACCAA)−3’ (配列番号5)
アンチセンス鎖:5’−r(UUGGUCUGCAUUCACAUUUGUUGUG)−3’ (配列番号6)
3’に2つのヌクレオチド(TT)オーバーハングを有する19塩基対:
hVEGF−25−siRNA−c:
センス鎖:5’−r(CACAACAAAUGUGAAUGCAGACCAA)−3’ (配列番号5)
アンチセンス鎖:5’−r(UUGGUCUGCAUUCACAUUUGUUGUG)−3’ (配列番号6)
3’に2つのヌクレオチド(TT)オーバーハングを有する19塩基対:
hVEGF165 5’−r(UCGAGACCCUGGUGGACAUTT)−3’ (配列番号7)
b.ヒトVEGF受容体1特異的siRNA:
25塩基対の平滑末端:
b.ヒトVEGF受容体1特異的siRNA:
25塩基対の平滑末端:
センス鎖:5’−r(GCCAACAUAUUCUACAGUGUUCUUA)−3’ (配列番号8)
アンチセンス鎖:5’−r(UAAGAACACUGUAGAAUAUGUUGGC) −3’ (配列番号9)
hVEGFR1−25−siRNA−b,
センス鎖:5’−r(CCCUCGCCGGAAGUUGUAUGGUUAA)−3’ (配列番号10)
アンチセンス鎖:5’−r(UUAACCAUACAACUUCCGGCGAGGG)−3’ (配列番号11)
3’に2つのヌクレオチド(TT)オーバーハングを有する19塩基対:
アンチセンス鎖:5’−r(UAAGAACACUGUAGAAUAUGUUGGC) −3’ (配列番号9)
hVEGFR1−25−siRNA−b,
センス鎖:5’−r(CCCUCGCCGGAAGUUGUAUGGUUAA)−3’ (配列番号10)
アンチセンス鎖:5’−r(UUAACCAUACAACUUCCGGCGAGGG)−3’ (配列番号11)
3’に2つのヌクレオチド(TT)オーバーハングを有する19塩基対:
VEGF Rl (FLT) 5’−GGAGAGGACCUGAAACUGUTT (配列番号12)
c.ヒトVEGF受容体2特異的siRNA:
25塩基対の平滑末端:
c.ヒトVEGF受容体2特異的siRNA:
25塩基対の平滑末端:
hVEGFR2−25−siRNA−a,
センス鎖:5’−r(CCUCUUCUGUAAGACACUCACAAUU)−3’ (配列番号13)
アンチセンス鎖:5’−r(AAUUGUGAGUGUCUUACAGAAGAGG)−3’ (配列番号14)
hVEGFR2−25−siRNA−b,
センス鎖:5’−r(CCCUUGAGUCCAAUCACACAAUUAA)−3’ (配列番号15)
アンチセンス鎖:5’−r(UUAAUUGUGUGAUUGGACUCAAGGG)−3’ (配列番号16)
hVEGFR2−25−siRNA−c,
センス鎖:5’−r(CCAAGUGAUUGAAGCAGAUGCCUUU)−3’ (配列番号17)
アンチセンス鎖:5’−r(AAAGGCAUCUGCUUCAAUCACUUGG)−3’ (配列番号18)
3’に2つのヌクレオチド(TT)オーバーハングを有する19塩基対:
センス鎖:5’−r(CCUCUUCUGUAAGACACUCACAAUU)−3’ (配列番号13)
アンチセンス鎖:5’−r(AAUUGUGAGUGUCUUACAGAAGAGG)−3’ (配列番号14)
hVEGFR2−25−siRNA−b,
センス鎖:5’−r(CCCUUGAGUCCAAUCACACAAUUAA)−3’ (配列番号15)
アンチセンス鎖:5’−r(UUAAUUGUGUGAUUGGACUCAAGGG)−3’ (配列番号16)
hVEGFR2−25−siRNA−c,
センス鎖:5’−r(CCAAGUGAUUGAAGCAGAUGCCUUU)−3’ (配列番号17)
アンチセンス鎖:5’−r(AAAGGCAUCUGCUUCAAUCACUUGG)−3’ (配列番号18)
3’に2つのヌクレオチド(TT)オーバーハングを有する19塩基対:
hVEGF R2 (KDR) 5’−CAGUAAGCGAAAGAGCCGGTT−3’ (配列番号19)
別の実施形態では、ヒトVEGFレセプター1を標的化するsiRNAは、以下の配列を有する。
センス鎖:5’-r(CCUCAAGAGCAAACGUGACUUAUUU)−3’(配列番号20)
アンチセンス鎖:5’-r(AAAUAAGUCACGUUUGCUCUUGAGG)−3’(配列番号21)
25塩基対のsiRNAオリゴは、ヒトおよびマウスの両方由来の対応する遺伝子を標的化することができる
別の実施形態では、25塩基対のsiRNA配列を、対応するmRNA配列に対して選択した(ヒトVEGF、VEGFR1、VEGFR2、PDGFR−α、PDGFR−β、およびEGFR遺伝子を含む)。選択された配列は、ヒト遺伝子に特異的なだけでなく、対応するマウス遺伝子にも特異的である(ヒトVEGFmRNAに対する配列は、マウスVEGFmRNAに対する配列でもあることなど)。
別の実施形態では、ヒトVEGFレセプター1を標的化するsiRNAは、以下の配列を有する。
センス鎖:5’-r(CCUCAAGAGCAAACGUGACUUAUUU)−3’(配列番号20)
アンチセンス鎖:5’-r(AAAUAAGUCACGUUUGCUCUUGAGG)−3’(配列番号21)
25塩基対のsiRNAオリゴは、ヒトおよびマウスの両方由来の対応する遺伝子を標的化することができる
別の実施形態では、25塩基対のsiRNA配列を、対応するmRNA配列に対して選択した(ヒトVEGF、VEGFR1、VEGFR2、PDGFR−α、PDGFR−β、およびEGFR遺伝子を含む)。選択された配列は、ヒト遺伝子に特異的なだけでなく、対応するマウス遺伝子にも特異的である(ヒトVEGFmRNAに対する配列は、マウスVEGFmRNAに対する配列でもあることなど)。
抗腫瘍有効性が腫瘍組織中のヒト遺伝子およびマウス遺伝子のノックダウンに依存するので、25塩基対のsiRNAオリゴは、マウス異種移植片腫瘍研究に非常に有用である。例えば、腫瘍細胞(ヒト起源)および内皮細胞(マウス起源)の両方由来のVEGF発現の、両配列を標的化するsiRNAオリゴでのノックダウンにより、より良好な抗腫瘍有効性が得られる。
一方で、実際の薬物を毒物学および過剰投与(exaggerated pharmacology)の両方について試験するので、試験動物(例えば、マウスまたはサル)およびヒトの遺伝子由来の両遺伝子を標的化するsiRNAオリゴを使用した毒性研究は非常に有用である。
以下の配列は、ヒト遺伝子およびマウス遺伝子の両方由来のVEGF、VEGFR2、VEGFR1、PDGFR−α、PDGFR−β、およびEGFRのmRNAを標的化する25塩基対のsiRNAオリゴ配列であり、これらのうちのいくつかはそのサルおよびイヌ対応物を標的化することもできる。
ヒト、マウス、ラット、マカクザル、イヌのVEGFmRNA配列を標的化する25塩基対のVEGFsiRNA
mhVEGF25−l:センス 5’−CAAGAUCCGCAGACGUGUAAAUGUU−3’ (配列番号22);
アンチセンス 5’−AAC AUUUACACGUCUGCGGAUCUUG−3’ (配列番号23)
mhVEGF25−2:センス 5’−GCAGCUUGAGUUAAACGAACGUACU−3’ (配列番号24);
アンチセンス 5’−AGUACGUUCGUUUAACUCAAGCUGC−3’ (配列番号25)
mhVEGF25−3:センス 5’−CAGCUUGAGUUAAACGAACGUACUU−3’; (配列番号26)
アンチセンス 5’−AAGUACGUUCGUUUAACUCAAGCUG−3’ (配列番号27)
アンチセンス 5’−AAC AUUUACACGUCUGCGGAUCUUG−3’ (配列番号23)
mhVEGF25−2:センス 5’−GCAGCUUGAGUUAAACGAACGUACU−3’ (配列番号24);
アンチセンス 5’−AGUACGUUCGUUUAACUCAAGCUGC−3’ (配列番号25)
mhVEGF25−3:センス 5’−CAGCUUGAGUUAAACGAACGUACUU−3’; (配列番号26)
アンチセンス 5’−AAGUACGUUCGUUUAACUCAAGCUG−3’ (配列番号27)
mhVEGF25−4:センス 5’−CCAUGCCAAGUGGUCCCAGGCUGCA−3’; (配列番号28)
アンチセンス 5’−TGCAGCCTGGGACCACTTGGCATGG−3’ (配列番号29)
mhVEGF25−4:センス 5’−CACAUAGGAGAGAUGAGCUUCCUCA−3’; (配列番号30)
アンチセンス 5’−UGAGGAAGCUCAUCUCUCCUAUGUG−3’ (配列番号31)
ヒトおよびマウスのVEGFR2mRNA配列の両方を標的化する25塩基対のVEGFR2siRNA配列
アンチセンス 5’−TGCAGCCTGGGACCACTTGGCATGG−3’ (配列番号29)
mhVEGF25−4:センス 5’−CACAUAGGAGAGAUGAGCUUCCUCA−3’; (配列番号30)
アンチセンス 5’−UGAGGAAGCUCAUCUCUCCUAUGUG−3’ (配列番号31)
ヒトおよびマウスのVEGFR2mRNA配列の両方を標的化する25塩基対のVEGFR2siRNA配列
mhVEGFR225−l:センス 5’−CCUACGGACCGUUAAGCGGGCCAAU−3’; (配列番号32)
アンチセンス: 5’−AUUGGCCCGCUUAACGGUCCGUAGG−3’ (配列番号33)
mhVEGFR225−2:センス 5’−CUCAUGUCUGUUCUCAAGAUCCUCA−3’; (配列番号34)
アンチセンス: 5’−UGAGGAUCUUGAGAACAGACAUGAG−3’ (配列番号35)
mhVEGFR225−3:センス 5’−CUCAUGGUGAUUGUGGAAUUCUGCA−3’; (配列番号36)
アンチセンス: 5 ‘ −UGCAGAAUUCCACAAUCACCAUGAG−3’ (配列番号37)
mhVEGFR225−4:センス 5’−GAGCAUGGAAGAGGAUUCUGGACUC−3’; (配列番号38)
アンチセンス: 5’−GAGUCCAGAAUCCTCUUCCAUGCTC−3’ (配列番号39)
mhVEGFR225−5:センス 5’−CAGAACAGUAAGCGAAAGAGCCGGC−3’; (配列番号40)
アンチセンス: 5’−GCCGGCUCUUUCGCUUACUGUUCUG−3’ (配列番号41)
mhVEGFR225−6:センス 5’−GACUUCCUGACCUUGGAGCAUCUCA−3’; (配列番号42)
アンチセンス: 5’−UGAGAUGCUCCAAGGUCAGGAAGUC−3’ (配列番号43)
mhVEGFR225−7:センス 5’−CCUGACCUUGGAGCAUCUCAUCUGU−3’; (配列番号44)
アンチセンス: 5’−ACAGAUGAGAUGCUCCAAGGUCAGG−3’ (配列番号45)
mhVEGFR225−8:センス 5’−GCUAAGGGCAUGGAGUUCUUGGCAU−3’; (配列番号46)
アンチセンス: 5’−AUGCCAAGAACUCCAUGCCCUUAGC−3’ (配列番号47)
ヒトおよびマウスのVEGFR1mRNA配列の両方を標的化する25塩基対のVEGFR1siRNA配列
アンチセンス: 5’−AUUGGCCCGCUUAACGGUCCGUAGG−3’ (配列番号33)
mhVEGFR225−2:センス 5’−CUCAUGUCUGUUCUCAAGAUCCUCA−3’; (配列番号34)
アンチセンス: 5’−UGAGGAUCUUGAGAACAGACAUGAG−3’ (配列番号35)
mhVEGFR225−3:センス 5’−CUCAUGGUGAUUGUGGAAUUCUGCA−3’; (配列番号36)
アンチセンス: 5 ‘ −UGCAGAAUUCCACAAUCACCAUGAG−3’ (配列番号37)
mhVEGFR225−4:センス 5’−GAGCAUGGAAGAGGAUUCUGGACUC−3’; (配列番号38)
アンチセンス: 5’−GAGUCCAGAAUCCTCUUCCAUGCTC−3’ (配列番号39)
mhVEGFR225−5:センス 5’−CAGAACAGUAAGCGAAAGAGCCGGC−3’; (配列番号40)
アンチセンス: 5’−GCCGGCUCUUUCGCUUACUGUUCUG−3’ (配列番号41)
mhVEGFR225−6:センス 5’−GACUUCCUGACCUUGGAGCAUCUCA−3’; (配列番号42)
アンチセンス: 5’−UGAGAUGCUCCAAGGUCAGGAAGUC−3’ (配列番号43)
mhVEGFR225−7:センス 5’−CCUGACCUUGGAGCAUCUCAUCUGU−3’; (配列番号44)
アンチセンス: 5’−ACAGAUGAGAUGCUCCAAGGUCAGG−3’ (配列番号45)
mhVEGFR225−8:センス 5’−GCUAAGGGCAUGGAGUUCUUGGCAU−3’; (配列番号46)
アンチセンス: 5’−AUGCCAAGAACUCCAUGCCCUUAGC−3’ (配列番号47)
ヒトおよびマウスのVEGFR1mRNA配列の両方を標的化する25塩基対のVEGFR1siRNA配列
mhVEGFR125−l:センス 5’−CACGCUGUUUAUUGAAAGAGUCACA−3’; (配列番号48)
アンチセンス: 5’−UGUGACUCUUUCAAUAAACAGCGUG−3’ (配列番号49)
mhVEGFR125−2:センス 5’−CGCUGUUUAUUGAAAGAGUCACAGA−3’; (配列番号50)
アンチセンス: 5’−UCUGUGACUCUUUCAAUAAACAGCG−3’ (配列番号51)
mhVEGFR125−3:センス 5’−CAAGGAGGGCCUCUGAUGGUGAUGU−3’; (配列番号52)
アンチセンス: 5’−ACAUCACCAUCAGAGGCCCUCCUUG−3’ (配列番号53)
mhVEGFR125−4:センス 5’−CCAACUACCUCAAGAGCAAACGUGA−3’; (配列番号54)
アンチセンス: 5’−UCACGUUUGCUCUUGAGGUAGUUGG−3’ (配列番号55)
アンチセンス: 5’−UGUGACUCUUUCAAUAAACAGCGUG−3’ (配列番号49)
mhVEGFR125−2:センス 5’−CGCUGUUUAUUGAAAGAGUCACAGA−3’; (配列番号50)
アンチセンス: 5’−UCUGUGACUCUUUCAAUAAACAGCG−3’ (配列番号51)
mhVEGFR125−3:センス 5’−CAAGGAGGGCCUCUGAUGGUGAUGU−3’; (配列番号52)
アンチセンス: 5’−ACAUCACCAUCAGAGGCCCUCCUUG−3’ (配列番号53)
mhVEGFR125−4:センス 5’−CCAACUACCUCAAGAGCAAACGUGA−3’; (配列番号54)
アンチセンス: 5’−UCACGUUUGCUCUUGAGGUAGUUGG−3’ (配列番号55)
mhVEGFR125−5:センス 5’−CUACCUCAAGAGCAAACGUGACUUA−3’; (配列番号56)
アンチセンス: 5’−UAAGUCACGUUUGCUCUUGAGGUAG−3’ (配列番号57)
mhVEGFR125−6:センス 5’−CCAGAAAGUGCAUUCAUCGGGACCU−3’; (配列番号58)
アンチセンス: 5’−AGGUCCCGAUGAAUGCACUUUCUGG−3’ (配列番号59)
mhVEGFR125−7:センス 5’−CAUUCAUCGGGACCUGGCAGCGAGA−3’; (配列番号60)
アンチセンス: 5’−UCUCGCUGCCAGGUCCCGAUGAAUG−3’ (配列番号61)
mhVEGFR125−8:センス 5’−CAUCGGGACCUGGCAGCGAGAAACA−3’; (配列番号62)
アンチセンス: 5’−UGUUUCUCGCUGCCAGGUCCCGAUG−3’ (配列番号63)
mhVEGFR125−9:センス 5’−GAGCCUGGAAAGAAUCAAAACCUUU−3’; (配列番号64)
アンチセンス: 5’−AAAGGUUUUGAUUCUUUCCAGGCUC−3’ (配列番号65)
mhVEGFR125−10:センス 5’−GCCUGGAAAGAAUCAAAACCUUUGA−3’; (配列番号66)
アンチセンス: 5’−UCAAAGGUUUUGAUUCUUUCCAGGC−3’ (配列番号67)
mhVEGFR125−11:センス 5’−GCCUGGAAAGAAUCAAAACCUUUGA−3’; (配列番号68)
アンチセンス: 5’−UCAAAGGUUUUGAUUCUUUCCAGGC−3’ (配列番号69)
mhVEGFR125−12:センス 5’−CUGAACUGAGUUUAAAAGGCACCCA−3’; (配列番号70)
アンチセンス: 5’−UGGGUGCCUUUUAAACUGAGUUCAG−3’ (配列番号71)
mhVEGFR125−13:センス 5’−GAACUGAGUUUAAAAGGCACCCAGC−3’; (配列番号72)
アンチセンス: 5’−GCUGGGUGCCUUUUAAACUCAGUUG−3’ (配列番号73)
ヒトおよびマウスのPDGFR−αの両方を標的化する25塩基対のsiRNA配列
アンチセンス: 5’−UAAGUCACGUUUGCUCUUGAGGUAG−3’ (配列番号57)
mhVEGFR125−6:センス 5’−CCAGAAAGUGCAUUCAUCGGGACCU−3’; (配列番号58)
アンチセンス: 5’−AGGUCCCGAUGAAUGCACUUUCUGG−3’ (配列番号59)
mhVEGFR125−7:センス 5’−CAUUCAUCGGGACCUGGCAGCGAGA−3’; (配列番号60)
アンチセンス: 5’−UCUCGCUGCCAGGUCCCGAUGAAUG−3’ (配列番号61)
mhVEGFR125−8:センス 5’−CAUCGGGACCUGGCAGCGAGAAACA−3’; (配列番号62)
アンチセンス: 5’−UGUUUCUCGCUGCCAGGUCCCGAUG−3’ (配列番号63)
mhVEGFR125−9:センス 5’−GAGCCUGGAAAGAAUCAAAACCUUU−3’; (配列番号64)
アンチセンス: 5’−AAAGGUUUUGAUUCUUUCCAGGCUC−3’ (配列番号65)
mhVEGFR125−10:センス 5’−GCCUGGAAAGAAUCAAAACCUUUGA−3’; (配列番号66)
アンチセンス: 5’−UCAAAGGUUUUGAUUCUUUCCAGGC−3’ (配列番号67)
mhVEGFR125−11:センス 5’−GCCUGGAAAGAAUCAAAACCUUUGA−3’; (配列番号68)
アンチセンス: 5’−UCAAAGGUUUUGAUUCUUUCCAGGC−3’ (配列番号69)
mhVEGFR125−12:センス 5’−CUGAACUGAGUUUAAAAGGCACCCA−3’; (配列番号70)
アンチセンス: 5’−UGGGUGCCUUUUAAACUGAGUUCAG−3’ (配列番号71)
mhVEGFR125−13:センス 5’−GAACUGAGUUUAAAAGGCACCCAGC−3’; (配列番号72)
アンチセンス: 5’−GCUGGGUGCCUUUUAAACUCAGUUG−3’ (配列番号73)
ヒトおよびマウスのPDGFR−αの両方を標的化する25塩基対のsiRNA配列
mhPDGFRa25−l:センス 5’−GAAGAUAAUGACUCACCUGGGGCCA−3’; (配列番号74)
アンチセンス: 5’−UGGCCCCAGGUGAGUCAUUAUCUUC−3’ (配列番号75)
mhPDGFRa25−2:センス 5’−GAUAAUGACUCACCUGGGGCCACAU−3’; (配列番号76)
アンチセンス: 5’−AUGUGGCCCCAGGUGAGUCAUUAUC−3’ (配列番号77)
mhPDGFRa25−3:センス 5’−CUCACCUGGGGCCACAUUUGAACAU−3’; (配列番号78)
アンチセンス: 5’−AUGUUCAAAUGUGGCCCCAGGUGAG−3’ (配列番号79)
mhPDGFRa25−4:センス 5’−CUUGCUGGGAGCCUGCACCAAGUCA−3’; (配列番号80)
アンチセンス: 5’−UGACUUGGUGCAGGCUCCCAGCAAG−3’ (配列番号81)
mhPDGFRa25−5:センス 5’−GAUUCUACUUUCUACAAUAAGAUCA−3’; (配列番号82)
アンチセンス: 5’−UGAUCUUAUUGUAGAAAGUAGAAUC−3’ (配列番号83)
mhPDGFRa25−6:センス 5’−CAGAGACUGAGCGCUGACAGUGGCU−3’; (配列番号84)
アンチセンス: 5’−AGCCACUGUCUGCGCUCAGUCUCUG−3’ (配列番号85)
mhPDGFRa25−7:センス 5’−GACCUGGGCAAGAGGAACAGACACA−3’; (配列番号86)
アンチセンス: 5’−UGUGUCUGUUCCUCUUGCCCAGGUC−3’ (配列番号87)
アンチセンス: 5’−UGGCCCCAGGUGAGUCAUUAUCUUC−3’ (配列番号75)
mhPDGFRa25−2:センス 5’−GAUAAUGACUCACCUGGGGCCACAU−3’; (配列番号76)
アンチセンス: 5’−AUGUGGCCCCAGGUGAGUCAUUAUC−3’ (配列番号77)
mhPDGFRa25−3:センス 5’−CUCACCUGGGGCCACAUUUGAACAU−3’; (配列番号78)
アンチセンス: 5’−AUGUUCAAAUGUGGCCCCAGGUGAG−3’ (配列番号79)
mhPDGFRa25−4:センス 5’−CUUGCUGGGAGCCUGCACCAAGUCA−3’; (配列番号80)
アンチセンス: 5’−UGACUUGGUGCAGGCUCCCAGCAAG−3’ (配列番号81)
mhPDGFRa25−5:センス 5’−GAUUCUACUUUCUACAAUAAGAUCA−3’; (配列番号82)
アンチセンス: 5’−UGAUCUUAUUGUAGAAAGUAGAAUC−3’ (配列番号83)
mhPDGFRa25−6:センス 5’−CAGAGACUGAGCGCUGACAGUGGCU−3’; (配列番号84)
アンチセンス: 5’−AGCCACUGUCUGCGCUCAGUCUCUG−3’ (配列番号85)
mhPDGFRa25−7:センス 5’−GACCUGGGCAAGAGGAACAGACACA−3’; (配列番号86)
アンチセンス: 5’−UGUGUCUGUUCCUCUUGCCCAGGUC−3’ (配列番号87)
mhPDGFRa25−8:センス 5’−CCACCUUCAUCAAGAGAGAGGACGA−3’; (配列番号88)
アンチセンス: 5’−UCGUCCUCUCUCUUGAUGAAGGUGG−3’ (配列番号89)
mhPDGFRa25−9:センス 5’−UAUGGAUUAAGCCGGUCCCAACCUGU−3’; (配列番号90)
アンチセンス: 5’−ACAGGUUGGGACCGGCUUAAUCCAUA−3’ (配列番号91)
ヒトおよびマウスのPDGFR−βの両方を標的化する25塩基対のsiRNA配列
アンチセンス: 5’−UCGUCCUCUCUCUUGAUGAAGGUGG−3’ (配列番号89)
mhPDGFRa25−9:センス 5’−UAUGGAUUAAGCCGGUCCCAACCUGU−3’; (配列番号90)
アンチセンス: 5’−ACAGGUUGGGACCGGCUUAAUCCAUA−3’ (配列番号91)
ヒトおよびマウスのPDGFR−βの両方を標的化する25塩基対のsiRNA配列
mhPDGFRB25−l:センス 5’−CUGCAGAGACCUCAAAAGGUGUCCA−3’; (配列番号92)
アンチセンス: 5’−UGGACACCUUUUGAGGUCUCUGCAG−3’ (配列番号93)
mhPDGFRB25−2:センス 5’−CAGAGACCUCAAAAGGUGUCCACGU−3’; (配列番号94)
アンチセンス: 5’−ACGUGGACACCUUUUGAGGUCUCUG−3’ (配列番号95)
mhPDGFRB25−3:センス 5’−GUGGUGGUGAUCUCAGCCAUCCUGG−3’; (配列番号96)
アンチセンス: 5’−CCAGGAUGGCUGAGAUCACCACCAC−3’ (配列番号97)
mhPDGFRB25−4:センス 5’−GGUGGUGAUCUCAGCCAUCCUGGCC−3’; (配列番号98)
アンチセンス: 5’−GGCCAGGAUGGCUGAGAUCACCACC−3’ (配列番号99)
mhPDGFRB25−5:センス 5’−GGCAAGCUGGUCAAGAUCUGUGACU−3’; (配列番号100)
アンチセンス: 5’−AGUCACAGAUCUUGACCAGCUUGCC−3’ (配列番号101)
mhPDGFRB25−6:センス 5’−GCAAGCUGGUCAAGAUCUGUGACUU−3’; (配列番号102)
アンチセンス: 5’−AAGUCACAGAUCUUGACCAGCUUGC−3’ (配列番号103)
mhPDGFRB25−7:センス 5’−GGGUGGCACCCCUUACCCAGAGCUG−3’; (配列番号104)
アンチセンス: 5’−CAGCUCUGGGUAAGGGGUGCCACCC−3’ (配列番号105)
mhPDGFRB25−8:センス 5’−GCACCCCUUACCCAGAGCUGCCCAU−3’; (配列番号106)
アンチセンス: 5’−AUGGGCAGCUCUGGGUAAGGGGUGC−3’ (配列番号107)
mhPDGFRB25−9:センス 5’−CUUACCCAGAGCUGCCCAUGAACGA−3’; (配列番号108)
アンチセンス: 5’−UCGUUCAUGGGCAGCUCUGGGUAAG−3’ (配列番号109)
mhPDGFRB25−10:センス 5’−CAUGCCUCCGACGAGAUCUAUGAGA−3’; (配列番号110)
アンチセンス: 5’−UCUCAUAGAUCUCGUCGGAGGCAUG−3’ (配列番号111)
mhPDGFRB25−11: センス 5’−GCCUCCGACGAGAUCUAUGAGAUCA−3’; (配列番号112)
アンチセンス: 5’−UGAUCUCAUAGAUCUCGUCGGAGGC−3’ (配列番号113)
mhPDGFRB25−12:センス 5’−CCGACGAGAUCUAUGAGAUCAUGCA−3’; (配列番号114)
アンチセンス: 5’−UGCAUGAUCUCAUAGAUCUCGUCGG−3’ (配列番号115)
mhPDGFRB25−13:センス 5’−GACGAGAUCUAUGAGAUCAUGCAGA−3’; (配列番号116)
アンチセンス: 5’−UCUGCAUGAUCUCAUAGAUCUCGUC−3’ (配列番号117)
ヒトおよびマウスのEGFRの両方を標的化する25塩基対のsiRNA配列
アンチセンス: 5’−UGGACACCUUUUGAGGUCUCUGCAG−3’ (配列番号93)
mhPDGFRB25−2:センス 5’−CAGAGACCUCAAAAGGUGUCCACGU−3’; (配列番号94)
アンチセンス: 5’−ACGUGGACACCUUUUGAGGUCUCUG−3’ (配列番号95)
mhPDGFRB25−3:センス 5’−GUGGUGGUGAUCUCAGCCAUCCUGG−3’; (配列番号96)
アンチセンス: 5’−CCAGGAUGGCUGAGAUCACCACCAC−3’ (配列番号97)
mhPDGFRB25−4:センス 5’−GGUGGUGAUCUCAGCCAUCCUGGCC−3’; (配列番号98)
アンチセンス: 5’−GGCCAGGAUGGCUGAGAUCACCACC−3’ (配列番号99)
mhPDGFRB25−5:センス 5’−GGCAAGCUGGUCAAGAUCUGUGACU−3’; (配列番号100)
アンチセンス: 5’−AGUCACAGAUCUUGACCAGCUUGCC−3’ (配列番号101)
mhPDGFRB25−6:センス 5’−GCAAGCUGGUCAAGAUCUGUGACUU−3’; (配列番号102)
アンチセンス: 5’−AAGUCACAGAUCUUGACCAGCUUGC−3’ (配列番号103)
mhPDGFRB25−7:センス 5’−GGGUGGCACCCCUUACCCAGAGCUG−3’; (配列番号104)
アンチセンス: 5’−CAGCUCUGGGUAAGGGGUGCCACCC−3’ (配列番号105)
mhPDGFRB25−8:センス 5’−GCACCCCUUACCCAGAGCUGCCCAU−3’; (配列番号106)
アンチセンス: 5’−AUGGGCAGCUCUGGGUAAGGGGUGC−3’ (配列番号107)
mhPDGFRB25−9:センス 5’−CUUACCCAGAGCUGCCCAUGAACGA−3’; (配列番号108)
アンチセンス: 5’−UCGUUCAUGGGCAGCUCUGGGUAAG−3’ (配列番号109)
mhPDGFRB25−10:センス 5’−CAUGCCUCCGACGAGAUCUAUGAGA−3’; (配列番号110)
アンチセンス: 5’−UCUCAUAGAUCUCGUCGGAGGCAUG−3’ (配列番号111)
mhPDGFRB25−11: センス 5’−GCCUCCGACGAGAUCUAUGAGAUCA−3’; (配列番号112)
アンチセンス: 5’−UGAUCUCAUAGAUCUCGUCGGAGGC−3’ (配列番号113)
mhPDGFRB25−12:センス 5’−CCGACGAGAUCUAUGAGAUCAUGCA−3’; (配列番号114)
アンチセンス: 5’−UGCAUGAUCUCAUAGAUCUCGUCGG−3’ (配列番号115)
mhPDGFRB25−13:センス 5’−GACGAGAUCUAUGAGAUCAUGCAGA−3’; (配列番号116)
アンチセンス: 5’−UCUGCAUGAUCUCAUAGAUCUCGUC−3’ (配列番号117)
ヒトおよびマウスのEGFRの両方を標的化する25塩基対のsiRNA配列
mhEGFR−1:センス 5’−CUCUGGAUCCCAGAAGGUGAGAAAG−3’; (配列番号118)
アンチセンス: 5’−CUUUCUCACCUUCUGGGAUCCAGAG−3’ (配列番号119)
mhEGFR−2:センス 5’−CAGCAUGUCAAGAUCACAGAUUUUG−3’; (配列番号120)
アンチセンス: 5’−CAAAAUCUGUGAUCUUGACAUGCUG−3’ (配列番号121)
mhEGFR−3:センス 5’−GAUCACAGAUUUUGGGCUGGCCAAA−3’; (配列番号122)
アンチセンス: 5’−UUUGGCCAGCCCAAAAUCUGUGAUC−3’ (配列番号123)
mhEGFR−4:センス 5’−CAGAUUUUGGGCUGGCCAAACUGCU−3’ (配列番号124)
アンチセンス: 5’−AGCAGUUUGGCCAGCCCAAAAUCUG−3’ (配列番号125)
mhEGFR−5:センス 5’−C AAAGUGCCUAUCAAGUGGAUGGCA−3’ (配列番号126)
アンチセンス: 5’−UGCCAUCCACUUGAUAGGCACUUUG−3’ (配列番号127)
mhEGFR−6:センス 5’−CCAUCGAUGUCUACAUGAUCAUGGU−3’; (配列番号128)
アンチセンス: 5’−ACCAUGAUCAUGUAGACAUCGAUGG−3’ (配列番号129)
mhEGFR−7:センス 5’−CGAUGUCUACAUGAUCAUGGUCAAGU−3’; (配列番号130)
アンチセンス: 5’−ACUUGACCAUGAUCAUGUAGACAUCG−3’ (配列番号131)
mhEGFR−8:センス 5’−CUACAUGAUCAUGGUCAAGUGCUGG−3’; (配列番号132)
アンチセンス: 5’−CCAGCACUUGACCAUGAUCAUGUAG−3’ (配列番号133)
mhEGFR−9:センス 5’−CAUGAUCAUGGUCAAGUGCUGGAUGA−3’; (配列番号134)
アンチセンス: 5’−UCAUCCAGCACUUGACCAUGAUCAUG−3’ (配列番号135)
mhEGFR−10:センス 5’−GGAUGAAAGAAUGCAUUUGCCAAGU−3’; (配列番号136)
アンチセンス: 5’−ACUUGGCAAAUGCAUUCUUUCAUCC−3’ (配列番号137)
mhEGFR−11:センス 5’−GACAACCCUGACUACCAGCAGGACU−3’ (配列番号138)
アンチセンス: 5’−AGUCCUGCUGGUAGUCAGGGUUGUC−3’ (配列番号139)
mhEGFR−12:センス 5’−CCUUCUUAAAGACCAUCCAGGAGGU−3’; (配列番号140)
アンチセンス: 5’−ACCUCCUGGAUGGUCUUUAAGAAGG−3’ (配列番号141)
別の実施形態は、同一の薬物ペイロード(payload)におけるこれらのオリゴの組み合わせの使用である。疾患過程に関与する3つまたはそれを超える遺伝子を標的化する3つまたはそれを超える25塩基対のsiRNAを、同一のナノ粒子中にパッケージングし、同一の投与経路(または異なる経路)によって送達させた場合、複数の遺伝子発現のノックダウンによって特定の腫瘍形成経路を有効に遮断することができるので、この治療はより有効である。以下の組み合わせを、本明細書に適用した同一の一般的原理を使用して、さらに拡大することができる。
アンチセンス: 5’−CUUUCUCACCUUCUGGGAUCCAGAG−3’ (配列番号119)
mhEGFR−2:センス 5’−CAGCAUGUCAAGAUCACAGAUUUUG−3’; (配列番号120)
アンチセンス: 5’−CAAAAUCUGUGAUCUUGACAUGCUG−3’ (配列番号121)
mhEGFR−3:センス 5’−GAUCACAGAUUUUGGGCUGGCCAAA−3’; (配列番号122)
アンチセンス: 5’−UUUGGCCAGCCCAAAAUCUGUGAUC−3’ (配列番号123)
mhEGFR−4:センス 5’−CAGAUUUUGGGCUGGCCAAACUGCU−3’ (配列番号124)
アンチセンス: 5’−AGCAGUUUGGCCAGCCCAAAAUCUG−3’ (配列番号125)
mhEGFR−5:センス 5’−C AAAGUGCCUAUCAAGUGGAUGGCA−3’ (配列番号126)
アンチセンス: 5’−UGCCAUCCACUUGAUAGGCACUUUG−3’ (配列番号127)
mhEGFR−6:センス 5’−CCAUCGAUGUCUACAUGAUCAUGGU−3’; (配列番号128)
アンチセンス: 5’−ACCAUGAUCAUGUAGACAUCGAUGG−3’ (配列番号129)
mhEGFR−7:センス 5’−CGAUGUCUACAUGAUCAUGGUCAAGU−3’; (配列番号130)
アンチセンス: 5’−ACUUGACCAUGAUCAUGUAGACAUCG−3’ (配列番号131)
mhEGFR−8:センス 5’−CUACAUGAUCAUGGUCAAGUGCUGG−3’; (配列番号132)
アンチセンス: 5’−CCAGCACUUGACCAUGAUCAUGUAG−3’ (配列番号133)
mhEGFR−9:センス 5’−CAUGAUCAUGGUCAAGUGCUGGAUGA−3’; (配列番号134)
アンチセンス: 5’−UCAUCCAGCACUUGACCAUGAUCAUG−3’ (配列番号135)
mhEGFR−10:センス 5’−GGAUGAAAGAAUGCAUUUGCCAAGU−3’; (配列番号136)
アンチセンス: 5’−ACUUGGCAAAUGCAUUCUUUCAUCC−3’ (配列番号137)
mhEGFR−11:センス 5’−GACAACCCUGACUACCAGCAGGACU−3’ (配列番号138)
アンチセンス: 5’−AGUCCUGCUGGUAGUCAGGGUUGUC−3’ (配列番号139)
mhEGFR−12:センス 5’−CCUUCUUAAAGACCAUCCAGGAGGU−3’; (配列番号140)
アンチセンス: 5’−ACCUCCUGGAUGGUCUUUAAGAAGG−3’ (配列番号141)
別の実施形態は、同一の薬物ペイロード(payload)におけるこれらのオリゴの組み合わせの使用である。疾患過程に関与する3つまたはそれを超える遺伝子を標的化する3つまたはそれを超える25塩基対のsiRNAを、同一のナノ粒子中にパッケージングし、同一の投与経路(または異なる経路)によって送達させた場合、複数の遺伝子発現のノックダウンによって特定の腫瘍形成経路を有効に遮断することができるので、この治療はより有効である。以下の組み合わせを、本明細書に適用した同一の一般的原理を使用して、さらに拡大することができる。
25塩基対のsiRNAオリゴ(それぞれが、ヒトおよびマウスの両方由来の対応する遺伝子を標的化することができる)の組み合わせは、より強い治療(多標的化)効果を達成することができる:
1.VEGF経路の標的化:
1.VEGF経路の標的化:
VEGF−VEGFR1−VEGFR2カクテルA:
mhVEGF25−1:センス 5’−CAAGAUCCGCAGACGUGUAAAUGUU−3’; (配列番号142)
アンチセンス 5 ‘−AACAUUUACACGUCUGCGGAUCUUG−3’ (配列番号143)
mhVEGFR125−3:センス 5’−CAAGGAGGGCCUCUGAUGGUGAUGU−3’; (配列番号144)
アンチセンス:5’−ACAUCACCAUCAGAGGCCCUCCUUG−3’ (配列番号145)
mhVEGFR225−1:センス 5’−CCUACGGACCGUUAAGCGGGCCAAU−3’; (配列番号146)
アンチセンス:5’−AUUGGCCCGCUUAACGGUCCGUAGG−3’ (配列番号147)
VEGF−VEGFR1−VEGFR2カクテルB:
mhVEGF25−l:センス 5’−CAAGAUCCGCAGACGUGUAAAUGUU−3’; (配列番号148)
アンチセンス 5’−AACAUUUACACGUCUGCGGAUCUUG−3’ (配列番号149)
mhVEGFR125−6:センス 5’−CCAGAAAGUGCAUUCAUCGGGACCU−3’; (配列番号150)
アンチセンス:5’−AGGUCCCGAUGAAUGCACUUUCUGG−3’ (配列番号151)
mhVEGFR225−2:センス 5’−CUCAUGUCUGUUCUCAAGAUCCUCA−3’; (配列番号152)
アンチセンス:5’−UGAGGAUCUUGAGAACAGACAUGAG−3’ (配列番号153)
VEGF−VEGFR1−VEGFR2カクテルC:
mhVEGF25−2: センス 5’−GCAGCUUGAGUUAAACGAACGUACU−3’; (配列番号154)
アンチセンス 5’−AGUACGUUCGUUUAACUCAAGCUGC−3’ (配列番号155)
mhVEGFR125−6:センス 5’−CCAGAAAGUGCAUUCAUCGGGACCU−3’; (配列番号156)
アンチセンス:5’−AGGUCCCGAUGAAUGCACUUUCUGG−3’ (配列番号157)
mhVEGFR225−2:センス 5’−CUCAUGUCUGUUCUCAAGAUCCUCA−3’; (配列番号158)
アンチセンス:5’−UGAGGAUCUUGAGAACAGACAUGAG−3’ (配列番号159)
VEGF、VEGFR1、およびVEGFR2を標的化する25塩基対のsiRNAオリゴとの多くの他の組み合わせを、最良の抗血管形成効果を得るために、同一または異なる比率の各成分のいずれかによって構成することができる。
mhVEGF25−1:センス 5’−CAAGAUCCGCAGACGUGUAAAUGUU−3’; (配列番号142)
アンチセンス 5 ‘−AACAUUUACACGUCUGCGGAUCUUG−3’ (配列番号143)
mhVEGFR125−3:センス 5’−CAAGGAGGGCCUCUGAUGGUGAUGU−3’; (配列番号144)
アンチセンス:5’−ACAUCACCAUCAGAGGCCCUCCUUG−3’ (配列番号145)
mhVEGFR225−1:センス 5’−CCUACGGACCGUUAAGCGGGCCAAU−3’; (配列番号146)
アンチセンス:5’−AUUGGCCCGCUUAACGGUCCGUAGG−3’ (配列番号147)
VEGF−VEGFR1−VEGFR2カクテルB:
mhVEGF25−l:センス 5’−CAAGAUCCGCAGACGUGUAAAUGUU−3’; (配列番号148)
アンチセンス 5’−AACAUUUACACGUCUGCGGAUCUUG−3’ (配列番号149)
mhVEGFR125−6:センス 5’−CCAGAAAGUGCAUUCAUCGGGACCU−3’; (配列番号150)
アンチセンス:5’−AGGUCCCGAUGAAUGCACUUUCUGG−3’ (配列番号151)
mhVEGFR225−2:センス 5’−CUCAUGUCUGUUCUCAAGAUCCUCA−3’; (配列番号152)
アンチセンス:5’−UGAGGAUCUUGAGAACAGACAUGAG−3’ (配列番号153)
VEGF−VEGFR1−VEGFR2カクテルC:
mhVEGF25−2: センス 5’−GCAGCUUGAGUUAAACGAACGUACU−3’; (配列番号154)
アンチセンス 5’−AGUACGUUCGUUUAACUCAAGCUGC−3’ (配列番号155)
mhVEGFR125−6:センス 5’−CCAGAAAGUGCAUUCAUCGGGACCU−3’; (配列番号156)
アンチセンス:5’−AGGUCCCGAUGAAUGCACUUUCUGG−3’ (配列番号157)
mhVEGFR225−2:センス 5’−CUCAUGUCUGUUCUCAAGAUCCUCA−3’; (配列番号158)
アンチセンス:5’−UGAGGAUCUUGAGAACAGACAUGAG−3’ (配列番号159)
VEGF、VEGFR1、およびVEGFR2を標的化する25塩基対のsiRNAオリゴとの多くの他の組み合わせを、最良の抗血管形成効果を得るために、同一または異なる比率の各成分のいずれかによって構成することができる。
2.VEGFおよびEGF経路の両方の標的化:
VEGF−VEGFR2−EGFRカクテルA:
mhVEGF25−l:センス 5’−CAAGAUCCGCAGACGUGUAAAUGUU−3’; (配列番号160)
アンチセンス 5’−AACAUUUACACGUCUGCGGAUCUUG−3’ (配列番号161)
mhVEGFR225−l:センス 5’−CCUACGGACCGUUAAGCGGGCCAAU−3’; (配列番号162)
アンチセンス:5’−AUUGGCCCGCUUAACGGUCCGUAGG−3’ (配列番号163)
mhEGFR−1:センス 5’−CUCUGGAUCCCAGAAGGUGAGAAAG−3’; (配列番号164)
アンチセンス:5’−CUUUCUCACCUUCUGGGAUCCAGAG−3’ (配列番号165)
VEGF−VEGFR2−EGFRカクテルB:
mhVEGF25−l: センス 5’−CAAGAUCCGCAGACGUGUAAAUGUU−3’; (配列番号166)
アンチセンス 5’−AACAUUUACACGUCUGCGGAUCUUG−3’ (配列番号167)
mhVEGFR225−2:センス 5’−CUCAUGUCUGUUCUCAAGAUCCUCA−3’; (配列番号168)
アンチセンス:5’−UG AGGAUCUUGAGAACAGACAUGAG−3’ (配列番号169)
mhEGFR−5:センス 5’−CAAAGUGCCUAUCAAGUGGAUGGCA−3’; (配列番号170)
アンチセンス:5’−UGCCAUCCACUUGAUAGGCACUUUG−3’ (配列番号171)
VEGF− VEGFR2−EGFRカクテルC:
mhVEGF25−2:センス 5’−GCAGCUUGAGUUAAACGAACGUACU−3’; (配列番号172)
アンチセンス 5’−AGUACGUUCGUUUAACUCAAGCUGC−3’ (配列番号173)
mhVEGFR225−2:センス 5’−CUCAUGUCUGUUCUCAAGAUCCUCA−3’; (配列番号174)
アンチセンス:5’−UGAGGAUCUUGAGAACAGACAUGAG−3’ (配列番号175)
mhEGFR−9:センス 5’−CAUGAUCAUGGUCAAGUGCUGGAUGA−3’; (配列番号176)
アンチセンス:5’−UCAUCCAGCACUUGACCAUGAUCAUG−3’ (配列番号177)
siRNAオリゴの異なる組成および同等または異なる比率を有するこれらの3つの遺伝子を標的化する他の配列との多くの他の組み合わせを作製することができる。
mhVEGF25−l:センス 5’−CAAGAUCCGCAGACGUGUAAAUGUU−3’; (配列番号160)
アンチセンス 5’−AACAUUUACACGUCUGCGGAUCUUG−3’ (配列番号161)
mhVEGFR225−l:センス 5’−CCUACGGACCGUUAAGCGGGCCAAU−3’; (配列番号162)
アンチセンス:5’−AUUGGCCCGCUUAACGGUCCGUAGG−3’ (配列番号163)
mhEGFR−1:センス 5’−CUCUGGAUCCCAGAAGGUGAGAAAG−3’; (配列番号164)
アンチセンス:5’−CUUUCUCACCUUCUGGGAUCCAGAG−3’ (配列番号165)
VEGF−VEGFR2−EGFRカクテルB:
mhVEGF25−l: センス 5’−CAAGAUCCGCAGACGUGUAAAUGUU−3’; (配列番号166)
アンチセンス 5’−AACAUUUACACGUCUGCGGAUCUUG−3’ (配列番号167)
mhVEGFR225−2:センス 5’−CUCAUGUCUGUUCUCAAGAUCCUCA−3’; (配列番号168)
アンチセンス:5’−UG AGGAUCUUGAGAACAGACAUGAG−3’ (配列番号169)
mhEGFR−5:センス 5’−CAAAGUGCCUAUCAAGUGGAUGGCA−3’; (配列番号170)
アンチセンス:5’−UGCCAUCCACUUGAUAGGCACUUUG−3’ (配列番号171)
VEGF− VEGFR2−EGFRカクテルC:
mhVEGF25−2:センス 5’−GCAGCUUGAGUUAAACGAACGUACU−3’; (配列番号172)
アンチセンス 5’−AGUACGUUCGUUUAACUCAAGCUGC−3’ (配列番号173)
mhVEGFR225−2:センス 5’−CUCAUGUCUGUUCUCAAGAUCCUCA−3’; (配列番号174)
アンチセンス:5’−UGAGGAUCUUGAGAACAGACAUGAG−3’ (配列番号175)
mhEGFR−9:センス 5’−CAUGAUCAUGGUCAAGUGCUGGAUGA−3’; (配列番号176)
アンチセンス:5’−UCAUCCAGCACUUGACCAUGAUCAUG−3’ (配列番号177)
siRNAオリゴの異なる組成および同等または異なる比率を有するこれらの3つの遺伝子を標的化する他の配列との多くの他の組み合わせを作製することができる。
3.VEGF、PDGF、およびEGF経路の標的化:
VEGFR2−PDGFRa−EGFRカクテルA:
mhVEGFR225−l:センス 5’−CCUACGGACCGUUAAGCGGGCCAAU−3’ (配列番号178)
アンチセンス:5’−AUUGGCCCGCUUAACGGUCCGUAGG−3’ (配列番号179)
mhPDGFRa25−1:センス 5’−GAAGAUAAUGACUCACCUGGGGCCA−3’; (配列番号180)
アンチセンス:5’−UGGCCCCAGGUGAGUCAUUAUCUUC−3’ (配列番号181)
mhEGFR−1:センス 5’−CUCUGGAUCCCAGAAGGUGAGAAAG−3’; (配列番号182)
アンチセンス:5’−CUUUCUCACCUUCUGGGAUCCAGAG−3’ (配列番号183)
VEGFR1−VEGFR2−PDGFRa−EGFRカクテルB:
mhVEGFR125−6:センス 5’−CCAGAAAGUGCAUUCAUCGGGACCU−3’; (配列番号184)
アンチセンス:5’−AGGUCCCGAUGAAUGCACUUUCUGG−3’ (配列番号185)
mhVEGFR225−1:センス 5’−CCUACGGACCGUUAAGCGGGCCAAU−3’; (配列番号186)
アンチセンス:5’−AUUGGCCCGCUUAACGGUCCGUAGG−3’ (配列番号187)
mhPDGFRa25−2:センス 5’−GAUAAUGACUCACCUGGGGCCACAU−3’; (配列番号188)
アンチセンス:5’−AUGUGGCCCCAGGUGAGUCAUUAUC−3’ (配列番号189)
mhEGFR−1:センス 5’−CUCUGGAUCCCAGAAGGUGAGAAAG−3’; (配列番号190)
アンチセンス:5’−CUUUCUCACCUUCUGGGAUCCAGAG−3’ (配列番号191)
VEGFR2−PDGFRa−EGFRカクテルC:
mhVEGFR225−1:センス 5’−CCUACGGACCGUUAAGCGGGCCAAU−3’; (配列番号192)
アンチセンス:5’−AUUGGCCCGCUUAACGGUCCGUAGG−3’ (配列番号193)
mhPDGFRa25−2: センス 5’−GAUAAUGACUCACCUGGGGCCACAU−3’; (配列番号194)
アンチセンス:5’−AUGUGGCCCCAGGUGAGUCAUUAUC−3’ (配列番号195)
mhEGFR−12:センス 5’−CCUUCUUAAAGACCAUCCAGGAGGU−3’; (配列番号196)
アンチセンス:5’−ACCUCCUGGAUGGUCUUUAAGAAGG−3’ (配列番号197)
VEGFR2−PDGFRb−EGFRカクテルA:
mhVEGFR225−1:センス 5’−CCUACGGACCGUUAAGCGGGCCAAU−3’; (配列番号198)
アンチセンス:5’−AUUGGCCCGCUUAACGGUCCGUAGG−3’ (配列番号199)
mhPDGFRB25−5:センス 5’−GGCAAGCUGGUCAAGAUCUGUGACU−3’; (配列番号200)
アンチセンス:5’−AGUCACAGAUCUUGACCAGCUUGCC−3’ (配列番号201)
mhEGFR−1: センス 5’−CUCUGGAUCCCAGAAGGUGAGAAAG−3’; (配列番号202)
アンチセンス:5’−CUUUCUCACCUUCUGGGAUCCAGAG−3’ (配列番号203)
mhVEGFR225−l:センス 5’−CCUACGGACCGUUAAGCGGGCCAAU−3’ (配列番号178)
アンチセンス:5’−AUUGGCCCGCUUAACGGUCCGUAGG−3’ (配列番号179)
mhPDGFRa25−1:センス 5’−GAAGAUAAUGACUCACCUGGGGCCA−3’; (配列番号180)
アンチセンス:5’−UGGCCCCAGGUGAGUCAUUAUCUUC−3’ (配列番号181)
mhEGFR−1:センス 5’−CUCUGGAUCCCAGAAGGUGAGAAAG−3’; (配列番号182)
アンチセンス:5’−CUUUCUCACCUUCUGGGAUCCAGAG−3’ (配列番号183)
VEGFR1−VEGFR2−PDGFRa−EGFRカクテルB:
mhVEGFR125−6:センス 5’−CCAGAAAGUGCAUUCAUCGGGACCU−3’; (配列番号184)
アンチセンス:5’−AGGUCCCGAUGAAUGCACUUUCUGG−3’ (配列番号185)
mhVEGFR225−1:センス 5’−CCUACGGACCGUUAAGCGGGCCAAU−3’; (配列番号186)
アンチセンス:5’−AUUGGCCCGCUUAACGGUCCGUAGG−3’ (配列番号187)
mhPDGFRa25−2:センス 5’−GAUAAUGACUCACCUGGGGCCACAU−3’; (配列番号188)
アンチセンス:5’−AUGUGGCCCCAGGUGAGUCAUUAUC−3’ (配列番号189)
mhEGFR−1:センス 5’−CUCUGGAUCCCAGAAGGUGAGAAAG−3’; (配列番号190)
アンチセンス:5’−CUUUCUCACCUUCUGGGAUCCAGAG−3’ (配列番号191)
VEGFR2−PDGFRa−EGFRカクテルC:
mhVEGFR225−1:センス 5’−CCUACGGACCGUUAAGCGGGCCAAU−3’; (配列番号192)
アンチセンス:5’−AUUGGCCCGCUUAACGGUCCGUAGG−3’ (配列番号193)
mhPDGFRa25−2: センス 5’−GAUAAUGACUCACCUGGGGCCACAU−3’; (配列番号194)
アンチセンス:5’−AUGUGGCCCCAGGUGAGUCAUUAUC−3’ (配列番号195)
mhEGFR−12:センス 5’−CCUUCUUAAAGACCAUCCAGGAGGU−3’; (配列番号196)
アンチセンス:5’−ACCUCCUGGAUGGUCUUUAAGAAGG−3’ (配列番号197)
VEGFR2−PDGFRb−EGFRカクテルA:
mhVEGFR225−1:センス 5’−CCUACGGACCGUUAAGCGGGCCAAU−3’; (配列番号198)
アンチセンス:5’−AUUGGCCCGCUUAACGGUCCGUAGG−3’ (配列番号199)
mhPDGFRB25−5:センス 5’−GGCAAGCUGGUCAAGAUCUGUGACU−3’; (配列番号200)
アンチセンス:5’−AGUCACAGAUCUUGACCAGCUUGCC−3’ (配列番号201)
mhEGFR−1: センス 5’−CUCUGGAUCCCAGAAGGUGAGAAAG−3’; (配列番号202)
アンチセンス:5’−CUUUCUCACCUUCUGGGAUCCAGAG−3’ (配列番号203)
VEGFR2−PDGFRb−EGFRカクテルB:
mhVEGFR225−l: センス 5’−CCUACGGACCGUUAAGCGGGCCAAU−3’; (配列番号204)
アンチセンス:5’−AUUGGCCCGCUUAACGGUCCGUAGG−3’ (配列番号205)
mhPDGFRB25−10:センス 5’−CAUGCCUCCGACGAGAUCUAUGAGA−3’;(配列番号206)
アンチセンス:5’−UCUCAUAGAUCUCGUCGGAGGCAUG−3’ (配列番号207)
mhEGFR−1:センス 5’−CUCUGGAUCCCAGAAGGUGAGAAAG−3’;(配列番号208)
アンチセンス:5’−CUUUCUCACCUUCUGGGAUCCAGAG−3’(配列番号209)
VEGFR2−PDGFRb−EGFRカクテルC:
mhVEGFR225−l:センス 5’−CCUACGGACCGUUAAGCGGGCCAAU−3’;(配列番号210)
アンチセンス:5’−AUUGGCCCGCUUAACGGUCCGUAGG−3’ (配列番号211)
mhPDGFRB25−5:センス 5’−GGCAAGCUGGUCAAGAUCUGUGACU−3’;(配列番号212)
アンチセンス:5’−AGUCACAGAUCUUGACCAGCUUGCC−3’(配列番号213)
mhEGFR−12:センス 5’−CCUUCUUAAAGACCAUCCAGGAGGU−3’;(配列番号214)
アンチセンス:5’−ACCUCCUGGAUGGUCUUUAAGAAGG−3’ (配列番号215)
siRNAオリゴの異なる組成および同等または異なる比を有するこれらの3つの遺伝子を標的化する他の配列との多くの他の組み合わせを作製することができる。
mhVEGFR225−l: センス 5’−CCUACGGACCGUUAAGCGGGCCAAU−3’; (配列番号204)
アンチセンス:5’−AUUGGCCCGCUUAACGGUCCGUAGG−3’ (配列番号205)
mhPDGFRB25−10:センス 5’−CAUGCCUCCGACGAGAUCUAUGAGA−3’;(配列番号206)
アンチセンス:5’−UCUCAUAGAUCUCGUCGGAGGCAUG−3’ (配列番号207)
mhEGFR−1:センス 5’−CUCUGGAUCCCAGAAGGUGAGAAAG−3’;(配列番号208)
アンチセンス:5’−CUUUCUCACCUUCUGGGAUCCAGAG−3’(配列番号209)
VEGFR2−PDGFRb−EGFRカクテルC:
mhVEGFR225−l:センス 5’−CCUACGGACCGUUAAGCGGGCCAAU−3’;(配列番号210)
アンチセンス:5’−AUUGGCCCGCUUAACGGUCCGUAGG−3’ (配列番号211)
mhPDGFRB25−5:センス 5’−GGCAAGCUGGUCAAGAUCUGUGACU−3’;(配列番号212)
アンチセンス:5’−AGUCACAGAUCUUGACCAGCUUGCC−3’(配列番号213)
mhEGFR−12:センス 5’−CCUUCUUAAAGACCAUCCAGGAGGU−3’;(配列番号214)
アンチセンス:5’−ACCUCCUGGAUGGUCUUUAAGAAGG−3’ (配列番号215)
siRNAオリゴの異なる組成および同等または異なる比を有するこれらの3つの遺伝子を標的化する他の配列との多くの他の組み合わせを作製することができる。
3つを超える配列との組み合わせを作製することもできる。
EGFR2−PDGFRab−EGFRカクテルA:
mhVEGFR225−l:センス 5’−CCUACGGACCGUUAAGCGGGCCAAU−3’;(配列番号216)
アンチセンス:5’−AUUGGCCCGCUUAACGGUCCGUAGG−3’(配列番号217)
mhPDGFRa25−2:センス 5’−GAUAAUGACUCACCUGGGGCCACAU−3’(配列番号218)
アンチセンス:5’−AUGUGGCCCCAGGUGAGUCAUUAUC−3’ (配列番号219)
mhPDGFRb25−5:センス 5’−GGCAAGCUGGUCAAGAUCUGUGACU−3’;(配列番号220)
アンチセンス:5’−AGUCACAGAUCUUGACCAGCUUGCC−3’(配列番号221)
mhEGFR−1:センス 5’−CUCUGGAUCCCAGAAGGUGAGAAAG−3’;(配列番号222)
アンチセンス:5’−CUUUCUCACCUUCUGGGAUCCAGAG−3’(配列番号223)
VEGFR1−VEGFR2−PDGFRb−EGFR−VEGFカクテルA:
mhVEGFR225−l:センス 5’−CCUACGGACCGUUAAGCGGGCCAAU−3’;(配列番号216)
アンチセンス:5’−AUUGGCCCGCUUAACGGUCCGUAGG−3’(配列番号217)
mhPDGFRa25−2:センス 5’−GAUAAUGACUCACCUGGGGCCACAU−3’(配列番号218)
アンチセンス:5’−AUGUGGCCCCAGGUGAGUCAUUAUC−3’ (配列番号219)
mhPDGFRb25−5:センス 5’−GGCAAGCUGGUCAAGAUCUGUGACU−3’;(配列番号220)
アンチセンス:5’−AGUCACAGAUCUUGACCAGCUUGCC−3’(配列番号221)
mhEGFR−1:センス 5’−CUCUGGAUCCCAGAAGGUGAGAAAG−3’;(配列番号222)
アンチセンス:5’−CUUUCUCACCUUCUGGGAUCCAGAG−3’(配列番号223)
VEGFR1−VEGFR2−PDGFRb−EGFR−VEGFカクテルA:
mhVEGFR125−6:センス 5’−CCAGAAAGUGCAUUCAUCGGGACCU−3’;(配列番号224)
アンチセンス:5’−AGGUCCCGAUGAAUGCACUUUCUGG−3’(配列番号225)
mhVEGFR225−1:センス 5’−CCUACGGACCGUUAAGCGGGCCAAU−3’;(配列番号226)
アンチセンス:5’−AUUGGCCCGCUUAACGGUCCGUAGG−3’(配列番号227)
mhPDGFRB25−10:センス 5’−CAUGCCUCCGACGAGAUCUAUGAGA−3’;(配列番号228)
アンチセンス:5’−UCUCAUAGAUCUCGUCGGAGGCAUG−3’ (配列番号229)
mhEGFR−1:センス 5’−CUCUGGAUCCCAGAAGGUGAGAAAG−3’;(配列番号230)
アンチセンス:5’−CUUUCUCACCUUCUGGGAUCCAGAG−3’ (配列番号231)
mhVEGF25−2: センス 5’−GCAGCUUGAGUUAAACGAACGUACU−3’;(配列番号232)
アンチセンス:5’−AGUACGUUCGUUUAACUCAAGCUGC−3’(配列番号233)
VEGFR1−VEGFR2−PDGFRb−EGFR−VEGFカクテルC:
mhVEGFR125−6:センス 5’−CCAGAAAGUGCAUUCAUCGGGACCU−3’;(配列番号234)
アンチセンス:5’−AGGUCCCGAUGAAUGCACUUUCUGG−3’(配列番号235)
mhVEGFR225−1:センス 5’−CCUACGGACCGUUAAGCGGGCCAAU−3’(配列番号236)
アンチセンス:5’−AUUGGCCCGCUUAACGGUCCGUAGG−3’(配列番号237)
mhPDGFRa25−2:センス 5’−GAUAAUGACUCACCUGGGGCCACAU−3’(配列番号238)
アンチセンス:5’−AUGUGGCCCCAGGUGAGUCAUUAUC−3’(配列番号239)
mhPDGFRB25−5:センス 5’−GGCAAGCUGGUCAAGAUCUGUGACU−3’;(配列番号240)
アンチセンス:5’−AGUCACAGAUCUUGACCAGCUUGCC−3’ (配列番号241)
mhEGFR−12:センス 5’−CCUUCUUAAAGACCAUCCAGGAGGU−3’;(配列番号242)
アンチセンス:5’−ACCUCCUGGAUGGUCUUUAAGAAGG−3’(配列番号243)
mhVEGF25−2:センス 5’−GCAGCUUGAGUUAAACGAACGUACU−3’(配列番号244)
アンチセンス 5’−AGUACGUUCGUUUAACUCAAGCUGC−3’ (配列番号245)
B.VEGF経路遺伝子阻害の組み合わせ
NV阻害のための本発明の組成物および方法の開発時に多数の要因を検討した。第1に、NV疾患は複雑であり、複数のタンパク質、異常に過剰発現した疾患に起因する遺伝子、および疾患に起因するタンパク質の複数の機能障害の結果である。第2に、RNA干渉(RNAi)を活性化する核酸薬は、配列特異的様式で遺伝子発現を高度に選択するインヒビターである。第3に、タンパク質活性の調整によるNVの阻害を、多数の方法(タンパク質機能の阻害(アンタゴニスト)、タンパク質機能の刺激(アゴニスト)、タンパク質発現レベルの減少、およびタンパク質の転写後修飾を含む)によって行うことができる。NV疾患の処置は、理想的には、疾患の進行に極めて重要な特定の生物学的経路を有効に遮断するための高度な治療作用(リガンドおよびその受容体の両方の機能の同時遮断、受容体活性および下流シグナル伝達タンパク質の同時遮断、ならびに経路の冗長な要素の同時遮断を含む)が必要である。これは、NV疾患およびVEGF経路に当てはまる。
アンチセンス:5’−AGGUCCCGAUGAAUGCACUUUCUGG−3’(配列番号225)
mhVEGFR225−1:センス 5’−CCUACGGACCGUUAAGCGGGCCAAU−3’;(配列番号226)
アンチセンス:5’−AUUGGCCCGCUUAACGGUCCGUAGG−3’(配列番号227)
mhPDGFRB25−10:センス 5’−CAUGCCUCCGACGAGAUCUAUGAGA−3’;(配列番号228)
アンチセンス:5’−UCUCAUAGAUCUCGUCGGAGGCAUG−3’ (配列番号229)
mhEGFR−1:センス 5’−CUCUGGAUCCCAGAAGGUGAGAAAG−3’;(配列番号230)
アンチセンス:5’−CUUUCUCACCUUCUGGGAUCCAGAG−3’ (配列番号231)
mhVEGF25−2: センス 5’−GCAGCUUGAGUUAAACGAACGUACU−3’;(配列番号232)
アンチセンス:5’−AGUACGUUCGUUUAACUCAAGCUGC−3’(配列番号233)
VEGFR1−VEGFR2−PDGFRb−EGFR−VEGFカクテルC:
mhVEGFR125−6:センス 5’−CCAGAAAGUGCAUUCAUCGGGACCU−3’;(配列番号234)
アンチセンス:5’−AGGUCCCGAUGAAUGCACUUUCUGG−3’(配列番号235)
mhVEGFR225−1:センス 5’−CCUACGGACCGUUAAGCGGGCCAAU−3’(配列番号236)
アンチセンス:5’−AUUGGCCCGCUUAACGGUCCGUAGG−3’(配列番号237)
mhPDGFRa25−2:センス 5’−GAUAAUGACUCACCUGGGGCCACAU−3’(配列番号238)
アンチセンス:5’−AUGUGGCCCCAGGUGAGUCAUUAUC−3’(配列番号239)
mhPDGFRB25−5:センス 5’−GGCAAGCUGGUCAAGAUCUGUGACU−3’;(配列番号240)
アンチセンス:5’−AGUCACAGAUCUUGACCAGCUUGCC−3’ (配列番号241)
mhEGFR−12:センス 5’−CCUUCUUAAAGACCAUCCAGGAGGU−3’;(配列番号242)
アンチセンス:5’−ACCUCCUGGAUGGUCUUUAAGAAGG−3’(配列番号243)
mhVEGF25−2:センス 5’−GCAGCUUGAGUUAAACGAACGUACU−3’(配列番号244)
アンチセンス 5’−AGUACGUUCGUUUAACUCAAGCUGC−3’ (配列番号245)
B.VEGF経路遺伝子阻害の組み合わせ
NV阻害のための本発明の組成物および方法の開発時に多数の要因を検討した。第1に、NV疾患は複雑であり、複数のタンパク質、異常に過剰発現した疾患に起因する遺伝子、および疾患に起因するタンパク質の複数の機能障害の結果である。第2に、RNA干渉(RNAi)を活性化する核酸薬は、配列特異的様式で遺伝子発現を高度に選択するインヒビターである。第3に、タンパク質活性の調整によるNVの阻害を、多数の方法(タンパク質機能の阻害(アンタゴニスト)、タンパク質機能の刺激(アゴニスト)、タンパク質発現レベルの減少、およびタンパク質の転写後修飾を含む)によって行うことができる。NV疾患の処置は、理想的には、疾患の進行に極めて重要な特定の生物学的経路を有効に遮断するための高度な治療作用(リガンドおよびその受容体の両方の機能の同時遮断、受容体活性および下流シグナル伝達タンパク質の同時遮断、ならびに経路の冗長な要素の同時遮断を含む)が必要である。これは、NV疾患およびVEGF経路に当てはまる。
しかし、2つ、3つ、またはそれを超えるタンパク質に選択性を示す1つの薬剤の同定は、不可能ではないが、困難であり、しばしば実用的ではない。この困難を克服するために、現代医学では薬物の組み合わせを使用する傾向がある。腫瘍学への適用において、化学療法薬の組み合わせが顕著な抗癌有効性を達成している。1つの例は、前立腺癌由来の複数の骨転移を有する口腔咽頭癌の治療のためのドセタキセル、イフォスファミド、およびシスプラチンの併用療法の使用である(2)。他の治療領域では、別の例は、コルチコ
ステロイド、メトロニダゾール、およびバンコマイシンの組み合わせを使用した潰瘍性大腸炎の治療である(3)。不十分に制御された2型糖尿病の治療のために、グリメピリド(glimepiride)とメトホルミンとの組み合わせ療法へのロシグリタゾン添加の有効性および安全性が評価された(4)。
ステロイド、メトロニダゾール、およびバンコマイシンの組み合わせを使用した潰瘍性大腸炎の治療である(3)。不十分に制御された2型糖尿病の治療のために、グリメピリド(glimepiride)とメトホルミンとの組み合わせ療法へのロシグリタゾン添加の有効性および安全性が評価された(4)。
臨床研究で顕著な治療有効性が証明されているにもかかわらず、供給源の相違、製造過程の相違、および化学的性質の相違に起因するより高い投薬量の毒性および長期使用の安全性は常に大きな懸念材料である。これらの問題を克服するために、本発明の1つの態様は、同一治療において複数の病原遺伝子を標的化するためにsiRNAの組み合わせを使用した、組み合わせ効果を達成するために固有の利点を提供するためのsiRNAオリゴヌクレオチド遺伝子インヒビターの使用である。本発明によって得られる1つの利点は、全てのsiRNAオリゴヌクレオチドが化学的および薬理学的に非常に類似しており、同一の供給源および同一の製造過程に由来し得るという結果である。本発明によって得られる別の利点は、複数のsiRNAオリゴヌクレオチドをナノ粒子調製物などの1つの調製物中に処方することができることである。
したがって、本発明の1つの態様は、複数のVEGF経路遺伝子の特異的且つ選択的阻害を達成し、その結果としてNV疾患の阻害およびより良好な臨床的利点を達成するためにsiRNA薬を組み合わせることである。本発明は、多くのsiRNA標的化の組み合わせ(その受容体(VEGFR1(Flt1)およびVEGFR2(KDR)を含む)、並行(parallel)成長因子(PDGFおよびEGFを含む)およびその受容体、下流シグナル伝達因子(RAFおよびAKTを含む)、および転写因子(NFKBを含む)、ならびにその組み合わせとのVEGF自体を標的化する組み合わせを含む)を提供する。好ましい実施形態は、VEGFを阻害するsiRNAとその受容体VEGFR1(Flt1)およびVEGFR2(KDR)の2つとの組み合わせである。別の好ましい実施形態は、VEGFを阻害するsiRNAおよびその受容体、PDGFおよびその受容体、ならびにEGFおよびその受容体との組み合わせである。さらに別の好ましい実施形態は、siRNA阻害VEGFおよびその受容体と下流シグナル伝達との組み合わせである。
NV疾患治療のための治療薬としてdsRNAオリゴヌクレオチドを組み合わせることができる。本発明の1つの実施形態では、dsRNAオリゴヌクレオチドを、カクテルとして共に混合することができ、別の実施形態では、これらを同一の経路または異なる経路および処方によって連続的に投与することができ、さらに別の実施形態では、いくつかをカクテルとして投与し、いくつかを連続的に投与することができる。NV疾患を治療するためのsiRNAの他の組み合わせおよびその組み合わせ方法が当業者に理解されているであろう。
C.VEGF経路のアンタゴニストと遺伝子阻害との組み合わせ
疾患は、複雑であり、且つ複数の病理学的過程が存在することが多く、さらに、病微の重症度が多様であり、これらが患者によって変動することが多い。多くの疾患は、病因遺伝子もしくは疾患調節遺伝子の異常な過剰発現、外来感染性生物、またはその両方に起因する。疾患の進行、長期治療に対する減少した応答の発達、および薬物耐性も単剤治療または様式の臨床的利点を制限する。このような制限を克服するための1つの手段は、治療と薬物との組み合わせの使用による。
疾患は、複雑であり、且つ複数の病理学的過程が存在することが多く、さらに、病微の重症度が多様であり、これらが患者によって変動することが多い。多くの疾患は、病因遺伝子もしくは疾患調節遺伝子の異常な過剰発現、外来感染性生物、またはその両方に起因する。疾患の進行、長期治療に対する減少した応答の発達、および薬物耐性も単剤治療または様式の臨床的利点を制限する。このような制限を克服するための1つの手段は、治療と薬物との組み合わせの使用による。
したがって、本発明の1つの態様は、NV疾患の強く、持続可能で、頑強な阻害および優れた臨床的利点を達成するためにsiRNA薬を他の薬剤と組み合わせることである。本発明は、siRNA薬の他の薬剤との複数の組み合わせ(VEGF自体およびその受容体のための治療siRNAとVEGF自体のアンタゴニストおよびその受容体(アバスチンなど)との組み合わせを含む)を提供する。本発明はまた、治療siRNA薬と経口で
利用可能なキナーゼインヒビター(SU11248など)との組み合わせも提供する。本発明はまた、治療siRNA薬と免疫療法との組み合わせも提供する。本発明のさらに別の実施形態は、siRNAを抗増殖薬と組み合わせることである。NV疾患を治療するためのsiRNA薬と他の薬剤との他の組み合わせが当業者に理解されるであろう。
利用可能なキナーゼインヒビター(SU11248など)との組み合わせも提供する。本発明はまた、治療siRNA薬と免疫療法との組み合わせも提供する。本発明のさらに別の実施形態は、siRNAを抗増殖薬と組み合わせることである。NV疾患を治療するためのsiRNA薬と他の薬剤との他の組み合わせが当業者に理解されるであろう。
D.処方および投与
合成試薬に基づいた、組織に標的化可能な核酸送達系を開発するための近年の努力によって有望な結果が得られている。頑強にするために、有効な送達系は、複数の選択レベル(すなわち、疾患組織での選択的局在化および病変を駆動する生化学経路の選択的阻害)を有するべきである。さらに、最も有効な現在の治療法は、冗長な病理学的経路を遮断する「多標的化(multi−targeted)」治療薬(すなわち、複数の作用機構を有するデザイナー「ダーティ(dirty)」ドラッグ)が必要である。優れたアプローチは、疾患を同時に標的化して核酸薬を標的細胞および正確な細胞内区画に送達させる「賢明な」ナノ粒子を使用するであろう。
合成試薬に基づいた、組織に標的化可能な核酸送達系を開発するための近年の努力によって有望な結果が得られている。頑強にするために、有効な送達系は、複数の選択レベル(すなわち、疾患組織での選択的局在化および病変を駆動する生化学経路の選択的阻害)を有するべきである。さらに、最も有効な現在の治療法は、冗長な病理学的経路を遮断する「多標的化(multi−targeted)」治療薬(すなわち、複数の作用機構を有するデザイナー「ダーティ(dirty)」ドラッグ)が必要である。優れたアプローチは、疾患を同時に標的化して核酸薬を標的細胞および正確な細胞内区画に送達させる「賢明な」ナノ粒子を使用するであろう。
1つの実施形態では、本発明は、3つのさらなる特性を有する組織標的化可能な送達を含むsiRNAdsRNAオリゴヌクレオチドの処方物を提供する。これらの性質は、細胞質にsiRNAを放出することができるコアへの核酸結合、非特異的相互作用からの保護、および細胞取り込みをもたらす組織標的化である。これらの必要な性質の全てを1つの分子中に有する物質は存在しない。本発明は、必要な複数の性質を組み合わせてアセンブリするための3つの材料のモジュラー抱合体(modular conjugate)を使用する組成物および方法を提供する。種々の性質が組み込まれるようにこれらをデザインおよび合成し、siRNAペイロードと混合してナノ粒子を形成することができる。これらの実施形態に基づいて、好ましい実施形態は、これらの細胞に特異的なペプチドリガンドを保護ポリマーの一方の末端にカップリングし、他方の末端に核酸のためのカチオン性キャリアをカップリングすることによって新脈管構造を標的化するモジュラーポリマー抱合体を含む。このポリマー抱合体は、3つの機能ドメインを有し、これらはしばしば三官能性ポリマー(TFP)と呼ばれる。この抱合体のモジュラーデザインにより、各成分が個別に置換され、至適化される。別のアプローチは、予め形成したナノ粒子上に表面コーティングを付着させることであった。ポリマー上への立体ポリマーコーティングの吸着は自己限定的であり、一旦立体層が形成され始めると、ポリマーのさらなる付加が妨げられる。本発明の組成物および方法から、概して他の2つの機能と無関係の3つの各機能の至適化に有効な方法が得られる。
核酸コア粒子の形成
核酸の送達薬は、核酸の生物活性を発揮することができる様式で、細胞内部への核酸の接近の増加を補助しなければならない。合成材料を使用した核酸治療薬についてのこの困難に取り組むための試みには、単純なカチオン性脂質およびインビトロDNAトランスフェクション試薬として開発されたポリマー複合体の使用が含まれる。細胞への核酸の挿入および生物活性の獲得の両方が非常に困難であることが即座に見出された。例えば、輸送のための安定な核酸パッケージを達成することが可能であるが、これが核に核酸を放出するか細胞質にsiRNAを放出する必要性を満たすために調整することが常に簡単というわけではない。また、インビトロで有効な多数のカチオン性脂質およびポリマーは、インビボで投与した場合に活性を保持しない。不運なことに、その理由は依然としてほとんど知られておらず、インビボで活性な複合体を開発するための予測値はほとんど得られていない。RNAを使用した研究は非常に遅れており、今までのところ、siRNAに関心が寄せられたのは最近である。それにもかかわらず、しばしば肺組織をDNA複合体の静脈内投与からトランスフェクトすることができる。ペイロードとしてsiRNAを使用した場合、類似の生物活性が認められている。
核酸の送達薬は、核酸の生物活性を発揮することができる様式で、細胞内部への核酸の接近の増加を補助しなければならない。合成材料を使用した核酸治療薬についてのこの困難に取り組むための試みには、単純なカチオン性脂質およびインビトロDNAトランスフェクション試薬として開発されたポリマー複合体の使用が含まれる。細胞への核酸の挿入および生物活性の獲得の両方が非常に困難であることが即座に見出された。例えば、輸送のための安定な核酸パッケージを達成することが可能であるが、これが核に核酸を放出するか細胞質にsiRNAを放出する必要性を満たすために調整することが常に簡単というわけではない。また、インビトロで有効な多数のカチオン性脂質およびポリマーは、インビボで投与した場合に活性を保持しない。不運なことに、その理由は依然としてほとんど知られておらず、インビボで活性な複合体を開発するための予測値はほとんど得られていない。RNAを使用した研究は非常に遅れており、今までのところ、siRNAに関心が寄せられたのは最近である。それにもかかわらず、しばしば肺組織をDNA複合体の静脈内投与からトランスフェクトすることができる。ペイロードとしてsiRNAを使用した場合、類似の生物活性が認められている。
最近の研究により、広範な能力を有すると考えられる所定のポリペプチド構造から構成される1つのカチオン性ポリマークラスが同定されている。直鎖形態および分岐形態をカバーする所定の構造を有するこのクラスの多数のメンバーを合成することができ、これらがインビトロおよびインビボの両方で生物活性を付与することが見出されている。これらは、いくつかの核酸型(プラスミドおよびDNAおよびRNAオリゴヌクレオチドを含む)で活性を有することが示されている。このカチオン性ポリマークラスが成功した理由は、特定の構造(分岐を含む)を組み込み、組み合わされたカチオン性を有するポリマーを形成するために硬い塩基と弱塩基との混合物を使用するデザインに起因するようである。完全に天然アミノ酸から構成されているが非天然の分岐を有するこの特定のクラスの別の利点は、その生分解性である。至適化のために使用される少なくとも2つの性質を有するポリマーが得られた場合、siRNAとの有効なコア複合体の形成のための材料の継続的開発を絞り込み、安定性と細胞質への放出とのバランスを取るためのさらなる改良に重点的に取り組むことができる。至適化されたコア形成ポリマーを、他の機能のための基礎材料として使用することができる。
保護的立体コーティング
外部細胞膜に類似した外部脂質二重層を有する均一なリポソームを迅速に認識し、血液から除去する。それにもかかわらず、ウイルス粒子と異なり、ナノ技術は広範な合成ポリマーの化学的性質にアクセスすることができる。PEG、ポリアセタール、およびポリオキサゾリンなどの親水性ポリマーは、コロイド状薬物の送達系(リポソーム、ポリマー、または静電ナノ粒子を問わない)の表面上に「立体」保護層を有効に形成し、血液からの免疫クリアランスを減少することが証明されている。この立体PEG層の使用は最初に開発され、立体的に安定化されたリポソームを使用して最も広範に研究されている。本発明は、立体ポリマーコーティングに加えて、表面電荷の化学的減少などの別のアプローチを提供する。
外部細胞膜に類似した外部脂質二重層を有する均一なリポソームを迅速に認識し、血液から除去する。それにもかかわらず、ウイルス粒子と異なり、ナノ技術は広範な合成ポリマーの化学的性質にアクセスすることができる。PEG、ポリアセタール、およびポリオキサゾリンなどの親水性ポリマーは、コロイド状薬物の送達系(リポソーム、ポリマー、または静電ナノ粒子を問わない)の表面上に「立体」保護層を有効に形成し、血液からの免疫クリアランスを減少することが証明されている。この立体PEG層の使用は最初に開発され、立体的に安定化されたリポソームを使用して最も広範に研究されている。本発明は、立体ポリマーコーティングに加えて、表面電荷の化学的減少などの別のアプローチを提供する。
立体バリアおよび生物学的結果が化学的性質ではなく物理的性質に由来することは強い証拠である。いくつかの他の親水性ポリマーがPEGの代替物として報告されている。立体的に安定化したリポソームについての物理研究により、ポリマー層の物理的挙動のための強い機械的基盤が証明されており、これを使用して他の粒子型に類似のコーティングを行うことができる。しかし、物理研究によって核酸とのポリマー複合体の表面上に類似のポリマー層の形成および類似の生物学的性質の達成が示された一方で、本発明者らは、現在、所望の生物学的性質(血液からの免疫クリアランスからの保護)を正確に予想するために物理的性質を使用するための十分な情報を欠いている。
その物理的性質のばらつきが制御されたナノ粒子複合体の構築およびその生物学的性質の決定がさらに研究されている。多くのリポソーム研究から、生物活性に対して最も大きな影響を及ぼす物理的性質を種々のサイズの2つのポリマーのマトリックスの合成およびグラフト密度によって得ることができることが明らかである。表面立体層の機能が物理的性質に起因する一方で、至適な抱合体の化学的性質は依然として立体ポリマーおよびこれにカップリングするキャリアの特定の化学的性質に依存することに留意されたい。
表面立体ポリマー層を有するナノ粒子の形成方法も関連するパラメーターである。本発明の1つの実施形態は、立体ポリマーをキャリアポリマーにカップリングして核酸と自己アセンブリする抱合体を得て、核酸が立体ポリマー表面層を有するナノ粒子を形成する方法を提供する。別の実施形態は、予め形成したナノ粒子上に表面コーティングを付着させることである。自己アセンブリでは、表面立体層の形成は、キャリアポリマーとペイロードとの相互作用に依存し、粒子表面と反応させるための立体層の形成による浸透に依存しない。この場合、キャリアポリマーが核酸ペイロードと結合する能力に及ぼす立体ポリマーの影響は粒子形成に悪影響を及ぼし得、したがって、表面立体層に悪影響を及ぼし得る
。これが起こる場合、キャリア上の立体ポリマーのグラフト密度は、その最大値を超えるか、構造のグラフティング特性が適切ではない。
。これが起こる場合、キャリア上の立体ポリマーのグラフト密度は、その最大値を超えるか、構造のグラフティング特性が適切ではない。
特定の組織を標的化する表面露呈リガンド
ナノ粒子が選択的に標的細胞の内部に到達する能力は、特定の受容体媒介取り込みを誘導する能力にある。この能力は、本発明において、結合特異性を有する露呈リガンドによって得られる。コロイド送達系の標的化について多くのリガンド型が広範に研究されている一方で、その多くが抗体に依存していた。20年以上前に、リポソーム表面に抗体をカップリングする(通常、免疫リポソームと呼ばれる)という考えが構築された。リガンド密度に影響を及ぼす1つの重要なパラメーターが明らかになっている。広範な研究によってインビトロで良い結果が得られているが、ごく最近になってインビボで肯定的な結果が得られ始めており、現在、小分子薬の送達について臨床開発の段階に到達している。
ナノ粒子が選択的に標的細胞の内部に到達する能力は、特定の受容体媒介取り込みを誘導する能力にある。この能力は、本発明において、結合特異性を有する露呈リガンドによって得られる。コロイド送達系の標的化について多くのリガンド型が広範に研究されている一方で、その多くが抗体に依存していた。20年以上前に、リポソーム表面に抗体をカップリングする(通常、免疫リポソームと呼ばれる)という考えが構築された。リガンド密度に影響を及ぼす1つの重要なパラメーターが明らかになっている。広範な研究によってインビトロで良い結果が得られているが、ごく最近になってインビボで肯定的な結果が得られ始めており、現在、小分子薬の送達について臨床開発の段階に到達している。
抗体は、リガンドとして使用するための多くの要件(良好な結合選択性、ほぼ任意の受容体についてのほぼ日常的な調製、およびナノ粒子型とは無関係のタンパク質結合方法への広い適用性を含む)を満たす傾向がある。モノクローナル抗体でさえ、血液脳関門を通過するための使用の兆候を示す。他方では、これらは理想的ではない。標的化リガンドとして、抗体は非常に巨大なタンパク質(約150Kd)である。化学的カップリングのために過剰なCysアミノ酸残基を導入するか他の固有の部位を同定することができない限り、このことが、特異的配向を得るための抱合を困難にしている。短縮形態(「scFv」など)を使用してサイズを小さくすることができるが、親和性が喪失し得る。
抗体の別の問題のある性質は、その複数の生物活性であり、生物活性の多くが哺乳動物免疫系におけるその役割の一部である抗原結合に関連しないドメインに伝えられる。これらの免疫活性を活用することができるが、この活性はまた、免疫クリアランスを回避するナノ粒子立体層の役割を干渉し得る。天然のリガンドである他のタンパク質も標的化ナノ粒子について考慮されている(トランスフェリン受容体のためのトランスフェリン、第VII因子および第VIIa因子タンパク質ならびにそのフラグメントなど)。これらの薬剤は良好な候補であり得るが、その首尾のよい使用には、特異的カップリング化学、結合活性を喪失しないカップリング、および免疫クリアランスを再導入することのない粒子上の曝露を同定するための相当な努力が必要である。
好ましいリガンドクラスは、内在化受容体に対して強い選択的結合親和性を有する低分子量の化合物である。研究によって、葉酸およびチアミンのようなビタミン、小麦胚凝集素またはe−セクレチンに対するシアリルルイスXのようなポリサッカリド、およびインテグリンに対するRGDのようなペプチド結合ドメインなどの天然の代謝産物が評価された。インビボパニング法を使用した場合でさえ、ファージディスプレイライブラリーを使用して天然または非天然の配列をスクリーニングすることができるので、ペプチドは多用途のリガンドクラスを提供する。このようなファージディスプレイ法により、配列と無関係に容易にカップリングするために1つの末端で非対合Cys残基を保持することができる。新脈管構造へのナノ粒子の標的化送達のためにRGDペプチドを使用した最近のインビボでの成功は、このアプローチが有効なリガンドの主な要件を非常に有効に満たすことができることを示す(リガンド結合を干渉しないか、依然として免疫クリアランスを誘導する特定の化学的性質によって標的細胞での受容体媒介性の選択的取り込みが可能である)。
本発明の好ましい実施形態は、RGD−2Cペプチドリガンド抱合体を含む。RGD−2Cリガンドは、新脈管構造および腫瘍新脈管構造付近の細胞に局在化し、核酸含有ナノ粒子が細胞内に内在化し、核酸が放出されて核酸の有効な生物活性が得られる。
本発明の別の好ましい実施形態は、2つまたはそれを超えるリガンドのリガンド−抱合体の混合物、または2つまたはそれを超えるリガンドの抱合体を含む。本発明の好ましい実施形態は、RGDペプチドリガンドと第VII因子タンパク質またはそのペプチドフラグメントもしくは化学的アナログとの混合物を含む。本発明の別の好ましい実施形態は、RGDペプチドリガンドとリガンド結合e−セクレチンとの混合物を含む。本発明の別の好ましい実施形態は、RGDペプチドリガンドとアポEタンパク質またはそのペプチドリガンドもしくは化学的アナログとの混合物を含む。本発明の別の好ましい実施形態は、RGDペプチドリガンドと腫瘍細胞結合リガンド(葉酸、トランスフェリン、ポルフィリン、bFGF、およびEGFなど)との混合物を含む。本発明の別の好ましい実施形態は、3つまたはそれを超えるこれらのリガンドの混合物を含む。
本発明の好ましい実施形態は、キャリアの1のドメインにおける2つまたはそれを超えるリガンドと該キャリアの第2のドメインにおけるポリアミン薬との抱合体を含む。
本発明の好ましい実施形態は、リガンド抱合体の混合物を含む。リガンド抱合体の混合物は、同一のキャリア薬および任意選択的にキャリアの同一ドメインに抱合したリガンドを含み得るか、またはリガンド抱合体の混合物は、異なるキャリア薬または任意選択的にキャリア薬の異なるドメインに抱合したリガンドを含み得る。リガンド抱合体の混合物は、さらに、保護剤、融合誘導因子、またはキャリア薬(PEGまたはポリアセタール)、pH感受性ポリマー、ポリアミン、またはヒスチジン−リジンコポリマーから構成され得る。
本発明の組成物および方法は、ポリマー、ポリマー抱合体、脂質、ミセル、自己アセンブリコロイド、ナノ粒子、立体的に安定化されたナノ粒子、またはリガンド指向性ナノ粒子を含むRNAiの投与を提供する。WO01/49324号(その全体が本明細書中で参考により援用される)に記載の標的化合成ベクター型を、RNAiを誘導する本発明の核酸の全身送達のために使用することができる。1つの実施形態では、PEI−PEG−RGD(ポリエチレンイミン−ポリエチレングリコール−アルギン−グリシン−アスパラギン酸)合成ベクターを調製し、例えば、WO01/49324号の実施例53および56に記載のように使用することができる。このベクターを使用して、静脈内注射によってRNAiを全身送達した。当業者は、当該分野で公知の他の標的化合成ベクター分子を使用することができることを認識している。例えば、ベクターは、RNAiおよび少なくとも1つの複合体形成試薬を含むコア複合体で構成されている内殻(inner shell)を有し得る。
ベクターはまた、融合誘導部分を含み得る。この融合誘導部分は、コア複合体に固定されているかコア複合体に直接組み込むことができる殻を含み得る。ベクターは、さらに、ベクターを安定化し、タンパク質および細胞への非特異的結合を減少させる外殻(outer shell)部分を有し得る。外殻部分は、親水性ポリマーを含み得、そして/または融合誘導部分に固定することができる。外殻部分を、コア複合体に固定することができる。ベクターは、標的組織および細胞集団へのベクターの結合を増強する標的化部分を含み得る。適切な標的化部分は当該分野で公知であり、WO01/49324号に詳述されている。
a.VEGF経路siRNAを含むRGD標的化ナノ粒子の調製
本発明の1つの実施形態は、抗VEGF経路siRNAの短いdsRNA分子のRGD媒介性リガンド指向性ナノ粒子調製物のための組成物および方法を提供する。図29および30は、siRNAを含むRGD−2C媒介性組織標的化ナノ粒子の製造方法を示す。標的化リガンド、RGD含有ペプチド(ACRGDMFGCA)を、立体ポリマー(ポリエチレングリコールまたは類似の性質を有する他のポリマーなど)に抱合する。このリガ
ンド−立体ポリマー抱合体を、ポリエチレンイミンなどのポリカチオンまたはヒスチジン−リジンコポリマーなどの他の有効な材料にさらに抱合する。抱合体は、共有結合または非共有結合であり得、共有結合は切断不可能であり得るか、加水分解または還元剤などによって切断可能であり得る。ヘテロ二官能性ポリマー(NHS−PEG−VS(市販の試薬(Nektar))など)、製造のために調製されたヘテロ二官能性薬、またはホモ二官能性ポリマー(NHS−PEG−NHS(市販の試薬(Rapp Polymere))など)、または製造のために調製されたホモ二官能性薬を使用して、抱合体を調製することができる。本発明の1つの好ましい実施形態は、ホモ二官能性NHS−PEG−NHS薬(RAPP Polymereから市販されている試薬など)の使用を含み、これを最初に固相合成によって調製したRGD−2Cペプチドとカップリングし、市販のPEIなどのポリアミン含有ポリマーまたは固相合成によって調製したヒスチジン−リジンコポリマーとカップリングする。
本発明の1つの実施形態は、抗VEGF経路siRNAの短いdsRNA分子のRGD媒介性リガンド指向性ナノ粒子調製物のための組成物および方法を提供する。図29および30は、siRNAを含むRGD−2C媒介性組織標的化ナノ粒子の製造方法を示す。標的化リガンド、RGD含有ペプチド(ACRGDMFGCA)を、立体ポリマー(ポリエチレングリコールまたは類似の性質を有する他のポリマーなど)に抱合する。このリガ
ンド−立体ポリマー抱合体を、ポリエチレンイミンなどのポリカチオンまたはヒスチジン−リジンコポリマーなどの他の有効な材料にさらに抱合する。抱合体は、共有結合または非共有結合であり得、共有結合は切断不可能であり得るか、加水分解または還元剤などによって切断可能であり得る。ヘテロ二官能性ポリマー(NHS−PEG−VS(市販の試薬(Nektar))など)、製造のために調製されたヘテロ二官能性薬、またはホモ二官能性ポリマー(NHS−PEG−NHS(市販の試薬(Rapp Polymere))など)、または製造のために調製されたホモ二官能性薬を使用して、抱合体を調製することができる。本発明の1つの好ましい実施形態は、ホモ二官能性NHS−PEG−NHS薬(RAPP Polymereから市販されている試薬など)の使用を含み、これを最初に固相合成によって調製したRGD−2Cペプチドとカップリングし、市販のPEIなどのポリアミン含有ポリマーまたは固相合成によって調製したヒスチジン−リジンコポリマーとカップリングする。
本発明の別の好ましい実施形態は、RGD−PEG−ポリアミン抱合体とポリアミンポリマー(PEIなど)またはヒスチジン−リジンコポリマーとの第1の組み合わせ、および該ポリマー混合物とdsRNAオリゴヌクレオチドの第2の混合物との第2の組み合わせを含む。ポリマー抱合体を含むかポリマー抱合体と他のポリマー、脂質、またはミセルとの混合物を含む溶液(リガンド、立体ポリマー、または融合誘導因子を含む材料など)を、核酸(1つの実施形態では、目的の遺伝子を標的化するsiRNA)を含む溶液と所望の比率で混合してsiRNAを含むナノ粒子を得る。
この実施形態では、ナノ粒子を、ポリマー抱合体および核酸を含む層状ナノ粒子自己アセンブリによって形成する。負電荷の核酸と正電荷のポリマー抱合体セグメントとの間の非共有結合性静電相互作用によって自己アセンブリ過程が駆動されてナノ粒子が形成される。この過程は、核酸を含む一方の溶液をポリマー抱合体を含む別の溶液に添加し、その後に撹拌するか同時に撹拌する2つの溶液の簡潔な混合を含む。1つの実施形態では、混合物中の正電荷の成分と負電荷の成分との比を、各溶液の濃度の適切な調整または溶液の添加体積の調整によって決定する。別の実施形態では、2つの溶液を、スタティックミキサーなどの混合装置を使用して連続流条件下で混合する(図30)。この実施形態では、2つまたはそれを超える溶液を、溶液の流れがスタティックミキサー内で混合される溶液比が得られる比率および圧力でスタティックミキサーに導入する。並行または直列の配置されるようにミキサーを配置することが可能である。
E.処方物の組み合わせおよび電場
一定の適用のために、電場を適用するか適用しないでRNAiを投与することができる。これを使用して、例えば、腫瘍組織への直接的注入および血管形成組織または新脈管構造を有する組織内またはその付近への直接的注入によって本発明のRNAi分子を送達することができる。siRNAは、適切な薬学的キャリア(例えば、生理食塩水または緩衝化生理食塩水など)中に存在し得る。
一定の適用のために、電場を適用するか適用しないでRNAiを投与することができる。これを使用して、例えば、腫瘍組織への直接的注入および血管形成組織または新脈管構造を有する組織内またはその付近への直接的注入によって本発明のRNAi分子を送達することができる。siRNAは、適切な薬学的キャリア(例えば、生理食塩水または緩衝化生理食塩水など)中に存在し得る。
本発明は、概して記載するように、以下の実施例を参照してより容易に理解される。この実施例は、例示を目的として記載され、本発明を制限することを意図しない。
実施例1:VEGFR2を標的化するsiRNA二重鎖とVEGFに対するベバシズマブ(アバスチン)との組み合わせ使用による腫瘍成長阻害
材料と方法
試薬:アバスチン、VEGFに対するモノクローナル抗体(25mg/ml、Genetech);マウスVEGFR2に対するsiRNA、配列
材料と方法
試薬:アバスチン、VEGFに対するモノクローナル抗体(25mg/ml、Genetech);マウスVEGFR2に対するsiRNA、配列
(a) AAGCTCAGCACACAGAAAGAC (配列番号247); (b)AATGCGGCGGTGGTGACAGTA) (配列番号248);
ルシフェラーゼに対するsiRNA(Qiagen);1.5gの2,2,2トリブロモエタノールおよび1.5mlのt−アミルアルコール(カタログ番号T4840−2、カタログ番号24048−6、Aldrich)から作製されたアベルチンを含む100ml蒸留水(St.Louis,MO)。マウス:5〜6週齢の胸腺欠損雌ヌードマウスを、TACONICから購入し、従来どおりに収容した。全ての調査は、Committee on the Care of Laboratory Animals Resources,Commission of Life Sciences,National Research Councilのガイドラインに従った。Biomedical Research Institute in Rockville Marylandの動物施設は、American Association of Laboratory Animal Careによって完全に認可されている。細胞:結腸癌細胞株DLD−1(CCL−221,ATCC)を、L−グルタミン2mM、重炭酸ナトリウム1.5g/L、グルコース4.5g/L、HEPES10mM、およびピルビン酸ナトリウム1.0mM、10%ウシ血清アルブミンを含むRPMI1640培地中で成長させた。
ルシフェラーゼに対するsiRNA(Qiagen);1.5gの2,2,2トリブロモエタノールおよび1.5mlのt−アミルアルコール(カタログ番号T4840−2、カタログ番号24048−6、Aldrich)から作製されたアベルチンを含む100ml蒸留水(St.Louis,MO)。マウス:5〜6週齢の胸腺欠損雌ヌードマウスを、TACONICから購入し、従来どおりに収容した。全ての調査は、Committee on the Care of Laboratory Animals Resources,Commission of Life Sciences,National Research Councilのガイドラインに従った。Biomedical Research Institute in Rockville Marylandの動物施設は、American Association of Laboratory Animal Careによって完全に認可されている。細胞:結腸癌細胞株DLD−1(CCL−221,ATCC)を、L−グルタミン2mM、重炭酸ナトリウム1.5g/L、グルコース4.5g/L、HEPES10mM、およびピルビン酸ナトリウム1.0mM、10%ウシ血清アルブミンを含むRPMI1640培地中で成長させた。
手順:1)コンフルエンス付近のDLD−1細胞を採取し、無血清RPMI培地に再懸濁した。2)0.4ml/マウスのアベルチンを腹腔内に使用してマウスを麻酔した。3)異種移植片腫瘍モデルの確立のために、1億個の細胞を含む無血清RPMI培地0.1mlを、マウスの左横腹に注射した。4)腫瘍細胞の接種から5日後に、成長した腫瘍のサイズをキャリパーを使用して測定した。次いで、マウスを、群あたり8匹の6つの群に無作為にグループ化した。5)実験デザインおよび投与スキームを以下のように行った。6)RPPとの複合体を形成した後に、尾静脈注射によってsiRNAを送達させた。
2.このsiRNAベースの抗血管形成活性(VEGFR2の標的化)は、VEGFモノクローナル抗体(mAb)媒介性抗血管形成を増強し、それにより、腫瘍成長をさらに阻害することができた(図1)。
3.多数の生化学経路が悪性新形成に独立するか集合的に重要であり得るにもかかわらず、血管新生が多くの癌型の成長に重要であると広く認められている。したがって、血管形成過程は、必然的に腫瘍薬開発のための最も標的化される領域の1つとなっている。血
管新生に関与する多数の因子のうち、VEGFは、重要な調節因子であり、アバスチン(結腸癌の成長を阻害することが証明されているVEGFに対するモノクローナル抗体)によって達成される臨床的利点が得られる治療効果を可能にすることができる因子であると考えられている。NV標的化VEGFsiRNA遺伝子阻害の組み合わせは、組み合わせプロトコールで投与した場合、アンタゴニスト治療薬に付加されるという証拠を示す。
管新生に関与する多数の因子のうち、VEGFは、重要な調節因子であり、アバスチン(結腸癌の成長を阻害することが証明されているVEGFに対するモノクローナル抗体)によって達成される臨床的利点が得られる治療効果を可能にすることができる因子であると考えられている。NV標的化VEGFsiRNA遺伝子阻害の組み合わせは、組み合わせプロトコールで投与した場合、アンタゴニスト治療薬に付加されるという証拠を示す。
4.例は、同一の治療レジメンでの遺伝子インヒビターおよびmAbインヒビターなどのアンタゴニストの使用が治療血管を改善するのに非常に有益であることを示す。
5.RT−PCRの結果は、VEGFR2特異的siRNAを送達するナノ粒子で処置した腫瘍サンプル中のVEGFR2mRNAレベルが、未処置腫瘍の発現レベルと比較して劇的に下方制御されたことを直接証明した(図2)。
6.免疫組織化学(IHC分析)は、新脈管構造のマーカーであるVEGFR2およびCD31についてタンパク質レベルのノックダウンが起こったことを示した(図3)。
7.ナノ粒子/VEGFR2siRNA処置のみおよびアバスチンとの組み合わせ由来の血液サンプル中のIFN−α活性についてのELISA測定は、IFN活性の任意の有意な(検出可能な)上方制御または誘導を示さず(図4)、これは、NVの阻害および腫瘍成長の阻害が非特異的インターフェロン媒介効果に起因しないことを示した。
まとめ
本実施例は、本発明が、薬剤が病原遺伝子の発現および病原タンパク質の生物学的機能の両方を阻害し、それにより治療有効性が増強される、同一の治療レジメンでモノクローナル抗体(mAb)と組み合わせた小さな干渉dsRNAオリゴヌクレオチド遺伝子インヒビターを使用した癌治療のための組成物および方法を提供することを示す。さらに、本実施例は、特定の生物経路(例えば、血管形成経路)を有効に阻害し、それにより、疾患の進行を阻害する治療を得るためのリガンド(例えば、VEGF)およびその受容体(例えば、VEGFR2)の両方の同時遮断の実例を提供する。したがって、2つの強力且つ標的化された生物学的インヒビター(RNAiおよびmAb)が寄与する阻害活性の組み合わせ適用は、NV疾患(癌を含む)の有効な治療手段である。
本実施例は、本発明が、薬剤が病原遺伝子の発現および病原タンパク質の生物学的機能の両方を阻害し、それにより治療有効性が増強される、同一の治療レジメンでモノクローナル抗体(mAb)と組み合わせた小さな干渉dsRNAオリゴヌクレオチド遺伝子インヒビターを使用した癌治療のための組成物および方法を提供することを示す。さらに、本実施例は、特定の生物経路(例えば、血管形成経路)を有効に阻害し、それにより、疾患の進行を阻害する治療を得るためのリガンド(例えば、VEGF)およびその受容体(例えば、VEGFR2)の両方の同時遮断の実例を提供する。したがって、2つの強力且つ標的化された生物学的インヒビター(RNAiおよびmAb)が寄与する阻害活性の組み合わせ適用は、NV疾患(癌を含む)の有効な治療手段である。
実施例2.インビトロおよびインビボでのsiRNA媒介性VEGFサイレンシング
ヒトVEGF165特異的siRNAを、リポフェクタミンによってMCF−7/VEGF165細胞(hVEGF過剰発現)にトランスフェクトして、細胞中のhVEGFmRNAをノックダウンした(図2の上のパネル)。エレクトロポレーション手順を使用して、MCF−7/VEGF165細胞をhVEGF165特異的siRNAによってトランスフェクトして、ELISA分析を使用して分析したところ、hVEGF発現を下方制御した。
ヒトVEGF165特異的siRNAを、リポフェクタミンによってMCF−7/VEGF165細胞(hVEGF過剰発現)にトランスフェクトして、細胞中のhVEGFmRNAをノックダウンした(図2の上のパネル)。エレクトロポレーション手順を使用して、MCF−7/VEGF165細胞をhVEGF165特異的siRNAによってトランスフェクトして、ELISA分析を使用して分析したところ、hVEGF発現を下方制御した。
hVEGF165特異的siRNAを腫瘍内投与によって繰り返し送達させた場合、MCF−7/VEGF165細胞誘導性異種移植片腫瘍の成長は有意に阻害された。hVEGFmRNA発現を試験するために腫瘍組織を回収した場合、この発現がRT−PCR分析に基づいて有意に下方制御され、この阻害がさらに確証された。同一のhVEGF165特異的siRNAを使用して、本発明者らはまた、頭頸部扁平上皮癌(HNSCC、1483細胞)異種移植片モデルを使用して、7日間隔での5回の腫瘍内投与によって腫瘍成長阻害を証明することができた。各注射には、10μgの特異的siRNAを含む15〜30μLの無RNアーゼ水溶液が必要である。
実施例3.25塩基対の平滑末端化二本鎖siRNAは、標的遺伝子発現のサイレンシ
ングにおいて、3’オーバーハングを有する標準的な19塩基対のsiRNAよりも強力である。
ングにおいて、3’オーバーハングを有する標準的な19塩基対のsiRNAよりも強力である。
1つのインビトロsiRNAトランスフェクション研究では、エレクトロポレーション媒介トランスフェクション法を使用して、ヒトVEGF(hVEGF)を過剰発現するMCF/165乳癌細胞を、25塩基対の平滑末端化二本鎖siRNA(hVEGF−25−siRNA−a、hVEGF−25−siRNA−b、hVEGF−25−siRNA−c、Luc−25−siRNA)または3’オーバーハングを有する19塩基対のsiRNA(hVEGF−siRNA−a、GFP−siRNA−a)でトランスフェクトした。4×106個のMCF7/165細胞を、siRNA5μgと混合した200μlのsiPORTsiRNAエレクトロポレーション緩衝液(Ambion)に再懸濁し、Electro Square Porator ECM830(BTX,Fisher Scientific)を使用したエレクトロポレーション処理に供した。エレクトロポレーションのパラメーターは以下である:電圧500v、持続時間60μs、パルス数2、パルス間隔1秒。トランスフェクトした細胞を、24ウェルプレートに5×104細胞/ウェルの密度で播種し、37℃のインキュベーターにて5%CO2で培養した。トランスフェクションから24時間後、各ウェル由来の培養培地を採取し、培地中のヒトVEGFタンパク質濃度を、市販のhVEGF EKISAキット(R&D Systems)を使用して測定した。
標準的な19塩基対のhVEGFsiRNA処置細胞よりも25塩基対のhVEGF−siRNA処置細胞の方が有意により強いhVEGF標的遺伝子阻害が認められた。標準的な19塩基対のhVEGF−siRNA−aでトランスフェクトした細胞で認められる約60%のhVEGFタンパク質の減少と比較して、siRNAトランスフェクションから24時間後の25塩基対の平滑末端化二本鎖hVEGF−25−siRNA分子でトランスフェクトした細胞の培養培地中の75%を超える分泌hVEGFタンパク質が減少した。非特異的配列コントロールである25塩基対の平滑末端化二本鎖siRNA(Luc−25−siRNA)または3’オーバーハングを有する標準的なGFP−siRNAは、同一のsiRNAトランスフェクション条件下でVEGF発現に影響を及ぼさなかった(図7)。
実施例4.25塩基対の平滑末端化二本酸siRNAは、標的遺伝子サイレンシングの延長を媒介した
別の1つのインビトロsiRNAトランスフェクション研究では、エレクトロポレーション媒介トランスフェクション法を使用して、ヒトVEGF(hVEGF)を過剰発現するMCF/165乳癌細胞を、25塩基対の平滑末端化二本鎖siRNA(hVEGF−25−siRNA−a、hVEGF−25−siRNA−b、hVEGF−25−siRNA−c、Luc−25−siRNA)または3’オーバーハングを有する19塩基対のsiRNA(hVEGF−siRNA−a、GFP−siRNA−a)でトランスフェクトした。4×106個のMCF7/165細胞を、2μgまたは5μgのsiRNAと混合した200μlのsiPORTsiRNAエレクトロポレーション緩衝液(Ambion)に再懸濁し、Electro Square Porator ECM830(BTX,Fisher Scientific)を使用したエレクトロポレーション処理に供した。エレクトロポレーションのパラメーターは以下である:電圧500v、持続時間60μs、パルス数2、パルス間隔1秒。トランスフェクトした細胞を、24ウェルプレートに5×104細胞/ウェルの密度で播種し、37℃のインキュベーターにて5%CO2で培養した。トランスフェクションから24時間後、48時間後、72時間後、96時間後、および120時間後、各ウェル由来の培養培地を採取し、新鮮な培養培地と置換した。種々の時点で採取した培地中のヒトVEGFタンパク質濃度を、市販のhVEGF EKISAキット(R&D Systems)を使用して測定した。siRNA媒介性hV
EGFノックダウンを、各非特異的コントロールsiRNAで処置した細胞中で測定したhVEGFタンパク質レベルを使用して正規化した。
別の1つのインビトロsiRNAトランスフェクション研究では、エレクトロポレーション媒介トランスフェクション法を使用して、ヒトVEGF(hVEGF)を過剰発現するMCF/165乳癌細胞を、25塩基対の平滑末端化二本鎖siRNA(hVEGF−25−siRNA−a、hVEGF−25−siRNA−b、hVEGF−25−siRNA−c、Luc−25−siRNA)または3’オーバーハングを有する19塩基対のsiRNA(hVEGF−siRNA−a、GFP−siRNA−a)でトランスフェクトした。4×106個のMCF7/165細胞を、2μgまたは5μgのsiRNAと混合した200μlのsiPORTsiRNAエレクトロポレーション緩衝液(Ambion)に再懸濁し、Electro Square Porator ECM830(BTX,Fisher Scientific)を使用したエレクトロポレーション処理に供した。エレクトロポレーションのパラメーターは以下である:電圧500v、持続時間60μs、パルス数2、パルス間隔1秒。トランスフェクトした細胞を、24ウェルプレートに5×104細胞/ウェルの密度で播種し、37℃のインキュベーターにて5%CO2で培養した。トランスフェクションから24時間後、48時間後、72時間後、96時間後、および120時間後、各ウェル由来の培養培地を採取し、新鮮な培養培地と置換した。種々の時点で採取した培地中のヒトVEGFタンパク質濃度を、市販のhVEGF EKISAキット(R&D Systems)を使用して測定した。siRNA媒介性hV
EGFノックダウンを、各非特異的コントロールsiRNAで処置した細胞中で測定したhVEGFタンパク質レベルを使用して正規化した。
試験した各時点での標準的な19塩基対のhVEGFsiRNA処置細胞よりも25塩基対のhVEGF−siRNA処置細胞の方が有意により強く延長されたhVEGF標的遺伝子阻害が認められた。siRNA処置から120時間後に、5μgの標準的な19塩基対のhVEGF−siRNA−aでトランスフェクトした細胞で認められる20%未満のhVEGFタンパク質の減少と比較して、5μgの25塩基対の平滑末端化二本鎖hVEGF−25−siRNA分子でトランスフェクトした細胞の培養培地中の60%を超える分泌hVEGFタンパク質が減少した(図8)。25塩基対の平滑末端化二本鎖hVEGF−25−siRNA分子について用量依存性siRNA媒介性hVEGF遺伝子阻害も認められた。
本発明者らの所見に基づいて、25塩基対の平滑末端化二本鎖hVEGF−25−siRNA分子によってより強く標的VEGF遺伝子が阻害されるだけでなく、有効な標的VEGF遺伝子阻害が有意により長く持続する。例えば、5μgの標準的な19塩基対のhVEGFsiRNAを使用して達成されるたった48時間での60%を超えるhVEGFタンパク質の減少と比較して、25塩基対の平滑末端化二本鎖hVEGFsiRNAを使用して少なくとも120時間の60%を超えるタンパク質が減少した。したがって、25塩基対の平滑末端化二本鎖siRNAは、より有意な治療有効性を得ることができるより強力な標的遺伝子インヒビターである。
さらなる情報には、以下が含まれる。(1)Luc−25−siRNAは、
(センス鎖 5’−rGGAACCGCUGGAGAGCAACUGCAUA−3’ (配列番号249)およびアンチセンス鎖 5’−rCCUUGGCGACCUCUCGUUGACGUAU−3’(配列番号250))
の配列を有する。(2)hVEGF−siRNA−aは、
の配列を有する。(2)hVEGF−siRNA−aは、
(センス鎖, 5’−rUCGAGACCCUGGUGGACAUdTT−3’ (配列番号251)およびアンチセンス鎖, 5’−rAUGUCCACCAGGGUCUCGAdTT−3’(配列番号252))
の配列を有する。(3)GFP−siRNAは、
の配列を有する。(3)GFP−siRNAは、
(センス鎖, 5’−rGCUGACCCUGAAGUUCAUCdTT−3’ (配列番号253)および(アンチセンス鎖, 5’−rGAUGAACUUCAGGGUCAGCdTT−3’(配列番号254))
の配列を有する。(4)hVEGF−25−siRNA−c:
の配列を有する。(4)hVEGF−25−siRNA−c:
5’−r(CCAAGUGAUUGAAGCAGAUGCCUUU)−3’ (配列番号255)
実施例5.25塩基対の平滑末端化二本鎖siRNAは、インビトロでヒトVEGFR1発現およびVEGFR2発現を有効にノックダウンする
ヒトVEGFR1を特異的に標的化する3つの25塩基対の平滑末端化二本鎖siRN
Aを、エレクトロポレーションによってHUVEC細胞中にトランスフェクトした。膜結合VEGFR1およびVEGFR1の遊離細胞外フラグメントを、ELISAアッセイによってトランスフェクションから96時間後に測定した。VEGFR1−siRNA二重鎖は、細胞培養上清液中の細胞溶解タンパク質および遊離フラグメントの両方について、2つの他のsiRNAと比較して、最も強いVEGFR1サイレンシング活性を示した(図9および10)。ヒトVEGFR2遺伝子を標的化する3つの25塩基対の平滑末端化二本鎖siRNAを評価するための同一のアプローチを使用した場合、本発明者らは、3つ全ての二重鎖が、トランスフェクション時点から24時間後および72時間後の両方で強いサイレンシング活性を示すことを見出した(図11)。
実施例5.25塩基対の平滑末端化二本鎖siRNAは、インビトロでヒトVEGFR1発現およびVEGFR2発現を有効にノックダウンする
ヒトVEGFR1を特異的に標的化する3つの25塩基対の平滑末端化二本鎖siRN
Aを、エレクトロポレーションによってHUVEC細胞中にトランスフェクトした。膜結合VEGFR1およびVEGFR1の遊離細胞外フラグメントを、ELISAアッセイによってトランスフェクションから96時間後に測定した。VEGFR1−siRNA二重鎖は、細胞培養上清液中の細胞溶解タンパク質および遊離フラグメントの両方について、2つの他のsiRNAと比較して、最も強いVEGFR1サイレンシング活性を示した(図9および10)。ヒトVEGFR2遺伝子を標的化する3つの25塩基対の平滑末端化二本鎖siRNAを評価するための同一のアプローチを使用した場合、本発明者らは、3つ全ての二重鎖が、トランスフェクション時点から24時間後および72時間後の両方で強いサイレンシング活性を示すことを見出した(図11)。
実施例6.25塩基対の平滑末端化二本鎖siRNAは、MDA−MB−435異種移植片腫瘍において強い抗腫瘍有効性を媒介した
ヒトVEGF165遺伝子配列を標的化する25塩基長のsiRNA二重鎖は、VEGFおよびbFGFタンパク質発現が高いことが公知のMDA−MB−435乳癌細胞株を使用して、5日毎に10μgの3回の反復腫瘍内投与後に(図12)、強い腫瘍成長阻害活性が証明された。
ヒトVEGF165遺伝子配列を標的化する25塩基長のsiRNA二重鎖は、VEGFおよびbFGFタンパク質発現が高いことが公知のMDA−MB−435乳癌細胞株を使用して、5日毎に10μgの3回の反復腫瘍内投与後に(図12)、強い腫瘍成長阻害活性が証明された。
実施例7.HSV誘導性眼新血管形成モデルにおいて、VEGF遺伝子、VEGFR1遺伝子、およびVEGFR1遺伝子を標的化するsiRNAカクテルは、これらの遺伝子の1つのみを標的化各siRNAのいずれよりも強力である
最近、本発明者らは、動物疾患モデルにおいて、VEGF、VEGFR1、およびVEGFR2を標的化するsiRNAを含むsiRNAカクテルがこれらの遺伝子の1つのみを標的化するsiRNAよりも強い抗血管形成有効性を達成することができることを証明した。このアプローチを使用して、本発明者らは、病理学的血管形成で重要な役割を果たすVEGF経路を有効に遮断することができた(図13)。
最近、本発明者らは、動物疾患モデルにおいて、VEGF、VEGFR1、およびVEGFR2を標的化するsiRNAを含むsiRNAカクテルがこれらの遺伝子の1つのみを標的化するsiRNAよりも強い抗血管形成有効性を達成することができることを証明した。このアプローチを使用して、本発明者らは、病理学的血管形成で重要な役割を果たすVEGF経路を有効に遮断することができた(図13)。
豊富な潜在的に生物活性を示すCpG含有モチーフを含むHSV DNAは、強力な血管形成因子である血管内皮成長因子(VEGF)を誘導することができ、抗体でのVEGFの中和によってHSV誘導性血管形成が最小化された。生物活性CpG含有オリゴデオキシヌクレオチド(ODN)がVEGFの誘導を介して新血管形成を誘導することも示す都合の良いモデルも確立した。このモデルは、RNA干渉(RNAi)がVEGFの発現および反応性を抑制する治療的可能性を評価するために本研究で使用される。
材料および方法
試薬
ホスホロチオエートODNは、Dennis M.Klinman(Biologies Evaluation and Research,Food and Drug Administration,Washington,DC)から提供された。本研究で使用した刺激ODNの配列は、
試薬
ホスホロチオエートODNは、Dennis M.Klinman(Biologies Evaluation and Research,Food and Drug Administration,Washington,DC)から提供された。本研究で使用した刺激ODNの配列は、
1466, TCAACGTTGA (配列番号256)、および1555, GCTAGACGTTAGCGT (配列番号257)
であった。その後、ODN1466と1555との等モル混合物を使用して研究を行った。遺伝子標的およびsiRNAの分子デザイン。3つのmVEGF経路因子(mVEGFAおよび2つのmVEGF受容体(mVEGFR1およびmVEGFR2))を、RNAiによって標的化した。各遺伝子標的のために、2つの標的配列を、同一のmRNA場の異なる位置に割り当てた。上記標的配列に対応するsiRNAをデザインした。これらのsiRNAを、Tuschl.14,15によって提案されたガイドラインに従ってデザインした。デザインしたsiRNA(センス鎖およびアンチセンス鎖の二重鎖)を、Qiagen(Valencia,CA)によって合成した。全てのsiRNAは、3’末端に2つのヌクレオチド(TT)オーバーハングを有する21ヌクレオチド長の二本鎖RNAオリゴであった。mVEGFAの標的化配列は、
であった。その後、ODN1466と1555との等モル混合物を使用して研究を行った。遺伝子標的およびsiRNAの分子デザイン。3つのmVEGF経路因子(mVEGFAおよび2つのmVEGF受容体(mVEGFR1およびmVEGFR2))を、RNAiによって標的化した。各遺伝子標的のために、2つの標的配列を、同一のmRNA場の異なる位置に割り当てた。上記標的配列に対応するsiRNAをデザインした。これらのsiRNAを、Tuschl.14,15によって提案されたガイドラインに従ってデザインした。デザインしたsiRNA(センス鎖およびアンチセンス鎖の二重鎖)を、Qiagen(Valencia,CA)によって合成した。全てのsiRNAは、3’末端に2つのヌクレオチド(TT)オーバーハングを有する21ヌクレオチド長の二本鎖RNAオリゴであった。mVEGFAの標的化配列は、
(a) AAGCCGTCCTGTGTGCCGCTG (配列番号258)および(b) AACGATGAAGCCCTGGAGTGC (配列番号259)
であった。
であった。
mVEGFR1の標的化配列は、
(a) AAGTTAAAAGTGCCTGAACTG (配列番号260)および
(b) AAGCAGGCCAGACTCTCTTTC (配列番号261)
であった。mVEGFR2の標的化配列は、
(b) AAGCAGGCCAGACTCTCTTTC (配列番号261)
であった。mVEGFR2の標的化配列は、
(a) AAGCTCAGCACACAGAAAGAC (配列番号262)および (b) ATGCGGCGGTGGTGACAGTA (配列番号263)
であった。非関連siRNAコントロール(それぞれLacZおよびホタルルシフェラーゼの2つの標的配列)の合成を使用した。これらは、
であった。非関連siRNAコントロール(それぞれLacZおよびホタルルシフェラーゼの2つの標的配列)の合成を使用した。これらは、
LacZ (a) AACAGTTGCGCAGCCTGAATG (配列番号264)および(b)AACTTAATCGCCTTGCAGCAC (配列番号265)、
Luc (a)AAGCTATGAAACGATATGGGC (配列番号266)および(b) AACCGCTGGAGAGCAACTGCA (配列番号267)
であった。各siRNAのためにaとbとの等モル混合物を使用して、その後の研究を行った。
Luc (a)AAGCTATGAAACGATATGGGC (配列番号266)および(b) AACCGCTGGAGAGCAACTGCA (配列番号267)
であった。各siRNAのためにaとbとの等モル混合物を使用して、その後の研究を行った。
マウス:5〜6週齢の雌BALB/cマウス(H−2d)を、Harlan Sprague−Dawley(Indianapolis,IN)から購入し、従来通りに収容した。全ての調査は、Committee on the Care of Laboratory Animals Resources,Commission of Life Sciences,National Research Councilのガイドラインに従った。University of Tennessee(Knoxville,TN)の動物施設は、American Association of Laboratory Animal Careによって完全に認可されている。
ウイルス:HSV−IのRE(Dr.Robert Lausch,University of Alabama,Mobile,ALから寄贈)を、全手順で使用した。ウイルスを、ベロ細胞単層(カタログ番号CCL81;American Type Culture Collection,Manassas,VA)で成長させ、滴定し、使用するまで80℃にてアリコートで保存した。
siRNAのインビトロ有効性
インビトロでのRNAiの有効を試験するために、以下の細胞株を使用した。RAW2
64.7γNO細胞(CRL−2278,ATCC)を使用して、これらの細胞中に自発的に発現されるVEGFA遺伝子のsiVEGFA特異的ノックダウンの有効性を試験した。細胞を、10%ウシ胎児血清を含むRPMIを含む6ウェルプレートに、5%CO2にて37℃で一晩プレートした。細胞プレーティングの翌日に、細胞を、リポフェクタミン2000(Invitrogen,Carlsbad,CA)を使用して、異なる濃度のsiVEGFAまたはsiLuc(それぞれ、0.0.1、0.5、1.0、または2.0μg/ml/ウェル)でトランスフェクトした。24時間後、逆転写酵素−ポリメラーゼRNA抽出およびRT−PCRのために、これらの細胞からRNAを抽出した。SVR細胞(CRL−2280,ATCC)を使用して、これらの細胞上で構成性に発現するVEGFR1遺伝子のsiVEGFR1特異的ノックダウンの有効性を試験した。細胞を、5%ウシ胎児血清を含むダルベッコ改変イーグル培地を含む6ウェルプレートプレートに、5%CO2にて37℃で一晩プレートした。細胞プレーティングの翌日に、細胞を、リポフェクタミン2000を使用して、異なる濃度のsiVEGFR1またはsiLuc(それぞれ、0、0.1、0.5、または1.0μg/ml/ウェル)でトランスフェクトした。48時間後、RSPCRのためにこれらの細胞からRNAを抽出して、VEGFR1を検出した(RNA抽出およびNATemplat特異的PCR(RS−PCR)を参照のこと)。293細胞(CRL−1573,ATCC)を使用して、外因性mVEGFR2のノックダウンの検出のためにmVEGFR2発現プラスミドでトランスフェクトした。細胞を、5%ウシ胎児血清を含むダルベッコ改変イーグル培地を含む6ウェルプレートプレートに、5%CO2にて37℃で一晩プレートした。細胞プレーティングの翌日に、細胞を、リポフェクタミン2000を使用して、プラスミドpCI−VEGFR2(0.2μg/2ml/ウェル)およびsiVEGFR2(a、b、a_b)またはsiLuc(それぞれ、0、0.1、0.5、または1.0μg/ウェル)で同時トランスフェクトした。48時間後、RS−PCRのためにこれらの細胞からRNAを抽出して、VEGFR2を検出した。
インビトロでのRNAiの有効を試験するために、以下の細胞株を使用した。RAW2
64.7γNO細胞(CRL−2278,ATCC)を使用して、これらの細胞中に自発的に発現されるVEGFA遺伝子のsiVEGFA特異的ノックダウンの有効性を試験した。細胞を、10%ウシ胎児血清を含むRPMIを含む6ウェルプレートに、5%CO2にて37℃で一晩プレートした。細胞プレーティングの翌日に、細胞を、リポフェクタミン2000(Invitrogen,Carlsbad,CA)を使用して、異なる濃度のsiVEGFAまたはsiLuc(それぞれ、0.0.1、0.5、1.0、または2.0μg/ml/ウェル)でトランスフェクトした。24時間後、逆転写酵素−ポリメラーゼRNA抽出およびRT−PCRのために、これらの細胞からRNAを抽出した。SVR細胞(CRL−2280,ATCC)を使用して、これらの細胞上で構成性に発現するVEGFR1遺伝子のsiVEGFR1特異的ノックダウンの有効性を試験した。細胞を、5%ウシ胎児血清を含むダルベッコ改変イーグル培地を含む6ウェルプレートプレートに、5%CO2にて37℃で一晩プレートした。細胞プレーティングの翌日に、細胞を、リポフェクタミン2000を使用して、異なる濃度のsiVEGFR1またはsiLuc(それぞれ、0、0.1、0.5、または1.0μg/ml/ウェル)でトランスフェクトした。48時間後、RSPCRのためにこれらの細胞からRNAを抽出して、VEGFR1を検出した(RNA抽出およびNATemplat特異的PCR(RS−PCR)を参照のこと)。293細胞(CRL−1573,ATCC)を使用して、外因性mVEGFR2のノックダウンの検出のためにmVEGFR2発現プラスミドでトランスフェクトした。細胞を、5%ウシ胎児血清を含むダルベッコ改変イーグル培地を含む6ウェルプレートプレートに、5%CO2にて37℃で一晩プレートした。細胞プレーティングの翌日に、細胞を、リポフェクタミン2000を使用して、プラスミドpCI−VEGFR2(0.2μg/2ml/ウェル)およびsiVEGFR2(a、b、a_b)またはsiLuc(それぞれ、0、0.1、0.5、または1.0μg/ウェル)で同時トランスフェクトした。48時間後、RS−PCRのためにこれらの細胞からRNAを抽出して、VEGFR2を検出した。
角膜マイクロポケットアッセイ
本研究で使用した角膜マイクロポケットアッセイは、Kenyon and colleaguesの一般的プロトコールを遵守した。角膜に挿入するためのペレットを、既知量のCpGODN、スクラルフェート(10mg,Bulch Meditec,Vaerlose,Denmark)、およびハイドロンポリマーを含むエタノール(120mg/1mlエタノール;Interferon Sciences,New Brunswick,NJ)を組み合わせ、15mm2の合成メッシュ片(Sefar America,Inc.,Kansas City,MO)に適用することによって作製した。混合物を風乾し、メッシュの繊維をバラバラにして、CpG ODNを含むペレットを得た。立体顕微鏡(Leica Microsytems,Wetzlar,Germany)下でマイクロポケットを作製し(群あたり4つの眼)、CpG ODNを含むペレットをマイクロポケットに挿入した。ペレット移植から4日後および7日後に、立体顕微鏡下でキャリパー(Biomedical Research Instruments,Rockville,MD)を使用して血管形成を評価した。新血管の長さは角膜輪部の血管の輪から角膜の中心に向かって発生しており、新血管の幅を測定し、クロックアワー(clock hour)で示した。4つの各クロックアワーは、この環境で30°に等しい。楕円公式に従って血管形成領域を計算した。
本研究で使用した角膜マイクロポケットアッセイは、Kenyon and colleaguesの一般的プロトコールを遵守した。角膜に挿入するためのペレットを、既知量のCpGODN、スクラルフェート(10mg,Bulch Meditec,Vaerlose,Denmark)、およびハイドロンポリマーを含むエタノール(120mg/1mlエタノール;Interferon Sciences,New Brunswick,NJ)を組み合わせ、15mm2の合成メッシュ片(Sefar America,Inc.,Kansas City,MO)に適用することによって作製した。混合物を風乾し、メッシュの繊維をバラバラにして、CpG ODNを含むペレットを得た。立体顕微鏡(Leica Microsytems,Wetzlar,Germany)下でマイクロポケットを作製し(群あたり4つの眼)、CpG ODNを含むペレットをマイクロポケットに挿入した。ペレット移植から4日後および7日後に、立体顕微鏡下でキャリパー(Biomedical Research Instruments,Rockville,MD)を使用して血管形成を評価した。新血管の長さは角膜輪部の血管の輪から角膜の中心に向かって発生しており、新血管の幅を測定し、クロックアワー(clock hour)で示した。4つの各クロックアワーは、この環境で30°に等しい。楕円公式に従って血管形成領域を計算した。
siRNAのインビボ送達
ペレット移植から4日後および7日後に角膜輪部をモニタリングした。ペレット移植から4日後に、コントロールsiLacZで得られた阻害と比較して、3つ全ての試験siRNAを使用して角膜新血管形成が有意に阻害された(p<0.05)。3つの試験したsiRNAの組み合わせは、最も有効なインヒビターであり、新血管形成が約60%減少した(p<0.01)。
ペレット移植から4日後および7日後に角膜輪部をモニタリングした。ペレット移植から4日後に、コントロールsiLacZで得られた阻害と比較して、3つ全ての試験siRNAを使用して角膜新血管形成が有意に阻害された(p<0.05)。3つの試験したsiRNAの組み合わせは、最も有効なインヒビターであり、新血管形成が約60%減少した(p<0.01)。
VEGF経路遺伝子を標的化するsiRNAの全身送達によるCpG誘導性新血管形成の阻害
各標的化siRNAの抗血管形成効果および全身siRNA送達の有効性を試験するために、ペレット移植から6時間後および24時間後に、CpG ODN含有マイクロポケットを有するマウスに、siVEGFA、siVEGFR1、siVEGFR2、これら3つの混合物、またはコントロールsiLacZを含む40μgのsiRNAを静脈内(i.v.)に単回投与した。これらの実験では、腫瘍血管形成に関する以前の研究でsiRNAの血管外送達を促進することが示されたポリマー(「Targetran」)を使用した。ペレット移植から4日後および7日後に、血管形成範囲を測定した。使用した全試薬は、それぞれ、ペレット移植から4日後に、siLacZ処置群と比較して、新血管形成の有意な阻害が誘導された(p<0.05)。局所投与で認められるように、3つの試験試薬の混合物により、最も有効なインヒビターが得られた(平均40%阻害、p<0.01)。さらなる実験では、ポリマービヒクル(vehicle)の機能を、ポリマー中に溶解するかPBS中に溶解した試験混合物の抗新血管形成活性の比較によって評価した。これらの実験により、結果は初期の試験期間でのみ有意であったが(p<0.05)、ポリマービヒクルの使用によってPBSビヒクルを使用した場合よりも抗新血管形成が有効であることが明らかとなった。この結果は、VEGF系遺伝子を標的化するsiRNAの静脈内投与によって眼の新血管形成を調節することができ、RGD媒介性dsRNAナノ粒子送達の使用によって治療効果の有効性が増強されることを証明する。
各標的化siRNAの抗血管形成効果および全身siRNA送達の有効性を試験するために、ペレット移植から6時間後および24時間後に、CpG ODN含有マイクロポケットを有するマウスに、siVEGFA、siVEGFR1、siVEGFR2、これら3つの混合物、またはコントロールsiLacZを含む40μgのsiRNAを静脈内(i.v.)に単回投与した。これらの実験では、腫瘍血管形成に関する以前の研究でsiRNAの血管外送達を促進することが示されたポリマー(「Targetran」)を使用した。ペレット移植から4日後および7日後に、血管形成範囲を測定した。使用した全試薬は、それぞれ、ペレット移植から4日後に、siLacZ処置群と比較して、新血管形成の有意な阻害が誘導された(p<0.05)。局所投与で認められるように、3つの試験試薬の混合物により、最も有効なインヒビターが得られた(平均40%阻害、p<0.01)。さらなる実験では、ポリマービヒクル(vehicle)の機能を、ポリマー中に溶解するかPBS中に溶解した試験混合物の抗新血管形成活性の比較によって評価した。これらの実験により、結果は初期の試験期間でのみ有意であったが(p<0.05)、ポリマービヒクルの使用によってPBSビヒクルを使用した場合よりも抗新血管形成が有効であることが明らかとなった。この結果は、VEGF系遺伝子を標的化するsiRNAの静脈内投与によって眼の新血管形成を調節することができ、RGD媒介性dsRNAナノ粒子送達の使用によって治療効果の有効性が増強されることを証明する。
全身送達におけるsiRNAの有効な抗血管形成用量を決定するために、ペレット移植から6時間後および24時間後に、CpG ODN含有マイクロポケットを有するマウスに、siVEGFA、siVEGFR1、siVEGFR2、またはコントロールsiLacZとTargeTranビヒクルとの混合物を含む10、20、40、80μgのsiRNAを静脈内に単回投与した。siRNAの投与により、用量依存様式で、CpG誘導性血管形成が阻害された。
HSKモデルにおけるVEGF経路遺伝子に対するsiRNAの治療的適用
以前の研究は、HSKモデルにおいてVEGFがHSV特異的血管形成の誘導に重要な血管形成因子であることを示した。VEGF経路遺伝子を標的化するsiRNAの投与がHSKの発症を阻害するかどうかを評価するために、マウスの角膜表面を傷付け、1×105個のHSV−1REを感染させた。次いで、ウイルス感染から1日後および3日後に、マウスに、ポリマービヒクルとのsiRNAの10μg(局所送達のための結膜下注射)または40μg(全身送達のための尾静脈注射)の混合物(siVEGFA、siVEGFR1、およびsiVEGFR2の等モル混合物)を単回投与した。図4に示すように、siLucコントロールで処置した動物と比較して、VEGF経路遺伝子を標的化するsiRNAで局所または全身に処置したマウスで血管形成およびHSKの重症度が有意に減少した(p<0.05)。80%lのsiLucコントロール処置した眼が臨床的に明らかな病変(感染後(p.i.)の10日目にスコア2またはそれを超える)を発症した一方で、VEGF経路遺伝子を標的化するsiRNAで処置した眼は、このような病変を42%(局所送達)または50%(全身送達)しか発症しなかった。さらに、感染後10日目までに、12のコントロール眼の9つで血管形成スコアが6より高いが、局所送達または全身送達のいずれかによってVEGF経路遺伝子に対するsiRNAで処置したマウスでは、12の眼のうちの5つのみが6より高かった。まとめると、これらの結果は、VEGF経路遺伝子に対するsiRNAの投与が血管形成の阻害によってHSKの発症を減少させることを示す。
以前の研究は、HSKモデルにおいてVEGFがHSV特異的血管形成の誘導に重要な血管形成因子であることを示した。VEGF経路遺伝子を標的化するsiRNAの投与がHSKの発症を阻害するかどうかを評価するために、マウスの角膜表面を傷付け、1×105個のHSV−1REを感染させた。次いで、ウイルス感染から1日後および3日後に、マウスに、ポリマービヒクルとのsiRNAの10μg(局所送達のための結膜下注射)または40μg(全身送達のための尾静脈注射)の混合物(siVEGFA、siVEGFR1、およびsiVEGFR2の等モル混合物)を単回投与した。図4に示すように、siLucコントロールで処置した動物と比較して、VEGF経路遺伝子を標的化するsiRNAで局所または全身に処置したマウスで血管形成およびHSKの重症度が有意に減少した(p<0.05)。80%lのsiLucコントロール処置した眼が臨床的に明らかな病変(感染後(p.i.)の10日目にスコア2またはそれを超える)を発症した一方で、VEGF経路遺伝子を標的化するsiRNAで処置した眼は、このような病変を42%(局所送達)または50%(全身送達)しか発症しなかった。さらに、感染後10日目までに、12のコントロール眼の9つで血管形成スコアが6より高いが、局所送達または全身送達のいずれかによってVEGF経路遺伝子に対するsiRNAで処置したマウスでは、12の眼のうちの5つのみが6より高かった。まとめると、これらの結果は、VEGF経路遺伝子に対するsiRNAの投与が血管形成の阻害によってHSKの発症を減少させることを示す。
実施例8.VEGF、VEGFR1、およびVEGFR1を標的化するsiRNAカクテルは、ROP眼新血管形成モデルにおける非常に強い抗血管形成薬である
眼の新血管形成は、種々の疾患に関連し、視力が著しく低下し、最終的に失明する。これらの障害のうち、糖尿病性網膜症(DR)、加齢性黄斑変性(AMD)、網膜静脈閉塞(RVO)、および未熟児網膜症(ROP)が一般的である。刺激因子と阻害因子との不均衡によってNV(NV)を生じ、血管内皮成長因子(VEGF)は、血管の透過性、膨張、および内皮細胞移動、増殖を引き起こす刺激因子のうちの最も重要な因子である(1)。
眼の新血管形成は、種々の疾患に関連し、視力が著しく低下し、最終的に失明する。これらの障害のうち、糖尿病性網膜症(DR)、加齢性黄斑変性(AMD)、網膜静脈閉塞(RVO)、および未熟児網膜症(ROP)が一般的である。刺激因子と阻害因子との不均衡によってNV(NV)を生じ、血管内皮成長因子(VEGF)は、血管の透過性、膨張、および内皮細胞移動、増殖を引き起こす刺激因子のうちの最も重要な因子である(1)。
RNA干渉(RNAi)は、標的化遺伝子に順に相同な二本鎖RNA(dsRNA)によって開始される広範な生物に置ける配列特異的転写後遺伝子サイレンシング過程である。本実施例では、VEGF経路を標的化する小さな干渉dsRNAオリゴヌクレオチド(siRNA)を使用して、酸素誘導性網膜症によって誘導されるNVを阻害した。
材料および方法
siRNAのデザインおよび合成
siRNAは、Intradigm Corporationから寄贈された。3つのmVEGF経路因子(mVEGFAおよび2つのmVEGF受容体(mVEGFR1およびmVEGFR2))を、RNAiによって標的化し、これをsiMixと呼んだ。コントロールとしてルシフェラーゼを標的化するsiRNAを、siLucと呼んだ。
siRNAのデザインおよび合成
siRNAは、Intradigm Corporationから寄贈された。3つのmVEGF経路因子(mVEGFAおよび2つのmVEGF受容体(mVEGFR1およびmVEGFR2))を、RNAiによって標的化し、これをsiMixと呼んだ。コントロールとしてルシフェラーゼを標的化するsiRNAを、siLucと呼んだ。
酸素誘導性網膜新血管形成のマウスモデル
本発明者ら(Smithら(2))が使用したモデルは、未熟児網膜症を模倣している。生後7日目(P7)に、マウスおよびその母親を、最終酸素画分が75□±2%になるように酸素と空気との混合物によって通気した密閉インキュベーター(自家製)に入れた。酸素レベルを、1日に少なくとも3回チェックした。P12に、マウスを大気に戻した。P17に、動物を屠殺した。
本発明者ら(Smithら(2))が使用したモデルは、未熟児網膜症を模倣している。生後7日目(P7)に、マウスおよびその母親を、最終酸素画分が75□±2%になるように酸素と空気との混合物によって通気した密閉インキュベーター(自家製)に入れた。酸素レベルを、1日に少なくとも3回チェックした。P12に、マウスを大気に戻した。P17に、動物を屠殺した。
マウス
C57BL/6マウスを、Guangzhou Medical collegeおよびGuangzhou University of traditional Chinese Medicineの実験動物センターから購入した。全ての調査は、Committee on the Care of Laboratory Animals Resources,Commission of Life Sciences,National Research Councilのガイドラインに従った。
C57BL/6マウスを、Guangzhou Medical collegeおよびGuangzhou University of traditional Chinese Medicineの実験動物センターから購入した。全ての調査は、Committee on the Care of Laboratory Animals Resources,Commission of Life Sciences,National Research Councilのガイドラインに従った。
siRNAのインビボ送達
局所送達のために、P12およびP13に、32ゲージのHamilton syringe(Hamilton Co,Revo,NV)によって、深い麻酔下でsiMix(4μg/2μl/眼)を、左目に結膜下または硝子体内に送達させ、siLuc(4μg/2μl/眼)を、右目に送達させた。全身投与のために、siRNA(15μg/50μl/マウス)をRGD−PEG−PEIポリマー抱合体調製物(TargeTran)と混合し、P12およびP13に腹腔内送達させた。
局所送達のために、P12およびP13に、32ゲージのHamilton syringe(Hamilton Co,Revo,NV)によって、深い麻酔下でsiMix(4μg/2μl/眼)を、左目に結膜下または硝子体内に送達させ、siLuc(4μg/2μl/眼)を、右目に送達させた。全身投与のために、siRNA(15μg/50μl/マウス)をRGD−PEG−PEIポリマー抱合体調製物(TargeTran)と混合し、P12およびP13に腹腔内送達させた。
網膜血管造影法(4)
P17に、前に記載のように、50mg/mlフルオレセイン標識デキストランの塩化ナトリウム溶液を使用した心臓潅流によって動物を屠殺した。両眼を摘出し、10%緩衝化ホルムアルデヒド中にて室温で0.5〜1時間固定した。前部を切り取り、感覚網膜を慎重に除去した。網膜を放射状に切断し、光り受容体が下に向くようにグリセリン中に平らに置いた。網膜上に覆いガラスを置き、マニキュア液で密封した。全載網膜を、蛍光顕微鏡法によって試験した。網膜のNV領域を、ソフト(Image−Pro Plus□Media Cybernetics,USA□)によって測定した。
P17に、前に記載のように、50mg/mlフルオレセイン標識デキストランの塩化ナトリウム溶液を使用した心臓潅流によって動物を屠殺した。両眼を摘出し、10%緩衝化ホルムアルデヒド中にて室温で0.5〜1時間固定した。前部を切り取り、感覚網膜を慎重に除去した。網膜を放射状に切断し、光り受容体が下に向くようにグリセリン中に平らに置いた。網膜上に覆いガラスを置き、マニキュア液で密封した。全載網膜を、蛍光顕微鏡法によって試験した。網膜のNV領域を、ソフト(Image−Pro Plus□Media Cybernetics,USA□)によって測定した。
凍結切片(5)
眼を取り出し、至適な切断温度にて包埋化合物(Miles Diagnostics)中で凍結した。眼の凍結切片(10μm)を、ビオチン化GSAで組織化学的に染色した。スライドを、メタノール/H2O2中にて4℃で10分間インキュベートし、Tris緩衝化生理食塩水(TBS)0.05M(pH7.6)で洗浄し、10%の正常なウシ血清中で30分間インキュベートした。スライドを、ビオチン化GSAと37℃で1時間インキュベートし、TBS0.05Mでのリンス後、これらをアルカリホスファターゼに結合したアビジン(Vector Laboratories)と室温で45分間インキュベートした。TBS0.05Mで10分間洗浄した後、スライドをジアミノベンジジンとインキュベートして褐色反応生成物を得て、エオシンで対比染色し、Cytosealを使用してマウントした。定量的評価を行うために、眼全体を10μmの連続切片に切断した。この切断は、虹彩を含む第1の切片から開始し、虹彩を含む眼の反対側の最後の切片まで続き、10番目の切片毎にGSAで染色し、全部で15切片を染色した。GSA染色切片を顕微鏡で試験し、デジタルカラービデオカメラを使用して画像をデジタル化した。Image−Pro Plusソフトウェア(Media Cybernetics,Silver Spring,MD,USA)を使用して、網膜表面上のGSA染色細胞を描写し、その領域を測定した。局所注射のために、各眼由来の全測定値を、1つの実験値として使用した。全身注射のために、マウスの両眼の平均を1つの実験値として使用した。
眼を取り出し、至適な切断温度にて包埋化合物(Miles Diagnostics)中で凍結した。眼の凍結切片(10μm)を、ビオチン化GSAで組織化学的に染色した。スライドを、メタノール/H2O2中にて4℃で10分間インキュベートし、Tris緩衝化生理食塩水(TBS)0.05M(pH7.6)で洗浄し、10%の正常なウシ血清中で30分間インキュベートした。スライドを、ビオチン化GSAと37℃で1時間インキュベートし、TBS0.05Mでのリンス後、これらをアルカリホスファターゼに結合したアビジン(Vector Laboratories)と室温で45分間インキュベートした。TBS0.05Mで10分間洗浄した後、スライドをジアミノベンジジンとインキュベートして褐色反応生成物を得て、エオシンで対比染色し、Cytosealを使用してマウントした。定量的評価を行うために、眼全体を10μmの連続切片に切断した。この切断は、虹彩を含む第1の切片から開始し、虹彩を含む眼の反対側の最後の切片まで続き、10番目の切片毎にGSAで染色し、全部で15切片を染色した。GSA染色切片を顕微鏡で試験し、デジタルカラービデオカメラを使用して画像をデジタル化した。Image−Pro Plusソフトウェア(Media Cybernetics,Silver Spring,MD,USA)を使用して、網膜表面上のGSA染色細胞を描写し、その領域を測定した。局所注射のために、各眼由来の全測定値を、1つの実験値として使用した。全身注射のために、マウスの両眼の平均を1つの実験値として使用した。
RT−PCR
P14およびP17にマウスを屠殺し、TRIzol試薬(Invitrogen,USA)を使用して網膜から総RNAを抽出した。260nmの280nmに対する比で総RNAを定量し、のRNA2μgを、cDNA合成キット(Fermentas,USA)によってcDNAに変換した。VEGF、VEGFR1、VEGFR2、およびb−アクチン(RNA完全性のコントロールおよび内部標準として作用する)をコードするRT生成cDNAを、RT−PCRを使用して増幅した。1.5μlのcDNAの増幅を、1μlのセンスおよびアンチセンスならびに2.5UのTaqポリメラーゼを使用して行った。オリゴヌクレオチドプライマー配列は以下である:
P14およびP17にマウスを屠殺し、TRIzol試薬(Invitrogen,USA)を使用して網膜から総RNAを抽出した。260nmの280nmに対する比で総RNAを定量し、のRNA2μgを、cDNA合成キット(Fermentas,USA)によってcDNAに変換した。VEGF、VEGFR1、VEGFR2、およびb−アクチン(RNA完全性のコントロールおよび内部標準として作用する)をコードするRT生成cDNAを、RT−PCRを使用して増幅した。1.5μlのcDNAの増幅を、1μlのセンスおよびアンチセンスならびに2.5UのTaqポリメラーゼを使用して行った。オリゴヌクレオチドプライマー配列は以下である:
mVEGF (430bp) □ 順方向 5’−−−GAT GTC TAC CAG CGA AGC TAC TGC CGT CCG−−−3’ (配列番号268) □ 逆方向 5’−−−GAA CAT CGA TGA CAA GCT TAG GTA TCG ATA caa get gcc teg cct tg−−−3’ (配列番号269) □ mVEGFR1 (404bp) □ 順方向 5’−−−GTCAGC TGC TGG GAC ACC GCG GTC TTG CCT−−−3’ (配列番号270) □ 逆方向 5’−−−GAA CAT CGA TGA CAA GCT TAG GTA TCG ATA tag art gaa gat tec gc−−−3’ (配列番号271) □ mVEGFR2 (485bp) □ 順方向 5’−TGG CTG GTC AAA CAG CTC ATC−3’ (配列番号272) □ 逆方向 5’−CTC ATC CAA GGG CAA TTC ATC−3’ (配列番号273) □□ β−アクチン (232bp) □ 順方向 5 ‘−CAT TGT GAT GGA CTC CGG AGA CGG−3’ (配列番号274) □ 逆方向 5’ − CAT CTC CTG CTG AAG TCT AGA GC−3’(配列番号275)
VEGF、VEGFR1、VEGFR2のELISA
P14およびp17にマウスを屠殺し、氷上で網膜を即座に抽出した。サンプルを、細胞溶解緩衝液(哺乳動物細胞溶解キット、Biotechnology Department Bio Basid Inc,Canada)中で均質化し、12,000rpmで30分間遠心分離した。上清を、BCAタンパク質定量分析キット(Shenery
Biocolor Bioscience & Technolgy Company,China)によってタンパク質濃度について分析した。サンプルを、1mg/mlの
最終濃度まで希釈した。VEGF、VEGFR1、およびVEGFR2のレベルを、QuantikineMマウスのVEGF、sVEGFR1、およびsVEGFR2免疫アッセイキット(R&D Systems Inc.,Minneapolis,MN)を使用してそれぞれ決定した。各群および各時点について6〜12の組織サンプルを分析した。
VEGF、VEGFR1、VEGFR2のELISA
P14およびp17にマウスを屠殺し、氷上で網膜を即座に抽出した。サンプルを、細胞溶解緩衝液(哺乳動物細胞溶解キット、Biotechnology Department Bio Basid Inc,Canada)中で均質化し、12,000rpmで30分間遠心分離した。上清を、BCAタンパク質定量分析キット(Shenery
Biocolor Bioscience & Technolgy Company,China)によってタンパク質濃度について分析した。サンプルを、1mg/mlの
最終濃度まで希釈した。VEGF、VEGFR1、およびVEGFR2のレベルを、QuantikineMマウスのVEGF、sVEGFR1、およびsVEGFR2免疫アッセイキット(R&D Systems Inc.,Minneapolis,MN)を使用してそれぞれ決定した。各群および各時点について6〜12の組織サンプルを分析した。
結果および考察
網膜NVに及ぼすsiRNAの影響についてのフルオレセイン血管造影評価
正常なp17マウスの網膜は、表面および深部の両方に血管層(血管の接続によって連結している)を有し、これは視神経から周囲まで伸びていた。低酸素状態に曝露されたP17コントロールマウス由来の網膜は、潅流網膜と非潅流網膜との間の接合部表面から伸長した多くの新血管の房(高フルオレセイン)を含んでいた。siLucまたはsiMixの結膜下注射後、網膜は多くのNVも有しており、この領域は明らかに異ならなかった。それに対して、siMixのガラス体内注射および腹腔内注射後のNV領域は、有意にコントロール未満であった。
網膜NVに及ぼすsiRNAの影響についてのフルオレセイン血管造影評価
正常なp17マウスの網膜は、表面および深部の両方に血管層(血管の接続によって連結している)を有し、これは視神経から周囲まで伸びていた。低酸素状態に曝露されたP17コントロールマウス由来の網膜は、潅流網膜と非潅流網膜との間の接合部表面から伸長した多くの新血管の房(高フルオレセイン)を含んでいた。siLucまたはsiMixの結膜下注射後、網膜は多くのNVも有しており、この領域は明らかに異ならなかった。それに対して、siMixのガラス体内注射および腹腔内注射後のNV領域は、有意にコントロール未満であった。
網膜NVの組織学的定量によるsiRNA効果の評価
内境界膜(ILM)の前のGSA陽性細胞(新血管形成)の測定によって網膜NVも組織学的に評価した。P17正常酸素(normoxic)マウスの網膜は、表面上に中程度の深い血管を有し、ILMの前に内皮細胞を含まなかった。低酸素状態に曝露したP17マウスの網膜は、表面上に複数の新血管の房を含んでおり、これらがガラス体内にいくらか伸長していた。siLucまたはsiMixの結膜下注射を使用して処置したマウスの網膜は、NV領域が異ならなかった。siMixのガラス体内注射および腹腔内注射後のNV領域は、siLuc注射と比較して明らかに減少した。
内境界膜(ILM)の前のGSA陽性細胞(新血管形成)の測定によって網膜NVも組織学的に評価した。P17正常酸素(normoxic)マウスの網膜は、表面上に中程度の深い血管を有し、ILMの前に内皮細胞を含まなかった。低酸素状態に曝露したP17マウスの網膜は、表面上に複数の新血管の房を含んでおり、これらがガラス体内にいくらか伸長していた。siLucまたはsiMixの結膜下注射を使用して処置したマウスの網膜は、NV領域が異ならなかった。siMixのガラス体内注射および腹腔内注射後のNV領域は、siLuc注射と比較して明らかに減少した。
siRNAの硝子体内注射および腹腔内注射後のVEGF、VEGFR1、VEGFR2のmRNAレベルの減少
VEGF経路遺伝子に対するsiRNA処置がVEGF、VEGFR1、VEGFR2のmRNAレベルを減少させるかどうかに取り組むために、siRNAの硝子体内注射および腹腔内注射後のP14およびP17に網膜を回収した。RT−PCRによってmRNAレベルを測定した。VEGF、VEGFR1、VEGFR2のmRNAの発現は、siLucで処置したコントロール網膜と比較して、VEGF経路遺伝子に対するsiMixで処置した網膜で減少した(P<0.05)。
VEGF経路遺伝子に対するsiRNA処置がVEGF、VEGFR1、VEGFR2のmRNAレベルを減少させるかどうかに取り組むために、siRNAの硝子体内注射および腹腔内注射後のP14およびP17に網膜を回収した。RT−PCRによってmRNAレベルを測定した。VEGF、VEGFR1、VEGFR2のmRNAの発現は、siLucで処置したコントロール網膜と比較して、VEGF経路遺伝子に対するsiMixで処置した網膜で減少した(P<0.05)。
siRNAの硝子体内適用および腹腔内適用後のVEGF、VEGFR1、VEGFR2タンパク質の発現レベルの減少
VEGF経路遺伝子を標的化するsiRNA処置がVEGF、VEGFR1、VEGFR2タンパク質の産生を減少させるかどうかを評価するために、ELISAを使用して、P14およびP17のsiRNA処置網膜中のVEGF、VEGFR1、VEGFR2タンパク質を測定した。表1および2に示すように、VEGF、VEGFR1、VEGFR2タンパク質レベルは、siLucを投与したコントロールと比較してsiMixを投与したもので低かった。
VEGF経路遺伝子を標的化するsiRNA処置がVEGF、VEGFR1、VEGFR2タンパク質の産生を減少させるかどうかを評価するために、ELISAを使用して、P14およびP17のsiRNA処置網膜中のVEGF、VEGFR1、VEGFR2タンパク質を測定した。表1および2に示すように、VEGF、VEGFR1、VEGFR2タンパク質レベルは、siLucを投与したコントロールと比較してsiMixを投与したもので低かった。
酸素および栄養素の需要と供給との不均衡は、VEGFの上方制御を誘導する新血管形成の開始因子である。VEGFは、内皮細胞の強力な分裂誘発因子であるだけでなく、血管透過性および膨張も誘導する。これらの生物活性は、高親和性膜貫通型自己リン酸化チロシンキナーゼ受容体へのVEGFの結合によって媒介される(5)。3つの異なるVEGF受容体(すなわち、VEGFR1(fms様チロシンキナーゼ−1またはFlt−1)、VEGFR2(キナーゼインサートドメイン含有受容体またはKDR)、およびVEGFR3(fms系チロシンキナーゼ−4またはFlt−4))が同定されている。VEGFR1およびVEGFR2は、主に血管に発現し、VEGFR3はリンパ内皮に発現する(6)。VEGFの硝子体内レベルおよび網膜内レベルの増加は、虚血性網膜症の動物モデルだけでなく患者における網膜新血管形成に関連する。これらのデータにより、VEGFシグナル伝達が網膜新血管形成の良好な治療標的であることが示唆される(5)。
マウスの酸素誘導性網膜症は、世界的に広く認識されている。Eric APら(7)は、低酸素症から6〜12時間後にVEGFのmRNAレベルが劇的に増加し、これが数日間上昇したままであり、次いで、網膜症の後退と共にベースラインに向けて減少したと報告している。それにより、本発明者らは、上方制御前にVEGF合成を干渉するために、P12およびP13にsiRNAを送達させた。siMixの硝子体内注射および腹腔内注射で処置した網膜のNV領域がsiLuc注射よりも低いという全載(whole mount)および凍結切片の結果が証明された。すなわち、siMixは、網膜NVを明らかに阻害することができる。機構を調査するために、P14およびP17での網膜VEGF、VEGFR1、およびVEGFR2発現を試験し、mRNAレベルおよびタンパク質レベルがsiLucコントロールより低かった。これらによって、siMixが網膜NVを阻害するVEGF経路遺伝子の阻害によることが示唆された。
しかし、結膜下注射後に明らかな相違は認められず、それにより、局所的に有効に濃縮されなかったと結論づけられる。硝子体内注射後、硝子体内に高濃度のsiRNAが存在し、siRNAを網膜新血管内皮細胞にトランスフェクトした。しかし、この注射により、眼内出血および眼内炎などを引き起こし得る。腹腔内注射は比較的安全であり、豊富な腹腔毛細管を介してsiRNAを血液に吸収させることができる。しかし、siRNAは非特異的(njonspecigic)器官(肝臓、肺、および脾臓を含む)に容易に捕捉される。したがって、どのようにしてsiRNAのトランスフェクション効率を増強させるのかが非常に重要である。ビヒクルTargeTranは、ポリエチレンイミン(PEI)、ポリエチレングリコール(PEG)、およびアルギニン−グリシン−アスパラギン酸ペプチド配列(RGD)から構成される。PEIは、siRNAのリン酸塩の負電荷に結合する。RGDモチーフは、活性化内皮細胞のインテグリンリガンドとして同定された。内皮細胞は、多数の異なるインテグリンを発現し、インテグリンαvβ3およびα5β1は血管形成時に重要であることが示された。両方のインテグリンは、露呈したRDGトリペプチド部分を有するマトリックスタンパク質の受容体であり、血管形成時の活性化内皮細胞で最も顕著である。したがって、Targetranの適用により、siRNAのトランスフェクション効率を改善することができる。Kim Bら(8)は、siMixの結膜下注射および静脈内注射がマウスにおけるCPG誘導性角膜新血管形成を阻害することができると報告している。他の新血管疾患に適用することもできる。
実施例9.リガンド指向性ナノ粒子siRNAは、全身投与を使用して、腫瘍に特異的に送達することができる
この自己アセンブリsiRNAナノ粒子は、これらを静脈内(IV)注射によって全身投与した場合に新脈管構造ターゲティング特性を示した。ルシフェラーゼレポート遺伝子系を使用して、このsiRNAナノ粒子系の腫瘍特異的ターゲティング能力が明らかとなった。
この自己アセンブリsiRNAナノ粒子は、これらを静脈内(IV)注射によって全身投与した場合に新脈管構造ターゲティング特性を示した。ルシフェラーゼレポート遺伝子系を使用して、このsiRNAナノ粒子系の腫瘍特異的ターゲティング能力が明らかとなった。
実施例10.リガンド指向性ナノ粒子siRNAは、マウス同系モデル(神経膠芽腫(neuroglioblastoma))で立証された強い抗腫瘍薬である
RGD−PEG−PEIナノ粒子中にパッケージングした蛍光標識siRNAを使用して、静脈内(iv)投与由来の標的化ナノ粒子系を使用したsiRNAの腫瘍標的化送達を証明する。
RGD−PEG−PEIナノ粒子中にパッケージングした蛍光標識siRNAを使用して、静脈内(iv)投与由来の標的化ナノ粒子系を使用したsiRNAの腫瘍標的化送達を証明する。
マウス腫瘍モデル
雌ヌードマウス(6〜8週齢)を、Taconic(Germantown,NY)から入手し、標準的なげっ歯類固形飼料および水を自由に与え、12時間の明暗サイクルで上部がフィルターのケージに保持した。国内規制に従って実験を行い、この実験は、動物実験倫理委員会支部(local animal experiments ethical committeee)によって承認された。1×106個のN2A細胞のマウスの側腹への接種によって皮下N2A腫瘍を誘導した。約0.5〜1cm3の腫瘍体積で、尾静脈への0.2ml溶液の静脈内注射によってナノプレックス(nanoplex)または遊離siRNAをマウスに投与した。40μgの蛍光標識siRNAを、遊離形態またはPEI−もしくはRGD−PEG−PEIナノ粒子として注射した。注射から1時間後に、組織を解剖し、蛍光に適した解剖顕微鏡を使用して試験した。デジタルカメラを具備し、MgnaFire2.0カメラソフトウェアが作動するPCに接続したOLympus SZX12蛍光顕微鏡(OIptronics,Goleta,CA)を使用して組織の顕微鏡試験を行った。各組織について等しい露光時間で写真を撮影した。
雌ヌードマウス(6〜8週齢)を、Taconic(Germantown,NY)から入手し、標準的なげっ歯類固形飼料および水を自由に与え、12時間の明暗サイクルで上部がフィルターのケージに保持した。国内規制に従って実験を行い、この実験は、動物実験倫理委員会支部(local animal experiments ethical committeee)によって承認された。1×106個のN2A細胞のマウスの側腹への接種によって皮下N2A腫瘍を誘導した。約0.5〜1cm3の腫瘍体積で、尾静脈への0.2ml溶液の静脈内注射によってナノプレックス(nanoplex)または遊離siRNAをマウスに投与した。40μgの蛍光標識siRNAを、遊離形態またはPEI−もしくはRGD−PEG−PEIナノ粒子として注射した。注射から1時間後に、組織を解剖し、蛍光に適した解剖顕微鏡を使用して試験した。デジタルカメラを具備し、MgnaFire2.0カメラソフトウェアが作動するPCに接続したOLympus SZX12蛍光顕微鏡(OIptronics,Goleta,CA)を使用して組織の顕微鏡試験を行った。各組織について等しい露光時間で写真を撮影した。
結果:遊離蛍光標識siRNAの微静脈による静脈内注射は、肺、肝臓、または腫瘍組織中にいかなる有意な蓄積も示さなかった。PEI−ナノ粒子を使用して送達されたsiRNAは、肺組織中に最も蓄積され、肝臓および腫瘍がこれに続いた。RGD−PEG−PEIナノ粒子を使用して送達されたsiRNAは、腫瘍組織中に最も高レベルで蓄積された。PEI−ナノ粒子と比較して、肺蓄積が非常に減少し、肝臓蓄積は非常に少なかった。この実験は、RGD−PEG−PEIナノ粒子を使用したsiRNAの腫瘍標的化送達を示す。
VEGFR2に対して標的化されたsiRNAを含む腫瘍標的化ナノ粒子処方物を使用して、腫瘍血管形成および腫瘍成長のRNAi媒介性阻害を研究した。40μgのsiRNA/注射の用量でのナノ粒子処方物の静脈内注射によって、皮下腫瘍保有マウスを処置した。3日毎に注射を繰り返し、腫瘍の成長を評価し、コントロール処方物で処置した動物と比較した。実験終了時に血管形成の阻害を評価した。
マウス腫瘍モデル
雌ヌードマウス(6〜8週齢)を、Taconic(Germantown,NY)から入手し、標準的なげっ歯類固形飼料および水を自由に与え、12時間の明暗サイクルで上部がフィルターのケージに保持した。国内規制に従って実験を行い、この実験は、動物実験倫理委員会支部によって承認された。1×106個のN2A細胞のマウスの側腹への接種によって皮下N2A腫瘍を誘導した。約0.5〜1cm3の腫瘍体積で、尾静脈への0.2ml溶液の静脈内注射によってナノプレックス(nanoplex)または遊離siRNAをマウスに投与した。siRNAを含むナノ粒子処方物を、所与のN/P比でのsiRNA溶液とポリマー溶液との簡単な混合によって調製した。
雌ヌードマウス(6〜8週齢)を、Taconic(Germantown,NY)から入手し、標準的なげっ歯類固形飼料および水を自由に与え、12時間の明暗サイクルで上部がフィルターのケージに保持した。国内規制に従って実験を行い、この実験は、動物実験倫理委員会支部によって承認された。1×106個のN2A細胞のマウスの側腹への接種によって皮下N2A腫瘍を誘導した。約0.5〜1cm3の腫瘍体積で、尾静脈への0.2ml溶液の静脈内注射によってナノプレックス(nanoplex)または遊離siRNAをマウスに投与した。siRNAを含むナノ粒子処方物を、所与のN/P比でのsiRNA溶液とポリマー溶液との簡単な混合によって調製した。
腫瘍成長阻害研究のために、腫瘍が触診可能になった時(腫瘍細胞接種から7日後)に実験を開始した。処置は、40μgのsiRNA/マウスを含むRPP−ナノプレックスの3日毎の尾静脈を介した静脈投与からなる。治療割り当てを伏せた観察者によってデジタルキャリパーを使用して腫瘍成長を一定の間隔で測定した。各測定は、約90°離れた2方向における腫瘍の直径からなる。腫瘍体積を、0.52×最長直径×最短直径2として計算した。実験終了時に、動物を屠殺し、腫瘍組織および周辺の皮膚を切り出し、顕微鏡用スライドガラス上に置いた。脈管形成(vascularization)および血管形成についての組織の試験を、上記の蛍光組織測定のために記載されたOlympus顕微鏡およびカメラ装置を使用した顕微鏡法によって行った。組織に光を通過させて皮膚中の血管を可視化し、デジタル画像を撮影し、上記のように保存した。ウェスタンブロッティングのために、その直後に組織を瞬間冷凍した。
結果:VEGFR2siRNAを含むナノ粒子処方物で処置した動物で有意な腫瘍成長阻害が認められた。非特異的siRNAで処置した動物は、未処置動物と比較して、いかなる実質的な腫瘍成長阻害も示さなかった。血管成長の有意な阻害が腫瘍周囲に認められ、VEGFR2−siRNA処置マウスにおける血管形成の阻害を示す。コントロールsiRNAで処置したマウスは、未処置動物と類似の血管成長を示した。異なる処置群の動物から回収した腫瘍溶解物のウェスタンブロット分析は、VEGFR2−siRNA処置動物においてVEGFR2の実質的減少を示したのに対して、コントロールsiRNA処置動物ではVEGFR2の減少は認められなかった。これらの実験は、静脈内投与由来の腫瘍組織へのsiRNAの送達を明白に証明する。腎臓細胞癌モデルにおいて腫瘍成長を阻害するためのRGD−PEG−PEIナノ粒子中にパッケージングしたVEGFR2siRNAの有効性を、786−O異種移植片腫瘍モデルを使用して研究した。実施例7に類似の実験手順を、本研究で使用した。簡単に述べれば、雌ヌードマウス(6〜8週齢)を、Taconic(Germantown,NY)から入手した。5×106個の786−O細胞のマウスの側腹への接種によって皮下786−O腫瘍を誘導した。腫瘍体積が約100mm3に到達した場合、尾静脈を介したVEGFR2−siRNA溶液を含むRGD−PEG−PEIナノ粒子の静脈内注射によって処置を開始した。コントロール処置群に、非特異的siRNAまたは生理食塩水を含むナノ粒子を投与した。3日毎の注射を使用して、処置を数日間繰り返した。実施例7に記載のように、3日毎に1回腫瘍体積を測定した。結果:VEGFR2−siRNAナノ粒子処方物で処置した動物で有意な腫瘍成長阻害が認められた。コントロールsiRNAナノ粒子で処置した動物で有意な腫瘍成長阻害は認められなかった。本実験は、腫瘍標的化ナノ粒子処方物によって送達されたVEGFR2siRNAが腫瘍成長阻害を達成することができることを証明する。
リガンド指向性siRNAナノ粒子を、腫瘍血管形成活性に及ぼすVEGFノックダウンの影響の評価のために、N2A膠芽細胞腫細胞の皮下接種を使用してC57マウスモデルに全身投与した。雌ヌードマウス(6〜8週齢)を、Taconic(Germantown,NY)から入手し、標準的なげっ歯類固形飼料および水を自由に与え、12時間の明暗サイクルで上部がフィルターのケージに保持した。国内規制に従って実験を行い、この実験は、動物実験倫理委員会支部によって承認された。1×106個のN2A細胞のマウスの側腹への接種によって皮下N2A腫瘍を誘導した。約0.5〜1cm3の腫瘍体積で、尾静脈への0.2ml溶液の静脈内注射によってナノプレックスまたは遊離siRNAをマウスに投与した。N/P比が2で上記のようにナノプレックス溶液を調製した。組織分布実験のために、40mgの蛍光標識siRNAを、遊離形態またはP−もしくはRPPナノプレックスとして注射した。注射から1時間後に、組織を解剖し、蛍光に適した解剖顕微鏡を使用して試験した。デジタルカメラを具備し、MgnaFire2.0カメラソフトウェアが作動するPCに接続したOLympus SZX12蛍光顕微鏡(OIptronics,Goleta,CA)を使用して組織の顕微鏡試験を行った。各組織について等しい露光時間で写真を撮影した。
同時送達実験では、プラスミドおよびsiRNAをそれぞれ1:100のモル比で混合し(40mgのpLucと13mgのsiRNAとの混合)、連続送達実験では、40mgのプラスミドを最初に送達させ、2時間後に40mgのsiRNAを送達させた(モル比1:300)。ナノプレックス注射から24時間後に組織を解剖し、秤量し、磁性ビーズを含む2mlチューブ(Q−Biogene,Carlsbad,CA)中の氷冷レポーター溶解緩衝液(Promega)に入れた。組織を、Fastprep FP120マグネティックホモジナイザー(Q−Biogene)を使用して均質化し、サンプルを、Monolight2010照度計(Analytical Luminescence Laboratory)を備えたルシフェラーゼアッセイシステム(Promega)を使用して、レポーター酵素活性についてアッセイした。腫瘍成長阻害研究では、腫瘍細胞の接種から7日後に収容が触診可能になった時に実験を開始した。処置は、40mgのsiRNA/マウスを含むRPP−ナノプレックスの3日毎の尾静脈を介した静脈投与からなる。治療割り当てを伏せた観察者によってデジタルキャリパーを使用して腫瘍成長を一定の間隔で測定した。各測定は、約90°離れた2方向における腫瘍の直径からなる。腫瘍体積を、0.52×最長直径×最短直径2として計算した。
実験終了時に、動物を屠殺し、腫瘍組織および周辺の皮膚を切り出し、顕微鏡用スライドガラス上に置いた。脈管形成(vascularization)および血管形成についての組織の試験を、上記の蛍光組織測定のために記載されたOlympus顕微鏡およびカメラ装置を使用した顕微鏡法によって行った。組織に光を通過させて皮膚中の血管を可視化し、デジタル画像を撮影し、上記のように保存した。ウェスタンブロッティングのために、その直後に組織を瞬間冷凍した。
siRNA RPP−ナノプレックスによる腫瘍成長阻害。マウスにN2A腫瘍細胞を接種し、未処置のままにするか、40mg/マウスの用量でのsiLacZまたはsiVEGFR2を含むRPP−ナノプレックスでの尾静脈注射によって処置した。腫瘍が触診可能になった時点で(20mm3)、処置を開始した。VEGFR2配列特異的siRNAのみが腫瘍成長を阻害するのに対して、LacZsiRNAでの処置は、未処置コントロール(n=5)と比較して、腫瘍成長率に影響を及ぼさなかった。
実施例11.リガンド指向性ナノ粒子siRNAは、異種移植片腫瘍モデル(腎臓癌)で立証された強い抗腫瘍薬である
腎臓癌細胞株を有するマウス異種移植片モデルにおけるリガンド指向性siRNAナノ粒子も試験した。実施例10と同一の送達経路を使用して、同一の材料および同一の手順によってsiRNAナノ粒子を製造した。2mg/kgの投薬量を使用した3日間隔での5回の反復送達を、コホートあたり6匹の動物を使用して行った。有意な腫瘍成長阻害が認められた。
腎臓癌細胞株を有するマウス異種移植片モデルにおけるリガンド指向性siRNAナノ粒子も試験した。実施例10と同一の送達経路を使用して、同一の材料および同一の手順によってsiRNAナノ粒子を製造した。2mg/kgの投薬量を使用した3日間隔での5回の反復送達を、コホートあたり6匹の動物を使用して行った。有意な腫瘍成長阻害が認められた。
実施例12.リガンド指向性ナノ粒子siRNAは、異種移植片腫瘍モデル(結腸直腸癌)で立証された強い抗腫瘍薬である
VEGFR2遺伝子をターゲティングするsiRNAナノ粒子を使用して、本発明者らは、ヒト結腸直腸癌細胞株DLD−1を有するマウス異種移植片モデルにおける抗腫瘍有効性をさらに試験した。
VEGFR2遺伝子をターゲティングするsiRNAナノ粒子を使用して、本発明者らは、ヒト結腸直腸癌細胞株DLD−1を有するマウス異種移植片モデルにおける抗腫瘍有効性をさらに試験した。
材料および方法。試薬:アバスチン、VEGFに対するモノクローナル抗体(25mg/ml、Genetech);VEGFR2配列に対するsiRNA(付録1);ルシフェラーゼに対するsiRNA(Qiagen);1.5gの2,2,2トリブロモエタノールおよび1.5mlのt−アミルアルコール(カタログ番号T4840−2、カタログ番号24048−6、Aldrich)から作製されたアベルチンを含む100ml蒸留水(St.Louis,MO)。マウス:5〜6週齢の胸腺欠損雌ヌードマウスを、TACONIC()から購入し、従来どおりに収容した。全ての調査は、Committee
on the Care of Laboratory Animals Resources,Commission of Life Sciences,National Research Councilのガイドラインに従った。Biomedical
Research Institute in Rockville Marylandの動物施設は、American Association of Laboratory Animal Careによって完全に認可されている。細胞:結腸癌細胞株DLD−1(CCL−221,ATCC)を、L−グルタミン2mM、重炭酸ナトリウム1.5g/L、グルコース4.5g/L、HEPES10mM、およびピルビン酸ナトリウム1.0mM、10%ウシ血清アルブミンを含むRPMI1640培地中で成長させた。
on the Care of Laboratory Animals Resources,Commission of Life Sciences,National Research Councilのガイドラインに従った。Biomedical
Research Institute in Rockville Marylandの動物施設は、American Association of Laboratory Animal Careによって完全に認可されている。細胞:結腸癌細胞株DLD−1(CCL−221,ATCC)を、L−グルタミン2mM、重炭酸ナトリウム1.5g/L、グルコース4.5g/L、HEPES10mM、およびピルビン酸ナトリウム1.0mM、10%ウシ血清アルブミンを含むRPMI1640培地中で成長させた。
試薬
アバスチン、VEGFに対するモノクローナル抗体(25mg/ml、Genetech);VEGFR2配列に対するsiRNA(付録1);ルシフェラーゼに対するsiRNA(Qiagen);1.5gの2,2,2トリブロモエタノールおよび1.5mlのt−アミルアルコール(カタログ番号T4840−2、カタログ番号24048−6、Aldrich)から作製されたアベルチンを含む100ml蒸留水(St.Louis,MO)。マウス:5〜6週齢の胸腺欠損雌ヌードマウスを、TACONIC()から購入し、従来どおりに収容した。全ての調査は、Committee on the Care of Laboratory Animals Resources,Commission of Life Sciences,National Research Councilのガイドラインに従った。Biomedical Research Institute in Rockville Marylandの動物施設は、American Association of Laboratory Animal Careによって完全に認可されている。細胞:結腸癌細胞株DLD−1(CCL−221,ATCC)を、L−グルタミン2mM、重炭酸ナトリウム1.5g/L、グルコース4.5g/L、HEPES10mM、およびピルビン酸ナトリウム1.0mM、10%ウシ血清アルブミンを含むRPMI1640培地中で成長させた。手順:1)コンフルエンス付近のDLD−1細胞を採取し、無血清RPMI培地に再懸濁した。2)0.4ml/マウスのアベルチンを腹腔内に使用してマウスを麻酔した。3)異種移植片腫瘍モデルの確立のために、1億個の細胞を含む0.1ml無血清RPMI培地を、マウスの背側の左横腹に注射した。4)腫瘍細胞の接種から5日後に、成長した腫瘍のサイズを、キャリパーを使用して測定した。次いで、マウスを、群あたり7匹の群に無作為にグループ化した。3つの異なる投薬レジメンを適用した:それぞれ、1mg/kg、2mg/kg、および4mg/kg。4mg/kgの高用量で最も強い腫瘍活性を示したが、3つの処置群で有意に異なる量ではない。異なる比較を用いて、4mg/kgの高用量のsiRNAナノ粒子が5mg/kgアバスチン処置よりも強い抗腫瘍有効性を示すことが見出された。
アバスチン、VEGFに対するモノクローナル抗体(25mg/ml、Genetech);VEGFR2配列に対するsiRNA(付録1);ルシフェラーゼに対するsiRNA(Qiagen);1.5gの2,2,2トリブロモエタノールおよび1.5mlのt−アミルアルコール(カタログ番号T4840−2、カタログ番号24048−6、Aldrich)から作製されたアベルチンを含む100ml蒸留水(St.Louis,MO)。マウス:5〜6週齢の胸腺欠損雌ヌードマウスを、TACONIC()から購入し、従来どおりに収容した。全ての調査は、Committee on the Care of Laboratory Animals Resources,Commission of Life Sciences,National Research Councilのガイドラインに従った。Biomedical Research Institute in Rockville Marylandの動物施設は、American Association of Laboratory Animal Careによって完全に認可されている。細胞:結腸癌細胞株DLD−1(CCL−221,ATCC)を、L−グルタミン2mM、重炭酸ナトリウム1.5g/L、グルコース4.5g/L、HEPES10mM、およびピルビン酸ナトリウム1.0mM、10%ウシ血清アルブミンを含むRPMI1640培地中で成長させた。手順:1)コンフルエンス付近のDLD−1細胞を採取し、無血清RPMI培地に再懸濁した。2)0.4ml/マウスのアベルチンを腹腔内に使用してマウスを麻酔した。3)異種移植片腫瘍モデルの確立のために、1億個の細胞を含む0.1ml無血清RPMI培地を、マウスの背側の左横腹に注射した。4)腫瘍細胞の接種から5日後に、成長した腫瘍のサイズを、キャリパーを使用して測定した。次いで、マウスを、群あたり7匹の群に無作為にグループ化した。3つの異なる投薬レジメンを適用した:それぞれ、1mg/kg、2mg/kg、および4mg/kg。4mg/kgの高用量で最も強い腫瘍活性を示したが、3つの処置群で有意に異なる量ではない。異なる比較を用いて、4mg/kgの高用量のsiRNAナノ粒子が5mg/kgアバスチン処置よりも強い抗腫瘍有効性を示すことが見出された。
参考文献:
Claims (41)
- 以下:
(a)5’−CACAACAAAUGUGAAUGCAGACCAA−3’(配列番号5);
(b)5’−GAGAGAUGAGCUUCCUACAGCACAA−3’(配列番号3);
(c)5’−CCUGAUGAGAUCGAGUACAUCUUCA−3’(配列番号1);
(d)5’−GAGUCCAACAUCACCAUGCAGAUUA−3’(配列番号277);
(e)5’−AGUCCAACAUCACCAUGCAGAUUAU−3’(配列番号278);
(f)5’−CCAACAUCACCAUGCAGAUUAUGCG−3’(配列番号279);
(g)5’−CACCAUGCAGAUUAUGCGGAUCAAA−3’(配列番号280);
(h)5’−GCACAUAGGAGAGAUGAGCUUCCUA−3’(配列番号281);
(i)5’−GCCAACAUAUUCUACAGUGUUCUUA−3’(配列番号8);
(j)5’−CCCUCGCCGGAAGUUGUAUGGUUAA−3’(配列番号10);
(k)5’−CCUCAAGAGCAAACGUGACUUAUUU−3’(配列番号20);
(l)5’−CAAAGGACUUUAUACUUGUCGUGUA−3’(配列番号283);
(m)5’−CAUCACUCAGCGCAUGGCAAUAAUA−3’ (配列番号285);
(n)5’−CCACCACUUUAGACUGUCAUGCUAA−3’(配列番号286);
(o)5’−CGGACAAGUCUAAUCUGGAGCUGAU−3’ (配列番号287);
(p)5’−UGACCCACAUUGGCCACCAUCUGAA−3’(配列番号288);
(q)5’−GAGGGCCUCUGAUGGUGAUUGUUGA−3’(配列番号289);
(r)5’−CGAGCUCCGGCUUUCAGGAAGAUAA−3’(配列番号290);
(s)5’−CAAUCAAUGCCAUACUGACAGGAAA−3’(配列番号291);
(t)5’−GAAAGUAUUUCAGCUCCGAAGUUUA−3’(配列番号292);
(u)5’−CCUCUUCUGUAAGACACUCACAAUU−3’(配列番号13);
(v)5’−CCCUUGAGUCCAAUCACACAAUUAA−3’(配列番号15);
(w)5’−CCAAGUGAUUGAAGCAGAUGCCUUU−3’(配列番号17);
(x)5’−CCUCGGUCAUUUAUGUCUAUGUUCA−3’(配列番号293);
(y)5’−CAGAUCUCCAUUUAUUGCUUCUGUU−3’(配列番号294);
(z)5’−GACCAACAUGGAGUCGUGUACAUUA−3’(配列番号295);
(aa)5’−CCCUUGAGUCCAAUCACACAAUUAA−3’(配列番号296);
(bb)5’−CCAUGUUCUUCUGGCUACUUCUUGU−3’(配列番号297);
(cc)5’−UCAUUCAUAUUGGUCACCAUCUCAA−3’(配列番号298);
(dd)5’−GAGUUCUUGGCAUCGCGAAAGUGUA−3’(配列番号299);
(ee)5’−CAGCAGGAAUCAGUCAGUAUCUGCA−3’(配列番号300);
(ff)5’−CAGUGGUAUGGUUCUUGCCUCAGAA−3’(配列番号301);および
(jj)5’−CCACACUGAGCUCUCCUCCUGUUUA−3’(配列番号302)
からなる群より選択される、核酸分子。 - 前記核酸分子がRNAである、請求項1に記載の核酸分子。
- 請求項1に記載の核酸分子の相補体である、核酸分子。
- 前記核酸分子がRNAである、請求項3に記載の核酸分子。
- 前記核酸分子がDNAである、請求項3に記載の核酸分子。
- 以下:
(a)センス鎖:5’−CACAACAAAUGUGAAUGCAGACCAA−3’(配列番号5)およびアンチセンス鎖:5’−UUGGUCUGCAUUCACAUUUGUUGUG−3’(配列番号6);
(b)センス鎖:5’−GAGAGAUGAGCUUCCUACAGCACAA−3’(配列番号3)およびアンチセンス鎖:5’−UUGUGCUGUAGGAAGCUCAUCUCUC−3’(配列番号4);
(c)センス鎖:5’−CCUGAUGAGAUCGAGUACAUCUUCA−3’(配列番号1)およびアンチセンス鎖:5’−UGAAGAUGUACUCGAUCUCAUCAGG−3’(配列番号2);
(d)センス鎖:5’−GCCAACAUAUUCUACAGUGUUCUUA−3’(配列番号8)およびアンチセンス鎖:5’−UAAGAACACUGUAGAAUAUGUUGGC−3’(配列番号9);
(e)センス鎖:5’−CCCUCGCCGGAAGUUGUAUGGUUAA−3’(配列番号10)およびアンチセンス鎖:5’−UUAACCAUACAACUUCCGGCGAGGG−3’(配列番号11);
(f)センス鎖:5’−CCUCAAGAGCAAACGUGACUUAUUU−3’(配列番号20)およびアンチセンス鎖:5’−AAAUAAGUCACGUUUGCUCUUGAGG−3’(配列番号21);
(g)センス鎖:5’−CCUCUUCUGUAAGACACUCACAAUU−3’(配列番号13)およびアンチセンス鎖:5’−AAUUGUGAGUGUCUUACAGAAGAGG−3’(配列番号14);
(h)センス鎖:5’−CCCUUGAGUCCAAUCACACAAUUAA−3’(配列番号15)およびアンチセンス鎖:5’−UUAAUUGUGUGAUUGGACUCAAGGG−3’(配列番号16);ならびに
(i)センス鎖:5’−CCAAGUGAUUGAAGCAGAUGCCUUU−3’(配列番号17)およびアンチセンス鎖:5’−AAAGGCAUCUGCUUCAAUCACUUGG−3’(配列番号18)
からなる群より選択される、25塩基対の平滑末端二本鎖核酸分子。 - 前記二本鎖核酸分子がRNAである、請求項6に記載の二本鎖核酸分子。
- 前記核酸分子または前記二本鎖核酸分子が、化学的に修飾された少なくとも1つのヌクレオチドを含むことを特徴とする、請求項1〜5のいずれか1項に記載の核酸分子、または請求項6もしくは7に記載の二本鎖核酸分子。
- 前記少なくとも1つの化学的に修飾されたヌクレオチドが、2’−O−メチルリボースを含むヌクレオチドアナログであることを特徴とする、請求項8に記載の核酸分子または二本鎖核酸分子。
- 前記少なくとも1つの化学的に修飾されたヌクレオチドが、 配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号277、配列番号278、配列番号279、配列番号280、配列番号281、配列番号8、配列番号10、配列番号20、配列番号283、配列番号285、配列番号286、配列番号287、配列番号288、配列番号289、配列番号290、配列番号291、配列番号292、配列番号13、配列番号15、配列番号17、配列番号293、配列番号294、配列番号295、配列番号296、配列番号297、配列番号298、配列番号299、配列番号300、配列番号301および配列番号302から選択される配列中に存在することを特徴とする、請求項8に記載の核酸分子または二本鎖核酸分子。
- 前記少なくとも1つの化学的に修飾されたヌクレオチドが、配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号277、配列番号278、配列番号279、配列番号280、配列番号281、配列番号8、配列番号10、配列番号20、配列番号283、配列番号285、配列番号286、配列番号287、配列番号288、配列番号289、配列番号290、配列番号291、配列番号292、配列番号13、配列番号15、配列番号17、配列番号293、配列番号294、配列番号295、配列番号296、配列番号297、配列番号298、配列番号299、配列番号300、配列番号301および配列番号302から選択される配列の相補体中に存在することを特徴とする、請求項8に記載の核酸分子または二本鎖核酸分子。
- 請求項1〜11のいずれか1項に記載の核酸分子および薬学的に許容可能なキャリアを含む、組成物。
- 以下:
(a)配列番号2からなるアンチセンス鎖とのsiRNA、配列番号9からなるアンチセンス鎖とのsiRNA、配列番号14からなるアンチセンス鎖とのsiRNA、および薬学的に許容可能なキャリアを含む、組成物;
(b)配列番号2からなるアンチセンス鎖とのsiRNA、配列番号9からなるアンチセンス鎖とのsiRNA、配列番号16からなるアンチセンス鎖とのsiRNA、および薬学的に許容可能なキャリアを含む、組成物;
(c)配列番号2からなるアンチセンス鎖とのsiRNA、配列番号9からなるアンチセンス鎖とのsiRNA、配列番号18からなるアンチセンス鎖とのsiRNA、および薬学的に許容可能なキャリアを含む、組成物;
(d)配列番号2からなるアンチセンス鎖とのsiRNA、配列番号11からなるアンチセンス鎖とのsiRNA、配列番号14からなるアンチセンス鎖とのsiRNA、および薬学的に許容可能なキャリアを含む、組成物;
(e)配列番号2からなるアンチセンス鎖とのsiRNA、配列番号11からなるアンチセンス鎖とのsiRNA、配列番号16からなるアンチセンス鎖とのsiRNA、および薬学的に許容可能なキャリアを含む、組成物;
(f)配列番号2からなるアンチセンス鎖とのsiRNA、配列番号11からなるアンチセンス鎖とのsiRNA、配列番号18からなるアンチセンス鎖とのsiRNA、および薬学的に許容可能なキャリアを含む、組成物;
(g)配列番号2からなるアンチセンス鎖とのsiRNA、配列番号21からなるアンチセンス鎖とのsiRNA、配列番号14からなるアンチセンス鎖とのsiRNA、および薬学的に許容可能なキャリアを含む、組成物;
(h)配列番号2からなるアンチセンス鎖とのsiRNA、配列番号21からなるアンチセンス鎖とのsiRNA、配列番号16からなるアンチセンス鎖とのsiRNA、および薬学的に許容可能なキャリアを含む、組成物;
(i)配列番号2からなるアンチセンス鎖とのsiRNA、配列番号21からなるアンチセンス鎖とのsiRNA、配列番号18からなるアンチセンス鎖とのsiRNA、および薬学的に許容可能なキャリアを含む、組成物;
(j)配列番号4からなるアンチセンス鎖とのsiRNA、配列番号9からなるアンチセンス鎖とのsiRNA、配列番号14からなるアンチセンス鎖とのsiRNA、および薬学的に許容可能なキャリアを含む、組成物;
(k)配列番号4からなるアンチセンス鎖とのsiRNA、配列番号9からなるアンチセンス鎖とのsiRNA、配列番号16からなるアンチセンス鎖とのsiRNA、および薬学的に許容可能なキャリアを含む、組成物;
(l)配列番号4からなるアンチセンス鎖とのsiRNA、配列番号9からなるアンチセンス鎖とのsiRNA、配列番号18からなるアンチセンス鎖とのsiRNA、および薬学的に許容可能なキャリアを含む、組成物;
(m)配列番号4からなるアンチセンス鎖とのsiRNA、配列番号11からなるアンチセンス鎖とのsiRNA、配列番号14からなるアンチセンス鎖とのsiRNA、および薬学的に許容可能なキャリアを含む、組成物;
(n)配列番号4からなるアンチセンス鎖とのsiRNA、配列番号11からなるアンチセンス鎖とのsiRNA、配列番号16からなるアンチセンス鎖とのsiRNA、および薬学的に許容可能なキャリアを含む、組成物;
(o)配列番号4からなるアンチセンス鎖とのsiRNA、配列番号11からなるアンチセンス鎖とのsiRNA、配列番号18からなるアンチセンス鎖とのsiRNA、および薬学的に許容可能なキャリアを含む、組成物;
(p)配列番号4からなるアンチセンス鎖とのsiRNA、配列番号21からなるアンチセンス鎖とのsiRNA、配列番号14からなるアンチセンス鎖とのsiRNA、および薬学的に許容可能なキャリアを含む、組成物;
(q)配列番号4からなるアンチセンス鎖とのsiRNA、配列番号21からなるアンチセンス鎖とのsiRNA、配列番号16からなるアンチセンス鎖とのsiRNA、および薬学的に許容可能なキャリアを含む、組成物;
(r)配列番号4からなるアンチセンス鎖とのsiRNA、配列番号21からなるアンチセンス鎖とのsiRNA、配列番号18からなるアンチセンス鎖とのsiRNA、および薬学的に許容可能なキャリアを含む、組成物;
(s)配列番号6からなるアンチセンス鎖とのsiRNA、配列番号9からなるアンチセンス鎖とのsiRNA、配列番号14からなるアンチセンス鎖とのsiRNA、および薬学的に許容可能なキャリアを含む、組成物;
(t)配列番号6からなるアンチセンス鎖とのsiRNA、配列番号9からなるアンチセンス鎖とのsiRNA、配列番号16からなるアンチセンス鎖とのsiRNA、および薬学的に許容可能なキャリアを含む、組成物;
(u)配列番号6からなるアンチセンス鎖とのsiRNA、配列番号9からなるアンチセンス鎖とのsiRNA、配列番号18からなるアンチセンス鎖とのsiRNA、および薬学的に許容可能なキャリアを含む、組成物;
(v)配列番号6からなるアンチセンス鎖とのsiRNA、配列番号11からなるアンチセンス鎖とのsiRNA、配列番号14からなるアンチセンス鎖とのsiRNA、および薬学的に許容可能なキャリアを含む、組成物;
(w)配列番号6からなるアンチセンス鎖とのsiRNA、配列番号11からなるアンチセンス鎖とのsiRNA、配列番号16からなるアンチセンス鎖とのsiRNA、および薬学的に許容可能なキャリアを含む、組成物;
(x)配列番号6からなるアンチセンス鎖とのsiRNA、配列番号11からなるアンチセンス鎖とのsiRNA、配列番号18からなるアンチセンス鎖とのsiRNA、および薬学的に許容可能なキャリアを含む、組成物;
(y)配列番号6からなるアンチセンス鎖とのsiRNA、配列番号21からなるアンチセンス鎖とのsiRNA、配列番号14からなるアンチセンス鎖とのsiRNA、および薬学的に許容可能なキャリアを含む、組成物;
(z)配列番号6からなるアンチセンス鎖とのsiRNA、配列番号21からなるアンチセンス鎖とのsiRNA、配列番号16からなるアンチセンス鎖とのsiRNA、および薬学的に許容可能なキャリアを含む、組成物;および
(aa)配列番号6からなるアンチセンス鎖とのsiRNA、配列番号21からなるアンチセンス鎖とのsiRNA、配列番号18からなるアンチセンス鎖とのsiRNA、および薬学的に許容可能なキャリアを含む、組成物
からなる群より選択される、組成物。 - 以下:
(a)配列番号2からなるアンチセンス鎖とのsiRNA、配列番号9からなるアンチセンス鎖とのsiRNA、および薬学的に許容可能なキャリアを含む、組成物;
(b)配列番号2からなるアンチセンス鎖とのsiRNA、配列番号11からなるアンチセンス鎖とのsiRNA、および薬学的に許容可能なキャリアを含む、組成物;
(c)配列番号2からなるアンチセンス鎖とのsiRNA、配列番号21からなるアンチセンス鎖とのsiRNA、および薬学的に許容可能なキャリアを含む、組成物;
(d)配列番号4からなるアンチセンス鎖とのsiRNA、配列番号9からなるアンチセンス鎖とのsiRNA、および薬学的に許容可能なキャリアを含む、組成物;
(e)配列番号4からなるアンチセンス鎖とのsiRNA、配列番号11からなるアンチセンス鎖とのsiRNA、および薬学的に許容可能なキャリアを含む、組成物;
(f)配列番号4からなるアンチセンス鎖とのsiRNA、配列番号21からなるアンチセンス鎖とのsiRNA、および薬学的に許容可能なキャリアを含む、組成物;
(g)配列番号6からなるアンチセンス鎖とのsiRNA、配列番号9からなるアンチセンス鎖とのsiRNA、および薬学的に許容可能なキャリアを含む、組成物;
(h)配列番号6からなるアンチセンス鎖とのsiRNA、配列番号11からなるアンチセンス鎖とのsiRNA、および薬学的に許容可能なキャリアを含む、組成物;
(i)配列番号6からなるアンチセンス鎖とのsiRNA、配列番号21からなるアンチセンス鎖とのsiRNA、および薬学的に許容可能なキャリアを含む、組成物;
(j)配列番号2からなるアンチセンス鎖とのsiRNA、配列番号14からなるアンチセンス鎖とのsiRNA、および薬学的に許容可能なキャリアを含む、組成物;
(k)配列番号2からなるアンチセンス鎖とのsiRNA、配列番号16からなるアンチセンス鎖とのsiRNA、および薬学的に許容可能なキャリアを含む、組成物;
(l)配列番号4からなるアンチセンス鎖とのsiRNA、配列番号14からなるアンチセンス鎖とのsiRNA、および薬学的に許容可能なキャリアを含む、組成物;
(m)配列番号4からなるアンチセンス鎖とのsiRNA、配列番号16からなるアンチセンス鎖とのsiRNA、および薬学的に許容可能なキャリアを含む、組成物;
(n)配列番号6からなるアンチセンス鎖とのsiRNA、配列番号14からなるアンチセンス鎖とのsiRNA、および薬学的に許容可能なキャリアを含む、組成物;および
(o)配列番号6からなるアンチセンス鎖とのsiRNA、配列番号16, および薬学的に許容可能なキャリア.を含む、組成物
からなる群より選択される、組成物。 - RNA干渉を誘導し、かつ目的の遺伝子の発現を減少させる、1または複数のさらなる核酸分子をさらに含む、請求項12〜14のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記1または複数のさらなる核酸分子は、ヒトVEGF、ヒトVEGFR1またはヒトVEGFR2の発現を減少させる、請求項15に記載の組成物。
- 前記1または複数のさらなる核酸分子のうちの少なくとも1つは、新血管形成を促進する遺伝子の発現を減少させる、請求項15に記載の組成物。
- 前記1または複数のさらなる核酸分子は、VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、PDGF、PDGFR−α、PDGFR−β、EGF、EGFR、RAF−a、RAF−c、AKT、RAS、NFkB、HIF、bFGF、bFGFR、Her−2、c−Met、c−MycおよびHGFからなる群より選択される遺伝子の発現を減少させる、請求項15に記載の組成物。
- 前記キャリアは核酸送達ビヒクルである、請求項12〜14のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記核酸送達ビヒクルは合成物である、請求項19に記載の組成物。
- 前記合成核酸送達ビヒクルが、カチオン性ポリマー−核酸複合体を含む、請求項20に記載の組成物。
- 前記カチオン性ポリマーはポリエチレンイミンである、請求項21に記載の組成物。
- 前記カチオン性ポリマーは、ヒスチジン−リジンコポリマーである、請求項21に記載の組成物。
- 前記合成核酸送達ビヒクルはさらに、親水性ポリマーを含む、請求項21に記載の組成物。
- 前記保護的親水性層は、ポリエチレングリコール、ポリアセタール、またはポリオキサゾリンからなる群より選択される要素を含む、請求項24に記載の組成物。
- 前記合成核酸ビヒクルは、標的化部分をさらに含む、請求項21に記載の組成物。
- 前記合成核酸ビヒクルは、標的化部分をさらに含む、請求項24に記載の組成物。
- 前記標的化部分は腫瘍特異的分子または新血管形成特異的分子に結合する、請求項27に記載の組成物。
- 前記標的化部分は、内皮細胞に結合する、請求項27に記載の組成物。
- 前記標的化部分は、血管内皮細胞におけるインテグリンに結合する、請求項29に記載の組成物。
- 前記標的化部分は、アミノ酸配列RGDを含むペプチドである、請求項30に記載の組成物。
- 前記RGDを含むペプチドは、環状ペプチドである、請求項31に記載の組成物。
- 前記合成核酸送達ビヒクルは、
(a)PEIを含むコア領域;
(b)PEGを含む保護的親水性層;および
(c)環状RGD含有ペプチド標的化部分
を含む、請求項20に記載の組成物。 - 抗癌剤、抗炎症剤、および抗感染剤からなる群より選択されるさらなる治療剤を含む、請求項12〜14のいずれか1項に記載の組成物。
- さらなる抗血管形成剤を含む、請求項12〜14のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記抗血管形成剤は、ヒトVEGFのインヒビター、ヒトVEGFR1のインヒビター、およびヒトVEGFR2のインヒビターからなる群より選択されるインヒビターである、請求項35に記載の組成物。
- 新脈管形成の低減が必要な被験体において新脈管形成を低減させるための、請求項12〜14または33のいずれか1項に記載の組成物。
- 腫瘍成長の低減が必要な被験体において腫瘍成長を低減させるための、請求項12〜14または33のいずれか1項に記載の組成物。
- 細胞におけるVEGF、VEGFR1またはVEGFR2タンパク質レベルのうちの1または複数を減少させるための、請求項12〜14または33のいずれか1項に記載の組成物。
- 細胞におけるVEGFおよびVEGFR1のタンパク質レベルが減少する、請求項39に記載の組成物。
- 細胞におけるVEGFおよびVEGFR2のタンパク質レベルが減少する、請求項39に記載の組成物。
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