JP5273740B2 - ｐ５３の発現促進方法およびそれに用いるｐ５３発現促進剤 - Google Patents

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Description

本発明は、細胞におけるｐ５３の発現を促進する方法、それに用いるｐ５３発現促進剤、およびその用途に関する。
ＤＮＡが損傷を受けると、細胞はその損傷の修復を行うが、修復が不可能な場合、細胞はアポトーシスを引き起こす。このアポトーシスの過程において、重要な役割を示すタンパク質として、ｐ５３が知られている。ｐ５３は、転写因子であって、３９３個のアミノ酸から構成される分子量５３，０００Ｄａの核タンパク質である。ｐ５３は、正常細胞では速やかに分解されるため、細胞内でのタンパク質発現レベルは低い。しかし、正常細胞がＤＮＡ損傷等を受けると、そのシグナル伝達によって、ｐ５３はリン酸化されて安定化する。その結果、ｐ５３に依存して転写される各種遺伝子（ｐ２１遺伝子、ｎｏｘａ遺伝子、ｐｕｍａ遺伝子、ｐｉｇ３遺伝子等）の転写が促進され、これらの遺伝子産物の関与によって、細胞のアポトーシスが進行する。
しかしながら、前述のように、正常細胞であればアポトーシスが進行するようなＤＮＡ損傷であっても、腫瘍細胞の場合、アポトーシスが起こり難い傾向にある。この原因の一つとして、ｐ５３遺伝子の変異が知られている。ｐ５３遺伝子が変異すると、発現したｐ５３タンパク質は機能を喪失しているため、結果的に、アポトーシスの進行が妨げられるのである。そして、ｐ５３遺伝子の変異が、腫瘍の進展に高頻度で関与しているという事実からも、ｐ５３は、腫瘍サプレッサーとして重要な役割を果たすことがわかっている（非特許文献１〜３）。しかしながら、ｐ５３遺伝子の変異は、腫瘍の進展過程（悪性化）の比較的遅い段階で見られる現象であり、臨床的に診断された多くの腫瘍は、ｐ５３遺伝子の変異がなく、且つ、ｐ５３の発現が減少するという現象が報告されている。例えば、乳腺腫瘍の場合、約８０％は、ｐ５３遺伝子の変異を有しておらず、且つ、ｐ５３のｍＲＮＡ発現量が、周囲の正常組織と比較して約１／５〜１／１０倍の減少を示していることが報告されている（非特許文献１、４、５）。
Steele, R. et al. Br. J. Surg. 85, 1460-7 (1998). Levine,A. et al. Cell 88, 323-331(1997). Vogelstein, B. et al. Nature 408, 307-310 (2000). Pharoah, P. et al. Br. J. Cancer 80, 1968-1973 (1999). Raman, V. et al. Nature 405, 974-978 (2000).
このため、腫瘍細胞において、ｐ５３ｍＲＮＡの発現量の減少を抑制し、ｐ５３ｍＲＮＡの発現量を維持または増加させれば、例えば、ｐ５３に依存して転写される各種遺伝子の転写が促進され、得られる各種遺伝子産物によって、腫瘍細胞のアポトーシスを進行させることが可能になると考えられる。
そこで、本発明は、ｐ５３のｍＲＮＡ発現を促進する方法およびそれに用いる発現促進剤の提供を目的とする。
前記目的を達成するために、本発明のｐ５３発現促進方法は、細胞におけるｐ５３遺伝子の発現を促進する方法であって、ｖｅｇｆ−Ａ遺伝子のエキソン１から転写されるＲＮＡと、ｐ５３遺伝子から転写されるｍＲＮＡとの結合を阻害することにより、ｐ５３遺伝子の発現を促進することを特徴とする。
本発明のｐ５３発現促進剤は、本発明のｐ５３発現促進方法に使用するｐ５３発現促進剤であって、ｖｅｇｆ−Ａ遺伝子のエキソン１から転写されるＲＮＡと、ｐ５３遺伝子から転写されるｍＲＮＡとの結合を阻害する、下記（Ａ１）〜（Ａ４）からなる群から選択された少なくとも一つの結合阻害剤を含むことを特徴とする。
（Ａ１）ｖｅｇｆ−Ａ遺伝子のエキソン１から転写されたＲＮＡを分解する、ｓｉＲＮＡ、リボヌクレアーゼで分解されることによりｓｉＲＮＡを遊離するｓｉＲＮＡ前駆体、アンチセンスおよびリボザイムからなる群から選択された少なくとも一つの結合阻害剤
（Ａ２）ｖｅｇｆ−Ａ遺伝子のエキソン１からのＲＮＡの転写を阻害する、ｓｉＲＮＡ、リボヌクレアーゼで分解されることによりｓｉＲＮＡを遊離するｓｉＲＮＡ前駆体、アンチセンス、リボザイムおよびデコイ核酸からなる群から選択された少なくとも一つの結合阻害剤
（Ａ３）ｖｅｇｆ−Ａ遺伝子のエキソン１から転写されたＲＮＡに結合する、ｐ５３遺伝子から転写されたｍＲＮＡとは別の核酸を含む結合阻害剤
（Ａ４）前記（Ａ１）〜（Ａ３）からなる群から選択された少なくとも一つの結合阻害剤をコードするＤＮＡが挿入された発現ベクターを含む結合阻害剤
本発明のアポトーシス促進方法は、細胞のアポトーシスを促進する方法であって、本発明のｐ５３発現促進方法により、細胞内におけるｐ５３の発現を促進することを特徴とする。
本発明のアポトーシス促進剤は、細胞のアポトーシスを促進するアポトーシス促進剤であって、本発明のｐ５３発現促進剤を含むことを特徴とする。
本発明の亢進方法は、抗がん剤に対する細胞の感受性を亢進する方法であって、本発明のｐ５３発現促進方法により、前記細胞におけるｐ５３の発現を促進させることを特徴とする。
本発明の亢進剤は、抗がん剤に対する細胞の感受性を亢進する亢進剤であって、本発明のｐ５３発現促進剤を含むことを特徴とする。
本発明の治療方法は、生体内のがん細胞に本発明のｐ５３発現促進剤を投与する工程を含む。
本発明の抗がん剤は、本発明のｐ５３発現促進剤を含むことを特徴とする。
本発明のｐ５３ｍＲＮＡ結合剤は、ｐ５３ｍＲＮＡに結合可能な結合剤であって、核酸を含み、前記核酸が、配列番号１に示すｖｅｇｆ−Ａ ｍＲＮＡにおける６９４番目−７１４番目の配列からなるＲＮＡを含むことを特徴とする。
本発明のｖｅｇｆ−Ａ ｍＲＮＡ結合剤は、ｖｅｇｆ−Ａ ｍＲＮＡに結合可能な結合剤であって、核酸を含み、前記核酸が、配列番号２に示すｐ５３ｍＲＮＡにおける４６２番目−４８１番目の配列からなるＲＮＡを含むことを特徴とする。
本発明のスクリーニング方法は、ｐ５３の発現を促進する発現促進剤のスクリーニング方法であって、下記（Ａ）工程〜（Ｃ）工程を有することを特徴とする。
（Ａ） 候補物質の存在下、本発明のｐ５３ｍＲＮＡ結合剤と、本発明のｖｅｇｆ−Ａ ＲＮＡ結合剤とを接触させる工程
（Ｂ） 前記候補物質による、前記ｐ５３ｍＲＮＡ結合剤と前記ｖｅｇｆ−Ａ ＲＮＡ結合剤との結合の阻害を検出する工程
（Ｃ） 前記ｐ５３ｍＲＮＡ結合剤と前記ｖｅｇｆ−Ａ ＲＮＡ結合剤との結合を阻害した候補物質を、ｐ５３発現促進剤として選択する工程。
以下、ｖｅｇｆ−Ａ遺伝子から転写されるＲＮＡは、「ｖｅｇｆ−Ａ ＲＮＡ」といい、前記ｖｅｇｆ−Ａ ＲＮＡは、例えば、ｖｅｇｆ−Ａ遺伝子から転写されるｍＲＮＡの意味も含む。また、ｐ５３遺伝子から転写されるｍＲＮＡは、「ｐ５３ｍＲＮＡ」という。
腫瘍細胞におけるｐ５３ｍＲＮＡの発現量の減少の原因を突き止めるべく、本発明者らは、鋭意研究を行った。その結果、血管内皮増殖因子Ａ（ＶＥＧＦ−Ａ）のＲＮＡ（ｖｅｇｆ−Ａ ＲＮＡ）が、ｐ５３ｍＲＮＡの発現に関与していることが明らかとなった。そして、さらなる研究を行った結果、ｖｅｇｆ−Ａ遺伝子から転写されるＲＮＡの中でもエキソン１から転写されるＲＮＡが、ｐ５３ｍＲＮＡに結合することで、ｐ５３ｍＲＮＡの発現を抑制していることを突き止めた。そこで、ｖｅｇｆ−Ａ遺伝子のエキソン１から転写されるＲＮＡと、ｐ５３ｍＲＮＡとの結合の阻害により、ｐ５３ｍＲＮＡの発現減少を回避し、ｐ５３の発現（ｐ５３ｍＲＮＡの転写およびｐ５３タンパク質の翻訳）が促進されることから、本発明を完成するに到った。このように、本発明によれば、ｐ５３の発現を促進できるため、これに伴って、ｐ５３に依存して転写されるアポトーシスに関与する遺伝子の転写を促進できる。このため、最終的には、目的の細胞のアポトーシスの進行を促進することができる。特に、医療分野においては、腫瘍の悪性化の予防やがんの治療に、細胞のアポトーシスが利用されることから、本発明は、がん等の治療において有用な手段になるといえる。また、ｐ５３の発現量が低下した腫瘍細胞においては、抗がん剤に対する感受性が低下し、抗がん剤耐性を示すことが知られている。しかしながら、本発明によれば、細胞の抗がん剤に対する感受性を亢進できるため、従来公知の抗がん剤を効率良く作用させることも可能となる。以上のように、本発明は、がん等の治療をはじめとする医療分野において、極めて優れた手法といえる。なお、ｐ５３ｍＲＮＡの発現量の低下は、以下のようなメカニズムによると考えられる。すなわち、転写されたｐ５３ｍＲＮＡに、ｖｅｇｆ−Ａ遺伝子のエキソン１から転写されたＲＮＡが結合して、ヘテロ二本鎖ＲＮＡが形成され、翻訳プロセスにおいて、ヘテロ二本鎖ＲＮＡを形成しているｐ５３ｍＲＮＡが分解されるというメカニズムである。なお、本発明は、このメカニズムに限定されるものではない。
なお、ＶＥＧＦ−Ａタンパク質は、腫瘍抑制因子として働くｐ５３タンパク質とは反対に、腫瘍血管の新生に関与し、さらには腫瘍細胞の生存因子としても機能することから、腫瘍進展においてキーとなる役割を果たすことが知られている。そこで、従来、ＶＥＧＦ−Ａタンパク質の発現を抑制することにより、腫瘍の悪性化を抑制する技術が開発されている。具体的には、ｖｅｇｆ ｍＲＮＡにおけるタンパク質コード領域のエキソン２、３、４および５をターゲットとするｓｉＲＮＡにより、ＶＥＧＦ−Ａタンパク質の発現を抑制することが報告されている。しかしながら、これまでに、ｐ５３ｍＲＮＡの発現量低下に、ＲＮＡが関与すること、さらに、ｖｅｇｆ−Ａ遺伝子のエキソン１からのＲＮＡが関与することについては、何ら報告されていない。
図１は、本発明の実施例Ａ１の結果であり、（ａ）は、各細胞におけるｖｅｇｆ ｍＲＮＡの発現を示す写真であり、（ｂ）は、抗がん剤５−ＦＵで処理した各種細胞のアポトーシスの割合（％）を示すグラフであり、（ｃ）は、ｖｅｇｆ ｓｉＲＮＡの発現細胞におけるｐ５３ｍＲＮＡおよびｐ５３タンパク質の発現を示す写真であり、（ｄ）は、ｖｅｇｆ ｓｉＲＮＡの発現細胞におけるｐ５３ターゲット遺伝子のｍＲＮＡの発現を示す写真である。 図２は、本発明の実施例Ａ２の結果であり、（ａ）は、各種プラスミドコンストラクトを示す概略図であり、（ｂ）は、各細胞におけるｐ５３ｍＲＮＡの発現を示す写真であり、（ｃ）は、各細胞におけるｐ５３タンパク質の結果を示す写真である。 図３は、本発明の実施例Ａ３の結果であり、（ａ）は、各種プラスミドコンストラクトを示す概略図であり、（ｂ）は、各細胞におけるｐ５３ｍＲＮＡの結果を示す写真、（ｃ）は、各細胞におけるｐ５３ｍＲＮＡ、ｐ５３タンパク質およびＬ−ＶＥＧＦタンパク質の発現を示す写真である。 図４は、本発明の前記実施例Ａ３の参考例であり、各種遺伝子における５’ＵＴＲとＣＡＴｍＲＮＡとのキメラｍＲＮＡを発現するプラスミドおよびｐ５３発現プラスミドを共導入したＨ１２９９細胞における、ｐ５３ｍＲＮＡの発現を示す写真である。 図５は、本発明の実施例Ａ４の結果であり、（ａ）は、各細胞における内在性ｐ５３ｍＲＮＡの発現を示す写真であり、（ｂ）は、各細胞における内在性ｐ５３タンパク質の発現を示す写真であり、（ｃ）は、ｎｏｘａ ｍＲＮＡ、ｂａｘ ｍＲＮＡおよびｐ２１ ｍＲＮＡの発現を示す写真である。 図６は、前記実施例Ａ４の結果であり、（ｄ）は、５−ＦＵの濃度変化に対する各種細胞のアポトーシスの割合（％）を示すグラフであり、（ｅ）は、５−ＦＵで処理した各種細胞の経時的なアポトーシスの割合（％）の変化を示すグラフである。 図７は、本発明の実施例Ａ５の結果であり、（ａ）は、各細胞における内在性ｐ５３ｍＲＮＡおよびその分解物の存在を示す写真であり、（ｂ）は、各細胞におけるｐ５３ｍＲＮＡの発現を示す写真であり、（ｃ）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるｖｅｇｆ ５’ＵＴＲとｐ５３ｍＲＮＡとの会合を示す写真である。 図８は、前記実施例Ａ５の結果であり、（ｄ）は、ｖｅｇｆ ５’ＵＴＲ共存下での無細胞タンパク質合成反応液におけるｐ５３ｍＲＮＡおよびその分解物の存在を示す写真であり、（ｅ）は、ｖｅｇｆ ５’ＵＴＲ共存下での、無細胞タンパク質反応液におけるｐ５３タンパク質の合成を示すオートラジオグラフィーである。 図９は、本発明の実施例Ａ６における、各種プラスミドコンストラクトを示す概略図である。 図１０は、本発明の実施例Ａ６において、各種がん細胞におけるｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡの存在を示す写真である。 図１１は、前記実施例Ａ６の結果であり、（ａ）および（ｂ）は、各細胞におけるｐ５３ｍＲＮＡの発現を示す写真である。 図１２は、本発明の実施例Ａ７の結果であり、（ａ）は、ｖｅｇｆ−Ａ ５’ＵＴＲを発現する導入細胞を移植したマウスの写真であり、（ｂ）は、変異型ｖｅｇｆ−Ａ ５’ＵＴＲを発現する導入細胞を移植したマウスの写真である。 図１３は、本発明の前記実施例Ａ７において、導入細胞を移植したマウスにおける腫瘍体積の経時的変化を示すグラフである。 図１４は、本発明の実施例Ａ８において、各種抗がん剤で処理した各種ｖｅｇｆ５’ＵＴＲの発現細胞のアポトーシスの割合（％）を示すグラフである。 図１５は、本発明の実施例Ａ９において、各種抗がん剤で処理した各種ｓｉＲＮＡ発現細胞のアポトーシスの割合（％）を示すグラフである。 図１６は、本発明の実施例Ａ１０において、各種抗がん剤で処理した各種ｓｉＲＮＡ発現細胞の相対的生存率（％）を示すグラフである。 図１７は、本発明の実施例Ａ１１の結果であり、（ａ）は、各種プラスミドコンストラクトを示す概略図であり、（ｂ）は、ｐ５３ｍＲＮＡの発現レベルを示す写真である。 図１８は、本発明の実施例Ｂ１の結果を示す図であり、（ａ）は、各種発現ベクターを導入した細胞のｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡの発現を示す写真であり、（ｂ）は、前記導入細胞のｐ５３ｍＲＮＡの発現を示すグラフであり、（ｃ）は、前記導入細胞のｐ５３タンパク質の発現を示す写真であり、（ｄ）は、各種抗がん剤で処理した前記導入細胞のアポトーシスの割合（％）を示すグラフであり、（ｅ）は、前記導入細胞の腫瘍体積の経時変化を示すグラフである。 図１９は、本発明の実施例Ｂ１の結果を示す図であり、（ｆ）は、前記細胞における腫瘍を示す写真である。 図２０は、本発明の実施例Ｂ２において、ｖｅｇｆ ｍＲＮＡに対するｓｉＲＮＡを発現する細胞における腫瘍体積の経時変化を示すグラフである。 図２１は、本発明の実施例Ｂ３の結果を示す図であり、（ａ）は、ｖｅｇｆ ｍＲＮＡに対するｓｉＲＮＡの発現細胞におけるｖｅｇｆ ｍＲＮＡならびにｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡの発現を示すグラフまたは写真であり、（ｂ）は、前記ｓｉＲＮＡの発現細胞におけるアポトーシスの割合（％）を示すグラフであり、（ｃ）は、前記ｓｉＲＮＡの発現細胞におけるｐ５３ｍＲＮＡの発現を示すグラフであり、（ｄ）は、前記ｓｉＲＮＡの発現細胞におけるｐ５３タンパク質の発現を示す写真である。 図２２は、本発明の実施例Ｂ３の結果を示す図であり、（ｅ）は、前記ｓｉＲＮＡの発現細胞におけるｐ５３ターゲット遺伝子のｍＲＮＡの発現を示すグラフであり、（ｆ）は、各種ストレスに曝した細胞における各種ＲＮＡの発現を示す写真である。 図２３は、本発明の実施例Ｂ４の結果を示す図であり、（ａ）は、各種発現ベクターを導入した細胞におけるｐ５３ｍＲＮＡならびにｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡの発現を示す写真であり、（ｂ）および（ｃ）は、ｐ５３ｍＲＮＡとｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡとの相互作用領域を示す図である。 図２４は、本発明の実施例Ｂ４の結果を示す図であり、（ｄ）は、ｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡの二次構造を示す図であり、（ｅ）は、ｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡにおける人為的に欠損させた領域を示す図であり、（ｆ）は、部分的に欠損したｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡを発現させた細胞におけるＲＮＡの発現を示す写真であり、（ｇ）は、ＲＮＡプルダウンアッセイによる各種ｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡとｐ５３ｍＲＮＡとの結合を示す写真である。 図２５は、本発明の実施例Ｃ１の結果を示す図であり、（ａ）は、ｐ５３デコイを導入した細胞におけるｐ５３ｍＲＮＡの発現を示す写真であり、（ｂ）は、前記細胞の生存率を示すグラフである。 図２６は、本発明の実施例Ｃ２の結果を示す図であり、（ａ）は、ｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡに対するアンチセンスを導入した細胞におけるｐ５３ｍＲＮＡの発現を示す写真であり、（ｂ）は、前記細胞の生存率を示すグラフである。
本発明において、「ｐ５３の発現」とは、直接的にｐ５３ｍＲＮＡの発現（すなわち転写）を意味するが、間接的に、ｐ５３タンパク質の発現（すなわち翻訳）も含む。本発明において、ｍＲＮＡは、ｍＲＮＡ前駆体（一次転写ｍＲＮＡ）およびプロセシング（スプライシング）後の成熟ＲＮＡのいずれであってもよい。また、ＲＮＡは、前記ｍＲＮＡ前駆体の部分配列でもよいし、前記成熟ＲＮＡの部分配列であってもよい。
本発明において、ｖｅｇｆ−Ａは、血管内皮増殖因子Ａ（ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ Ａ）である。本発明において、配列番号１は、ヒトｖｅｇｆ−Ａ遺伝子から転写される成熟ｍＲＮＡの全配列、すなわち、イントロンを除き、非翻訳領域を含む完全長の成熟ｍＲＮＡを示す。配列番号１において、１−１１０４番目の領域が「エキソン１領域」、１−１０３８番目の領域が「５’ＵＴＲ領域」である。配列番号１における６００番目−８７９番目の領域は、小分子ＲＮＡとして発現する領域である。以下、この領域からなるＲＮＡを、ｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡまたはＩｒｅｓＲＮＡという。５’ＵＴＲおよびＩｒｅｓＲＮＡは、非翻訳性のＲＮＡである。エキソン１領域における非翻訳性の領域とは、開始コドン（配列番号１の１０３９番目からのＡＵＧ）より上流の領域を意味する。配列番号１において、１０３９−１０４１番目の領域が「開始コドン（ａｕｇ）」、１６８４−１６８６番目の領域が「終止コドン（ｕｇａ）」である。この成熟ｍＲＮＡ配列は、例えば、その８塩基目以降が、ＮＣＢＩアクセッションＮｏ．ＮＭ＿００３３７６に登録されている。なお、配列番号１において、「ｕ」を「ｔ」で表わした配列が、ｖｅｇｆ−Ａ遺伝子のｃＤＮＡの配列である。また、配列番号４５は、ヒトｖｅｇｆ−Ａ遺伝子の一次転写産物の部分配列、すなわち、イントロンを含む、ｍＲＮＡ前駆体の部分配列を示す。配列番号４５において、１−１１０４番目までの領域は、前記配列番号１と同様であり、１１０５番目以降は、「イントロン１」の５’側の部分配列である。なお、配列番号４５において、「ｕ」を「ｔ」で表わした配列が、ｖｅｇｆ−Ａ遺伝子のゲノムＤＮＡの部分配列であり、例えば、ＮＣＢＩアクセッションＮｏ．ＡＬ１３６１３１.１５に登録されている。本発明において、ｖｅｇｆ−Ａ ｍＲＮＡの配列は、前記配列番号１の配列には制限されず、例えば、ＳＮＰ等の種々の多型を有する配列であってもよい。
また、配列番号２には、ヒトｐ５３遺伝子から転写される成熟ｍＲＮＡの全配列、すなわち、イントロンを除き、非翻訳領域を含む完全長の成熟ｍＲＮＡを示す。この全配列は、例えば、Ensemble Transcript ID:ENST00000269305に登録されている。配列番号２において、２５２番目−２５４番目の領域が、「開始コドン（ａｕｇ）」、１４３１−１４３３番目の領域が、「終止コドン（ｕｇａ）」である。本発明において、ｐ５３ｍＲＮＡの配列は、前記配列番号２の配列には制限されず、例えば、ＳＮＰ等の種々の多型を有する配列であってもよい。
＜ｐ５３発現促進方法＞
本発明のｐ５３発現促進方法は、前述のように、細胞におけるｐ５３遺伝子の発現を促進する方法であって、ｖｅｇｆ−Ａ遺伝子のエキソン１から転写されるＲＮＡと、ｐ５３遺伝子から転写されるｍＲＮＡとの結合を阻害することにより、ｐ５３遺伝子の発現を促進することを特徴とする。この結合阻害の工程を、以下、（ａ）工程ともいう。
本発明は、前述のように、ｖｅｇｆ−Ａ ＲＮＡとｐ５３ｍＲＮＡとの結合阻害により、ｖｅｇｆ−Ａ ＲＮＡによるｐ５３の発現抑制を抑制できることから、「ｐ５３の発現抑制を阻害する方法」、「ｐ５３の発現回復方法」、「ｐ５３の発現の維持方法」ということもできる。なお、本発明において、ｐ５３ｍＲＮＡとの結合が阻害される、ｖｅｇｆ−Ａ遺伝子のエキソン１から転写されるＲＮＡとは、例えば、エキソン１全体から転写されたＲＮＡ、前記エキソン１を含む領域から転写されたＲＮＡ、エキソン１の部分領域から転写されたＲＮＡ、エキソン１の部分領域を含む領域から転写されたＲＮＡのいずれであってもよい。
本発明の前記（ａ）工程において、ｖｅｇｆ−Ａ遺伝子のエキソン１から転写されるＲＮＡと、ｐ５３遺伝子から転写されるｍＲＮＡとの結合を阻害する方法としては、例えば、下記（ａ１）工程〜（ａ３）工程からなる群から選択された少なくとも一つの工程を含む方法があげられる。本発明においては、いずれか一種類の工程を含んでもよいし、二種類以上の工程を含んでもよい。また、二種類以上の工程は、例えば、同時に行ってもよいし、別個に行ってもよい。
（ａ１）ｖｅｇｆ−Ａ遺伝子のエキソン１から転写されたＲＮＡを分解する工程
（ａ２）ｖｅｇｆ−Ａ遺伝子のエキソン１からのＲＮＡの転写を阻害する工程
（ａ３）ｖｅｇｆ−Ａ遺伝子のエキソン１から転写されたＲＮＡに、ｐ５３遺伝子から転写されたｍＲＮＡとは別の核酸を結合させることで、前記ＲＮＡとｐ５３遺伝子から転写されたｍＲＮＡとの結合を阻害する工程
まず、前記（ａ１）工程について説明する。前記（ａ１）工程においては、例えば、転写されたＲＮＡが減少すればよく、そのメカニズムは特に制限されないが、例えば、分解があげられる。本発明において分解は、例えば、切断の意味も含む。前記（ａ１）工程によれば、ｖｅｇｆ−Ａ遺伝子のエキソン１からＲＮＡが転写されても、その転写物を分解（または切断）するため、結果的に前記ＲＮＡの発現量（転写量）を抑制できる。このため、ｖｅｇｆ−Ａ遺伝子のエキソン１から転写されたＲＮＡが、ｐ５３ｍＲＮＡに結合することを抑制でき、結果的に、ｐ５３ｍＲＮＡの発現抑制を防止して、ｐ５３の発現を促進できる。
前記（ａ１）工程において、分解の対象となるＲＮＡを、以下、ターゲットＲＮＡといい、その領域をターゲット領域という。前記（ａ１）工程において、ｖｅｇｆ−Ａ遺伝子のエキソン１から転写されたＲＮＡは、例えば、ｖｅｇｆ−Ａ ｍＲＮＡにおけるエキソン１ＲＮＡの全体が分解されてもよいし、エキソン１ＲＮＡの部分が分解されてもよい。すなわち、前記（ａ１）工程において、ターゲットＲＮＡは、エキソン１ＲＮＡの全体でもよいし、エキソン１ＲＮＡの部分であってもよい。また、前記ターゲットＲＮＡは、ｖｅｇｆ−Ａ遺伝子から転写されたＲＮＡにおける、前記エキソン１ＲＮＡを含む領域からなるＲＮＡでもよいし、前記エキソン１ＲＮＡの部分配列からなるＲＮＡでもよいし、前記エキソン１の部分配列を含む領域からなるＲＮＡであってもよい。
前記ターゲットＲＮＡは、例えば、少なくとも配列番号１における６００番目−８７９番目の配列の全部または一部の配列からなるＲＮＡであることが好ましい。すなわち、前記ターゲットＲＮＡは、ｖｅｇｆ−Ａ ｍＲＮＡのエキソン１ＲＮＡ内に存在する、前記ＩｒｅｓＲＮＡの全部または部分であることが好ましい。また、前記ターゲットＲＮＡは、ｖｅｇｆ−Ａ ｍＲＮＡにおける、前記ＩｒｅｓＲＮＡを含む領域からなるＲＮＡでもよいし、前記ＩｒｅｓＲＮＡの部分を含む領域からなるＲＮＡであってもよい。前記ターゲットＲＮＡにおける前記ＩｒｅｓＲＮＡの部分配列は、例えば、その塩基数が、１００〜１５０塩基であり、好ましくは８０〜１００塩基であり、より好ましくは２０〜４０塩基である。また、前記ＩｒｅｓＲＮＡの部分配列としては、例えば、配列番号１における、６９４番目−７１４番目、６９３番目−７１４番目、６９１番目−７０３番目、もしくは、７１１番目−７２３番目の配列からなるＲＮＡ、または、前記ＲＮＡを含む配列であることが好ましい。なお、本発明は、これには制限されない。
前記ターゲットＲＮＡの具体例を、以下に示す。これらは、いずれか一種類をターゲットＲＮＡとしてもよいし、二種類以上をターゲットＲＮＡとしてもよい。また、これらのＲＮＡを含む領域からなるＲＮＡをターゲットＲＮＡとしてもよい。なお、本発明は、これらには制限されない。
（１）配列番号１における６００番目−８７９番目の配列からなるＲＮＡ
（２）配列番号１における６５９番目−８７９番目の配列からなるＲＮＡ
（３）配列番号１における６５９番目−７８０番目の配列からなるＲＮＡ
（４）配列番号１における６５９番目−７５２番目の配列からなるＲＮＡ
（５）配列番号１における６５９番目−７４５番目の配列からなるＲＮＡ
（６）配列番号１における６９４番目−７１４番目の配列からなるＲＮＡ
（７）配列番号１における６９３番目−７１４番目の配列からなるＲＮＡ
（８）配列番号１における６９１番目−７０３番目の配列からなるＲＮＡ
（９）配列番号１における７１１番目−７２３番目の配列からなるＲＮＡ
（１０）配列番号１における１６番目−７８０番目の配列からなるＲＮＡ
（１１）配列番号１における６５９番目−９１７番目の配列からなるＲＮＡ
（１２）配列番号１における５２６番目−１１０４番目の配列からなるＲＮＡ
（１３）配列番号４５における５２６番目−１２１６番目の配列からなるＲＮＡ
（１４）ｖｅｇｆ ｍＲＮＡにおける５’ＵＴＲ ＲＮＡ
（１５）ｖｅｇｆ ｍＲＮＡにおけるエキソン１ ＲＮＡ
（１６）ｖｅｇｆ ｍＲＮＡ
前記（１）は、ＩｒｅｓＲＮＡ、（２）〜（９）は、ＩｒｅｓＲＮＡの部分配列、（１０）および（１１）は、ＩｒｅｓＲＮＡの部分を含む配列、（１２）〜（１６）は、ＩｒｅｓＲＮＡ全体を含む配列である。前記（１０）の１６番目−７８０番目の領域は、機能未知の配列として、ＮＣＢＩアクセッションＮｏ．ＢＣ０１９８６７に、前記（１２）の５２６番目−１２１６番目の領域は、ＮＣＢＩアクセッションＮｏ．ＢＣ０１１１７７に、それぞれ登録されている。前記（１４）の５’ＵＴＲ ＲＮＡは、前述のように、配列番号１における１〜１０３８番目の領域であり、前記（１５）のエキソン１ ＲＮＡは、配列番号１における１番目〜１１０４番目の領域である。前記（１６）のｖｅｇｆ−Ａ ｍＲＮＡは、成熟ｍＲＮＡとｍＲＮＡ前駆体のいずれであってもよい。前記ターゲットＲＮＡの中でも、特に、ＩｒｅｓＲＮＡ内の、前記（２）６５９番目−８７９番目のＲＮＡ，前記（６）６９４番目−７１４番目、（７）６９３番目−７１４番目、（８）６９１番目−７０３番目もしくは（９）７１１番目−７２３番目の領域からなるＲＮＡ、または、ｖｅｇｆ−Ａ ｍＲＮＡにおいて前記ＲＮＡを含む領域からなるＲＮＡを分解することが好ましい。
前記ターゲットＲＮＡとしては、例えば、下記（１７）もあげられる。
（１７）前記（１）〜（１６）のＲＮＡにおいて、１若しくは数個の塩基が、置換、欠失、挿入または付加された塩基配列からなり、且つ、ｐ５３の発現を抑制する機能を有するＲＮＡ、または、ｐ５３ｍＲＮＡと結合する機能（もしくは、ハイブリッドを形成する機能）を有するＲＮＡ
前記（ａ１）工程において、前記ターゲットＲＮＡの分解方法は、特に制限されず、ＲＮＡの分解に使用される従来公知の手法が採用できる。具体例としては、例えば、ｓｉＲＮＡ、リボヌクレアーゼで切断されることによりｓｉＲＮＡを遊離するｓｉＲＮＡ前駆体、アンチセンス、リボザイム等の分解用核酸を使用する方法や、前記分解用核酸を発現する発現用ベクターを使用する方法があげられる。これらの分解用核酸でターゲットＲＮＡを分解することにより、ｖｅｇｆ−Ａ遺伝子のエキソン１から転写されるＲＮＡとｐ５３ｍＲＮＡとの結合が阻害される。このため、本発明においては、前記分解用核酸ならびにそれを発現する発現用ベクターを、「結合阻害剤」ともいう。また、これらの結合阻害剤は、前述のように、ターゲットＲＮＡを分解して、ｖｅｇｆ−Ａ遺伝子のエキソン１から転写されるＲＮＡとｐ５３ｍＲＮＡとの結合をすることで、結果的に、ｐ５３の発現を促進する。このため、前記結合阻害剤は、ｐ５３の発現を促進するｐ５３発現促進剤ということもできる。これらについては、本発明のｐ５３発現促進剤として後述する。
前記結合阻害剤による処理方法は、特に制限されない。前記結合阻害剤は、例えば、目的の細胞に直接導入することができる。また、前記結合阻害剤が前記分解用核酸を発現する発現ベクターの場合、前記発現ベクターを目的の細胞に導入し、前記細胞内で、前記発現ベクターから前記結合阻害剤を発現させてもよい。
つぎに、前記（ａ２）工程について説明する。前記（ａ２）工程においては、ｖｅｇｆ遺伝子のエキソン１からのＲＮＡの転写を阻害できればよく、そのメカニズムは特に制限されない。前記（ａ２）工程によれば、ｖｅｇｆ−Ａ遺伝子のエキソン１からのＲＮＡの転写自体を阻害するため、前記ＲＮＡが、ｐ５３ｍＲＮＡに結合することを抑制できる。この結果、ｐ５３ｍＲＮＡの発現抑制を防止して、ｐ５３の発現を促進できると解される。前記（ａ２）工程において、「ＲＮＡの転写の阻害」には、例えば、転写の完全な停止だけでなく、転写量の減少も含まれる。また、「ＲＮＡの転写の阻害」には、例えば、ｖｅｇｆ−Ａ遺伝子に、１若しくは数個の塩基を、置換、欠失、挿入または付加することにより、ｐ５３の発現を抑制する機能を有さないＲＮＡを転写すること、または、ｐ５３ｍＲＮＡとハイブリッドを形成する機能を有さないＲＮＡを転写すること、もしくは、これらの機能が低下したＲＮＡを転写することも含む。
前記（ａ２）工程において、転写阻害の対象を、以下、ターゲットＲＮＡといい、その領域をターゲット領域という。前記（ａ２）工程におけるターゲットＲＮＡは、前記（ａ１）工程におけるターゲットＲＮＡと同様である。具体的には、前記（ａ２）工程において、ｖｅｇｆ−Ａ遺伝子のエキソン１からのＲＮＡの転写は、例えば、エキソン１ＲＮＡの全体の転写が阻害されてもよいし、エキソン１ＲＮＡの部分の転写が阻害されてもよい。すなわち、前記（ａ２）工程において、ターゲットＲＮＡは、エキソン１ＲＮＡの全体でもよいし、エキソン１ＲＮＡの部分であってもよい。また、前記ターゲットＲＮＡは、ｖｅｇｆ−Ａ ｍＲＮＡにおける、前記エキソン１ＲＮＡを含む領域からなるＲＮＡでもよいし、前記エキソン１ＲＮＡの部分を含む領域からなるＲＮＡであってもよい。
前記ターゲットＲＮＡは、少なくとも配列番号１における６００番目−８７９番目の配列の全部または一部の配列からなるＲＮＡであることが好ましい。すなわち、前記ターゲットＲＮＡは、ｖｅｇｆ−Ａ ｍＲＮＡのエキソン１ＲＮＡ内に存在する、前記ＩｒｅｓＲＮＡの全部または部分であることが好ましい。また、前記ターゲットＲＮＡは、ｖｅｇｆ−Ａ遺伝子から転写されたＲＮＡにおける、前記ＩｒｅｓＲＮＡを含む領域からなるＲＮＡでもよいし、前記ＩｒｅｓＲＮＡの部分を含む領域からなるＲＮＡであってもよい。前記部分配列の塩基数や配列の具体例は、例えば、前述の通りである。また、ターゲットＲＮＡの具体例は、前記（ａ１）工程と同様に、例えば、（１）〜（１７）があげられる。なお、これらには限定されない。
前記（ａ２）工程において、前記ターゲットＲＮＡの転写の阻害方法は、特に制限されず、ＲＮＡの転写阻害に使用される従来公知の手法が採用できる。具体例としては、例えば、ｓｉＲＮＡ、リボヌクレアーゼで切断されることによりｓｉＲＮＡを遊離するｓｉＲＮＡ前駆体、アンチセンス、リボザイム、デコイ核酸等の転写阻害用核酸を使用する方法や、前記転写阻害用核酸を発現する発現用ベクターを使用する方法があげられる。具体的には、例えば、ｖｅｇｆ−Ａ遺伝子のプロモーター領域の配列をターゲットにしたｓｉＲＮＡ、アンチセンスまたはリボザイム、ｖｅｇｆ−Ａ遺伝子のプロモーター領域の配列を含むデコイ核酸等で、プロモーター活性を阻害することによって、ｖｅｇｆ−Ａ遺伝子からのターゲットＲＮＡの転写を抑制できる。これらの転写阻害用核酸でターゲットＲＮＡの転写を阻害することにより、ｖｅｇｆ−Ａ遺伝子のエキソン１から転写されるＲＮＡとｐ５３ｍＲＮＡとの結合が阻害される。このため、本発明においては、前記転写阻害用核酸ならびにそれを発現する発現用ベクターを、前記（ａ１）工程と同様に、「結合阻害剤」ともいう。また、これらの結合阻害剤は、前述のように、ターゲットＲＮＡの転写を阻害して、ｖｅｇｆ−Ａ遺伝子のエキソン１からのＲＮＡとｐ５３ｍＲＮＡとの結合を阻害することで、結果的に、ｐ５３の発現を促進する。このため、前記結合阻害剤は、前記（ａ１）工程と同様に、ｐ５３の発現を促進するｐ５３発現促進剤ということもできる。これらについては、本発明のｐ５３発現促進剤として後述する。前記結合阻害剤による処理方法は、特に制限されず、例えば、前記（ａ１）工程と同様である。
つぎに、（ａ３）工程について説明する。前記（ａ３）工程においては、例えば、細胞内でｖｅｇｆ−Ａ遺伝子のエキソン１から転写されたＲＮＡに、前記細胞内で転写されたｐ５３ｍＲＮＡとは別の核酸を結合させればよい。ｐ５３ｍＲＮＡに結合させる前記別の核酸を、以下、デコイ核酸という。このように、デコイ核酸を、ｖｅｇｆ−Ａ遺伝子のエキソン１から転写されたＲＮＡに結合させ、前記ＲＮＡにおけるｐ５３ＲＮＡとの結合部位をマスキングすることで、前記ＲＮＡとｐ５３ｍＲＮＡとの結合を阻害できる。これによって、ｖｅｇｆ−Ａ ＲＮＡによるｐ５３ｍＲＮＡの発現抑制が阻害され、ｐ５３の発現を促進することができる。また、前記デコイ核酸を発現する発現ベクターを使用し、細胞中で前記発現ベクターから発現したデコイ核酸を、ｖｅｇｆ−Ａ遺伝子のエキソン１から転写されたＲＮＡに結合させてもよい。このように、前記デコイ核酸ならびにこれを発現するベクターは、ｐ５３の発現を促進できることから、ｐ５３発現促進剤ということもできる。これらについては、本発明のｐ５３発現促進剤として後述する。
前記デコイ核酸による処理方法は、特に制限されず、例えば、目的の細胞に直接デコイ核酸を導入することができる。また、前記デコイ核酸を発現する発現ベクターの場合、前記発現ベクターを目的細胞に導入し、前記細胞内で、前記発現ベクターから前記核酸デコイを発現させてもよい。
本発明によれば、前述のように、ｐ５３発現の促進（回復）によって、ｐ５３に依存して転写する各種遺伝子の転写を促進し、細胞のアポトーシスを進行することができる。このため、本発明を適用する細胞は、特に制限されないが、アポトーシスの進行が望まれる細胞であることが好ましい。具体的には、例えば、ｐ５３ｍＲＮＡの発現量が低下している細胞であり、特に、腫瘍細胞に適用することが望ましい。細胞の具体例としては、例えば、肝臓がん細胞、大腸がん細胞（結腸がん細胞）、肺がん細胞、乳がん細胞、腎臓がん細胞、卵巣がん細胞、前立腺がん細胞、皮膚がん細胞、胃がん細胞等があげられる。細胞の由来は、特に制限されず、例えば、ヒト、ヒトを除く哺乳類等の動物等があげられる。
前記細胞は、例えば、生体から採取した細胞でもよいし、生体内細胞であってもよい。このため、本発明のｐ５３発現促進方法は、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、目的の細胞や目的の組織に適用してもよいし、ｉｎ ｖｉｖｏで、生体内の目的の細胞や目的の組織に適用してもよい。また、ｅｘ ｖｉｖｏで、目的の細胞や目的の組織に適用してもよい。
＜ｐ５３発現促進剤＞
本発明のｐ５３発現促進剤は、例えば、前述のように、ｖｅｇｆ−Ａ遺伝子のエキソン１から転写されるＲＮＡと、ｐ５３遺伝子から転写されるｍＲＮＡとの結合を阻害する、下記（Ａ１）〜（Ａ４）からなる群から選択された少なくとも一つの結合阻害剤を含むことを特徴とする。本発明のｐ５３発現促進剤は、「ｐ５３発現回復剤」または「ｐ５３発現維持剤」ということもできる。
（Ａ１）ｖｅｇｆ−Ａ遺伝子のエキソン１から転写されたＲＮＡを分解する、ｓｉＲＮＡ、リボヌクレアーゼで分解されることによりｓｉＲＮＡを遊離するｓｉＲＮＡ前駆体、アンチセンスおよびリボザイムからなる群から選択された少なくとも一つの結合阻害剤
（Ａ２）ｖｅｇｆ−Ａ遺伝子のエキソン１からのＲＮＡの転写を阻害する、ｓｉＲＮＡ、リボヌクレアーゼで分解されることによりｓｉＲＮＡを遊離するｓｉＲＮＡ前駆体、アンチセンス、リボザイムおよびデコイ核酸からなる群から選択された少なくとも一つの結合阻害剤
（Ａ３）ｖｅｇｆ−Ａ遺伝子のエキソン１から転写されたＲＮＡに結合する、ｐ５３遺伝子から転写されたｍＲＮＡとは別の核酸を含む結合阻害剤
（Ａ４）前記（Ａ１）〜（Ａ３）からなる群から選択された少なくとも一つの結合阻害剤をコードするＤＮＡが挿入された発現ベクターを含む結合阻害剤
本発明のｐ５３発現促進剤は、例えば、（Ａ１）〜（Ａ４）の結合阻害剤のうち、いずれか一種類を含んでもよいし、二種類以上を含んでもよい。
ｓｉＲＮＡ、アンチセンス、リボザイムおよびデコイ核酸の技術は、例えば、遺伝子から転写されたＲＮＡを分解する手段、または、遺伝子からのＲＮＡの転写を阻害する手段として確立されている。このため、本発明を実施するにあたって、ターゲットＲＮＡの分解やターゲットＲＮＡの転写阻害のために、ｓｉＲＮＡ、アンチセンス、リボザイムおよびデコイ核酸等を設計することは、当業者であれば技術常識に基づいて行うことができる。また、ｓｉＲＮＡ、アンチセンス、リボザイムおよびデコイ核酸等の構成材料は、特に制限されず、例えば、天然由来の核酸でもよいし、ＰＮＡ等の人工核酸等でもよく、何ら制限されない（以下、同様）。
まず、前記（Ａ１）の結合阻害剤について説明する。この結合阻害剤は、例えば、本発明のｐ５３発現促進方法における前記（ａ１）工程で述べた結合阻害剤に該当する。この結合阻害剤が分解するターゲットＲＮＡは、前記本発明のｐ５３発現促進方法の（ａ１）工程におけるターゲットＲＮＡと同様である。
（Ａ１）ｖｅｇｆ−Ａ遺伝子のエキソン１から転写されたＲＮＡを分解する、ｓｉＲＮＡ、リボヌクレアーゼで分解されることによりｓｉＲＮＡを遊離するｓｉＲＮＡ前駆体、アンチセンスおよびリボザイムからなる群から選択された少なくとも一つの結合阻害剤
本発明のｐ５３発現促進剤は、前記（Ａ１）の結合阻害剤として、ｓｉＲＮＡ、リボヌクレアーゼで切断されることによりｓｉＲＮＡを遊離するｓｉＲＮＡ前駆体、アンチセンス、リボザイムのいずれを含んでもよい。また、前記結合阻害剤は、いずれか一種類でもよいし、二種類以上を併用してもよい。
前記結合阻害剤としては、例えば、ｓｉＲＮＡが好ましい。前記ｓｉＲＮＡは、通常、ｍＲＮＡ等のＲＮＡに相補的なアンチセンス鎖と、それに相補的なセンス鎖とからなる二本鎖ＲＮＡである。ｓｉＲＮＡの各鎖の長さは、特に制限されないが、通常、１９〜２５塩基のオリゴヌクレオチドであり、好ましくは、１９塩基である。前記ｓｉＲＮＡは、例えば、各鎖の３’末端にオーバーハングを有してもよく、この場合、それぞれの３’末端が突出した形状となる。オーバーハングの長さは、特に制限されないが、通常、２塩基である。オーバーハングの配列は、特に制限されず、例えば、アンチセンス鎖においては、結合するＲＮＡに相補的な配列であってもよいし、センス鎖においては、アンチセンス鎖に相補的な配列、すなわち、アンチセンス鎖が結合するＲＮＡと同じ配列であってもよい。また、その他の配列であってもよく、例えば、ｕｕ、ａｕ、ａｇ、ｇｃ、ｃｃ等の配列があげられる。アンチセンス鎖に対応するセンス鎖は、例えば、内部の配列が、アンチセンス鎖よりも２塩基程度短い配列であってもよい。
アンチセンス鎖の配列は、例えば、結合するＲＮＡの配列に対して完全に相補的でなくともよいが、前記ｍＲＮＡに対する相同性は、例えば、７０％以上であり、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上であり、最も好ましくは１００％（完全にマッチ）である。また、アンチセンス鎖において、オーバーハングを除く前記オリゴヌクレオチドの配列は、例えば、結合するｍＲＮＡの配列と完全に相補的でなくともよいが、前記ｍＲＮＡに対する相同性は、例えば、７０％以上であり、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上であり、最も好ましくは１００％（完全一致）である。
また、ｖｅｇｆ−Ａ ＲＮＡにおいて、前記ｓｉＲＮＡが結合する領域は、前述のターゲットＲＮＡの領域には制限されない。通常、ｓｉＲＮＡによるｍＲＮＡの切断は、まず、ｓｉＲＮＡが結合した領域内で生じるが、これをきっかけに他の領域でも切断が起こり、最終的に、ターゲット領域が完全に切断されることが知られている。したがって、ｓｉＲＮＡは、例えば、ｖｅｇｆ−Ａ ＲＮＡのターゲット領域に結合するように、設計してもよいし、前記ターゲット領域以外に結合するように設計してもよい。後者の場合、ｓｉＲＮＡの結合領域内での切断がきっかけとなり、結果的に、目的とするターゲット領域（ターゲットＲＮＡ）も分解される。このため、ｖｅｇｆ−Ａ遺伝子のエキソン１からＲＮＡが転写されても、結果的に前記ＲＮＡは分解されるため、前記ＲＮＡのｐ５３ｍＲＮＡへの結合が阻害され、ｐ５３の発現を抑制する機能は失われることとなる。
ｖｅｇｆ−Ａ ｍＲＮＡに対するｓｉＲＮＡの結合領域としては、前述のように、制限されないが、例えば、前述したターゲットＲＮＡの領域内部であることが好ましく、例えば、ＩｒｅｓＲＮＡの内部、５’ＵＴＲの内部、エキソン１ＲＮＡの内部、エキソン１ＲＮＡとイントロン１ＲＮＡとの境界付近等があげられる。具体例としては、例えば、前記（１）〜（９）のターゲットＲＮＡの内部（ＩｒｅｓＲＮＡの内部）や、前記（１０）〜（１６）のターゲットＲＮＡの内部があげられる。なお、本発明は、これらには制限されない。
以下に、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖の具体例を示す。また、下記アンチセンス鎖＃１〜＃１０におけるオーバーハングを下線で示す。下記＃１〜＃１７において、ｎは、任意の核酸であり、ａ、ｕ、ｇ、ｃまたはｔがあげられる。なお、ｓｉＲＮＡにおいて、オーバーハングは任意であり、例えば、有していなくともよい（以下、同様）。なお、本発明において、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は、これらには限定されない。
＃１ 5’−agcaaggcaaggcuccaaugcnn−3’（配列番号４）
配列番号１における塩基番号1062-1082に相補的
＃２ 5’−agagcagcaaggcaaggcuccnn−3’（配列番号６）
配列番号１における塩基番号1067-1087に相補的
＃３ 5’−cacgaccgcuuaccuuggcaunn−3’（配列番号８）
配列番号４５における塩基番号1097-1117に相補的
＃４ 5’−uagcacuucucgcggcuccgcnn−3’（配列番号１０）
配列番号１における塩基番号728-748に相補的
＃５ 5’−cgagcuagcacuucucgcggcnn−3’（配列番号１２）
配列番号１における塩基番号733-753に相補的
＃６ 5’−uggacgaaaaguuucagugcgacgcnn−3’（配列番号１４）
配列番号１における塩基番号644-668に相補的
＃７ 5’−agaaguuggacgaaaaguuucagugnn−3’（配列番号１６）
配列番号１における塩基番号650-674に相補的
＃８ 5’−gaaguuggacgaaaaguuucagugcnn−3’（配列番号１８）
配列番号１における塩基番号649-673に相補的
＃９ 5’−ggacgaaaaguuucagugcgacgccnn−3’（配列番号２０）
配列番号１における塩基番号643-667に相補的
＃１０ 5’−uuggacgaaaaguuucagugcgacgnn−3’（配列番号２２）
配列番号１における塩基番号645-669に相補的
＃１１ 5’−agaaguuggacgaaaaguuucagugnn−3’（配列番号６１）
配列番号１における塩基番号650-674に相補的
＃１２ 5’−aguuucagugcgacgccgcgagcccnn−3’（配列番号６３）
配列番号１における塩基番号635-659相補的
＃１３ 5’−gaagcgagaacagcccagaaguuggnn−3’（配列番号６５）
配列番号１における塩基番号666-690に相補的
＃１４ 5’−agcaaggcaaggcuccaaugcacccnn−3’（配列番号６７）
配列番号１における塩基番号1058-1082に相補的
＃１５ 5’−agagcagcaaggcaaggcuccaaugnn−3’（配列番号６９）
配列番号１における塩基番号1063-1087に相補的
＃１６ 5’−cgagcuagcacuucucgcggcuccgnn−3’（配列番号７１）
配列番号１における塩基番号729-753に相補的
＃１７ 5’−cgcggaccacggcuccuccgaagcgnn−3’（配列番号７３）
配列番号１における塩基番号685-709に相補的
前記アンチセンス鎖とセンス鎖とからなるｓｉＲＮＡの具体例を以下に示す。下記例において、下線部の「ｎｎ」はオーバーハングであり、センスのｎｎの上部、アンチセンスのｎｎの下部に、それぞれオーバーハングの配列の一例をあわせて示す。なお、ｓｉＲＮＡ＃１〜＃１７は、例えば、アンチセンス鎖およびセンス鎖、それぞれ、オーバーハングは任意であり、有していなくともよい。なお、本発明において、ｓｉＲＮＡは、これらには制限されない。
ｓｉＲＮＡ＃１
gu or ca
センス 5’− gcauugga cuugccuugcunn−3’（配列番号３）
アンチセンス 3’−nncguaaccucggaacggaacga−5’ （配列番号４）
ac or gu
ｓｉＲＮＡ＃２
gu or ca
センス 5’− ggagccuug uugcugcucunn−3’（配列番号５）
アンチセンス 3’−nnccucggaacggaacgacgaga−5’ （配列番号６）
ac or gu
ｓｉＲＮＡ＃３
gu or ca
センス 5’− augccaag aagcggucgugnn−3’（配列番号７）
アンチセンス 3’−nnuacgguuccauucgccagcac−5’ （配列番号８）
ac or gu
ｓｉＲＮＡ＃４
gu or ca
センス 5’− gcggagccg agaagugcuann−3’（配列番号９）
アンチセンス 3’−nncgccucggcgcucuucacgau−5’ （配列番号１０）
ac or gu
ｓｉＲＮＡ＃５
gu or ca
センス 5’− gccgcgag gugcuagcucgnn−3’（配列番号１１）
アンチセンス 3’−nncggcgcucuucacgaucgagc−5’ （配列番号１２）
ac or gu
ｓｉＲＮＡ＃６
ag
センス 5’− gcgucgcacugaaacuuuucguccann−3’（配列番号１３）
アンチセンス 3’−nncgcagcgugacuuugaaaagcaggu −5’（配列番号１４）
ua
ｓｉＲＮＡ＃７
ag
センス 5’− cacugaaacuuuucguccaacuucunn−3’（配列番号１５）
アンチセンス 3’−nngugacuuugaaaagcagguugaaga −5’（配列番号１６）
ua
ｓｉＲＮＡ＃８
ag
センス 5’− gcacugaaacuuuucguccaacuucnn−3’（配列番号１７）
アンチセンス 3’−nncgugacuuugaaaagcagguugaag −5’（配列番号１８）
ua
ｓｉＲＮＡ＃９
ag
センス 5’− ggcgucgcacugaaacuuuucguccnn−3’（配列番号１９）
アンチセンス 3’−nnccgcagcgugacuuugaaaagcagg −5’（配列番号２０）
ua
ｓｉＲＮＡ＃１０
ag
センス 5’− cgucgcacugaaacuuuucguccaann−3’（配列番号２１）
アンチセンス 3’−nngcagcgugacuuugaaaagcagguu −5’（配列番号２２）
ua
ｓｉＲＮＡ＃１１
センス 5’− cacugaaacuuuucguccaacuucunn−3’（配列番号６０）
アンチセンス 3’−nngugacuuugaaaagcagguugaaga −5’（配列番号６１）
ｓｉＲＮＡ＃１２
センス 5’− gggcucgcggcgucgcacugaaacunn−3’（配列番号６２）
アンチセンス 3’−nncccgagcgccgcagcgugacuuuga −5’（配列番号６３）
ｓｉＲＮＡ＃１３
センス 5’− ccaacuucugggcuguucucgcuucnn−3’（配列番号６４）
アンチセンス 3’−nngguugaagacccgacaagagcgaag −5’（配列番号６５）
ｓｉＲＮＡ＃１４
センス 5’− gggugcauuggagccuugccuugcunn−3’（配列番号６６）
アンチセンス 3’−nncccacguaaccucggaacggaacga −5’（配列番号６７）
ｓｉＲＮＡ＃１５
センス 5’− cauuggagccuugccuugcugcucunn−3’（配列番号６８）
アンチセンス 3’−nnguaaccucggaacggaacgacgaga −5’（配列番号６９）
ｓｉＲＮＡ＃１６
センス 5’− cggagccgcgagaagugcuagcucgnn−3’（配列番号７０）
アンチセンス 3’−nngccucggcgcucuucacgaucgagc −5’（配列番号７１）
ｓｉＲＮＡ＃１７
センス 5’− cgcuucggaggagccgugguccgcgnn−3’（配列番号７２）
アンチセンス 3’−nngcgaagccuccucggcaccaggcgc −3’（配列番号７３）
これらのｓｉＲＮＡは、例えば、前述の配列の二本鎖ｓｉＲＮＡとして細胞内に導入してもよいし、後述する（Ａ４）の結合阻害剤に示すように、例えば、前述の配列を発現するｓｉＲＮＡ発現ベクターとして細胞内に導入してもよい。
前記（Ａ１）の結合阻害剤は、前述のように、リボヌクレアーゼで分解されることによりｓｉＲＮＡを遊離するｓｉＲＮＡ前駆体であってもよい。前記ｓｉＲＮＡ前駆体としては、例えば、二本鎖ＲＮＡや一本鎖ＲＮＡがあげられる。前者の場合、例えば、細胞に導入すると、前記二本鎖ＲＮＡがリボヌクレアーゼにより切断され、前述のようなｓｉＲＮＡが生成される。後者の一本鎖ＲＮＡとしては、例えば、自己アニーリングによって、複数のヘヤピン構造が連なったフォールドバックＲＮＡ前駆体があげられる。例えば、これを細胞に導入すると、まず、Ｄｒｏｓｈａで切断され、ヘヤピン型のｍｉＲＮＡ様ＲＮＡ前駆体が形成され、これがさらにＤｉｃｅｒで切断されることによって、前述のような二本鎖のｓｉＲＮＡが生成される。また、後者の一本鎖ＲＮＡとしては、例えば、ヘヤピン型のｍｉＲＮＡ様ＲＮＡ前駆体であってもよい。例えば、これを細胞に導入すると、ＤｒｏｓｈａおよびＤｉｃｅｒで切断されることによって、前述のようなｓｉＲＮＡが生成される。また、後者の一本鎖ＲＮＡとしては、ヘアピン型ｓｉＲＮＡ前駆体であってもよい。なお、後者の場合、細胞に導入するｓｉＲＮＡ前駆体は、例えば、ヘヤピンを予め形成してもよいし、細胞内でヘヤピンを形成してもよい。前記ｓｉＲＮＡ前駆体の配列は、特に制限されず、例えば、ｓｉＲＮＡの配列、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖が結合する領域の配列、ターゲットＲＮＡの配列に応じて適宜設計できる。前記リボヌクレアーゼとしては、例えば、Ｄｉｃｅｒ、Ｄｒｏｓｈａ等があげられる（以下、同様）。
前記（Ａ１）の結合阻害剤は、前述のように、アンチセンスであってもよい。アンチセンスとしては、例えば、前述のターゲットＲＮＡと相補的な配列からなるアンチセンスがあげられる。アンチセンスは、例えば、ＤＮＡでもよいしＲＮＡでもよい。アンチセンスによる発現抑制のメカニズムとしては、例えば、三重鎖形成による転写開始阻害、ＲＮＡポリメラーゼにより局所的に開状ループ構造が形成された部位とのハイブリッド形成による転写阻害、合成が進行中であるＲＮＡとのハイブリッド形成による転写阻害等があげられる（平島および井上；新生化学実験講座２ 核酸IV 遺伝子の複製と発現（日本生化学会編、東京化学同人）pp．319−347、1993）。アンチセンスの長さは、特に制限されないが、例えば、一般的に、下限が、１５塩基以上であり、好ましくは１００塩基以上であり、さらに好ましくは５００塩基以上であり、上限が、例えば、５０００塩基（５ｋｂ）以下であり、好ましくは２５００塩基（２．５ｋｂ）以下である。
前記（Ａ１）の結合阻害剤は、前述のように、リボザイムであってもよい。リボザイムは、触媒活性を有するＲＮＡ分子のことを意味し、本発明においては、ＲＮＡを部位特異的に切断するリボザイムがあげられる。本発明におけるリボザイムは、例えば、前述のようなターゲットＲＮＡを特異的に開裂するリボザイム活性を有する。リボザイムの配列は、特に制限されず、例えば、切断目的の配列に相補的な配列を有するように設計できる。リボザイムの種類は、特に制限されないが、例えば、ハンマーヘッド型リボザイム、ヘアピン型リボザイム等があげられる。
つぎに、前記（Ａ２）の結合阻害剤について説明する。この結合阻害剤は、例えば、本発明のｐ５３発現促進方法における前記（ａ２）工程で述べた、各種結合阻害剤に該当する。この結合阻害剤が分解するターゲットＲＮＡは、前記本発明のｐ５３発現促進方法の（ａ２）工程におけるターゲットＲＮＡと同様である。
（Ａ２）ｖｅｇｆ−Ａ遺伝子のエキソン１からのＲＮＡの転写を阻害する、ｓｉＲＮＡ、リボヌクレアーゼで分解されることによりｓｉＲＮＡを遊離するｓｉＲＮＡ前駆体、アンチセンス、リボザイムおよびデコイ核酸からなる群から選択された少なくとも一つの結合阻害剤
本発明のｐ５３発現促進剤は、前記（Ａ２）の結合阻害剤として、ｓｉＲＮＡ、リボヌクレアーゼで切断されることによりｓｉＲＮＡを遊離するｓｉＲＮＡ前駆体、リボザイムＲＮＡ、デコイ核酸のいずれを含んでもよい。また、ｓｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ前駆体、リボザイムおよびデコイ核酸は、特に示さない限り、例えば、前記（Ａ１）の結合阻害剤と同様に設計できる。
前記結合阻害剤は、例えば、ｖｅｇｆ−Ａ遺伝子のプロモーター活性を阻害するように、設計することが好ましい。これによって、ｖｅｇｆ−Ａ遺伝子のエキソン１からの転写が抑制できる。前記結合阻害剤としては、例えば、ｖｅｇｆ−Ａ遺伝子のプロモーター領域に相補的である、前記領域に結合可能なアンチセンスがあげられる。このようなアンチセンスによれば、ｖｅｇｆ−Ａ遺伝子のプロモーターに前記アンチセンスを結合させることで、プロモーター活性が阻害され、その結果、ｖｅｇｆ−Ａ遺伝子のエキソン１からの転写が抑制できる。
つぎに、前記（Ａ３）の結合阻害剤について説明する。この結合阻害剤は、例えば、本発明のｐ５３発現促進方法における前記（ａ３）工程で述べた、デコイ核酸からなる結合阻害剤に該当する。
（Ａ３）ｖｅｇｆ−Ａ遺伝子のエキソン１から転写されたＲＮＡに結合する、ｐ５３遺伝子から転写されたｍＲＮＡとは別の核酸（デコイ核酸）からなる結合阻害剤
前記デコイ核酸の種類は、特に制限されず、例えば、ＤＮＡでもよいし、ＲＮＡでもよい。前記デコイ核酸の配列は、特に制限されず、ｖｅｇｆ−Ａ遺伝子のエキソン１から転写されるＲＮＡにおけるｐ５３ｍＲＮＡとの結合領域に、結合可能な配列があげられる。具体的には、例えば、ｖｅｇｆ−Ａ ＲＮＡにおける、ｐ５３ｍＲＮＡとの結合領域に相補的な配列または前記結合領域を含む領域に相補的な配列、ｐ５３ｍＲＮＡにおける、ｖｅｇｆ−Ａ遺伝子のエキソン１から転写されるＲＮＡとの結合領域からなる配列または前記結合領域を含む領域からなる配列があげられる。前記デコイ核酸の塩基数は、特に制限されないが、例えば、２５〜５０塩基であり、好ましくは、２５〜３０塩基である。
前記デコイ核酸の具体例を、以下に示す。前記結合阻害剤は、例えば、いずれか一種類でもよいし、二種類以上を含んでもよい。なお、本発明は、これには限定されない。
（Ｄ１）配列番号２における４６２番目−４８１番目の配列からなるＲＮＡ、または、前記配列において、塩基ｕが塩基ｔに置換された配列からなるＤＮＡ
（Ｄ２）配列番号２における４６２番目−４８２番目の配列からなるＲＮＡ、または、前記配列において、塩基ｕが塩基ｔに置換された配列からなるＤＮＡ
（Ｄ３）配列番号２における４６２番目−４９１番目の配列からなるＲＮＡ、または、前記配列において、塩基ｕが塩基ｔに置換された配列からなるＤＮＡ
（Ｄ４）配列番号２における４６２番目−５０５番目の配列からなるＲＮＡ、または、前記配列において、塩基ｕが塩基ｔに置換された配列からなるＤＮＡ
（Ｄ５）配列番号２における２５２番目−５５１番目の配列からなるＲＮＡ、または、前記配列において、塩基ｕが塩基ｔに置換された配列からなるＤＮＡ
（Ｄ６）配列番号１における６９４番目−７１４番目の配列に相補的な配列からなるＲＮＡ、または、前記配列において、塩基ｕが塩基ｔに置換された配列からなるＤＮＡ
（Ｄ７）配列番号１における６９３番目−７１４番目の配列に相補的な配列からなるＲＮＡ、または、前記配列において、塩基ｕが塩基ｔに置換された配列からなるＤＮＡ
5’-ccccgcgcggaccacggctcct-3’（配列番号７４）
（Ｄ８）前記（Ｄ１）〜（Ｄ７）からなる群から選択された少なくとも一つの核酸において、１若しくは数個の塩基が、置換、欠失、挿入または付加された塩基配列からなり、かつ、ｖｅｇｆ−Ａ遺伝子のエキソン１から転写されたＲＮＡに結合可能である核酸
前記（Ｄ１）〜（Ｄ５）のＲＮＡおよびＤＮＡは、ｐ５３遺伝子（ＲＮＡまたはＤＮＡ）の部分配列と同じ配列からなる。前記（Ｄ６）および（Ｄ７）は、ｖｅｇｆ−Ａ遺伝子（ＲＮＡまたはＤＮＡ）のエキソン１における部分配列に相補的な配列からなるアンチセンスである。
つぎに、前記（Ａ４）の結合阻害剤について説明する。
（Ａ４）前記（Ａ１）〜（Ａ３）からなる群から選択された少なくとも一つの結合阻害剤をコードするＤＮＡが挿入された発現ベクターからなる結合阻害剤
前記（Ａ４）の結合阻害剤は、例えば、前述の（Ａ１）〜（Ａ３）の少なくともいずれかを発現する発現ベクターであればよい。前記発現ベクターを用いた場合、例えば、細胞への前記発現ベクターの導入によって、前記細胞内で前記結合阻害剤が発現（例えば、ＲＮＡの転写やＤＮＡの複製）される。前記発現ベクターの導入ならびに、前記発現ベクターに挿入されたコード配列の発現システムは、制限されず、従来公知の技術が採用できる。例えば、発現ベクターにより細胞内でｓｉＲＮＡを生成させる場合には、ｓｉＲＮＡ発現システムや、ｍｉＲＮＡ発現システム等の市販キットが使用できる。
前記発現ベクターは、例えば、ベクターに、前記各種結合阻害剤をコードするＤＮＡが挿入されている。前記ベクターとしては、特に制限されず、例えば、前記発現ベクターを導入する細胞の種類、導入方法等に応じて適宜決定でき、例えば、ウイルス系ベクターや非ウイルス系ベクターがあげられる。前記非ウイルスベクターとしては、例えば、目的とする細胞内や生体内で、前記ＲＮＡを発現できるベクターがあげられる。具体例としては、例えば、pcDNA3.1（Invitrogen社）、pZeoSV（Invitrogen社）、pBK−CMV（Stratagene社）、pCAGGS（Gene108，193−200（1991））等の発現ベクターが例示できる。通常、これらのベクターのプロモーターの下流に、発現可能なように前記ＤＮＡを挿入すればよい。また、ウイルスベクターとしては、例えば、レトロウイルスベクター、免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）等のレンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ベクター（ＡＡＶベクター；adeno associated virus）、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンビスウイルス、センダイウイルス、ＳＶ４０等のＤＮＡウイルスやＲＮＡウイルスがあげられる。以上のようなベクターに、従来公知の方法に基づいて前記ＤＮＡを挿入することによって、発現ベクターを製造できる。
前記発現ベクターは、さらに、前記ＤＮＡの発現を調節する調節配列を含んでもよい。前記調節配列としては、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）由来のプロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、シミアンウイルス−４０（ＳＶ−４０）、筋βアクチンプロモーター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）等の構成プロモーター、チミジンキナーゼプロモーター等の組織特異的プロモーター、成長ホルモン調節性プロモーター、ｌａｃオペロン配列の制御下にあるプロモーター、亜鉛誘導性メタロチオネインプロモーター等の誘導性プロモーターや調節性プロモーターがあげられる。このような調節配列は、従来公知の方法に基づいて、前記遺伝子の発現を機能的に調節できる部位に配置または結合させればよい。また、この他にも、例えば、エンハンサー配列、ポリアデニル化シグナル、複製起点配列（ｏｒｉ）等を含んでもよい。
また、前記発現ベクターは、例えば、薬剤耐性マーカー、蛍光タンパク質マーカー、酵素マーカー、細胞表面レセプターマーカー等の選択マーカーをコードする配列を有してもよい。
本発明においては、細胞内でｓｉＲＮＡを生成させる場合、例えば、前記ｓｉＲＮＡを発現する発現ベクターを導入してもよいし、リボヌクレアーゼで切断されることによりｓｉＲＮＡを遊離する前記ｓｉＲＮＡ前駆体を発現する発現ベクターを導入してもよい。前者の場合、例えば、細胞内でｓｉＲＮＡが生成され、後者の場合、例えば、細胞内で生成されたｓｉＲＮＡ前駆体は、分子内で相補鎖結合しステムループを形成し、さらに、前述のように、ＤｒｏｓｈａやＤｉｃｅｒ等のリボヌクレアーゼによって切断されて、前述のｓｉＲＮＡが生成される。アンチセンスＲＮＡを発現する発現ベクターやリボヌクレオチドを発現する発現ベクターについても、同様である。
本発明のｐ５３発現促進剤の細胞への導入方法は、特に制限されず、従来公知の方法が採用できる。これらのｐ５３発現促進剤をｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞に導入する場合、例えば、リン酸カルシウム法、ポリエチレングリコール法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法、超音波核酸導入法、遺伝子銃による導入法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、微小ガラス管等を用いた直接注入法があげられる。また、前述のようなウイルスベクターを用いた、感染導入法等があげられる。また、本発明のｐ５３発現促進剤を、ｉｎ ｖｉｖｏで細胞や組織に導入する場合、その導入方法は、例えば、目的の細胞や組織の種類に応じて、従来公知の方法が適宜採用できる。具体的としては、例えば、筋肉内、腹腔内等への注射、経口投与、皮下組織投与、遺伝子銃による投与、液浸、ハイドロダイナミック法、カチオニックリポソーム法、アテロコラーゲンを用いる方法等があげられる。また、ｅｘ ｖｉｖｏの場合は、例えば、被検体から目的の細胞や組織を採取し、採取した細胞等に、本発明のｐ５３発現促進剤を前述の方法により導入し、導入後の細胞等を被検体の体内に戻す方法等がある。
本発明のｐ５３発現促進剤は、さらに、前記結合阻害剤や前記発現ベクターの細胞への導入を補助する補助剤等、種々の添加物を含んでもよい。前記補助剤としては、例えば、リポフェクタミン、カチオニックリポソーム等のリポソーム、アテロコラーゲン等があげられる。
＜アポトーシス促進方法およびアポトーシス促進剤＞
本発明のアポトーシス促進方法は、細胞のアポトーシスを促進する方法であって、本発明のｐ５３発現促進方法により、細胞内におけるｐ５３の発現を促進することを特徴とする。
本発明においては、さらに、前記細胞を抗がん剤で処理する工程を含むことが好ましい。具体的には、前記（ａ）工程、すなわち、細胞における、ｖｅｇｆ−Ａ遺伝子のエキソン１から転写されるＲＮＡと、ｐ５３ｍＲＮＡとの結合を阻害する工程に加えて、さらに、（ｂ）工程として、前記細胞を抗がん剤で処理する工程を含むことが好ましい。前記（ａ）工程および（ｂ）工程の順序は、特に制限されないが、例えば、細胞に対して、前記（ａ）工程として、前記結合を阻害する処理を施した後、処理後の細胞に対して、抗がん剤処理を行うことが好ましい。前記結合を阻害する処理は、特に制限されないが、前述のような（ａ１）〜（ａ３）工程の少なくともいずれかの工程を含むことが好ましい。
前記抗がん剤の種類は、特に制限されないが、具体例として、例えば、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、シスプラチン、ドキソルビシン、エトポシド、ロイコボリン、マイトマイシンＣ、パクリタキセル、ビンクリスチン、カンプトテシン等があげられる（以下、同様）。
本発明のアポトーシス促進剤は、前述のように、本発明のｐ５３発現促進剤を含むことを特徴とする。本発明のアポトーシス促進剤は、前記ｐ５３発現促進剤を含んでいればよく、その他の組成等は、何ら制限されない。また、本発明のアポトーシス促進剤は、本発明のアポトーシス促進方法に使用できるが、具体的な使用方法等は、前述の本発明のｐ５３発現促進剤と同様である。また、本発明のアポトーシス促進剤は、さらに抗がん剤を含むことが好ましい。
＜抗がん剤感受性亢進方法および亢進剤＞
本発明の抗がん剤感受性の亢進方法は、抗がん剤に対する細胞の感受性を亢進する方法であって、本発明のｐ５３発現促進方法により、前記細胞におけるｐ５３の発現を促進させることを特徴とする。本発明の亢進方法は、例えば、抗がん剤による処理に先立って、目的の細胞に、本発明のｐ５３発現促進方法を施せばよく、その他の工程は、何ら制限されない。このような処理を行うことによって、細胞の抗がん剤に対する感受性を亢進することができる。
本発明の亢進剤は、前述のように、抗がん剤に対する細胞の感受性を亢進する亢進剤であって、本発明のｐ５３発現促進剤を含むことを特徴とする。本発明の亢進剤は、前記ｐ５３発現促進剤を含んでいればよく、その他の組成等は、何ら制限されない。また、本発明の亢進剤は、本発明の抗がん剤感受性の亢進方法に使用できるが、具体的な使用方法等は、前述の本発明のｐ５３発現促進剤と同様である。
＜がんの治療方法および抗がん剤＞
本発明のがんの治療方法は、生体内のがん細胞に本発明のｐ５３発現促進剤を投与する工程を含む。前記ｐ５３発現促進剤の投与対象は、特に制限されないが、例えば、ヒト、ヒトを除く哺乳類等の動物があげられる。
本発明の抗がん剤は、前述のように、本発明のｐ５３発現促進剤を含むことを特徴とする。本発明の抗がん剤は、前記ｐ５３発現促進剤を含んでいればよく、その他の組成等は、何ら制限されない。本発明の抗がん剤は、例えば、他の抗がん剤や、薬学的に許容可能な成分を、さらに含んでもよい。また、本発明の抗がん剤は、本発明のがんの治療方法に使用できるが、具体的な使用方法は、前述の本発明のｐ５３発現促進剤と同様である。
＜ｐ５３ｍＲＮＡ結合剤＞
本発明のｐ５３ｍＲＮＡ結合剤は、ｐ５３ｍＲＮＡに結合可能な結合剤であって、核酸を含み、前記核酸が、配列番号１に示すｖｅｇｆ−Ａ ｍＲＮＡにおける６９４番目−７１４番目の配列からなるＲＮＡを含むことを特徴とする。
前記核酸に含まれるＲＮＡは、例えば、前記６９４番目−７１４番目の配列からなるＲＮＡでもよいし、ｖｅｇｆ−Ａ ｍＲＮＡにおける６９４番目−７１４番目の領域を含む配列からなるＲＮＡでもよい。前記ＲＮＡとしては、例えば、下記（１）〜（１７）のＲＮＡがあげられる。前記核酸に含まれるＲＮＡは、いずれか一種類でもよいし、二種類以上であってもよい。
（１）配列番号１における６００番目−８７９番目の配列からなるＲＮＡ
（２）配列番号１における６５９番目−８７９番目の配列からなるＲＮＡ
（３）配列番号１における６５９番目−７８０番目の配列からなるＲＮＡ
（４）配列番号１における６５９番目−７５２番目の配列からなるＲＮＡ
（５）配列番号１における６５９番目−７４５番目の配列からなるＲＮＡ
（６）配列番号１における６９４番目−７１４番目の配列からなるＲＮＡ
（７）配列番号１における６９３番目−７１４番目の配列からなるＲＮＡ
（８）配列番号１における６９１番目−７０３番目の配列からなるＲＮＡ
（９）配列番号１における７１１番目−７２３番目の配列からなるＲＮＡ
（１０）配列番号１における１６番目−７８０番目の配列からなるＲＮＡ
（１１）配列番号１における６５９番目−９１７番目の配列からなるＲＮＡ
（１２）配列番号１における５２６番目−１１０４番目の配列からなるＲＮＡ
（１３）配列番号４５における５２６番目−１２１６番目の配列からなるＲＮＡ
（１４）ｖｅｇｆ ｍＲＮＡにおける５’ＵＴＲ ＲＮＡ
（１５）ｖｅｇｆ ｍＲＮＡにおけるエキソン１ ＲＮＡ
（１６）ｖｅｇｆ ｍＲＮＡ
（１７）前記（１）〜（１６）のＲＮＡにおいて、１若しくは数個の塩基が、置換、欠失、挿入または付加された塩基配列からなり、且つ、ｐ５３の発現を抑制する機能を有するＲＮＡ、または、ｐ５３ｍＲＮＡと結合する機能（もしくは、ハイブリッドを形成する機能）を有するＲＮＡ
＜ｖｅｇｆ−Ａ ｍＲＮＡ結合剤＞
本発明のｖｅｇｆ−Ａ ｍＲＮＡ結合剤は、ｖｅｇｆ−Ａ ｍＲＮＡに結合可能な結合剤であって、核酸を含み、前記核酸が、配列番号２に示すｐ５３ｍＲＮＡにおける４６２番目−４８１番目の配列からなるＲＮＡを含むことを特徴とする。
前記核酸に含まれるＲＮＡは、例えば、前記４６２番目−４８１番目の配列からなるＲＮＡでもよいし、ｐ５３ｍＲＮＡにおける４６２番目−４８１番目の領域を含む配列からなるＲＮＡでもよい。前記ＲＮＡとしては、例えば、下記（Ｉ）〜（VI）のＲＮＡがあげられる。前記核酸に含まれるＲＮＡは、いずれか一種類でもよいし、二種類以上であってもよい。
（I）配列番号２における４６２番目−４８１番目の配列からなるＲＮＡ
（II）配列番号２における４６２番目−４８２番目の配列からなるＲＮＡ
（III）配列番号２における４６２番目−４９１番目の配列からなるＲＮＡ
（IV）配列番号２における４６２番目−５０５番目の配列からなるＲＮＡ
（Ｖ）配列番号２における２５２番目−５５１番目の配列からなるＲＮＡ
（VI）前記（I）〜（Ｖ）からなる群から選択された少なくとも一つのＲＮＡにおいて、１若しくは数個の塩基が、置換、欠失、挿入または付加された塩基配列からなり、かつ、ｖｅｇｆ−Ａのエキソン１から転写されたＲＮＡに結合する機能を有するＲＮＡ
＜スクリーニング方法＞
本発明のスクリーニング方法は、ｐ５３の発現を促進する発現促進剤のスクリーニング方法であって、下記（Ａ）工程〜（Ｃ）工程を有することを特徴とする。
（Ａ） 候補物質の存在下、本発明のｐ５３ｍＲＮＡ結合剤と、本発明のｖｅｇｆ−Ａ ＲＮＡ結合剤とを接触させる工程
（Ｂ） 前記候補物質による、前記ｐ５３ｍＲＮＡ結合剤とｖｅｇｆ−Ａ ＲＮＡ結合剤との結合の阻害を検出する工程
（Ｃ） 前記ｐ５３ｍＲＮＡ結合剤とｖｅｇｆ−Ａ ＲＮＡ結合剤との結合を阻害した候補物質を、ｐ５３発現促進剤として選択する工程。
このような方法によれば、ｐ５３ｍＲＮＡとｖｅｇｆ−Ａ ＲＮＡとの結合を阻害する物質をスクリーニングできる。前記結合を阻害できれば、結果的に、ｐ５３ｍＲＮＡの分解を抑制し、ｐ５３ｍＲＮＡの発現抑制を回避し、ｐ５３の発現を促進（回復）できる。このため、本発明によりスクリーニングされた物質は、ｐ５３発現促進剤として使用することが可能となる。なお、前記（Ｃ）工程における阻害の検出方法は、特に制限されず、ヘテロ二本鎖の形成の有無を確認する従来公知の方法が採用できる。
つぎに、本発明の実施例について説明する。ただし、本発明は下記の実施例により制限されない。市販の試薬は、特に示さない限り、それらのプロトコールに基づいて使用した。以下、ｖｅｇｆ−Ａ遺伝子をｖｅｇｆ遺伝子、ｖｅｇｆ−Ａ ｍＲＮＡをｖｅｇｆ ｍＲＮＡ、ｖｅｇｆ−Ａ ＲＮＡをｖｅｇｆ ＲＮＡ、ＶＥＧＦ−Ａタンパク質をＶＥＧＦタンパク質という。
（細胞培養）
ヒト大腸がんＨＣＴ１１６細胞（親細胞、野生型ｐ５３）、ヒト大腸がんｐ５３欠損ＨＣＴ１１６細胞（ｐ５３-ＫＯ ＨＣＴ１１６）、ＨＴ−２９細胞およびＳＷ４８０細胞；ヒト肝臓がんＨｅｐＧ２細胞、Ｈｅｐ３Ｂ細胞およびＨＬＥ細胞；ヒト胃がんＡＧＳ細胞；および、ヒト正常皮膚繊維芽細胞を使用した。これらの細胞は、１０％のウシ胎児血清および／または抗生物質を含む、ＭｃＣｏｙ’ｓ ５Ａ培地またはＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ改変Ｅａｇlｅ’ｓ（ＤＭＥＭ）培地を使用した。
（トランスフェクション）
細胞への各種ベクターのトランスフェクションは、ＪｅｔＰＥＩ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ（商品名、Ｐｏｌｙｐｌｕｓ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ社製）を用いて、使用説明書に従って行った。
（ｖｅｇｆ ｓｉＲＮＡ）
目的細胞において、ｖｅｇｆ ｍＲＮＡに対する下記＃１〜＃５のｓｉＲＮＡを発現させるために、各種発現ベクターを作成した。以下、これらのｓｉＲＮＡをｖｅｇｆ ｓｉＲＮＡ、これらのｓｉＲＮＡを発現するベクターをｖｅｇｆ ｓｉＲＮＡベクターともいう。なお、ｓｉＲＮＡの発現には、市販のｓｉＲＮＡ発現系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を応用した。
まず、ｖｅｇｆ ｓｉＲＮＡのコード配列を含む二本鎖オリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチド＃１〜＃５）を準備した。これらのオリゴヌクレオチドのセンス鎖配列を以下に示す。各オリゴヌクレオチドの配列において、下線部は、ｖｅｇｆ遺伝子のエキソン１の領域内部に相補的なアンチセンス配列、または、エキソン１とイントロン１とを含む領域内部に相補的なアンチセンス配列であって、最終的にｓｉＲＮＡ＃１〜＃５として機能する配列をコードする。また、下記配列において、小文字配列は、ｓｉＲＮＡのアンチセンスがハイブリダイズするｖｅｇｆ ｍＲＮＡの領域内部から２塩基を欠損させたＲＮＡの配列に対応するＤＮＡ配列に該当する。各オリゴヌクレオチドの配列の下に、発現させるｓｉＲＮＡのセンスおよびアンチセンス、ならびに、ｓｉＲＮＡのアンチセンスがハイブリダイズするｖｅｇｆ ｍＲＮＡの領域（ターゲットＲＮＡ）の配列を示す。
Figure 0005273740
前記二本鎖オリゴヌクレオチドを、それぞれ、ｓｉＲＮＡ発現用プラスミドベクターに、プロトコールに従ってクローニングした。前記ベクターとしては、プレ−ｍｉＲＮＡ発現カセット内にＧＦＰコード領域を含むｐｃＤＮＡ６．２−ＧＷ／ＥｍＧＦＰ−ｍｉＲ ｖｅｃｔｏｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を使用した。得られた組換えベクターを、それぞれ、ｖｅｇｆ ｓｉＲＮＡ＃１ベクター〜ｖｅｇｆ ｓｉＲＮＡ＃５ベクターという。各組換えベクターについて、前記挿入配列は、ＤＮＡシークエンスにより確認した。また、ｓｉＲＮＡのコントロールベクターとして、脊椎動物の既知遺伝子に対して相同性のない配列（配列番号４６：5’−gaaatgtactgcgcgtggagacgttttggccactgactgacgtctccacgcagtacattt−3’）の二本鎖オリゴヌクレオチドを、前記ｐｃＤＮＡ６．２−ＧＷ／ＥｍＧＦＰ−ｍｉＲ ｖｅｃｔｏｒにクローニングした。得られた組換えベクターを、コントロールｓｉＲＮＡベクターという。各種組換えベクターで細胞を導入した結果、トランスフェクション効率は、ＧＦＰタンパク質の緑蛍光を発生した細胞の割合（％）に基づき、約７０％であった。
前記ｖｅｇｆ ｓｉＲＮＡ＃１ベクター〜ｖｅｇｆ ｓｉＲＮＡ＃５ベクターを細胞に導入すると、ＥｍＧＦＰコード配列と前記オリゴヌクレオチド（＃１〜＃５）とのキメラＤＮＡから、キメラｍＲＮＡが発現される。この際、前記オリゴヌクレオチドに対応するＲＮＡは、ＥｍＧＦＰ ｍＲＮＡの３’側に３’ＵＴＲとして発現する。この３’ＵＴＲ部分が分子内で相補鎖と結合し、形成された塩基対は、Ｄｒｏｓｈａにより切断され、さらに、Ｄｉｃｅｒで切断される。これによって、導入された細胞内において、二本鎖ｓｉＲＮＡ（＃１〜＃５）が形成され、そのアンチセンス鎖により、ターゲットＲＮＡの切断が起こる。なお、得られる二本鎖ｓｉＲＮＡは、両鎖ともに、３’末端に二塩基のオーバーハングを有している。
コントロールｓｉＲＮＡとして、Ｓｉｌｅｎｃｅｒ（登録商標）ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ＃１（Ａｍｂｉｏｎ社製）またはｓｉＲＩＳＣ−ｆｒｅｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｉＲＮＡ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）を購入した。これらのｓｉＲＮＡは、ヒト遺伝子産物に相同性を示さない。また、以下に示すｓｉＲＮＡをＡｍｂｉｏｎ社より購入した。これらのｓｉＲＮＡは、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭａｘ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて、使用説明書に従って細胞に導入した。ｓｉＲＮＡの導入効率は、ＢＬＯＣＫ−ｉＴ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ Ｒｅｄ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｏｌｉｇｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）によると、約６０−７０％であった。
（アポトーシス評価１）
目的の細胞を各種抗がん剤で処理した後、トリプシン／ＥＤＴＡとインキュベートして、細胞懸濁液を調製した。この細胞懸濁液を遠心分離し、上清を除いた後、３．７％ホルムアルデヒド、０．５％Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ４０および１０μｇ／ｍＬ Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を含むＰＢＳ溶液で固定および染色した。染色された核を蛍光顕微鏡で観察し、分断化した核を数えてスコア化した。一回の測定において、最小３００個の細胞についてカウントを行った。
（アポトーシス評価２）
評価対象の細胞を、ｉｎ ｓｉｔｕ Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）を用いて、ＴＵＮＥＬ染色法により評価した。ＴＵＮＥＬ陽性細胞は、顕微鏡で観察し、アポトーシス陽性細胞の割合（％）を算出した。一回の測定において、最小３００個の細胞についてカウントを行った。
（ウェスタンイムノブロッティング）
ウェスタンイムノブロッティングは、Huez, I. et al. Mol. Endocrinol. 15 2197-2210 (2001)、または、Masuda, K., et al. PLoS Med. 5, e94 (2008)に従って行った。一次抗体としては、抗ｐ５３抗体（ＤＯ−１またはＦＬ−３９３、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）、抗β−ａｃｔｉｎ（ｃｌｏｎｅＡＣ−１５、Ｓｉｇｍａ社製）、抗ＨＡ（Ｙ−１１、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）、前記Huezら（2001）に記載の抗Ｌ−ＶＥＧＦ（ポリクローナル抗Ｌ−ＶＥＧＦ抗体）を用いた。
（ノーザンブロッティング）
トータルＲＮＡは、グアニジンチオシアネート法により調製した。以下に示す各種ｃＤＮＡを鋳型として、下記アンチセンスプライマー、クレノウフラグメント（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ社製）および［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰを用いて、標識化ｃＤＮＡを作製した。得られた標識化ｃＤＮＡを、ノーザンブロッティング用のプローブとした。
ｖｅｇｆ ｍＲＮＡ用プローブ１
鋳型：ヒトｖｅｇｆ エキソン１−エキソン５のｃＤＮＡ
アンチセンスプライマー：
5’−gtcttgctctatctttctttggtctgc−3’（配列番号４７）
5’−catctctcctatgtg−3’（配列番号４８）
5’−tccaggccctcgtca−3’（配列番号４９）
ｖｅｇｆ ｍＲＮＡ用プローブ２（実施例Ｂ用）
鋳型：ヒトｖｅｇｆ エキソン２−５のｃＤＮＡ
アンチセンスプライマー：
5’−ttgtcttgctctatctttctttg−3’（配列番号７５）
ｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡ用プローブ
鋳型：ヒトｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡ(配列番号１の６００−８７９)のｃＤＮＡ
アンチセンスプライマー：
5’−gcgcacaccgccgcctcacccgtccatgagcccgg−3’（配列番号７６）
ｐ５３ｍＲＮＡおよび分解ｐ５３ｍＲＮＡ用プローブ１
鋳型：ヒトｐ５３ 全長ｃＤＮＡ
アンチセンスプライマー：
5’−tcagtctgagtc−3’（配列番号５０）
5’−gcccacggatct−3’（配列番号５１）
5’−tgatggtgagga−3’（配列番号５２）
5’−cctcacaacctc−3’（配列番号５３）
5’−aagatgacaggg−3’（配列番号５４）
ｐ５３ｍＲＮＡ用プローブ２（実施例Ｂ用）
鋳型：ヒトｐ５３ 全長ｃＤＮＡ
アンチセンスプライマー：
5’−ttaaaagctttcagtctgagtcaggc−3’（配列番号７７）
ｖｅｇｆ−ＹＦＰ ｍＲＮＡおよびＹＦＰ ｍＲＮＡ用プローブ
鋳型：ＹＦＰ ｃＤＮＡ(Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製)
アンチセンスプライマー：
5’−ttgatcctagcagaagcaca−3’（配列番号５５）
下記アンチセンスプローブは、ｔｅｒｍｉｎａｌ Ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌ Ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ社製）と［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰとを用いて、３’末端を標識化した。
ｎｏｘａ ｍＲＮＡ用アンチセンスプローブ （配列番号５６）
5’−gctctgctggagcccgcgcggggctcggttgagcgttcttgcgcg−3’
ｐｕｍａ ｍＲＮＡ用アンチセンスプローブ （配列番号５７）
5’−ccctctacgggctccggggagctgccctcctggcgtgcgcggg−3’
ｂａｘ ｍＲＮＡ用アンチセンスプローブ （配列番号５８）
5’−ggtggacgcatcctgaggcaccgggtccagggccagctcgggtg−3’
ｐ２１ ｍＲＮＡ用アンチセンスプローブ （配列番号５９）
5’−ggcaggccttgctgccgcatgggttctgacggacatccccagccggttctgacat−3’
（定量的ＲＴ-ＰＣＲ）
トータルＲＮＡ１μｇから、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔII ＲＮａｓｅＨ（−） ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）によりｃＤＮＡを合成し、前記ｃＤＮＡを鋳型として、増幅目的の核酸配列に対するプライマーを用いてＰＣＲを行った。増幅ならびにＰＣＲ産物の定量は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７５００ （Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて、メーカー推奨の方法で行った。
ｖｅｇｆ ｍＲＮＡ用フォワードプライマー（配列番号７８）
5’-gagccttgccttgctgctctac-3’
ｖｅｇｆ ｍＲＮＡ用リバースプライマー（配列番号７９）
5’-caccagggtctcgattggatg -3
ｐ５３ｍＲＮＡ用フォワードプライマー１（配列番号８０）
5’-ctttccacgacggtgaca-3’
ｐ５３ｍＲＮＡ用リバースプライマー１（配列番号８１）
5’-tcctccatggcagtgacc-3
ｂａｘ ｍＲＮＡ用フォワードプライマー（配列番号８２）
5’-atgttttctgacggcaacttc-3’
ｂａｘ ｍＲＮＡ用リバースプライマー（配列番号８３）
5’-atcagttccggcaccttg-3’
ｎｏｘａ ｍＲＮＡ用フォワードプライマー（配列番号８４）
5’-gagatgcctgggaagaagg-3’
ｎｏｘａ ｍＲＮＡ用リバースプライマー（配列番号８５）
5’-ttgagtagcacactcgacttcc-3’
（ＲＮＡプルダウンアッセイ）
ｐ５３欠損ＨＣＴ１１６細胞に、ｐｃＤＮＡ３．１をベースとし且つ前記ベクター配列由来のＴ７配列を有する各種発現ベクターと、ｐＣＭＶ−ｎｅｏ−Ｂａｍをベースとし且つ前記ベクター配列由来のＴ７配列を有さないｐ５３発現ベクターとを、共導入した。共導入の１２時間後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、ｂｕｆｆｅｒＡで細胞を溶解させた。前記ｂｕｆｆｅｒＡの組成は、１０ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、６０ｍｍｏｌ／Ｌ ＫＣｌ、３ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ２、０．１％ ＮＰ−４０、１ｍｍｏｌ／Ｌ ＤＴＴ、１０ｍｍｏｌ／Ｌ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ｖａｎａｄｙｌ ｃｏｍｐｌｅｘとした。得られた細胞抽出液を、ビオチンタグの付いたアンチＴ７プローブとインキュベートした。前記アンチＴ７プローブと結合した複合体を、ストレプトアビジンでコートした磁性ビーズＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ−２７０ ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて沈降させた。前記沈降物から回収した全ＲＮＡを、ＤＮａｓｅＩ（商品名ＴｕｒｂｏＤＮａｓｅＩ、Ａｍｂｉｏｎ社製）で処理した後、ランダムヘキサマーとＴｈｅｒｍｏｓｃｒｉｐｔ ＲＴ−ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）とを用いて、プロトコールに従って、逆転写反応とＰＣＲを行った。ＰＣＲ後、電気泳動によりＰＣＲ産物の増幅の有無を検証した。
使用したアンチＴ７プローブ、ｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡのＰＣＲプライマーセット、および、ｐ５３ｍＲＮＡのＰＣＲプライマーセットを以下に示す。なお、下記アンチＴ７プローブにおいて、大文字で示した塩基がＴ７に対応する配列で、小文字で示した塩基は付加配列である。
アンチＴ７プローブ（配列番号８６）
5’-CCCTATAGTGAGTCGTATTATTTaaaa-biotin-3’
ｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡ用フォワードプライマー（配列番号８７）
5'-GAGCCCGCGCCCGGAGGCGGGGTGG-3'
ｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡ用リバースプライマー（配列番号８８）
5'-GCGCACACCGCCGCCTCACCCGTCCATGAGCCCGG-3'
ｐ５３ｍＲＮＡ用フォワードプライマー２（配列番号８９）
5'-AATATCTAGAATGGAGGAGCCGCA-3'
ｐ５３ｍＲＮＡ用リバースプライマー２（配列番号９０）
5'-TTAAAAGCTTTCAGTCTGAGTCAGGC-3'
［実施例Ａ１］
ＶＥＧＦシグナル経路を有するヒト肝臓がんＨｅｐＧ２細胞は、抗がん剤に対して耐性を示す。そこで、ＲＮＡ干渉によるｖｅｇｆ ｍＲＮＡの減少が、ＨｅｐＧ２細胞の抗がん剤耐性に与える影響を確認した。
（１）ｖｅｇｆ ｍＲＮＡの減少
ＨｅｐＧ２細胞（野生型ｐ５３）に、前述のｖｅｇｆ ｓｉＲＮＡ＃１ベクター、ｖｅｇｆ ｓｉＲＮＡ＃２ベクターおよびコントロールｓｉＲＮＡベクターを、それぞれ導入した。これらの細胞を１８時間培養し、ｖｅｇｆ ｍＲＮＡの発現レベルをノーザンブロッティングにより分析した。また、前記ベクター未導入のＨｅｐＧ２細胞についても、同様に分析を行った。また、分析の際、ローディングコントロールとして、各細胞におけるｇａｐｄｈ ｍＲＮＡをモニターした（以下、同様）。培養は、１０％ウシ胎児血清および１００μｇ／ｍｌ（１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ培地を使用し、条件は、温度３７℃、５％ＣＯ２とした（以下、同様）。
これらの結果を、図１（ａ）に示す。図１（ａ）は、各細胞におけるｖｅｇｆ ｍＲＮＡの発現を示すノーザンブロッティングの結果である。同図において、Ｌａｎｅ１「−」は、ベクター未導入の細胞、Ｌａｎｅ２「ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｉＲＮＡ」は、コントロールｓｉＲＮＡ発現細胞、Ｌａｎｅ３「ｖｅｇｆ ｓｉＲＮＡ＃１」は、ｖｅｇｆ ｓｉＲＮＡ＃１発現細胞、Ｌａｎｅ４「ｖｅｇｆ ｓｉＲＮＡ＃２」は、ｖｅｇｆ ｓｉＲＮＡ＃２発現細胞の結果をそれぞれ示す（以下、同様）。
図１（ａ）に示すように、ベクター未導入の細胞（Ｌａｎｅ１）およびコントロールｓｉＲＮＡ発現細胞（Ｌａｎｅ２）と比較して、ｖｅｇｆ ｓｉＲＮＡ＃１発現細胞（Ｌａｎｅ３）またはｖｅｇｆ ｓｉＲＮＡ＃２発現細胞（Ｌａｎｅ４）は、ｖｅｇｆ ｍＲＮＡの発現量が著しく減少した。
（２）アポトーシスの増加
前記（１）と同様に、各種組換えベクターをＨｅｐＧ２細胞に１８時間導入した。導入細胞を、所定濃度（０、１０、３０μｍｏｌ／Ｌ）の抗がん剤５−ＦＵで６０時間処理し、処理後の細胞について、前記アポトーシス評価１に基づいて、アポトーシス（％）を確認した。これらの結果を、図１（ｂ）に示す。図１（ｂ）は、所定濃度の５−ＦＵで処理した各種細胞のアポトーシス（％）を示すグラフである（ｍｅａｎｓ±ＳＤ、ｎ＝３）。
図１（ｂ）に示すように、コントロールｓｉＲＮＡ発現細胞は、遺伝毒性の抗癌剤５−ＦＵで処理した結果、アポトーシスの割合を若干増加した。これに対して、ｖｅｇｆ ｓｉＲＮＡ＃１またはｖｅｇｆ ｓｉＲＮＡ＃２の発現細胞では、ｓｉＲＮＡによるｖｅｇｆ ｍＲＮＡのサイレンシングが、基底アポトーシス（０μｍｏｌ／Ｌ）に影響を与えなかったが、５−ＦＵで処理した場合、濃度依存的に、５−ＦＵに応答してアポトーシスの割合が著しく向上した。なお、ヒト大腸がんＨＣＴ１１６（親細胞、野生型ｐ５３）においても、前記（１）および（２）におけるＨｅｐＧ２細胞と同様の結果が確認された。
（３）ｐ５３の発現
ＨｅｐＧ２細胞およびＨＣＴ１１６細胞において、５−ＦＵにより誘導されるアポトーシスは、ｐ５３に依存することが知られている（Bunz, F. et al. J. Clin. Invest. 104, 263-269 (1999)）。そこで、前記（１）におけるｖｅｇｆ ｍＲＮＡの減少が、細胞内のｐ５３経路に影響を与えているか否かを確認すべく、ｐ５３ｍＲＮＡおよびｐ５３タンパク質の発現レベルを測定した。
前記（１）と同様にして、各種ベクターをＨｅｐＧ２細胞に１８時間導入した後、この細胞を、３０μｍｏｌ／Ｌの５−ＦＵ存在下（＋）または５−ＦＵ非存在下（−）で処理した。８時間処理した細胞について、ｐ５３ｍＲＮＡの発現レベルをノーザンブロッティングにより分析し、１２時間処理した細胞について、ｐ５３タンパク質の発現レベルをウェスタンイムノブロッティングにより分析した。タンパク質の分析は、あわせて、内在性コントロールであるβ−アクチンタンパク質についても行った（以下、同様）。これらの結果を、図１（ｃ）に示す。同図は、ｖｅｇｆ ｓｉＲＮＡを発現させた細胞におけるｐ５３ｍＲＮＡおよびｐ５３タンパク質の発現を示す結果である。同図において、上から１段目はｐ５３ｍＲＮＡ、２段目はｇａｐｄｈ ｍＲＮＡ、３段目はｐ５３タンパク質、４段目はβ−アクチンタンパク質の発現をそれぞれ示す。また、同図において、「−」は、５−ＦＵ非存在下、「＋」は、５−ＦＵ存在下の条件を示す。
また、同様にして、前記各種ベクターを導入したＨｅｐＧ２細胞を、３０μｍｏｌ／Ｌの５−ＦＵ存在下（＋）または５−ＦＵ非存在下（−）で、１６時間処理した。処理後の細胞について、ｐ５３系路において誘導されるｎｏｘａ ｍＲＮＡ、ｐｕｍａ ｍＲＮＡおよびｐ２１ ｍＲＮＡの発現を、それぞれノーザンブロッティングにより分析した。これらの結果を、図１（ｄ）に示す。同図は、ｖｅｇｆ ｓｉＲＮＡを発現させた細胞におけるｐ５３ｍＲＮＡの発現を示すノーザンブロッティングの結果である。同図において、上から１段目はｎｏｘａ ｍＲＮＡ、２段目はｐｕｍａ ｍＲＮＡ、３段目はｐ２１ ｍＲＮＡ、４段目はｇａｐｄｈ ｍＲＮＡの発現をそれぞれ示す。各Ｌａｎｅは、図１（ｃ）と同様である。
図１（ｃ）に示すように、５−ＦＵ非存在下（−）、ｖｅｇｆ ｓｉＲＮＡ＃１の発現細胞（Ｌａｎｅ３）およびｖｅｇｆ ｓｉＲＮＡ＃２の発現細胞（Ｌａｎｅ５）は、コントロール細胞と比較して（Ｌａｎｅ１）、ｖｅｇｆのサイレンシングにより、ｐ５３ｍＲＮＡおよびｐ５３タンパク質の発現増加を示した。さらに、図１（ｃ）のＬａｎｅ４および６に示すように、５−ＦＵ存在下（＋）において、ｖｅｇｆ ｓｉＲＮＡ＃１の発現細胞（Ｌａｎｅ４）およびｖｅｇｆ ｓｉＲＮＡ＃２の発現細胞（Ｌａｎｅ６）は、ｖｅｇｆのサイレンシングにより、５−ＦＵによるｐ５３の発現誘導が亢進され、ｐ５３ｍＲＮＡおよびｐ５３タンパク質の著しい発現増加を示した。そして、これに伴い、図１（ｄ）に示すように、ｖｅｇｆ ｓｉＲＮＡ＃１の発現細胞（Ｌａｎｅ４）およびｖｅｇｆ ｓｉＲＮＡ＃２の発現細胞（Ｌａｎｅ６）は、ｎｏｘａ ｍＲＮＡ、ｐｕｍａ ｍＲＮＡ、ｐ２１ ｍＲＮＡの発現誘導も著しく亢進された。これに対して、コントロール細胞（Ｌａｎｅ２）は、図１（ｄ）に示すように、５−ＦＵに応答して、ｐ２１ ｍＲＮＡの発現が若干誘導されたにすぎなかった。
これらの結果から、ｖｅｇｆ ｍＲＮＡのノックダウンによるｐ５３ｍＲＮＡの発現レベルの増加が、抗がん剤に対する細胞の感受性を向上し、５−ＦＵの最適以下の投与量に対する応答も実現した。これらは、ｐ５３発現が、細胞内のｖｅｇｆ ｍＲＮＡによって抑制されていることを示唆している。
［実施例Ａ２］
ＶＥＧＦタンパク質またはｖｅｇｆ ｍＲＮＡが、直接的にｐ５３の発現の抑制に関与しているか否かを確認した。
（１）プラスミドコンストラクト
ヒトＶＥＧＦ１６５のコード遺伝子（ｖｅｇｆ遺伝子）、その５’ＵＴＲならびに３’ＵＴＲに相当する配列等は、文献（J． Abraham et al. J. Biol. Chem. 266, 18, 11947-11954 (1991)）に基づいて準備した。下記方法により作製したプラスミドコンストラクトの概略を、図２（ａ）に示す。同図に示す、プラスミドコンストラクトＡ（ｐ１６５ｍＳＰＨＡ３’）、Ｂ（ｐ１６５ｍＳＰＨＡ）、Ｃ（ｐ１６５−３’）およびＤ（ｐＶＣ）は、それぞれ文献（Bornes, S. et al. J. Biol. Chem. 279, 18717-18726 (2004)、Huez, I. et al. Mol. Endocrinol. 15 2197-2210 (2001)）の方法を参照して構築した。
コンストラクトＡ（ｐ１６５ｍＳＰＨＡ３’）（ｖｅｇｆ遺伝子の全長ｃＤＮＡ）
文献Bornes, S. et al. J. Biol. Chem. 279, 18717-18726 (2004)の方法を参照して、コンストラクトＡ（ｐ１６５ｍＳＰＨＡ３’）を作製した。コンストラクトＡは、ｖｅｇｆ遺伝子のｃＤＮＡ、すなわち、５’ＵＴＲに相当するＤＮＡ配列、ＶＥＧＦ１６５タンパク質のコード配列および３’ＵＴＲに相当するＤＮＡ配列を有し、且つ、前記タンパク質コード配列の３’末端と前記３’ＵＴＲ ＤＮＡ配列の５’末端との間にＨＡタグのコード配列が付加されたＤＮＡ断片が、ｐＳＣＴプラスミドベクターに挿入されている。
コンストラクトＢ（ｐ１６５ｍＳＰＨＡ）（３’ＵＴＲ欠損）
文献Bornes, S. et al. J. Biol. Chem. 279, 18717-18726 (2004)の方法を参照して、コンストラクトＢ（ｐ１６５ｍＳＰＨＡ）を作製した。コンストラクトＢは、ｖｅｇｆ遺伝子の５’ＵＴＲに相当するＤＮＡ配列およびＶＥＧＦ１６５タンパク質のコード配列を有し、且つ、前記タンパク質コード配列の３’末端にＨＡタグのコード配列が付加されたＤＮＡ断片が、ｐＳＣＴプラスミドベクターに挿入されている。
コンストラクトＣ（ｐ１６５−３’）（５’ＵＴＲ欠損）
ｐＳＣＴプラスミドベクターに下記ＤＮＡ断片が挿入されたコンストラクトＣ（ｐ１６５−３’）を作製した。前記ＤＮＡ断片は、ＶＥＧＦ１６５タンパク質のコード配列およびｖｅｇｆ遺伝子の３’ＵＴＲに相当するＤＮＡ配列を有し、且つ、前記タンパク質コード配列の３’末端と前記３’ＵＴＲ ＤＮＡ配列の５’末端との間にＨＡタグのコード配列が付加されたＤＮＡ断片である。具体的には、前記コンストラクトＡ（ｐ１６５ｍＳＰＨＡ３’）を制限酵素ＸｂａＩとＮｇｏＭ IVとで処理し、５’ＵＴＲ部分を除去した。その後、クレノウフラグメント処理によりＤＮＡ末端を平滑化し、リガーゼを用いて平滑末端同士を連結することによって、コンストラクトＣを得た。
コンストラクトＤ(ｐＶＣ)（５’ＵＴＲのみ）
文献Huez, I. et al. Mol. Endocrinol. 15 2197-2210 (2001)の方法を参照して、コンストラクトＤ（ｐＶＣ）を作製した。コンストラクトＤは、配列番号１の１番目〜１２０５番目の領域に相当するＤＮＡ配列とＣＡＴコード配列とのキメラＤＮＡが、ｐＳＣＴプラスミドベクターに挿入されている。前記配列番号１の１番目〜１２０５番目の領域は、ｖｅｇｆ ｍＲＮＡにおいて、５’ＵＴＲと、開始コドンａｔｇから１６７塩基までの配列とを含む。
コンストラクトｍｏｃｋ
ｖｅｇｆ遺伝子のＤＮＡ断片を挿入していない空ベクター（ｐＳＣＴプラスミドベクター）を、コンストラクトｍｏｃｋとした。
（２）ｐ５３ｍＲＮＡおよびｐ５３タンパク質の発現
ヒト肺がんＨ１２９９細胞（ｐ５３ｎｕｌｌ）に、ｐ５３を発現するプラスミドベクターおよびエフェクターとして前記各種プラスミドコンストラクトを共導入した。前記ｐ５３を発現するプラスミドベクターを、以下、「ｐ５３発現ベクター」という。このｐ５３発現ベクターは、ｐｃＤＮＡ３．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）のＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩサイトに、ヒトｐ５３のタンパク質コード配列（配列番号２の２５２番目−１４３３番目）を挿入して作製した（ｐｃＤＮＡ３．１−ｐ５３）。以下、同様である。共導入した各細胞を１８時間培養し、外来性ｐ５３ｍＲＮＡの発現レベルをノーザンブロッティングにより分析した。また、共導入した各細胞を２４時間培養し、外来性ｐ５３タンパク質ならびに外来性ＶＥＧＦタンパク質の発現レベルを、それぞれ抗ｐ５３抗体と抗ＨＡタグ抗体を用いたウェスタンイムノブロッティングにより分析した。培養は、１０％ウシ胎児血清および１００μｇ／ｍｌ（１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ培地を使用し、条件は、温度３７℃、５％ＣＯ２とした（以下、同様）。
これらの結果を、図２（ｂ）および（ｃ）に示す。図２（ｂ）は、各細胞におけるｐ５３ｍＲＮＡの発現を示すノーザンブロッティングの結果であり、上段は、ｐ５３ｍＲＮＡの発現、下段は、ｇａｐｄｈ ｍＲＮＡの発現を示す。図２（ｃ）は、各細胞におけるｐ５３タンパク質の発現を示すウェスタンイムノブロッティングの結果であり、上段は、ｐ５３タンパク質の発現、下段は、β−アクチンタンパク質の発現を示す。両図において、Ｌａｎｅ１「ＮＴ」は、ベクター未導入の細胞、Ｌａｎｅ２「Ａ」は、コンストラクトＡ（ｐ１６５ｍＳＰＨＡ３’）の導入細胞、Ｌａｎｅ３「Ｂ」は、コンストラクトＢ（ｐ１６５ｍＳＰＨＡ）の導入細胞、Ｌａｎｅ４「Ｃ」は、コンストラクトＣ（ｐ１６５−３’）の導入細胞、Ｌａｎｅ５「ｍｏｃｋ」は、空ベクターの導入細胞、Ｌａｎｅ６「Ｄ」は、コンストラクトＤ（ｐＶＣ）の導入細胞を示す。「ｐ５３＋」は、ｐ５３発現ベクターの導入を意味する。
図２（ｂ）および（ｃ）に示すように、ｖｅｇｆ遺伝子の全長成熟ｍＲＮＡを発現するコンストラクトＡ導入細胞（Ｌａｎｅ２）は、外来性ｐ５３ｍＲＮＡの発現を著しく抑制した。この結果から、ＶＥＧＦタンパク質またはｖｅｇｆ ｍＲＮＡがｐ５３の発現抑制に関与していることがわかった。そこで、ｐ５３発現抑制に対するｖｅｇｆ ｍＲＮＡのＵＴＲ配列の関与を確かめるため、３’ＵＴＲを欠損するコンストラクトＢおよび５’ＵＴＲを欠損するコンストラクトＣを用いてｐ５３発現を確認した。その結果、３’ＵＴＲを欠損するコンストラクトＢの導入細胞（Ｌａｎｅ３）は、ｖｅｇｆ遺伝子の全長ｃＤＮＡを含むコンストラクトＡの導入細胞（Ｌａｎｅ２）と同様に、外来性ｐ５３の発現を著しく抑制した。これに対して、５’ＵＴＲを欠損するコンストラクトＣの導入細胞（Ｌａｎｅ４）は、ｐ５３発現に影響がなかった。この結果は、ｐ５３ｍＲＮＡの抑制が、ＶＥＧＦタンパク質ではなく、ｖｅｇｆ ｍＲＮＡによって、特に、ｖｅｇｆ ｍＲＮＡの５’ＵＴＲ配列によって媒介されていることを示唆している。この５’ＵＴＲの関与をさらに確認するために、ＣＡＴコード遺伝子に５’ＵＴＲのＤＮＡ配列が融合され、ＣＡＴ ｍＲＮＡと５’ＵＴＲとのキメラｍＲＮＡを発現するコンストラクトＤについても、同様にｐ５３の発現を確認した。なお、コンストラクトＤの導入細胞は、ｖｅｇｆ遺伝子の５’ＵＴＲを有するのみであるため、ＶＥＧＦタンパク質は生産されない。その結果、コンストラクトＤの導入細胞（Ｌａｎｅ６）は、ＶＥＧＦタンパク質は生産されないにもかかわらず、ｐ５３ｍＲＮＡおよびｐ５３タンパク質の発現抑制が確認された。この結果から、ＶＥＧＦタンパク質ではなく、ｖｅｇｆ ｍＲＮＡ、中でも、ｍＲＮＡの５’ＵＴＲが、ｐ５３の発現抑制に関与していることが確認できた。したがって、ｖｅｇｆ遺伝子について、５’ＵＴＲの発現抑制または発現した５’ＵＴＲの切断によって、ｖｅｇｆ ｍＲＮＡによるｐ５３のダウンレギュレーションを解除できるといえる。なお、ｐ５３欠損ＨＣＴ１１６細胞を用いた場合にも、同様の結果が得られた。
［実施例Ａ３］
部分的に欠損した５’ＵＴＲまたは変異５’ＵＴＲを発現するコンストラクトを作製し、ｐ５３のダウンレギュレーションに関与するｖｅｇｆ ５’ＵＴＲの要素配列の決定を行った。
（１）プラスミドコンストラクト
ヒトｖｅｇｆ遺伝子のエキソン１に相当するＤＮＡ断片、ならびに、下記各種プラスミドコンストラクトを、前記実施例Ａ２と同様に、前述した各文献に基づいて準備した。下記方法により作製したプラスミドコンストラクトを、図３（ａ）に示す。
コンストラクトＡ(ｐＶＣ)（ｖｅｇｆ１−１２０３）
文献Huez, I. et al. Mol. Endocrinol. 15 2197-2210 (2001)の方法を参照して、コンストラクトＡ（ｐＶＣ）を作製した。コンストラクトＡは、ｖｅｇｆ遺伝子におけるエキソン１、エキソン２およびエキソン３の一部からなるＤＮＡ配列とＣＡＴコード配列とのキメラＤＮＡが、ｐＳＣＴプラスミドベクターに挿入されている。前記ＤＮＡ配列は、ｖｅｇｆ ｍＲＮＡのエキソン１（配列番号１の１−１１０４番目）、エキソン２（配列番号１の１１０５−１１５４番目）およびエキソン３部分配列（配列番号１の１１５５−１２０３番目）に相当する配列である。なお、このコンストラクトＡは、実施例Ａ２におけるコンストラクトＤと同じである。
コンストラクトＢ（Δ５５５−１０１２）
エキソン１を部分的に欠損するコンストラクトＢを作製した。コンストラクトＢは、配列番号１の５５５−１０１２番目の領域を欠損するエキソン１部分配列、エキソン２（配列番号１の１１０５−１１５４番目）およびエキソン３部分配列（配列番号１の１１５５−１２０３番目）からなるＤＮＡ配列とＣＡＴコード配列とのキメラＤＮＡが、ｐＳＣＴプラスミドベクターに挿入されている。具体的には、前記コンストラクトＡ（ｐＶＣ）をＮｇＯＭＩＶで処理し、再度、ライゲーションすることでコンストラクトＢを得た。
コンストラクトＣ（Δ１−７４４）
エキソン１を部分的に欠損するコンストラクトＣを作製した。コンストラクトＣは、配列番号１の１−７４４番目の領域を欠損するエキソン１部分配列、エキソン２（配列番号１の１１０５−１１５４番目）およびエキソン３部分配列（配列番号１の１１５５−１２０３番目）からなるＤＮＡ配列とＣＡＴコード配列とのキメラＤＮＡが、ｐＳＣＴプラスミドベクターに挿入されている。具体的には、前記コンストラクトＡ（ｐＶＣ）をＸｂａＩおよびＮｈｅＩで処理し、再度、ライゲーションすることでコンストラクトＣを得た。
コンストラクトＤ（Δ１−６５８）
エキソン１を部分的に欠損するコンストラクトＤを作製した。コンストラクトＤは、配列番号１の１−６５８番目の領域を欠損するエキソン１部分配列、エキソン２（配列番号１の１１０５−１１５４番目）およびエキソン３部分配列（配列番号１の１１５５−１２０３番目）からなるＤＮＡ配列とＣＡＴコード配列とのキメラＤＮＡが、ｐＳＣＴプラスミドベクターに挿入されている。具体的には、前記コンストラクトＡ（ｐＶＣ）をＸｂａＩおよびＸｍｎＩで処理し、リガーゼ処理によって平滑末端化した後、再度、ライゲーションすることでコンストラクトＤを得た。
コンストラクトＥ（Δ１−４７５、Δ９１８−１１７５）
エキソン１を部分的に欠損するコンストラクトＥを作製した。コンストラクトＥは、配列番号１の１−４７５番目の領域および９１８−１１７５番目の領域を欠損するエキソン１部分配列、および、５’領域を欠損するエキソン３部分配列（配列番号１の１１７６−１２０３番目）からなるＤＮＡ配列とＣＡＴコード配列とのキメラＤＮＡが、ｐＳＣＴプラスミドベクターに挿入されている。具体的には、まず、前記コンストラクトＡ（ｐＶＣ）をＢａｍＨＩ処理してＢａｍＨＩ断片を除いた後、再ライゲーションを行った（ｐＶＣ−Δ１−４７４）。そして、このｐＶＣ−Δ１−４７４のＳｍａＩ−ＢｓａＢＩ断片を除いて再ライゲーションすることで得た。
コンストラクトＦ（Δ１−４７５、Δ７４６−１０１２）
エキソン１を部分的に欠損するコンストラクトＦを作製した。コンストラクトＦは、配列番号１の１−４７５番目の領域および７４６−１０１２番目の領域を欠損するエキソン１部分配列、エキソン２（配列番号１の１１０５−１１５４番目）およびエキソン３部分配列（配列番号１の１１５５−１２０３番目）からなるＤＮＡ配列とＣＡＴコード配列とのキメラＤＮＡが、ｐＳＣＴプラスミドベクターに挿入されている。具体的には、前記コンストラクトｐＶＣ−Δ１−４７４のＮｈｅＩ−ＮｇＯＭIV断片を除き、リガーゼ処理によって平滑末端化した後、再ライゲーションすることでコンストラクトＦを得た。
コンストラクトＧ(ｐＶＣＴＴＴ)（４９９−５０１の変異：ＣＴＧ→ＴＴＴ）
文献（Huez, I. et al. Mol. Endocrinol. 15 2197-2210 (2001)）の方法を参照して、変異５’ＵＴＲを発現する変異エキソン１を有するコンストラクトＧ（ｐＶＣＴＴＴ）を作製した。コンストラクトＧは、前記変異エキソン１配列およびエキソン２部分配列（配列番号１の１１０５−１２０５番目）とからなるＤＮＡ配列とＣＡＴコード配列とのキメラＤＮＡが、ｐＳＣＴプラスミドベクターに挿入されている。具体的には、５’ＵＴＲをコードするＤＮＡ配列において、ＣＴＧコドン（配列番号第１の４９９−５０１番目に対応）をＴＴＴに変異させた。この変異導入により、ｐＶＣＴＴＴから転写されたｍＲＮＡは、ＣＴＧコドン（配列番号第１の４９９−５０１番目）からのタンパク質産生ができない。
コンストラクトＨ(ｐＶＣｍｕｔ５’)（変異５’ＵＴＲ）
変異５’ＵＴＲを発現する変異エキソン１配列およびエキソン２部分配列（配列番号１の１１０５−１２０５番目）とＣＡＴコード配列とのキメラＤＮＡを有するコンストラクトＨを作製した。具体的には、ＣＴＧコドン（配列番号第１の４９９−５０１番目に対応）から翻訳が開始されるｌｏｎｇ ＶＥＧＦタンパク質(以下、「Ｌ−ＶＥＧＦ」という)のアミノ酸配列には影響を与えないように、エキソン１配列に変異を導入した。変異は、５’ＵＴＲをコードするＤＮＡ配列において、配列番号１の５９４−９１５番目に対応するＤＮＡ領域に対して行った。
まず、５’ＵＴＲをコードするＤＮＡ配列において、配列番号１の５９４−９１５番目に対応するＤＮＡ領域に変異を有する、４種類の二本鎖オリゴヌクレオチドを合成した。各二本鎖オリゴヌクレオチドのセンス鎖配列を以下に示す。なお、下記配列において、小文字が変異部位である。
Fragment 1（配列番号３３）
5’−GCG AGC CGC GGG CAa GGa CCa GAa CCa GCa CCa GGg GGa GGa GTa GAa GGa GTa GGG GCT C−3’
Fragment 2（配列番号３４）
5’−GG GCT CGa GGa GTa GCa tta AAg CTa TTt GTa CAg tta tta GGa TGc TCa CGa TTt GGg GGg GCa GTa GTa aga GCa GGa Gag GCa GAa CCa AGt GGg GCa GCa AGg AGT GCT AGC−3’
Fragment 3（配列番号３５）
5’−GCT AGC TCa GGa aga GAa GAa CCa CAa CCa GAa GAa GGa GAa GAa Gag Gag GAa AAa GAg GAa GAa cgt GGa CCa CAa TGG agg tta GGa GCa aga AAa CCG GGC TC−3’
Fragment 4（配列番号３６）
5’−G GGC TCA TGG ACa GGa GAa GCa GCa GTa TGt GCc Gat AGc GCa CCt GCa GCa aga GCa CCa CAa GCa tta GCC CGG GCC TCG−3’
これらの４種類の二本鎖オリゴヌクレオチドを、ＳａｃIIおよびＸｍａＩで処理した前記コンストラクトＡ（ｐＶＣ）に連結した。なお、Ｆｒａｇｍｅｎｔ１から４は、上流５’側からこの順序で連結するように、前記コンストラクトＡ（ｐＶＣ）に挿入した。変異を有する４種類の断片を挿入したプラスミドコンストラクトは、ＤＮＡシークエンスにより挿入断片を確認した。このようにして得られたプラスミドコンストラクトをコンストラクトＨ（ｐＶＣｍｕｔ５’）という。
（２）ｐ５３ｍＲＮＡおよびｐ５３タンパク質の発現
Ｈ１２９９細胞（ｐ５３ ｎｕｌｌ）に、前記ｐ５３発現ベクターおよびエフェクターとなる前記各種プラスミドコンストラクトを共導入した。そして、前記実施例Ａ２と同様にして、各導入細胞を培養し、外来性ｐ５３ｍＲＮＡの発現レベルおよび外来性ｐ５３タンパク質の発現レベルを分析した。あわせて、Ｌ−ＶＥＧＦの発現レベルを、抗Ｌ-ＶＥＧＦ抗体を用いたウェスタンイムノブロッティングにより分析した。これらの結果を、図３（ｂ）および（ｃ）に示す。図３（ｂ）および（ｃ）は、上から１段目がｐ５３ｍＲＮＡ、２段目がｇａｐｄｈ ｍＲＮＡの発現をそれぞれ示すノーザンブロッティングの結果である。図３（ｃ）において、上から３段目はｐ５３タンパク質、４段目はＬ−ＶＥＧＦタンパク質、５段目はβ−アクチンタンパク質の発現をそれぞれ示す。図３（ｂ）において、Ｌａｎｅ１「Ａ」はコンストラクトＡ、Ｌａｎｅ２「Ｂ」はコンストラクトＢ、Ｌａｎｅ３「Ｃ」はコンストラクトＣ、Ｌａｎｅ４「Ｄ」はコンストラクトＤ、Ｌａｎｅ５「Ｅ」はコンストラクトＥ、Ｌａｎｅ６「Ｆ」はコンストラクトＦを、それぞれ導入した細胞である。図３（ｃ）において、Ｌａｎｅ１「ＮＴ」は、ベクター未導入の細胞、Ｌａｎｅ２「ｍｏｃｋ」はコンストラクトｍｏｃｋ、Ｌａｎｅ３「Ｇ」はコンストラクトＧ、Ｌａｎｅ４「Ａ」はコンストラクトＡ、Ｌａｎｅ「Ｈ」はコンストラクトＨをそれぞれ導入した細胞である。「ｐ５３＋」は、ｐ５３発現ベクターの導入を示す。なお、図３（ｃ）において、「ｎｓ」は、抗Ｌ−ＶＥＧＦ抗体により検出された非特異的なバンドを示す。
図３（ｂ）に示すように、コンストラクトＤ（Ｌａｎｅ４）およびＥ（Ｌａｎｅ５）は、５’ＵＴＲを含む全長エキソン１ＲＮＡを発現するコンストラクトＡ導入細胞（Ｌａｎｅ１）と同様に、ｐ５３ｍＲＮＡの発現をダウンレギュレーションする能力を有していた。コンストラクトＤは、エキソン１の６５９番目から下流域を有し、コンストラクトＥは、４７６番目−９１７番目および１１７６番目から下流域を有する。このことから、ｖｅｇｆ ５’ＵＴＲの６５９番目−９１７番目の２５９ヌクレオチド（ｎｔ）の分子が、ｐ５３のダウンレギュレーションに関与していることがわかった。一方、ｐ５３の発現が抑制されなかったコンストラクトＢ導入細胞（Ｌａｎｅ２）、コンストラクトＣ導入細胞（Ｌａｎｅ３）、コンストラクトＦ導入細胞（Ｌａｎｅ６）は、それぞれ、エキソン１の５５５番目−１０１２番目、１番目−７４４番目、７４６番目−１０１２番目の領域を欠損している。この結果は、ｐ５３の発現を抑制したコンストラクトＤ、Ｅの結果と対応していることがわかる。
前述の６５９番目−９１７番目の領域には、ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｅｎｔｒｙ ｓｉｔｅ(ＩＲＥＳ)と呼ばれるユニークな構造配列の一部が含まれている（Huez, I. et al. Mol. Cell. Biol. 18, 6178-6190 (1998)、Akiri, G. et al. Oncogene 17, 227-236 (1998)）。そこで、他の遺伝子（ｆｇｆ−２、ｐｄｇｆおよびｃ−ｍｙｃ）のＩＲＥＳ含有５’ＵＴＲについても、ｐ５３発現に影響を与えるか否かを調べた。その結果を図４に示す。同図は、各種遺伝子の５’ＵＴＲ ＲＮＡとＣＡＴｍＲＮＡとのキメラｍＲＮＡを発現するプラスミドベクター、および、ｐ５３発現ベクターを、共導入したＨ１２９９細胞に関する、ｐ５３ｍＲＮＡの発現を示すノーザンブロッティングの結果である。同図に示すように、ｐ５３の発現を特異的に抑制するのは、ｖｅｇｆ ５’ＵＴＲのみであることが確認できた。
文献（Huez, I. et al. Mol. Endocrinol. 15, 2197-2210 (2001)）において、ヒトｖｅｇｆ ｍＲＮＡの５’ＵＴＲが、開始コドンＡＵＧ（１０３９−１０４１）より上流に位置するＣＵＧコドン（４９９−５０１）から、ｉｎ ｆｌａｍｅで、ＶＥＧＦタンパク質のＮ末端が長くなったタンパク質（Ｌ−ＶＥＧＦ）に翻訳される場合があることが実証されている。そして、前述のｐ５３発現抑制に関与するＲＮＡの要素配列（６５９番目−９１７番目）は、Ｌ−ＶＥＧＦに翻訳される前記ＣＵＧコドンより下流の領域に局在する。このため、ｖｅｇｆ ５’ＵＴＲ ＲＮＡとＬ−ＶＥＧＦタンパク質のいずれかが、ｐ５３発現の抑制に関与する可能性が考えられる。そこで、ｖｅｇｆ ５’ＵＴＲ ＲＮＡとＬ−ＶＥＧＦタンパク質のいずれが、ｐ５３発現の抑制を誘導しているのかを、変異５’ＵＴＲを発現するコンストラクトＧおよびコンストラクトＨを用いて確認した。コンストラクトＧは、前述のように、開始コドンＣＴＧが非開始コドンＴＴＴ（ｍＲＮＡにおいてＣＵＧがＵＵＵ）となるように、ＤＮＡ配列を変化させた。コンストラクトＨは、アミノ酸配列を変化させることなくＬ−ＶＥＧＦタンパク質を生産でき、且つ、ＲＮＡ構造を変化させることでＲＮＡ機能を十分損なうことができるように、５’ＵＴＲコードＤＮＡ配列を置換した。その結果、図３（ｃ）に示すように、コンストラクトＧ（Ｌａｎｅ３）は、非開始コドンをＴＴＴに変化させたことにより、Ｌ−ＶＥＧＦタンパク質は検出されなかったが、依然としてｐ５３ｍＲＮＡの発現が抑制された。一方、コンストラクトＨ（Ｌａｎｅ５）は、全長５’ＵＴＲを有するコンストラクトＡ（Ｌａｎｅ４）と同様に、Ｌ−ＶＥＧＦタンパク質を生産したが、ｐ５３ｍＲＮＡの発現抑制能を示さなかった。これらの結果は、５’ＵＴＲから翻訳されるＬ−ＶＥＧＦタンパク質ではなく、５’ＵＴＲが、ｍＲＮＡレベルで、ｐ５３の発現を抑制する能力を有することを示している。このため、ｖｅｇｆ ｍＲＮＡにおける５’ＵＴＲの発現抑制、または、発現した５’ＵＴＲ（ｍＲＮＡ）の分解によって、ｐ５３のダウンレギュレーションを解除できるといえる。また、前述の結果から、５’ＵＴＲの発現抑制は、全体でもよいし、例えば、要素配列（６５９番目−９１７番目）の発現抑制のみであってもよい。このようにして、ｐ５３の発現抑制を解除できれば、ｐ５３の発現によって、がん細胞の成長が抑制され、アポトーシスを誘導することができる。そして、結果的に、細胞のがん化やがん化細胞の成育を抑制し、また、がんの治療も可能になるといえる。
［実施例Ａ４］
本実施例では、ｖｅｇｆ ｍＲＮＡにおける５’ＵＴＲが、内在性ｐ５３発現およびｐ５３依存性アポトーシス応答に与える影響を確認した。本実施例においては、Ｙｅｌｌｏｗ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＹＦＰ）をコードするｍＲＮＡにｖｅｇｆ ５’ＵＴＲが融合したキメラｍＲＮＡを発現するアデノウイルス骨格ベクターを使用した。
（１）組換えアデノウイルスベクターの構築
前記実施例Ａ２におけるコンストラクトＤ（ｐＶＣ）をＥｃｏＲＩおよびＮｃｏＩで処理し、得られたＥｃｏＲＩ−ＮｃｏＩ断片を、ｐｄ２ＥＹＦＰ−Ｎ１(Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製)に連結した。得られたプラスミドコンストラクトを、ｐＶＹという。また、前記実施例Ａ３におけるコンストラクトＨ（ｐＶＣｍｕｔ５’）をＥｃｏＲＩおよびＮｃｏＩで処理し、得られたＥｃｏＲＩ−ＮｃｏＩ断片をｐｄ２ＥＹＦＰ−Ｎ１(Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製)に連結した。得られたプラスミドコンストラクトを、ｐＶＹｍｕｔ５’という。
ｐＶＹ、ｐＶＹｍｕｔ５’およびｐｄ２ＥＹＦＰ−Ｎ１（コントロール）を、ＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩで処理し、切り出した断片をクレノウフラグメント処理によって平滑化した。そして、各平滑化断片をｐＳｈｕｔｔｌｅＣＭＶベクターにクローニングした。得られたプラスミドベクターを、それぞれ、ｐＳｈｕｔｔｌｅＣＭＶ−ＶＹ、ｐＳｈｕｔｔｌｅＣＭＶ−ＶＹｍｕｔ５’、および、ｐＳｈｕｔｔｌｅＣＭＶ−ＹＦＰ（コントロール）という。これらのプラスミドベクターの構築は、ＤＮＡシークエンスにより確認した。続いて、ＢＪ５１８３細菌において、アデノウイルス骨格プラスミドｐＡｄＥａｓｙ−１と、ＰｍｅＩで処理した各プラスミドｐＳｈｕｔｔｌｅＣＭＶ−ＶＹ、ｐＳｈｕｔｔｌｅＣＭＶ−ＶＹｍｕｔ５’およびｐＳｈｕｔｔｌｅＣＭＶ−ＹＦＰとの間で、相同組換えを行うことにより、組換えアデノウイルスベクターＡｄ−ＶＹ、Ａｄ−ＶＹｍｕｔ５’およびＡｄ−ＹＦＰを作製した。そして、これらの組換えアデノウイルスベクターを、さらにＰａｃＩで処理し、ＪｅｔＰＥＩ(Ｐｏｌｙｐｌｕｓ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ社)を用いて、ＨＥＫ２９３細胞（ＡＴＣＣ）に導入した。複製したウイルスを、ＣｓＣｌ平衡密度勾配遠心法により精製し、使用時まで−８０℃で保存した。ウイルスのプラーク形成ユニットについての機能滴定は、ＨＥＫ２９３細胞における終点希釈感染（ｅｎｄ−ｐｏｉｎｔ ｄｉｌｕｔｉｏｎ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）により確認した。なお、以下の試験は、各組換えアデノウイルスベクターＡｄ−ＶＹ、Ａｄ−ＶＹｍｕｔ５’およびＡｄ−ＹＦＰの単一バッチについて行った。
Ａｄ−ＶＹは、ＹＦＰをコードするｍＲＮＡに、ｖｅｇｆ ｍＲＮＡの全長５’ＵＴＲを融合させたキメラｍＲＮＡを発現する組換えベクター（以下、「Ａｄ−ＶＥＧＦ５’」ともいう）である。Ａｄ−ＶＹｍｕｔ５’は、ＹＦＰをコードするｍＲＮＡに、前記図３（ａ）のコンストラクトＨ（ｐＶＣｍｕｔ５’）に示す変異５’ＵＴＲを融合させたキメラ遺伝子を有するベクターである。Ａｄ−ＹＦＰは、ＹＦＰをコードするｍＲＮＡを発現し、ｖｅｇｆ遺伝子の５’ＵＴＲが未挿入であるコントロールベクター（以下、「Ａｄ−ｃｏｎｔｒｏｌ」ともいう）である。
（２）内在性ｐ５３の発現
内在性ｐ５３ｍＲＮＡの発現
ＨＣＴ１１６細胞（親細胞、野生型ｐ５３）に、前記各組換えアデノウイルスベクターＡｄ−ＶＹ、Ａｄ−ＶＹｍｕｔ５’およびＡｄ−ＹＦＰを、従来公知の方法にしたがって、それぞれ１２時間感染させた。それから、感染した各細胞を、９０μｍｏｌ／Ｌの５−ＦＵで所定時間（０、６、１２時間）処理した。処理後の細胞について、内在性ｐ５３ｍＲＮＡ、外来性ｖｅｇｆ−ＹＦＰ ｍＲＮＡおよび外来性ＹＦＰ ｍＲＮＡの発現レベルをノーザンブロッティングにより分析した。ＨＣＴ１１６の培養は、１０％ウシ胎児血清および１００μｇ／ｍｌ（１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）ストレプトマイシンを含むＭｃＣｏｙ’ｓ ５Ａ培地を使用し、条件は、温度３７℃、５％ＣＯ２とした（以下、同様）。これらの結果を、図５（ａ）に示す。図５（ａ）は、各細胞における内在性ｐ５３ｍＲＮＡの発現を示すノーザンブロッティングの結果である。同図において、上から１段目は内在性ｐ５３ｍＲＮＡ、２段目はｖｅｇｆ−ＹＦＰキメラｍＲＮＡまたはＹＦＰｍＲＮＡ、３段目はｇａｐｄｈ ｍＲＮＡの発現をそれぞれ示す。同図において、Ｌａｎｅ１〜３「Ａｄ−ｃｏｎｔｒｏｌ」は、コントロールＡｄ−ＹＦＰの導入細胞、Ｌａｎｅ４〜６「Ａｄ−ＶＥＧＦｍｕｔ５’」は、Ａｄ−ＶＹｍｕｔ５’の導入細胞、Ｌａｎｅ７〜９「Ａｄ−ＶＥＧＦ５’」は、Ａｄ−ＶＹの導入細胞の結果である。また、「５−ＦＵ」の数値は、５−ＦＵの存在下で培養した時間（ｈ）を示す。なお、「０ｈ」は、５−ＦＵ未処理を意味する。
内在性ｐ５３タンパク質の生成
前述と同様に、各組換えアデノウイルスベクターで１２時間感染させた細胞を、１２０μｍｏｌ／Ｌの５−ＦＵで所定時間（０、９、１８時間）処理した。処理後の細胞について、内在性ｐ５３タンパク質の発現レベルをウェスタンイムノブロッティングにより分析した。これらの結果を、図５（ｂ）に示す。図５（ｂ）において、上から１段目は内在性ｐ５３タンパク質、２段目はβ−アクチンタンパク質の発現をそれぞれ示す。同図において、Ｌａｎｅ番号は、前記図５（ａ）と同様である。
ｐ５３系路で誘導される各種遺伝子のｍＲＮＡの発現
前述と同様に、各組換えアデノウイルスベクターで感染させた細胞を、１２０μｍｏｌ／Ｌの５−ＦＵで所定時間（０、９、１８時間）処理した。処理後の細胞について、ｎｏｘａ ｍＲＮＡ、ｂａｘ ｍＲＮＡおよびｐ２１ ｍＲＮＡの発現レベルをノーザンブロッティングにより分析した。これらの結果を、図５（ｃ）に示す。図５（ｃ）において、上から１段目はｎｏｘａ ｍＲＮＡ、２段目はｂａｘ ｍＲＮＡ、３段目はｐ２１ ｍＲＮＡ、４段目はｇａｐｄｈ ｍＲＮＡの発現をそれぞれ示す。同図において、Ｌａｎｅ番号は、前記図５（ａ）と同様である。
図５（ａ）のＬａｎｅ７〜９に示すように、ｖｅｇｆ ５’ＵＴＲ（未変異）を過剰発現する細胞（Ａｄ−ＶＹ）は、内在性ｐ５３ｍＲＮＡの発現が著しく低下した。そして、図５（ｂ）のＬａｎｅ７〜９に示すように、５−ＦＵに応じたｐ５３タンパク質の蓄積も、ｖｅｇｆ ５’ＵＴＲによって著しく抑制された。さらに、その結果として、図５（ｃ）のＬａｎｅ７〜９に示すように、ｐ５３のターゲット遺伝子であるｎｏｘａ、ｂａｘおよびｐ２１のｍＲＮＡも、発現誘導が抑制された。これに対して、図５（ａ）に示すように、Ｌａｎｅ４〜６のｖｅｇｆ変異５’ＵＴＲを発現する細胞（Ａｄ−ＶＹｍｕｔ５’）と、Ｌａｎｅ１〜３のコントロール細胞（Ａｄ−ｃｏｎｔｒｏｌ）では、内在性ｐ５３ｍＲＮＡの発現が確認され、また、５−ＦＵの処理時間に応じて、ｐ５３ｍＲＮＡの発現量の増加も確認された。そして、図５（ｂ）に示すように、５−ＦＵに応じたｐ５３タンパク質の蓄積も、５−ＦＵの処理時間に応じて増加した。さらに、その結果として、図５（ｃ）に示すように、ｐ５３のターゲット遺伝子であるｎｏｘａ、ｂａｘおよびｐ２１のｍＲＮＡの発現も、発現の誘導が確認された。
（３）ｐ５３依存性アポトーシス応答
前述と同様に、各組換えアデノウイルスベクターで１２時間感染させた細胞を、所定濃度（０、３０、６０、１２０μｍｏｌ／Ｌ）の５−ＦＵで６０時間処理した。処理後の細胞について、前記実施例Ａ１と同様にして、アポトーシス（％）を確認した（ｍｅａｎｓ±ＳＤ、ｎ＝３）。これらの結果を、図６（ｄ）に示す。図６（ｄ）は、５−ＦＵの濃度変化に対する各種細胞のアポトーシスの割合（％）を示すグラフである。同図において、○が、コントロールＡｄ−ＹＦＰの導入細胞（Ａｄ−ｃｏｎｔｒｏｌ）、□が、Ａｄ−ＶＹｍｕｔ５’の導入細胞（Ａｄ−ＶＹｍｕｔ５’）、■が、Ａｄ−ＶＹの導入細胞（Ａｄ−ＶＥＧＦ５’）のそれぞれの結果を示す。なお、図６（ｅ）においても同様である。
また、前述と同様に、各組換えアデノウイルスベクターで１２時間感染させた細胞を、１２０μｍｏｌ／Ｌの５−ＦＵで所定時間（０、１２、２４、４８、６０時間）処理し、アポトーシス（％）を確認した（ｍｅａｎｓ±ＳＤ、ｎ＝３）。これらの結果を、図６（ｅ）に示す。図６（ｅ）は、５−ＦＵで処理した各種細胞の経時的なアポトーシスの割合（％）の変化を示すグラフである。
図６（ｄ）および（ｅ）に示すように、ｖｅｇｆ ５’ＵＴＲを発現する細胞（Ａｄ−ＶＹ、■）は、５−ＦＵで誘導されるアポトーシスに対して著しい耐性を示した。特に、同図（ｄ）に示すように、５−ＦＵ濃度が３０μｍｏｌ／Ｌまたは６０μｍｏｌ／Ｌの場合、５’ＵＴＲによってアポトーシスは完全に阻害された。同図（ｅ）に示すように、５−ＦＵの処理時間を長くしても、アポトーシスの大幅な増加は確認されなかった。これに対して、ｖｅｇｆ変異５’ＵＴＲを発現する細胞（Ａｄ−ＶＹｍｕｔ５’、□）では、アポトーシスに耐性を示さなかった。そして、図６（ｄ）に示すように、５−ＦＵの濃度に依存して、また、図６（ｅ）に示すように、５−ＦＵの処理時間に依存して、アポトーシスの割合が向上した。この結果は、ｖｅｇｆ ５’ＵＴＲを発現しない細胞（Ａｄ−ｃｏｎｔｒｏｌ、○）と同様の結果であり、図５（ｂ）、（ｃ）で示されたｐ５３系路の活性化の結果と対応している。
［実施例Ａ５］
ｖｅｇｆ ５’ＵＴＲによる、発現した内在性ｐ５３ｍＲＮＡの分解の可能性を確認した。
（１）ｖｅｇｆ ５’ＵＴＲによるｐ５３ｍＲＮＡの分解誘導
前記実施例Ａ４と同様にして、Ｈ１２９９細胞（ｐ５３ヌル）に、前記ｐ５３発現ベクターと、前記各組換えプラスミドベクターｐＶＣ、ｐＶＣｍｕｔ５’または空ベクター（ｍｏｃｋ）とを共導入し、１２時間培養した。各導入細胞からＲＮＡを回収し、変性アガロースゲル電気泳動によりＲＮＡを分離し、外来性ｐ５３ｍＲＮＡおよびｐ５３ｍＲＮＡ分解物をノーザンブロッティングにより検出した。これらの結果を、図７（ａ）に示す。図７（ａ）は、各細胞における外来性ｐ５３ｍＲＮＡおよびその分解物を示す写真である。同図において、Ｌａｎｅ１「ｍｏｃｋ」は空ベクターの導入細胞、Ｌａｎｅ２「ＶＥＧＦｍｕｔ５’」はｐＶＣｍｕｔ５’の導入、Ｌａｎｅ３「ＶＥＧＦ５’」はｐＶＣの導入細胞のそれぞれの結果である。ブロッティングの写真の左側に、ＲＮＡマーカー（Ａｍｂｉｏｎ社製）のサイズ（ｎｔ）を示す。
同図（ａ）のＬａｎｅ３に示すように、ｖｅｇｆ ５’ＵＴＲの発現により、発現したｐ５３ｍＲＮＡが分解されていることが確認された。これに対して、ｖｅｇｆ ５’ＵＴＲが未発現である場合（Ｌａｎｅ１）や変異ｖｅｇｆ ５’ＵＴＲの発現の場合（Ｌａｎｅ２）には、ｐ５３ｍＲＮＡは発現するが、その分解物は確認されなかった。この結果は、ｖｅｇｆ ５’ＵＴＲ ＲＮＡが、ｐ５３ｍＲＮＡの発現を転写後レベルで抑制していることを示している。
（２）５’ＵＴＲで媒介されるｐ５３ｍＲＮＡの分解における翻訳阻害剤シクロヘキシミドの影響
まず、Ｈ１２９９（ｐ５３ヌル）に、前記ｐ５３発現ベクターと、前記各組換えプラスミドベクターｐＶＣ、ｐＶＣｍｕｔ５’とを共導入し、８時間培養した。そして、各導入細胞を、終濃度５０μｇ／ｍｌのシクロヘキシミド存在下または非存在下で、１６時間処理した。処理後の細胞について、ｐ５３ｍＲＮＡの発現レベルをノーザンブロッティングにより確認した。これらの結果を、図７（ｂ）に示す。図７（ｂ）は、各細胞におけるｐ５３ｍＲＮＡの発現を示すノーザンブロッティングの結果である。同図において、上から１段目はｐ５３ｍＲＮＡ、２段目はｇａｐｄｈ ｍＲＮＡの発現をそれぞれ示す。同図において、Ｌａｎｅ１および３「ＶＥＧＦ５’」はｖｅｇｆ ５’ＵＴＲを発現するｐＶＣ導入細胞、Ｌａｎｅ２および４「ＶＥＧＦ ｍｕｔ５’」は変性５’ＵＴＲを発現するｐＶＣｍｕｔ５’導入細胞である。また、「−」および「＋」は、シクロヘキシミド（ＣＨＸ）の存在の有無を示す。
同図（ｂ）に示すように、シクロヘキシミド処理（Ｌａｎｅ３、４）によって、シクロヘキシミド未添加（Ｌａｎｅ１、２）と比較して、ｖｅｇｆ ５’ＵＴＲによるｐ５３ｍＲＮＡのサイレンシングの著しい阻害が確認された。これらの結果から、ｖｅｇｆ ５’ＵＴＲが媒介するｐ５３ｍＲＮＡのサイレンシングに、翻訳プロセスが関与していることが示唆された。
（３）ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるｖｅｇｆ ５’ＵＴＲ ＲＮＡとｐ５３ｍＲＮＡとの直接相互作用
ＲＮＡが媒介する遺伝子サイレンシングのメカニズムとして、塩基対形成による、ターゲットＲＮＡと制御ＲＮＡとの直接的な相互作用が知られている。そこで、ｖｅｇｆ ５’ＵＴＲとｐ５３ｍＲＮＡとの直接相互作用を分析した。
前記実施例Ａ２におけるプラスミドベクターＤ（ｐＶＣ）、実施例Ａ３におけるＨ（ｐＶＣｍｕｔ５’）およびｐｃ５３発現ベクター（ｐｃＤＮＡ３．１−ｐ５３）を、ＢｓａＢＩおよびＸｂａＩで処理することによって、線状化した。これらの線状化ＤＮＡを鋳型にして、ｍＭＥＳＳＡＧＥｍＭＡＣＨＩＮＥ ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ社製）を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏ転写法により５’末端がキャッピングされたＲＮＡをそれぞれ合成した。合成ＲＮＡは、２６０ｎｍの吸光度およびアガロースゲルでのエチジウムブロマイド染色により定量した。各ＲＮＡをＲＮａｓｅフリーの水に溶解し、これらの溶液を９０℃で３分間加熱した後、２５℃まで徐々に冷却した。各ＲＮＡを、図７（ｃ）に示す組み合わせとなるように、等量（１ｐｍｏｌ）ずつ、Ｍｇ２＋含有バッファーに混合し、３７℃で６０分インキュベートした。前記バッファーは、ＲＮＡが内部分子会合を生じる高塩濃度であり、１０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＫＣｌ、５ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ２および４０Ｕ／ｍｌ ＲＮａｓｉｎ（登録商標、Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を含む水溶液とした。これらのインキュベート後のサンプルを、１．８％未変性アガロースゲルに供し、エチジウムブロマイドで染色した。
これらの結果を、図７（ｃ）に示す。同図は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける、ｖｅｇｆ ５’ＵＴＲ ＲＮＡとｐ５３ｍＲＮＡとの会合を示す写真である。同図において、「ＶＥＧＦ ｍｕｔ５’ＵＴＲ ＲＮＡ」は、変異５’ＵＴＲ ＲＮＡであり、「ＶＥＧＦ ５’ＵＴＲ ＲＮＡ」は、５’ＵＴＲ ＲＮＡ（野生型）であり、「ｐ５３ ＲＮＡ」は、ｐ５３ｍＲＮＡである。そして、各Ｌａｎｅの上側における「＋、−」は、前記Ｍｇ２＋含有バッファー内でインキュベートしたＲＮＡの組み合わせを意味する。また、同図において、矢印は、５’ＵＴＲ ＲＮＡとｐ５３ｍＲＮＡとのヘテロ二本鎖を示す。
同図のＬａｎｅ３に示すように、ｐ５３ｍＲＮＡの減衰に関与するｖｅｇｆ ５’ＵＴＲ ＲＮＡは、ｐ５３ｍＲＮＡとヘテロ二本鎖を形成することが確認された。一方、Ｌａｎｅ４に示すように、ｐ５３ｍＲＮＡの減衰に関与しない変異ｖｅｇｆ５’ＵＴＲ ＲＮＡは、ｍＲＮＡとヘテロ二本鎖を形成しなかった。
（４）ｖｅｇｆ ５’ＵＴＲ ＲＮＡが媒介するｐ５３ｍＲＮＡの減衰に対する翻訳プロセスの関連性
ｖｅｇｆ ５’ＵＴＲとｐ５３ｍＲＮＡとのヘテロ二本鎖の形成後、無細胞タンパク質合成反応（無細胞翻訳反応）を行い、翻訳プロセスがｐ５３ｍＲＮＡ分解に与える影響を確認した。
（５）ｐ５３ｍＲＮＡおよびその分解物の検出
前記（３）と同様にして、変異５’ＵＴＲ ＲＮＡまたは５’ＵＴＲとｐ５３ｍＲＮＡとをインキュベートした。なお、前述のように、変異５’ＵＴＲ ＲＮＡとｐ５３ｍＲＮＡとは、インキュベートによりヘテロ二本鎖を形成する。そして、この処理後のＲＮＡサンプルを用いて、シクロヘキシミドの非存在下もしくは存在下（終濃度５０μｌ／ｍｌ）、または、スクロース密度勾配遠心分離法によって調製された精製リボソームの存在下で、無細胞タンパク質合成反応を行った。無細胞タンパク質合成は、論文（Huez, I. et al. Mol. Cell. Biol. 18, 6178-6190 (1998)）を参照し、あるいは、Ｗａｋｏ ＰＵＲＥ ｓｙｓｔｅｍ（商品名、Ｗａｋｏ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社製）を用いて、その使用説明書にしたがって行った。
前記反応液について、ｐ５３ｍＲＮＡおよびその分解物をノーザンブロッティングにより分析した。この結果を図８（ｄ）に示す。同図は、ｖｅｇｆ ５’ＵＴＲ ＲＮＡ共存下での無細胞タンパク質合成反応液におけるｐ５３ｍＲＮＡおよびその分解物を示すノーザンブロッティングの結果である。同図において、Ｌａｎｅ２、５、８「ＶＥＧＦ ｍｕｔ５’」は、変異５’ＵＴＲ ＲＮＡとｐ５３ｍＲＮＡとをインキュベートしたサンプルの結果であり、Ｌａｎｅ３、６、９「ＶＥＧＦ ５’」は、５’ＵＴＲ ＲＮＡ（野生型）とｐ５３とをインキュベートしたサンプルの結果であり、Ｌａｎｅ１、４、７「−」は、ｐ５３ｍＲＮＡのみをインキュベートしたサンプルの結果である。また、Ｌａｎｅ４〜６「＋ｃｙｃｌｏｈｅｘｉｍｉｄｅ」は、シクロヘキシミド存在下、Ｌａｎｅ７〜８「＋ｒｉｂｏｓｏｍｅ」は、精製リボソーム存在下で、それぞれ無細胞タンパク質合成を行ったことを示す。
この結果、同図に示すように、ｐ５３ｍＲＮＡと５’ＵＴＲ ＲＮＡとがヘテロ二本鎖を形成した系（Ｌａｎｅ３）は、シクロヘキシミド非存在下、ｐ５３ｍＲＮＡの部分的な分解が確認された。そして、この系は、翻訳阻害剤であるシクロヘキシミドの添加により、完全にｐ５３ｍＲＮＡの部分的な分解がブロックされた。さらに、このヘテロ二本鎖を形成した系に、精製リボソームを添加しただけでも、ｐ５３ｍＲＮＡの部分的な分解が確認された。これらの結果は、ヘテロ二本鎖ＲＮＡとリボソームとの間の相互作用が、ｖｅｇｆ ５’ＵＴＲが介在するｐ５３ｍＲＮＡの分解を開始することを示唆している。このことから、ｐ５３ｍＲＮＡの部分的な分解は、細胞内のさらなる減衰の引き金になると推測される。これに対して、５’ＵＴＲ ＲＮＡ非存在の系（Ｌａｎｅ１、４、７）および変異５’ＵＴＲとｐ５３とが共存する系（Ｌａｎｅ２、５、８）では、シクロヘキシミド非存在下、ｐ５３ｍＲＮＡの分解は生じなかった。
（６）ｐ５３タンパク質の検出
続いて、５’ＵＴＲが介在するｐ５３ｍＲＮＡの部分的な分解が、ｐ５３タンパク質の翻訳に与える影響を確認した。
前記（４）と同様にして、各ＲＮＡを図８（ｅ）に示す組み合わせでインキュベートし、無細胞タンパク質合成を行った。なお、無細胞タンパク質合成の反応液には、［３５Ｓ］メチオニンを共存させた。そして、ｉｎ ｖｉｔｒｏで合成されたｐ５３タンパク質を、１２％ポリアクリルアミドゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、乾燥させたゲルをオートラジオグラフィーに供した。この結果を図８（ｅ）に示す。同図は、ｖｅｇｆ ５’ＵＴＲ共存下での、無細胞タンパク質反応液におけるｐ５３タンパク質の合成の示すオートラジオグラフィーである。同図において、「ＶＥＧＦ ｍｕｔ５’ＲＮＡ」は、変異５’ＵＴＲ、「ＶＥＧＦ ５’ＲＮＡ」は、５’ＵＴＲ（野生型）、「ｐ５３ＲＮＡ」は、ｐ５３ｍＲＮＡを示す。
同図に示すように、ｐ５３ｍＲＮＡとｖｅｇｆ５’ＵＴＲ ＲＮＡとがヘテロ二本鎖を形成した系においては（Ｌａｎｅ３）、ｖｅｇｆ５’ＵＴＲ非存在の系（Ｌａｎｅ１）および変異ｖｅｇｆ５’ＵＴＲの系（Ｌａｎｅ２）と比較して、ｐ５３タンパク質合成が著しく抑制された。
［実施例Ａ６］
実施例Ａ３において、ｖｅｇｆ ５’ＵＴＲの６５９番目−９１７番目の２５９ヌクレオチド（ｎｔ）の分子が、ｐ５３のダウンレギュレーションに必要であることがわかった。そこで、ｐ５３のダウンレギュレーションに関与する、ｖｅｇｆ ５’ＵＴＲにおける要素配列のさらなる絞込みを行った。
（１）プラスミドコンストラクト
ヒトＶＥＧＦ１６５のコード遺伝子（ｖｅｇｆ遺伝子）のエキソン１、ならびに、下記の各種プラスミドコンストラクトを、前記実施例Ａ２と同様に、前述した各文献に基づいて準備した。下記コンストラクトにより発現させるｖｅｇｆ ｍＲＮＡの領域を、図９に示す。
コンストラクトｖｅｇｆ ｍＲＮＡ（ｐ１６５ｍＳＰＨＡ３’）（全長ｖｅｇｆ ｍＲＮＡ）
プラスミドベクターｐＳＣＴのＸｂａＩ−ＸｈｏＩ部位に、イントロンを除く完全長ｖｅｇｆ ｍＲＮＡをコードするＤＮＡを挿入した（Bornes, S. et al. J. Biol. Chem. 279, 18717-18726 (2004)）。得られたプラスミドコンストラクトをコンストラクトｖｅｇｆ ｍＲＮＡ（ｐ１６５ｍＳＰＨＡ３’）とした。なお、このプラスミドコンストラクトを導入した細胞においては、ｖｅｇｆ１６５遺伝子の完全長ｍＲＮＡが発現される。
コンストラクトＢＣ０１９８６７ＲＮＡ（１６−７８０）
ＩＭＡＧＥ Ｃｌｏｎｅ（Ｃｌｏｎｅ ＩＤ ４１５３０５３、Ｏｐｅｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を購入した。これは、ｖｅｇｆ遺伝子のエキソン１の５’ＵＴＲにおける所定領域（１６−７８０番目の領域）をコードするＤＮＡ断片が、プラスミドベクターｐＣＭＶ−ＳＰＯＲＴ６のＮｏｔＩ−ＳａｌＩ部位に挿入されている。このプラスミドコンストラクトを、ＮＣＢＩアクセッションＮｏ．ＢＣ０１９８６７に従い、コンストラクトＢＣ０１９８６７ＲＮＡとした。なお、このプラスミドコンストラクトを導入した細胞においては、ｖｅｇｆ ｍＲＮＡ ５’ＵＴＲの１６−７８０番目の領域が発現される。
コンストラクトＢＣ０１１１７７ＲＮＡ（５２６−１２１６）
ＩＭＡＧＥ Ｃｌｏｎｅ（Ｃｌｏｎｅ ＩＤ ４１５０４５１、Ｏｐｅｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を購入した。これは、ｖｅｇｆ遺伝子のエキソン１の５２６−１１０４番目の領域とイントロン１の１番目−１１２番目の領域とをコードするＤＮＡ断片が、プラスミドベクターｐＣＭＶ−ＳＰＯＲＴ６のＮｏｔＩ−ＳａｌＩ部位に挿入されている。このプラスミドコンストラクトを、ＮＣＢＩアクセッションＮｏ．ＢＣ０１９８６７に従い、コンストラクトＢＣ０１１１７７ＲＮＡとした。なお、このプラスミドベクターを導入した細胞においては、配列番号４５で示されるｖｅｇｆ 前駆体ｍＲＮＡの５２６番目−１２１６番目の領域が発現される。
コンストラクトｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡ（６００−８７９）
実施例Ａ３で特定したｖｅｇｆ ｍＲＮＡ ５’ＵＴＲの６５９番目−９１７番目の領域に対して、アンチセンスオリゴＤＮＡプローブを用いたノーザンブロッティングによる解析を行った。この結果を、図１０に示す。図１０は、ヒトの種々のがん細胞株における、ｖｅｇｆのＲＮＡ断片を示すノーザンブロッティングの結果である。同図に示すように、種々のがん細胞株において、鎖長約２００〜３００塩基からなる小分子ＲＮＡが存在すること、この小分子ＲＮＡはヒト正常繊維芽細胞にはほとんど発現していないことを見出した。そこで、変性アガロースゲル電気泳動法により、この小分子ＲＮＡを含む画分を分離し、常法（参考文献 Kawano, M. et al. Nucleic Acid Res. 33(3):1040-1050 (2005)）により、前記小分子ＲＮＡをクローニングした。得られたＲＮＡの塩基配列を決定したところ、ｖｅｇｆ ｍＲＮＡの５’ＵＴＲにおける６００番目−８７９番目の領域から成るＲＮＡ産物であった。この小分子ＲＮＡを独自に、ＩＲＥＳ−ｒｅｌａｔｅｄ ｓｍａｌｌ ＲＮＡ（Ｉｒｅｓ ＲＮＡ）と命名した。そして、前記クローニングにより得られたｃＤＮＡを、プラスミドベクターｐｃＤＮＡ３．１のＸｈｏＩ−ＨｉｎｄIII部位に再クローニングした。得られたプラスミドコンストラクトをコンストラクトｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡとした。なお、このプラスミドコンストラクトを導入した細胞においては、ｖｅｇｆ ｍＲＮＡの５’ＵＴＲにおける６００番目−８７９番目の領域が発現される。
コンストラクトｖｅｇｆ ｍＲＮＡ 変異１
図９に示すように、ｖｅｇｆ ｍＲＮＡの５’ＵＴＲにおける５９４−７４５番目の領域内に変異を有するｍＲＮＡを発現する、コンストラクトを作成した。具体的には、前記コンストラクトｖｅｇｆ ｍＲＮＡ（ｐ１６５ｍＳＰＨＡ３’）のＳａｃII−ＮｈｅＩ部位に、二本鎖の下記フラグメント１およびフラグメント２を、５’側からこの順序で連結させた。なお、下記センス鎖において、小文字が変異させた塩基である。このようにして得られたプラスミドコンストラクトをコンストラクトｖｅｇｆ ｍＲＮＡ変異１という。このプラスミドを導入した細胞においては、ｖｅｇｆ ５’ＵＴＲにおける５９４−７４１番目の領域が変異している。
フラグメント１（ｖｅｇｆ ５’ＵＴＲの５８９−６３９番目）
センス鎖（配列番号３７）
5’− GGG CAa GGa CCa GAa CCa GCa CCa GGg GGa GGa GTa GAa GGa GTa GGG GCT−3’
アンチセンス鎖（配列番号３８）
5’−CCTACTCCTTCTACTCCTCCCCCTGGTGCTGGTTCTGGTCCTTGCCCGC−3’
フラグメント２（ｖｅｇｆ ５’ＵＴＲの６４０−７４５番目）
センス鎖（配列番号３９）
5’−CGa GGa GTa GCa tta AAg CTa TTt GTa CAg tta tta GGa TGc TCa CGa TTt GGg GGg GCa GTa GTa aga GCa GGa Gag GCa GAa CCa AGt GGg GCa GCa AGg AGT G−3’
アンチセンス鎖（配列番号４０）
5’−CTAGCACTCCTTGCTGCCCCACTTGGTTCTGCCTCTCCTGCTCTTACTACTGCCCCCCCAAATCGTGAGCATCCTAATAACTGTACAAATAGCTTTAATGCTACTCCTCGAGCC−3’
コンストラクトｖｅｇｆ ｍＲＮＡ 変異２
図９に示すように、ｖｅｇｆ ｍＲＮＡの５’ＵＴＲにおける７４６−９１５番目の領域内に変異を有するｍＲＮＡを発現する、コンストラクトを作成した。具体的には、前記コンストラクトｖｅｇｆ ｍＲＮＡ（ｐ１６５ｍＳＰＨＡ３’）のＮｈｅＩ−ＸｍａＩ部位に、二本鎖の下記フラグメント３およびフラグメント４を、５’側からこの順序で連結させた。なお、下記センス鎖において、小文字が変異させた塩基である。このようにして得られたプラスミドコンストラクトをコンストラクトｖｅｇｆ ｍＲＮＡ変異２という。このプラスミドを導入した細胞においては、ｖｅｇｆ ５’ＵＴＲにおける７５３−９１５番目の領域が変異している。
フラグメント３（ｖｅｇｆ ５’ＵＴＲの７４６−８５０番目）
センス鎖（配列番号４１）
5’−CT AGC TCa GGa aga GAa GAa CCa CAa CCa GAa GAa GGa GAa GAa GAgGAg GAa AAa Gag GAa GAa cgt GGa CCa CAa TGG agg tta GGa GCa aga AAa CCG GGC T−3’
アンチセンス鎖（配列番号４２）
5’−CGGTTTTCTTGCTCCTAACCTCCATTGTGGTCCACGTTCTTCCTCTTTTTCCTCCTCTTCTTCTCCTTCTTCTGGTTGTGGTTCTTCTCTTCCTGAG−3’
フラグメント４（ｖｅｇｆ ５’ＵＴＲの８５１−９１７番目）
センス鎖（配列番号４３）
5’−CA TGG ACa GGa GAa GCa GCa GTa TGt GCc Gat AGc GCa CCt GCa GCaaga GCa CCa CAa GCa tta GC−3’
アンチセンス鎖（配列番号４４）
5’−CCGGGCTAATGCTTGTGGTGCTCTTGCTGCAGGTGCGCTATCGGCACATACTGCTGCTTCTCCTGTCCATGAGCC−3’
（２）ｐ５３ｍＲＮＡの発現
Ｈ１２９９細胞（ｐ５３ヌル）に、前記ｐ５３発現ベクターおよび前記各種プラスミドコンストラクトを共導入した。そして、前記実施例Ａ２と同様にして、各導入細胞を培養し、ｐ５３ｍＲＮＡの発現レベルを分析した。これらの結果を、図１１（ａ）および（ｂ）に示す。図１１（ａ）および（ｂ）において、上から１段目はｐ５３ｍＲＮＡ、２段目はｇａｐｄｈ ｍＲＮＡのそれぞれの発現を示すノーザンブロッティングの結果である。両図において、「−」はｐ５３発現ベクターのみを導入した細胞であり、ｐ５３ｍＲＮＡ発現のコントロールである（Ｌａｎｅ１）。
同図（ａ）に示すように、６００番目−８７９番目のｍＲＮＡ（Ｌａｎｅ５）を発現する細胞では、全長ｖｅｇｆ ｍＲＮＡ（Ｌａｎｅ２）を発現する細胞と同様に、ｐ５３ｍＲＮＡの発現が確認されなかった。したがって、前記実施例Ａ２で決定された結果（６５９番目−９１７番目）とあわせて、ｐ５３発現のサイレンシングに関与する配列を、ｖｅｇｆｍＲＮＡの６５９番目−８７９番目に絞りこむことができた。
また、同図（ａ）に示すように、１６番目−７８０番目のｍＲＮＡ（Ｌａｎｅ３）および配列番号４５の５２６番目−１２１６番目のｍＲＮＡ（Ｌａｎｅ４）をそれぞれ発現する細胞では、全長ｖｅｇｆ ｍＲＮＡ（Ｌａｎｅ２）を発現する細胞と同様に、ｐ５３ｍＲＮＡの発現が確認されなかった。これらの各ｍＲＮＡは、６００番目−７８０番目の領域を共通して含んでいる。したがって、前記実施例Ａ２で決定された結果（６５９番目−９１７番目）とあわせて、ｐ５３発現のサイレンシングに関与する配列を、ｖｅｇｆ ｍＲＮＡの６５９番目−７８０番目に絞りこむことができた。
さらに、同図（ｂ）に示すように、７５３−９１５番目が変異したｖｅｇf ｍＲＮＡ変異２（Ｌａｎｅ３）は、全長ｖｅｇｆ ｍＲＮＡ（Ｌａｎｅ４）を発現する細胞と同様に、ｐ５３ｍＲＮＡの発現が確認されなかった。しかしながら、５９４−７４１番目が変異したｖｅｇｆ ｍＲＮＡ変異１（Ｌａｎｅ２）は、ｐ５３ｍＲＮＡのコントロール（Ｌａｎｅ１）と同様の位置に、ｐ５３ｍＲＮＡの発現が確認された。このことから、前記実施例Ａ２の結果、ならびに、前記図１１（ａ）の結果とあわせて、６５９番目〜７４１番目の領域が、ｐ５３発現のサイレンシングに関与することがわかった。
したがって、例えば、ｖｅｇｆ ｍＲＮＡにおける６５９番目−８７９番目、６５９番目−７８０番目、６５９−７４１番目等の配列を含む等のＲＮＡ配列を分解したり、前記ＲＮＡ配列への転写を阻害することによって、ｐ５３ｍＲＮＡの発現抑制を回避できるといえる。これによって、例えば、がん細胞の成育や生存を抑制し、がん化の予防、がんの治療等が可能になる。
［実施例Ａ７］
マウスにｖｅｇｆ ５’ＵＴＲの発現細胞を移植し、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるがん細胞の成育の影響を確認した。
前記実施例Ａ４で作製したプラスミドコンストラクトｐＶＹと、新たに作製したプラスミドコンストラクトｐＶＹ変異を使用した。ｐＶＹ変異は、実施例Ａ６で作成したコンストラクトｖｅｇｆ ｍＲＮＡ変異１のＳａｃＩＩ−ＮｈｅＩ部位を切り出し、ｐＶＹのＳａｃＩＩ−ＮｈｅＩ部位と入れ替えることで作製した。これらのプラスミドコンストラクトを、それぞれ、ＨＣＴ１１６細胞（親細胞、野生型ｐ５３）に導入し、抗生剤Ｇ４１８に対する耐性を獲得したクローンをそれぞれ２株ずつ樹立した。得られた各細胞株を、「ｐＶＹ細胞株（Ｇ３株およびＧ５株）、「ｐＶＹ変異細胞株（Ｄ５株およびＥ４株）」とした。これらの各細胞株５×１０６個を、それぞれ、ヌードマウスの大腿部の皮下に、２７ゲージの注射針を用いて移植した。移植後、５、７、９、１２、１４、１６、１９、２１、２６、２８日目に形成された腫瘍について、長さと幅を測定し、腫瘍の体積を下記数式により算定した。コントロールとして、ｐｄ２ＥＹＦＰ（ＹＦＰのみを発現するコンストラクト）を導入した細胞を、同様にしてマウスに移植し、測定を行った。
体積＝（長さ×幅２）×０．５
これらの結果を、図１２および図１３に示す。同図１２（ａ）はｐＶＹ細胞株を、（ｂ）はｐＶＹ変異細胞株を、それぞれ移植したマウスの写真である（移植後２８日）。同図（ａ）は、野生型ｖｅｇｆ５’ＵＴＲを発現する導入細胞を移植したマウスであり、左が、ｐＶＹ細胞株Ｇ３の結果、右が、ｐＶＹ細胞株Ｇ５の結果である。同図（ｂ）は、変異ｖｅｇｆ５’ＵＴＲを発現する導入細胞を移植したマウスであり、左が、ｐＶＹ変異細胞株Ｄ４、右が、ｐＶＹ変異細胞株Ｅ４の結果である。そして、図１３は、これらの４種類の細胞株を移植したマウスにおける腫瘍体積の経時的変化を示すグラフである。図１２（ａ）に示すように、野生型ｖｅｇｆ５’ＵＴＲを発現するｐＶＹ細胞株を移植したマウスは、移植患部の腫瘍が明らかに大きくなった。これに対して、変異ｖｅｇｆ５’ＵＴＲを発現するｐＶＹ変異細胞株を移植したマウスは、図１２（ｂ）に示すように、腫瘍の成長はほとんどみられなかった。この腫瘍体積の変化は、図１３のグラフからも明らかなように、野生型５’ＵＴＲを発現するｐＶＹ細胞株を移植したマウス（●および■）において経時的な増大が確認され、他方、変異５’ＵＴＲを発現するｐＶＹ変異細胞株を移植したマウス（○および□）は、コントロールマウス（△）とほとんど変わらない結果を示した。これらの結果から、ｖｅｇｆ ５’ＵＴＲ ＲＮＡはｉｎ ｖｉｖｏでの腫瘍形成を著しく亢進させることが明らかとなった。
［実施例Ａ８］
ｖｅｇｆ ５’ＵＴＲ関連ＲＮＡが細胞に与える抗がん剤耐性能について確認した。
前記実施例Ａ６と同様に、コンストラクトｖｅｇｆ ｍＲＮＡ、コンストラクトＢＣ０１９８６７ ＲＮＡ（１６−７８０）、コンストラクトＢＣ０１１１７７ ＲＮＡ（５２６−１２１６）、コンストラクトｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡ（６００−８７９）を、それぞれ、ＨＣＴ１１６（親細胞、野生型ｐ５３）に導入した。そして、導入した細胞を、以下に示す終濃度の各種抗がん剤で６０時間処理を行い、処理後の細胞について、前記実施例Ａ１と同様にして、アポトーシス率（％）を定量した。抗がん剤としては、ｃａｍｐｔｏｔｅｃｉｎ（４０ｎｍｏｌ／Ｌ）、ｃｉｓｐｌａｔｉｎ(２μg／ｍｌ)、ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ(１６０ｎＭ)、ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ(６０μｍｏｌ／Ｌ)、５−ＦＵ(８０μｍｏｌ／Ｌ)、および、ｌｅｕｃｏｖｏｒｉｎ(５μｍｏｌ／Ｌ)と５−ＦＵ(１０μｍｏｌ／Ｌ)との組合せを使用した。また、コントロール細胞としては、空ベクターであるｐｃＤＮＡ３．１を導入した細胞を使用した。
これらの結果を、図１４に示す。図１４は、各種ｖｅｇｆ５’ＵＴＲ関連ＲＮＡを発現する細胞を各種抗がん剤で処理した際のアポトーシスの割合を示す。同図において、各バーは、左から、コントロール、コンストラクトｖｅｇｆ ｍＲＮＡ、コンストラクトＢＣ０１９８６７ ＲＮＡ、コンストラクトＢＣ０１１１７７ ＲＮＡ、コンストラクトｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡ（６００−８７９）の導入結果である。通常、抗がん剤によってアポトーシスが誘導されることから、この結果より、各細胞において発現したｖｅｇｆ５’ＵＴＲ関連ＲＮＡによって、抗がん剤の効果が抑制されているか否か、すなわち、細胞に抗がん剤耐性を与えているか否かがわかる。同図に示すように、全ての細胞について、コントロール細胞よりも低いアポトーシス（％）が確認された。すなわち、各細胞において発現されたｖｅｇｆ５’ＵＴＲ関連ＲＮＡによって、細胞が抗がん剤耐性を示していることがわかった。したがって、がん細胞におけるｖｅｇｆ５’ＵＴＲ関連ＲＮＡの発現を抑制、または、発現したｖｅｇｆ５’ＵＴＲ関連ＲＮＡを分解することによって、細胞の抗がん剤感受性を亢進できることが示唆される。
［実施例Ａ９］
実施例Ａ８において、ｖｅｇｆ ５’ＵＴＲ ＲＮＡが細胞に抗がん剤耐性を与えていることが確認された。そこで、ｖｅｇｆ ５’ＵＴＲを標的とするｓｉＲＮＡにより、発現したｖｅｇｆ５’ＵＴＲ ＲＮＡを分解し、細胞における抗がん剤感受性の亢進を確認した。
前述のｖｅｇｆ ｓｉＲＮＡ＃１、＃２を発現する組換えベクターおよびコントロールｓｉＲＮＡ発現するベクターを、それぞれＨＣＴ１１６（親細胞、野生型ｐ５３）に導入した。また、コントロール細胞として、ｓｉＲＮＡを発現する組み換えベクターを未導入のＨＣＴ１１６細胞を使用した。これらの４種類の細胞を、以下に示す終濃度の各種抗がん剤存在下、または、非存在下で、６０時間処理を行った。前記抗がん剤としては、ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ（２０μｍｏｌ／Ｌ）、ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ（１７０ｎｍｏｌ／Ｌ）、５−ＦＵ（４０μｍｏｌ／Ｌ）を使用した。そして、処理後の細胞について、実施例Ａ１と同様にして、アポトーシス（％）を確認した。
また、ｖｅｇｆ ｓｉＲＮＡ＃１またはｓｉＲＮＡ＃２の発現によりｖｅｇｆ ｍＲＮＡをノックダウンすると、ＶＥＧＦタンパク質も合成されなくなる。ＶＥＧＦタンパク質は、がん細胞に対し生存因子として働き、抗がん剤耐性を導くことが知られている。つまり、ｖｅｇｆ ｓｉＲＮＡは、ｖｅｇｆ ５’ＵＴＲ ＲＮＡの機能とＶＥＧＦタンパク質機能の両方をブロックすることになる。ｖｅｇｆ ５’ＵＴＲ ＲＮＡの機能をブロックした効果をより明確にする目的で、ｖｅｇｆ ｓｉＲＮＡを導入した細胞に、リコンビナントＶＥＧＦタンパク質（Ｒ＆Ｄ社製、以下「ｒＶＥＧＦ」という）を培養上清中に添加し、ｓｉＲＮＡにより低下したＶＥＧＦタンパク質を補充した。なお、ＨＣＴ１１６細胞が恒常的に分泌しているＶＥＧＦタンパク質のレベルは、実験の結果、０．７〜１ｎｇ／ｍｌであった。このため、本実施例では、前記４種類の細胞に、１ｎｇ／ｍｌのｒＶＥＧＦタンパク質を添加した。これにより、真にｓｉＲＮＡでｖｅｇｆ ５’ＵＴＲ ＲＮＡがノックダウンされることによる、抗がん剤感受性の亢進を確認した。そして、これらの導入細胞について、同条件で、抗がん剤による処理を行った。
これらの結果を図１５に示す。同図は、各種抗がん剤を使用した場合における、各細胞のアポトーシス（％）を示すグラフである。アポトーシスの割合が高い程、抗がん剤感受性が亢進されたと判断できる。同図において、（ａ）は、抗がん剤ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ感受性を示すアポトーシスの結果、（ｂ）は、抗がん剤ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ感受性を示すアポトーシスの結果、（ｃ）は、抗がん剤５−ＦＵ感受性を示すアポトーシスの結果である。各図において、「ＮＴ」は、ｓｉＲＮＡを発現する組換えベクターを未導入のコントロール細胞、「ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｉＲＮＡ」は、コントロールｓｉＲＮＡの発現細胞、「ＶＥＧＦ ｓｉＲＮＡ＃１」は、ｓｉＲＮＡ＃１の発現細胞、「ＶＥＧＦ ｓｉＲＮＡ＃２」は、ｓｉＲＮＡ＃２の発現細胞を示す。そして、各図において、白抜きのバー（□）は、抗がん剤未処理、黒いバー（■）は、抗がん剤処理、斜線のバーは、ｒＶＥＧＦの処理を行い、且つ、抗がん剤処理を行ったことを示す。
図１５（ａ）、（ｂ）および（ｃ）のいずれにおいても、ｓｉＲＮＡ未発現の細胞（ＮＴ）およびコントロールｓｉＲＮＡの発現細胞（ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｉＲＮＡ）では、低濃度のｅｔｏｐｏｓｉｄｅ（２０μｍｏｌ／Ｌ）、ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ（１７０ｎｍｏｌ／Ｌ）、５−ＦＵ（４０μｍｏｌ／Ｌ）を添加しても、有意なアポトーシスの亢進は誘導されなかった。これらの結果から、ｖｅｇｆ ５’ＵＴＲ ＲＮＡをノックダウンしていないがん細胞では、抗がん剤耐性をもつことがわかる。これに対して、ｓｉＲＮＡ＃１またはｓｉＲＮＡ＃２の発現細胞は、未処理（□）と比較して、低濃度の抗がん剤処理によって著しくアポトーシスが亢進された。また、このアポトーシスの亢進は、ｒＶＥＧＦタンパク質で処理しても（斜線）、ほとんど影響を受けなかった。つまり、これらの抗がん剤に対する感受性の亢進は、ｓｉＲＮＡによって内在性のＶＥＧＦタンパク質が減ったためではなく、主に、ｖｅｇｆ ５’ＵＴＲ ＲＮＡ（ｖｅｇｆ ｍＲＮＡを含む）がｓｉＲＮＡによってノックダウンされたために生じたと考えられる。これらの結果から、従来、癌治療の標的として重要視されてきたＶＥＧＦタンパク質に加え、ｖｅｇｆ ５’ＵＴＲ関連ＲＮＡを治療標的にすることの重要性が示された。
［実施例Ａ１０］
各種ｓｉＲＮＡによる細胞の抗がん剤感受性の亢進を確認した。
前述のｖｅｇｆ ｓｉＲＮＡ＃１ベクター〜ｖｅｇｆ ｓｉＲＮＡ＃５ベクターおよびコントロールｓｉＲＮＡベクターを、ＨＣＴ１１６（親細胞、野生型ｐ５３）に導入した。そして、導入した細胞を、以下に示す終濃度の各種抗がん剤で６０時間処理を行った。抗がん剤としては、ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ（１７０ｎｍｏｌ／Ｌ）、ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ（２０μｍｏｌ／Ｌ）、５−ＦＵ（４０μｍｏｌ／Ｌ）、および、ｌｅｕｃｏｖｏｒｉｎ（５μｍｏｌ／Ｌ）と５−ＦＵ（１０μｍｏｌ／Ｌ）との組合せ、ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ Ｃ（１μｇ／ｍＬ）、ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ（５ｎｍｏｌ／Ｌ）、ｖｉｎｃｒｉｔｉｎｅ（１２．５ｎｍｏｌ／Ｌ）、ｃｉｓｐｌａｔｉｎ（１μｇ／ｍｌ）を使用した。そして、処理後の細胞について、生存率の相対値（％）を算出した。前記相対値は、コントロールｓｉＲＮＡを発現する組換えベクターを導入した細胞の生存細胞数を１００％として求めた。
これらの結果を図１６に示す。同図は、各種組換えベクターを導入した細胞を抗がん剤で処理した際の相対的生存率（％）を示すグラフである。同図において、各バーは、左から、コントロールｓｉＲＮＡベクター、ｖｅｇｆ ｓｉＲＮＡ＃１ベクター〜ｖｅｇｆ ｓｉＲＮＡ＃５ベクターを導入した結果である。同図に示すように、ｓｉＲＮＡ＃１〜＃５を発現する細胞は、いずれも、コントロールｓｉＲＮＡを発現する細胞と比較して、抗がん剤処理によって、十分且つ確実に、生存細胞の相対値は低下した。これらの結果から、ｓｉＲＮＡ＃１〜＃５のいずれのｓｉＲＮＡによっても、細胞の抗がん剤感受性を向上できることがわかった。この結果から、ｓｉＲＮＡ＃１〜＃５により、ｖｅｇｆ５’ＵＴＲ ＲＮＡを攻撃することによって、がん細胞の成育および生存を有効に阻害することができ、これらのｓｉＲＮＡは、抗がん剤として、また、既存の抗がん剤に対する併用剤として、極めて有用であるといえる。
［実施例Ａ１１］
部分的に欠損したｐ５３ｍＲＮＡを発現するコンストラクトを作製し、ｖｅｇｆ ５’ＵＴＲと相互作用する要素配列の決定を行った。
作製したコンストラクトの概略を、図１７（ａ）に示す。ｐ５３遺伝子のＣＤＳと、前記ＣＤＳの５’領域を欠損したｃＤＮＡ（Δ５’ｐ５３）と、前記ＣＤＳの３’領域を欠損したｃＤＮＡとを、ＰＣＲにより準備した。前記ＣＤＳは、配列番号２で表わされるヒトｐ５３ 成熟ｍＲＮＡの全配列における２５２番目〜１４３４番目のＲＮＡに対応し、Δ５’ｐ５３は、配列番号２における２５２番目〜１４３４番目の領域のうち、２５２番目〜５５１番目を欠損させたＲＮＡに対応するｃＤＮＡ、Δ３’ｐ５３は、および、配列番号２における２５２番目〜１４３４番目の領域のうち、１１３３番目−１４３３番目を欠損させたＲＮＡに対応するｃＤＮＡである。これらのｃＤＮＡを、それぞれｐｃＤＮＡ３．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）のＢａｍＨΙ／ＥｃｏＲΙサイトに挿入した。これらのプラスミドコンストラクトと、実施例Ａ２のプラスミドコンストラクトＡ（ｐＶＣ）またはプラスミドコンストラクトＨ（ｐＶＣｍｕｔ５’）とを、Ｈ１２９９細胞に共発現させた。そして、これらの細胞について、外来性ｐ５３ｍＲＮＡの発現レベルを、ＲＴ−ＰＣＲ法により検出した。この結果を、図１７（ｂ）の写真に示す。同図において、ｐＶＣはコンストラクトＡ、ｍｕｔ５’はコンストラクトＨをそれぞれ示す。
同図に示すように、５’末端を欠損するΔ５’ｐ５３は、ｖｅｇｆ ５’ＵＴＲ ＲＮＡによるサイレンシングを受けなかった。これに対して、３’末端を欠損するΔ３’ｐ５３は、野生型ｐ５３ｍＲＮＡと同様に、ｖｅｇｆ ５’ＵＴＲ ＲＮＡによりサイレンシングされた。この結果から、ｐ５３ｍＲＮＡにおいて、ｖｅｇｆ ５’ＵＴＲと相互作用する領域は、配列番号２における２５２番目〜５５１番目の領域を含むＲＮＡであることがわかった。
［実施例Ｂ１］
ｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡを発現する細胞の悪性形質化
ｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡが腫瘍細胞の悪性化を促進するか否かを明らかにするために、以下の実験を行った。
（１）ｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡの発現
ｖｅｇｆ ｍＲＮＡの５’ＵＴＲにおける配列番号１に示す６００番目−８７９番目のｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡの全長ｃＤＮＡを、プラスミドベクターｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に挿入して、ｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡ発現ベクター（ｐｃＤＮＡ−ｖｅｇｆ Ｉｒｅｓ）を作製した。このｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡ発現ベクター（ｐｃＤＮＡ−ｖｅｇｆ Ｉｒｅｓ）をＨＣＴ１１６（親細胞、野生型ｐ５３）に導入し、ｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡを安定過剰発現する２つの細胞クローンを抗生剤Ｇ４１８により選択した。このようにして樹立した二つのｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡ発現細胞を、以下、ｖｅｇｆ Ｉｒｅｓ−＃１およびｖｅｇｆ Ｉｒｅｓ−＃２という。また、ｍｏｃｋ処理として、ＨＣＴ１１６細胞に、前記インサートを欠いたプラスミドベクターｐｃＤＮＡ３．１を導入し、導入された細胞クローンを前記抗生剤Ｇ４１８により選択した。この細胞クローンを、以下、ｍｏｃｋという。そして、これらの細胞クローンにおけるｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡの発現をノーザンブロッティングにより確認した。
これらの結果を、図１８（ａ）に示す。図１８（ａ）は、各細胞におけるＲＮＡの発現を示すノーザンブロッティングの結果であり、上から１段目が、ｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡの発現、２段目は、ローディングコントロールのｇａｐｄｈ ｍＲＮＡの発現を示す。同図に示すように、ｍｏｃｋでは、ｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡの発現はほとんど認められなかった。これに対して、ｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡを発現するｖｅｇｆ Ｉｒｅｓ−＃１およびｖｅｇｆ Ｉｒｅｓ−＃２は、それぞれ、ｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡの発現が認められた。
（２）Ｃｉｓｐｌａｔｉｎのｐ５３ｍＲＮＡ発現誘導能に対するｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡの影響
続いて、これらのｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡ安定発現細胞株を、それぞれ、５μｇ／ｍＬの抗がん剤Ｃｉｓｐｌａｔｉｎ存在下または非存在下で、所定時間（０、６、８、１２、２４時間）処理した後、定量的ＲＴ−ＰＣＲによりｐ５３ｍＲＮＡの発現レベルを分析し、ウェスタンイムノブロッティングによりｐ５３タンパク質の発現レベルを分析した。また、ｍｏｃｋ細胞についても同様に処理して、発現レベルの分析を行った。
これらの結果を図１８（ｂ）および（ｃ）に示す。同図（ｂ）は、各細胞におけるｐ５３ｍＲＮＡ発現量の結果であり、縦軸は、ｐ５３ｍＲＮＡ発現量とコントロールｇａｐｄｈ ｍＲＮＡ発現量との比である。同図（ｃ）は、各細胞におけるｐ５３タンパク質発現量の結果である。同図（ｂ）および（ｃ）に示すように、Ｃｉｓｐｌａｔｉｎ未処理のｍｏｃｋ（０ｈ）と比較して、Ｃｉｓｐｌａｔｉｎ処理のｍｏｃｋ（６、１２ｈ）は、Ｃｉｓｐｌａｔｉｎによってｐ５３ｍＲＮＡの発現が誘導され、ｐ５３ｍＲＮＡならびにｐ５３タンパク質の発現が著しく増加した。これに対して、ｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡ−＃１およびｖｅｇｆ Ｉｒｅs−＃２は、Ｃｉｓｐｌａｔｉｎ未処理（０ｈ）の場合、ｍｏｃｋ（０ｈ）と比較して、内在性ｐ５３ｍＲＮＡおよびｐ５３タンパク質の基底発現量が減少した。また、ｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡ−＃１（６、１２ｈ）およびｖｅｇｆ Ｉｒｅｓ−＃２（６、１２ｈ）は、ｍｏｃｋ（６、１２ｈ）とは反対に、ｐ５３ｍＲＮＡならびにｐ５３タンパク質の発現誘導が見られなかった。このように、ｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡの発現によって、ｍｏｃｋで確認されたＣｉｓｐｌａｔｉｎによるｐ５３ｍＲＮＡ発現誘導能が著しく低下したことから、ｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡは、ｐ５３の発現誘導を阻害することがわかった。
（３）各種抗がん剤によるアポトーシスへのｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡの影響
抗癌剤である５−ＦＵ、ｅｔｏｐｓｉｄｅ、ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ Ｃ（ＭＭＣ）およびｃｉｓｐｌａｔｉｎによるアポトーシスに対する各種細胞の抵抗性と、アポトーシスに対するｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡの影響を確認した。前記（２）のｖｅｇｆ Ｉｒｅｓ−＃１、ｖｅｇｆ Ｉｒｅｓ−＃２、ｍｏｃｋおよびベクター未導入のＨＣＴ１１６（親細胞）を、５−ＦＵ（１２０μｍｏｌ／Ｌ）、ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ（１０μｍｏｌ／Ｌ）、ＭＭＣ（６μｇ／ｍｌ）、ｃｉｓｐｌａｔｉｎ（５μｇ／ｍｌ）で６０時間処理し、アポトーシスを誘導した。誘導後の細胞のアポトーシスを、前述のアポトーシス評価２の方法により検出した（ｍｅａｎｓ±ＳＤ、ｎ＝４）。
これらの結果を図１８（ｄ）に示す。同図は、各細胞におけるアポトーシス陽性細胞の割合を示すグラフである。同図において、ｐａｒｅｎｔａｌは、親細胞ＨＣＴ１１６の結果である。同図に示すように、ＨＣＴ１１６（ｐａｒｅｎｔａｌ）およびｍｏｃｋは、いずれの抗がん剤の刺激によっても、約３０％前後の細胞にアポトーシスが誘導され、いずれの抗がん剤にも耐性を示さなかった。これに対して、ｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡ−＃１およびｖｅｇｆ Ｉｒｅｓ−＃２は、いずれの抗がん剤の刺激によっても、約１０％程度の細胞にアポトーシスが誘導されるにとどまり、ＨＣＴ１１６（ｐａｒｅｎｔａｌ）およびｍｏｃｋと比較して有意に低い割合であった。この結果から、ｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡは、細胞にアポトーシス抵抗性を付与することがわかった。
（４）ｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡによるｉｎ ｖｉｖｏにおける細胞の悪性形質化
続いて、前記（２）のｖｅｇｆ Ｉｒｅｓ−＃１、ｖｅｇｆ Ｉｒｅｓ−＃２およびｍｏｃｋ（５×１０６細胞）を、それぞれ、胸腺を欠くヌードマウスの大腿部皮下に、２７ゲージの注射針を用いて移植した。移植後、所定期間（０、５、９、１３、１７、２１日）経過時に、形成された腫瘍の体積を実施例Ａ７と同様にして測定した（ｍｅａｎｓ±ＳＥＭ、ｎ＝５）。コントロールとして、発現ベクター未導入のＨＣＴ１１６細胞を、同様にしてマウスに移植し、腫瘍の体積を測定した。これらの結果を、図１８（ｅ）に示す。同図は、これらの細胞株を移植したマウスにおける腫瘍体積の経時的変化を示すグラフである。また、ｖｅｇｆ Ｉｒｅｓ−＃１および発現ベクター未導入のコントロールＨＣＴ１１６細胞（１×１０６個）を、それぞれヌードマウスの腹腔内に２７ゲージの注射針を用いて移植し、移植後３５日目に形成された腫瘍を開腹により観察した。これらの結果を、図１９（ｆ）に示す。同図は、マウスの開腹部の写真であり、矢頭は、形成された腫瘍を示す。同図において、左図は、ｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡ発現細胞を移植した結果であり。右図は、コントロール細胞を移植した結果である。
図１８（ｅ）に示すように、ｖｅｇｆ Ｉｒｅｓ−＃１およびｖｅｇｆ Ｉｒｅｓ−＃２は、それぞれ、ｍｏｃｋに比べて、明らかに大きな腫瘍が短期間で形成された。また、図１９（ｆ）に示すように、悪性度の高い腫瘍細胞の形質を評価できる腹腔内移植モデルにおいても、ｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡを発現する細胞は、コントロール細胞に比べ、顕著な造腫瘍能を示すことが明らかになった。以上の結果から、ｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡは、生体内において、腫瘍形成を著しく亢進させることが明らかとなった。
［実施例Ｂ２］
ｖｅｇｆ ｓｉＲＮＡによる細胞の腫瘍形成能の抑制効果
ｖｅｇｆに対するｓｉＲＮＡを発現する細胞について、生体内での腫瘍形成能に対する効果を確認した。前述の、ｓｉＲＮＡ＃１を発現するｖｅｇｆ ｓｉＲＮＡ＃１ベクターを、ヒト大腸がん由来ＨＣＴ１１６細胞株（野生型ｐ５３）に導入し、抗生剤ブラストシジンにより選択した。得られた細胞クローンを、以下、ｓｉ−ｖｅｇｆ＃１細胞株という。また、コントロールとしては、前述と同様に、脊椎動物の既知遺伝子に対して相同性のない配列（配列番号４６：5’−gaaatgtactgcgcgtggagacgttttggccactgactgacgtctccacgcagtacattt−3’）の二本鎖オリゴヌクレオチドが挿入された、ｐｃＤＮＡ６．２−ＧＷ／ＥｍＧＦＰ−ｍｉＲ ｖｅｃｔｏｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を使用した（コントロールｓｉＲＮＡベクター）。このコントロールｓｉＲＮＡベクターにより、同様に、ＨＣＴ１６細胞株を導入し、導入された細胞を前記抗生剤により選択した。得られた細胞クローンを、以下、ｓｉ−Ｃｏｎｔｒｏｌ細胞株という。そして、前記実施例Ｃ２と同様にして、前記ｓｉ−ｖｅｇｆ＃１細胞株およびｓｉ−Ｃｏｎｔｒｏｌ細胞株を、それぞれ、ヌードマウスの大腿部皮下に移植し、所定期間後の腫瘍体積を測定した（各ｎ＝５）。
これらの結果を、図２０に示す。同図は、これらの細胞株を移植したマウスにおける腫瘍体積の経時的変化を示すグラフである。同図において、白抜きのシンボルで表わされた＃１〜＃５ ｓｉ−ｖｅｇｆ＃１は、ｓｉＲＮＡ＃１を発現するｓｉ−ｖｅｇｆ＃１細胞を移植した結果であり、黒塗りのシンボルで表わされた＃１〜＃５ コントロールは、ｓｉ−Ｃｏｎｔｒｏｌ細胞を移植した結果である。
同図に示すように、ｓｉ−Ｃｏｎｔｒｏｌ細胞を移植したマウス（コントロール）では、経時的に、腫瘍の増大が確認された。これに対して、ｓｉＲＮＡ＃１を発現するｓｉ−ｖｅｇｆ＃１細胞を移植したマウス（ｓｉ−ｖｅｇｆ＃１）では、有意に、腫瘍形成の抑制、腫瘍の増大の抑制が認められた。これらの結果から、ｖｅｇｆ ｍＲＮＡにおけるｅｘｏｎ１を標的とするｓｉＲＮＡによれば、腫瘍形成ならびに形成された腫瘍の増大を有意に抑制できることが明らかとなった。
[実施例Ｂ３]
ｖｅｇｆ ｓｉＲＮＡによるアポトーシス感受性の促進
（１）ｖｅｇｆ ｓｉＲＮＡによるｖｅｇｆ ｍＲＮＡまたはｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡの発現抑制
ｖｅｇｆ ｓｉＲＮＡが細胞のアポトーシス感受性を促進するか否かを確認した。ＨｅｐＧ２細胞（野生型ｐ５３）に代えてＨＣＴ１１６（親細胞、野生型ｐ５３）を使用した以外は、前記実施例Ａ１と同様にして、ＨＣＴ１１６（親細胞、野生型ｐ５３）に、前述の、ｓｉＲＮＡ＃１を発現するｖｅｇｆ ｓｉＲＮＡ＃１ベクター、ｖｅｇｆ ｓｉＲＮＡ＃２ベクターを発現する＃２およびコントロールｓｉＲＮＡベクターを、それぞれ導入した。そして、導入１８時間後の細胞について、定量的ＲＴ−ＰＣＲによりｖｅｇｆ ｍＲＮＡおよびｇａｐｄｈ ｍＲＮＡの発現レベル（ｍｅａｎｓ±ＳＤ、ｎ＝４）を、ノーザンブロッティングによりｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡとｇａｐｄｈ ｍＲＮＡの発現レベルを分析した。前記組換えベクター未導入のＨＣＴ１１６細胞についても、同様に分析を行った。定量的ＲＴ−ＰＣＲは、ｖｅｇｆ ｍＲＮＡ用プライマーセットを用いた以外は、前記実施例Ｂ１と同様に行った。
これらの結果を、図２１（ａ）に示す。同図において、左は、各細胞におけるｖｅｇｆ ｍＲＮＡの発現量解析の結果であり、縦軸は、ｖｅｇｆ ｍＲＮＡとｇａｐｄｈ ｍＲＮＡとの比を示す。同図において、右は、各細胞におけるｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡの発現を示すノーザンブロッティングの結果であり、上段は、ｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡ、下段は、ｇａｐｄｈ ｍＲＮＡの結果を示す。同図において、ｎｏｎｅは、組換えベクター未導入の細胞、ｓｉ−Ｃｏｎｔｒｏｌは、コントロールｓｉＲＮＡベクターを導入した細胞、ｓｉ−ｖｅｇｆ＃１は、ｖｅｇｆ ｓｉＲＮＡ＃１ベクターを導入した細胞、ｓｉ−ｖｅｇｆ＃２は、ｖｅｇｆ ｓｉＲＮＡ＃２ベクターを導入した細胞の結果である（以下、同様）。
図２１（ａ）の左のグラフに示すように、ｖｅｇｆ ｓｉＲＮＡ＃１ベクターまたはｖｅｇｆ ｓｉＲＮＡ＃２ベクターの導入によって、ＨＣＴ１１６におけるｖｅｇｆ ｍＲＮＡの発現量が著しく減少した。また、図２１（ａ）の右の写真に示すように、ｖｅｇｆ ｓｉＲＮＡ＃１ベクターまたはｖｅｇｆ ｓｉＲＮＡ＃２ベクターの導入によって、ｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡの発現量が、コントロール細胞に比べて減少した。特に、ｖｅｇｆ ｓｉＲＮＡ＃２ベクターの導入細胞において、著しくｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡの発現が減少した。以上の結果から、ｓｉＲＮＡ＃１およびｓｉＲＮＡ＃２によって、ｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡをノックダウンできることが明らかになった。
（２）ｖｅｇｆ ｓｉＲＮＡによるアポトーシス感受性の促進
ｐ５３依存的にアポトーシスを誘導する抗がん剤５−ＦＵで、各種細胞を処理し、アポトーシスへの感受性を解析した。ＨＣＴ１１６（親細胞）およびｐ５３欠損細胞ＨＣＴ１１６に、前述の、ｓｉＲＮＡ＃１を発現するｖｅｇｆ ｓｉＲＮＡ＃１ベクター、ｓｉＲＮＡ＃２を発現するｖｅｇｆ ｓｉＲＮＡ＃２ベクターおよびコントロールｓｉＲＮＡベクターを、それぞれ導入した。そして、導入１８時間後の細胞を、８０μｍｏｌ／Ｌ ５−ＦＵ存在下（＋）または５−ＦＵ非存在下（−）で、６０時間処理した。処理後の細胞について、前述のアポトーシス評価２に基づいて、アポトーシス陽性細胞の割合（％）を算出した（ｍｅａｎｓ±ＳＤ、ｎ＝４）。
これらの結果を、図２１（ｂ）に示す。同図は、各細胞のアポトーシス（％）を示すグラフである。同図において、ｐａｒｅｎｔａｌ ＨＣＴ１１６は、ｐ５３を発現する親細胞ＨＣＴ１１６、ｐ５３−ＫＯ ＨＣＴ１１６は、ｐ５３欠損ＨＣＴ１１６細胞、ｎｏ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎは、組換えベクター未導入細胞、ｓｉ−Ｃｏｎｔｒｏｌ、ｓｉ−ｖｅｇ＃１およびｓｉ−ｖｅｇｆ＃２は、それぞれ図２１（ａ）と同様である。また、５−ＦＵについて、「＋」は、５−ＦＵ存在下、「−」は、５−ＦＵ非存在下での処理を示す（以下、同様）。同図に示すように、ｐ５３欠損細胞ＨＣＴ１１６のアポトーシス割合は、５−ＦＵ処理によってわずかに増加したが、さらにｓｉＲＮＡ＃１またはｓｉＲＮＡ＃２を発現させても、ほとんど増加は見られなかった。これに対して、親細胞ＨＣＴ１１６においては、ｓｉＲＮＡ＃１またはｓｉＲＮＡ＃２を発現させて、５−ＦＵ処理を行うことにより、アポトーシスの割合が著しく増加した。これらの結果から、ｓｉＲＮＡ＃１およびｓｉＲＮＡ＃２によるアポトーシス感受性の増大は、ｐ５３に依存していることが示された。
（３）ｖｅｇｆ ｓｉＲＮＡによるｐ５３ｍＲＮＡおよびｐ５３タンパク質の発現促進
前記（１）および（２）の結果から、ｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡが、ｐ５３がん抑制経路において、ネガティブに影響していると解される。そこで、ｖｅｇｆ ｓｉＲＮＡを導入した細胞について、内在性ｐ５３の発現レベルを確認した。具体的には、前述と同様の導入後の親細胞ＨＣＴ１６６を、８０μｍｏｌ／Ｌ ５−ＦＵ存在下（＋）または５−ＦＵ非存在下（−）で、８時間処理した後、定量的ＲＴ−ＰＣＲにより、ｐ５３ｍＲＮＡの発現を解析した（ｍｅａｎｓ±ＳＤ、ｎ＝４）。また、前記導入後の細胞を、８０μｍｏｌ／Ｌ ５−ＦＵ存在下（＋）で、所定時間（０、８、１６、２４時間）処理した後、前述のウェスタンイムノブロッティングにより、ｐ５３タンパク質を検出した。
これらの結果を、図２１（ｃ）および（ｄ）に示す。図２１（ｃ）は、各細胞におけるｐ５３ｍＲＮＡの発現量を示すグラフであり、縦軸は、ｐ５３ｍＲＮＡとｇａｐｄｈ ｍＲＮＡとの比を示す。同図において、５−ＦＵについて、「＋」は、５−ＦＵ存在下、「−」は、５−ＦＵ非存在下での処理を示す。図２１（ｄ）は、各細胞におけるｐ５３タンパク質の発現を示すウェスタンイムノブロッティングの結果である。同図において、５−ＦＵの値は、５−ＦＵによる処理時間（時間）を示す。両図において、ｓｉ−Ｃｏｎｔｒｏｌ、ｓｉ−ｖｅｇ＃１およびｓｉ−ｖｅｇｆ＃２は、それぞれ図２１（ａ）と同様である。同図（ｃ）に示すように、ｓｉＲＮＡ＃１またはｓｉＲＮＡ＃２を発現させた細胞は、ｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡの減少により、ｍＲＮＡの発現量が、コントロールと比較して増加した。そして、このような細胞をさらに５−ＦＵ処理することによって、ｐ５３ｍＲＮＡの発現量を著しく増加することができた。また、同図（ｄ）に示すように、ｐ５３タンパク質についても、同様に、コントロールと比較して、ｓｉＲＮＡ＃１またはｓｉＲＮＡ＃２を発現させた細胞は、発現量が増加した。そして、このような細胞をさらに５−ＦＵ処理することによって、ｐ５３タンパク質の発現量を著しく増加することができた。以上の結果から、ｖｅｇｆ ｓｉＲＮＡによるｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡのノックダウンによって、５-ＦＵで誘導されるｐ５３ｍＲＮＡならびにｐ５３タンパク質の発現が増加することがわかった。
（４）ｖｅｇｆ ｓｉＲＮＡによる、ｐ５３を介して誘導されるｍＲＮＡの発現促進
ｖｅｇｆ ｓｉＲＮＡによるｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡのノックダウンに起因する、５-ＦＵで誘導されるｐ５３ｍＲＮＡの発現増加が、ｐ５３ターゲット遺伝子ｂａｘ遺伝子またはｎｏｘａ遺伝子のｍＲＮＡの発現を誘導するか否かを確認した。親細胞ＨＣＴ１１６に、前述と同様のコントロールｓｉＲＮＡベクター、ｖｅｇｆ ｓｉＲＮＡ＃１ベクターまたはｖｅｇｆ ｓｉＲＮＡ＃２ベクターを導入した細胞を、８０μｍｏｌ／Ｌ ５−ＦＵ存在下（＋）または５−ＦＵ非存在下（−）で、２４時間処理した後、定量的ＲＴ−ＰＣＲにより、ｂａｘ ｍＲＮＡおよびｎｏｘａ ｍＲＮＡの発現を解析した（ｍｅａｎｓ±ＳＤ、ｎ＝４）。
これらの結果を図２２（ｅ）に示す。同図は、ｐ５３ターゲット遺伝子のｍＲＮＡの発現量を示すグラフである。同図において、左が、ｂａｘ ｍＲＮＡの結果であり、縦軸は、ｂａｘ ｍＲＮＡとｇａｐｄｈ ｍＲＮＡとの比を示す。同図において、右は、ｎｏｘａ ｍＲＮＡの結果であり、縦軸は、ｎｏｘａ ｍＲＮＡとｇａｐｄｈ ｍＲＮＡとの比を示す。同図に示すように、ｂａｘ ｍＲＮＡおよびｎｏｘａ ｍＲＮＡは、ともに、コントロールと比較して、ｓｉＲＮＡ＃１またはｓｉＲＮＡ＃２の発現によって、５−ＦＵ処理による発現の誘導が著しく促進された。この結果から、ｓｉＲＮＡ＃１またはｓｉＲＮＡ＃２の発現によって、ｂａｘやｎｏｘａ等のアポトーシス関連遺伝子の発現量が増加し、結果的に、アポトーシス感受性を増大できるといえる。
（５）ｐ５３ｍＲＮＡ、ｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡおよびｖｅｇｆ ｍＲＮＡの関係
ＨＣＴ１１６（親細胞）を、ｐ５３ｍＲＮＡ発現をアップレギュレートする遺伝毒性のストレスに曝した。具体的には、ＨＣＴ１１６を、５−ＦＵ（８０μｍｏｌ／Ｌ）、マイトマイシンＣ（ＭＭＣ、６μｇ／ｍｌ）またはｃｉｓｐｌａｔｉｎ（５μｇ／ｍｌ）で所定時間（０、６、１２時間）処理した後、ノーザンブロッティングによりｐ５３ｍＲＮＡ、ｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡ、ｖｅｇｆ ｍＲＮＡの発現を確認した。また、ＨＣＴ１１６をＵＶ−Ｂに１分間暴露し、所定時間（６、１２時間）非暴露条件下においた後、同様にして発現を確認した。
これらの結果を図２２（ｆ）に示す。同図に示すように、５−ＦＵ、ＭＭＣまたはＵＶ照射でストレスをかけた細胞は、ｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡおよびｖｅｇｆ ｍＲＮＡの両方が、著しく増加し、これによってｐ５３ｍＲＮＡ発現が抑制された。これに対して、ｃｉｓｐｌａｔｉｎは、ｐ５３ｍＲＮＡの発現を増加し、ｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡの発現を減少させた。この結果は、ｃｉｓｐｌａｔｉｎが、ｖｅｇｆ ｍＲＮＡ発現と続くｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡの発生を阻害するという結果により裏付けられる。この逆の相関関係は、ｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡが、ｐ５３発現のリプレッサーとして作用することを裏付けている。また、ｐ５３は、ＶＥＧＦ発現を転写レベルで抑制することが報告されている。このため、ｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡは、ｐ５３発現のサイレンシングを通じて、ＶＥＧＦ産生のためのポジティブフィードバックループを提供していると考えられる。
［実施例Ｂ４］
ｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡにおけるｐ５３ｍＲＮＡとの相互作用領域の同定
（１）ｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡのｐ５３ｍＲＮＡ発現への影響
前記実施例Ｂ１と同様にして、ｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡ発現ベクター（ｐｃＤＮＡ−ｖｅｇｆ Ｉｒｅｓ）を作製した。ｐ５３欠損ＨＣＴ１１６細胞（ｐ５３ヌル）に、前記実施例Ａ２のｐ５３発現ベクターと前記ｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡ発現ベクター（ｐｃＤＮＡ−ｖｅｇｆ Ｉｒｅｓ）とを共導入し、１８時間後、ノーザンブロッティングによって、ｐ５３ｍＲＮＡおよびｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡの発現を確認した。さらに、ｍｏｃｋ処理として、インサートを欠いた発現プラスミドベクターｐｃＤＮＡ３．１と前記ｐ５３発現ベクターとを、ｐ５３欠損ＨＣＴ１１６細胞に共導入した。この細胞クローンを以下ｍｏｃｋという。ｍｏｃｋについても、同様にＲＮＡ発現を確認した。
これらの結果を、図２３（ａ）に示す。図２３（ａ）において、左は、各細胞におけるｐ５３ｍＲＮＡの発現を示すノーザンブロッティングの結果であり、右は、各細胞におけるｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡの発現を示すノーザンブロッティングの結果である。同図において、ｍｏｃｋは、ｍｏｃｋ処理した細胞、ｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡは、ｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡ発現ベクターを導入した細胞であり、ｐ５３「＋」は、ｐ５３発現ベクターの導入を示し、「−」は未導入を示す。同図に示すように、ｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡ未発現の細胞ｍｏｃｋでは、ｐ５３ｍＲＮＡが強く検出された。これに対して、ｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡを発現する細胞ｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡでは、ｐ５３ｍＲＮＡの分解が誘導された。これらの結果から、ｖｅｇｆ ５’ＵＴＲ、特に、ｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡは、転写後に、ｐ５３発現を抑制することが示唆された。
（２）ｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡにおけるｐ５３ｍＲＮＡとの相互作用領域の同定
前述の結果から、ｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡが、ｐ５３ｍＲＮＡの発現量を転写後に負に制御することが明らかになった。そこで、さらに、ｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡにおけるｐ５３ｍＲＮＡとの相互作用領域の同定を行った。
ｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡおよびｐ５３ｍＲＮＡの２次構造を、核酸の２次構造予測プログラムｍＦｏｌｄ３．２を用いて予測した。そして、これらの予測二次構造に基づき、ＶｉｅｎｎａＲＮＡ ｆｏｌｄアルゴリズムを用いて、ｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡとｐ５３ｍＲＮＡとの相補領域を予測した。その結果を図２３（ｂ）および（ｃ）に示す。両図は、それぞれ、ｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡとｐ５３ｍＲＮＡとの相補領域のアラインメントを示す。同図（ｂ）に示すように、配列番号１におけるｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡの６９４番目−７１４番目と、配列番号２におけるｐ５３ｍＲＮＡの４６２番目−４８１番目との間、ならびに、同図（ｃ）に示すように、配列番号１におけるｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡの６９３番目−７１４番目と、配列番号２におけるｐ５３ｍＲＮＡの４６２番目−４９１番目との間に、相補領域が確認された。この配列番号１における６９３番目−７１４番目の領域は、ｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡ二次構造において、ステムループを形成する領域であることがわかった。図２４（ｄ）に、ｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡの二次構造（ステムループ構造）の概略を示す。
（３）ｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡにおけるステムループの変異による影響
ｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡにおけるステムループ構造が、ｐ５３ｍＲＮＡのサイレンシングに関与するか否かを以下の方法により確認した。ｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡのステムループを部分的に欠損するｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡ（ｄｅｌ−１）およびｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡ（ｄｅｌ−２）を発現する発現ベクター（ｄｅｌ−１）および（ｄｅｌ−２）を作製した。ｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡにおける欠損部分を図２４（ｅ）に示す。同図（ｅ）には、前記図２４（ｄ）のｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡの二次構造において、四角で囲んだ領域のみを示す。同図の左が、ｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡ（ｄｅｌ−１）であり、同図の右が、ｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡ（ｄｅｌ−２）である。ｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡ（ｄｅｌ−１）は、ｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡにおける６９３番目−７１４番目の前記領域を部分的に欠損し、具体的には、図２４（ｅ）に示すように、ステムループの根本部分を形成する６９１番目−７０３番目の領域を欠損する。また、ｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡ（ｄｅｌ−２）は、ｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡにおける７１１番目−７１８番目および７２１番目−７２３番目の領域を欠損する、具体的には、図２４（ｅ）に示すように、ステムループの先端ループ部分を欠損する、短いステムループを形成する。
発現ベクター（ｄｅｌ−１）および（ｄｅｌ−２）は、以下のようにして作製した。まず、前記実施例Ｂ１のｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡ発現ベクター（ｐｃＤＮＡ−ｖｅｇｆ Ｉｒｅｓ）をＮｈｅＩで切断し、これに、ｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡ（ｄｅｌ−１）およびｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡ（ｄｅｌ−２）をコードするオリゴヌクレオチドを挿入した。以下に、ｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡ（ｄｅｌ−１）をコードするオリゴヌクレオチドおよびｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡ（ｄｅｌ−２）をコードするオリゴヌクレオチドを示す。
ｄｅｌ−１オリゴヌクレオチド（配列番号９１）
5’-gctagcggagcccgcgcccggaggcggggtggagggggtcggggctcgcggcgtcgcactgaaacttttcgtccaacttctgggctgttctcgcttctccgcgcgggggaagccgagccgagcggagccgcgagaagtgctagc-3’
ｄｅｌ−２オリゴヌクレオチド（配列番号９２）
5’-gctagcggagcccgcgcccggaggcggggtggagggggtcggggctcgcggcgtcgcactgaaacttttcgtccaacttctgggctgttctcgcttcggaggagccgtggtccgcgcccccgagcggagccgcgagaagtgctagc-3’
そして、発現ベクター（ｄｅｌ−１）、発現ベクター（ｄｅｌ−２）または前記ｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡ発現ベクターと、前記実施例Ａ２におけるｐ５３発現ベクターとをｐ５３欠損ＨＣＴ１１６に共導入し、１８時間後、ｐ５３ｍＲＮＡおよびｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡの発現をノーザンブロッティングによって確認した。また、ｍｏｃｋ処理として、インサートを欠いた発現プラスミドベクターｐｃＤＮＡ３．１と前記ｐ５３発現ベクターとをｐ５３欠損ＨＣＴ１１６に共導入し、同様に、発現を確認した。なお、ＨＣＴ１１６（ｐ５３ヌル）の培養は、１０％ウシ胎児血清および１００μｇ／ｍｌ（１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）ストレプトマイシンを含むＭｃＣｏｙ’ｓ ５Ａ培地を使用し、条件は、温度３７℃、５％ＣＯ２とした（以下、同様）。
これらの結果を、図２４（ｆ）に示す。同図（ｆ）は、各細胞におけるＲＮＡの発現を示すノーザンブロッティングの結果であり、上から１段目が、ｐ５３ｍＲＮＡの発現、２段目が、ｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡの発現、３段目が、ローディングコントロールのｇａｐｄｈ ｍＲＮＡの発現を示す。また、ｐ５３「＋」は、ｐ５３発現ベクターの導入を表す。同図において、ｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡ（ｗｔ）は、発現ベクターｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡの導入細胞、ｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡ（ｄｅｌ−１）は、発現ベクターｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡ（ｄｅｌ−１）の導入細胞、ｖｅｇｆ Ｉｒｅｓ（ｄｅｌ−２）は、発現ベクター（ｄｅｌ−２）の導入細胞である。同図のｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡ（ｗｔ）に示すように、ｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡ全長をｐ５３ｍＲＮＡとともに発現させた場合、ｐ５３ｍＲＮＡおよびｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡのサイレンシングが見られた。一方、ｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡ（ｄｅｌ−１）およびｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡ（ｄｅｌ−２）に示すように、ｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡの部分欠失変異体をｐ５３と共発現させた場合、ｐ５３ｍＲＮＡの発現量は、ｍｏｃｋと同様であり、また、ｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡの分解はみられなかった。このように、ｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡ（ｄｅｌ−１）およびｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡ（ｄｅｌ−２）には、ｐ５３サイレンシング能が無いことが示された。以上の結果から、ｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡによるｐ５３ｍＲＮＡのサイレンシングには、ｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡにおける６９３−７１４番目の領域付近のステムループ構造が重要な役割を果たすということが分かった。
（４）ｖｅｇｆ ＩｒｅｓｍＲＮＡのステムループを介したｐ５３ｍＲＮＡとの結合
ｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡが、前述のステムループ構造を介してｐ５３ｍＲＮＡに結合する可能性を確認した。まず、前述と同様にして、ｐ５３欠損ＨＣＴ１１６に、前記ＲＮＡプルダウンアッセイで記載した前記ｐ５３発現ベクターと、各種ｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡを発現する発現ベクターとを共導入した。そして、前述のＲＮＡプルダウンアッセイにより、ＰＣＲ産物の増幅の有無を確認した。
これらの結果を図２４（ｇ）に示す。同図において、ｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡ（ｗｔ）は、ｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡ発現ベクターの導入細胞、ｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡ（ｄｅｌ−１）は、発現ベクターｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡ（ｄｅｌ−１）の導入細胞、ｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡ（ｄｅｌ−２）は、発現ベクターｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡ（ｄｅｌ−２）の導入細胞である。ＲＴ（−）は、逆転写酵素を欠いたネガティブコントロールであり、ｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡ ｃＤＮＡおよびｐ５３ｃＤＮＡは、ＰＣＲのポジティブコントロールである。同図のｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡ（ｗｔ）に示すように、野生型ｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡ全長とｐ５３とを発現させた場合、ｐ５３の増幅が確認できた。この結果から、野生型ｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡ全長に、ｐ５３ｍＲＮＡが結合していることが分かった。一方、ｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡ（ｄｅｌ−１）およびｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡ（ｄｅｌ−２）に示すように、ｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡの部分欠失変異体をｐ５３と共発現させた場合、ｐ５３の増幅は見られなかった。この結果から、ｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡ（ｄｅｌ−１）およびｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡ（ｄｅｌ−２）には、ｐ５３ｍＲＮＡが結合しないことが分かった。このように、ｐ５３ｍＲＮＡとｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡは、ｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡの６９３番目−７１４番目の領域付近のステムループ構造を介して結合していることが示唆された。以上の結果から、ｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡは、ｐ５３に相補的な配列に加えて、そのステムループ構造が、ｐ５３ｍＲＮＡの分解の誘導に重要であると推測される。
［実施例Ｃ１］
ｐ５３デコイＬＮＡ−ＤＮＡの効果
ｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡと相互作用するｐ５３ｍＲＮＡの領域をデコイＤＮＡとして使用し、ｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡによるｐ５３ｍＲＮＡサイレンシングならびにがん細胞の細胞死に対する効果を確認した。
前記実施例Ｂ４の結果から、ｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡと相互作用するｐ５３ｍＲＮＡの領域は、４６２−４９１番目の塩基を含む領域であると考えられる。そこで、野生型ｐ５３デコイとして、ｐ５３ｍＲＮＡの４６２−４８２番目の配列に相当するＬＮＡ−ＤＮＡを作製した。これを、野生型ｐ５３デコイという。あわせて、この配列に変異を導入したＬＮＡ−ＤＮＡを作製した。これを、変異型ｐ５３デコイという。これらの配列を以下に示す。変異型ｐ５３デコイにおいて、大文字の塩基は、野生型ｐ５３デコイと異なる変異部位である。
野生型ｐ５３デコイ（配列番号９３）
5’-ccccgcgtggcccctgcacca-3’
変異型ｐ５３デコイ（配列番号９４）
5’-cccGCcCACCcGGctgGTcca-3’
そして、ｐ５３欠損ＨＣＴ１１６に、前記実施例Ａ２のｐ５３発現ベクター、前記実施例Ｂ１のｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡ発現ベクター、および、前記野生型または変異型ｐ５３デコイを共導入し、ｐ５３ｍＲＮＡ発現をノーザンブロッティングにて解析した。また、前記ｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡ発現ベクターと前記ｐ５３発現ベクターを共導入し且つデコイ未導入のｐ５３欠損ＨＣＴ１１６（ｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡ）、前記インサートを欠いたプラスミドベクターｐｃＤＮＡ３．１と前記ｐ５３発現ベクターを共導入し且つデコイ未導入のｐ５３欠損ＨＣＴ１１６（ｍｏｃｋ）、発現ベクターおよびデコイ未導入のｐ５３欠損ＨＣＴ１１６についても、同様にｐ５３ｍＲＮＡ発現を解析した。
これらの結果を、図２５（ａ）に示す。同図は、各細胞におけるｐ５３ｍＲＮＡの発現を示すノーザンブロッティングの結果である。同図において、「ｎｏ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ」は、発現ベクター未導入の細胞、「ｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡ」は、前記ｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡ発現ベクターの導入細胞、「ｍｏｃｋ」は、ｐｃＤＮＡ３．１の導入細胞、「ｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡ＋ｐ５３ ｄｅｃｏｙ ｍｕｔａｎｔ」は、前記変異型ｐ５３デコイと前記ｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡ発現ベクターとの共導入細胞、「ｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡ＋ｐ５３ ｄｅｃｏｙ」は、前記野生型ｐ５３デコイと前記ｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡ発現ベクターとの共導入細胞の結果を示す。また、ｐ５３「＋」は、ｐ５３発現ベクターの導入、ｐ５３「−」は、ｐ５３発現ベクター未導入を示す。同図に示すように、デコイ未導入の「ｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡ」は、ｐ５３ｍＲＮＡの発現量は極めて少なく、サイレンシングを受けたと解される。また、変異型ｐ５３デコイを導入した「ｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡ＋ｐ５３ ｄｅｃｏｙ ｍｕｔａｎｔ」も、ｐ５３ＲＮＡの発現量は少なく、サイレンシングを受けたと解される。これに対して、野生型ｐ５３デコイを導入した「ｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡ＋ｐ５３ ｄｅｃｏｙ」で、「ｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡ」よりも、高い発現量が確認され、ｍｏｃｋと同等のｐ５３ｍＲＮＡ発現量を示した。このことから、ｐ５３デコイは、ｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡの内在性ｐ５３ｍＲＮＡへのサイレンシング効果を抑制し、ｐ５３ｍＲＮＡの発現量を増加させることがわかった。
さらに、野生型および変異型ｐ５３デコイについて、がん細胞のアポトーシス感受性への影響を確認した。
ＨＣＴ１１６細胞（野生型ｐ５３）に、前記野生型および変異型ｐ５３デコイＬＮＡ−ＤＮＡを、それぞれ導入した。前記デコイを導入した細胞を、１０％ウシ胎児血清および１００μｇ／ｍｌ（１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）ストレプトマイシンを含むＭｃＣｏｙ’ｓ ５Ａ培地で培養し、前記アポトーシス評価２に基づいて、生存率の相対値（％）を算出した。前記相対値は、５−ＦＵ未処理細胞の生存細胞数を１００％として求めた。あわせて、デコイ未導入のＨＣＴ細胞（ｐ５３）についても同様に生存率を算出した。
これらの結果を図２５（ｂ）に示す。同図は、各細胞の生存率（％）を示すグラフである。同図において、ｎｏｎｅは、デコイ未導入の細胞、ｐ５３ ｄｅｃｏｙは、野生型ｐ５３デコイを導入した細胞、ｐ５３ ｄｅｃｏｙ ｍｕｔａｎｔは、変異型ｐ５３デコイを導入した細胞の結果である。同図に示すように、野生型ｐ５３デコイの導入細胞は、未導入細胞ならびに変異型ｐ５３デコイ導入細胞よりも、５−ＦＵ（４０μｍｏｌ／Ｌ）処理による細胞の生存率が低下した。これらの結果から、ｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡと相互作用するｐ５３ｍＲＮＡ領域は、デコイとして使用することにより、ｐ５３ｍＲＮＡ分解を防ぎ、細胞死を誘導するのに有用であることが明らかとなった。前記デコイは、本発明のｐ５３結合阻害剤として、また、ｐ５３発現促進剤として使用できる。
［実施例Ｃ２］
ｖｅｇｆアンチセンスＤＮＡの効果
ｐ５３ｍＲＮＡと相互作用するｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡの領域に相補的なアンチセンスＤＮＡについて、ｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡによるｐ５３ｍＲＮＡサイレンシングならびにがん細胞の細胞死に対する効果を確認した。
前記実施例Ｂ４の結果から、ｐ５３ｍＲＮＡと相互作用するｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡの領域は、６９３−７１４番目の塩基を含む領域であると考えられる。そこで、この領域に相補的なアンチセンスＬＮＡ−ＤＮＡを作製した。これを、野生型ｖｅｇｆアンチセンスという。あわせて、この配列に変異を導入したアンチセンスＬＮＡ−ＤＮＡを作製した。この配列を、変異型ｖｅｇｆアンチセンスという。これらの配列を以下に示す。変異型アンチセンスにおいて、大文字の塩基は、野生型アンチセンスと異なる変異部位である。
野生型ｖｅｇｆアンチセンス（配列番号７４）
5’-ccccgcgcggaccacggctcct-3’
変異型ｖｅｇｆアンチセンス（配列番号９５）
5’-cccGCcCGggTcGTcCgcAccA-3’
これらの結果を、図２６（ａ）に示す。同図は、各細胞におけるｐ５３ｍＲＮＡの発現を示すノーザンブロッティングの結果である。同図において、「ｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡ」は、前記ｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡ発現ベクターを導入した細胞、「ｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡ＋ＡＳ ｍｕｔａｎｔ」は、前記変異型ｖｅｇｆアンチセンスと前記ｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡ発現ベクターを共導入した細胞、「ｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡ＋ＡＳ」は、前記野生型ｖｅｇｆアンチセンスと前記ｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡ発現ベクターを共導入した細胞の結果を示す。また、ｐ５３「＋」は、ｐ５３発現ベクターの導入を示す。同図に示すように、前記アンチセンス未導入の「ｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡ」は、ｐ５３ｍＲＮＡの発現量は極めて少なく、サイレンシングを受けたと解される。また、変異型アンチセンスを導入した「ｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡ＋ＡＳ ｍｕｔａｎｔ」も、同様にｐ５３ｍＲＮＡの発現量は少なく、サイレンシングを受けたと解される。これに対して、野生型ｖｅｇｆアンチセンスを共導入した「ｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡ＋ＡＳ」は、「ｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡ」よりも、顕著な発現量が確認された。このことから、ｖｅｇｆアンチセンスは、ｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡの内在性ｐ５３ｍＲＮＡへのサイレンシング効果を抑制し、ｐ５３ｍＲＮＡの発現量を増加させることがわかった。
さらに、野生型および変異型ｖｅｇｆアンチセンスについて、がん細胞のアポトーシス感受性への影響を確認した。
ＨＣＴ１１６細胞（野生型ｐ５３）に、前記野生型および変異型ｖｅｇｆアンチセンスを、それぞれ導入した。前記アンチセンスを導入した細胞について、前記実施例Ｃ４と同様にして生存率の相対値（％）を算出した。前記相対値は、５−ＦＵ未処理細胞の生存細胞数を１００％として求めた。あわせて、ｖｅｇｆアンチセンス未導入のＨＣＴ細胞（野生型ｐ５３）についても同様に生存率を算出した。
これらの結果を図２６（ｂ）に示す。同図は、各細胞の生存率（％）を示すグラフである。同図において、ｎｏｎｅは、ｖｅｇｆアンチセンス未導入の細胞、ｖｅｇｆ５’−ＡＳは、野生型ｖｅｇｆアンチセンスを導入した細胞、ｖｅｇｆ５’−ＡＳ ｍｕｔａｎｔは、変異型ｖｅｇｆアンチセンスを導入した細胞の結果である。同図に示すように、野生型ｖｅｇｆアンチセンスの導入細胞は、未導入の細胞（ｎｏｎｅ）よりも、５−ＦＵ（４０μｍｏｌ／Ｌ)処理による細胞の生存率が著しく低下した。これらの結果から、ｐ５３ｍＲＮＡと相互作用するｖｅｇｆ ＩｒｅｓＲＮＡの領域は、アンチセンスとして使用することにより、ｐ５３ｍＲＮＡ分解を防ぎ、抗がん剤による細胞死を誘導するのに有用であることが明らかとなった。前記アンチセンスは、本発明のｐ５３結合阻害剤として、また、ｐ５３発現促進剤として使用できる。
以上のように、本発明によれば、ｖｅｇｆ−Ａ遺伝子のエキソン１から転写されるＲＮＡと、ｐ５３ｍＲＮＡとの結合を阻害することで、ｐ５３の発現を促進できるため、これに伴って、ｐ５３に依存して転写されるアポトーシスに関与する遺伝子の転写を促進できる。このため、最終的には、目的の細胞のアポトーシスの進行を促進することができる。特に、医療分野においては、腫瘍の悪性化の予防やがんの治療に、細胞のアポトーシスが利用されることから、本発明は、がん等の治療において有用な手段になるといえる。また、ｐ５３の発現量が低下した腫瘍細胞においては、抗がん剤に対する感受性が低下し、抗がん剤耐性を示すことが知られている。しかしながら、本発明によれば、細胞の抗がん剤に対する感受性を亢進することができるため、従来公知の抗がん剤を効率良く作用させることも可能となる。以上のように、本発明は、がん等の治療をはじめとする医療分野において、極めて優れた手法といえる。

Claims (13)

  1. ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏまたは非ヒト動物において、がん細胞におけるｐ５３遺伝子の発現を促進する方法であって、
    結合阻害剤として、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスおよびデコイ核酸からなる群から選択された少なくとも一つを用いて、ｖｅｇｆ−Ａ遺伝子のエキソン１から転写されるＲＮＡと、ｐ５３遺伝子から転写されるｍＲＮＡとの結合を阻害することにより、ｐ５３遺伝子の発現を促進し、
    前記ｓｉＲＮＡおよび前記アンチセンスが、ｖｅｇｆ−Ａ遺伝子から転写されるＲＮＡのうち下記（１）〜（１３）からなる群から選択された少なくとも一つをターゲットするｓｉＲＮＡおよびアンチセンスであり、
    前記デコイ核酸が、下記（Ｄ１）〜（Ｄ５）および（Ｄ８）からなる群から選択された少なくとも一つの核酸であることを特徴とするｐ５３発現促進方法。
    （１）配列番号１における６００番目−８７９番目の配列
    （２）配列番号１における６５９番目−８７９番目の配列
    （３）配列番号１における６５９番目−７８０番目の配列
    （４）配列番号１における６５９番目−７５２番目の配列
    （５）配列番号１における６５９番目−７４５番目の配列
    （６）配列番号１における６９４番目−７１４番目の配列
    （７）配列番号１における６９３番目−７１４番目の配列
    （８）配列番号１における６９１番目−７０３番目の配列
    （９）配列番号１における７１１番目−７２３番目の配列
    （１０）配列番号１における１６番目−７８０番目の配列
    （１１）配列番号１における６５９番目−９１７番目の配列
    （１２）配列番号１における５２６番目−１１０４番目の配列
    （１３）配列番号４５における５２６番目−１２１６番目の配列
    （Ｄ１）配列番号２における４６２番目−４８１番目の配列からなるＲＮＡ、または、前記配列において、塩基ｕが塩基ｔに置換された配列からなるＤＮＡ
    （Ｄ２）配列番号２における４６２番目−４８２番目の配列からなるＲＮＡ、または、前記配列において、塩基ｕが塩基ｔに置換された配列からなるＤＮＡ
    （Ｄ３）配列番号２における４６２番目−４９１番目の配列からなるＲＮＡ、または、前記配列において、塩基ｕが塩基ｔに置換された配列からなるＤＮＡ
    （Ｄ４）配列番号２における４６２番目−５０５番目の配列からなるＲＮＡ、または、前記配列において、塩基ｕが塩基ｔに置換された配列からなるＤＮＡ
    （Ｄ５）配列番号２における２５２番目−５５１番目の配列からなるＲＮＡ、または、前記配列において、塩基ｕが塩基ｔに置換された配列からなるＤＮＡ
    （Ｄ８）前記（Ｄ１）〜（Ｄ５）からなる群から選択された少なくとも一つの核酸において、１若しくは数個の塩基が、置換、欠失、挿入または付加された塩基配列からなり、かつ、ｖｅｇｆ−Ａ遺伝子のエキソン１から転写されたＲＮＡに結合可能である核酸
  2. 前記ターゲットが、前記ｖｅｇｆ−Ａ遺伝子のエキソン１から転写される５’ＵＴＲ ＲＮＡである、請求項１記載のｐ５３発現促進方法。
  3. 前記ターゲットが、前記５’ＵＴＲ ＲＮＡにおける配列番号１の６００番目−８７９番目の配列またはその一部である、請求項２記載のｐ５３発現促進方法。
  4. 前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖が、下記（＃１）〜（＃１７）からなる群から選択された少なくとも一つである、請求項１から３のいずれか一項に記載のｐ５３発現促進方法。
    ＃１ 5’−agcaaggcaaggcuccaaugcnn−3’（配列番号４）
    ＃２ 5’−agagcagcaaggcaaggcuccnn−3’（配列番号６）
    ＃３ 5’−cacgaccgcuuaccuuggcaunn−3’（配列番号８）
    ＃４ 5’−uagcacuucucgcggcuccgcnn−3’（配列番号１０）
    ＃５ 5’−cgagcuagcacuucucgcggcnn−3’（配列番号１２）
    ＃６ 5’−uggacgaaaaguuucagugcgacgcnn−3’（配列番号１４）
    ＃７ 5’−agaaguuggacgaaaaguuucagugnn−3’（配列番号１６）
    ＃８ 5’−gaaguuggacgaaaaguuucagugcnn−3’（配列番号１８）
    ＃９ 5’−ggacgaaaaguuucagugcgacgccnn−3’（配列番号２０）
    ＃１０ 5’−uuggacgaaaaguuucagugcgacgnn−3’（配列番号２２）
    ＃１１ 5’−agaaguuggacgaaaaguuucagugnn−3’（配列番号６１）
    ＃１２ 5’−aguuucagugcgacgccgcgagcccnn−3’（配列番号６３）
    ＃１３ 5’−gaagcgagaacagcccagaaguuggnn−3’（配列番号６５）
    ＃１４ 5’−agcaaggcaaggcuccaaugcacccnn−3’（配列番号６７）
    ＃１５ 5’−agagcagcaaggcaaggcuccaaugnn−3’（配列番号６９）
    ＃１６ 5’−cgagcuagcacuucucgcggcuccgnn−3’（配列番号７１）
    ＃１７ 5’−cgcggaccacggcuccuccgaagcgnn−3’（配列番号７３）
  5. 前記アンチセンスが、下記（Ｄ６）〜（Ｄ８）からなる群から選択された少なくとも一つの核酸である、請求項１から３のいずれか一項に記載のｐ５３発現促進方法。
    （Ｄ６）配列番号１における６９４番目−７１４番目の配列に相補的な配列からなるＲＮＡ、または、前記配列において、塩基ｕが塩基ｔに置換された配列からなるＤＮＡ
    （Ｄ７）配列番号１における６９３番目−７１４番目の配列に相補的な配列からなるＲＮＡ、または、前記配列において、塩基ｕが塩基ｔに置換された配列からなるＤＮＡ
    （Ｄ８）前記（Ｄ６）または（Ｄ７）の核酸において、１若しくは数個の塩基が、置換、欠失、挿入または付加された塩基配列からなり、かつ、ｖｅｇｆ−Ａ遺伝子のエキソン１から転写されたＲＮＡに結合可能である核酸
  6. 前記アンチセンスが、配列番号７４の配列からなるＤＮＡであり、前記デコイ核酸が、配列番号９３の配列からなるＤＮＡである、請求項１記載のｐ５３発現促進方法。
  7. ｖｅｇｆ−Ａ遺伝子のエキソン１から転写されるＲＮＡと、ｐ５３遺伝子から転写されるｍＲＮＡとの結合を阻害する結合阻害剤として、ｓｉＲＮＡ、アンチセンス、デコイ核酸およびこれらをコードするＤＮＡが挿入された発現ベクターからなる群から選択された少なくとも一つを含み、
    前記ｓｉＲＮＡおよび前記アンチセンスが、ｖｅｇｆ−Ａ遺伝子から転写されるＲＮＡのうち下記（１）〜（１３）からなる群から選択された少なくとも一つをターゲットするｓｉＲＮＡおよびアンチセンスであり、
    前記デコイ核酸が、下記（Ｄ１）〜（Ｄ５）および（Ｄ８）のデコイ核酸
    からなる群から選択された少なくとも一つの核酸であることを特徴とするｐ５３発現促進剤。
    （１）配列番号１における６００番目−８７９番目の配列
    （２）配列番号１における６５９番目−８７９番目の配列
    （３）配列番号１における６５９番目−７８０番目の配列
    （４）配列番号１における６５９番目−７５２番目の配列
    （５）配列番号１における６５９番目−７４５番目の配列
    （６）配列番号１における６９４番目−７１４番目の配列
    （７）配列番号１における６９３番目−７１４番目の配列
    （８）配列番号１における６９１番目−７０３番目の配列
    （９）配列番号１における７１１番目−７２３番目の配列
    （１０）配列番号１における１６番目−７８０番目の配列
    （１１）配列番号１における６５９番目−９１７番目の配列
    （１２）配列番号１における５２６番目−１１０４番目の配列
    （１３）配列番号４５における５２６番目−１２１６番目の配列
    （Ｄ１）配列番号２における４６２番目−４８１番目の配列からなるＲＮＡ、または、前記配列において、塩基ｕが塩基ｔに置換された配列からなるＤＮＡ
    （Ｄ２）配列番号２における４６２番目−４８２番目の配列からなるＲＮＡ、または、前記配列において、塩基ｕが塩基ｔに置換された配列からなるＤＮＡ
    （Ｄ３）配列番号２における４６２番目−４９１番目の配列からなるＲＮＡ、または、前記配列において、塩基ｕが塩基ｔに置換された配列からなるＤＮＡ
    （Ｄ４）配列番号２における４６２番目−５０５番目の配列からなるＲＮＡ、または、前記配列において、塩基ｕが塩基ｔに置換された配列からなるＤＮＡ
    （Ｄ５）配列番号２における２５２番目−５５１番目の配列からなるＲＮＡ、または、前記配列において、塩基ｕが塩基ｔに置換された配列からなるＤＮＡ
    （Ｄ８）前記（Ｄ１）〜（Ｄ５）からなる群から選択された少なくとも一つの核酸において、１若しくは数個の塩基が、置換、欠失、挿入または付加された塩基配列からなり、かつ、ｖｅｇｆ−Ａ遺伝子のエキソン１から転写されたＲＮＡに結合可能である核酸
  8. 前記ターゲットが、前記ｖｅｇｆ−Ａ遺伝子のエキソン１から転写される５’ＵＴＲ ＲＮＡである、請求項７記載のｐ５３発現促進剤。
  9. 前記ターゲットが、前記５’ＵＴＲ ＲＮＡにおける配列番号１における６００番目−８７９番目の配列またはその一部である、請求項８記載のｐ５３発現促進剤。
  10. 前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖が、下記（＃１）〜（＃１７）からなる群から選択された少なくとも一つである、請求項７から９のいずれか一項に記載のｐ５３発現促進剤。
    ＃１ 5’−agcaaggcaaggcuccaaugcnn−3’（配列番号４）
    ＃２ 5’−agagcagcaaggcaaggcuccnn−3’（配列番号６）
    ＃３ 5’−cacgaccgcuuaccuuggcaunn−3’（配列番号８）
    ＃４ 5’−uagcacuucucgcggcuccgcnn−3’（配列番号１０）
    ＃５ 5’−cgagcuagcacuucucgcggcnn−3’（配列番号１２）
    ＃６ 5’−uggacgaaaaguuucagugcgacgcnn−3’（配列番号１４）
    ＃７ 5’−agaaguuggacgaaaaguuucagugnn−3’（配列番号１６）
    ＃８ 5’−gaaguuggacgaaaaguuucagugcnn−3’（配列番号１８）
    ＃９ 5’−ggacgaaaaguuucagugcgacgccnn−3’（配列番号２０）
    ＃１０ 5’−uuggacgaaaaguuucagugcgacgnn−3’（配列番号２２）
    ＃１１ 5’−agaaguuggacgaaaaguuucagugnn−3’（配列番号６１）
    ＃１２ 5’−aguuucagugcgacgccgcgagcccnn−3’（配列番号６３）
    ＃１３ 5’−gaagcgagaacagcccagaaguuggnn−3’（配列番号６５）
    ＃１４ 5’−agcaaggcaaggcuccaaugcacccnn−3’（配列番号６７）
    ＃１５ 5’−agagcagcaaggcaaggcuccaaugnn−3’（配列番号６９）
    ＃１６ 5’−cgagcuagcacuucucgcggcuccgnn−3’（配列番号７１）
    ＃１７ 5’−cgcggaccacggcuccuccgaagcgnn−3’（配列番号７３）
  11. 前記アンチセンスが、下記（Ｄ６）〜（Ｄ８）からなる群から選択された少なくとも一つの核酸である、請求項７から９のいずれか一項に記載のｐ５３発現促進剤。
    （Ｄ６）配列番号１における６９４番目−７１４番目の配列に相補的な配列からなるＲＮＡ、または、前記配列において、塩基ｕが塩基ｔに置換された配列からなるＤＮＡ
    （Ｄ７）配列番号１における６９３番目−７１４番目の配列に相補的な配列からなるＲＮＡ、または、前記配列において、塩基ｕが塩基ｔに置換された配列からなるＤＮＡ
    （Ｄ８）前記（Ｄ６）または（Ｄ７）の核酸において、１若しくは数個の塩基が、置換、欠失、挿入または付加された塩基配列からなり、かつ、ｖｅｇｆ−Ａ遺伝子のエキソン１から転写されたＲＮＡに結合可能である核酸
  12. 前記アンチセンスが、配列番号７４の配列からなるＤＮＡであり、前記デコイ核酸が、配列番号９３の配列からなるＤＮＡである、請求項７記載のｐ５３発現促進剤。
  13. ｐ５３の発現を促進する発現促進剤のスクリーニング方法であって、
    下記（Ａ）工程〜（Ｃ）工程を有することを特徴とするスクリーニング方法。
    （Ａ） 候補物質の存在下、配列番号１に示すｖｅｇｆ−Ａ ｍＲＮＡにおける６９４番目−７１４番目の配列からなるｐ５３ｍＲＮＡ結合剤と、配列番号２に示すｐ５３ ｍＲＮＡにおける４６２番目−４８１番目の配列からなるｖｅｇｆ−Ａ ＲＮＡ結合剤とを接触させる工程
    （Ｂ） 前記候補物質による、前記ｐ５３ｍＲＮＡ結合剤と前記ｖｅｇｆ−Ａ ＲＮＡ結合剤との結合の阻害を検出する工程
    （Ｃ） 前記ｐ５３ｍＲＮＡ結合剤と前記ｖｅｇｆ−Ａ ＲＮＡ結合剤との結合を阻害した候補物質を、ｐ５３発現促進剤として選択する工程。
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