JP2008531646A - 血管新生依存性腫瘍を治療するためのデフィブロチドおよび／またはオリゴデオキシリボヌクレオチド - Google Patents

Abstract

デフィブロチドおよび/または4000-10000ダルトンの分子量を有するオリゴデオキシリボヌクレオチドを抗腫瘍薬として、単独または抗腫瘍作用を有する他の活性成分との組み合わせで使用する方法、が示されている。オリゴチドは、動物および/または植物の組織から、特に哺乳動物の器官からの抽出により作成されうる、あるいは、合成的に作成されうる。治療されうる腫瘍は、好ましくは、多発性骨髄腫または乳がんのような血管新生依存性の腫瘍である。

Description

本発明の主題は、有効な量のデフィブロチド（defibrotide）および/またはオリゴチド（oligotide）を投与することにより、腫瘍に冒された哺乳動物を治療する方法である。特に、血管新生依存性の腫瘍を治療するためにデフィブロチドおよび/またはオリゴチドを使用する方法に関する。

血管新生は、先在の血管系から新規血管を形成することをもたらす多段階の過程であり、初期段階の腫瘍の成長、侵襲性および転移の進行にとって必要である（２０）。血管新生は成体では通常抑制されており、再生、成長および創傷治癒の間だけ一時的に起こるものである。新血管形成がない状況では腫瘍は、臨界体積を超えて、さらなる拡大をすることができない（１２）。これを進展させるために、腫瘍は正（血管新生促進）と負（血管新生抑制）の調節因子の間の正味の平衡の結果である血管新生の表現型を獲得しなければならない（１６）。しかしながら、腫瘍は、血管構築、分化、および機能的な血液供給において非常に異質である（２４）。無血管性の血管新生前の腫瘍の大きさにおけるこれらの差は、低酸素状態のさまざまな程度の条件下で生存することを可能とする腫瘍細胞の能力に部分的によるものかもしれない（１８）。

多発性骨髄腫、また非固形の白血病およびリンパ腫（８）および（２１）、さらには乳房（２５）、大腸（７）、胃（２６）、前立腺（９）、頸部（１９）、肝細胞（２３）、および非小細胞肺癌（１３）でさえ或る種の腫瘍の血管新生依存性の証拠は、血管新生の程度（微小血管密度）の測定が、記載された臨床施設における生存のための独立的な予後因子である、という観察からきている（１７）。最近の臨床研究では、再び乳がんについて、例えば血管内皮細胞増殖因子 VEGF、VEGF受容体 FLT1、およびメタロプロテイナーゼ MMP9の血管新生関連遺伝子は臨床結果にとって重要であるということが明らかとなった（６）。

定義
本明細書中では、語オリゴチドは、4000-10000ダルトンの分子量を有する任意のオリゴデオキシリボヌクレオチドを指すために用いられる。好ましくは、それは、以下の分析パラメーターを有する任意のオリゴデオキシリボヌクレオチドを指す。
分子量（mw）：4000-10000ダルトン、
濃色効果（h）：＜１０、
A+T/C+G：1.100-1.455、
A+G/C+T：0.800-1.160、
比旋光度： +30°− +46.8°、好ましくは +30°− +46.2°
オリゴチドは、動物および/または植物の組織から、特に、哺乳動物の器官からの抽出により作成されうる、あるいは合成的に作成されうる。好ましくは、抽出により作成されるときは、引用することにより本明細書に組み入れられる（１）、（２）、および（３）に記載された方法に従ってそれは得られる。オリゴチドは、顕著な抗虚血活性を持っているとして知られている。

語デフィブロチドは、動物および/または植物の組織からの抽出により得られるだけでなく、合成的にも作成されうるポリデオキシリボヌクレオチドを指す；ポリデオキシヌクレオチドは通常はアルカリ金属塩（一般的には塩化ナトリウム）の形態で用いられ、一般的には約45-50ｋDaの分子量を有する（CAS登録番号：83712-60-1）。好ましくは、デフィブロチドは、引用することにより本明細書に組み入れられる（４）および（５）に記載された物理的/化学的特徴を提示する。

我々は、最近、腫瘍血管新生の代替的な経路のモデルを開発した。先在血管系から生じる内皮細胞に加えて、我々は血液由来の内皮細胞もが腫瘍血管系を生じさせうることを提案する。これらの内皮様の細胞（ELC）は特定の培養条件下では腫瘍関連の樹状細胞から分化転換することができる（１１）。簡単に言えば、単球が、健康なヒト血液供与者の白血球アフェレーシス産物から傾しゃされ、樹状細胞（DC）分化を刺激するために顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）およびインターロイキン４（IL-4）の存在下で培養される。加えて、これらの細胞は、腫瘍関連の樹状細胞（TuDC）の増殖を促進するために、腫瘍細胞により特異的に放出されたカクテル（M-CSF、IL.6および乳酸、Gottfriedら、既提出原稿）で処理される。

これらのTuDC-ELCは、単球マーカー（CD14）と樹状細胞マーカー（CD1a）を失いながら、内皮細胞の表現型（第8因子に関連した抗原、ｖWF（フォンヴィレブランド因子））を獲得する。重要なことに、それらが本当の分化転換産物であることおよび循環内皮前駆細胞（CD34、CD133）または成熟循環内皮細胞（CD146）のいずれの混入物でもないことを示すCD34、CD133またはCD146を、それらが発現しない。加えて、それらは、血管新生のインビトロ分析であるMatrigel（商標）中で管状構造を形成することができる。

Matrigel（商標）分析は、インビトロ血管新生分析では最もよく知られているもののひとつであり、かつ、幅広く用いられている（２２）。Matrigel（商標）は、血管の内皮細胞壁の直下に生理的に存在するマトリックスを模倣した細胞外のマトリックスタンパク質の半固体の合成混合物である。顕微鏡のチャンバースライド中の本マトリックス上に問題の細胞が植え付けられると、それらは活性化され管状構造を3-7日中に形成するが、それらが内皮表現型を有する場合のみそうである。従って、本分析は、腫瘍血管系を生じさせる細胞の潜在的な能力を示すのに適している。

我々のデータは、オリゴチドおよび/またはデフィブロチドが臨床的および亜臨床的な濃度において、マトリゲル（商標）中で分化転換しているELC（TuDC-ELC）の管形成を阻害することができることを示す。TuDC-ELCおよび成熟した分化した内皮細胞、[“安定な”対照としてヒト臍帯静脈細胞（HUVEC）または微小血管内皮細胞（HMEC）]がオリゴチドまたはデフィブロチド（それぞれ10 μg/ml）の存在下または不存在下で７日間温置された。重要なことに、デフィブロチドの単独添加後、HUVECおよびHMECはそれらの管形成能が影響されることはなく、これはデフィブロチドおよび/またはオリゴチドが分化転換している内皮細胞のみを標的としていることを示す（図１A）。しかしながら、デフィブロチドが繰り返して添加されたときには、それは、成熟した完全に分化した内皮細胞の血管新生もブロックすることができた（以下を参照）。

NIHが提供している無料のソフトウェアの助けを借りて（Image J、http://rsb.info.nih.gov/ij/）、我々はこれらの影響を定量化することができ、管の全長および写真の面積が算定され、次に微小血管密度（MVD）が全長/面積[pix^-1]として与えられる。DFはTuDC-ELCのMVDを有意に（p=0.02、TTEST）抑制する（図１B）。

他の血管新生分析によりこれらのデータを裏づけるために、DFが毎日投与されたときに、Matrigel（商標）中でのラット大動脈内皮細胞の発芽がほぼ100%で抑えられてたが、これはDFが分化転換に作用するだけでなく、成熟し完全に分化した内皮細胞にも作用することを示している。

大動脈リング分析は、大血管の内皮細胞を調査する。しかし、しばしば腫瘍血管系は微小血管内皮細胞から成る。従って、第３のインビトロ血管新生分析が、9-11日の培養後の皮膚線維芽細胞層を通じて血管新生する微小血管内皮細胞に基づいて行われた。これらの血管様構造は、その後CD３１およびｖWFの染色により視覚化されうる。

図３（AおよびB）に示されたように、DFは毎日投与の優位性を有してヒト微小血管内皮細胞の血管新生をブロックすることもできる。興味深いことに、10 μg/ml前後の濃度が最も効果的であるように見える。DFの１回投与では血管新生を有意にブロックすることはできない。

総合すると、我々のデータは、デフィブロチドおよび/またはオリゴチドは、腫瘍関連の分化転換している内皮細胞の血管新生およびすでに存在している血管系の細胞から生じる血管新生をブロックできることを、強く示している。

オリゴチドおよびデフィブロチドがインビボでも血管新生を阻害するかどうかが、進行中の研究の主題である。我々は現在、高度に血管新生がなされたヒト胃癌マウスモデル（異種移植系）でのデフィブロチドの効果を調査する背部皮膚チャンバー分析（１４）を行っている。最初のデータは、DF処理をされた腫瘍の微小血管密度（MVD）は、対照腫瘍のそれよりも低いということを明白に示している。この一連の実験はしかるべき時に再現されうる。

DFが血管新生をブロックできる作用の機構は依然として明らかにされていないが、ウェスタンブロット分析からの予備的な証拠は、マイトーゲン活性化されたタンパク質キナーゼである活性化されたp70S6キナーゼ（p-p70S6）に対してDFが制御する効果を示している。

p70S6キナーゼの影響の付加的な証拠が、p70S6キナーゼ阻害剤DRBの存在下または不存在下で温置されたHMEを用いることを伴う別の管形成分析から得られた。

同種幹細胞移植（SCT）を受けた患者（ｐｔｓ.）について利用できる最初の臨床データもある：１７のデフィブロチド処置を受けた患者のコホートにおいて、血清VEGF水準の著しい減少が見られ、これはまたデフィブロチドが腫瘍内皮細胞の発芽に対して増殖因子除去を通じて作用しうることを示している。

デフィブロチドおよびオリゴチドは、血管新生依存性の腫瘍の治療にとって強力な候補であり、そして、単独またはラパマイシン（１４）のような他の抗血管新生薬剤との組み合わせで用いられうる。興味深いことに、ラパマイシンは、抗血栓性および線維素溶解性のデフィブロチドの同時使用により弱められうるプロトロンビン活性（１５）の負の副作用を有する。

[参考文献]
１．米国特許第5646127号明細書
２．米国特許第5646268号明細書
３．米国特許第6046172号明細書
４．米国特許第4985552号明細書
５．米国特許第5223609号明細書

オリゴチドおよびDFがELCの管形成を阻害するが、HMECまたはHUVECの管形成は阻害しないことを示す写真である。 DFが管形成を阻害するが、TuDC-ELCの分化転換は阻害しないことを示す写真およびグラフである。 DFが大動脈リング分析においてEC発芽を防ぐことを示す写真およびグラフである。 DFがAngioKit（商標）分析において、ヒト微小血管内皮細胞の血管新生を防ぐことを示す写真である。 DFがAngioKit（商標）分析において、ヒト微小血管内皮細胞の血管新生を防ぐことを示すグラフである。

Claims (14)

1. 血管新生依存性の腫瘍の治療のための医薬製剤の製造のために、デフィブロチドおよび/または4000-10000ダルトンの分子量を有するオリゴデオキシリボヌクレオチドを使用する方法。
2. 該オリゴデオキシリボヌクレオチドが以下の分析パラメーターを有することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
   h（濃色効果） ＜１０
   A+T/C+G：1.100-1.455
   A+G/C+T：0.800-1.160
   比旋光度： +30°− +46.8°
3. 比旋光度が+30°および+46.2°の間にあることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
4. 該オリゴデオキシリボヌクレオチドおよび/またはデフィブロチドが、動物および/または植物の組織から、好ましくは哺乳動物の器官からの抽出により得られることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
5. 該オリゴデオキシリボヌクレオチドおよび/またはデフィブロチドが、合成的に得られることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
6. 該血管新生依存性の腫瘍が多発性骨髄腫であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
7. 該血管新生依存性の腫瘍が乳がんであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
8. 該製剤が哺乳動物に投与されるものであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
9. 該哺乳動物がヒトであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
10. 該製剤が静脈から投与されるものであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
11. 該製剤が水溶液であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
12. 該製剤が抗腫瘍作用を有する少なくとも１の他の活性成分を含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
13. 抗腫瘍作用を有する該他の活性成分が、ラパマイシン、パクリタキセル、モノクロタリン、BCNU、および/またはシクロホスファミドから選択されることを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
14. 該製剤が慣用の賦形剤および/または助剤を含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。

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