JP2008527977A - ２型糖尿病に関連する新規遺伝子とマーカー - Google Patents

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Abstract

２型糖尿病（Ｔ２Ｄ）に対する疾患感受性や素因及びＴ２Ｄの副診断と関連する遺伝子、ＳＮＰマーカー及びハプロタイプを開示する。Ｔ２Ｄリスク遺伝子に存在する多型を用いた診断方法、及び臨床経過やＴ２Ｄに対する治療の効果を予測するための方法も開示する。本発明の遺伝子、遺伝子産物及び薬剤は、Ｔ２Ｄの予防や治療の効果をモニタリングするのにも有用である。Ｔ２Ｄの診断、治療の選択及び予後判定を行うためのキットも提供する。

Description

本発明は、糖尿病（ＤＭ）の診断の分野に関する。より詳細には、本発明は、２型糖尿病（Ｔ２Ｄ）の素因、発症傾向や感受性を診断又は判定するための方法を提供する。特に本発明は、試験する対象生物から得た生物学的サンプルを提供し、そして生物学的サンプルから、ゲノム上の１種又は数種の一塩基多型（ＳＮＰ）マーカーの存在又は不存在を検出することを包含する方法に関する。更に本発明は、Ｔ２Ｄを発症する確率を提供するスコアを構築するために、遺伝的情報及び表現型の情報に加えて、アンケートで得られた情報をも使用する。また、本発明は、この方法を実施するためのキットを提供する。このキットは、治療的及び予防的介入（例えば、食事についての助言）を行う対象を決めるためのみならず、治験薬や他の介入方法に関する臨床試験の対象を層化するための、Ｔ２Ｄの病因論に基づく診断に使用することができる。このキットは、Ｔ２Ｄの臨床経過及び治療の効力を予測するために用いることもできる。
Ｔ２Ｄの公衆衛生における重要性
「糖尿病（ＤＭ）」（ＩＣＤ／１０コード：Ｅ１０〜Ｅ１４）とは、高血糖症を特徴とする、炭水化物代謝異常に伴う複数の症候群の総称である。糖尿病は、インスリン分泌の相対的な又は絶対的な損失と共に、インスリンの作用に対する種々の末梢抵抗値に関連している。糖尿病の慢性高血糖症は、様々な器官、特に目、腎臓、神経、心臓及び血管の、長期にわたる損傷、機能不全及び障害を特徴とする（ADA, 2003）。Ｔ２Ｄは、成人で発症するインスリン抵抗性と血中糖濃度の上昇を特徴とする。
２０００年には、世界中で約１億７，１００万人が糖尿病であった。糖尿病患者の数は、今後２５年間で２倍を超え、２０３０年までに３億６，６００万人に達すると予想される（WHO/IDF, 2004）。この増加の大部分が、発展途上国における糖尿病患者数の１５０％の増加の結果であろう。このことは、高カロリー摂取や座りがちなライフスタイルなどの、比較的現代的な環境や行動に伴う危険因子の役割を示唆している。しかし、Ｔ２Ｄの発生率と有病率における人種差と、Ｔ２Ｄの家族性集積は、遺伝的危険因子が主要な役割を果たすことを示唆している。米国では、１、５００万人以上が糖尿病であり、１、５００万人が耐糖能異常である。年間１００万人に近いアメリカ人が糖尿病を発症している。
糖尿病有病率の世界中での増加に繋がる２つの主な要因は、とりわけ発展途上国における、結果として肥満の増加をもたらす高齢化と都市化である（WHO/IDF, 2004）。現在、１０億人以上の成人が過体重であり、そのうちの少なくとも３億人が臨床的に肥満である。現在の肥満率は、中国、日本及び一部のアフリカ諸国の５％未満から、サモア都市部の７５％超まで幅がある。肥満の有病率は、西ヨーロッパで１０〜２５％、アメリカ大陸では２０〜２７％である（WHO, 2004）。
２０００年には、３２０万人が糖尿病に関連した合併症で死亡した。糖尿病は、ほとんどの国で早期疾患と早死の主要原因の１つとなっており、これは主として心血管障害（ＣＶＤ）の危険度の増加によるものである。糖尿病は失明、四肢等の切断及び腎不全の主な原因である。こうした合併症は、糖尿病による社会的且つ経済的負担の大きな原因である（WHO/IDF, 2004）。
Ｔ２Ｄの慢性的性質、その合併症の重篤性及びその抑制に必要な手段ゆえに、患者個人やその家族にとってだけでなく、保健機関にとっても、糖尿病は費用のかかる病気である。米国では、糖尿病に起因する直接及び間接医療費は、２００２年には１，３２０億ドルと概算された。直接医療費だけでも合計で９１８億ドルになり、その内訳は、糖尿病治療のための２３２億ドル、糖尿病に起因する慢性合併症のための２４６億ドル、及び過度に発症する一般的病状のための４４１億ドルである。糖尿病に起因する労働損失日数、活動制限日数、死亡数及び不可逆的障害に起因する間接医療費は、合計で３９８億ドルになる（ADA, 2003）。
ＤＭの分類
新しい病因学的分類によれば、ＤＭは以下の４つのカテゴリーに区別される：１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）、２型糖尿病（Ｔ２Ｄ）、他の特定の型の糖尿病、及び妊娠糖尿病である（ADA, 2003）。米国、カナダ及びヨーロッパにおいては、糖尿病の症例のうちの８０％超がＴ２Ｄ、５〜１０％がＴ１Ｄ、そして残りが他の特定の原因による糖尿病である。
以前はインスリン依存型（ＩＤＤＭ）と呼ばれていたＴ１Ｄにおいては、生命維持に必要なインスリンを膵臓が産生することができない。この型の糖尿病は、幼児期と青年期に最も頻繁に発症するが、それ以降に診断される例が増えつつある。以前はインスリン非依存型（ＮＩＤＤＭ）と呼ばれていたＴ２Ｄは、膵臓の産生したインスリンの作用に生体が適切に応答できないことが原因である。Ｔ２Ｄは成人期に最も頻繁に発症するが、青年期の発症も増加している（WHO, 2004）。
Ｔ２Ｄの病態生理学
Ｔ２Ｄの原因は多因子的であり、ベータ細胞の機能と組織（筋肉、肝臓、脂肪組織、膵臓）のインスリン感受性に影響を及ぼす遺伝的成分と環境成分の両方が含まれる。ベータ細胞の機能不全とインスリン感受性の低下が糖尿病の病因に与える相対的な影響についてはかなりの議論がなされているが、これら２つの因子が共に重要な役割を担うという見解で一般的には合意に達している（Scheen AJ, 2003）。
インスリン耐性
Ｔ２Ｄにおいて生じる最初の障害はインスリン耐性であると考えられ、糖尿病の症状、即ち、診断に充分な高い血中グルコース濃度、が表れる何年も前に始まる（Martin BC et al, 1992）。インスリン耐性は身体の末梢細胞（主として筋肉細胞と脂肪細胞）及び肝臓で生じる。これは環境因子のみならず、遺伝的因子（後述する）によって起こるものである。環境因子には、年齢、座りがちな生活習慣と中心性肥満が含まれる。
通常、インスリンシグナル伝達は、インスリンが対応する細胞表面受容体タンパク質に結合し、受容体に固有のチロシンキナーゼ活性を活性化することで進行する（Saltiel AR and Kahn CR, 2001）。活性化した受容体キナーゼは、次に、細胞内のタンパク質基質のチロシン残基をリン酸化する。チロシンリン酸化インスリン受容体基質タンパク質は連結部位として機能し、そこに、細胞内シグナル伝達タンパク質複合体の形成においてアダプターとして働く他の細胞内伝達分子を結合する。このようなシグナル伝達複合体の下流では、グルコースと脂質の代謝や細胞成長に対するインスリンの種々の細胞作用が刺激される。
最近の研究によって、過度の過脂肪症はインスリンの正常な細胞作用に影響を与え、インスリン耐性の一因となるという特異的なメカニズムが報告された。脂肪組織の放出する因子の中でも遊離脂肪酸（ＦＦＡ）の値は、内臓脂肪組織の増加したヒトにおいて上昇している（Boden G, 2001、Shulman GI, 2000）。長時間にわたってＦＦＡ値が上昇したままだと、ＦＦＡは骨格筋組織と肝臓とにおけるインスリン作用に直接作用し、骨格筋組織によるグルコースの取り込みの促進と肝臓からの糖放出の抑制というインスリンに対する正常な応答を減少させる（Boden G, 2001、Shulman GI, 2000）。これら２つの組織において、ＦＦＡはアシルＣｏＡ誘導体の細胞レベルを上昇させ、これは、インスリン受容体の正常なチロシンリン酸化カスケードに対抗するセリンキナーゼと呼ばれる細胞シグナル分子の活性増加につながる（Zick Y, 2001）。肥満症の生物において異所性脂肪（即ち、良性貯蔵脂肪としてではなく、標的臓器そのものに蓄えられるトリグリセリド）として生じる細胞内脂質貯蔵の増加は、正常なインスリンシグナル伝達に影響を与えることのできる、細胞内アシルＣｏＡ分子の別の重要な源である（Ravussin E and Smith SR, 2002）。
重要な炎症性メディエーターであるインターロイキン−６（ＩＬ−６）と腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）を含む、脂肪組織の分泌する他のタンパク質は、肝臓及び筋肉におけるエネルギー代謝とインスリン感受性に悪影響を及ぼし、肥満症におけるインスリン耐性の発症に重要な役割を担う（Dandona P et al, 2004）。アジポネクチンは、脂肪組織のみが分泌する、最近発見された血漿タンパク質である。内臓肥満症において血漿濃度が増加するＴＮＦαやＦＦＡとは異なり、アジポネクチンの濃度は、肥満症の生物において低下する（Berg AH et al, 2002）。アジポネクチンの生理学的機能の研究によって、それはインスリン作用を増強し、インスリン感受性を高めるだけでなく、血管内皮に対する抗炎症性保護作用を有するという証拠が得られた。アジポネクチンはＦＦＡ、グルコース及びトリグリセリドの血漿クリアランスを上昇させ、肝臓によるグルコース産生を抑制する（Berg AH et al, 2002）。肝臓、骨格筋及び脂肪組織におけるアジポネクチン作用のメカニズムには、アデノシン一リン酸活性化キナーゼ（ＡＭＰキナーゼ）（即ち、骨格筋によるインスリン依存性のグルコースの取り込みと、メトフォルミン作用の細胞メカニズムに関連するシグナル伝達キナーゼ）が関与することが示されている（Wu X et al, 2001、Yamauchi T et al, 2002、Tomas E et al, 2002）。更に、インスリン耐性とメタボリック症候群に対する内臓脂肪の影響と符合するように、アジポネクチンの循環濃度の制御は網嚢脂肪組織レベルで行われるようであり、皮下脂肪レベルで行われるわけではない（Motoshima H et al, 2002）。
インスリン欠乏症
インスリン耐性が生じると、それを補い、正常な身体機能に必要な狭い範囲内に血中グルコース濃度を維持するために、ベータ細胞はインスリン産生を増加する。インスリン耐性が一定期間（通常は３〜５年）にわたって持続したり、増加したりすると、ベータ細胞は衰え始める。インスリン耐性が持続するが、インスリン分泌が低下すると、血中グルコース濃度は上昇し始め、真性糖尿病を発症する（Guthrie RA and Guthrie DW, 2004）。ベータ細胞機能の喪失パターンは、急性又は第１相のインスリン分泌における初期欠陥と、それに続く、最大インスリン分泌量の低下である。最後に、定常時及び基礎インスリン分泌に障害が発生し、インスリン処置が必要なほぼ完全なベータ細胞不全に至る。インスリン分泌とインスリン感受性が相互に影響し合う関係（reciprocal relation）にあるため、ベータ細胞機能の確かな証明には、インスリン感受性の程度が高い条件下におけるインスリン応答の解釈が必要である（Scheen AJ, 2004）。ベータ細胞機能の進行的喪失に関する証拠には、プロインスリンのインスリンへの転換反応の変化、間断的及び振動的なインスリン分泌の変化、及びインスリン放出の定量的な低下が挙げられる。これらの元となるメカニズムと考えられる現象には、グルコース毒性、脂質毒性、増加した分泌要求に対する不十分な耐性、そしてベータ細胞塊の縮小が含まれる（Buchanan TA, 2003）。糖尿病における様々な種類の細胞、特にベータ細胞、の機能変化に関するグルコースと脂肪酸の役割は、「糖・脂質毒性」仮説（"glucolipotoxicity" hypothesis）にまとめられている（Prentki M et al, 2002）。この仮説は、グルコース濃度のみが高い場合には、グルコースが酸化され、ＦＦＡ濃度のみが高い場合には、グルコースの代わりにＦＦＡが酸化されるという単純な理由から、高脂血症と循環ＦＦＡ濃度の上昇のいずれか単独では細胞にとってさほど有害ではないことを示唆している。しかし、グルコース濃度とＦＦＡ濃度の両方が高い場合には、種々の細胞系の機能を進行的に変化させる可能性がある。このような条件下では、ＦＦＡ誘導性長鎖アシルＣｏＡエステル（ＦＡＣｏＡ）の値は高いが、グルコース誘導性マロニルＣｏＡの値も上昇しているためにＦＡＣｏＡを酸化することができない。マロニルＣｏＡは、脂肪酸のミトコンドリアβ−酸化の律速段階を触媒するカルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ−１（ＣＰＴ−１）に対する阻害作用によって、脂質の分配（ＦＦＡの酸化とエステル化の相対的な転変）を調節する代謝シグナル分子である。その結果、ＦＡＣｏＡは細胞質に蓄積され、例えば、ベータ細胞のアポトーシスを促進することができる。実際に、今では、Ｔ２Ｄ発症例の大部分において、ベータ細胞の有糸分裂と新生の速度を上回る程に著しく増加したベータ細胞のアポトーシスによる、ベータ細胞塊の縮小が確認されている。近年の技術発展により、インスリン受容体基質−２（ＩＲＳ−２）によるシグナル伝達とその下流のタンパク質チロシンキナーゼ２ベータ（ＰＴＫ２Ｂ）がベータ細胞の生存の制御に重要であることが明らかになった（Dickson LM and Rhodes CJ, 2004）。
Ｔ２Ｄ： 多遺伝子疾患
Ｔ２Ｄは、遺伝的感受性と環境因子の両方が主要な役割を担うことを示す家系調査によって確証されるように、遺伝形式が複雑である。Ｔ２Ｄと関連表現型については、顕著な家族性集積が認められた。一般的に、Ｔ２Ｄ患者の兄弟／姉妹（sibling）の発症危険度は、血縁のない個人の発症危険度（７％）よりも、４〜６倍高い値（３０％〜４０％）である（Florez JC et al, 2003）。二卵性双生児（ＤＺ）のペアと比べて一卵性双生児（ＭＺ）において２型糖尿病の一致率が高いことによっても、強力な遺伝的影響が示唆されている。Ｔ２Ｄは、二卵性双生児と比べて一卵性双生児において一致率がはるかに高い。十分に長い期間追跡すれば、一卵性双生児のペアの９０％でＴ２Ｄの一致が見られると報告されている（Barnett AH et al, 1981）。また、デンマークでは、一卵性双生児におけるＴ２Ｄの一致率が６３％であるのに対して、二卵性双生児では４３％であるという報告もある（Poulsen et al, 1999）。Ｔ２Ｄ、グルコース不耐性及びインスリン分泌の遺伝性は、６０〜８０％と推定された（Lowe, 2001、Lehtovirta et al, 2005）。
公知の単一因子性糖尿病は、以下の２つのカテゴリーに分類される：ベータ細胞の遺伝的欠陥と、インスリン作用の遺伝的欠陥である（ADA, 2003）。ベータ細胞機能の単一因子性欠陥と関連する型の糖尿病は、若年（一般的に２５歳未満）での高血糖症の発症を屡々特徴とする。この型の糖尿病は、若年発症成人型糖尿病（ＭＯＤＹ）と呼ばれ、インスリン作用に微小な欠陥しかないかあるいは全く欠陥がないにも拘らず、インスリン分泌に障害があることを特徴とする（Herman WH et al, 1994、Clement K et al, 1996、Byrne MM et al, 1996）。この型の糖尿病は、常染色体優性遺伝する。これまでに、異なる染色体上の３つの遺伝子座の異常が確認されている。最も一般的な型は、染色体12qにおける、肝細胞核因子（ＨＮＦ）−１αと呼ばれる肝臓転写因子の遺伝子座の変異に関連する（Vaxillaire M et al, 1995、Yamagata K et al, 1996）。第２の型は、染色体7p上のグルコキナーゼ遺伝子の遺伝子座の変異に関連しており、その結果として欠陥のあるグルコキナーゼ分子を生じる（Froguel P et al, 1992、Vionnet N et al, 1992）。グルコキナーゼはグルコースをグルコース−６−リン酸に変換し、この代謝は、次にベータ細胞によるインスリン分泌を促進する。グルコキナーゼ遺伝子の欠陥ゆえに、正常な量のインスリン分泌を誘発するためには、高い血漿グルコース濃度が必要である。第３の型は、染色体20q上のＨＮＦ−４α遺伝子の変異に関連する（Bell GI et al, 1991、Yamagata K et al, 1996）。ＨＮＦ−４αは、ＨＮＦ−１αの発現の調節に関与する転写因子である。ミトコンドリアＤＮＡの点変異によって膵臓のベータ細胞機能が損なわれることが主たる原因となりＤＭを発症することがある（Reardon W et al, 1992、van den Ouwenland JMW et al, 1992、Kadowaki T et al, 1994）。遺伝学的に決定されているインスリン作用の異常に起因する、糖尿病の珍しい病因も存在する。インスリン受容体の変異に関連する代謝異常は、高インスリン血症や中度の高血糖症から、重度の糖尿病にまで及ぶ（Kahn CR et al, 1976、Taylor SI, 1992）。
大部分の症例において、Ｔ２Ｄは遺伝因子、環境因子及び人口統計学的因子の複雑な相互作用の結果である。遺伝子解析方法、特に候補遺伝子関連研究とゲノムワイドな連鎖研究（ゲノムワイドスキャン、ＧＷＳ）、の技術発展は、Ｔ２Ｄの発症に寄与する遺伝子を集団から探索することを可能にした。
Ｔ２Ｄの発症を説明する主要な単一遺伝子は同定されていない。しかし２型糖尿病の発症の原因となる種々の代謝異常と、いくつかの感受性遺伝子（例えば、ＰＰＡＲγやＰＧＣ−１）に存在する多型部位との関連が、研究によって明らかになっている。１００種を超える候補遺伝子がＴ２Ｄとの関連について評価されたものの、多くの研究で複製されているものはほんの一握りに過ぎない。Ｔ２Ｄについては、ＰＰＡＲγの関与が多くの研究で再現されており（Deeb SS et al, 1998；Hara K et al, 2000；Altshuler D et al, 2000；Mori H et al, 2001）、ＫＣＮＪ１（Hani EH et al, 1998；Gloyn AL et al, 2001；Gloyn AL et al, 2003）、ＡＢＣＣ８（Inoue H, 1996；Hani EH et al, 1997；Hansen T et al, 1998）、ＧＣＧＲ（Hager J et al, 1995；Gough SC et al, 1995）、ＧＣＫ（Chiu KC et al, 1992；McCarthy MI et al, 1994；Takekawa K et al, 1994）及びＳＬＣ２Ａ１（Li SR et al, 1988；Tao T et al, 1995；Pontiroli AE et al, 1996）の関与が、これまでに複数の研究グループによって観察されている。未だ確証されていない最近の知見の一例が、胎児発生に必須な転写因子であるＡＲＮＴ遺伝子である（Gunton et al 2005）。
遺伝子−環境相互作用が、ＰＰＡＲＧと成人のインスリン感受性に影響する出生時体重との間（Eriksson JG et al, 2002）、及びＰＰＡＲＧと成人のＢＭＩに影響する食事による脂肪摂取との間（Luan J et al, 2001、Memisoglu A et al, 2003）に見出された。遺伝子−遺伝子相互作用も、ＰＰＡＲＧと、成人のインスリン感受性及び身体組成に影響するＦＡＢＰ４との間（Damcott CM et al, 2004）に見出された。
これまでに、Ｔ２Ｄの遺伝子座を特定するための、３０件を超えるＧＷＳ研究が報告されている。少なくとも暗示的なＬＯＤスコアを示す、Ｔ２Ｄと連鎖した遺伝子座が、全ての染色体に見られた。しかし、最も驚くべきことは、一貫して連鎖を示す遺伝子座がないことである。Demenais F et al, 2003は、出版済みの、白色人種に関する４件のゲノムワイドスキャン（ＧＩＦＴ団体（GIFT consortium）、フィンランド、スウェーデン、イギリスとフランス）に対してゲノムサーチ・メタ解析（ＧＳＭＡ）を行い、個別の研究においては連鎖の程度が中庸か有意ではないと判断された染色体 1p13.1〜q22、2p22.1〜p13.2、6q21〜q24.1、12q21.1〜q24.12、16p12.3〜q11.2 及び 17p11.2〜q22 が、Ｔ２Ｄ感受性領域であるという証拠を見つけた。この結果は、ヒトＴ２Ｄの不均質性に加えて、異なる方法を用いた研究を比較するという試みに存在しうる問題を示している。
集団遺伝学の機会
ＧＷＳ、シークエンシング技術及びデータ解析方法の発展によって、複雑且つ多因子性の性質に係る罹病性遺伝子を特定し、この疾病における遺伝的素因及び環境／生活習慣因子の役割を新たな精密さをもって分析する試みが今では可能となった。遺伝的効果及び環境効果は一生の間に変化し、遺伝子情報データセットにおける縦断研究のみがこのような効果の研究を可能にする。疾病遺伝子の発見において集団遺伝学的手法が他の方法よりも優れる主な利点は、ヒトにおいて有効な診断マーカーが得られる点である。
Ｔ２Ｄのような主要な公衆衛生問題を引き起こす遺伝子の同定は、以下に示す分子生物学、集団遺伝学及びバイオインフォマティクスにおける最近の発展によって、今では可能になった： １．操作コストの低下とスループットの増加に劇的な向上をもたらす、新しいジェノタイピング・プラットフォームの入手可能性、 ２．（１００，０００個を超えるマーカーを用いた）高密度マーカー地図を用いたゲノムスキャンの応用、 ３．ハプロタイプ共有分析を用いた、連鎖不平衡を探索するための新しい強力な統計学的手法によるデータ解析、そして ４．遺伝的に均一な集団におけるゲノムスキャンには、従来考えられていたよりも少数の遺伝子マーカーで充分であるという認識。
マイクロサテライトマーカーと連鎖解析を用いた古典的なＧＷＳは、一般的な疾病の原因となる遺伝子の発見には成功していない。失敗の一因はＧＷＳに用いた遺伝子マーカーの数があまりにも少なかったことであり、他の一因は研究した集団があまりにも不均一だったことである。ヒトゲノムプロジェクトとジェノタイピング技術の発展により、全ヒトゲノムのマッピングのために、初めての高密度マーカー地図が最近入手可能となった。ユリラブ社（Jurilab）の使用したマイクロアレイは１００，０００個を超えるＳＮＰマーカーのためのプローブを含有する。これらのＳＮＰは、Ｔ２Ｄの原因となる疾病遺伝子の大部分を発見するのに充分に密集した、全ゲノムを網羅するマーカー地図を始めて形成する。
東フィンランド創始者集団における遺伝的均一性
フィンランド人は、それぞれ約４，０００年前と約２，０００年前に起きた２つのヒト移民群を先祖とする。Ｙ−染色体ハプロタイプとミトコンドリア配列の両方が、フィンランド人の遺伝的多様性は他のヨーロッパ集団と比べて低いことを示し、フィンランドが長い間孤立していたことを裏付ける（Sajantila A et al, 1996）。４００年以上前のグスタヴ・ヴァーサ王の時代（１５２３年〜１５６０年）には、後期移住地域（late settlements）と呼ばれる、地域的な孤立集団（regional subisolates）が内部移住によって形成された（Peltonen L et al, 1999）。この中でも最も孤立していた地域が東フィンランドである。
東フィンランドの人口は、効果的な遺伝子発見プログラムを実施するのに充分な大きさを有する、現在知られる遺伝的に最も均一な隔離集団である。均一性の理由は、人口の年齢が若い（世代数が少ない）こと、創始者が少ないこと、長期にわたる地理的な隔離、そして戦争、飢餓と致死病の流行のよる人口増加の妨害が生じたことである。
東フィンランド人口の遺伝的均一性故に、重要な疾病素因遺伝子に含まれる変異は少なく、罹患した個体は類似した遺伝的背景を共有している。より強力な連鎖不平衡（ＬＤ）故に、他の集団と比べてＧＷＳに必要なＳＮＰと対象者はより少数である。
発明の概要
本発明は、Ｔ２Ｄに対する危険度の変化に関連する一塩基多型（ＳＮＰ）マーカー、これらマーカーの組み合わせ及びハプロタイプ、並びに該マーカーやハプロタイプが位置する遺伝子座が内部又は近傍に存在する、Ｔ２Ｄに関連する遺伝子に関する。該ＳＮＰマーカーは、Ｔ２Ｄを発症する危険度の増加又はＴ２Ｄを発症する危険度の低下、即ち、Ｔ２Ｄに対する防御、のいずれかに関連する。ここで「予測」又は危険度とは、危険度の増加又は低下を含意する。
従って本発明は、Ｔ２Ｄ関連ＳＮＰマーカー、ＳＮＰマーカーの組み合わせ、Ｔ２Ｄ関連遺伝子領域に含まれるハプロタイプ、公知の遺伝子ではあるがＴ２Ｄとの関連は知られていない遺伝子、そしてＴ２Ｄリスク遺伝子に存在する多型を用いた、Ｔ２Ｄに対する疾患感受性又は素因を推定するための方法やＴ２Ｄの分子サブタイプを決定する方法のみならず、Ｔ２Ｄの治療の臨床経過及び効力を予測するための方法を提供する。更に本発明は、本願で開示するＴ２Ｄ関連ＳＮＰマーカー、ＳＮＰマーカーの組み合わせ、ハプロタイプ及び遺伝子に基づく、新規な方法及び組成物を提供する。
更に本発明は、Ｔ２Ｄに対する個体の疾患感受性や素因を推定するための方法であって、ＳＮＰマーカーとハプロタイプの存在を検出するか、表１〜５に示したＴ２Ｄリスク遺伝子の発現の変化や、Ｔ２Ｄリスク遺伝子のコードするポリペプチドの変化を検出することを包含する方法に関する。変化は、量的変化、質的変化又はその両方である。
更に本発明は、Ｔ２Ｄに対する個体の疾患感受性や素因を推定するための方法に関する。Ｔ２Ｄに対する個体の疾患感受性や素因を推定するための該方法は、個体の核酸配列に存在する、危険性を示すハプロタイプの検出を包含する。
更に本発明は、Ｔ２Ｄに対する個体の疾患感受性を推定するためのキットであって、その全体又は一部として、ＳＮＰマーカーを含有する核酸断片を増幅するための増幅試薬、ＳＮＰマーカーのジェノタイピング用の検出試薬、及びデータ解析と危険度の評価のためのソフトウエアを包含する試験キットに関する。
１つの態様において本発明は、Ｔ２Ｄに対する素因を診断するための方法に関する。Ｔ２Ｄに対する個体の素因を診断するための該方法には、Ｔ２Ｄを予測するＳＮＰマーカーの存在の検出のみならず、該マーカーに関連する遺伝子の発現の変化の検出も含まれる。発現の変化は、量的変化、質的変化又はその両方である。
本発明の更なる目的は、対象生物の生物学的サンプルからＳＮＰマーカーを検出することで、Ｔ２Ｄに対する危険度を同定するための方法である。この方法によって得られた情報は、個体に関する他の情報、例えば、血液検査の結果、臨床検査の結果及びアンケートの結果、と組み合わせることができる。血液検査の結果としては、血漿又は血清のコレステロール値及び高比重リポタンパク質コレステロール値が挙げられるが、これらに限定されるものではない。アンケートによって集める情報には、性別、年齢、家族歴や病歴、例えば肥満症と糖尿病の家族歴に関する情報が含まれる。検査によって集める臨床情報には、例えば、身長、体重、ウエストとヒップのサイズ及び過脂肪症や肥満症に関する他の測定値が含まれる。
本発明の方法は、疾病発症前又は発症後のＴ２Ｄの正確な診断を可能とし、Ｔ２Ｄによる衰弱効果を減少又は最小化する。この方法は、臨床症状やＴ２Ｄの兆候を示さない者、Ｔ２Ｄや肥満症の家族歴を有する者、あるいはＴ２Ｄや肥満症に対する危険因子のレベルが上昇している者に適用することができる。
更に本発明は、Ｔ２Ｄに対する個体の疾患感受性を診断するための方法を提供する。この方法は、一般的な集団と比べてＴ２Ｄ感受性の個体により高頻度で存在する、Ｔ２Ｄを予測するための危険性を示すハプロタイプのスクリーニングを行うことを包含し、危険性を示すハプロタイプの存在をＴ２Ｄに対する疾患感受性の指標とする。「危険性を示すハプロタイプ」は、Ｔ２Ｄに対する危険度の上昇ではなく、危険度の低下と関連してもよい。「危険性を示すハプロタイプ」は、Ｔ２Ｄと高い関連性を示すマーカーと共に、本願で開示するハプロタイプの１種又は組み合わせを包含する。Ｔ２Ｄに対する個体の疾患感受性を診断するためのキットも開示する。
当業者は、個体の核酸配列に存在する、１種又は数種の本発明のＳＮＰマーカーに含まれるヌクレオチドの解析は、多型部位に存在するヌクレオチドを決定することのできる方法や技術によって行うことができることを容易に理解する。当業界では明らかなように、ＳＮＰマーカーに存在するヌクレオチドは、いずれかの核酸鎖又は両方の核酸鎖から検出することができる。
本発明の主な利用法には、Ｔ２Ｄを発症する危険性の高い者を予測することが含まれる。Ｔ２Ｄに寄与する遺伝的因子を特定する診断試験は、単独で使用するか、又は一般的な集団に対する個体の危険度を定義するための公知の臨床危険因子と組み合わせて使用することができる。Ｔ２Ｄを発症する危険性を有する個体を同定するためのより良い方法は、より良い予防的及び治療的な養生法に繋がると考えられ、養生法には、肥満症などのＴ２Ｄの危険因子、並びに、以下に示す、Ｔ２Ｄの余病に関する危険因子に対するより積極的な管理が含まれる：喫煙、高コレステロール血症、上昇したＬＤＬコレステロール値、低いＨＤＬコレステロール値、ＢＰ上昇、肥満、運動不足、及びＣ反応性タンパク質レベルや他の炎症性マーカーの上昇によって反映される炎症性成分。遺伝的危険度に関する情報は、特定の患者に生活習慣の調整（例えば、禁煙、カロリー摂取量の削減、運動量の増加）を医師が説得するために使用することもできる。最後に、体重、塩分摂取量やアルコール摂取量の削減といった、血圧低下を目標とした予防的処置の実施に関して、Ｔ２Ｄの分子副診断に基づいて、Ｔ２Ｄの危険度が高い患者の意欲を高めたり、具体的な方法を選択したりすることができる。
本発明の更なる目的は、Ｔ２Ｄの分子診断の方法を提供することにある。個体におけるＴ２Ｄの遺伝的病因は、Ｔ２Ｄの分子病因に関する情報を提供する。分子病因が明らかになれば、病因に基づく治療法の選択が可能となる。例えば、効果を発揮する可能の高い薬剤、即ち、血糖値を低下させる薬剤を、試行錯誤せずに選択することが可能となる。
本発明の更なる目的は、薬剤の抗糖尿病効果を試験する研究の対象者を選択するための方法を提供することにある。本発明の更なる目的は、抗糖尿病薬を試験するための臨床試験の対象生物を選択するための方法を提供することにある。
本発明の更なる目的は、Ｔ２Ｄリスク遺伝子に存在する多型を用いた、Ｔ２Ｄの治療の臨床経過及び効力を予測するための方法を提供することにある。本発明の遺伝子、遺伝子産物及び薬物は、Ｔ２Ｄの治療、治療効果のモニタリング、及び薬物の開発にも有用である。Ｔ２Ｄの診断、治療及び予後判定のためのキットも提供する。
発明の詳細な説明
治療方法
本発明は、Ｔ２Ｄの予防及び治療のための新規な方法を開示する。
本願において「治療」という用語は、疾患に関連した症状を改善することだけでなく、疾患の発症を予防又は遅らせることも意味し、更には、疾患に伴う症状の重症度や頻度を減少させること、疾患又は病態の再発を予防又は遅らせること及び／又は疾患又は病態に伴う症状の重症度や頻度を減少させることも意味する。
特に本発明は、Ｔ２Ｄ又はＴ２Ｄに対する感受性（例えば、本願明細書で開示した、危険性を示す集団に属する個体）を治療する方法のみならず、Ｔ２Ｄの症状発現やサブタイプの治療方法に関する。
本発明は、Ｔ２Ｄ治療剤を用いた、Ｔ２Ｄを有する個体、例えば、本願明細書で開示した標的集団に属する個体、を治療するための方法（予防法及び／又は療法）を包含する。「Ｔ２Ｄ治療剤」とは、Ｔ２Ｄリスク作用性のポリペプチドの酵素活性又は機能及び／又は本願明細書で開示したＴ２Ｄリスク遺伝子の発現を変化（例えば、増加又は低下）させる薬剤である。有用なＴ２Ｄ治療剤は、以下に例示する種々の方法でＴ２Ｄ感受性ポリペプチドの活性及び／又は機能、あるいはＴ２Ｄ感受性遺伝子の発現を変化させることができる：Ｔ２Ｄ感受性ポリペプチドをコードするｍＲＮＡの翻訳率の変更、Ｔ２Ｄリスク遺伝子の転写率の変更、Ｔ２Ｄ感受性ポリペプチドの翻訳後プロセシングの変更、Ｔ２Ｄ感受性ポリペプチドの活性及び／又は機能に対する干渉（例えば、Ｔ２Ｄ感受性ポリペプチドに結合することによる干渉）、Ｔ２Ｄ感受性ポリペプチドの安定性の変更、Ｔ２Ｄリスク遺伝子のスプライシング変異体の転写率の変更、あるいは標的細胞、器官及び／又は組織からのＴ２Ｄ感受性ポリペプチドの排除の阻害又は亢進。
Ｔ２Ｄ治療剤の代表例には、以下のものが含まれる：
（ａ）本発明で開示するＴ２Ｄ関連遺伝子の核酸、その断片、変異体又は誘導体、Ｔ２Ｄ感受性ポリペプチド、その活性断片や誘導体をコードする核酸、並びにＴ２Ｄ遺伝子の発現を修飾する核酸［例えば、アンチセンスポリヌクレオチド、酵素活性を有するポリヌクレオチド（例えば、リボザイムやＤＮＡザイム）、ＲＮＡ干渉を誘導する分子（ＲＮＡｉ）、及びマイクロＲＮＡ］、並びに上記核酸を包含するベクター、
（ｂ）Ｔ２Ｄ感受性ポリペプチド、その活性断片、変異体や誘導体、Ｔ２Ｄ感受性ポリペプチドに対する結合性物質、模倣ペプチド、上記ポリペプチドの融合タンパク質やプロドラッグ、抗体（例えば、上述したような、Ｔ２Ｄ感受性ポリペプチド変異体に対する抗体、変異体ではないＴ２Ｄ感受性ポリペプチドに対する抗体、Ｔ２Ｄリスク遺伝子のコードする特定の変異体に対する抗体）、並びに他のポリペプチド（例えば、Ｔ２Ｄ感受性受容体、その活性断片、変異体や誘導体）、
（ｃ）Ｔ２Ｄ感受性ポリペプチドやその誘導体の代謝産物、
（ｄ）Ｔ２Ｄリスク遺伝子の発現、Ｔ２Ｄリスク遺伝子のコードするポリペプチドの活性及び／又は機能、あるいはＴ２Ｄ遺伝子の関連する代謝経路の活性及び／又は機能を変える（例えば、阻害又は拮抗する）小分子と化合物、並びに
（ｅ）Ｔ２Ｄリスク遺伝子の発現、Ｔ２Ｄリスク遺伝子のコードするポリペプチドの活性及び／又は機能、あるいはＴ２Ｄ遺伝子の関連する代謝経路の活性及び／又は機能を変える（例えば、誘導又はアゴナイズする）小分子と化合物。
所望により、１種を超えるＴ２Ｄ治療剤を同時に使用することもできる。治療法は、個体における１種又は数種のＴ２Ｄポリペプチドの活性及び／又は機能、あるいは関連する代謝経路を変化（例えば、阻害又は亢進）、置換又は補足するように設計する。例えば、Ｔ２Ｄ治療剤は、Ｔ２Ｄリスク遺伝子やＴ２Ｄ感受性遺伝子の特定の変異体の発現や存在量を上方制御又は増加させるために投与することができ、あるいはそれとは反対に、Ｔ２Ｄリスク遺伝子やＴ２Ｄリスク遺伝子の特定の変異体の発現や存在量を下方制御又は低下させるために投与することもできる。本来のＴ２Ｄリスク遺伝子や、Ｔ２Ｄ感受性遺伝子の特定の変異体の発現や存在量の上方制御又は増加は、欠陥遺伝子や変異体の発現や活性に干渉したり、補ったりすることができる。又、本来のＴ２Ｄリスク遺伝子や、Ｔ２Ｄ感受性遺伝子の特定のスプライシング変異体の発現や存在量の下方制御又は低下は、欠陥遺伝子や特定の変異体の発現や活性を最小化することで、欠陥遺伝子や特定の変異体の影響を最小化することができる。
Ｔ２Ｄ治療剤は、治療効果を発揮する量（即ち、疾患に関連した症状を改善する、疾患の発症を予防又は遅らせる、及び／又は疾患に伴う症状の重症度や頻度を減少させたりすることで、疾患を治療するのに充分な量）を投与する。特定の個体の有する障害又は病態を治療する上で治療効果を発揮する量は、疾患に伴う病状や重症度に依存し、標準的な臨床技術で決定することができる。更に、最適投与範囲の同定を助けるために、in vitro又はin vivoのアッセイを所望により用いてもよい。製剤に用いる厳密な量は投与経路及び疾患又は障害の重症度にも依存するので、医療従事者の判断と各患者の状況とに基づいて決定しなければならない。効果的な量は、in vitroの試験システム又は動物モデルの試験システムから得られた用量−反応曲線から外挿することもできる。
１つの態様において、本発明の核酸（例えば、Ｔ２Ｄ感受性ポリペプチドをコードする核酸、その断片、変異体又は誘導体）は、単独で又はベクターに入れた形態で、Ｔ２Ｄに罹患した患者の細胞に、当業界で公知の種々の方法を用いて導入し、核酸を導入した細胞が本来のＴ２Ｄ感受性ポリペプチドの産生を開始するようにする。こうすることで、天然では本来のＴ２Ｄリスク遺伝子の発現及び活性を失っているか、Ｔ２Ｄリスク遺伝子の発現及び活性に異常のある細胞を、Ｔ２Ｄ感受性ポリペプチド、あるいはＴ２Ｄ感受性ポリペプチドの活性断片又は別の変異型を発現するように操作することができる。細胞の遺伝子工学的操作は、“ex vivo”（即ち、適当な細胞を患者から単離・精製し、遺伝子工学的操作を施した後に、患者に再度導入する方法）又は“in vivo”（即ち、ベヒクルを用いて、患者の組織に対して直接、遺伝子工学的操作を行う方法）のいずれかの方法で行うことができる。
本発明の他の態様においては、上記方法の代わりに、本発明の核酸、本発明の核酸に相補的な核酸、又はこのような核酸の一部（例えば、ポリヌクレオチド）を「アンチセンス」療法に使用する。この場合は、Ｔ２Ｄリスク遺伝子のｍＲＮＡ及び／又はゲノムＤＮＡに特異的にハイブリダイズする核酸（例えば、ポリヌクレオチド）を、医薬組成物の形態で標的細胞に投与するか又は該核酸を“in vivo”で産生する。ｍＲＮＡ及び／又はＤＮＡに特異的にハイブリダイズするアンチセンス核酸は、例えば、翻訳及び／又は転写を阻害することで、Ｔ２Ｄ感受性ポリペプチドの発現を阻害する。アンチセンス核酸の結合は、型どおりの塩基対の結合によるものでもよいし、あるいは、例えば、２本鎖ＤＮＡへの結合のように、二重らせんの主溝との特異的な相互作用によるものでもよい。
好ましい態様においては、本発明の核酸治療剤は、１種又は数種のＴ２Ｄリスク遺伝子を発現する細胞に送達される。核酸の細胞への送達には、公知の方法を用いることができるが、これらに限定されるものではない。例えば、細胞がベクターを取り込み、細胞内でＲＮＡ干渉を誘導するＲＮＡ分子の転写を誘導するように、ベクターをin vivoで導入することもできる。このようなベクターは、エピソームのままでも、染色体に組み込まれてもかまわない。また、転写されて目的ＲＮＡ分子を産生する限り、ＲＮＡ分子はＴ２Ｄリスク遺伝子の発現を修飾する。このようなベクターは、種々の標準的な組み換えＤＮＡ工学的手法で構築することができる。
公知の標的化相同組み換えによってＴ２Ｄリスク遺伝子又はそのプロモーターを不活化又は「ノックアウト」することで、内因性のＴ２Ｄリスク遺伝子の発現を減少させることもできる。代わりに、細胞の非機能的なＴ２Ｄリスク遺伝子を、標的化相同組み換えを用いて機能的な形態の該遺伝子で置き換える、という類似した方法を用いることで、機能的な、変異体ではないＴ２Ｄリスク遺伝子の発現を増加させることもできる。
本発明の別の態様においては、本明細書に開示した他のＴ２Ｄ治療剤もＴ２Ｄの治療又は予防に用いることができる。治療剤は、医薬組成物の形態で送達することができる。治療剤は全身的に投与するか、又は特定の組織にターゲティングすることができる。治療剤は、化学合成、細胞培養と組み換え技術（例えば、トランスジェニックな細胞や動物を用いた方法）などの種々の方法で製造することができる。治療剤は、薬学的条件を満たすように、公知の標準的な方法で単離・精製することができる。
上記の治療方法のいかなる組み合わせ（例えば、変異体ではないＴ２Ｄ感受性ポリペプチドの投与と、Ｔ２Ｄ感受性ｍＲＮＡ変異体を標的とする、ＲＮＡ干渉を誘導するＲＮＡ分子の組み合わせ）も使用することができる。
薬学的治療に関する態様においては、本発明は、表１２に示したＴ２Ｄ感受性遺伝子のコードする１種又は数種のポリペプチドの活性及び／又は機能を亢進又は低下させる化合物を包含する。この治療は、表１２に示した１種又は数種のＴ２Ｄ感受性遺伝子の発現を増加又は低下させてもよい。
本発明の別の態様においては、本発明の薬学的治療は、Ｔ２Ｄ感受性遺伝子、タンパク質又はポリペプチドに関連した１種又は数種の生物学的ネットワーク及び／又は代謝経路の活性及び／又は機能を亢進又は低下させる化合物を包含する。この治療は、Ｔ２Ｄ感受性遺伝子、タンパク質又はポリペプチドに関連した生物学的ネットワーク及び／又は代謝経路に含まれる１種又は数種の遺伝子の発現を増加又は低下させてもよい。
更に、ここで開示するＴ２Ｄ感受性遺伝子特異的マーカー（例えば、多型部位、遺伝子発現やポリペプチド）に基づく方法又は試験は、Ｔ２Ｄ患者のための薬理療法の選択に有用である。
本発明は、哺乳動物について、個体がＴ２Ｄを発症する危険度を評価する方法を開示する。Ｔ２Ｄリスクアレルのホモ接合度又はＴ２Ｄ感受性遺伝子の保有状況を認識する遺伝子試験は、Ｔ２Ｄの危険度が高い個体のための予防処置の選択に有用である。
本発明の更に別の態様においては、Ｔ２Ｄ感受性遺伝子特異的マーカー（例えば、多型部位、遺伝子発現やポリペプチド）に基づく試験又は方法は、Ｔ２Ｄの治療法を試験するための対象生物の選択に有用である。
Ｔ２Ｄ感受性遺伝子特異的マーカー（例えば、多型部位、遺伝子発現やポリペプチド）に基づく本発明の試験又は方法は、Ｔ２Ｄ感受性遺伝子の活性に影響を与える薬剤による副作用の危険度が高まっている可能性のある患者のための薬理療法の選択に有用である。
出現頻度の低い（即ち、マイナーな）Ｔ２Ｄ感受性遺伝子内の変異アレルと考えられるものが危険度を低下させ、且つこの変異が、遺伝子機能を低下させる変異である場合には、この遺伝子の機能及び／又は活性は、Ｔ２Ｄの危険度を増加するものであると推論することができる。これに基づいて、Ｔ２Ｄ感受性遺伝子又はそれがコードするタンパク質の機能又は活性を低下又は阻害する薬剤や他の治療法（遺伝子治療など）は、Ｔ２Ｄの危険度を低下させ、そしてＴ２Ｄの予防と治療の両方に用いることができると考えられる。
医薬組成物
本発明は、本願に記載した薬剤（agent）、特にＴ２Ｄ感受性遺伝子のポリヌクレオチド、ポリペプチド及びそれらの断片、変異体又は誘導体、及び／又は本願に記載したように、Ｔ２Ｄリスク遺伝子の発現又はＴ２Ｄ感受性遺伝子のコードする１種又は数種のポリペプチドの活性を変化（例えば、増強又は阻害）する薬剤を包含する医薬組成物に関する。例えば、Ｔ２Ｄリスク遺伝子の発現、Ｔ２Ｄ感受性遺伝子のコードする１種又は数種のポリペプチドの活性、Ｔ２Ｄ感受性ポリペプチド結合性物質や結合パートナー、それらの断片、融合タンパク質やプロドラッグ、あるいは本発明のポリヌクレオチドを、生理的に許容される担体や賦形剤と共に処方し、医薬組成物を調製することができる。担体と組成物は滅菌することができる。処方は投与方法に適したものでなければならない。
好ましい態様においては、医薬組成物は、本発明のＴ２Ｄ関連遺伝子に関連した生物学的ネットワーク及び／又は代謝経路における、Ｔ２Ｄに関連した変化の少なくとも一部を逆転させる１種又は２種以上の薬剤を包含する。
本発明に適した薬学的に許容される担体に特に限定はなく、水、塩溶液（例えば、ＮａＣｌ）、生理食塩水、緩衝化生理食塩水、アルコール類、グリセロール、エタノール、アラビアガム、植物油、ベンジルアルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、炭水化物（乳糖、アミロース、デンプンなど）、デキストロース、マグネシウムステアレート、タルク、珪酸、粘性パラフィン、香油、脂肪酸エステル、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンや、これ等の組み合わせなどが挙げられる。所望により医薬組成物は、有効成分と有害な反応を起こさない補助剤、例えば、潤滑剤、保存料、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧を調整するための塩類、緩衝剤、着色剤、調味料及び／又は香料などと混合してもかまわない。
所望により組成物は更に、微量の浸潤剤か乳化剤又はｐＨ調節剤を含有してもよい。組成物は、溶液、懸濁液、乳状液、錠剤、丸剤、カプセル、徐放性製剤又は粉剤とすることができる。組成物は、古典的なバインダーや担体であるトリグリセリドなどと共に、座薬として処方することもできる。経口製剤は、標準的な担体、例えば、医薬用のマニトール、ラクトース、デンプン、マグネシウムステアレート、ポリビニルピロリドン、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどを含んでいてもよい。
上記の組成物を生体に導入する方法に特に限定はなく、皮内、筋肉内、腹膜内、眼内、静脈内、皮下、局所、経口及び鼻腔内への投与が挙げられる。他の適した導入方法としては、（以下で説明する）遺伝子療法、再充填可能か生体分解可能な機構、粒子加速化装置（“ジーンガン”）及び薬物徐放型高分子機構が挙げられる。本発明の医薬組成物は、他の成分と共に、コンビナトリアル療法の一部として投与することもできる。
医薬組成物は、慣例的な手順に従って処方し、ヒトへの投与に適合した医薬組成物とすることができる。例えば、典型的な静脈注射用の組成物は、滅菌済みの等張水性緩衝液の溶液である。必要な場合には、医薬組成物は更に可溶化剤と、注射する部位の痛みを低減するための局所麻酔剤を含んでもよい。一般的に、処方材料はそれぞれ個別に供給するか、投与単位形式に混合したもの（例えば、有効成分の量を表示したアンプルや小袋などの容器に密封した、凍結乾燥品の乾燥粉末又は水を含まない濃縮物）として供給する。医薬組成物を点滴で投与する場合には、医薬組成物は、医薬用の滅菌水、生理食塩水又はデキストロース／水の入った点滴用ビンに分配することができる。医薬組成物を注射によって投与する場合には、投与前に処方材料を混合できるように、注射用の滅菌水又は生理食塩水の入ったアンプルを提供することができる。
局所投与のためには、局所投与に適合し、好ましくは水よりも動粘性率の高い担体を包含する、非スプレー形態あるいは粘性〜半固体又は固体の形態を用いることができる。適当な処方に特に限定はないが、溶液、懸濁液、乳液、クリーム、軟膏、粉末、浣腸、ローション、ゾル、塗布剤、膏薬、エアゾールなどが挙げられ、これらは、所望により、滅菌してもよいし、また補助剤（例えば、保存料、安定化剤、湿潤剤、浸透圧を調整するための塩類や緩衝剤など）と混合してもかまわない。薬剤は化粧品処方剤に導入してもよい。局所投与にはスプレー可能なエアゾール製剤も適しており、この場合は有効成分を、好ましくは固体状又は液状の不活性担体と共にスクィーズボトルに梱包したり、加圧した揮発性の、通常は気体状の噴射剤（例えば、圧縮空気）と更に混合して梱包したりすることも好適である。
本願に記載した薬剤は、中性の形態でも、塩の形態でも処方することができる。薬学的に許容される塩類としては、塩酸、リン酸、酢酸、蓚酸、酒石酸などから誘導した、遊離アミノ基を有するもの、及びナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどから誘導した、遊離カルボキシル基を有するものが挙げられる。
薬剤は、治療効果を発揮する量を投与する。特定の疾患又は病態を治療する上で治療効果を発揮する量は、疾患や病態の性質に依存し、標準的な臨床技術で決定することができる。更に、最適投与範囲の同定を助けるために、in vitro又はin vivoのアッセイを所望により用いてもよい。製剤に用いる厳密な量は投与経路及びＴ２Ｄの病状の重症度にも依存するので、医療従事者の判断と各患者の状況とに基づいて決定しなければならない。効果的な投与量は、in vitroの試験システム又は動物モデルの試験システムから得られた用量−反応曲線から外挿することもできる。
代表的な標的集団
Ｔ２Ｄを発症する危険性がある個体とは、例えば、以下に挙げるＴ２Ｄ危険因子の少なくとも１つを有する個体である：Ｔ２Ｄや肥満症の家族歴、妊娠糖尿病の病歴、既に確認されているグルコース不耐性、肥満症、高トリグリセリド血症、低いＨＤＬコレステロール値、ＨＴとＢＰ上昇、運動不足、及び１種又は数種のＴ２ＤリスクＳＮＰマーカーを含む、危険性を示すアレルやハプロタイプ。
本発明の別の態様において、Ｔ２Ｄを発症する危険性がある個体とは、Ｔ２Ｄリスク遺伝子内に少なくとも１種のリスク増加アレルが存在する個体であり、多型の存在は、Ｔ２Ｄ感受性が高いことを示す。本明細書で使用する「遺伝子」という用語は、遺伝子のポリペプチドコード配列の上流と下流のみならず、その内部に位置する全ての調節エレメントと、ｍＲＮＡの５’及び３’非翻訳領域を含む遺伝子の全転写領域と、遺伝子の全てのエクソン配列とイントロン配列（更に選択的スプライシングが行われるエクソンとイントロン）を含有する全長ポリペプチドコード配列を含む全体の総称である。
危険性を示すアレルと危険性を示すハプロタイプの評価
遺伝子マーカーは、Ｔ２Ｄと関連する「多型部位」に存在する特定の「アレル」である。集団の中に複数の配列をもたらしうるヌクレオチドのゲノム内の位置を、本明細書では「多型部位」と称する。多型部位の長さが１ヌクレオチドの場合は、ＳＮＰと称する。例えば、特定の染色体位置のヌクレオチドが、集団に属するある個体ではアデニンであり、同じ集団の別の個体ではチミンの場合、この位置は多型部位であり、より詳細には、この多型部位はＳＮＰである。多型部位は、挿入、欠失、変換又は転座によってその長さが数ヌクレオチドであってもよい。多型部位に見られる各種の配列を、本明細書では、多型部位の「アレル」と称する。従って、上記の例では、ＳＮＰとしてアデニンアレルとチミンアレルの両方が存在する。
典型的には、特定の遺伝子について参照ヌクレオチド配列、例えば、ＮＣＢＩデータベース（www.ncbi.nlm.nih.gov）内の遺伝子に参照する。参照配列と異なるアレルを、「変異型（variant）」アレルと称する。参照ヌクレオチド配列のコードするポリペプチドは、特定の参照アミノ酸配列を有する「参照」ポリペプチドであり、変異型アレルのコードするポリペプチドを、変異型アミノ酸配列を有する「変異型」ポリペプチドと称する。
変異型ヌクレオチド配列は、ポリペプチドの性質に影響を与える変化をもたらすことがある。参照ヌクレオチド配列との比較により示されるこうした配列差としては、挿入、欠失、変換及び置換が挙げられ、具体例としては、変異型ポリペプチドを生成するフレームシフトをもたらすことのある、挿入、欠失又は変換；中途終止コドン、アミノ酸の変化又は異常なｍＲＮＡスプライシングをもたらすことがある、少なくとも１つのヌクレオチドの置換；ヌクレオチドのコードする１種又は数種のアミノ酸の欠失をもたらすことがある、複数のヌクレオチドの欠失；読み枠中のコード配列の中断をもたらすことがある、不均等な組み換えや遺伝子変換などの、複数のヌクレオチドの挿入；配列の全て又は一部の重複；トランスポジション；又は詳しく上記したような、ヌクレオチド配列の再編成が挙げられる。このような配列の変化は、Ｔ２Ｄ感受性遺伝子のコードするポリペプチドを変化させる。例えば、ポリペプチド配列に変化をもたらすヌクレオチドの変化は、ポリペプチドの生理学的特性を劇的に変化させ、その結果、活性、分布及び安定性の変化、若しくはポリペプチドの他の性質に変化をもたらすことができる。
あるいはまた、変異型ヌクレオチド配列は、遺伝子の転写又はそのｍＲＮＡの翻訳に影響する変化をもたらすことがある。遺伝子の調節領域に存在する多型部位は、組織特異性、転写率、転写因子への応答などの変化によって、遺伝子の転写に変化をもたらすことがある。ｍＲＮＡに対応する遺伝子領域に存在する多型部位は、安定した二次構造をｍＲＮＡに誘導し、ｍＲＮＡの安定性に影響を与えることなどによって、ｍＲＮＡの翻訳に変化をもたらすことがある。こうした配列の変化は、Ｔ２Ｄ感受性遺伝子の発現を変化させることがある。
本明細書に記載する「ハプロタイプ」とは、遺伝子マーカー（「アレル」）の全ての組み合わせを意味する。またハプロタイプは、２個以上のアレルを含んでいてもよく、ハプロタイプを含有するゲノム領域の長さは数百ベースから数百キロベースである。当業者には認知されているように、ハプロタイプを定義するアレルを異なる核酸鎖から求めることによって、同じハプロタイプであっても、異なった形で記載されることがある。例えば、ＳＮＰマーカー rs2400503（C/T）、rs10515605（A/G）とrs7709159（C/T）で定義されるハプロタイプ CAC は、ＳＮＰマーカー rs2400503（C/T）、rs10515605（A/G）とrs7709159（C/T）を相補鎖から決定したハプロタイプ GTG や、ＳＮＰマーカー rs2400503（C/T）のみを相補鎖から決定したハプロタイプ GAC と同じである。本発明で開示するハプロタイプは、Ｔ２Ｄの危険度を有していない個体よりも、Ｔ２Ｄの危険度を有する個体においてより頻繁に見られるものである。従って、これらのハプロタイプは、個体におけるＴ２Ｄの危険度又はＴ２Ｄ感受性を検出するための予測力を有する。多型部位に存在する配列を検出するための公知の方法によって、ハプロタイプの検出を行うことができる。
本発明で開示する、危険性を示すＴ２Ｄ関連アレルと危険性を示すＴ２Ｄ関連ハプロタイプは、本発明のＴ２Ｄ関連遺伝子に存在する他の「多型部位」と関連してもよいことが理解されよう。こうした他のＴ２Ｄ関連多型部位は、遺伝子マーカーと同等に有用か、あるいは危険性を示す本発明のアレルとハプロタイプについて観察されるＴ２Ｄとの関連を説明する、原因性変異型（causative variations）としてより有用である。
本明細書で説明したいくつかの方法においては、Ｔ２Ｄを発症する危険性のある個体とは、危険性を示すアレル又は危険性を示すハプロタイプが同定された個体である。１つの態様においては、危険性を示すアレル又は危険性を示すハプロタイプは、死亡の有意な危険度を示すものである。１つの態様においては、アレル又はハプロタイプと関連する有意性はオッズ比で測定する。更に別の態様においては、有意性は百分率で測定する。１つの態様においては、有意な危険度を示すオッズ比は０．８以下又は少なくとも約１．２であり、具体的なオッズ比としては、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．５、３．０、４．０、５．０、１０．０、１５．０、２０．０、２５．０、３０．０及び４０．０が挙げられるが、これらに限定されるものではない。更に別の態様においては、危険度の有意な増加と低下は少なくとも約２０％であり、具体的には、約２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％及び９８％が挙げられるが、これらに限定されるものではない。更に別の態様においては、危険度の有意な増加は少なくとも約５０％である。しかし、危険度が医学的に有意か否かの判定は、特定の疾患、アレルやハプロタイプ、そして屡々環境因子を含む、多様な因子にも依存し得ることが理解されよう。
Ｔ２Ｄリスク遺伝子又はその所定の部位に存在する、リスクを示すハプロタイプとは、健康な個体（対照者）に存在する頻度と比べて、Ｔ２Ｄを発症する危険性のある個体（Ｔ２Ｄ発症者（affected））に存在する頻度の方がより高いハプロタイプであり、ハプロタイプの存在が、Ｔ２Ｄの危険性又はＴ２Ｄに対する疾患感受性の指標となるものである。
好ましい態様においては、この方法は、Ｔ２Ｄリスク遺伝子又はその所定の部位におけるＳＮＰマーカーの存在又は出現頻度を個体について検出することを包含し、健常対照個体と比べて、過剰なＳＮＰマーカー又はその出現頻度の上昇は、Ｔ２Ｄの危険性を有しているかＴ２Ｄ感受性が高いことを示す。ハプロタイプの存在は、Ｔ２Ｄの危険度又は、Ｔ２Ｄに対する疾患感受性が高いことを示すので、本明細書で説明する治療法の標的集団に該当する個体の指標となる。
プライマー、プローブ及び核酸分子
「プローブ」や「プライマー」は、塩基特異的な形式で核酸分子の相補鎖にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドである。「塩基特異的な形式」とは、プライマーやプローブがハイブリダイズするのに十分な程度のヌクレオチド相補性を２つの配列が有していることを意味する。従って、プライマーやプローブの配列は、テンプレートの配列に対して完全に相補的である必要はない。塩基置換がハイブリダイゼーションを阻害しない限り、非相補的な塩基や修飾塩基がプライマーやプローブ中に散在していてもよい。核酸テンプレートは、プライマーやプローブに対して種々の相補性を示す「非特異的プライミング配列」又は「非特異的配列」を更に包含してもよい。このようなプローブとプライマーとしては、ポリペプチド核酸（polypeptide nucleic acid）が挙げられる（Nielsen PE et al, 1991）。
プローブやプライマーは、本発明の核酸の中の連なった少なくとも約１５ヌクレオチド、例えば約２０〜２５ヌクレオチド、特定の態様においては約４０、５０又は７５ヌクレオチド（例えば、連続した核酸の配列）にハイブリダイズする核酸領域を包含する。
好ましい態様においては、プローブやプライマーは、１００個以下のヌクレオチドを包含し、特定の態様においては６〜５０ヌクレオチド、例えば１２〜３０ヌクレオチドを包含する。別の態様においては、プローブやプライマーは、連続した核酸の配列又はその相補鎖と少なくとも７０％同一であり、例えば、少なくとも８０％同一、特定の態様においては少なくとも９０％同一、別の態様においては少なくとも９５％同一である。あるいはプローブやプライマーは、連続した核酸配列又はその相補鎖に選択的にハイブリダイズすることさえ可能である。プローブやプライマーは、屡々、ラジオアイソトープ、蛍光化合物、酵素又は酵素の補因子などの標識を更に包含する。
本発明のアンチセンス核酸分子は、Ｔ２Ｄリスク遺伝子及び／又はその相補配列のヌクレオチド配列に基づいて設計し、公知の方法を用いて、化学合成及び酵素による連結反応によって構築することができる。例えば、アンチセンス核酸分子（アンチセンスオリゴヌクレオチドなど）は、自然界に見られるヌクレオチド、若しくは、分子の生物学的安定性の増加や、アンチセンス核酸とセンス核酸の間で形成される２本鎖の物理的安定性の増加を目的として設計された種々の修飾ヌクレオチド（例えばホスホロチオエート誘導体やアクリジン置換ヌクレオチド）を用いて化学合成することができる。また、アンチセンス核酸分子は、アンチセンスの方向に、Ｔ２Ｄリスク遺伝子、その断片又は変異体をコードする核酸分子がクローニングされた発現ベクター（つまり、発現ベクターから転写されたＲＮＡが、目的のＴ２Ｄリスク遺伝子から転写されたＲＮＡに対して相補鎖となるようにした発現ベクター）を用いて生物学的に製造することもできる。
本発明で開示するＴ２Ｄ関連遺伝子の核酸配列は、患者の内因性ＤＮＡ配列と比較することで遺伝的障害（Ｔ２Ｄ素因又は感受性など）を同定するために用いることができ、また、プローブとして用い、関連するＤＮＡ配列とハイブリダイズさせて発見したり、公知の配列をサンプルから除外したりすることができる。核酸配列は更に、遺伝子フィンガープリント法のためのプライマーの誘導、ＤＮＡ免疫法を用いた抗ポリペプチド抗体の産生、及び抗ＤＮＡ抗体の産生や免疫応答の誘発のための抗原として用いることができる。本願で同定したヌクレオチド配列（及び対応する完全な遺伝子配列）の一部、即ち断片は、ポリヌクレオチド試薬として種々の用途に用いることができる。例えば、これらの配列は、（ｉ）各配列に対応する遺伝子を染色体上にマッピングすることによる、遺伝性疾患に関連する遺伝子領域の位置の特定、（ii）微小な生物学的サンプルからの個体の同定（組織タイピング）、そして（iii）生物学的サンプルの法医学的な同定の補助に用いることができる。加えて、本発明のヌクレオチド配列は、解析、特徴づけ又は治療用途に用いるための組み換えポリペプチドの同定と発現に用いたり、対応するポリペプチドが恒常的に、又は組織分化の際に、又は疾患状態で発現される組織のためのマーカーとして使用したりすることができる。加えて核酸配列は、本発明で開示するスクリーニング及び／又は診断アッセイのための試薬として用いることができ、また本発明で開示するスクリーニング及び／又は診断アッセイに使用するキット（例えば試薬キット）の構成成分として含めることができる。
ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体
本発明は、本発明のポリペプチドに結合するポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を包含する。本明細書に記載される「抗体」とは、免疫グロブリン分子、及び免疫グロブリン分子の免疫学的活性部位（即ち、エピトープ（抗原、抗原決定基）に特異的に結合する抗原結合部位を含む分子）の総称である。本発明のポリペプチドに特異的に結合する抗体分子は、該ポリペプチドやその断片に存在するエピトープには結合するが、サンプル（例えば、天然に該ポリペプチドを含む生物学的サンプル）の中の他の分子とは実質的に結合しない分子である。免疫グロブリン分子の免疫学的活性部位の例としては、ペプシンなどの酵素で抗体を処理することによって得られるＦ(ａｂ) 断片とＦ(ａｂ’)2断片が挙げられる。ある形態の遺伝子産物には特異的に結合するが、他の形態の遺伝子産物には結合しないポリクローナル抗体及び／又はモノクローナル抗体も提供する。１つ又は複数の多型部位を含有する変異体あるいは参照遺伝子産物の一部に結合する抗体も提供する。本明細書に記載される「モノクローナル抗体」や「モノクローナル抗体組成物」とは、特定のエピトープに対する一群の抗体分子であって、Ｂ細胞の単一クローン又は単一ハイブリドーマ細胞系で産生されるものの総称である。従って、典型的なモノクローナル抗体組成物は、この組成物が免疫反応を示す特定の本発明のポリペプチドに対して、１つの結合親和性のみを示す。
ポリクローナル抗体は、当業者に公知の方法、即ち、適切な対象生物を所望の免疫原（例えば、本発明のポリペプチド又はその断片）で免疫することによって製造することができる。免疫した対象生物における抗体力価は、例えば、固定したポリペプチドを用いる酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）などの標準的な方法で、経時的にモニタリングすることができる。所望であれば、ポリペプチドに対する抗体分子を哺乳動物（例えば、その血液）から単離し、更にプロテインＡクロマトグラフィー法などの公知の処理方法で精製して、ＩｇＧ画分を得ることができる。免疫後の適当な時点（例えば、抗体力価が最大値に達した時点）で抗体産生細胞を対象生物から採取し、それを用いて、ハイブリドーマ法（Kohler G and Milstein C, 1975）、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Kozbor D et al, 1982）、ＥＢＶ−ハイブリドーマ法（Cole SP et al, 1994）又はトリオーマ法（Hering S et al, 1988）などの標準的な技術でモノクローナル抗体を製造することができる。ハイブリドーマを製造するためには、不死化細胞株（典型的には骨髄腫）を、上記の免疫原で免疫した哺乳動物に由来するリンパ球（典型的には脾細胞）に融合し、得られたハイブリドーマ細胞の培養上清のスクリーニングを行って、本発明のポリペプチドと結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを同定する。
リンパ球と不死化細胞株の融合に用いる多くの公知のプロトコルのどれでも、本発明のポリペプチドに対するモノクローナル抗体の産生に適用することができる（Bierer B et al, 2002）。更に当業者であれば、同じように有用な、上記の方法のバリエーションがたくさん存在することを理解できよう。モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを調製する代わりに、組み換え免疫グロブリンコンビナトリアルライブラリー（例えば、抗体ファージディスプレーライブラリー）をポリペプチドでスクリーニングし、ポリペプチドに結合する免疫グロブリンライブラリーのメンバーを単離することで、本発明のポリペプチドに対するモノクローナル抗体を同定して単離することができる（Hayashi N et al, 1995、Hay BN et al, 1992、Huse WD et al, 1989、Griffiths AD et al, 1993）。ファージディスプレーライブラリーを産生し、スクリーニングするためのキットは市販されている。
加えて、通常の組み換えＤＮＡ法を用いた製造が可能な、ヒト化キメラモノクローナル抗体などの、ヒト由来の部分とヒトに由来しない部分を包含する組み換え抗体も本発明の範囲内に含まれる。こうしたヒト化キメラモノクローナル抗体は、公知の組み換えＤＮＡ技術によって製造することができる。
一般的に、本発明の抗体（例えばモノクローナル抗体）は、アフィニティークロマトグラフィー法又は免疫沈降法などの標準的な技術で本発明のポリペプチドを単離するために用いることができる。本発明のポリペプチドに特異的な抗体は、生物学的材料からの、本来の本発明のポリペプチドの精製のみならず、培養細胞（培養液又は細胞）からの、組み換え型の本発明のポリペプチドの精製も容易にする。更に、本発明のポリペプチドに特異的な抗体は、ポリペプチドの発現量と発現パターンを評価するために、（例えば、細胞溶解物、細胞上清又は組織サンプル中の）ポリペプチドの検出に用いることができる。抗体は、Ｔ２Ｄ感受性を予測するための試験の一部、あるいは臨床試験の手順の一部（例えば、養生法の有効性を決めるための手順）として、組織（例えば血液）に存在するタンパク質のレベルを診断目的でモニタリングするために用いることができる。抗体は、検出率を向上するために、種々の酵素、補欠分子族、蛍光材料、発光材料、生物発光材料及び放射性材料にカップリングすることができる。好適な酵素の具体例としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ及びアセチルコリンエステラーゼが挙げられ、好適な補欠分子族複合体の具体例としては、ストレプトアビジン／ビオチン及びアビジン／ビオチンが挙げられ、好適な蛍光材料の具体例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリド及びフィコエリトリンが挙げられ、好適な発光材料としては、ルミノールが挙げられ、好適な生物発光材料としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリン及びエクオリンが挙げられ、好適な放射性材料としては、125Ｉ、131Ｉ、35Ｓ及び3Ｈが挙げられる。
高度に精製された抗体（例えば、本発明のＴ２Ｄ関連遺伝子のコードするポリペプチドに特異的なヒト化モノクローナル抗体）は、ＧＭＰに対応した公知の製造方法で製造することができる。このような「薬理グレード」の抗体は、本発明のＴ２Ｄ関連遺伝子のコードするポリペプチドの活性及び／又は機能を変化させるか、本発明のＴ２Ｄ関連遺伝子の関連する代謝経路の活性及び／又は機能を変化させる、新規な治療法に用いることができる。
診断アッセイ
本発明で開示するマーカー、プローブ、プライマー及び抗体は、対象生物におけるＴ２ＤあるいはＴ２Ｄ関連疾患又は病態について、危険度の評価、診断及び予後判定のための方法及びキットにも用いることができる。
本発明の１つの態様においては、本発明で開示する危険性を示す１種又は数種のアレル、ハプロタイプ、又はそれらの組み合わせを、本発明で開示するように、対象生物の核酸から検出することによって、Ｔ２Ｄの危険度又は感受性の診断（若しくはＴ２Ｄ関連疾患や病態の診断又はこれらに対する感受性の診断）を行う。
本発明の１つの態様においては、本発明で開示する危険性を示すアレル及び／又はハプロタイプに関連する１種又は数種の多型部位を対象生物の核酸から検出することによって、Ｔ２Ｄの危険度又は感受性の診断（若しくはＴ２Ｄ関連疾患や病態の診断又はこれらに対する感受性の診断）を行う。診断において最も有用な多型部位は、フレームシフト、中途終止コドン、アミノ酸の変化又は異常なｍＲＮＡスプライシングによって、Ｔ２Ｄ関連遺伝子のポリペプチド構造を変化させる多型部位である。多くの場合、ポリペプチドのアミノ酸配列に変化をもたらすヌクレオチドの変化は、ポリペプチドの生理学的特性を変化させ、その結果、活性、分布及び安定性の変化、若しくはポリペプチドの他の性質に変化をもたらすことができる。診断において有用な他の多型部位としては、Ｔ２Ｄ関連遺伝子の組織特異性の変化、転写率の変化、生理学的状態に対する応答の変化、ｍＲＮＡの翻訳効率の変化、及びｍＲＮＡの安定性の変化によって、Ｔ２Ｄ関連遺伝子の転写又はそのｍＲＮＡの翻訳に影響を与える多型部位である。Ｔ２Ｄ関連遺伝子のポリペプチド構造の変化や、Ｔ２Ｄ関連遺伝子の発現の変化を伴う変異型ヌクレオチド配列の存在によって、Ｔ２Ｄ感受性を有すると診断することができる。
診断用途においては、機能的多型と連鎖不平衡の状態にある、疾患危険度の予測に有益な多型を用いてもよい。こうした機能的多型は、スプライシング部位の変化や、ｍＲＮＡの安定性又は輸送の変化を伴うか、あるいは核酸の転写と翻訳の変化を伴う。機能的多型に関連する変異型ヌクレオチド配列の存在によって、Ｔ２Ｄ感受性を有すると診断することができる。我々は限られた数のＳＮＰマーカーについてジェノタイピングを行い、それらを本願の実施例に記載したが、本発明で同定したＴ２Ｄリスク遺伝子のいずれかにおいて、上述したような機能的変異、調節的変異又は他の変異のいずれかが見られる場合、Ｔ２Ｄ危険度の予測が可能であると期待される。
診断アッセイにおいては、１種又は数種の本発明のＴ２Ｄ関連ＳＮＰマーカーに存在するヌクレオチドのみならず、本発明のＴ２Ｄ関連ＳＮＰマーカーと関連する多型部位も個体の核酸から検出するが、この検出は、多型部位に存在するヌクレオチドを正確に検出することが可能ないかなる方法や技術で行ってもよい。数多くの好適な方法が当業界では報告されており（例えば、Kwok P-Y, 2001、Syvanen A-C, 2001を参照）、そのような方法としては、ハイブリダイゼーションアッセイ、連結反応アッセイ、プライマー伸長アッセイ、酵素開裂アッセイ、化学的開裂アッセイ及びこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されるものではない。アッセイは、ＰＣＲ、固相固定工程、マイクロアレイ、修飾オリゴヌクレオチド、標識プローブ又は標識ヌクレオチドを含んでいても、含んでいなくてもよく、アッセイはマルチプレックスでもシングルプレックスでもかまわない。当業界では自明であるように、多型部位に存在するヌクレオチドは、いずれか一方の核酸鎖又は両方の核酸鎖から検出することができる。
本発明の別の態様においては、Ｔ２Ｄ感受性の診断を、１種又は数種のＴ２Ｄ関連遺伝子の転写の検査によって行うことが可能である。転写の変化は、ハイブリダイゼーション法、酵素開裂アッセイ、ＲＴ−ＰＣＲアッセイ及びマイクロアレイなどの、当業界で報告されている多様な方法で評価することができる。個体から試験サンプルを採取し、サンプル中に含まれるＲＮＡからＴ２Ｄ関連遺伝子の転写の変化を評価する。転写の変化によって、Ｔ２Ｄ感受性を有すると診断することができる。
本発明の別の態様においては、Ｔ２Ｄ感受性の診断は、Ｔ２Ｄ感受性ポリペプチドの発現及び／又は構造及び／又は機能の検査によっても行うことが可能である。個体から得た試験サンプルについて、Ｔ２Ｄリスク遺伝子のコードするポリペプチドの発現及び／又は構造及び／又は機能の変化の存在、あるいはＴ２Ｄリスク遺伝子のコードする特定の変異型ポリペプチド（例えばイソフォーム）の存在のいずれかを評価する。Ｔ２Ｄリスク遺伝子のコードするポリペプチドの発現の変化は、例えば、定量的（ポリペプチド発現の量、即ち、産生ポリペプチド量の変化）又は定性的（Ｔ２Ｄリスク遺伝子のコードするポリペプチドの構造及び／又は機能の変化、即ち、変異型Ｔ２Ｄ感受性ポリペプチド、異なるスプライシング変異体やイソフォームの発現）である。好ましい態様においては、Ｔ２Ｄリスク遺伝子のコードする特定のスプライシング変異体、又はスプライシング変異体の特定のパターンの検出によって、Ｔ２Ｄに関連する疾患や病態、又はＴ２Ｄに関連する疾患や病態に対する感受性を診断することが可能となる。
Ｔ２Ｄ感受性ポリペプチドの発現及び／又は構造及び／又は機能の変化は、当業界でよく知られる多様な方法、例えば、クロマトグラフィー法、分光法、比色分析法、電気泳動法、等電点電気泳動法、特異的開裂法、免疫学的手法、及び生物学的活性の測定に基づくアッセイや、種々のアッセイの組み合わせによって測定することができる。本明細書において、ポリペプチドの発現又は組成における「変化」とは、対照サンプルにおける発現や組成と比較した際に、試験サンプルに見られる発現や組成の変化である。変化は、Ｔ２Ｄ感受性ポリペプチド又はその断片から直接評価するか、又は該ポリペプチドの基質又は反応産物から評価する。対照サンプルとは、試験サンプルに対応するサンプル（例えば、同じ種類の細胞から得たもの）であって、Ｔ２Ｄを発症していない（not affected）個体から得たものである。対照サンプルと比べて変化した、試験サンプルにおける本発明のＴ２Ｄ感受性遺伝子のコードするポリペプチドの発現と組成は、Ｔ２Ｄに対する感受性の指標となる。
変異型Ｔ２Ｄリスク遺伝子のコードするポリペプチドに特異的に結合する上記の抗体、変異していない遺伝子のコードするポリペプチドに特異的に結合する抗体、又はＴ２Ｄリスク遺伝子のコードする特定のスプライシング変異体に特異的に結合する抗体を用いたウエスタンブロット法によって、試験サンプルにおける、Ｔ２Ｄリスク遺伝子の多型や変異型がコードする特定のポリペプチドの存在や不存在を検出することができる。Ｔ２Ｄリスク遺伝子のコードする特定のスプライシング変異体の存在（又は不存在）と同様に、多型遺伝子や変異型遺伝子のコードするポリペプチドの存在、又は多型でない遺伝子や変異していない遺伝子のコードするポリペプチドの不存在によって、Ｔ２Ｄ感受性を有すると診断することができる。
上記方法の１つの態様においては、試験サンプル中のＴ２Ｄリスク遺伝子のコードするポリペプチドのレベル又は量を、対照サンプル中の同じＴ２Ｄリスク遺伝子のコードする同じポリペプチドのレベル又は量と比較する。試験サンプル中のポリペプチドのレベル又は量が、対照サンプル中のポリペプチドのレベル又は量よりも高いか低く、この差が統計的に有意である場合には、試験サンプル中のポリペプチドのレベル又は量は、Ｔ２Ｄリスク遺伝子のコードするポリペプチドの発現の変化を示し、これによってＴ２Ｄ感受性を有すると診断することができる。上記方法に代わる方法としては、試験サンプル中のＴ２Ｄリスク遺伝子のコードするポリペプチドの組成を、対照サンプル中のＴ２Ｄリスク遺伝子のコードするポリペプチドの組成（例えば、種々のスプライシング変異体の存在）と比較する。試験サンプル中のポリペプチドの組成と対照サンプル中のポリペプチドの組成の違いによって、Ｔ２Ｄ感受性を有すると診断することができる。更に別の態様においては、ポリペプチドのレベルや量と組成の両方を試験サンプルと対照サンプルにおいて評価することができる。試験サンプルと対照サンプルとの比較から明らかなポリペプチドの量やレベルの違い、組成の違い、又は量やレベルの違いと組成の違いの両方が、Ｔ２Ｄに対する感受性の指標となる。
別の態様においては、Ｔ２Ｄリスク遺伝子の多型又は変異型がコードするポリペプチドのスプライシング変異体やイソフォームを評価することができる。この評価は、直接的に（例えば、ポリペプチドそのものの検査によって）又は間接的に（例えば、ｍＲＮＡのプロファイリングなどによる、ポリペプチドをコードするｍＲＮＡの検査によって）行うことができる。例えば、本発明で開示するプローブやプライマーは、標準的な方法によって、Ｔ２Ｄリスク遺伝子のｍＲＮＡがどのスプライシング変異体やイソフォームをコードしているのかを決定することができる。
Ｔ２Ｄ又はＴ２Ｄ危険度に関連する特定のスプライシング変異体やイソフォームの試験サンプルにおける存在、又はＴ２Ｄ又はＴ２Ｄ危険度と関連のない特定のスプライシング変異体やイソフォームの試験サンプルにおける不存在によって、Ｔ２Ｄリスク遺伝子に関連する疾患や病態、又はＴ２Ｄリスク遺伝子に関連する疾患や病態に対する感受性を有すると診断することができる。同様に、Ｔ２Ｄ又はＴ２Ｄ危険度に関連する特定のスプライシング変異体やイソフォームの試験サンプルにおける不存在、又はＴ２Ｄ又はＴ２Ｄ危険度に関連のない特定のスプライシング変異体やイソフォームの試験サンプルにおける存在によって、Ｔ２Ｄリスク遺伝子に関連する疾患や病態ではない、又はＴ２Ｄリスク遺伝子に関連する疾患や病態に対する感受性を有していないと診断することができる。
更に本発明は、Ｔ２Ｄリスク遺伝子に含まれる危険性を示すアレル又は危険性を示すハプロタイプに存在するマーカーを評価することによって、個体におけるＴ２Ｄ感受性の診断と同定を行うための方法に関する。１つの態様においては、この危険性を示すアレル又は危険性を示すハプロタイプは、アレル又はハプロタイプの存在によってＴ２Ｄの危険度が有意に増加するアレル又はハプロタイプである。危険度が有意か否かの判定は、特定の疾患、ハプロタイプ、そして屡々環境因子を含む多様な因子に依存すると理解すべきであるが、有意性はオッズ比又は百分率で求めることができる。更に別の態様においては、有意性は百分率で求める。１つの態様においては、有意な危険度とはオッズ比が０．８以下又は少なくとも約１．２の場合であり、具体的にはオッズ比が０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．５、３．０、４．０、５．０、１０．０、１５．０、２０．０、２５．０、３０．０及び４０．０の場合が挙げられるが、これらに限定されるものではない。更に別の態様においては、オッズ比が少なくとも１．２の場合を有意とする。更に別の態様においては、オッズ比が少なくとも約１．５の場合を有意とする。更に別の態様においては、危険度の有意な増加又は低下とは、オッズ比が少なくとも約１．７の場合である。更に別の態様においては、危険度の有意な増加とは少なくとも約２０％の増加であり、具体的には、約２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％及び９８％の増加が挙げられるが、これらに限定されるものではない。更に別の態様においては、危険度の有意な増加又は低下は少なくとも約５０％の変化である。しかし、危険度が医学的に有意か否かの判定は、特定の疾患、アレルやハプロタイプ、そして屡々環境因子を含む多様な因子に依存することが理解されよう。
本発明はまた、個体におけるＴ２Ｄの危険度又は感受性を診断する方法であって、健常個体（対照）と比較して、Ｔ２Ｄに対して感受性を有する（発症している（affected））個体において存在頻度が高まっている、Ｔ２Ｄリスク遺伝子に含まれる危険性を示すハプロタイプのスクリーニングを包含し、ハプロタイプの存在が、Ｔ２Ｄに対する危険度又は感受性の指標となることを特徴とする方法に関する。
別の態様においては、本発明のＴ２Ｄリスク遺伝子のコードする１種又は数種のポリペプチドに関連する生物学的ネットワーク及び／又は代謝経路の状態及び／又は機能を評価することで、Ｔ２Ｄに対する感受性を診断することができる。生物学的ネットワーク及び／又は代謝経路の状態及び／又は機能は、例えば、対象生物から得た生物学的サンプルから生物学的ネットワーク及び／又は代謝経路に属する１種又は数種のポリペプチド又は代謝産物の量又は組成を測定することで、評価することができる。対象生物について観測した生物学的ネットワーク及び／又は代謝経路の状態及び／又は機能を、健常対照群における生物学的ネットワーク及び／又は代謝経路の状態及び／又は機能と比較することで、Ｔ２Ｄを発症する危険度を評価する。
診断方法に有用なキット（試薬キットなど）は、本明細書で説明したいかなる方法においても有用な構成成分を包含しており、そのような成分としては、例えば、以下のものが挙げられる：ＰＣＲプライマー、本明細書で説明したハイブリダイゼーション用のプローブやプライマー（標識したプローブやプライマーなど）、ＳＮＰマーカーのジェノタイピングのための試薬、標識分子を検出するための試薬、（ＲＦＬＰ分析などのための）制限酵素、アレル特異的なオリゴヌクレオチド、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、標識用酵素、変化した又は変化していない（本来の）Ｔ２Ｄ感受性ポリペプチドと結合する抗体、１種又は数種のＴ２Ｄリスク遺伝子を包含する核酸を増幅する手段、１種又は数種のＴ２Ｄリスク遺伝子の核酸配列を分析するための手段、又は１種又は数種のＴ２Ｄ感受性ポリペプチドのアミノ酸配列を分析するための手段。１つの態様においては、Ｔ２Ｄに対する感受性を診断するためのキットは、Ｔ２Ｄに対する感受性の高い個体において存在頻度が高まっている、危険性を示すハプロタイプを定義するマーカー含む、Ｔ２Ｄリスク遺伝子の断片の核酸増幅を行うためのプライマーを包含してもよい。このようなプライマーは、Ｔ２Ｄの指標となるＳＮＰに隣接する核酸配列の一部を用いて設計することができる。
本発明は、１回又は少数回のジェノタイピングを行い、Ｔ２Ｄを予測する能力に基づいてタイピングする変異を選択するという原則に基づいている。従って、ゲノムＤＮＡサンプル中の変異体のジェノタイピングはいかなる方法を用いてもよい。リアルタイムＰＣＲなどの非並列法を用いる場合には、ジェノタイピングは連続して行う。ＰＣＲ反応はマルチプレックスで行うか、あるいはそれぞれ独立系で連続して行うか、又は等量を用いて並列に行う。
本発明の検出方法は、対象生物の年齢、性別、喫煙状況、運動量、ウエスト/ヒップ比（waist-to-hip circumference ratio）（ｃｍ／ｃｍ）、対象生物のＴ２Ｄや肥満の家族歴、妊娠糖尿病の病歴、既に確認されているグルコース不耐性、肥満症、高トリグリセリド血症、低いＨＤＬコレステロール値、ＨＴとＢＰ上昇、に関する情報を組み合わせる工程を更に包含してもよい。本発明の検出方法は、血液、血清又は血漿中の、グルコース、総コレステロール、ＨＤＬコレステロール、ＬＤＬコレステロール、トリグリセリド、アポリポタンパクＢとＡＩ、フィブリノーゲン、フェリチン、トランスフェリン受容体、Ｃ反応性タンパク質、あるいは血清又は血漿インスリン濃度を測定する工程を更に包含してもよい。
Ｔ２Ｄを発症する確率を予測するスコアは、多変量故障時間モデル（multivariate failure time model）又はロジスティック回帰式を用いて計算することができる。上述した、本発明の方法に付加する更なる工程で得られる結果によって、Ｔ２Ｄの確率を以下のロジスティック回帰式で計算する工程が可能となる。
Ｔ２Ｄを発症する確率 ＝１／［１＋ｅ(−(−ａ＋Σ(ｂi×Ｘi))］
式中、ｅはネーピアの定数であり、ＸiはＴ２Ｄに関連した変数であり、ｂiは上記変数のロジスティック関数における係数であり、ａはロジスティック関数の定数項であるが、但し、ａ値とｂi値は、この方法を実施する集団から求められる値であることが好ましく、Ｘi値は、この方法を実施する集団で測定した変数から選ばれる値であることが好ましい。ｂi値は−２０と２０の間であることが好ましく、ｉ値は０（なし）と１００，０００の間であることが好ましい。ｂi値が負の係数であるということは、このマーカーが危険度の低下を示すことを意味し、正の係数であるということは、このマーカーが危険度の増加を示すことを意味する。Ｘi値は、ＳＮＰマーカーのように０又は１と表されるかコード化される２値変数である。加えてこのモデルには、変数Ｘiのいかなる相互作用（積）や項（例えば、ｂiＸi）が含まれてもよい。１年、２年、５年、１０年又は２０年以内にＴ２Ｄを発症する危険度を百分率で示す単純な予測を行うために、情報を組み合わせるアルゴリズムも開発されている。これに代わる統計学的モデルとしては、コックスの比例ハザードモデル、他の反復モデル及びニューラルネットワークモデルなどの故障時間モデルが挙げられる。
この試験は、Ｔ２Ｄを発症する危険度を試験するために実施することができ、スクリーニング又は素因の試験として健常者に実施することも、高リスク患者（即ち、Ｔ２Ｄの家族歴、妊娠糖尿病の病歴、既に確認されているグルコース不耐性、肥満症、あるいはこれらの組み合わせ、あるいは他のＴ２Ｄリスク因子の上昇のいずれかを示す者）に実施することもできる。
この方法は、成人におけるＴ２Ｄの予測又は早期診断、臨床試験のための対象者の層化と選択、及び／又は予防的及び治療的な集中介入を行う対象者の層化と選択に用いることができる。その目的は、治験薬の臨床試験及び健康管理のコスト削減である。
治療の経過のモニタリング
本発明はまた、１種又は数種のＴ２Ｄリスク遺伝子の発現（例えば、相対的又は絶対的な発現）に基づく、Ｔ２Ｄ治療の効果をモニタリングするための方法に関する。Ｔ２Ｄリスク感受性遺伝子のｍＲＮＡ、それがコードするポリペプチド、又はコードするポリペプチドの生物学的活性は、組織サンプル（例えば、末梢血サンプルや皮下脂肪生検）から測定することができる。ポリペプチドの発現や生物学的活性のレベルは、Ｔ２Ｄ治療剤による治療を行う前と治療の継続中に評価することができる。
また、Ｔ２Ｄ治療の効果は、本発明のＴ２Ｄリスク遺伝子のコードする１種又は数種のポリペプチドに関連する生物学的ネットワーク及び／又は代謝経路の状態及び／又は機能の評価によって追跡することができる。生物学的ネットワーク及び／又は代謝経路の状態及び／又は機能の評価は、例えば、治療開始の前と治療の継続中に対象生物から得た生物学的サンプルから、生物学的ネットワーク及び／又は代謝経路に属する１種又は数種のポリペプチドの量又は組成を測定することで行うことができる。又、治療開始の前と治療の継続中に対象生物から得た生物学的サンプルから、生物学的ネットワーク及び／又は代謝経路に属する１種又は数種の代謝産物を測定することで、生物学的ネットワーク及び／又は代謝経路の状態及び／又は機能を評価することもできる。Ｔ２Ｄ治療薬による処置に続く生物学的ネットワーク及び／又は代謝経路の状態及び／又は機能の変化について観察し、その結果を入手可能な健常対象者に関するデータと比較することで、治療の効果を評価する。
例えば、本発明の１つの態様においては、標的集団の一員である個体について、Ｔ２Ｄ阻害剤による治療に対する応答を評価する。評価は、末梢血、あるいは末梢血中の総細胞画分又は特定の細胞画分、あるいは細胞画分の組み合わせにおける、Ｔ２Ｄリスク遺伝子のコードするポリペプチドの生物学的活性、あるいはＴ２Ｄリスク遺伝子のコードするポリペプチド又はｍＲＮＡの絶対的及び／又は相対的なレベルを測定することで行う。
更に、Ｔ２Ｄリスク遺伝子の内部又は近傍（例えば１〜２００ｋｂの範囲内）に見られるハプロタイプや変異を定義するＳＮＰマーカーなどの変異型は、Ｔ２Ｄやその合併症を予防したり治療したりするための医薬製剤（pharmaceutical agent）に関して行う臨床試験の効力や効率を高めるために、Ｔ２Ｄを発症する危険性の高い個体を同定するのに用いることができる。危険性を示すハプロタイプやその他の変異型の存在は、他の経路が関与するＴ２Ｄを発症している患者を排除するか分別することで、試験する治療法に適した経路の関与する患者を集め、臨床試験の効力と感受性を増加させるために用いることもできる。このような変異型は、個体のための医薬製剤の選択を手引きする薬理遺伝学的試験（pharmacogenetic test）に用いることもできる。
実施例
研究対象集団： ＫＩＨＤコホートとＮＳＰコホート
ＫＩＨＤ： クオピオ虚血性心疾患危険因子研究（Kuopio Ischaemic Heart Disease Risk Factor Study、ＫＩＨＤ）とは、遺伝的均一性とＣＨＤの発症率が高いことで知られる東フィンランド創始者集団について、心血管障害、代謝性疾患及びそれらに関連した症状の遺伝的因子及びその他の危険因子を調査するために進行中の、集団に基づく前方視的なコホート研究（prospective population-based study）である（Salonen JT 1988、Salonen JT et al 1998, 1999、Tuomainen T-P et al 1999）。
研究対象となる集団は、基礎検査を実施した１９８４年〜１９８９年の時点で４２歳、４８歳、５４歳又は６０歳であったフィンランド東部在住の男性から無作為に抽出した年齢別サンプルである。１９８４年〜１９８９年の間に合計２６８２人の男性を検査した。男性コホートの１１年目の追跡調査期間に当たる１９９８年〜２００１年に最初の検査を実施した、人口から無作為に抽出した９２０人の女性によって、男性コホートを補完した。被験者の募集と検査方法については、既に詳細に報告した（Salonen JT 1988）。この研究は、クオピオ大学及び大学病院の研究倫理委員会（University of Kuopio and University Hospital Research Ethics Committee）の承認済みである。全ての参加者から書面による同意を得ている。
ＮＳＰ： 既に存在するＫＩＨＤコホートに加えて、２００３年には東フィンランドで大きな人口コホートを研究した。この「北サボプロジェクト」（“North Savo Project”）（ＮＳＰ）には、疾患、家族、薬物応答及び連絡先に関する情報の収集が含まれる。２００４年の１０月までに、１７，１００人の参加者にアンケートを実施した。この研究は、Ｔ２Ｄの発端者の同定、ＤＮＡ抽出のための血液の収集、及びそれを用いることの同意を得ることからなる。第２相の研究では、Ｔ２Ｄの発症例とＴ２Ｄを発症していない対照例の検査を行った。
発症例と対照例の定義
本研究の対照者は、ＫＩＨＤ又はＮＳＰの参加者だった。ＫＩＨＤにおいては、空腹時血糖値は、トリクロロ酢酸でタンパク質を沈殿させた後にグルコースデヒドロゲナーゼ法を用いて測定した。血清インスリンはNovo Biolabsラジオイムノアッセイキット（Novo Nordisk製）で測定した。ＮＳＰにおいては、重度の糖尿病は服薬調査と空腹時血糖値から評価した。空腹時血糖値は、少なくとも１２時間の、一晩の絶食後の全血サンプルを用い、トリクロロ酢酸（Granutest 100、Merck製）でタンパク質を沈殿させた後にグルコースデヒドロゲナーゼ法を用いて測定した。被験者（男／女）が、現在、食餌療法又は服薬によって血糖値を制御しているか、空腹時血糖値が６．７ｍｍｏｌ／Ｌ（１２０ｍｇ／ｄＬ）以上の場合に糖尿病と判定した。
発症例はＴ２Ｄ及びＴ２Ｄの家族歴を有していた。全てのＴ２Ｄ患者（発端者）に、少なくとも一人の罹患した親戚（即ち、発端者の親、兄弟／姉妹又は子供）がいた。大部分の患者に複数の罹患家族がいた。対照例には、Ｔ２ＤもＴ２Ｄの家族歴もない。研究の第１相においては、９３人の発症例と１５７人の対照例を、Affymetrix GeneChipRのヒト マッピング１００Ｋアッセイ（Affymetrix GeneChipR Human Mapping 100k assay）の技術アクセスバージョン（technology access version）又は市販バージョン（commercial version）を用いて解析した（第１解析）。研究の第２相においては、発症例に３０人、対照例に２９人を追加して、１２３人の発症例と１８６人の対照例を、Affymetrix GeneChipRのヒト マッピング１００Ｋアッセイの技術アクセスバージョン又は市販バージョンを用いて解析した。第３の解析は、８０人の発症例と３０人の対照例（いずれも第２解析に含まれていた）に基づいて、Affymetrix GeneChipRのヒト マッピング１００Ｋアッセイの市販バージョンのみを用いて行った。これら解析の結果をまとめて「結果」の項に示した。
他の表現型の測定
年齢と喫煙量は、インタビューワーの監督下で、自己記入式のアンケートに記入されたものである。ＨＤＬ画分は、超遠心分離と沈殿の組み合わせによって新鮮血清から分離した。リポタンパク質画分のコレステロール含量と血清トリグリセリド値は、酵素を用いて測定した。収縮期血圧と拡張期血圧は共に、朝に看護師によってランダムゼロ水銀血圧計で測定した。測定用プロトコルには、あおむけの状態で３回、立った状態で１回、座った状態で２回の測定を５分間隔で行うことが含まれる。６回の測定の平均値をＳＢＰとＤＢＰとして使用した（Salonen JT et al, 1998）。ボディマス指数（ＢＭＩ）は、身長の二乗に対する体重の比（ｋｇ／ｍ2）として計算した。ウエスト／ヒップ比（ＷＨＲ）は、ヒップのサイズ（大転子のところで測定）に対するウエストのサイズ（一番下の助骨と腸骨稜との中間点で測定した、吸気後の１つの測定値と排気後の１つの測定値の平均値）の比として計算した。
ゲノムＤＮＡの単離と定性試験
高分子量ゲノムＤＮＡサンプルを、凍結した静脈全血から標準的な方法を用いて抽出し、標準的なＴＥバッファーに溶解した。各ＤＮＡサンプルの量と純度は、２６０ｎｍと２８０ｎｍの吸光度を測定することで評価し、単離したＤＮＡサンプルの完全性は、０．９％アガロースゲル電気泳動とエチジウムブロマイド染色によって評価した。Ａ２６０／Ａ２８０比が１．７以上及び／又はアガロースゲル電気泳動で得た単離ＤＮＡの平均サイズが２０ｋｂを超えた場合に、サンプルはゲノムワイドスキャン（ＧＷＳ）に使用可能であると判断した。ＧＷＳ解析の前には、サンプルの濃度が５０ｎｇ／μｌとなるように還元型ＥＤＴＡ−ＴＥバッファー（TEKnova）で希釈した。
ゲノムワイドスキャン
Affymetrix GeneChipR ヒト マッピング１００Ｋアッセイの技術アクセスバージョン又は市販バージョンを用いて、ＳＮＰマーカーのジェノタイピングを行った。このアッセイは２つのアレイ、即ち、XbaとHindからなり、これらを用いて各ＤＮＡサンプルから１００，０００個を超えるＳＮＰマーカーのジェノタイピングを行った。アッセイは、製造者の提供する説明書に従って実施した。合計２５０ｎｇのゲノムＤＮＡをそれぞれのアッセイに付した。ＤＮＡサンプルは、Xba I又はHind III（New England Biolabs（ＮＥＢ）製）で消化した。具体的には、ＮＥバッファー２（１×、ＮＥＢ製）、ウシ血清アルブミン（１×、ＮＥＢ製）、及びXba I又はHind III（０．５Ｕ／μｌ、ＮＥＢ製）からなる混合溶液中で消化反応を＋３７℃で２時間行い、続いて酵素の不活化を＋７０℃で２０分間行った。Xba Ｉアダプター又はHind IIIアダプター（０．２５μＭ、Affymetrix製）、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼバッファー（１×、ＮＥＢ製）及びＴ４ ＤＮＡリガーゼ（２５０Ｕ、ＮＥＢ製）を消化したＤＮＡサンプルに加えることで、Xba Iアダプター又はHind IIIアダプターをサンプルに連結した。連結反応を＋１６℃で２時間行い、続いて＋７０℃で２０分間インキュベートした。連結したＤＮＡサンプルを７５μｌの分子生物学用の水（BioWhittaker Molecular Applications／Cambrex製）で希釈した。
１０μｌ等量のＤＮＡサンプルをPfx 増幅バッファー（Pfx Amplification Buffer）（１×、Invitrogen製）、ＰＣＲエンハンサー（１×、Invitrogen製）、ＭｇＳＯ4（１ｍＭ、Invitrogen製）、ｄＮＴＰ（各３００μＭ、Takara製）、ＰＣＲプライマー（1μＭ、Affymetrix製）及びPfx ポリメラーゼ（０．０５Ｕ／μｌ、Invitrogen製）と共に使用することで、希釈した連結ＤＮＡサンプルを１００μｌ容のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に同じ条件下で３〜４回付した。ＰＣＲを＋９４℃で３分間進行させた後に、＋９４℃で１５秒、＋６０℃で３０秒、＋６８℃で６０秒のサイクルを３０回行い、そして＋６８℃で７分の最後の伸長反応を実施した。ＰＣＲの性能は、１×ＴＢＥバッファー中での標準的な２％アガロースゲル電気泳動を１２０Ｖで１時間行うことで確認した。
ＰＣＲ産物の精製は、Affymetrixのマニュアルに従い、MinElute 96 UF ＰＣＲ精製キット（MinElute 96 UF PCR Purification kit）（Qiagen製）を用い、それぞれのサンプルについて得られた３〜４個のＰＣＲ産物をまとめて１回の精製反応に付すことで行った。精製したＰＣＲ産物は、４０μｌのＥＢバッファー（Qiagen製）で溶出し、産物の収率を２６０ｎｍの吸光度で測定した。合計４０μｇの各ＰＣＲ産物を、０．２Ｕ／μｌの断片化試薬（Affymetrix製）と１×断片化バッファー（Fragmentation Buffer）からなる断片化反応に付した。断片化反応は＋３７℃で３５分間行い、続いて＋９５℃で１５分間インキュベートすることで酵素を不活化した。断片化したＰＣＲ産物について、４％のＴＢＥゲル（４％ NuSieve：プラスアガロースが３：１、BMA Reliant製のプレキャストゲル）を使用して、１２０Ｖで３０〜４５分間電気泳動を行うことで、断片化が完全であるかどうかを確認した。
断片化したＰＣＲ産物は、次に１×ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（Terminal Deoxinucleotidyl Transferase）（TdT）バッファー（Affymetrix製）、GeneChip ＤＮＡ標識試薬（GeneChip DNA Labeling Reagent）（０．２１４ｍＭ、 Affymetrix製）とＴｄＴ（１．５Ｕ／μｌ、 Affymetrix製）を用いて、標識反応を＋３７℃で２時間行い、続いて＋９５℃で１５分間インキュベートした。標識したＤＮＡサンプルを、０．０５６ＭのＭＥＳ溶液（Sigma製）、５％のＤＭＳＯ（Sigma製）、２．５×デンハルト溶液（Sigma製）、５．７７ｍＭのＥＤＴＡ（Ambion製）、０．１１５ｍｇ／ｍｌのニシン精子ＤＮＡ（Promega製）、１×オリゴヌクレオチドコントロール試薬（Oligonucleotide Control reagent）（Affymetrix製）、１１．５μｇ／ｍｌのヒトＣｏｔ−１（Invitrogen製）、０．０１１５％のTween-20（Pierce製）及び２．６９Ｍの塩化テトラメチルアンモニウム（Sigma製）からなるハイブリダイゼーションバッファーと混合した。ＤＮＡ−ハイブリダイゼーションバッファー混合物は、対応するXba又はHind GeneChipRアレイとのハイブリダイゼーションを行う前に、＋９５℃で１０分間変性処理し、１０秒間氷冷してから、＋４８℃で２分間インキュベートした。ハイブリダイゼーションは、６０ｒｐｍ、＋４８℃の Affymetrix GeneChip ハイブリダイゼーションオーブンに１６〜１８時間入れることで完了した。ハイブリダイゼーションに続いて、アレイの染色と洗浄をGeneChip Fluidics Station 450の中で、推奨されるプロトコルであるMapping 10Kv1_450（技術アクセスバージョンのアレイ）又はマッピング100Kv1 450（市販バージョンのアレイ）に従って行った。アレイはGeneChip 3000スキャナーでスキャンし、アレイ上の各ＳＮＰマーカーに対するジェノタイプコール（genotype call）は、Affymetrix ジェノタイピングツール（Genotyping Tools）（GTT）ソフトウエア（技術アクセスバージョンのアレイについては、ＳＮＰコールアルゴリズムにおける信頼スコアを０．２０に調整した）又はGeneChip ＤＮＡ解析ソフトウエア２．０（ＧＤＡＳ）（市販バージョンのアレイ）を製造者の提供する標準的な設定で使用して作製した。
統計解析のためのＳＮＰの初期選択
統計解析を行う前に、ＳＮＰの質を次の３つの値に基づいて判定した：コール頻度（call rate）（ＣＲ）、マイナーアレル頻度（minor allele frequency）（ＭＡＦ）及びハーディワインバーグ平衡（Hardy-Weinberg equilibrium）（Ｈ−Ｗ）。コール頻度（ＣＲ）は、ジェノタイピングの成功したサンプルの比率を示す。この値は、遺伝型が正しいかどうかは考慮しない。コール頻度は、以下の式で求めた：ＣＲ＝ジェノタイプコールが得られたサンプルの数／サンプルの合計数。マイナーアレル頻度（ＭＡＦ）は、研究対象サンプルにより低い頻度で出現するアレルの頻度である。ＭＡＦは以下の式で求めた：ＭＡＦ＝min(p, q)［但し、ｐはＳＮＰアレル‘Ａ’の頻度であり、ｑはＳＮＰアレル‘Ｂ’の頻度であり、ｐ＝（遺伝型‘ＡＡ’を有するサンプルの数＋０．５×遺伝型‘ＡＢ’を有するサンプルの数）／ジェノタイプコールが得られたサンプルの数であり、ｑ＝１−ｐである］。ホモ接合型（ＭＡＦ＝０）のＳＮＰは遺伝子解析に用いることができないので取り除いた。ハーディワインバーグ（Ｈ−Ｗ）平衡は、対照のために試験した。この試験は、適合度を求めるための標準的なχ二乗検定に基づいている。観察された遺伝型の分布を、Ｈ−Ｗ平衡の元で予想される遺伝型分布と比較する。２つのアレルの場合、‘ＡＡ’、‘ＡＢ’と‘ＢＢ’という遺伝型に対する分布はそれぞれｐ2、２ｐｑとｑ2である。ＳＮＰがＨ−Ｗ平衡にない場合には、それはジェノタイピングの誤り又は未知のポピュレーションダイナミクス（例えば、機会的浮動や選択）によるものと考えられる。
対照群に基づいて、ＣＲ＞５０％であり、ＭＡＦ＞１％であり、更にＨ−Ｗ平衡にある（χ二乗検定の統計値＜２３．９３である）ＳＮＰのみを統計解析に使用した。合計で１００，８４８個のＳＮＰが上記の基準を満たし、統計解析に含まれた。
統計的手法
単一ＳＮＰ解析
発症例と対照例との間のアレル分布の差を、全部のＳＮＰについてスクリーニングした。スクリーニングは、ｄｆ＝１とした標準的なχ二乗独立検定（アレル分布、２×２のテーブル）で行った。Ｐ値が０．００５未満（ｄｆ＝１のχ2分布が７．８８以上）のＳＮＰを統計的に有意とみなし、表１に示した。オッズ比はａｄ／ｂｃの式に基づいて計算した（式中、ａは発症例のマイナーアレルの数、ｂは発症例のメジャーアレルの数、ｃは対照例のマイナーアレルの数、そしてｄは対照例のメジャーアレルの数である）。マイナーアレルは、特定のＳＮＰに対して、対照例において他のアレルよりも出現頻度の低いアレルと定義した。
ハプロタイプ解析
データのセットは、ＨＰＭソフトウエアを用いた、ハプロタイプパターンマイニング（pattern mining）のアルゴリズムて解析した（Toivonen HT et al, 2000）。ＨＰＭソフトウエアを用いる場合には、ジェノタイプのフェーズが分っていなければならない、即ち、母から受け継いだアレルと父から受け継いだアレルを判別しなければならない。家族データがない場合は、フェーズを集団データに基づいて推定しなければならない。我々は、フェーズを推定するためにHaploRecプログラム（Eronen L et al, 2004）を用いた。ＨＰＭは非常に高速で、１回の処理で大量のＳＮＰを扱うことができる。
フェーズの分っているデータについて、ＨＰＭは、フェーズ構造（phase configuration）の合致する全てのハプロタイプパターンを検出する。ハプロタイプパターンの長さは色々ある。例えば、４個のＳＮＰがあり、個体が有するアレルは、ＳＮＰ１についてはA／T、ＳＮＰ２についてはC／C、ＳＮＰ３についてはC／G、そしてＳＮＰ４についてはA／Cの場合、ＨＰＭは（HaploRecで）推定したフェーズと合致するハプロタイプパターンを考慮する。推定したフェーズが（母／父からの）ACGA と（父／母からの）TCCCの場合、ＨＰＭは、（長さが４個のＳＮＰの）たった２つのハプロタイプパターン：ACGA と TCCCを考慮する。
ＳＮＰのスコア付けは、症例群と対照群との間で異なるハプロタイプパターンにＳＮＰが含まれる回数に基づいて行われる（χ二乗値の閾値はユーザーが選択することができる）。スコア値の有意性は、順列検定に基づいて評価する。
ＨＰＭプログラムにおいて変更することのできるパラメーターとしては、χ二乗閾値（−ｘ）、最大ハプロタイプパターン長さ（−ｌ）、ハプロタイプパターンに含めることのできるワイルドカードの最大数（−ｗ）、及びＰ値を推定するための順列検定の回数（−ｐ）が挙げられる。ワイルドカードはハプロタイプ内にギャップが存在することを可能にする。HaploRec＋ＨＰＭプログラムは、パラメーターを次のように設定して実行した：５個のＳＮＰによるハプロタイプ解析（−ｘ９ −ｌ５ −ｗ１ −ｐ１００００）と８個のＳＮＰによるハプロタイプ解析（−ｘ９ −ｌ８ −ｗ１ −ｐ１００００）。HaploRec＋ＨＰＭは、ｄｂＳＮＰ１２４に示されたＳＮＰの順番に基づいていた。１０，０００回の反復（−ｐ１００００）に基づき、Ｐ値が０．００５未満のＳＮＰを統計的に有意とみなし、表２〜７に示した。
ハプロタイプ解析結果で使用する用語の定義
「ハプロタイプゲノム領域」や「ハプロタイプ領域」という用語は、ハプロタイプ解析（ＨＰＭ又は同様の統計的方法／プログラム）によって、有意であると判定されたゲノム領域である。ハプロタイプ領域は、統計解析（ハプロタイプ解析）に含まれた、最初／最後のＳＮＰの物理的な位置から１００Ｋｂｐ上流／下流の領域であり、統計的に有意と判定された領域と定義する。この領域は、ゲノムビルド（genome build）に基づく塩基対［例えば、ＮＣＢＩのヒトゲノムビルド３５（NCBI Human Genome Build 35）に従ったＳＮＰの物理的位置（塩基対の位置）］として得られる。
本明細書に記載される「ハプロタイプ」という用語は、任意のアレルの組み合わせを意味し、例えば、ある遺伝子マーカー（例えば、rs1418754、rs2797573、rs787663、rs10509650）に存在する C A G G である。定義したハプロタイプは遺伝子マーカー（ＳＮＰのｄｂＳＮＰ ｒｓ−ｉｄ）とそのアレルに名前を与える。当業者には認知されているように、ハプロタイプを定義するアレルを異なる鎖から求めることによって、同じハプロタイプであっても、異なった形で記載されることがある。例えば、本明細書に記載したハプロタイプrs1418754、rs2797573、rs787663、rs10509650（C A G G）は、全てのアレルをもう一方の鎖から決定したハプロタイプ rs1418754、rs2797573、rs787663、rs10509650（G T C C）や、１番目のアレルのみをもう一方の鎖から決定したハプロタイプ rs1418754、rs2797573、rs787663、rs10509650（G A G G）と同じである。
本願に記載したハプロタイプ、例えば、表２〜７に示したマーカーを有するものは、Ｔ２Ｄを発症していない個体よりも、Ｔ２Ｄを発症した個体においてより頻繁に見出される。従ってこれらのハプロタイプは、個体からＴ２ＤやＴ２Ｄに対する感受性を検出する上で予測的な価値を有する。ハプロタイプの検出は、多型部位に存在する配列を検出するために当業界で使用される方法で実施することができる。
本発明で開示した、Ｔ２Ｄ関連リスクを示すアレルとハプロタイプは、本発明のＴ２Ｄ関連遺伝子に位置する他の「多型部位」と関連してもよい。他のＴ２Ｄ関連多型部位は、遺伝子マーカーとして同等に有用であるか、あるいはリスク示す本発明のアレルやハプロタイプとＴ２Ｄとの間に見られる関連性を説明する、病因となる変異としてより有用である。
結果
表１には、第１のゲノムスキャンと第２のゲノムスキャンで得た個別マーカーの解析結果の総計から、Ｔ２Ｄと最も強力な関連性が見出されたＳＮＰマーカーの特徴をまとめた。ＳＮＰ登録番号は、ＮＣＢＩ ｄｂＳＮＰデータベース ビルド１２４（NCBI db SNP database build 124）に基づく。ＳＮＰの物理的位置は、ＮＣＢＩ ヒト ゲノム ビルド３５．１（NCBI Human Genome Build 35.1）に基づく。遺伝子座は、ＮＣＢＩ ｄｂＳＮＰ データベース ビルド１２４で報告されたものである。ＳＮＰ隣接配列は、Affymetrix "csv" 市販ヒトマッピング１００Ｋアレイ用アノテーションファイル（Affymetrix "csv" commercial access Human Mapping 100K array annotation files）の提供するものである。ＳＮＰの物理的位置から１００Ｋｂｐ上流／下流の範囲内に位置する遺伝子は、ＮＣＢＩ ヒト ゲノム ビルド３５．１に基づいて提供する。
表２には、第１のゲノムスキャンで行った、５個のＳＮＰを用いたハプロタイプ共有解析（HaploRec＋ＨＰＭ）において、Ｔ２Ｄと最も強力な関連性が見出されたハプロタイプゲノム領域の特徴をまとめた。ＳＮＰ登録番号は、ＮＣＢＩ ｄｂＳＮＰ データベース ビルド１２４に基づく。ＳＮＰの物理的位置は、ＮＣＢＩヒトゲノム ビルド３５．１に基づく。ハプロタイプ遺伝子含有量、即ち、ハプロタイプゲノム領域の両端に位置するＳＮＰの物理的位置から１００Ｋｂｐ上流／下流の領域内に位置する遺伝子は、ＮＣＢＩヒトゲノム ビルド３５．１に基づいて、ＮＣＢＩマップビューワー（NCBI MapViewer）で見出した。ＳＮＰ隣接配列は、Affymetrix "csv" 市販ヒトマッピング１００Ｋアレイ用アノテーションファイルの提供するものである。
表３には、第１のゲノムスキャンで行った、８個のＳＮＰを用いたハプロタイプ共有解析（HaploRec＋ＨＰＭ）において、Ｔ２Ｄと最も強力な関連性が見出されたハプロタイプゲノム領域の特徴をまとめた。注釈は表２と同じである。
表４には、第１のゲノムスキャンで得たχ二乗値に基づき、Ｔ２Ｄと最も強力な関連性が見出されたハプロタイプブロック領域と、それに対応する、危険性を示すハプロタイプを列挙した。χ二乗値は、以下の１）〜４）の個体群に関する数値の入ったセルを用いた２×２χ二乗試験で計算した：１）危険性を示すハプロタイプを保有し、Ｔ２Ｄを発症している個体群、２）危険性を示すハプロタイプを保有するが、Ｔ２Ｄを発症していない個体群、３）危険性を示すハプロタイプを保有しないが、Ｔ２Ｄを発症している個体群、及び４）危険性を示すハプロタイプを保有せず、Ｔ２Ｄを発症していない個体群。ＳＮＰ登録番号は、ＮＣＢＩ ｄｂＳＮＰ データベース ビルド１２４に基づく。
表５には、第２のゲノムスキャンで行った、５個のＳＮＰを用いたハプロタイプ共有解析（HaploRec＋ＨＰＭ）において、Ｔ２Ｄと最も強力な関連性が見出されたハプロタイプゲノム領域の特徴をまとめた。注釈は表２と同じである。
表６には、第２のゲノムスキャンで行った、８個のＳＮＰを用いたハプロタイプ共有解析（HaploRec＋ＨＰＭ）において、Ｔ２Ｄと最も強力な関連性が見出されたハプロタイプゲノム領域の特徴をまとめた。注釈は表２と同じである。
表７には、第２のゲノムスキャンで得たχ二乗値に基づき、Ｔ２Ｄと最も強力な関連性が見出されたハプロタイプブロック領域と、それに対応する、危険性を示すハプロタイプを列挙した。χ二乗値は、表４と同様に計算した。
表８には、第３のゲノムスキャンで行った個別マーカーの解析において、Ｔ２Ｄと最も強力な関連性が見出されたＳＮＰマーカーの特徴をまとめた。注釈は表１と同じである。
表９には、第３のゲノムスキャンで行った、５個のＳＮＰを用いたハプロタイプ共有解析（HaploRec＋ＨＰＭ）において、Ｔ２Ｄと最も強力な関連性が見出されたハプロタイプゲノム領域の特徴をまとめた。注釈は表２と同じである。
表１０には、第３のゲノムスキャンで行った、８個のＳＮＰを用いたハプロタイプ共有解析（HaploRec＋ＨＰＭ）において、Ｔ２Ｄと最も強力な関連性が見出されたハプロタイプゲノム領域の特徴をまとめた。注釈は表２と同じである。
表１１と表１２には、Ｔ２Ｄを予測する多変量ロジスティックモデルの結果を示した。このモデルは、使用するマイクロアレイの種類に応じて調節した、即ち、サンプルは、ダミー変数（０、１）を加えてearly access Affymetrix １００Ｋで解析するか、Affymetrix １００Ｋアレイの市販バージョンで解析した。回帰モデルにおいては、リスクアレルを独立変数とみなした。ＳＮＰのコードは０、１又は２であり、コード２はマイナーアレルのホモ接合性を表し、コード１は非マイナーアレルのヘテロ接合性を表し、コード０は非マイナーアレルのホモ接合性を表す。注釈は前出の表と同じである。
表１３には、全３回のゲノムスキャンで行った点別の解析及びハプロタイプ解析によって、Ｔ２Ｄとの関連性が見出された全ての遺伝子を列挙した。遺伝子の名称は、ＨＵＧＯの遺伝子専門用語委員会（HUGO Gene Nomenclature Committee）（ＨＧＮＣ）に従った。
推測と考察
我々は、集団に基づく家族性の症例群と家族歴のない健康な対照群から、Ｔ２Ｄの危険度と関連する４６８５個のＳＮＰマーカーを見出した。これらの内、１６３７個を個別ＳＮＰの解析で同定し、３７５１個をハプロタイプ共有解析で同定した。４６８５個のマーカーの内、７０３個は両方の統計解析でＴ２Ｄを予測した。Ｔ２Ｄの危険度と関連する４６８５個のＳＮＰマーカーの内、２４０７個のＳＮＰマーカーは遺伝子内に存在した。
点別の解析とハプロタイプ解析の結果によって、合計３０４８個の遺伝子がＴ２Ｄと関連するものとして同定され、この内、９０３個の遺伝子には、４６８５個のＳＮＰマーカーの内の少なくとも１個が物理的に結合していた。
こうして我々は、その遺伝子マーカーがいずれもＴ２Ｄの予測に用いることのできる、合計３０４８個のＴ２Ｄ遺伝子を同定した。従って、これらのマーカーは、Ｔ２Ｄ素因に対する分子診断試験の一部として用いることができる。更に我々は、Ｔ２Ｄ予測性の４６８５個のＳＮＰマーカーのセットを開示した。これらマーカーは、抗高脂血性の薬剤や化合物の効果や副作用を予測する薬理遺伝学試験の一部として用いることができる。発見した遺伝子は、新しいＴ２Ｄ治療法、例えば薬物、の標的となる。他の治療法としては、遺伝子導入を含む分子治療が挙げられる。これらの新しい遺伝子は、抗高血圧性の薬剤や化合物を研究するための新規なトランスジェニック動物の開発と製産にも使用することができる。
本発明をその好ましい態様に参照しながら具体的に開示し説明したが、当業者は、請求の範囲で定義した本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、本発明の形態及びその細部に変更を加えることが可能であることを理解するであろう。
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配列番号３７３３： ６番目の塩基ｎは、ａ、ｃ、ｇ又はｔである。

Claims (115)

  1. 対象哺乳動物の２型糖尿病（Ｔ２Ｄ）又はＴ２Ｄ関連疾患について、危険度の評価、診断又は予後判定を行うための方法であって、
    ａ）対象哺乳動物から得た生物学的サンプルを提供し、
    ｂ）該サンプル中の１種又は数種のバイオマーカーであって、表１３に示したＴ２Ｄ関連遺伝子あるいは該遺伝子のコードするタンパク質又はポリペプチドに関連するものを評価し、そして
    ｃ）上記工程（ｂ）で得たバイオマーカーに関するデータを、健常群及び疾病群から得たバイオマーカーに関するデータと比較して、Ｔ２Ｄ又はＴ２Ｄ関連疾患について、危険度の評価、診断又は予後判定を行う
    ことを包含する方法。
  2. 該バイオマーカーが、表１３に示したＴ２Ｄ関連遺伝子が含まれるゲノム領域に存在する多型部位であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  3. 該バイオマーカーが、表１〜１２に示した一塩基多型（ＳＮＰ）マーカーから選ばれることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  4. 該バイオマーカーが、表１〜１２に示した１種又は数種のＳＮＰマーカーに関連する多型部位であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  5. 該バイオマーカーが、表１〜１２に示した１種又は数種のＳＮＰマーカーと完全な連鎖不平衡状態にある多型部位であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  6. 該バイオマーカーが、１種又は数種の該Ｔ２Ｄ関連遺伝子の発現産物であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  7. 該バイオマーカーが、１種又は数種の該Ｔ２Ｄ関連遺伝子の転写産物であることを特徴とする、請求項６に記載の方法。
  8. 該バイオマーカーが、１種又は数種の該Ｔ２Ｄ関連遺伝子の翻訳産物であることを特徴とする、請求項６に記載の方法。
  9. 該バイオマーカーが、１種又は数種の該Ｔ２Ｄ関連遺伝子のコードするポリペプチドの生物学的活性の測定値であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  10. 該バイオマーカーが、１種又は数種の該Ｔ２Ｄ関連遺伝子のコードするポリペプチドの生物学的機能の測定値であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  11. 該バイオマーカーが、１種又は数種の該Ｔ２Ｄ関連遺伝子のコードするポリペプチドの代謝産物であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  12. 該バイオマーカーが、該Ｔ２Ｄ関連遺伝子、タンパク質又はポリペプチドの内因性又は外因性の調節因子に関連することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  13. 該バイオマーカーが、１種又は数種の該Ｔ２Ｄ関連遺伝子のコードするポリペプチドに特異的な一組の抗体であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  14. 該バイオマーカーが、請求項２〜１３で定義したバイオマーカーからなる群より選ばれる複数のバイオマーカーの組み合わせであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  15. Ｔ２Ｄ又はＴ２Ｄ関連疾患を発症する危険度が変化した対象生物を同定するために用いることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  16. Ｔ２Ｄ又はＴ２Ｄ関連疾患を発症した対象生物について、Ｔ２Ｄのサブタイプを診断するために用いることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  17. Ｔ２Ｄ又はＴ２Ｄ関連疾患を発症した対象生物にとって効率的且つ安全なＴ２Ｄの治療法を選択するために用いることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  18. Ｔ２Ｄ又はＴ２Ｄ関連疾患を発症した対象生物に施した治療の効果を追跡するために用いることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  19. Ｔ２Ｄ又はＴ２Ｄ関連疾患を発症した対象生物において、特定の療法がＴ２Ｄを治療する効果を予測するために用いることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  20. Ｔ２Ｄ又はＴ２Ｄ関連疾患を発症する危険度の高まった対象生物にとって効率的且つ安全なＴ２Ｄの予防法を選択するために用いることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  21. Ｔ２Ｄ又はＴ２Ｄ関連疾患を発症する危険度の高まった対象生物に施した予防法の効果を追跡するために用いることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  22. Ｔ２Ｄ又はＴ２Ｄ関連疾患を発症する危険度の高まった対象生物において、特定の療法がＴ２Ｄを予防する効果を予測するために用いることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  23. 対象生物の家系を評価するためのマーカーのセットを使用することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  24. 対象生物の家系を評価するために、ＳＮＰマーカーのセットを使用することを特徴とする、請求項２３に記載の方法。
  25. 個体の家系を評価するために、マイクロサテライトマーカーのセットを使用することを特徴とする、請求項２３に記載の方法。
  26. Ｔ２Ｄ又はＴ２Ｄ関連疾患について、危険度の評価、診断又は予後判定を行うために、非遺伝学的情報をバイオマーカーに関するデータと組み合わせる工程を更に包含する、請求項１に記載の方法。
  27. 非遺伝学的情報が、年齢、性別、人種、社会経済的状態、妊娠糖尿病の病歴、対象生物の他の病歴、関連疾患の家族歴、精神的性向と精神状態、行動パターンと習慣、生化学検査結果、臨床検査結果、及び肥満症と過脂肪症に関する検査結果に関するものであることを特徴とする、請求項２６に記載の方法。
  28. 対象生物の他の病歴が、メタボリック症候群、グルコース不耐性、インスリン耐性の増加、肥満、腎臓病、甲状腺機能低下症、甲状腺機能亢進症、下垂体の異常、視床下部の異常、膵臓疾患、食欲・摂食障害、運動を妨げる病態、低体重児及び未熟児からなる群より選ばれる少なくとも１種に関するものであることを特徴とする、請求項２７に記載の方法。
  29. 関連疾患の家族歴が、１型及び２型糖尿病、妊娠糖尿病、他の糖尿病、メタボリック症候群、グルコース不耐性、インスリン耐性の増加、肥満、甲状腺機能低下症、甲状腺機能亢進症、下垂体の異常、視床下部の異常、膵臓疾患、及び食欲・摂食障害に関するものであることを特徴とする、請求項２７に記載の方法。
  30. 生化学検査結果に、ヒトの組織及び体液中の脂質、リポタンパク質、炭水化物、及びペプチドとタンパク質の測定結果が含まれることを特徴とする、請求項２７に記載の方法。
  31. タンパク質の測定結果に、プロホルモン、ホルモン、酵素及び受容体の測定結果が含まれることを特徴とする、請求項３０に記載の方法。
  32. タンパク質の測定結果に、以下のタンパク質及びペプチドの測定結果が含まれることを特徴とする、請求項３０又は３１に記載の方法。
    糖化ペプチドや糖化タンパク質、糖化最終産物、酸化修飾タンパク質や酸化修飾ペプチド、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド（ＧＬＰ）、他のインスリン分泌刺激ペプチド、プロインスリン、インスリン、インスリン分解酵素、成長ホルモン、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＴＲＨ）、ＴＲＨ様ペプチド、プロラクチン、アミリン、ホモシステイン、Ｃ−ペプチド、レプチン、アジポネクチン、グレリン、ガストリン、レジスチン、オベスタチン、インクレチン、軽度慢性炎のマーカー（ＴＮＦα、ＩＬ−６、Ｃ反応性タンパク質など）、ジペプチジルぺプチダーゼIV、エンドセリン、下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ペプチド（ＰＡＣＡＰ）、血管作動性腸管ペプチド（ＶＩＰ）、視床下部調節ペプチド、オピオイドペプチド、神経ペプチドＹ、アドレノメデュリン、心房性ナトリウム利尿ペプチドや脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ，ＢＮＰ）、ヒートショックタンパク質由来ペプチド、フェリチン、トランスフェリン、セルロプラスミン、アルブミン、上記ペプチドに関連する内因性の活性化因子、阻害因子、不活化因子、受容体と分解因子、及び上記ペプチドの合成や放出に関与する酵素。
  33. 肥満症と過脂肪症に関する検査結果に、身長、体重、ボディマス指数（ｋｇ／ｍ2）、ウエストのサイズ、ウエスト／ヒップ比、皮下脂肪の厚み、脂肪組織の厚み、体脂肪量と体脂肪率が含まれることを特徴とする、請求項２７に記載の方法。
  34. 行動パターンと習慣に、喫煙、運動、食事による栄養摂取、塩分摂取、アルコール摂取とその消費パターン、並びにコーヒーの消費量とその質が含まれることを特徴とする、請求項２７に記載の方法。
  35. 下記ロジスティック回帰式を用いて、Ｔ２Ｄの危険度を計算する工程を更に包含する、請求項１に記載の方法。
    Ｔ２Ｄの危険度 ＝［１＋ｅ-(a+Σ(bi×Xi)］-1
    式中、ｅはネーピアの定数であり、ＸiはＴ２Ｄの危険度に関連した変数であり、ｂiは上記変数のロジスティック関数における係数であり、ａはロジスティック関数の定数項である。
  36. ａ値とｂi値が、この方法を実施する集団から求められる値であることを特徴とする、請求項３５に記載の方法。
  37. Ｘi値が、この方法を実施する集団で測定した変数から選ばれる値であることを特徴とする、請求項３５に記載の方法。
  38. Ｘi値が、表１〜１２のＳＮＰマーカー、表２、３、４、５、６、７、９及び１０のハプロタイプ、並びに本発明の非遺伝学的変数から選ばれる値であることを特徴とする、請求項３５に記載の方法。
  39. 下記条件の少なくとも一方を満足することを特徴とする、請求項３５に記載の方法。
    ｂi値が−２０〜２０の範囲内である、及び
    Ｘi値が、−９９９９９〜９９９９９の範囲以内であるか、０又は１とコード化される変数である。
  40. ｉ値が０（即ち、なし）〜１００，０００の範囲内であることを特徴とする、請求項３５に記載の方法。
  41. 対象生物がＴ２Ｄを発症する短期危険度、中期危険度及び長期危険度の少なくとも１つを予測することを特徴とする、請求項３５に記載の方法。
  42. Ｔ２Ｄ又はＴ２Ｄ関連疾患について、危険度の評価、診断又は予後判定を行うための、請求項１の方法に基づく試験キットであって、
    ａ）生物学的サンプル中の１種又は数種のバイオマーカーであって、表１３に示したＴ２Ｄ関連遺伝子、あるいは該遺伝子のコードするタンパク質又はポリペプチドに関連するバイオマーカーの種類とレベルの少なくとも一方を評価するための試薬、材料及びプロトコル、並びに
    ｂ）バイオマーカーに関して対象生物から得たデータを、健常群及び疾病群から得たバイオマーカーに関するデータと比較して、Ｔ２Ｄ又はＴ２Ｄ関連疾患の危険度の評価、診断又は予後判定を行うための手引き書とソフトウエア
    を包含する試験キット。
  43. 表１３に示したＴ２Ｄ関連遺伝子が含まれるゲノム領域に存在する１種又は数種の多型部位を含有する核酸断片を増幅するためのＰＣＲプライマーのセットを更に包含する、請求項４２に記載の試験キット。
  44. 表１３に示したＴ２Ｄ関連遺伝子が含まれるゲノム領域に存在する１種又は数種の多型部位に特異的に結合する捕捉用核酸プローブのセットを包含する、請求項４２に記載のキット。
  45. ジェノタイプを評価するためのマイクロアレイ又はマルチウエルプレートを包含する、請求項４２に記載の試験キット。
  46. 対象生物から個体情報と臨床情報を集めるためのアンケート及び手引き書、並びに
    Ｔ２Ｄ又はＴ２Ｄ関連疾患の危険度の評価、診断又は予後判定を行うために、個体情報と臨床情報をバイオマーカーに関するデータと組み合わせるためのソフトウエアとその手引き書
    を更に包含することを特徴とする、請求項４２に記載の試験キット。
  47. 個体情報と臨床情報からなる非遺伝学的情報が、年齢、性別、人種、社会経済的状態、妊娠糖尿病の病歴、対象生物の他の病歴、関連疾患の家族歴、精神的性向と精神状態、行動パターンと習慣、生化学検査結果、臨床検査結果、及び肥満症と過脂肪症に関する検査結果に関するものであることを特徴とする、請求項４６に記載の試験キット。
  48. 対象生物の他の病歴が、メタボリック症候群、グルコース不耐性、インスリン耐性の増加、肥満、腎臓病、甲状腺機能低下症、甲状腺機能亢進症、下垂体の異常、視床下部の異常、膵臓疾患、食欲・摂食障害、運動を妨げる病態、低体重児及び未熟児からなる群より選ばれる少なくとも１種に関するものであることを特徴とする、請求項４７に記載の試験キット。
  49. 関連疾患の家族歴が、１型及び２型糖尿病、妊娠糖尿病、他の糖尿病、メタボリック症候群、グルコース不耐性、インスリン耐性の増加、肥満、甲状腺機能低下症、甲状腺機能亢進症、下垂体の異常、視床下部の異常、膵臓疾患、及び食欲・摂食障害に関するものであることを特徴とする、請求項４７に記載の試験キット。
  50. 生化学検査結果に、ヒトの組織及び体液中の脂質、リポタンパク質、炭水化物、及びペプチドとタンパク質の測定結果が含まれることを特徴とする、請求項４７に記載の試験キット。
  51. タンパク質の測定結果に、プロホルモン、ホルモン、酵素及び受容体の測定結果が含まれることを特徴とする、請求項５０に記載の試験キット。
  52. タンパク質の測定結果に、以下のタンパク質及びペプチドの測定結果が含まれることを特徴とする、請求項５０又は５１に記載の試験キット。
    糖化ペプチドや糖化タンパク質、糖化最終産物、酸化修飾タンパク質や酸化修飾ペプチド、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド（ＧＬＰ）、他のインスリン分泌刺激ペプチド、プロインスリン、インスリン、インスリン分解酵素、成長ホルモン、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＴＲＨ）、ＴＲＨ様ペプチド、プロラクチン、アミリン、ホモシステイン、Ｃ−ペプチド、レプチン、アジポネクチン、グレリン、ガストリン、レジスチン、オベスタチン、インクレチン、軽度慢性炎のマーカー（ＴＮＦα、ＩＬ−６、Ｃ反応性タンパク質など）、ジペプチジルぺプチダーゼIV、エンドセリン、下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ペプチド（ＰＡＣＡＰ）、血管作動性腸管ペプチド（ＶＩＰ）、視床下部調節ペプチド、オピオイドペプチド、神経ペプチドＹ、アドレノメデュリン、心房性ナトリウム利尿ペプチドや脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ，ＢＮＰ）、ヒートショックタンパク質由来ペプチド、フェリチン、トランスフェリン、セルロプラスミン、アルブミン、上記ペプチドに関連する内因性の活性化因子、阻害因子、不活化因子、受容体と分解因子、及び上記ペプチドの合成や放出に関与する酵素。
  53. 肥満症と過脂肪症に関する検査結果に、身長、体重、ボディマス指数（ｋｇ／ｍ2）、ウエストのサイズ、ウエスト／ヒップ比、皮下脂肪の厚み、脂肪組織の厚み、体脂肪量と体脂肪率が含まれることを特徴とする、請求項４７に記載の試験キット。
  54. 行動パターンと習慣に、喫煙、運動、食事による栄養摂取、塩分摂取、アルコール摂取とその消費パターン、並びにコーヒーの消費量とその質が含まれることを特徴とする、請求項４７に記載の試験キット。
  55. 該バイオマーカーが、表１３に示したＴ２Ｄ関連遺伝子が含まれるゲノム領域に存在する多型部位であることを特徴とする、請求項４２に記載の試験キット。
  56. 該バイオマーカーが、表１〜１２に示したＳＮＰマーカーから選ばれることを特徴とする、請求項４２に記載の試験キット。
  57. 該バイオマーカーが、表１〜１２に示した１種又は数種のＳＮＰマーカーに関連する多型部位であることを特徴とする、請求項４２に記載の試験キット。
  58. 該バイオマーカーが、表１〜１２に示した１種又は数種のＳＮＰマーカーと完全な連鎖不平衡状態にある多型部位であることを特徴とする、請求項４２に記載の試験キット。
  59. 該バイオマーカーが、１種又は数種の該Ｔ２Ｄ関連遺伝子の発現産物であることを特徴とする、請求項４２に記載の試験キット。
  60. 該バイオマーカーが、１種又は数種の該Ｔ２Ｄ関連遺伝子の転写産物であることを特徴とする、請求項５９に記載の試験キット。
  61. 該バイオマーカーが、１種又は数種の該Ｔ２Ｄ関連遺伝子の翻訳産物であることを特徴とする、請求項５９に記載の試験キット。
  62. 該バイオマーカーが、１種又は数種の該Ｔ２Ｄ関連遺伝子のコードするポリペプチドの生物学的活性の測定値であることを特徴とする、請求項４２に記載の試験キット。
  63. 該バイオマーカーが、１種又は数種の該Ｔ２Ｄ関連遺伝子のコードするポリペプチドの生物学的機能の測定値であることを特徴とする、請求項４２に記載の試験キット。
  64. 該バイオマーカーが、１種又は数種の該Ｔ２Ｄ関連遺伝子のコードするポリペプチドの代謝産物であることを特徴とする、請求項４２に記載の試験キット。
  65. 該バイオマーカーが、該Ｔ２Ｄ関連遺伝子、タンパク質又はポリペプチドの内因性又は外因性の調節因子に関連することを特徴とする、請求項４２に記載の試験キット。
  66. 該バイオマーカーが、１種又は数種の該Ｔ２Ｄ関連遺伝子のコードするポリペプチドに特異的な一組の抗体であることを特徴とする、請求項４２に記載の試験キット。
  67. 該バイオマーカーが、請求項５５〜６６の試験キットで使用するバイオマーカーからなる群より選ばれる複数のバイオマーカーの組み合わせであることを特徴とする、請求項４２に記載の試験キット。
  68. Ｔ２Ｄ又はＴ２Ｄ関連疾患を発症する危険度が変化した対象生物を同定するために用いることを特徴とする、請求項４２に記載の試験キット。
  69. Ｔ２Ｄ又はＴ２Ｄ関連疾患を発症した対象生物について、Ｔ２Ｄのサブタイプを診断するために用いることを特徴とする、請求項４２に記載の試験キット。
  70. Ｔ２Ｄ又はＴ２Ｄ関連疾患を発症した対象生物にとって効率的且つ安全なＴ２Ｄの治療法を選択するために用いることを特徴とする、請求項４２に記載の試験キット。
  71. Ｔ２Ｄ又はＴ２Ｄ関連疾患を発症した対象生物に施した治療の効果を追跡するために用いることを特徴とする、請求項４２に記載の試験キット。
  72. Ｔ２Ｄ又はＴ２Ｄ関連疾患を発症した対象生物において、特定の療法がＴ２Ｄを治療する効果を予測するために用いることを特徴とする、請求項４２に記載の試験キット。
  73. Ｔ２Ｄ又はＴ２Ｄ関連疾患を発症する危険度の高まった対象生物にとって効率的且つ安全なＴ２Ｄ予防法を選択するために用いることを特徴とする、請求項４２に記載の試験キット。
  74. Ｔ２Ｄ又はＴ２Ｄ関連疾患を発症する危険度の高まった対象生物に施した予防法の効果を追跡するために用いることを特徴とする、請求項４２に記載の試験キット。
  75. Ｔ２Ｄ又はＴ２Ｄ関連疾患を発症する危険度の高まった対象生物において、特定の療法がＴ２Ｄを予防する効果を予測するために用いることを特徴とする、請求項４２に記載の試験キット。
  76. 対象生物の家系を評価するためのマーカーのセットを使用することを特徴とする、請求項４２に記載の試験キット。
  77. 対象生物の家系を評価するために、ＳＮＰマーカーのセットを使用することを特徴とする、請求項７６に記載の試験キット。
  78. 個体の家系を評価するために、マイクロサテライトマーカーのセットを使用することを特徴とする、請求項７６に記載の試験キット。
  79. 対象哺乳動物のＴ２Ｄ又はＴ２Ｄ関連疾患を予防又は治療するための方法であって、表１３に示したＴ２Ｄ関連遺伝子のコードするタンパク質又はポリペプチドの生物学的な活性又は機能を調節する治療法を包含する方法。
  80. 表１３に示した１種又は数種のＴ２Ｄ関連遺伝子の発現を増加又は低下させる治療剤の有効量を、治療を必要とする対象哺乳動物に投与することを包含する、請求項７９に記載の方法。
  81. 表１３に示したＴ２Ｄ関連遺伝子のコードするタンパク質又はポリペプチドの生物学的な活性又は機能を亢進又は低下させる治療剤の有効量を、治療を必要とする対象哺乳動物に投与することを特徴とする、請求項７９に記載の方法。
  82. 表１３に示したＴ２Ｄ関連遺伝子のコードするタンパク質又はポリペプチドに関連した生物学的ネットワーク及び代謝経路の少なくとも一方に含まれる１種又は数種の遺伝子の発現を増加又は低下させる治療剤の有効量を、治療を必要とする対象哺乳動物に投与することを特徴とする、請求項７９に記載の方法。
  83. 表１３に示したＴ２Ｄ関連遺伝子のコードするタンパク質又はポリペプチドに関連した生物学的ネットワーク及び代謝経路からなる群より選ばれる１種又は数種の活性を亢進又は低下させる治療剤の有効量を、治療を必要とする対象哺乳動物に投与することを特徴とする、請求項７９に記載の方法。
  84. Ｔ２Ｄ又はＴ２Ｄ関連疾患に関与し、且つ、表１３に示したＴ２Ｄ関連遺伝子のコードするポリペプチドに関連する１種又は数種の病態生理学的経路の活性を亢進又は低下させる治療剤の有効量を、治療を必要とする対象哺乳動物に投与することを特徴とする、請求項７９に記載の方法。
  85. Ｔ２Ｄを発症していない健常対象生物と比べて該哺乳動物において変化している、表１３に示したＴ２Ｄ関連遺伝子のコードする１種又は数種のタンパク質又はポリペプチドの生物学的活性の少なくとも一部を修復する治療法を包含することを特徴とする、請求項７９に記載の方法。
  86. Ｔ２Ｄを発症していない健常対象生物と比べて該哺乳動物において変化している、表１３に示した１種又は数種のＴ２Ｄ関連遺伝子の発現の少なくとも一部を修復する治療法を包含することを特徴とする、請求項７９に記載の方法。
  87. 遺伝子治療又は遺伝子導入を包含することを特徴とする、請求項７９に記載の方法。
  88. 該治療が、表１３に示したＴ２Ｄ関連遺伝子、その変異体、断片又は誘導体の１種又は数種の導入を含むことを特徴とする、請求項８７に記載の方法。
  89. 表１３に示したＴ２Ｄ関連遺伝子、その変異体、断片又は誘導体が、Ｔ２Ｄ又はＴ２Ｄ関連疾患の危険度の低下と関連することを特徴とする、請求項８８に記載の方法。
  90. 該治療が、対象生物の体細胞、幹細胞又は病変組織における遺伝子調節領域及び遺伝子含有領域の少なくとも一方の処置を包含し、該遺伝子は、表１３に示した１種又は数種のＴ２Ｄリスク遺伝子、その変異体、断片又は誘導体であることを特徴とする、請求項８７に記載の方法。
  91. 該治療が、表１３に示したＴ２Ｄリスク遺伝子、その変異体、断片又は誘導体のコードする組み換えポリペプチドの使用を包含することを特徴とする、請求項７９に記載の方法。
  92. 該治療が、表１３に示したＴ２Ｄリスク遺伝子のコードするタンパク質又はポリペプチドに結合する抗体の使用を包含することを特徴とする、請求項７９に記載の方法。
  93. 該治療が、表１３に示したＴ２Ｄ関連遺伝子のコードするタンパク質又はポリペプチドに結合する薬剤の使用を包含することを特徴とする、請求項７９に記載の方法。
  94. 該治療が、表１３に示したＴ２Ｄ関連遺伝子に対するｈｎＲＮＡ及びｍＲＮＡの少なくとも一方とハイブリダイズする、ｓｉＲＮＡなどの配列特異的な遺伝子サイレンシング薬に基づくことを特徴とする、請求項７９に記載の方法。
  95. 該治療が、ｈｎＲＮＡ及びｍＲＮＡの少なくとも一方とハイブリダイズする、ｓｉＲＮＡなどの配列特異的な遺伝子サイレンシング薬に基づくものであり、該ｈｎＲＮＡ及びｍＲＮＡは、表１３に示したＴ２Ｄ関連遺伝子のコードするタンパク質又はポリペプチドに関連した生物学的なネットワーク及び代謝経路の少なくとも一方に含まれる１種又は数種の遺伝子に対するものであることを特徴とする、請求項７９に記載の方法。
  96. 該治療が、食餌療法又は予防接種であることを特徴とする、請求項７９に記載の方法。
  97. Ｔ２Ｄ又はＴ２Ｄ関連疾患の予防や治療に有用な薬剤のスクリーニング方法であって、生存細胞内の、表１３に示したＴ２Ｄ関連遺伝子のコードする１種又は数種のポリペプチドに関連した生物学的ネットワーク、あるいは表１３に示したＴ２Ｄ関連遺伝子のコードする１種又は数種のポリペプチドに関連した代謝経路に対して、薬剤が及ぼす影響を測定することを包含し、生物学的なネットワーク及び代謝経路から選ばれる１種又は数種の活性を変化させる薬剤を、Ｔ２Ｄ又はＴ２Ｄ関連疾患の予防や治療に有用な化合物と評価することを特徴とする方法。
  98. 候補薬剤をモデルシステム又はモデル生物に投与し、該Ｔ２Ｄ関連遺伝子及びポリペプチドの１種又は数種に関連した転写発現、翻訳、生物学的活性、生物学的構造及び代謝産物量からなる群より選ばれる少なくとも１種を変化させるか調節する薬剤を、Ｔ２Ｄ又はＴ２Ｄ関連疾患の予防や治療に有用な薬剤と評価することを特徴とする、請求項９７に記載の方法。
  99. モデルシステム又はモデル生物が、表１３に示した１種又は数種のＴ２Ｄ関連遺伝子を発現する、ヒト以外のトランスジェニック動物であることを特徴とする、請求項９８に記載の方法。
  100. 表１３に示した１種又は数種のＴ２Ｄ関連遺伝子を発現する、培養微生物細胞、培養昆虫細胞又は培養哺乳動物細胞の使用を包含する、請求項９８に記載の方法。
  101. 表１３に示した１種又は数種のＴ２Ｄ関連遺伝子を発現する、哺乳動物の組織、臓器又は器官の使用を包含する、請求項９８に記載の方法。
  102. 表１３に示した１種又は数種のＴ２Ｄ関連遺伝子を発現するヒト以外のトランスジェニック動物を用いて、Ｔ２Ｄ又はＴ２Ｄ関連疾患に関与する病態生理学及び分子機構のいずれか一方又は両方を研究する方法。
  103. Ｔ２Ｄ又はＴ２Ｄ関連疾患の予防又は治療に有用な医薬組成物であって、表１３に示した１種又は数種のＴ２Ｄ関連遺伝子のコードする１種又は数種のポリペプチドの生物学的な活性又は機能を変化させる薬剤を包含する医薬組成物。
  104. 表１３に示した１種又は数種のＴ２Ｄ関連遺伝子の発現を変化させる薬剤を包含する、請求項１０３に記載の医薬組成物。
  105. 表１３に示したＴ２Ｄ関連遺伝子のコードするポリペプチドに関連した生物学的なネットワーク及び代謝経路の少なくとも一方に含まれる１種又は数種の遺伝子の発現を変化させる薬剤を包含する、請求項１０３に記載の医薬組成物。
  106. 表１３に示したＴ２Ｄ関連遺伝子のコードするポリペプチドに関連した生物学的なネットワーク及び代謝経路からなる群より選ばれる１種又は数種の活性を変化させる薬剤を包含する、請求項１０３に記載の医薬組成物。
  107. Ｔ２Ｄ又はＴ２Ｄ関連疾患に関与する１種又は数種の病態生理学的経路の活性を変化させ、且つ表１３に示したＴ２Ｄ関連遺伝子のコードするポリペプチドに関連した薬剤を包含する、請求項１０３に記載の医薬組成物。
  108. Ｔ２Ｄを発症していない健常対象生物と比べて該哺乳動物において変化している、表１３に示したＴ２Ｄ関連遺伝子のコードする１種又は数種のポリペプチドの生物学的活性の少なくとも一部を修復する薬剤を包含する、請求項１０３に記載の医薬組成物。
  109. Ｔ２Ｄを発症していない健常対象生物と比べて該哺乳動物において変化している、表１３に示した１種又は数種のＴ２Ｄ関連遺伝子の発現の少なくとも一部を修復する薬剤を包含する、請求項１０３に記載の医薬組成物。
  110. 表１３に示したＴ２Ｄ関連遺伝子のｍＲＮＡ又は制御領域にハイブリダイズするポリヌクレオチドを包含する、請求項１０３に記載の医薬組成物。
  111. 表１３に示したＴ２Ｄリスク遺伝子、その変異体、断片又は誘導体のコードする組み換えポリペプチドを包含する、請求項１０３に記載の医薬組成物。
  112. 表１３に示したＴ２Ｄリスク遺伝子のコードする１種又は数種のポリペプチドに結合する抗体を包含する、請求項１０３に記載の医薬組成物。
  113. 表１３に示したＴ２Ｄ関連遺伝子のコードする１種又は数種のポリペプチドに結合する薬剤を包含する、請求項１０３に記載の医薬組成物。
  114. 表１３に示したＴ２Ｄ関連遺伝子に対するｈｎＲＮＡ及びｍＲＮＡの少なくとも一方とハイブリダイズする、ｓｉＲＮＡなどの配列特異的な遺伝子サイレンシング薬を包含する、請求項１０３に記載の医薬組成物。
  115. ｈｎＲＮＡ及びｍＲＮＡの少なくとも一方とハイブリダイズする、ｓｉＲＮＡなどの配列特異的な遺伝子サイレンシング薬を包含し、ｈｎＲＮＡ及びｍＲＮＡは、表１３に示したＴ２Ｄ関連遺伝子のコードするタンパク質又はポリペプチドに関連した生物学的なネットワーク及び代謝経路の少なくとも一方に含まれる１種又は数種の遺伝子に対するものであることを特徴とする、請求項１０３に記載の医薬組成物。
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