JP2008524163A - 4級ヘテロ環活性剤を用いたホスフィチル化した化合物の合成 - Google Patents
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Abstract
ここで、
Rはアルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアルキル、ヘテロアリールであり、
R1、R2は、Hか又は共に5から6員環を形成し、
X1、X2は、独立にそれぞれN又はCHであり、
Yは、H又はSi(R4)3であって、R4はアルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアルキル、ヘテロアリールであり、
Bは、脱プロトン化された酸である。該ヒドロキシル含有化合物は、好ましくは糖部分又はヌクレオシド又はこれらから誘導されるオリゴマーである。
【選択図】なし
Description
本発明は、特定の活性剤を用いたホスフィチル化した(phosphitylated)化合物の調製方法、とりわけホスホルアミダイト(phosphoramidite)の合成に関する。
オリゴヌクレオチドは、種々の分野における重要な役割を有する、生命科学において鍵となる化合物である。オリゴヌクレオチドは、例えば、遺伝子発現解析の分野におけるプローブとして、PCRにおける又はDNAシーケンシングに対するプライマーとして使用される。
さらに、換言すれば、アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む潜在的な治療の適用も多く存在する。
多くの化学的な修飾が、オリゴヌクレオチドに対して導入され、診断における、検査薬として及び治療薬としてのそれらの有用性を向上し、例えばヌクレアーゼに対して安定にした。
オリゴヌクレオチドの合成は、液相法及び固相法の両方を用いて達成できる。近年好ましい方法は、固相を介した合成であり、該方法において、オリゴヌクレオチドは、固形物支持体上で調製され、及び該オリゴヌクレオチドはヌクレオチドの逐次的な付加により成長する。
一般的な概観に関しては、例えば“Antisense−From Technology to Therapy” Blackwell Science(Oxford,1997)を参照されたい。
オリゴヌクレオチドの合成におけるビルディングブロックの有名な一の種類は、ホスホルアミダイトである;例えば、S.L. Beaucage, M.H. Caruthers, Tetrahedron Letters 1859(1981)22を参照されたい。ヌクレオシド、デオキシリボヌクレオシド及び両方の誘導体のこれらホスホルアミダイトは、市場で入手可能である。通常の固相合成において、3’−O−ホスホルアミダイトが使用されるが、他の合成方法においては5’−O及び2’−O−ホスホルアミダイトも使用される。これらヌクレオシドホスホルアミダイトの調製における一の工程は、(保護された)ヌクレオシドのホスフィチル化(phosphitylating)である。最も通常には、3’−、5’−又は2’−Oヒドロキシル基をホスフィチル化する前に、ヌクレオシドにおいて存在するこれら以外のヒドロキシル基及びアミノ基及び他の官能基が保護される。いくつかの経路が、モノマー(ヌクレオシド)及びポリマー(ヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド)ホスホルアミダイトの調製に関して周知である。周知の方法は、非常に多くの場合、化学的又は安全性の問題に帰着する。大量のバッチ合成(100kg−1000kg)に対するこの化学反応の使用については、コスト有効度が向上しなければならない。
ホスフィチル化反応において最も普通に用いられる活性剤は、1H−テトラゾールである。
とりわけラージスケールの合成を行う場合、1H−テトラゾールの使用での特有の問題が存在する。例えば、1H−テトラゾールは、爆発性及び毒性のものであるとして公知である。製品安全データシート(MSDS)によると、1H−テトラゾール(1H−テトラゾール、98%)は、吸い込まれ、摂取され又は皮膚を介して吸収された場合、有害となり得る。
さらに、1H−テトラゾールは高価である。とりわけ、ラージスケールの合成において、1H−テトラゾールは、オリゴヌクレオチド類の合成コストにおいて、かなりの影響を有する。
加えて、1H−テトラゾールがその貯蔵、使用及び廃棄の間、特別な取扱を必要とすることが知られている。
1H−テトラゾール及び関連した誘導体、例えば5−エチルチオ−1H−テトラゾール、5−ベンジルチオ−1H−テトラゾールは、目的分子の分解に関する可能性も有する。従って、酸感受性保護基の開裂が、異なる出版物において報告された(Krotz et al, Tetrahedron Letters, 1997,38,3875)。
酸に不安定な保護基の不注意な脱保護は、クロロ−(2−シアノエトキシ)−N,N−ジイソプロピルアミノホスフィンの使用に関しても知られる。使用された保護基の開裂の傾向と無関係に、このホスフィチル化剤が、結果として大量の3’−3’アイソマーに帰着するであろう。結果得られるアミダイトは、時間及びコスト集約的なクロマトグラフィー工程により精製しなければならない。
ある活性剤を用いたビス−ホスの使用は、モノマーのヌクレオシドアミダイトに関して一般的に知られているが、オリゴヌクレオチドの場合において、該低い反応性はこのアプローチを非常に複雑にした。
該低い反応性は、長い反応時間(2−6h)にも帰着する。長い反応時間を避けることは、膨大に超過したホスフィチル化剤及び活性剤の使用を要求するであろう。最後には、この種の反応の取扱は、付加的な精製工程も要求するであろう。
EP0906917A2及びHayakawa et al.,J.Am.Chem.Soc.120(1998)12395−12401は、ホスホルアミダイトの合成のためのイミダゾリウムトリフレートの使用を開示する。該記載された合成の収量及び純度は、繰り返すことができなかった。
この活性剤の感受性及び低い反応性は、複雑な取扱に帰着し、アミダイトのラージスケールの合成のためには扱いにくい。
Hayakawaのこの活性剤を用いた全ての実験において、結果得られたアミダイトは、コスト集約的なクロマトグラフィー工程により、精製されなければならない。
しかしながら、全ての場合において、ホスフィチル化反応の結果は、不完全かつ能率的ではなく、従って精製工程は常に主要な要件である。
感受性のオリゴヌクレオチドのホスフィチル化は、ほとんどが分解の結果となる。
記載した合成の収量及び純度は、繰り返すことができず、なぜならば使用されたイミダゾリウムトリフレートは、高い求核特性及び高い含水の傾向を有するためである。これら特性は、大量の分解及び加水分解で終わることであろう。該記載された活性剤は、単離され、及びその純粋な形態において使用された。
加えて、Hayakawaは、ヌクレオチド間の結合の形成のための化合物を使用した(ヌクレオシドとアミダイトの縮合)。
Hyakawa et al.,J.Org.Chem.61(1996)7996−7997は、ヌクレオシドとホスホルアミダイトの縮合のための、ベンズイミダゾリウムトリフレートの使用を開示する。
Hayakawa et al.,J.Am.Chem.Soc.123(2001)8165−8176は、ヌクレオシドとホスホルアミダイトの縮合のための、酸/アゾール複合体の使用を開示する。
Arnold et al.,Collect.Czech.Chem.Commun.54(1989)523−532は、オリゴデオキシリボヌクレオチドの自動化したクロリダイト(chloridite)及びアミダイト合成を開示し、及びとりわけヌクレオシドとホスホルアミダイトの縮合における1−メチルイミダゾールの使用を開示した。
本発明の目的は、少なくともいくつかの先行技術の欠点を克服する、ホスフィチル化された化合物の調製方法を提供することである。
本発明のさらなる目的は、先行技術の活性剤と比較した場合に、向上した特性を有する活性剤を提供することである。
−以下の式Iを有する活性剤の存在下において、ヒドロキシル含有化合物をホスフィチル化剤と反応させる工程;
Rは、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアルキル、ヘテロアリールであり、
R1、R2は、Hか又は共に5から6−員の環を形成し、
X1、X2は、独立にNか又はCHであり、
Yは、H又はSi(R4)3であって、R4はアルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアルキル、ヘテロアリールであり、
Bは、脱プロトン化された酸である。
該活性剤は、化学量論的に若しくは触媒的に(3から50モル%、好ましくは10から30モル%)又は過剰に(最大で300モル%)使用できる。
Yは、上と同じように定義され、
Rは、メチル、フェニル又はベンジルである。
これら活性剤の調製は、例えばHayakawa et al,J.Am.Chem.Soc.123(2001)8165−8176において記載されている。
一の好ましい態様において、該活性剤は、“インサイチュー”方法に従って調製できる。この場合において、該活性剤は単離されず、これは反応の向上した結果に帰着する。目的分子の加水分解又は分解が抑制される。
オリゴヌクレオチド(ジ、トリ、テトラ、ペンタ、ヘキサ、ヘプタ及びオクタマー)の3’−及び/又は5’−位における高い収率のホスフィチル化のため、該活性剤のインサイチューでの調製及び添加剤を用いた組み合わせが好ましい。
本発明の方法は、オリゴヌクレオチド(ジ、トリ、テトラ、ペンタ、ヘキサ、ヘプタ及びオクタマー)のホスフィチル化に対して特に有用である。該ホスフィチル化されたオリゴヌクレオチドは、例えば、フラグメント縮合の概念を介した大きいオリゴヌクレオチドの合成に対して使用される。
普通は、該オリゴヌクレオチドは、これらのヘテロ環官能基において、及びホスフィチル化されるべき基を除いたこれらヒドロキシルを有する基において適切に保護されるであろう。典型的には、ジメトキシトリチル、モノメトキシトリチル又はシリル含有保護基(例えばTBDMS)が、5’OH基に対する保護基として使用され、3’−OH基のホスフィチル化を許容する。
該ホスフィチル化の方法は、同一の結果を伴って3’−又は5’−ホスホルアミダイトの合成に対して使用できる。
ホスフィチル化反応の結果として得られる目的分子は、一態様において、ホスホルアミダイトであり、以下の構造を有する:
好ましい態様において、ホスフィチル化剤は以下の式を有する:
他の好ましいホスフィチル化剤は、参照により取り込まれるN.Ok et al.,J.Am.Chem.Soc.2003,125,8307から8317において記載されているような、オキサザホスホリジン(oxazaphospholidine)誘導体である。このホスフィチル化剤はオリゴヌクレオチドの合成を許容し、該ヌクレオチド間の結合は、立体選択的な方法においてホスホチオエート(phosphothioate)に転換する事ができる。該ジアステレオ選択的に合成されたヌクレオチド間のホスホチオエート架橋は、アンチセンス薬品としてのホスホチオエートの使用における有望な効果を有する。
脱プロトン化された酸B-の適切な例は、トリフレート、トリフルオロアセテート、ジクロロアセテート、メシル、トシル、o−クロロフェノラートである。4.5より低いpKaを有する酸が好ましい。好ましくは、これらは低い求核性を有する。
本発明の活性剤とホスフィチル化剤を組み合わせ、後でヒドロキシル成分を添加することも可能である。該活性剤とヒドロキシル含有化合物を合わせ、及びその後にホスフィチル化剤を添加することも可能である。
添加剤を使用する場合において、該活性剤は、該ホスフィチル化剤が添加される前に、ヒドロキシ化合物と混合される。
該活性剤のインサイチューでの発生のため、制御された反応温度の下における添加剤の添加の後に、該選択された酸が好ましく添加される。
該選択された酸の添加前又は添加後に、該ホスフィチル化剤を添加することができる。
酸及びホスフィチル化剤の添加に関して、該ヌクレオシド成分は、最後又は最初に添加することができる。
本発明のさらなる目的は、以下の式Iを有する活性剤の、ホスフィチル化剤を用いた、ヒドロキシル含有化合物のホスフィチル化のための活性剤としての使用である:
Rは、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアルキル、ヘテロアリールであり、
R1、R2は、Hか又は5から6−員環を共に形成し、
X1、X2は、独立にNか又はCHであり、
Yは、H又はSi(R4)3であり、R4はアルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアルキル、ヘテロアリールであり、
Bは、脱プロトン化された酸である。
とりわけ、アセトンの使用と合わせて、該活性剤/触媒は、公知の副反応(分解又は3’−3’若しくは5’−5’同族体の形成)を示さないであろう。アセトンは、抽出物及び試薬を溶解する能力も有する。
先行技術に従って、より長い反応時間の場合において、ジイソプロピルアミンの単体分離及び活性化したBis−Phosの存在は、目的化合物の分解に帰着する(脱トリチル化、CE−開裂、脱プリン化又は他の保護基の開裂)。アセトン及び特定の式の活性剤の存在は、これらの傾向を低下させる。
アセトンの存在は、ホスフィチル化方法の間に遊離する、いかなる量のジイソプロピルアミン(DIPA)の活性を抑える。これは、同じ結果(分解しない)を伴って、より短い及びより長いオリゴヌクレオチドのホスフィチル化に対して使用できる。Rx及びRyが独立にC1−C6アルキルであり又は共にシクロアルキルを形成する、式Rx−C(=O)−Ryを有する他のケトン化合物も、それらが、例えばα位においてCH2−基を有するアミンの存在下において、エノラートを形成することができる限りは使用できる。
アセトンは、例えばアセトニトリルと比較して、毒性のよりよい特性及び向上した環境特性も有し、並びに安価である。
従って、さらなる目的は、ホスホルアミダイトの合成における反応媒体又は共溶媒としてのアセトンの使用である。
ある量の添加剤と活性剤の組み合わせは、より長く及び感受性のオリゴヌクレオチド(3’又は5’脱保護された)のホスフィチル化方法のより高い効率を補助する。
典型的には、該試薬の反応性が増加し、2−5分の後に合成を終わらせる。
本発明の方法を用いることにより、付加的な精製工程は必要とされれないであろう。
結果得られたモノマー及びオリゴマーのアミダイトは、オリゴヌクレオチドの固相及び液相合成に対して使用できる。
本明細書において使用するものとして、オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオシド群、オリゴヌクレオチド類似体、修飾したオリゴヌクレオチド、ヌクレオチド模倣薬並びにRNA及びDNAの形態にある同様のものも含む。一般的に、これら化合物は、架橋したモノマーのサブユニットの骨格を含み、各架橋したモノマーのサブユニットは、直接的又は間接的に、ヘテロ環塩基部分に対して結合する。モノマーのサブユニット群を合わせる架橋、モノマーのサブユニット及びヘテロ環塩基部分は、結果得られる化合物に対する多数の目的に関する原因を与える構造において可変であることができる。
典型的な誘導体は、ホスホルチオエート、ホスホロジチオエート、メチル及びアルキルホスホネート及びホスホノアセト誘導体である。
さらに典型的な修飾は、糖部分でのものである。リボースが異なる糖により置換されるか、又は1以上の位置が、他の基、例えばF、O−アルキル、S−アルキル、N−アルキルで置換される。好ましい態様は、2’−メチル及び2’−メトキシエトキシである。全てのこれら修飾は、本技術において公知である。
ヘテロ環塩基部分について、本技術において使用される多くの他の合成塩基、例えば5−メチル−シトシン、5−ヒドロキシ−メチル−シトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、2−アミノアデニン、アデニン及びグアニンの6−又は2−アルキル誘導体、2−チオウラシルが存在する。該修飾は、WO2004/011474の21ページから記載されている。
オリゴヌクレオチドホスホルアミダイトの合成に関する態様において、反応媒体か又は他の溶媒に対する共溶媒として使用することができる、アセトン又は他のケトン類、例えばアセトン、ブタノン、ペンタノン、ヘキサノン、シクロヘキサノンの存在下において反応を行うことが有用である。
本発明は、以下の制限されない例により、さらに説明される。
メチル−イミダゾリウム−トリフルオロアセテートを用いた5’−O−DMTr−T−3’−O−ホスホルアミダイトの合成
5.0gの5’−O−DMTr−T−3’−OH(9.2mmol、1.0当量)及び2.34gのメチル−イミダゾリウム−トリフルオロアセテート(11.9mmol、1.3当量)を、100mlジクロロメタン中に溶解し、次いで3gのモレキュラーシーブ3Åを添加し、該混合物を10分攪拌した。3.8mlの2−シアノエチルN,N,N’,N’−テトライソプロピルホスホルジアミダイト(11.9mmol、1.3当量)を添加する。該反応を、2時間後に完結する。収率(HPLCにより決定):95%。
(例2)
ベンジル−イミダゾリウム−トリフルオロアセテートを用いた5’−O−DMTr−dGiBu−3’−O−ホスホルアミダイトの合成
322mgのメチル−イミダゾリウム−トリフルオロアセテート(1.64mmol、1.05当量)及び1.0gの5’−O−DMTr−dGiBu−3’−OH(1.56mmol、1.0当量)を、10mlのジクロロメタン中に溶解し、及び500mgのモレキュラーシーブ3Åを添加する。30分後、0.52mlの2−シアノエチルN,N,N’,N’−テトライソプロピルホスホルジアミダイト(1.64mmol、1.05当量)及び0.1mlのアセトンを、攪拌した該溶液に対して添加する。反応を30分後に完結する。収率(HPLCにより決定):74%。
メチル−イミダゾリウム−トリフルオロアセテートを用いた5’−O−DMTr−dCBz−3’−O−ホスホルアミダイトの合成
9.51gの5’−O−DMTr−dCBz−3’−OH(15mmol、1.0当量)を、80mlアセトン及び80mlアセトニトリル中に溶解する。6.17gのメチル−イミダゾリウム−トリフルオロアセテート(32mmol、2.1当量)及び9.64gの2−シアノエチルN,N,N’,N’−テトライソプロピルホスホルジアミダイト(32mmol、2.1当量)を、攪拌した該溶液に対して添加する。該反応を30分後完結する。500mlの酢酸エチルを添加し、該溶液を250mlのNaHCO3−溶液で2回、及び250mlの食塩水で抽出する。該有機層をMgSO4を用いて乾燥し、乾燥するまで蒸発させる。該残渣を40mlのジクロロメタン中に溶解し、250mlのペンタンを添加し、上澄みをデカンテーションし、及び該残渣を減圧下で乾燥して、無色の泡を形成する。収率(12.0g、14.4mmol):96%、純度(HPLCにより決定):93%。
(例4)
ベンジル−イミダゾリウム−トリフルオロアセテートを用いた5’−O−DMTr−dABz−3’−O−ホスホルアミダイトの合成
38mgのベンジル−イミダゾリウム−トリフルオロアセテート(0.14mmol、1.5当量)を、5mlのアセトニトリルに溶解し、次いで300mgのモレキュラーシーブ3Åを添加する。145μlの2−シアノエチルN,N,N’,N’−テトライソプロピルホスホルジアミダイト(0.46mmol、5.0当量)を添加する。30分後、61mgの5’−O−DMTr−dABz−3’−OH(0.09mmol、1.0当量)を添加し、次いで該溶液を一晩攪拌する。該反応を17時間後に完結する。収率(HPLCにより決定):91%。
触媒量のメチル−イミダゾリウム−トリフルオロアセテートを用いた、5’−O−DMTr−dCBz−3’−O−ホスホルアミダイトの合成
500mgの5’−O−DMTr−dCBz−3’−OH(0.79mmol、1.0当量)を、18mlのジクロロメタン中に溶解し、及び1mlのDMF、3gのモレキュラーシーブ3Åを添加する。50mgのメチル−イミダゾリウム−トリフルオロアセテート(0.17mmol、0.2当量)及び276μlの2−シアノエチルN,N,N’,N’−テトライソプロピルホスホルジアミダイト(0.87mmol、1.1当量)を、攪拌した該溶液に対して添加する。該反応を、24時間後に完結する。収率(HPLCにより決定):89%。
(例6)
触媒量のベンジル−イミダゾリウム−トリフルオロアセテートを用いた、5’−O−DMTr−dGiBu−3’−O−ホスホルアミダイトの合成
5mgのベンジル−イミダゾリウム−トリフルオロアセテート(0.02mmol、0.2当量)を、5mlのアセトニトリル中に溶解し、次いで300mgのモレキュラーシーブ3Åを添加する。145μlの2−シアノエチルN,N,N’,N’−テトライソプロピルホスホルジアミダイト(0.46mmol、5.0当量)を、攪拌した該溶液に対して添加する。1時間後、60mgの5’−O−DMTr−dGiBu−3’−OH(0.09mmol、1.0当量)を添加し、該溶液を一晩攪拌する。該反応を48時間後に完結する。収率(HPLCにより決定):90%。
触媒量のベンジル−イミダゾリウム−トリフルオロアセテートを用いた5’−O−DMTr−T−3’−O−ホスホルアミダイトの合成
50mgのベンジル−イミダゾリウム−トリフルオロアセテート(0.18mmol、0.18当量)及び500mgの5’−O−DMTr−T−3’−OH(0.92mmol、1.0当量)を28mlのジクロロメタン中に溶解し、3gのモレキュラーシーブ3Åを添加する。350μlの2−シアノエチルN,N,N’,N’−テトライソプロピルホスホルジアミダイト(1.0mmol、1.1当量)を、攪拌した該溶液に対して添加する。該反応を25時間後に完結する。収率(HPLCにより決定):90%。
(例8)
メチル−イミダゾリウム−トリフルオロアセテートを用いた5’−O−DMTr−T−P(S)−dCBz−3’−O−ホスホルアミダイトの合成
100mgの5’−O−DMTr−T−P(S)−dCBz−3’−OH(0.10mmol、1.0当量)及び24.4mgのメチル−イミダゾリウム−トリフルオロアセテート(0.11mmol、1.1当量)を10mlのジクロロメタン中に溶解し、200mgのモレキュラーシーブ4Åを添加する。32μlの2−シアノエチルN,N,N’,N’−テトライソプロピルホスホルジアミダイト(0.10mmol、1.0当量)を、攪拌した該溶液に対して添加する。該反応を24時間後に完結する。収率(HPLCにより決定):60%。
メチル−イミダゾリウム−トリフルオロアセテートを用いた、5’−O−DMTr−dCBz−P(S)−dGiBu−3’−O−ホスホルアミダイトの合成
100mgの5’−O−DMTr−dCBz−P(S)−dGiBu−3’−OH(0.09mmol、1.0当量)、及び17.8mgのメチル−イミダゾリウム−トリフルオロアセテート(0.09mmol、1.0当量)を10mlジクロロメタン中に溶解し、200mgのモレキュラーシーブ4Åを添加する。28μlの2−シアノエチルN,N,N’,N’−テトライソプロピルホスホルジアミダイト(0.09mmol、1.0当量)を、攪拌した該溶液に対して添加する。該反応を3時間後に完結する。収率(HPLCにより決定):56%。
(例10)
メチル−イミダゾリウム−トリフルオロアセテートを用いた、5’−O−DMTr−dGiBu−P(O)−dGiBu−3’−O−ホスホルアミダイトの合成
106mgの5’−O−DMTr−dGiBu−P(O)−dGiBu−3’−OH(0.10mmol、1.0当量)及び30mgのメチル−イミダゾリウム−トリフルオロアセテート(0.15mmol、1.5当量)を10mlのアセトン中に溶解し、500mgのモレキュラーシーブ3Åを添加する。30分後、34μlの2−シアノエチルN,N,N’,N’−テトライソプロピルホスホルジアミダイト(0.11mmol、1.1当量)を、攪拌した該溶液に対して添加する。該反応を4時間後に完結する。収率(HPLCにより決定):55%。
メチル−イミダゾリウム−トリフルオロアセテートを用いた、5’−O−DMTr−T−P(S)−dCBz−P(S)−T−P(S)−dCBz−P(S)−dCBz−P(S)−dCBz−3’−O−ホスホルアミダイトの合成
10mgの5’−O−DMTr−T−P(S)−dCBz−P(S)−T−P(S)−dCBz−P(S)−dCBz−P(S)−dCBz−3’−OH(3.6μmol、1.0当量)及び1.4mgのメチル−イミダゾリウム−トリフルオロアセテート(7.2μmol、2.0当量)を、0.5mlのアセトン及び0.5mlのアセトニトリル中に溶解し、50mgのモレキュラーシーブ3Åを添加する。30分後、5.8μlの2−シアノエチルN,N,N’,N’−テトライソプロピルホスホルジアミダイト(18.1μmol、5.0当量)を、攪拌した該溶液に対して添加する。該反応を5時間後に完結する。収率(HPLCにより決定):71%。
(例12)
N−メチルイミダゾリウムトリフルオロアセテートのインサイチューでの発生を介した5’−O−DMTr−dT−3’−O−ホスホルアミダイトの合成
1.00gの5’−O−DMTr−dT−3’−OH(1.84mmol、1.0当量)を、2mlのジクロロメタン及び2mlのアセトン中に溶解する。300mgのN−メチルイミダゾール(3.68mmol、291μl、2.0当量)及び665mgの2−シアノエチル−N,N,N’,N’−テトライソプロピルホスホルジアミダイト(2.21mmol、700μl、1.2当量)を、続いて1.00gのモレキュラーシーブ3Åを添加する。この攪拌した懸濁液に対して、1mlジクロロメタン中の230mgのトリフルオロ酢酸(2.02mmol、159μl、1.1当量)を滴下して添加する。該反応を3時間後に完結する。収率(HPLCにより決定):99%。
N−メチルイミダゾリウムトリフルオロアセテートのインサイチューでの発生を介した、5’−O−DMTr−dGiBu−3’−O−ホスホルアミダイトの合成
1.00gの5’−O−DMTr−dGiBu−3’−OH(1.56mmol、1.0当量)を2mlジクロロメタン及び2mlアセトン中に溶解する。255mgのN−メチルイミダゾール(3.11mmol、247μl、2.0当量)及び563mgの2−シアノエチル−N,N,N’,N’−テトライソプロピルホスホルジアミダイト(1.87mmol、593μl、1.2当量)を、次いで1.00gのモレキュラーシーブ3Åを添加する。この攪拌した懸濁液に対して、1mlジクロロメタン中の195mgのトリフルオロ酢酸(1.72mmol、135μl、1.1当量)を滴下し添加する。該反応を5時間後に完結する。収率(HPLCにより決定):88%。
(例14)
N−メチルイミダゾリウムトリフルオロアセテート−N−メチルイミダゾール混合物を用いた、5’−O−DMTr−dGiBu−3’−O−ホスホルアミダイトの合成
1.00gの5’−O−DMTr−dGiBu−3’−OH(1.56mmol、1.0当量)を、2mlのジクロロメタン及び2mlのアセトン中に溶解する。2.00gのモレキュラーシーブ3Å、367mgのN−メチルイミダゾリウムトリフルオロアセテート(1.87mmol、1.2当量)及び383mgのN−メチルイミダゾール(4.68mmol、371μl、3.0当量)を、続いて563mgの2−シアノエチル−N,N,N’,N’−テトライソプロピルホスホルジアミダイト(1.87mmol、593μl、1.2当量)を添加する。該反応を20分後完結する。収率(HPLCにより決定):90%。
N−メチルイミダゾリウムトリフルオロアセテート−N−メチルイミダゾール混合物を用いた、5’−O−DMTr−dCBz−3’−O−ホスホルアミダイトの合成
1.00gの5’−O−DMTr−dGiBu−3’−OH(1.56mmol、1.0当量)を、2mlのジクロロメタン及び2mlのアセトン中に溶解する。2.00gのモレキュラーシーブ3Å、367mgのN−メチルイミダゾリウムトリフルオロアセテート(1.87mmol、1.2当量)及び383mgのN−メチルイミダゾール(4.68mmol、371μl、3.0当量)を、次いで563mgの2−シアノエチル−N,N,N’,N’−テトライソプロピルホスホルジアミダイト(1.87mmol、593μl、1.2当量)を添加する。該反応を20分後完結する。収率(HPLCにより決定):90%。
(例16)
メチルイミダゾリウムトリフルオロアセテートのインサイチューでの発生を介した、5’−O−DMTr−dCBz−P(O)−dABz−3’−O−ホスホルアミダイトの合成
100mgの5’−O−DMTr−dCBz−P(O)−dABz−3’−OH(90.7μmol、1.0当量)を、200μlのジクロロメタン及び200μlのアセトン中に溶解する。15mgのN−メチルイミダゾール(180μmol、14μl、2.0当量)及び54.6mgの2−シアノエチル−N,N,N’,N’−テトライソプロピルホスホルジアミダイト(181μmol、57μl、2.0当量)を、続いて100mgのモレキュラーシーブ3Åを添加する。この攪拌した懸濁液に対して、ジクロロメタン中における1Mのトリフルオロ酢酸溶液100μlを滴下して添加する。該反応を30分後完結する。収率(HPLCにより決定):90%。
N−メチルイミダゾリウムトリフルオロアセテートを用いた、5’−O−ホスホルアミダイト−dT−P(O)−dGiBu−P(O)−dGiBu−3’−O−Levの合成
2.0gの5’−HO−dT−P(O)−dGiBu−P(O)−dGiBu−3’−O−Lev(1.6mmol、1.0当量)を、80mlのアセトン中に溶解し、500mgのメチルイミダゾリウムトリフルオロアセテート(2.5mmol、1.56当量)及び4.0gのモレキュラーシーブ3Åを添加した。2.76mlの2−シアノエチル−N,N,N’,N’−テトライソプロピルホスホルジアミダイト(2.62g、8.7mmol、5当量)を添加して、及び30分の攪拌後、ホスホルアミダイトを300mlのn−ヘプタンの添加により沈殿させた。収率(HPLCにより決定):72%。
(例18)
N−メチルイミダゾリウムトリフルオロアセテートを用いた、5’−O−ホスホルアミダイト−dCBz−P(O)−dABz−3’−O−Levの合成
1.0gの5’−HO−dCBz−P(O)−dABz−3’−O−Lev(1.1mmol、1.0当量)及び326mgのメチルイミダゾリウムトリフルオロアセテート(1.66mmol、1.5当量)を、8mlアセトン及び10mlジクロロメタン中に溶解して、次いで2.0gのモレキュラーシーブ3Åを添加した。700μlの2−シアノエチル−N,N,N’,N’−テトライソプロピルホスホルジアミダイト(664mg、2.2mmol、2当量)を添加して、1時間の攪拌後、該ホスホルアミダイトを50mlのn−ヘプタンを添加することにより沈殿させた。収率(HPLCにより決定):78%。
N−メチルイミダゾリウムトリフルオロアセテートを用いた、5’−O−ホスホルアミダイト−T−P(O)−dCBz−P(O)−dCBz−P(O)−dCBz−3’−O−Levの合成
20mgの5’−HO−T−P(O)−dCBz−P(O)−dCBz−P(O)−dCBz−3’−O−Lev(11.6μmol、1.0当量)及び4.3mgのN−メチルイミダゾリウムトリフルオロアセテート(22μmol、1.9当量)を、2mlアセトン中に溶解し、及び40mgのモレキュラーシーブ3Åを添加した。15μlの2−シアノエチル−N,N,N’,N’−テトライソプロピルホスホルジアミダイト(14mg、47μmol、4当量)を添加し、1時間の攪拌後、該ホスホルアミダイトを、3mlのn−ヘプタンを添加することにより沈殿させた。収率(HPLCにより決定):86%。
(例20)
N−メチルイミダゾリウムトリフルオロアセテートを用いた、5’−O−TBDPS−dT−3’−O−ホスホルアミダイトの合成
510mgの5’−O−DMTr−dT−3’−OH(1.06mmol、1.0当量)を、20mlのアセトン中に溶解し、及び251mgのN−メチルイミダゾリウムトリフルオロアセテート(1.27mmol、1.2当量)、1.0gのモレキュラーシーブ3Å及び383mgの2−シアノエチル−N,N,N’,N’−テトライソプロピルホスホルジアミダイト(403μl、1.27mmol、1.2当量)を攪拌下で添加する。該反応を30分後完結する。収率(HPLCにより決定):88%。
N−メチルイミダゾリウムトリフルオロアセテートを用いた、5’−O−TBDMS−dGiBu−3’−O−ホスホルアミダイトの合成
1mgの5’−O−TBDMS−dGiBu−3’−OH(2.21mmol、1.0当量)を20mlのアセトン中に溶解し、次いで875mgのN−メチルイミダゾリウムトリフルオロアセテート(4.42mmol、2当量)、2.0gのモレキュラーシーブ3Å及び3.33gの2−シアノエチル−N,N,N’,N’−テトライソプロピルホスホルジアミダイト(3.5ml、11mmol、5当量)を攪拌下で添加する。該反応を30分後に完結する。収率(HPLCにより決定):88%。
Claims (18)
- 該ヒドロキシル含有化合物が、糖部分を含む、請求項1又は2に記載する方法。
- 該ヒドロキシル含有化合物が、ヌクレオシド又はこれから誘導されるオリゴマーである、請求項1から3のいずれか1項に記載する方法。
- 該ヒドロキシル含有化合物が、3’−ヒドロキシル基を有する5’−O−保護されたヌクレオシド、又は5’−ヒドロキシル基を有する3’−O−保護されたヌクレオシドである、請求項1から4のいずれか1項に記載する方法。
- 該活性剤が、インサイチューで調製され、及び精製を伴うことなく使用される、請求項1から5のいずれか1項に記載する方法。
- 該対応する塩基を、ヒドロキシル含有化合物及びホスフィチル化剤と接触させ、次いで酸H+B-が添加される、請求項7に記載する方法。
- ホスフィチル化剤が、2−シアノエチル−N,N,N’,N’−テトライソプロピルホスホロジアミダイトである、請求項1から9のいずれか1項に記載する方法。
- 該脱プロトン化した酸が、トリフルオロ酢酸、ジクロロ酢酸、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸(トリフレート)、o−クロロフェノレート及びこれらの混合物から成る群より誘導される、請求項1から10のいずれか1項に記載する方法。
- 該反応が、アセトンの存在下におけるものである、請求項1から11のいずれか1項に記載する方法。
- アデノシンホスホルアミダイト、シトシンホスホルアミダイト、グアノシンホスホルアミダイト及びウラシルホスホルアミダイト、デスオキシアデノシンホスホルアミダイト、デスオキシグアノシンホスホルアミダイト、デスオキシチミジンホスホルアミダイト、デスオキシシトシンホスホルアミダイト、加えて各XがA、dA、C、dC、G、dG、U、dTから選択され及びn=2から8、好ましくは2から6である式Xnを有するオリゴヌクレオチドホスホルアミデート、並びに保護基を含むこれらの誘導体の合成のための、請求項13の使用。
- アデノシンホスホルアミダイト、シトシンホスホルアミダイト、グアノシンホスホルアミダイト及びウラシルホスホルアミダイト、デスオキシアデノシンホスホルアミダイト、デスオキシグアノシンホスホルアミダイト、デスオキシチミジンホスホルアミダイト、デスオキシシトシンホスホルアミダイト、加えてXがA、dA、C、dC、G、dG、U、dTから選択され及びn=2から8、好ましくは2から6である式Xnを有するオリゴヌクレオチドホスホルアミデート、並びに保護基を含むこれらの誘導体の合成のための、請求項15の混合物の使用。
- Rx及びRyが独立にC1−C6アルキルであり、又は共にシクロアルキルを形成する、式Rx−C(=O)−Ryを有するケトンの、ホスホルアミダイトの合成における反応媒体又は共溶媒としての使用。
- 該ケトンが、アセトン、ブタノン、ペンタノン、ヘキサノン、シクロヘキサノン又はこれらの混合物である、請求項17に記載する使用。
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