JP2008518635A

JP2008518635A - インスリン関連障害の処置のためのｇｐｒ４１およびその調節因子

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Publication number: JP2008518635A
Application number: JP2007540382A
Authority: JP
Inventors: ジェームスエヌ．レオナルド，; チーリャンチュー，; マークエー．ブルース，; ピー．ダグラスボートマン，
Original assignee: アリーナファーマシューティカルズ，インコーポレイテッド
Priority date: 2004-11-03
Filing date: 2005-11-01
Publication date: 2008-06-05
Anticipated expiration: 2025-11-01
Also published as: ES2498972T3; CN101084018B; TWI440460B; SG170642A1; EP1812080A2; JP2013082748A; WO2006052566A3; WO2006052566A2; EP1812080B1; US20080312277A1; TW200633707A; AU2005305083B2; JP5785354B2; IL182574A0; CA2584224A1; HK1100358A1; IL182574A; CN101084018A; AU2005305083A1

Abstract

本発明は、ａ）候補化合物をＧＰＲ４１と接触させる工程と、ｂ）ＧＰＲ４１の機能性が調節されるかどうかを調べる工程とによって血糖安定化化合物を同定する方法であって、ＧＰＲ４１の機能性の調節が、候補化合物が血糖安定化化合物であることを示す方法に関する。さらに、本発明は、血糖安定化化合物を同定する方法であって、ａ）候補化合物をＧＰＲ４１と接触させる工程と、ｂ）ＧＰＲ４１の機能性が増大するかどうかを調べる工程とを含み、ＧＰＲ４１の機能性の増大が、候補化合物が血糖安定化化合物であることを示す方法に関する。さらに、本発明は、血糖安定化化合物を同定する方法であって、ａ）候補化合物をＧＰＲ４１と接触させる工程と、ｂ）ＧＰＲ４１の機能性が低減するかどうかを調べる工程とを含み、ＧＰＲ４１の機能性の低減が、候補化合物が血糖安定化化合物であることを示す方法に関する。

Description

（発明の分野）
本発明は、化合物がＧＰＲ４１の機能性を調節するかどうかを調べることによって、血糖安定化化合物、例えば、インスリン分泌を制御する化合物を同定する方法に関する。したがって、本発明の化合物は、インスリン関連障害、例えば、低血糖症、インスリン分泌性もしくはインスリン依存性腫瘍、加齢、インスリン抵抗性、耐糖能障害または糖尿病の予防または治療において有用である。

（発明の背景）
細胞は、エネルギーの主供給源としてグルコースを用いる。したがって、食物は、利用される前に、身体によって、まずグルコースに分解される。次いで、グルコースは腸から血液中に放出され、その結果、血糖値が上昇する。この血糖値の上昇に応じて、膵臓のβ島細胞が、そのインスリン生成および分泌を増加させる。インスリンは血液によって循環し、メッセンジャーとして作用し、インスリン応答組織、例えば、脂肪組織、筋肉および肝臓にそのグルコース取り込みを増大させるようシグナルを送る。このようにして、血糖の上昇は、その後のβ細胞からのインスリン分泌の増大を伴う。血糖値を正常に戻すよう作用するのはインスリンの上昇である。健常な個体では、血糖値は適性に一定に保たれている。正常血糖（正常な血糖値）と呼ばれるこの平衡状態は、インスリンによって厳しく制御されている。

糖尿病などの疾患では、血糖値のこの厳しい調節が失われており、それが糖尿病患者において観察される血糖値の上昇を導く。高血糖症（高い血糖値）という状態は、膵臓のβ細胞によるインスリンの不十分な生成によって、および／または筋肉、肝臓および脂肪などの標的組織によるグルコースの不十分な取り込みのために生じ得る。結末は血糖値の上昇である。したがって、糖尿病は２つの種類の機能障害の結果と考えることができる：β細胞からのインスリン分泌の低下および主要インスリン応答組織によるインスリン感受性の低下。インスリン抵抗性としても知られる（組織がインスリンの作用に対して耐性であるため）このインスリン感受性の低下は、標的組織がそのグルコース取り込みを増大するにはより多くのインスリンが必要であることを意味する。インスリン抵抗性は、β細胞がインスリン抵抗性を代償するためにそのインスリン分泌を増加する必要があるため、β細胞に対する圧力の増大をもたらす。これはエスカレートする問題であり、まず、耐糖能障害をもたらし、最終的に、膵臓が、増え続けるインスリンの需要についていくことができないことによってインスリン分泌の完全な喪失をもたらす。

糖尿病とは、血糖の上昇をもたらす異常なグルコースホメオスタシスを特徴とする障害の群に対する診断用語である。多数の種類の糖尿病があるが、最も一般的な２種のものとして、インスリン依存性真性糖尿病またはＩＤＤＭとも呼ばれるＩ型と、非インスリン依存性真性糖尿病またはＮＩＤＤＭとも呼ばれるＩＩ型がある。Ｉ型糖尿病は、大抵の場合は、若い発症年齢の疾患であり、免疫系による膵臓のインスリン分泌性β細胞の破壊によるものである。この場合には、身体が膵臓β細胞を自身であると認識できず、自身の細胞を破壊する。β細胞が破壊されると、インスリン分泌が完全に失われ、冒された個体は生存するためにインスリンに完全に依存する。ＩＩ型糖尿病は、大抵の場合は、遅い発症年齢の疾患であり、通常、４０代以降であるが、近年では、ＩＩ型糖尿病であると診断される、より若い人を見い出すことが多くなっている。大抵の場合、インスリン抵抗性とβ細胞消耗とを特徴とし、肥満症を伴っていることが多い。ＩＩ型糖尿病は、Ｉ型糖尿病よりも多く、世界中で診断される全糖尿病症例の９０〜９５％を占める。

高血糖症に対する組織の慢性的な曝露は、神経障害、網膜症および腎症という微小血管の問題ならびに卒中、冠動脈心疾患という大血管性合併症、ならびに末梢血管疾患をはじめ、多種多様な合併症を引き起こし得る。血糖値の不適切な制御はまた、肥満症およびシンドロームＸなどの糖尿病以外の疾患の特徴でもある。例えば、シンドロームＸの特徴の１つは、インスリン抵抗性またはグルコース不耐性である。さらに、肥満症は、高インスリン血症およびインスリン抵抗性、すなわち、ＮＩＤＤＭ、高血圧症およびアテローム性動脈硬化症と共有される特徴を特徴とする。さらに、肥満症は、ＮＩＤＤＭの主要な危険因子である。３０％以上過体重の被験体では、ＮＩＤＤＭを発症する危険は３倍になり、４分の３のＮＩＤＤＭ患者が過体重である。

カロリー摂取量とエネルギー消費量との間の不均衡の結果である肥満症は、実験動物およびヒトではインスリン抵抗性および糖尿病と高度に相関がある。しかし、肥満症−糖尿病症候群に関与する分子機構は、いまだ研究中である。肥満症の発症の初期の間は、インスリン分泌の増大がインスリン抵抗性とバランスをとり、患者を高血糖症から保護する（非特許文献１）。しかし、経時的に、β細胞機能が低下し、肥満個体の約２０％で非インスリン依存性糖尿病が発症する（非特許文献２および非特許文献３）。現代社会における高い有病率を考えると、肥満症はＮＩＤＤＭの主たる危険因子となっている（非特許文献４）。しかし、一部の患者に、脂肪蓄積に応じてインスリン分泌を変更させやすくする因子は依然未知である。残念ながら、肥満症を治療するための効果的な長期治療はまだ存在しない。

糖尿病は全世界で数百万人を苦しめている。米国単独でも、１８００万人より多くの糖尿病患者がおり、毎年、６００，０００の新規症例が診断されている。糖尿病の人は、心疾患、失明、腎不全、感染、四肢切断およびその他の症状に対する危険がより高い。２００２年、米国における、糖尿病に起因する直接な医療保険支出および間接的な支出は、１３２０億ドルであったと推測される。総合すれば、糖尿病合併症は国民の主たる死因の１つである。

α−グルコシダーゼ阻害剤、ビグアナイド系、チアゾリジンジオン系、メグリチニド系、スルホニル尿素系および外因性インスリンなど糖尿病を治療するための治療法は、確かに存在する。しかし、これらの治療法は、限定された有効性しかなく、低血糖発作の危険、体重増加、胃腸障害および貧血などの、重大な安全性および耐容性の問題を伴っている。さらに、治療選択肢の多くは、注射、または服薬遵守の課題となる複数回の毎日の投薬を必要とする。

糖尿病などのインスリン分泌の増大から利益を受ける障害に加え、インスリン分泌の減少から利益を受けることができるいくつかの障害がある。例えば、インスリン分泌の減少は、低血糖症の際に必要とされる血糖の上昇をもたらすことができる。さらに、例えば、インスリン分泌の減少は、過剰のインスリンを分泌する腫瘍であるインスリノーマの患者にとって有用であり得る。インスリンはまた、特定の腫瘍の増殖因子としても働き得る。さらに、カロリー制限はインスリン分泌をダウンレギュレートすることが知られており、これがカロリー制限の長寿に対する好影響の媒介者であり得る。したがって、インスリン分泌の減少は、加齢を治療するために有益であり得る。これらすべての場合において、インスリンレベルの低減は有益であり得る。
ＬｅＳｔｕｎｆｆら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ１９８９年４３ｐ．６９６−７０２Ｐｅｄｅｒｓｏｎ，Ｐ．、Ｄｉａｂ．Ｍｅｔａｂ．Ｒｅｖ．１９８９年５ｐ．５０５−５０９Ｂｒａｎｃａｔｉ，Ｆ．Ｌ．ら、Ａｒｃｈ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．１９９９年１５９ｐ．９５７−９６３Ｈｉｌｌ，Ｊ．Ｏ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ１９９８年２８０ｐ．１３７１−１３７４

したがって、インスリン関連障害、例えば、低血糖症、インスリン分泌性もしくはインスリン依存性腫瘍、加齢、インスリン抵抗性、耐糖能障害または糖尿病を治療するための、インスリン分泌および／または血糖値を安全かつ有効に調節する薬剤を同定する必要がある。本発明はこの必要性を満たし、さらに関連する利点も提供する。

（発明の要旨）
出願人らは、驚くべきことに、ＧＰＲ４１は膵島細胞株において発現され、また、ＧＰＲ４１はｄｂ／ｄｂ糖尿病マウスにおいてアップレギュレートされているということを見い出した。さらに、出願人らは、ＧＰＲ４１機能を調節するアゴニスト化合物を同定し、また、これらの化合物がインスリン分泌を低減させることを見い出した。さらに、出願人らは、インスリン関連障害、例えば、インスリン抵抗性、耐糖能障害および糖尿病の治療のために、インスリン分泌を増大させるために使用できるＧＰＲ４１のインバースアゴニストまたはアンタゴニストを開示する。

第１の態様では、本発明は、血糖安定化化合物を同定する方法であって、ａ）候補化合物をＧＰＲ４１と接触させる工程と、ＧＰＲ４１の機能性が調節されるかどうかを調べる工程とを含み、ＧＰＲ４１の機能性の調節が、候補化合物が血糖安定化化合物であることを示す方法を特徴とする。いくつかの実施形態では、前記ＧＰＲ４１はヒトである。いくつかの実施形態では、前記調べる工程はセカンドメッセンジャーアッセイを含む。いくつかの実施形態では、血糖安定化化合物は、以下からなる群より選択される化合物を含む：２−メチル−４−（４−ニトロ−フェニル）−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミド、シクロプロパンカルボン酸４−［１，２，３］チアジアゾール−４−イル−フェニルエステル、シクロプロパンカルボン酸；４−フラン−３−イル−２−メチル−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミド、４−フラン−３−イル−２−メチル−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸（２，５−ジクロロ−フェニル）−アミド、４−フラン−２−イル−２−メチル−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミド、４−フラン−３−イル−２−メチル−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸（４−クロロ−フェニル）−アミド、２−メチル−４−（４−メチルスルファニル−フェニル）−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミド、２−メチル−４−（３−ニトロ−フェニル）−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミド、２−メチル−４−［５−（２−ニトロ−４−トリフルオロメチル−フェニル）−フラン−２−イル］−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミド、４−（５−ビフェニル−２−イル−フラン−２−イル）−２−メチル−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミド、２−メチル−４−［５−（２−ニトロ−フェニル）−フラン−２−イル］−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸（２−クロロ−フェニル）−アミド、２−メチル−５−オキソ−４−（４−フェノキシ−フェニル）−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミド、２−メチル−５−オキソ−４−［５−（２−トリフルオロメトキシ−フェニル）−フラン−２−イル］−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミドおよび４−［５−（２，５−ジクロロ−フェニル）−フラン−２−イル］−２−メチル−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミドまたはその製薬上許容される塩。

第２の態様では、本発明は第１の態様の方法によって同定される血糖安定化化合物を特徴とする。いくつかの実施形態では、前記血糖安定化化合物は、ＧＰＲ４１アゴニスト、例えば、以下からなる群より選択される化合物である：２−メチル−４−（４−ニトロ−フェニル）−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミド、シクロプロパンカルボン酸４−［１，２，３］チアジアゾール−４−イル−フェニルエステル、シクロプロパンカルボン酸；４−フラン−３−イル−２−メチル−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミド、４−フラン−３−イル−２−メチル−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸（２，５−ジクロロ−フェニル）−アミド、４−フラン−２−イル−２−メチル−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミド、４−フラン−３−イル−２−メチル−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸（４−クロロ−フェニル）−アミド、２−メチル−４−（４−メチルスルファニル−フェニル）−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミドおよび２−メチル−４−（３−ニトロ−フェニル）−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミドまたはその製薬上許容される塩。いくつかの実施形態では、前記血糖安定化化合物はＧＰＲ４１インバースアゴニストまたはアンタゴニスト、例えば、以下からなる群より選択される化合物である：２−メチル−４−［５−（２−ニトロ−４−トリフルオロメチル−フェニル）−フラン−２−イル］−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミド、４−（５−ビフェニル−２−イル−フラン−２−イル）−２−メチル−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミド、２−メチル−４−［５−（２−ニトロ−フェニル）−フラン−２−イル］−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸（２−クロロ−フェニル）−アミド、２−メチル−５−オキソ−４−（４−フェノキシ−フェニル）−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミド、２−メチル−５−オキソ−４−［５−（２−トリフルオロメトキシ−フェニル）−フラン−２−イル］−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミドおよび４−［５−（２，５−ジクロロ−フェニル）−フラン−２−イル］−２−メチル−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミドまたはその製薬上許容される塩。

第３の態様では、本発明は、血糖安定化化合物を同定する工程と、次いで、前記化合物を担体と混合する工程とを含む組成物の調製方法であって、前記化合物が第１の態様の方法によって同定される方法を特徴とする。

第４の態様では、本発明は、第２の態様の化合物を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなる薬剤組成物を特徴とする。

第５の態様では、本発明は、インスリン関連障害を治療または予防することを必要とする個体において、インスリン関連障害を治療または予防する方法であって、前記個体に有効量の第４の態様の化合物を投与する工程を含む方法を特徴とする。いくつかの実施形態では、前記インスリン関連障害は、低血糖症、インスリン分泌性もしくはインスリン依存性腫瘍、加齢、インスリン抵抗性、耐糖能障害または糖尿病である。いくつかの実施形態では、第５の態様の方法は、前記個体に、糖尿病、血液脂質障害または肥満症の治療に用いられる薬剤の有効量を、有効量の第４の態様の化合物と組み合わせて投与する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、個体は哺乳類であり、いくつかの実施形態では、個体はヒトである。

第６の態様では、本発明は、血糖安定化化合物として用いるための、第４の態様の化合物を含む医薬の製造方法、およびインスリン関連障害の治療に用いるための、第４の態様の化合物を含む医薬の製造方法を特徴とする。

第７の態様では、本発明は血糖安定化化合物を同定する方法であって、ａ）候補化合物をＧＰＲ４１と接触させる工程と、ｂ）ＧＰＲ４１の機能性が増大するかどうかを調べる工程とを含み、ＧＰＲ４１の機能性の増大が、候補化合物が血糖安定化化合物であることを示す方法を特徴とする。いくつかの実施形態では、前記ＧＰＲ４１はヒトである。いくつかの実施形態では、前記調べる工程はセカンドメッセンジャーアッセイを含む。いくつかの実施形態では、血糖安定化化合物は、以下からなる群より選択される化合物を含む：２−メチル−４−（４−ニトロ−フェニル）−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミド、シクロプロパンカルボン酸４−［１，２，３］チアジアゾール−４−イル−フェニルエステル、シクロプロパンカルボン酸；４−フラン−３−イル−２−メチル−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミド、４−フラン−３−イル−２−メチル−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸（２，５−ジクロロ−フェニル）−アミド、４−フラン−２−イル−２−メチル−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミド、４−フラン−３−イル−２−メチル−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸（４−クロロ−フェニル）−アミド、２−メチル−４−（４−メチルスルファニル−フェニル）−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミドおよび２−メチル−４−（３−ニトロ−フェニル）−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミドまたはその製薬上許容される塩。

第８の態様では、本発明は、第７の態様の方法によって同定される血糖安定化化合物を特徴とする。いくつかの実施形態では、前記血糖安定化化合物はＧＰＲ４１アゴニスト、例えば、以下からなる群より選択される化合物である：２−メチル−４−（４−ニトロ−フェニル）−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミド、シクロプロパンカルボン酸４−［１，２，３］チアジアゾール−４−イル−フェニルエステル、シクロプロパンカルボン酸；４−フラン−３−イル−２−メチル−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミド、４−フラン−３−イル−２−メチル−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸（２，５−ジクロロ−フェニル）−アミド、４−フラン−２−イル−２−メチル−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミド、４−フラン−３−イル−２−メチル−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸（４−クロロ−フェニル）−アミド、２−メチル−４−（４−メチルスルファニル−フェニル）−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミドおよび２−メチル−４−（３−ニトロ−フェニル）−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミドまたはその製薬上許容される塩。

第９の態様では、本発明は、血糖安定化化合物を同定する工程と、次いで、前記化合物を担体と混合する工程とを含む組成物の調製方法であって、前記化合物が第７の態様の方法によって同定される方法を特徴とする。

第１０の態様では、本発明は、第８の態様の化合物を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなる薬剤組成物を特徴とする。

第１１の態様では、本発明は、インスリン関連障害を治療または予防することを必要とする個体において、インスリン関連障害を治療または予防する方法であって、前記個体に有効量の第１０の態様の化合物を投与する工程を含む方法を特徴とする。いくつかの実施形態では、前記インスリン関連障害は、低血糖症、インスリン分泌性もしくはインスリン依存性腫瘍または加齢である。いくつかの実施形態では、個体は哺乳類であり、いくつかの実施形態では、個体はヒトである。

第１２の態様では、本発明は、血糖安定化化合物として用いるための、第８の態様の化合物を含む医薬の製造方法、およびインスリン関連障害の治療に用いるための、第８の態様の化合物を含む医薬の製造方法を特徴とする。

第１３の態様では、本発明は、血糖安定化化合物を同定する方法であって、ａ）候補化合物をＧＰＲ４１と接触させる工程と、ｂ）ＧＰＲ４１の機能性が低減するかどうかを調べる工程とを含み、ＧＰＲ４１の機能性の低減が、候補化合物が血糖安定化化合物であることを示す方法を特徴とする。いくつかの実施形態では、前記ＧＰＲ４１はヒトである。いくつかの実施形態では、前記調べる工程はセカンドメッセンジャーアッセイを含む。いくつかの実施形態では、前記血糖安定化化合物は、以下からなる群より選択される化合物を含む：２−メチル−４−［５−（２−ニトロ−４−トリフルオロメチル−フェニル）−フラン−２−イル］−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミド、４−（５−ビフェニル−２−イル−フラン−２−イル）−２−メチル−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミド、２−メチル−４−［５−（２−ニトロ−フェニル）−フラン−２−イル］−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸（２−クロロ−フェニル）−アミド、２−メチル−５−オキソ−４−（４−フェノキシ−フェニル）−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミド、２−メチル−５−オキソ−４−［５−（２−トリフルオロメトキシ−フェニル）−フラン−２−イル］−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミドおよび４−［５−（２，５−ジクロロ−フェニル）−フラン−２−イル］−２−メチル−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミドまたはその製薬上許容される塩。

第１４の態様では、本発明は、第１３の態様の方法によって同定される血糖安定化化合物を特徴とする。いくつかの実施形態では、前記血糖安定化化合物はＧＰＲ４１インバースアゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態では、前記血糖安定化化合物は、以下からなる群より選択される化合物を含む：２−メチル−４−［５−（２−ニトロ−４−トリフルオロメチル−フェニル）−フラン−２−イル］−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミド、４−（５−ビフェニル−２−イル−フラン−２−イル）−２−メチル−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミド、２−メチル−４−［５−（２−ニトロ−フェニル）−フラン−２−イル］−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸（２−クロロ−フェニル）−アミド、２−メチル−５−オキソ−４−（４−フェノキシ−フェニル）−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミド、２−メチル−５−オキソ−４−［５−（２−トリフルオロメトキシ−フェニル）−フラン−２−イル］−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミドおよび４−［５−（２，５−ジクロロ−フェニル）−フラン−２−イル］−２−メチル−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミドまたはその製薬上許容される塩。

第１５の態様では、本発明は、血糖安定化化合物を同定する工程と、次いで、前記化合物を担体と混合する工程とを含む組成物の調製方法であって、前記化合物が第１３の態様の方法によって同定される方法を特徴とする。

第１６の態様では、本発明は、第１４の態様の化合物を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなる薬剤組成物を特徴とする。

第１７の態様では、本発明は、インスリン関連障害を治療または予防することを必要とする個体において、インスリン関連障害を治療または予防する方法であって、前記個体に有効量の第１６の態様の化合物を投与する工程を含む方法を特徴とする。いくつかの実施形態では、前記インスリン関連障害はインスリン抵抗性、耐糖能障害または糖尿病である。いくつかの実施形態では、第１７の態様の方法は、前記個体に、糖尿病、血液脂質障害または肥満症の治療に用いられる薬剤の有効量を、有効量の第１６の態様の化合物と組み合わせて投与する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、個体は哺乳類であり、いくつかの実施形態では、個体はヒトである。

第１８の態様では、本発明は、血糖安定化化合物として用いるための、第１６の態様の化合物を含む医薬の製造方法、およびインスリン関連障害の治療に用いるための、第１６の態様の化合物を含む医薬の製造方法を特徴とする。

第１９の態様では、本発明は、ＧＰＲ４１を有効量のＧＰＲ４１アゴニストと接触させる工程を含む、ＧＰＲ４１機能を増大させる方法を特徴とする。いくつかの実施形態では、前記アゴニストは以下からなる群より選択される化合物を含む：２−メチル−４−（４−ニトロ−フェニル）−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミド、シクロプロパンカルボン酸４−［１，２，３］チアジアゾール−４−イル−フェニルエステル、シクロプロパンカルボン酸；４−フラン−３−イル−２−メチル−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミド、４−フラン−３−イル−２−メチル−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸（２，５−ジクロロ−フェニル）−アミド、４−フラン−２−イル−２−メチル−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミド、４−フラン−３−イル−２−メチル−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸（４−クロロ−フェニル）−アミド、２−メチル−４−（４−メチルスルファニル−フェニル）−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミドおよび２−メチル−４−（３−ニトロ−フェニル）−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミドまたはその製薬上許容される塩。

第２０の態様では、本発明は、ＧＰＲ４１を有効量のＧＰＲ４１インバースアゴニストまたはアンタゴニストと接触させる工程を含む、ＧＰＲ４１機能を低下させる方法を特徴とする。いくつかの実施形態では、前記インバースアゴニストまたはアンタゴニストは、以下からなる群より選択される化合物を含む：２−メチル−４−［５−（２−ニトロ−４−トリフルオロメチル−フェニル）−フラン−２−イル］−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミド、４−（５−ビフェニル−２−イル−フラン−２−イル）−２−メチル−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミド、２−メチル−４−［５−（２−ニトロ−フェニル）−フラン−２−イル］−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸（２−クロロ−フェニル）−アミド、２−メチル−５−オキソ−４−（４−フェノキシ−フェニル）−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミド、２−メチル−５−オキソ−４−［５−（２−トリフルオロメトキシ−フェニル）−フラン−２−イル］−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミドおよび４−［５−（２，５−ジクロロ−フェニル）−フラン−２−イル］−２−メチル−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミドまたはその製薬上許容される塩。

第２１の態様では、本発明は、インスリン関連障害を治療または予防することを必要とする個体に、有効量のＧＰＲ４１モジュレーターを投与する工程を含むインスリン関連障害を治療または予防する方法を特徴とする。いくつかの実施形態では、前記インスリン関連障害は、低血糖症、インスリン分泌性もしくはインスリン依存性腫瘍または加齢であり、前記モジュレーターはアゴニスト、例えば、以下からなる群より選択される化合物である：２−メチル−４−（４−ニトロ−フェニル）−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミド、シクロプロパンカルボン酸４−［１，２，３］チアジアゾール−４−イル−フェニルエステル、シクロプロパンカルボン酸；４−フラン−３−イル−２−メチル−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミド、４−フラン−３−イル−２−メチル−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸（２，５−ジクロロ−フェニル）−アミド、４−フラン−２−イル−２−メチル−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミド、４−フラン−３−イル−２−メチル−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸（４−クロロ−フェニル）−アミド、２−メチル−４−（４−メチルスルファニル−フェニル）−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミドおよび２−メチル−４−（３−ニトロ−フェニル）−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミドまたはその製薬上許容される塩。いくつかの実施形態では、前記インスリン関連障害はインスリン抵抗性、耐糖能障害または糖尿病であり、前記モジュレーターはインバースアゴニストまたはアンタゴニスト、例えば、以下からなる群より選択される化合物である：２−メチル−４−［５−（２−ニトロ−４−トリフルオロメチル−フェニル）−フラン−２−イル］−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミド、４−（５−ビフェニル−２−イル−フラン−２−イル）−２−メチル−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミド、２−メチル−４−［５−（２−ニトロ−フェニル）−フラン−２−イル］−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸（２−クロロ−フェニル）−アミド、２−メチル−５−オキソ−４−（４−フェノキシ−フェニル）−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミド、２−メチル−５−オキソ−４−［５−（２−トリフルオロメトキシ−フェニル）−フラン−２−イル］−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミドおよび４−［５−（２，５−ジクロロ−フェニル）−フラン−２−イル］−２−メチル−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミドまたはその製薬上許容される塩。いくつかの実施形態では、第２１の態様の方法は、前記個体に、糖尿病、血液脂質障害または肥満症の治療に用いられる薬剤の有効量を、有効量のＧＰＲ４１インバースアゴニストまたはアンタゴニストと組み合わせて投与する工程をさらに含む。

第２２の態様では、本発明は、ＧＰＲ４１機能を増大させることによって治療可能または予防可能な障害を治療または予防することを必要とする個体に、以下からなる群より選択される化合物の有効量を投与する工程を含む、ＧＰＲ４１機能を増大させることによって治療可能または予防可能な障害を治療または予防する方法を特徴とする：２−メチル−４−（４−ニトロ−フェニル）−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミド、シクロプロパンカルボン酸４−［１，２，３］チアジアゾール−４−イル−フェニルエステル、シクロプロパンカルボン酸；４−フラン−３−イル−２−メチル−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミド、４−フラン−３−イル−２−メチル−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸（２，５−ジクロロ−フェニル）−アミド、４−フラン−２−イル−２−メチル−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミド、４−フラン−３−イル−２−メチル−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸（４−クロロ−フェニル）−アミド、２−メチル−４−（４−メチルスルファニル−フェニル）−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミドおよび２−メチル−４−（３−ニトロ−フェニル）−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミドまたはその製薬上許容される塩。いくつかの実施形態では、前記障害は、インスリン関連障害、例えば、低血糖症、インスリン分泌性もしくはインスリン依存性腫瘍または加齢である。

第２３の態様では、本発明は、ＧＰＲ４１機能を低下させることによって治療可能または予防可能な障害を治療または予防することを必要とする個体に、以下からなる群より選択される化合物の有効量を投与する工程を含む、ＧＰＲ４１機能を低下させることによって治療可能または予防可能な障害を治療または予防する方法を特徴とする：２−メチル−４−［５−（２−ニトロ−４−トリフルオロメチル−フェニル）−フラン−２−イル］−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミド、４−（５−ビフェニル−２−イル−フラン−２−イル）−２−メチル−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミド、２−メチル−４−［５−（２−ニトロ−フェニル）−フラン−２−イル］−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸（２−クロロ−フェニル）−アミド、２−メチル−５−オキソ−４−（４−フェノキシ−フェニル）−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミド、２−メチル−５−オキソ−４−［５−（２−トリフルオロメトキシ−フェニル）−フラン−２−イル］−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミドおよび４−［５−（２，５−ジクロロ−フェニル）−フラン−２−イル］−２−メチル−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミドまたはその製薬上許容される塩。いくつかの実施形態では、前記障害は、インスリン関連障害、例えば、インスリン抵抗性、耐糖能障害または糖尿病である。いくつかの実施形態では、前記インスリン関連障害はＩＩ型糖尿病である。いくつかの実施形態では、第２３の態様の方法は、前記個体に糖尿病、血液脂質障害または肥満症の治療に用いられる薬剤の有効量を、有効量のＧＰＲ４１インバースアゴニストまたはアンタゴニストと組み合わせて投与する工程をさらに含む。

第２４の態様では、本発明は、血糖値を上昇させることを必要とする個体において血糖値を上昇させる方法であって、個体に、有効量のＧＰＲ４１アゴニスト、例えば、以下からなる群より選択される化合物を投与する工程を含む方法を特徴とする：２−メチル−４−（４−ニトロ−フェニル）−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミド、シクロプロパンカルボン酸４−［１，２，３］チアジアゾール−４−イル−フェニルエステル、シクロプロパンカルボン酸；４−フラン−３−イル−２−メチル−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミド、４−フラン−３−イル−２−メチル−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸（２，５−ジクロロ−フェニル）−アミド、４−フラン−２−イル−２−メチル−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミド、４−フラン−３−イル−２−メチル−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸（４−クロロ−フェニル）−アミド、２−メチル−４−（４−メチルスルファニル−フェニル）−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミドおよび２−メチル−４−（３−ニトロ−フェニル）−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミドまたはその製薬上許容される塩。

第２５の態様では、本発明は、血糖値を低下させることを必要とする個体において血糖値を低下させる方法であって、個体に有効量のＧＰＲ４１インバースアゴニストまたはアンタゴニスト、例えば、以下からなる群より選択される化合物を投与する工程を含む方法を特徴とする：２−メチル−４−［５−（２−ニトロ−４−トリフルオロメチル−フェニル）−フラン−２−イル］−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミド、４−（５−ビフェニル−２−イル−フラン−２−イル）−２−メチル−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミド、２−メチル−４−［５−（２−ニトロ−フェニル）−フラン−２−イル］−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸（２−クロロ−フェニル）−アミド、２−メチル−５−オキソ−４−（４−フェノキシ−フェニル）−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミド、２−メチル−５−オキソ−４−［５−（２−トリフルオロメトキシ−フェニル）−フラン−２−イル］−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミドおよび４−［５−（２，５−ジクロロ−フェニル）−フラン−２−イル］−２−メチル−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミドまたはその製薬上許容される塩。

第２６の態様では、本発明は、インスリン分泌を低減させることを必要とする個体においてインスリン分泌を低減させる方法であって、個体に、有効量のＧＰＲ４１アゴニスト、例えば、以下からなる群より選択される化合物を投与する工程を含む方法を特徴とする：２−メチル−４−（４−ニトロ−フェニル）−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミド、シクロプロパンカルボン酸４−［１，２，３］チアジアゾール−４−イル−フェニルエステル、シクロプロパンカルボン酸；４−フラン−３−イル−２−メチル−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミド、４−フラン−３−イル−２−メチル−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸（２，５−ジクロロ−フェニル）−アミド、４−フラン−２−イル−２−メチル−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミド、４−フラン−３−イル−２−メチル−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸（４−クロロ−フェニル）−アミド、２−メチル−４−（４−メチルスルファニル−フェニル）−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミドおよび２−メチル−４−（３−ニトロ−フェニル）−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミドまたはその製薬上許容される塩。

第２７の態様では、本発明は、インスリン分泌を増大させることを必要とする個体においてインスリン分泌を増大させる方法であって、個体に、有効量のＧＰＲ４１インバースアゴニストまたはアンタゴニスト、例えば、以下からなる群より選択される化合物を投与する工程を含む方法を特徴とする：２−メチル−４−［５−（２−ニトロ−４−トリフルオロメチル−フェニル）−フラン−２−イル］−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミド、４−（５−ビフェニル−２−イル−フラン−２−イル）−２−メチル−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミド、２−メチル−４−［５−（２−ニトロ−フェニル）−フラン−２−イル］−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸（２−クロロ−フェニル）−アミド、２−メチル−５−オキソ−４−（４−フェノキシ−フェニル）−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミド、２−メチル−５−オキソ−４−［５−（２−トリフルオロメトキシ−フェニル）−フラン−２−イル］−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミドおよび４−［５−（２，５−ジクロロ−フェニル）−フラン−２−イル］−２−メチル−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミドまたはその製薬上許容される塩。

（発明の詳細）
出願人らは本明細書において、ヒトＧＰＲ４１は主に膵臓において発現され（図１参照のこと）、マウスＧＰＲ４１は膵臓および膵島細胞株において発現される（図２および３参照のこと）ということを開示した。膵臓は結合組織性中隔によって小葉に分割される。小葉は、大部分は、腺房と呼ばれる外分泌細胞のブドウ状の集合体からなり、これが消化酵素を分泌する。膵臓外分泌組織内にランゲルハンス島、膵臓の内分泌要素が埋まっている。島は膵臓の１％を構成するにすぎない。島は、数種の細胞種を含み、豊富に血管新生化されている。島細胞種としては以下が挙げられる：α、β、δ、Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥ。インスリンを分泌するのはβ島細胞である。

出願人らはまた本明細書において、マウスＧＰＲ４１が、ｄｂ／ｄｂ糖尿病マウス由来の膵島細胞において、Ｃ５７野生型マウス由来の島と比較してアップレギュレートされていることを開示する（図２参照のこと）。さらに、出願人らは本明細書において、ＧＰＣＲＧＰＲ４１のＧαｉおよびＧα１２／１３とのＧタンパク質共役を開示した（図４および５参照のこと）。さらに、出願人らは本明細書において、Ｇｑ／Ｇｉで同時トランスフェクトされた細胞においてＧＰＲ４１アゴニストがＩＰ３シグナル伝達を誘導することを開示する（図６参照のこと）。出願人らはさらに、本明細書において、ＭＩＮ６インスリノーマ細胞を用いて、ＧＰＲ４１アゴニストはインスリン分泌を阻害し（図７）、経口ブドウ糖負荷試験（ｏＧＴＴ）を低下させる化合物の有益な効果を逆転させることを開示する（図８）。

ヒトにはいくつかの受容体の種類が存在するが、最も豊富であり、現在治療上関係のあるものはＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）の種類によって代表される。ヒトゲノム内にはおよそ３０，０００〜４０，０００種の遺伝子があると推定されており、これらのうちおよそ２％がＧＰＣＲをコードすると推定されている。ＧＰＣＲは薬剤製品の開発にとって重要な領域に相当する：１００種の既知のＧＰＣＲのうちおよそ２０種から、すべての処方調合薬のおよそ６０％が開発されている。

ＧＰＣＲは共通の構造モチーフを共有し、これは各々が膜を貫通する７つのαへリックスを形成する、２２〜２４個の疎水性アミノ酸からなる７つの配列を有する（各貫通は番号によって同定される、すなわち、膜貫通−１（ＴＭ−１）、膜貫通−２（ＴＭ−２）など）。膜貫通へリックスは、細胞膜の外部、すなわち「細胞外」側で、膜貫通−２と膜貫通−３、膜貫通４と膜貫通５、および膜貫通６と膜貫通７の間のアミノ酸の鎖によって結合している（これらはそれぞれ、「細胞外」領域１、２および３（ＥＣ−１、ＥＣ−２およびＥＣ−３）と呼ばれている）。膜貫通へリックスはまた、細胞膜の内部、すなわち「細胞内」側で、膜貫通１と膜貫通２、膜貫通３と膜貫通４、および膜貫通５と膜貫通６の間のアミノ酸の鎖によって結合している（これらはそれぞれ、「細胞内」領域１、２および３（ＩＣ−１、ＩＣ−２およびＩＣ−３）と呼ばれている）。受容体の「カルボキシ」（「Ｃ」）末端は、細胞内の細胞内空間にあり、受容体の「アミノ」（「Ｎ」）末端は、細胞の外側の細胞外空間にある。

一般に、リガンドが受容体と結合する（受容体の「活性化」と呼ばれることも多い）際には、受容体のコンホメーションの変化があり、これが細胞内領域と細胞内「Ｇタンパク質」との間の共役を促進する。ＧＰＣＲはＧタンパク質に関して「無差別」である、すなわち、ＧＰＣＲは２種以上のＧタンパク質と相互作用し得るということが報告されている。Ｋｅｎａｋｉｎ，Ｔ．，４３ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ１０９５（１９８８）参照のこと。他のＧタンパク質も存在するが、現在のところ、Ｇｑ、Ｇｓ、Ｇｉ、ＧｚおよびＧｏが同定されているＧタンパク質である。Ｇタンパク質との、リガンドによって活性化されたＧＰＣＲの共役は、シグナル伝達カスケードプロセス（「シグナル伝達」と呼ばれる）を開始する。正常な状態下では、シグナル伝達は最終的に細胞の活性化または細胞の阻害をもたらす。理論に拘束されようとは思わないが、ＩＣ−３ループならびに受容体のカルボキシ末端がＧタンパク質と相互作用するということが考えられる。

ホスホリパーゼＣ経路のいくつかの種類のＧＰＣＲ、例えば、Ｇα１５またはＧα１６と共役すると思われる無差別なＧタンパク質（Ｏｆｆｅｒｍａｎｎｓ＆Ｓｉｍｏｎ，ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ２７０：１５１７５−８０（１９９５））または同一経路、例えば、ホスホリパーゼＣの多数の異なるＧＰＣＲと共役するよう設計されたキメラＧタンパク質もある（Ｍｉｌｌｉｇａｎ＆Ｒｅｅｓ，ＴｒｅｎｄｓｉｎＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ２０：１１８−２４（１９９９））。

Ｇｉ共役型ＧＰＣＲは細胞内ｃＡＭＰレベルを低下させる。メラノフォア技術（下記参照）は、Ｇｉ共役型ＧＰＣＲを同定するのに、また、前記のＧｉ共役型ＧＰＣＲのモジュレーターを同定するのに有用である。

生理学的条件下では、ＧＰＣＲは、２種の異なるコンホメーション：「不活性」状態と「活性」状態との間の平衡状態で細胞膜中に存在する。不活性状態にある受容体は、細胞内シグナル伝達経路と結合して、生物学的応答をもたらすシグナル伝達を開始することができない。受容体コンホメーションを活性状態に変更することによって、伝達経路との結合（Ｇタンパク質を介する）が可能となり、生物学的応答が生じる。

受容体は、リガンドまたは薬物などの化合物によって活性状態に安定化することができる。排他的に限定するものではないが、受容体のアミノ酸配列の修飾をはじめとする最近の発見が、活性状態コンホメーションにある受容体を促進し、安定化する、リガンドまたは薬物以外の手段を提供する。これらの手段は、受容体とのリガンド結合の効果をまねることによって受容体を活性状態に効率的に安定化する。このようなリガンド独立性手段による安定化は「構成的受容体活性化」と呼ばれる。

ＧＰＲ４１の配列は、Ｓａｗｚｄａｒｇｏらの文献（Ｓａｗｚｄａｒｇｏら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２３９：５４３−５４７（１９９７））において最初に公開された。Ｓａｗｚｄａｒｇｏらは、ヒトおよびラットガラニン受容体１（ＧＡＬＲ１）およびラットＧＡＬＲ２内の保存された配列に基づく縮重プライマーを用いるＰＣＲを用いてヒトゲノムＤＮＡを増幅した。１種の生成物は、ヒトＣＤ２２遺伝子の３プライム領域の一部に対して１００％の相同性を示すセグメントを含んでいた。Ｓａｗｚｄａｒｇｏはこの領域においてオープンリーディングフレームを探索し、ＧＰＲ４０およびＧＰＲ４１遺伝子を同定した。ＧＰＲ４１遺伝子にはイントロンがない。ＧＰＲ４１は、７つの膜貫通ドメイン、１つのグリコシル化部位、１つのＰＫＣリン酸化部位、２つのＰＫＡ／ＰＫＣリン酸化部位、およびＣ末端ドメインに位置する１つのパルミトイル化部位を含む予測される３４６アミノ酸ＧＰＣＲをコードする。ＧＰＲ４１タンパク質はＧＰＲ４２と９８％のアミノ酸同一性を共有するが、ＧＡＬＲとはほとんど類似していない。Ｓａｗｚｄａｒｇｏらは、以前は１９ｑ１３．１にマッピングされていたＧＰＲ４１遺伝子はＣＤ２２の下流に位置することをさらに報告した。

ＧＰＲ４１はオーファン受容体として分類され、これはその受容体のリガンドが同定されていないことを意味する。近年、Ｂｒｏｗｎらが、ＧＰＲ４１はプロピオネートおよびその他の短い鎖のカルボン酸アニオンによって活性化されるということを報告した（Ｂｒｏｗｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７８：１１３１２−１１３１９（２００３））。さらに、Ｂｒｏｗｎらは、ＧＰＲ４１がＧｉ／ｏファミリータンパク質を活性化することおよびＧＰＲ４１が主に脂肪組織において発現されることを示した。

ＧＰＲ４１が膵臓のβ細胞において発現される本明細書の開示内容とは対照的に、ＷＯ０１／６１３５９（出願日２００１年２月１９日）は、ＧＰＲ４１は脂肪組織に限定されていると示す。さらに、ＷＯ０１／６１３５９は、ＧＰＲ４１を、脂肪分解を阻害する化合物のスクリーニング標的として使用できることを示す。ＧＰＲ４１はＧｉと共役しているので、このような化合物はＧＰＲ４１のアゴニストである。ＧＰＲ４１のアゴニストはまた、ＷＯ０１／６１３５９では、例えば、脂質代謝異常および脂質代謝異常に伴われる症状、冠動脈心疾患、アテローム性動脈硬化症、血栓症または肥満症、アンギナ、慢性腎不全、末梢血管疾患、卒中、ＩＩ型糖尿病またはメタボリック症候群を治療するための医薬の製造において有用であると仮定されている。これは、ＧＰＲ４１のインバースアゴニストまたはアンタゴニストが、例えば、インスリン関連障害、例えば、糖尿病を治療するための医薬の製造において有用であるという本明細書の開示内容とは対照的である。

（定義）
受容体の周辺で発展してきた科学文献は、受容体に対する種々の作用を有するリガンドを指すためにいくつかの用語を採用してきた。明確性および整合性のために、本特許文献を通じて以下の定義を用いる。

アゴニストは、受容体と結合した際に細胞内応答を活性化する物質、例えば、リガンドまたは候補化合物を意味するものとする。細胞内応答は、例えば、ＧＴＰの膜との結合の増強またはｃＡＭＰもしくはＩＰ３などのセカンドメッセンジャーのレベルの調節であり得る。いくつかの実施形態では、アゴニストは、受容体と結合した際に細胞内応答を活性化する（例えば、ＧＴＰγＳの膜との結合を増強する、または細胞内ｃＡＭＰレベルを低下させる）とは、これまでは知られていなかった物質である。いくつかの実施形態では、アゴニストは、受容体と結合した際に血糖値を低減させるとは、これまでは知られていなかった物質である。用語アゴニストはまた、受容体と結合した際に細胞内応答を、完全アゴニストが行うよりも小さい程度または範囲に活性化する物質、例えば、リガンドまたは候補化合物である部分アゴニストを含む。

アンタゴニストとは、アゴニストと同一部位で受容体と競合的に結合するが、細胞内応答を活性化せず、それによって、アゴニストによって誘発される細胞内応答を阻害できる物質、例えば、リガンドまたは候補化合物を意味するものとする。アンタゴニストは、アゴニストの不在下でのベースライン細胞内応答を下げることはない。いくつかの実施形態では、アンタゴニストは、受容体と結合する際にアゴニストと競合し、細胞の応答を阻害するとは（例えば、細胞の応答がＧＴＰγＳの膜との結合または細胞内ｃＡＭＰレベルの低下である場合に）、これまでは知られていなかった物質である。

抗体は、本明細書では、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を包含するものとする。用語抗体はＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥおよびＩｇＭをさらに包含するものとする。抗体は、全抗体、例えば、一本鎖全抗体およびその抗原結合フラグメント、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２およびＦ（ａｂ’）２を含む。抗体は、天然または合成起源のいずれに由来するもの、例えば、ヒト、マウス、ウサギ、ヤギ、モルモット、ハムスター、ラクダ、ロバ、ヒツジ、ウマまたはニワトリ由来であってもよい。抗体は、例えば、５×１０−６Ｍ、１０−６Ｍ、５×１０−７Ｍ、１０−７Ｍ、５×１０−８Ｍ、１０−８Ｍ、５×１０−９Ｍ、１０−９Ｍ、５×１０−１０Ｍ、１０−１０Ｍ、５×１０−１１Ｍ、１０−１１Ｍ、５×１０−１２Ｍ、１０−１２Ｍ、５×１０−１３Ｍ、１０−１３Ｍ、５×１０−１４Ｍ、１０−１４Ｍ、５×１０−１５Ｍおよび１０−１５Ｍ未満の解離定数すなわちＫｄ値の結合親和性を有し得る。本発明の抗体は、当技術分野で公知のいずれかの適した方法によって調製できる。

候補化合物は、スクリーニング技術を受け入れられる分子（例えば、化合物）を意味するものとする。用語候補化合物は、具体的には、ＧＰＲ４１を調節すると既に知られている化合物、例えば、既知のＧＰＲ４１のアゴニストはいずれも排除する。

組成物とは、少なくとも２種の化合物または２種の成分を含む物質を意味するものとし、例えば、「薬剤組成物」は組成物である。

化合物の有効性とは、受容体結合親和性の対語として、化合物の、受容体の機能性を阻害または刺激する能力の測定結果を意味するものとする。構成的活性化受容体とは、構成的受容体活性化に付されている受容体を意味するものとする。

構成的受容体活性化とは、受容体と、その内因性リガンドまたはその化学的等価物との結合以外の手段によって、受容体を活性状態に安定化することを意味するものとする。

接触させる、または接触とは、イン・ビトロ系においてであろうとイン・ビボ系においてであろうと、少なくとも２種の部分を一緒にすることを意味するものとする。

本明細書において糖尿病とは、例えば、以下の羅列をはじめとするいずれかの方法によってなされる通常の糖尿病という診断を包含するものとする：糖尿病の症状（例えば、多尿、多飲、過食）および２００ｍｇ／ｄｌ以上の随時血糖値（随時血糖は食事および飲料消費のタイミングに関わらず日中いつでも決められる）；または１２６ｍｇ／ｄｌ以上の８時間絶食時血糖値；または水に溶解した７５ｇの無水ブドウ糖を経口投与した２時間後の２００ｍｇ／ｄｌ以上の血糖値。さらに、用語糖尿病はまた、本明細書では、米国糖尿病協会よって、１００〜１２５ｍｇ／ｄｌという絶食時血糖値またはブドウ糖を経口投与した２時間後の１４０〜１９９ｍｇ／ｄｌという血糖値であると定義される「前糖尿病」状態を含む。糖尿病は、例えば、β島細胞の自己免疫破壊、β細胞アポトーシスまたは妊娠（妊娠性糖尿病）をはじめとするいくつかの条件によって促進され得る。

内因性とは、哺乳類が天然に産生する物質を意味するものとする。例えば、それだけには限らないが、用語「受容体」に関連して内因性とは、哺乳類（例えば、それだけには限らないが、ヒト）またはウイルスによって天然に産生されるものを意味するものとする。対照的に、これに関連して用語非内因性とは、哺乳類（例えば、それだけには限らないが、ヒト）またはウイルスによって天然に産生されないことを意味するものとする。例えば、それだけには限らないが、内因性型では構成的に活性でないが、操作されると構成的に活性となる受容体が最も好ましく、本明細書において「非内因性の構成的に活性化された受容体」と呼ばれる。両用語とも「イン・ビボ」および「イン・ビトロ」系の双方を説明するために使用できる。例えば、それだけには限らないが、スクリーニングアプローチにおいて、内因性または非内因性受容体はイン・ビトロスクリーニング系に関するものであり得る。

有効量とは、研究者または医師またはその他の臨床医によって探索されている組織、系または個体において、所望の生物学的応答または医薬的応答を誘発する活性化合物または薬剤組成物の量を意味する。例えば、有効用量は、インスリン関連障害を治療できる量であり得る。また、例えば、有効用量はインスリン関連障害を予防できる量であり得る。

血糖安定化化合物は、血糖値を安定化する化合物を意味するものとする。血糖の安定化は、直接であってもよいし、間接であってもよい。例えば、血糖安定化化合物は、糖尿病を患う個体において、インスリン分泌を増大させることによって血糖値を安定化できる。さらに、例えば、血糖安定化化合物は、低血糖症を患う個体において、インスリン分泌を低減させることによって血糖値を安定化できる。さらに、例えば、血糖安定化化合物は、器官または組織のグルコース感受性を増大させることによって血糖値を安定化できる。

本明細書において耐糖能障害（ＩＧＴ）とは、明らかな２型糖尿病と正常耐糖能（ＮＧＴ）との間の中間にあるインスリン耐性と関連している状態を示すものとする。ＩＧＴは、罹患した人の食後グルコース応答が、食後２時間の血漿血糖値によって評価され、異常であると決定される手順によって診断される。この試験では、測定された量のグルコースを患者に与え、一定間隔、通常３０分毎に最初の２時間、その後は１時間毎に血糖値を測定する。「正常」または非ＩＧＴ個体では、血糖値は最初の２時間の間、１４０ｍｇ／ｄｌ未満のレベルに上昇し、次いで急速に降下する。ＩＧＴ個体では、血糖値はより高く、降下レベルがより遅い速度である。

本明細書において、予防または治療を必要とするとは、介護者（例えば、ヒトの場合には医師、看護師、ナース・プラクティショナーなど、非ヒト哺乳類をはじめとする動物の場合には獣医）によってなされる、個体または動物が治療を必要とするか治療から恩恵を受けるという判断を指す。この判断は、介護者の専門知識の領域にあるが、個体または動物が、本発明の化合物によって治療できる状態の結果として病気であるか病気になるという知識を含む種々の因子に基づいてなされる。

本明細書において個体とは、いずれかの動物、例えば、哺乳類、好ましくは、マウス、ラット、その他の齧歯類、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ウマまたは霊長類および最も好ましくは、ヒトを指す。

用語「応答する」との関連で、阻害するまたは阻害とは、化合物の不在下とは対照的に、化合物の存在下で応答が低減されるか、または妨げられることを意味するものとする。

インスリン関連障害とは、血中または器官もしくは組織でのインスリンレベルに関連している障害を意味する。本明細書において、インスリン関連障害は、例えば、少なすぎるインスリン分泌、多すぎるインスリン分泌、またはさらに、器官のインスリンに対する耐性とあいまった正常なインスリン分泌の結果であり得る。インスリン関連障害は、例えば、インスリン分泌の減少から恩恵を受ける障害、例えば、低血糖症、インスリノーマ、インスリンが増殖因子である腫瘍または加齢を含むものとする。さらに、インスリン関連障害は、例えば、血糖の上昇をもたらし、インスリン分泌の増大から恩恵を受ける障害を含むものとする。このような障害としては、例えば、インスリン抵抗性、耐糖能障害またはＩ型糖尿病もしくはＩＩ型糖尿病などの糖尿病が挙げられる。さらに、いくつかの実施形態では、用語インスリン関連障害は、血糖値の上昇と関連している疾患、例えば、アテローム性動脈硬化症、心疾患、卒中、高血圧症、シンドロームＸ、肥満症および末梢血管疾患を含み得る。

本明細書においてインスリン抵抗性とは、それだけには限らないが、静脈内グルコース耐性または絶食時インスリンレベルの測定をはじめとするいくつかの方法のうちのいずれかによってなされるインスリン抵抗性の通常の診断を包含するものとする。絶食時インスリンレベルの高さとインスリン抵抗性の程度との間には良好な相関があるということはよく知られている。したがって、どの正常グルコース耐性（ＮＧＴ）個体がインスリン抵抗性を有するかを同定することを目的として、絶食時インスリンレベルの上昇をインスリン抵抗性の代理マーカーとして用いることができる。インスリン抵抗性という診断はまた、正常血糖グルコースクランプ試験を用いて行うこともできる。

インバースアゴニストとは、内因性型または構成的に活性化された型の受容体のいずれかと結合し、アゴニストの不在下で観察される受容体のベースライン細胞内応答を低下させる物質、例えば、リガンドまたは候補化合物を意味する。細胞内応答は、例えば、ＧＴＰの膜との結合の調節またはｃＡＭＰもしくはＥＰ３などのセカンドメッセンジャーレベルの調節であり得る。いくつかの実施形態では、インバースアゴニストは、アゴニストの不在下で観察される受容体のベースライン細胞内応答を低下させるとは、これまでは知られていなかった物質である。

リガンドとは、内因性の、天然に存在する受容体に特異的な、内因性の、天然に存在する分子を意味するものとする。

本明細書において、用語調節するまたは調節とは、個々の活性、機能または分子の量、質、応答または作用の増大または減少を指すことを意味するものとする。ＧＰＲ４１モジュレーターとは、ＧＰＲ４１受容体を調節する物質である。

薬剤組成物とは、少なくとも１種の化合物および製薬上許容される担体を含む組成物を意味するものとする。例えば、薬剤組成物は、それによって組成物が、動物（例えば、ヒトなどの哺乳類）における指定の、有効な結果についての調査を受け入れられる、少なくとも１種の有効成分を含み得る。当業者ならば、技術者の必要性に基づいて有効成分が所望の有効な結果を有するかどうかを調べるのに適当な技術を理解し、分かるであろう。

受容体の機能性とは、それだけには限らないが、例えば、遺伝子転写を調節し、イオンの流入または流出を調節し、触媒反応を達成し、かつ／またはＧタンパク質を介して活性を調節して、細胞において刺激を受け取り、作用を和らげる受容体の正常な働きを指すものとする。ＧＰＲ４１の機能性は、例えば、ＧｉもしくはＧ１２／１３などのＧタンパク質との結合、ｃＡＭＰもしくはＩＰ３などのセカンドメッセンジャーによるシグナル伝達（キメラＧタンパク質を用いる場合）、ＧＰＲ４１特異的抗体との特異的結合、ＧＰＲ４１アゴニストまたはインバースアゴニストなどの化合物との特異的結合、インスリン分泌の調節またはイン・ビボでの血糖値の調節であり得る。

セカンドメッセンジャーとは、受容体活性化の結果として生じた細胞内応答を意味するものとする。セカンドメッセンジャーとしては、例えば、イノシトール三リン酸（ＩＰ３）、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）、サイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）、サイクリックＧＭＰ（ｃＧＭＰ）およびＣａ２＋が挙げられる。セカンドメッセンジャー応答は、受容体活性化を調べるために測定できる。さらに、セカンドメッセンジャー応答は、候補化合物、例えば、インバースアゴニスト、部分アゴニスト、アゴニストおよびアンタゴニストを直接同定するために測定できる。

本発明は、血糖安定化化合物を同定する方法であって、ａ）候補化合物をＧＰＲ４１と接触させる工程と、ｂ）ＧＰＲ４１の機能性が調節されるかどうかを調べる工程とを含み、ＧＰＲ４１の機能性の調節が、候補化合物が血糖安定化化合物であることを示す方法に関する。本スクリーニング法を用いて、例えば、ＧＰＲ４１のアゴニスト、インバースアゴニスト、部分アゴニストまたはアンタゴニストであり得る化合物を同定できる。

本明細書において、「ＧＰＲ４１」とは、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは配列番号２に参照されるアミノ酸配列を含むポリペプチドの機能を実質的に保持するこの配列の変異体もしくはオルソログを指す。

ＧＰＲ４１に対する制限された変動または改変を、その機能を破壊せずに行うことができるということは理解される。例えば、ＧＰＲ４１は、その他のＧＰＲ４１ポリペプチド、例えば、ヒトＧＰＲ４１ポリペプチドの哺乳類種オルソログ含むものとする。ヒトＧＰＲ４１の種オルソログの配列はデータベースに存在し、例えば、ＧＰＲ４１のマウスオルソログは、ＧｅｎＢａｎｋにおいて受託番号ＸＭ＿１４５４７０に見い出すことができ、ＧＰＲ４１のラットオルソログはＧｅｎＢａｎｋにおいて受託番号ＸＭ＿３４４８８０に見い出すことができる。さらに、ＧＰＲ４１はＧＰＲ４１の変異体、例えば、対立遺伝子多型、スプライス変異体および保存的アミノ酸置換変異体を含む。例えば、ＧＰＲ４１は、野生型ＧＰＲ４１ポリペプチドの機能、例えば、ＧαｉまたはＧα１２／１３を介してシグナルを送る能力、ＧＰＲ４１特異的抗体と特異的に結合する能力、既知のリガンドまたはアゴニストなどの化合物と特異的に結合する能力、本明細書に開示されるアゴニストもしくはインバースアゴニスト化合物と特異的に結合する能力、またはインスリン分泌もしくは血糖値を調節する能力を実質的に保持する変異体を含む。ＧＰＲ４１変異体は、野生型ＧＰＲ４１と同レベルに機能する必要はなく、野生型ＧＰＲ４１のすべての機能を含む必要はない。

保存的および非保存的アミノ酸変更、ギャップおよびアミノ酸配列への挿入は、入手可能なアルゴリズムおよびＢａｓｉｃＬｏｃａｌＡｌｉｇｎｍｅｎｔＳｅａｒｃｈＴｏｏｌ（「ＢＬＡＳＴ」）などのプログラムを用い、デフォルト値設定を用いて参照配列と比較することができる［例えば、ＫａｒｌｉｎａｎｄＡｌｔｓｃｈｕｌ，ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ（１９９０）８７：２２６４−８；Ａｌｔｓｃｈｕｌら、ＪＭｏＩＢｉｏｌ（１９９０）２１５：４０３−４１０；Ａｌｔｓｃｈｕｌら、ＮａｔｕｒｅＧｅｎｅｔｉｃｓ（１９９３）３：２６６−７２およびＡｌｔｓｃｈｕｌら、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ（１９９７）２５：３３８９−３４０２参照のこと］。

全ポリペプチドの機能を実質的に保持するＧＰＲ４１の断片が定義に含まれるということは理解される。例えば、ＧＰＲ４１のシグナル生成ドメインまたはＧＰＲ４１の化合物結合ドメインを全ポリペプチドの代わりに使用できる。さらに、ＧＰＲ４１は、エピトープタグまたはその他の融合しているポリペプチドなどの異種配列を含んでいてもよい。さらに、ＧＰＲ４１は、標識、例えば、放射標識、蛍光標識または酵素標識を含んでいてもよい。

一実施形態では、本発明の方法を、配列番号２に対して９９％、９８％、９５％、９２％、９０％、８５％、８０％または７５％の配列同一性を含み、ＧＰＲ４２ではないポリペプチドを用いて適用できる。

いくつかの実施形態では、ＧＰＲ４１の前記変異体は、ＧＰＲ４１の非内因性の構成的に活性化された変異体である。一実施形態では、前記ＧＰＲ４１は哺乳類由来である。他の実施形態では、前記ＧＰＲ４１はヒトである。

特定の実施形態では、前記ＧＰＲ４１は組換え型である。特定の実施形態では、前記の接触させる工程は、ＧＰＣＲを発現する宿主細胞と、または宿主細胞の膜と接触させる工程を含み、宿主細胞は受容体をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む。いくつかの実施形態では、前記の接触させる工程はＧＰＣＲの既知アゴニストまたは本明細書に開示されるアゴニストの存在下で実施される。

特定の実施形態では、前記方法は、候補化合物によって引き起こされる受容体の調節を、受容体を受容体の既知モジュレーターと接触させる工程によって引き起こされる受容体の第２の調節と比較する工程をさらに含む。特定の実施形態では、前記既知モジュレーターはアゴニストである。

いくつかの実施形態では、前記調べる工程はセカンドメッセンジャーアッセイを含み、例えば、調べる工程は、前記ＧＰＣＲを含む膜とのＧＴＰγＳ結合の測定によるものである。特定の実施形態では、前記ＧＴＰγＳを［^３５Ｓ］で標識する。特定の実施形態では、前記調べる工程は、サイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）、サイクリックＧＭＰ（ｃＧＭＰ）、イノシトール三リン酸（ＩＰ３）、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）、ＭＡＰキナーゼ活性およびＣａ^２＋からなる群より選択されるセカンドメッセンジャーのレベルの測定によるものである。特定の実施形態では、前記セカンドメッセンジャーはｃＡＭＰである。特定の実施形態では、前記のｃＡＭＰの測定は、全細胞アデニリルシクラーゼアッセイを用いて実施する。特定の実施形態では、前記のｃＡＭＰの測定は、前記ＧＰＣＲを含む膜を用いて実施する。特定の実施形態では、前記調べる工程は細胞内ＩＰ３の測定によるものである。特定の実施形態では、前記調べる工程は、キメラＧタンパク質、例えばＧｑ／Ｇｉキメラの使用をさらに含む。特定の実施形態では、前記セカンドメッセンジャーはＭＡＰキナーゼ活性である。いくつかの実施形態では、前記調べる工程は、ＣＲＥリポーターアッセイによるものである。特定の実施形態では、前記リポーターはルシフェラーゼである。いくつかの実施形態では、前記リポーターはβ−ガラクトシダーゼである。特定の実施形態では、前記調べる工程または前記の比較する工程は細胞内Ｃａ^２＋の測定によるものである。

いくつかの実施形態では、前記調べる工程は、哺乳類から得た脂肪細胞によるグルコース取り込みの測定によるものである。いくつかの実施形態では、前記調べる工程は、哺乳類から得た骨格筋細胞によるグルコース取り込みの測定によるものである。

特定の実施形態では、前記調べる工程は、メラノフォアアッセイの使用によるものである。

いくつかの実施形態では、前記血糖安定化化合物は、以下からなる群より選択される化合物を含む：２−メチル−４−（４−ニトロ−フェニル）−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミド、シクロプロパンカルボン酸４−［１，２，３］チアジアゾール４−イル−フェニルエステル、シクロプロパンカルボン酸；４−フラン−３−イル−２−メチル−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミド、４−フラン−３−イル−２−メチル−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸（２，５−ジクロロ−フェニル）−アミド、４−フラン−２−イル−２−メチル−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミド、４−フラン−３−イル−２−メチル−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸（４−クロロ−フェニル）−アミド、２−メチル−４−（４−メチルスルファニル−フェニル）−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミド、２−メチル−４−（３−ニトロ−フェニル）−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミド、２−メチル−４−［５−（２−ニトロ−４−トリフルオロメチル−フェニル）−フラン−２−イル］−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミド、４−（５−ビフェニル−２−イル−フラン−２−イル）−２−メチル−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミド、２−メチル−４−［５−（２−ニトロ−フェニル）−フラン−２−イル］−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸（２−クロロ−フェニル）−アミド、２−メチル−５−オキソ−４−（４−フェノキシ−フェニル）−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミド、２−メチル−５−オキソ−４−［５−（２−トリフルオロメトキシ−フェニル）−フラン−２−イル］−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミドおよび４−［５−（２，５−ジクロロ−フェニル）−フラン−２−イル］−２−メチル−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミドまたはその製薬上許容される塩。

本発明はまた、インスリン分泌のモジュレーターとして候補化合物を同定する方法であって、ａ）候補化合物をＧＰＲ４１と接触させる工程と、ｂ）ＧＰＲ４１の機能性が調節されるかどうかを調べる工程とを含み、ＧＰＲ４１の機能性の調節が、候補化合物がインスリン分泌のモジュレーターであることを示す方法に関する。例えば、ＧＰＲ４１の機能性を低減させる化合物、例えば、ＧＰＲ４１アンタゴニストまたはインバースアゴニストは、インスリン分泌の増大をもたらし得る。インスリン分泌の増大は、例えば、インスリン抵抗性を有する個体、例えば、糖尿病患者において望まれる場合がある。ＧＰＲ４１の機能性を増大させる化合物、例えば、ＧＰＲ４１アゴニストは、インスリン分泌の減少をもたらし得る。インスリン分泌の減少は、例えば、低血糖症を患う個体において望まれる場合がある。

本発明はまた、血糖濃度のモジュレーターとして候補化合物を同定する方法であって、ａ）候補化合物をＧＰＲ４１と接触させる工程と、ｂ）ＧＰＲ４１の機能性が調節されるかどうかを調べる工程とを含み、ＧＰＲ４１の機能性の調節が、候補化合物が血糖濃度のモジュレーターであることを示す方法に関する。本発明はまた、インスリン分泌のモジュレーターとして候補化合物を同定する方法であって、ａ）候補化合物をＧＰＲ４１と接触させる工程と、ｂ）ＧＰＲ４１の機能性が調節されるかどうかを調べる工程とを含み、ＧＰＲ４１の機能性の調節が、候補化合物がインスリン分泌のモジュレーターであることを示す方法に関する。例えば、ＧＰＲ４１の機能性を低減させる化合物、例えば、ＧＰＲ４１インバースアゴニストまたはアンタゴニストは、インスリン分泌の増大および血糖濃度の低下をもたらし得る。血糖の低下は、例えば、高血糖症を患う個体、例えば、糖尿病患者において望まれるものであり得る。ＧＰＲ４１の機能性を増大させる化合物、例えば、ＧＰＲ４１アゴニストは、インスリン分泌の減少および血糖濃度の上昇をもたらし得る。血糖の上昇は、例えば、低血糖症を患う個体において望まれる場合がある。

特定の実施形態では、前記ＧＰＲ４１は組換え型である。特定の実施形態では、前記接触させる工程は、ＧＰＣＲを発現する宿主細胞と、または宿主細胞の膜と接触させる工程を含み、宿主細胞は受容体をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む。いくつかの実施形態では、前記の接触させる工程はＧＰＣＲのアゴニストの存在下で実施される。

本発明の方法では、対照反応は、反応の特異性を示すよう実施できる。例えば、ＧＰＲ４１でトランスフェクトした細胞に対して偽トランスフェクト細胞を比較して、ＧＰＲ４１受容体との応答の特異性を示すことができる。

本発明の方法において、特定の実施形態では、前記候補化合物は、抗体またはその抗原結合性誘導体ではない。特定の実施形態では、前記の候補化合物はペプチドではない。特定の実施形態では、前記の候補化合物はポリペプチドではない。

上記のように、受容体の機能性とは、それだけには限らないが、例えば、遺伝子転写を調節し、イオンの流入または流出を調節し、触媒反応を達成し、かつ／またはＧタンパク質を介して活性を調節して、細胞において刺激を受け取り、作用を和らげる受容体の正常な働きを指す。ＧＰＲ４１の機能性とは、例えば、ＧｉもしくはＧ１２／１３などのＧタンパク質との結合、ｃＡＭＰもしくはＩＰ３などのセカンドメッセンジャーによるシグナル伝達（キメラＧタンパク質を用いる場合）、ＧＰＲ４１特異的抗体との特異的結合、ＧＰＲ４１アゴニストまたはインバースアゴニストなどの化合物との特異的結合、インスリン分泌の調節またはイン・ビボでの血糖値の調節であり得る。

本発明の方法では、調べる工程はセカンドメッセンジャーアッセイを含み得る。細胞内シグナルの開始は、例えば、サイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）、サイクリックＧＭＰ（ｃＧＭＰ）、イノシトール三リン酸（ＩＰ３）、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）、ＭＡＰキナーゼまたはカルシウムなどのセカンドメッセンジャーのレベルの測定によって調べることができる。これらのセカンドメッセンジャーを測定するためのいくつかのアッセイ、例えば、ｃＡＭＰアッセイ、ＩＰ３アッセイ、ＦＬＩＰＲアッセイ、メラノフォアアッセイまたはＣＲＥリポーターアッセイが当技術分野では周知である。さらに、セカンドメッセンジャーアッセイの例は本明細書において実施例１２〜１７に開示されている。特定の実施形態では、前記セカンドメッセンジャーはｃＡＭＰである。その他の実施形態では、前記セカンドメッセンジャーはＩＰ３である。さらなる実施形態では、前記セカンドメッセンジャーはカルシウムである。

一実施形態では、前記の測定する工程は、ＧＴＰγＳの、前記ＧＰＣＲを含む膜との結合の測定によるものである。このようなアッセイは当技術分野では周知であり、本明細書において実施例１２および１４に例示される。特定の実施形態では、前記ＧＴＰγＳを［^３５Ｓ］で標識する。

本発明はまた、ａ）候補化合物をＧＰＲ４１と接触させる工程と、ｂ）ＧＰＲ４１の機能性が調節されるかどうかを調べる工程とを含み、ＧＰＲ４１の機能性の調節が、候補化合物が血糖安定化化合物であることを示す方法によって同定可能な血糖安定化化合物に関する。

例えば、本発明は、ａ）候補化合物をＧＰＲ４１と接触させる工程と、ｂ）ＧＰＲ４１の機能性が調節されるかどうかを調べる工程とを含み、ＧＰＲ４１の機能性の調節が、候補化合物が血糖安定化化合物であることを示す方法によって同定される血糖安定化化合物を提供する。

一実施形態では、前記血糖安定化化合物はＧＰＲ４１アゴニストである。例えば、前記血糖安定化化合物は以下からなる群より選択される化合物を含む：２−メチル−４−（４−ニトロ−フェニル）−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミド、シクロプロパンカルボン酸４−［１，２，３］チアジアゾール−４−イル−フェニルエステル、シクロプロパンカルボン酸；４−フラン−３−イル−２−メチル−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミド、４−フラン−３−イル−２−メチル−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸（２，５−ジクロロ−フェニル）−アミド、４−フラン−２−イル−２−メチル−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミド、４−フラン−３−イル−２−メチル−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸（４−クロロ−フェニル）−アミド、２−メチル−４−（４−メチルスルファニル−フェニル）−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミドおよび２−メチル−４−（３−ニトロ−フェニル）−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミドまたはその製薬上許容される塩。

いくつかの実施形態では、前記血糖安定化化合物はＧＰＲ４１アゴニストである。いくつかの実施形態では、前記血糖安定化化合物は、ＥＣ５０が１０μＭ未満、１μＭ未満、１００ｎＭ未満または１０ｎＭ未満であるＧＰＲ４１アゴニストである。いくつかの実施形態では、前記血糖安定化化合物は、ＥＣ５０が１ｎＭから１０μＭの間から選択される値であるアゴニストである。いくつかの実施形態では、前記血糖安定化化合物は、ＥＣ５０が１ｎＭから１μＭの間から選択される値であるアゴニストである。いくつかの実施形態では、前記血糖安定化化合物は、ＥＣ５０が１ｎＭから１００ｎＭの間から選択される値であるアゴニストである。いくつかの実施形態では、前記血糖安定化化合物は、ＥＣ５０が１ｎＭから１０ｎＭの間から選択される値であるアゴニストである。

特定の実施形態では、前記ＥＣ５０を、以下からなる群より選択されるアッセイを用いて調べる：組換えＧＰＲ４１ポリペプチドを発現するトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞を用いて実施されるＩＰ３アッセイ、および組換えＧＰＲ４１ポリペプチドを発現するトランスフェクトされたメラノフォアを用いて実施されるメラノフォアアッセイ。いくつかの実施形態では、前記血糖安定化化合物は、前記アッセイにおいてＥＣ５０が１０μＭ未満、１μＭ未満、１００ｎＭ未満または１０ｎＭ未満であるアゴニストである。いくつかの実施形態では、前記血糖安定化化合物は、前記アッセイにおいてＥＣ５０が１０μＭ未満、９μＭ未満、８μＭ未満、７μＭ未満、６μＭ未満、５μＭ未満、４μＭ未満、３μＭ未満、２μＭ未満、１μＭ未満、９００ｎＭ未満、８００ｎＭ未満、７００ｎＭ未満、６００ｎＭ未満、５００ｎＭ未満、４００ｎＭ未満、３００ｎＭ未満、２００ｎＭ未満、１００ｎＭ未満、９０ｎＭ未満、８０ｎＭ未満、７０ｎＭ未満、６０ｎＭ未満、５０ｎＭ未満、４０ｎＭ未満、３０ｎＭ未満、２０ｎＭ未満、１０ｎＭ未満であるアゴニストである。いくつかの実施形態では、前記血糖安定化化合物は、前記アッセイにおけるＥＣ５０が１ｎＭ〜１０μＭの間から選択される値であるアゴニストである。いくつかの実施形態では、前記血糖安定化化合物は、前記アッセイにおけるＥＣ５０が１ｎＭ〜１μＭの間から選択される値であるアゴニストである。いくつかの実施形態では、前記血糖安定化化合物は、前記アッセイにおけるＥＣ５０が１ｎＭ〜１００ｎＭの間から選択される値であるアゴニストである。いくつかの実施形態では、前記血糖安定化化合物は、前記アッセイにおけるＥＣ５０が１ｎＭ〜１０ｎＭの間から選択される値であるアゴニストである。いくつかの実施形態では、前記血糖安定化化合物はＧＰＣＲに対して選択的である。

いくつかの実施形態では、前記血糖安定化化合物はＧＰＲ４１インバースアゴニストまたはアンタゴニストである。例えば、前記血糖化合物は以下からなる群より選択される化合物を含み得る：２−メチル−４−［５−（２−ニトロ−４−トリフルオロメチル−フェニル）−フラン−２−イル］−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミド、４−（５−ビフェニル−２−イル−フラン−２−イル）−２−メチル−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミド、２−メチル−４−［５−（２−ニトロ−フェニル）−フラン−２−イル］−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸（２−クロロ−フェニル）−アミド、２−メチル−５−オキソ−４−（４−フェノキシ−フェニル）−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミド、２−メチル−５−オキソ−４−［５−（２−トリフルオロメトキシ−フェニル）−フラン−２−イル］−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミドおよび４−［５−（２，５−ジクロロ−フェニル）−フラン−２−イル］−２−メチル−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミドまたはその製薬上許容される塩。

いくつかの実施形態では、前記血糖安定化化合物は、ＩＣ５０が１０μＭ未満、１μＭ未満、１００ｎＭ未満または１０ｎＭ未満であるＧＰＲ４１インバースアゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態では、前記血糖安定化化合物は、ＩＣ５０が１ｎＭ〜１０μＭの間から選択される値であるインバースアゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態では、前記血糖安定化化合物は、ＩＣ５０が１ｎＭ〜１μＭの間から選択される値であるインバースアゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態では、前記血糖安定化化合物は、ＩＣ５０が１ｎＭ〜１００ｎＭの間から選択される値であるインバースアゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態では、前記血糖安定化化合物は、ＩＣ５０が１ｎＭ〜１０ｎＭの間から選択される値であるインバースアゴニストまたはアンタゴニストである。

特定の実施形態では、前記ＩＣ５０を、以下からなる群より選択されるアッセイを用いて調べる：組換えＧＰＲ４１ポリペプチドを発現するトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞を用いて実施されるＩＰ３アッセイ、および組換えＧＰＲ４１ポリペプチドを発現するトランスフェクトされたメラノフォアを用いて実施されるメラノフォアアッセイ。いくつかの実施形態では、前記血糖安定化化合物は、前記アッセイにおいてＩＣ５０が１０μＭ未満、１μＭ未満、１００ｎＭ未満または１０ｎＭ未満であるインバースアゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態では、前記血糖安定化化合物は、前記アッセイにおいてＩＣ５０が１０μＭ未満、９μＭ未満、８μＭ未満、７μＭ未満、６μＭ未満、５μＭ未満、４μＭ未満、３μＭ未満、２μＭ未満、１μＭ未満、９００ｎＭ未満、８００ｎＭ未満、７００ｎＭ未満、６００ｎＭ未満、５００ｎＭ未満、４００ｎＭ未満、３００ｎＭ未満、２００ｎＭ未満、１００ｎＭ未満、９０ｎＭ未満、８０ｎＭ未満、７０ｎＭ未満、６０ｎＭ未満、５０ｎＭ未満、４０ｎＭ未満、３０ｎＭ未満、２０ｎＭ未満、１０ｎＭ未満であるインバースアゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態では、前記血糖安定化化合物は、前記アッセイにおけるＩＣ５０が１ｎＭ〜１０μＭの間から選択される値であるインバースアゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態では、前記血糖安定化化合物は、ＩＣ５０が１ｎＭ〜１μＭの間から選択される値であるインバースアゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態では、前記血糖安定化化合物は、ＩＣ５０が１ｎＭ〜１００ｎＭの間から選択される値であるインバースアゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態では、前記血糖安定化化合物は、ＩＣ５０が１ｎＭ〜１０ｎＭの間から選択される値であるインバースアゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態では、前記血糖安定化化合物はＧＰＣＲに選択的である。

いくつかの実施形態では、前記血糖安定化化合物は経口投与可能である。いくつかの実施形態では、前記経口バイオアベイラビリティは、腹膜内投与と比較して、少なくとも１％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％または少なくとも４５％である。いくつかの実施形態では、前記経口バイオアベイラビリティは、腹膜内投与と比較して、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％または少なくとも４５％である。いくつかの実施形態では、前記経口投与可能な血糖安定化化合物はさらに、血液脳関門を越えることができる。

さらに、本発明は、血糖安定化化合物を同定する工程と、次いで、前記化合物を担体と混合する工程とを含む組成物の調製方法であって、前記化合物がａ）候補化合物をＧＰＲ４１と接触させる工程と、ｂ）ＧＰＲ４１の機能性が調節されるかどうかを調べる工程とからなり、ＧＰＲ４１の機能性の調節が、候補化合物が血糖安定化化合物であることを示す方法によって同定可能な方法に関する。例えば、本発明は、血糖安定化化合物を同定する工程と、次いで、前記化合物を担体と混合する工程とを含む組成物の調製方法であって、前記化合物がａ）候補化合物をＧＰＲ４１と接触させる工程と、ｂ）ＧＰＲ４１の機能性が調節されるかどうかを調べる工程とからなり、ＧＰＲ４１の機能性の調節が、候補化合物が血糖安定化化合物であることを示す方法によって同定される方法を提供する。さらに、本発明は、血糖安定化化合物を同定する工程と、次いで、前記化合物を担体と混合する工程とを含む組成物の調製方法であって、前記化合物が以下からなる群より選択される化合物を含む方法を提供する：２−メチル−４−（４−ニトロ−フェニル）−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミド、シクロプロパンカルボン酸４−［１，２，３］チアジアゾール−４−イル−フェニルエステル、シクロプロパンカルボン酸；４−フラン−３−イル−２−メチル−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミド、４−フラン−３−イル−２−メチル−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸（２，５−ジクロロ−フェニル）−アミド、４−フラン−２−イル−２−メチル−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミド、４−フラン−３−イル−２−メチル−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸（４−クロロ−フェニル）−アミド、２−メチル−４−（４−メチルスルファニル−フェニル）−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミドおよび２−メチル−４−（３−ニトロ−フェニル）−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミドまたはその製薬上許容される塩。

本発明はまた、ａ）候補化合物をＧＰＲ４１と接触させる工程と、ｂ）ＧＰＲ４１の機能性が調節されるかどうかを調べる工程とからなり、ＧＰＲ４１の機能性の調節が、候補化合物が血糖安定化化合物であることを示す方法によって同定される血糖安定化化合物を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなる薬剤組成物を提供する。

本発明のいくつかの実施形態は、本明細書に開示される化合物実施形態のいずれかによる少なくとも１種の化合物と、製薬上許容される担体とを混合する工程を含む薬剤組成物を製造する方法を含む。

化合物は、当業者に周知の技術を用いて、薬剤組成物に製剤できる。当業者には、本明細書に記載されるものの外の適した製薬上許容される担体が利用可能である。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，１６^ｔｈＥｄｉｔｉｏｎ，１９８０，ＭａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏ．，（Ｏｓｌｏら、ｅｄｓ．）参照のこと。

本明細書に開示される化合物または本発明の方法によって同定される化合物は、代替使用では原料のままの化学物質または純粋な化学物質として投与できることもあり得るが、予防または治療において使用するためには、化合物または有効成分が、製薬上許容される担体をさらに含む薬剤製剤または薬剤組成物として存在することが有用であり得る。

したがって、本発明は、本明細書に開示される化合物、または本発明の方法によって同定される化合物、またはその製薬上許容される塩もしくは誘導体を、１種以上のその製薬上許容される担体および／または予防成分と一緒に含む薬剤製剤をさらに提供する。担体（類）は、製剤のその他の成分と適合している、およびその受容者にとって過度に有害でないという意味で「許容される」。

薬剤製剤は、経口、直腸、鼻腔、局所（口内および舌下を含む）、膣または非経口（筋肉内、皮下および静脈内を含む）投与に適したもの、または吸入もしくは吹送による投与に適した形のものを含む。

したがって、本発明の化合物は、従来のアジュバント、担体または希釈剤とともに、薬剤製剤およびその単位投与の形にすることができ、そのような形では、錠剤もしくは充填カプセル剤などの固体、または溶液、懸濁液、エマルション、エリキシル、ゲルなどの液体またはそれらが充填されたカプセルとして、すべて経口使用用に、直腸投与用の坐剤の形で、または非経口（皮下を含む）使用のための滅菌注射用溶液の形で使用できる。このような薬剤組成物およびその単位投与形は、さらなる活性化合物または有効成分とともに、またはそれらを伴わずに、従来の成分を従来の割合で含み得る。このような単位投与形は、用いられる意図される一日投与量範囲に相応の、いずれかの適した有効量の有効成分を含み得る。

経口投与用には、薬剤組成物は、例えば、錠剤、カプセル剤、懸濁液または液体の形であり得る。薬剤組成物は、特定量の有効成分を含む投与量単位の形に製造できる。このような投与量単位の例として、従来の添加物、例えば、ラクトース、マンニトール、コーンスターチまたはジャガイモデンプンを含み、結合剤、例えば、結晶性セルロース、セルロース誘導体、アラビアガム、コーンスターチまたはゼラチンを含み、崩壊剤、例えば、コーンスターチ、ジャガイモデンプンまたはカルボキシメチルセルロースナトリウムを含み、滑沢剤、例えば、タルクまたはステアリン酸マグネシウムを含む、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤または懸濁液がある。有効成分はまた、組成物として注射によって投与でき、例えば、生理食塩水、デキストロースまたは水を適した製薬上許容される担体として使用できる。

本発明は、ヒト宿主においてＧＰＲ４１受容体を選択的に活性化する方法であって、このような治療を必要とするヒト宿主においてＧＰＲ４１遺伝子産物を選択的に活性化する化合物を投与する工程を含む方法に関する。例えば、化合物はＧＰＲ４１アゴニスト、例えば、２−メチル−４−（４−ニトロ−フェニル）−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミド、シクロプロパンカルボン酸４−［１，２，３］チアジアゾール−４−イル−フェニルエステル、シクロプロパンカルボン酸；４−フラン−３−イル−２−メチル−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミド、４−フラン−３−イル−２−メチル−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸（２，５−ジクロロ−フェニル）−アミド、４−フラン−２−イル−２−メチル−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミド、４−フラン−３−イル−２−メチル−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸（４−クロロ−フェニル）−アミド、２−メチル−４−（４−メチルスルファニル−フェニル）−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミドおよび２−メチル−４−（３−ニトロ−フェニル）−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミドまたはその製薬上許容される塩であり得る。

本発明は、ヒト宿主においてＧＰＲ４１受容体を選択的に阻害する方法であって、このような治療を必要とするヒト宿主においてＧＰＲ４１遺伝子産物を選択的に阻害する化合物を投与する工程を含む方法に関する。例えば、化合物はＧＰＲ４１インバースアゴニスト、例えば、２−メチル−４−［５−（２−ニトロ−４−トリフルオロメチル−フェニル）−フラン−２−イル］−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミド、４−（５−ビフェニル−２−イル−フラン−２−イル）−２−メチル−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミド、２−メチル−４−［５−（２−ニトロ−フェニル）−フラン−２−イル］−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸（２−クロロ−フェニル）−アミド、２−メチル−５−オキソ−４−（４−フェノキシ−フェニル）−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミド、２−メチル−５−オキソ−４−［５−（２−トリフルオロメトキシ−フェニル）−フラン−２−イル］−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミドおよび４−［５−（２，５−ジクロロ−フェニル）−フラン−２−イル］−２−メチル−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミドまたはその製薬上許容される塩であり得る。

本発明は、インスリン関連障害を治療または予防することを必要とする個体において、インスリン関連障害を治療または予防する方法であって、前記個体に、ａ）候補化合物をＧＰＲ４１と接触させる工程と、ｂ）ＧＰＲ４１の機能性が調節されるかどうかを調べる工程とからなり、ＧＰＲ４１の機能性の調節が、候補化合物が血糖安定化化合物であることを示す方法によって同定される化合物の有効量を投与する工程を含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、前記インスリン関連障害は、低血糖症、インスリン分泌性もしくはインスリン依存性腫瘍、加齢、インスリン抵抗性、耐糖能障害または糖尿病である。いくつかの実施形態では、前記インスリン関連障害は、血糖濃度の上昇と関連している症状、例えば、アテローム性動脈硬化症、心疾患、卒中、高血圧症、肥満症、シンドロームＸまたは末梢血管疾患を含む。いくつかの実施形態では、前記インスリン関連障害はＩＩ型糖尿病である。一実施形態では、投与される化合物はＧＰＲ４１アゴニストを含む。一実施形態では、投与される化合物はＧＰＲ４１インバースアゴニストまたはアンタゴニストを含む。

一実施形態では、本方法は、前記個体に、糖尿病、血液脂質障害または肥満症の治療に用いられる薬剤の有効量を、ａ）候補化合物をＧＰＲ４１と接触させる工程と、ｂ）ＧＰＲ４１の機能性が調節されるかどうかを調べる工程とからなり、ＧＰＲ４１の機能性の調節が、候補化合物が血糖安定化化合物であることを示す方法によって同定される血糖安定化化合物を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなる薬剤組成物の有効量と組み合わせて投与する工程をさらに含む。例えば、一実施形態では、本方法は、前記個体に、糖尿病、血液脂質障害または肥満症の治療に用いられる薬剤の有効量を、ＧＰＲ４１インバースアゴニストを含む薬剤組成物の有効量と組み合わせて投与する工程をさらに含む。一実施形態では、個体は哺乳類であり、他の実施形態では、個体はヒトである。

本明細書において、障害に関連して、用語「治療」とは、個々の障害と関連している１種以上の症状の重篤度の低減を意味する。したがって、障害を治療することは、一障害と関連しているすべての症状の重篤度の低減を必ずしも意味するのではなく、一障害と関連している１種以上の症状の重篤度の完全な低減を必ずしも意味しない。同様に、用語「予防」とは、個々の障害と関連している１種以上の症状の出現または発生の予防を意味するものであって、一障害の完全な予防を必ずしも意味しない。本発明の方法を用いて、例えば、低血糖症または糖尿病をはじめとするインスリン関連障害を治療できる。

本明細書に開示される化合物または本発明の方法によって同定される化合物を用いる場合、用量は、広い制限内で変化し得、常として、また、医師には公知であるように、各個々の場合において個体の状態に合わせられる。例えば、治療される病気の性質および重篤度によって、患者の状態によって、使用される化合物によって、または急性もしくは慢性の病状が治療されるのか、または予防が実施されるのかによって、あるいは本明細書に開示される化合物または本発明の方法によって同定される化合物に加えて、さらなる活性化合物が投与されるかによって変わる。本発明の代表的な用量として、約０．０１ｍｇ〜約１０００ｍｇ、約０．０１〜約７５０ｍｇ、約０．０１〜約５００ｍｇ、０．０１〜約２５０ｍｇ、０．０１ｍｇ〜約２００ｍｇ、約０．０１ｍｇ〜１５０ｍｇ、約０．０１ｍｇ〜約１００ｍｇおよび約０．０１ｍｇ〜約７５ｍｇが挙げられる。特に、比較的多量が必要であると考えられる場合には、１日の間に複数回の用量、例えば、２、３または４用量を投与してもよい。適切な場合、個々の挙動に応じて、患者の医師または介護者からの必要に応じて、一日用量から上方または下方に逸脱することが必要である場合もある。

治療に用いるのに必要な、有効成分またはその活性な塩もしくは誘導体の量は、選択される個々の塩によってだけでなく、投与経路、治療される状態の性質ならびに患者の年齢および状態によっても変わり、最終的には、担当する医師または臨床医の判断となる。一般に、当業者ならば、モデル系、通常、動物モデルにおいて得られたイン・ビボデータを、別のもの、例えば、ヒトに当てはめる方法は理解している。通常、動物モデルとしては、それだけには限らないが、下記、実施例１９に記載される齧歯類糖尿病モデルが挙げられる（その他の動物モデルは、ＲｅｅｄａｎｄＳｃｒｉｂｎｅｒｉｎＤｉａｂｅｔｅｓ，ＯｂｅｓｉｔｙａｎｄＭｅｔａｂｏｌｉｓｍ，１：７５−８６（１９９９）によって報告されている）。いくつかの状況では、これらの外挿は、単に、別のもの、例えば、哺乳類、例えば、ヒトと比較した、動物モデルの体重に基づくものであり得るが、これらの外挿は単純に体重に基づくものではなく、種々の因子を取り入れることが多い。代表的な因子として、患者の種類、年齢、体重、性別、食事および病状、疾患の重篤度、投与経路、薬理学的に考慮すべき事柄、例えば、用いられる個々の化合物の活性、有効性、薬物動態および毒性プロフィール、薬物送達システムが用いられるかどうか、急性もしくは慢性の病状が治療されるのか、または予防が実施されるのかどうか、あるいは本明細書に開示される化合物または本発明の方法によって同定される化合物に加えて、および複合薬の一部として、さらなる活性化合物が投与されるかどうかが挙げられる。本発明の化合物および／または組成物を用いて病状を治療するための投与計画は、上に挙げたような種々の因子にしたがって選択される。したがって、用いられる実際の投与計画は、大幅に変わり得、したがって、好ましい投与計画から逸脱し得、当業者には認識されるであろうが、これらの通常の範囲の外側の投与量および投与計画を試験することができ、適切な場合には、本発明の方法において使用できる。

所望の用量は単回用量で、または適当な間隔で投与される分割用量として、例えば、１日あたり２、３または４回以上の分割用量として提示されることが好都合であり得る。この分割用量自体を、例えば、何回かの、不連続な、大まかに間隔をあけた投与にさらに分割することができる。１日用量は、特に、適当と思われる比較的多量を投与する場合には、数回、例えば、２、３または４部分の投与に分割できる。適切な場合、個体の挙動に応じて、示される１日用量から上方または下方に逸脱することが必要であり得る。

本明細書に開示される化合物または本発明の方法によって同定される化合物は、多種多様な経口および非経口投与形で投与できる。当業者には明らかであろうが、以下の投与形は、有効成分として、本明細書に開示される化合物もしくは本発明の方法によって同定される化合物または本明細書に開示される化合物もしくは本発明の方法によって同定される化合物の製薬上許容される塩のいずれかを含み得る。

本明細書に開示される化合物または本発明の方法によって同定される化合物から薬剤組成物を調製するには、適した製薬上許容される担体の選択は、固体、液体またはそれらの混合物であり得る。固体形製剤としては、散剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、カシェ剤、坐剤および分散性顆粒剤が挙げられる。固体担体は、希釈剤、矯味剤、可溶化剤、滑沢剤、懸濁剤、結合剤、保存料、錠剤崩壊剤またはカプセル化剤として作用し得る１種以上の物質であり得る。

散剤では、担体は、微粉化された有効成分との混合物中にある微粉化固体である。錠剤では、有効成分を、必要な結合能を有する担体と適した割合で混合し、所望の形および大きさに打錠する。

散剤および錠剤は、さまざまなパーセンテージの量の活性化合物を含み得る。散剤または錠剤中の代表的な量は、０．５〜約９０パーセントの活性化合物を含み得るが、技術者ならば、この範囲の外側の量が必要である場合も認識している。散剤および錠剤に適した担体としては、炭酸マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、糖、ラクトース、ペクチン、デキストリン、デンプン、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、低融点ワックス、ココアバターなどがある。用語「調製」とは、活性化合物を、担体としてのカプセル化物質とともに製剤し、有効成分が、担体とともに、または担体を伴わずに担体によって囲まれており、したがって、それと関連しているカプセルを提供することを含むものとする。同様に、カシェ剤およびトローチ剤も含まれる。錠剤、散剤、カプセル剤、丸剤、カシェ剤およびトローチ剤は、経口投与に適した固体形として使用できる。

坐剤を調製するには、低融点ワックス、例えば、脂肪酸グリセリドまたはココアバターの混合物をまず融解させ、撹拌によってのように、その中に有効成分を均一に分散させる。次いで、融解された均一な混合物を、好都合な大きさの型に注ぎ入れ、放冷し、それによって固化させる。

膣投与に適した製剤は、有効成分に加え、当技術分野で適当であると知られているような担体を含む、ペッサリー、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、発泡物質またはスプレーとして提供できる。

液体形製剤としては、溶液、懸濁液およびエマルション、例えば、水または水−プロピレングリコール溶液が挙げられる。例えば、非経口用注射液体製剤は、ポリエチレングリコール水溶液中の溶液として製剤できる。注射用製剤、例えば、滅菌注射用水性または油性懸濁液は、適した分散剤または湿潤剤および懸濁剤を用い、公知の技術にしたがって製剤できる。滅菌注射用製剤はまた、例えば、１，３−ブタンジオール中の溶液のような、非毒性の非経口的に許容される希釈液または溶媒中の滅菌注射用溶液または懸濁液であり得る。使用できる許容されるビヒクルおよび溶媒の中には、水、リンガー溶液および等張塩化ナトリウム溶液がある。さらに、滅菌硬化油を溶媒または懸濁媒体として用いることも好都合である。この目的には、合成モノグリセリドまたはジグリセリドをはじめ、いずれの無刺激性の硬化油も使用できる。さらに、オレイン酸などの脂肪酸も、注射物質の調製に用途を見い出す。

したがって、本発明の化合物は、非経口投与用（例えば、注射、例えば、ボーラス注射または連続注入による）に製剤でき、アンプル、プレフィルドシリンジ、小容量点滴液に入れた単位投与形で、または保存料を添加した複数回用量容器に入れて提供できる。薬剤組成物は、油性または水性ビヒクル中の懸濁液、溶液またはエマルションのような形をとることができ、また、懸濁剤、安定剤および／または分散剤などの処方用薬剤を含み得る。あるいは、有効成分は、使用前に、適したビヒクル、例えば、滅菌した、発熱物質を含まない水で構成するための、滅菌固体の無菌単離によってか、溶液からの凍結乾燥によって得られる散剤の形であり得る。

経口使用に適した水溶液は、有効成分を水に溶解することと、要望どおりに、適した着色剤、矯味剤、安定化剤および増粘剤を添加することとによって調製できる。

経口使用に適した水性懸濁液は、微粉化された有効成分を、粘稠性物質、例えば、天然または合成ゴム、樹脂、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムまたはその他の周知の懸濁剤とともに水に分散させることによって製造できる。

また、使用の直前に、経口投与用液体形製剤に変換されるものである固体形製剤も含まれる。このような液体形としては、溶液、懸濁液およびエマルションが挙げられる。これらの製剤は、有効成分に加え、着色剤、矯味剤、安定化剤、バッファー、人工および天然甘味料、分散剤、増粘剤、可溶化剤などを含み得る。

表皮への局所投与には、本発明の化合物は、軟膏、クリームもしくはローションとして、または経皮パッチとして製剤できる。

軟膏およびクリームは、例えば、適した増粘剤および／またはゲル化剤を添加した水性または油性基剤を用いて製剤できる。ローションは、水性または油性基剤を用いて製剤でき、一般に、１種以上の乳化剤、安定化剤、分散剤、懸濁剤、増粘剤または着色剤を含む。

口中における局所投与に適した製剤としては、矯味付けした基剤、通常、スクロースおよびアラビアガムまたはトラガカント中の有効成分を含むトローチ剤（ｌｏｚｅｎｇｅ）；不活性の基剤、例えば、ゼラチンおよびグリセリンまたはスクロースおよびアラビアガム中の有効成分を含むトローチ剤（ｐａｓｔｉｌｌｅ）；および適した液体担体中の有効成分を含むマウスウォッシュが挙げられる。

鼻腔には、従来の手段によって、例えば、点滴器、ピペットまたはスプレーを用いて、溶液または懸濁液を直接適用する。製剤は単回または複数回用量形で提供できる。点滴器またはピペットの後者の場合には、これは適当な、所定の容量の溶液または懸濁液を患者が投与することによって達成できる。スプレーの場合には、これは、例えば、定量噴霧スプレーポンプによって達成できる。

また、気道への投与は、有効成分が適した高圧ガスを含む加圧型パック中に提供されるエアゾール製剤によって達成できる。本明細書に開示される化合物または本発明の方法によって同定される化合物またはそれらを含む薬剤組成物を、エアゾールとして、例えば、鼻エアゾールとしてまたは吸入によって投与する場合には、これは、例えば、スプレー、噴霧器、ポンプ噴霧器、吸入装置、定量吸入器または乾燥粉末吸入器を用いて実施できる。本明細書に開示される化合物または本発明の方法によって同定される化合物をエアゾールとして投与するための製剤形は、当業者に周知のプロセスによって調製できる。これらの調製には、例えば、通常の添加物、例えば、ベンジルアルコールまたはその他の適した保存料、バイオアベイラビリティを高めるための吸収促進剤、可溶化剤、分散剤その他、ならびに、適切な場合には、通常の高圧ガス（例えば、二酸化炭素、ＣＦＣ類、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタンまたはジクロロテトラフルオロエタンなどが挙げられる）を用い、水、水／アルコール混合物または適した生理食塩水溶液中の、本明細書に開示される化合物または本発明の方法によって同定される化合物の溶液または分散物を使用できる。エアゾールはレシチンなどの界面活性剤を含むことが好都合であり得る。薬物の用量は、定量バルブを提供することによって制限できる。

経鼻製剤を含む、気道への投与を対象とする製剤では、一般に、化合物は、例えば、１０ミクロン以下というオーダーの小さな粒径を有する。このような粒径は、当技術分野で公知の手段によって、例えば、微粒子化によって得ることができる。必要な場合には、有効成分の持続放出を与えるよう適応させた製剤を使用できる。

あるいは、有効成分は、乾燥粉末、例えば、適した粉末基剤、例えば、ラクトース、デンプン、ヒドロキシプロピルメチルセルロースなどのデンプン誘導体およびポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）中の化合物の粉末混合物の形で提供できる。粉末担体が鼻腔においてゲルを形成することが好都合である。粉末組成物は単位用量形で、例えば、ゼラチンの、例えば、カプセルまたはカートリッジ、または吸入器によって散剤を投与できるブリスターパックで提供できる。

薬剤製剤は単位投与形であり得る。このような形では、製剤は適当な量の有効成分を含む単位用量に分割できる。単位投与形は、パッケージが個別の量の製剤を含むパッケージングされた製剤、例えば、バイアルまたはアンプル中のパッケージングされた錠剤、カプセル剤および散剤であってもよい。また、単位投与形はカプセル剤、錠剤、カシェ剤またはトローチ剤自体であってもよく、またはパッケージングされた形のこれらのうちのいずれかの適当な数であってもよい。

経口投与用の錠剤またはカプセル剤および静脈内投与用の液体は、特に有用な組成物である。

インスリン関連障害としては、例えば、低血糖症、インスリン分泌性もしくはインスリン依存性腫瘍、加齢、インスリン抵抗性、耐糖能障害または糖尿病が挙げられる。

低血糖症は、異常に低い血糖として定義される。低血糖症は、例えば、過剰なインスリンまたは乏しい食事に起因し得る。例えば、低血糖症は、糖尿病を患う人が多すぎるインスリンを注射した場合、少なすぎる食事をとった場合に、または追加の食品をとらずに運動した場合に生じ得る。低血糖症の症状としては、例えば、神経過敏または脱力感、頭痛、かすみ目、空腹感および過剰な発汗が挙げられる。

インスリン分泌性腫瘍としては、例えば、インスリノーマが挙げられる。インスリノーマは、ランゲルハンス島と呼ばれる、膵臓の領域にあるβ細胞の腫瘍である。通常、癌性ではないが、このような腫瘍は、身体に過剰のインスリンを製造させ、低すぎる血糖値を導き得る。インスリン分泌性腫瘍の他に、インスリンを分泌しないいくつかの腫瘍が、インスリンを増殖因子として使用する場合もある。インスリンが、腫瘍によって使用される唯一の増殖因子であろうがなかろうが、身体におけるインスリン量の低下によって腫瘍の増殖を低減できる。

加齢は、年齢を重ねるにつれ生物に生じる生理学的プロセスである。カロリー制限はインスリン分泌をダウンレギュレートするが、これらの作用が、長生きに対するカロリー制限の好ましい影響の重要なメディエーターであると思う理由がある。したがって、インスリンをダウンレギュレートする戦略は、加齢のプロセスを遅らせ、長生きを延長させるのに有用であり得る。

糖尿病ならびにインスリン抵抗性および耐糖能障害などの関連症状は、本明細書において上で記載されている。

さらに、インスリン抵抗性は、多嚢胞性卵巣症候群（ＰＣＯＳ）の共通の特徴であり、ロシグリタゾンおよびメトホルミンなどの薬物がＰＣＯＳの治療に用いられている（ＳｅｐｉｌｉａｎａｎｄＮａｇａｍａｎｉＪ．Ｃｌｉｎ．ＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌＭｅｔａｂ．Ｏｃｔ．１４，２００３；Ｂａｉｌｌａｒｇｅｏｎら、Ｆｅｒｔｉｌ．Ｓｔｅｒｉｌ．８２：８９３−９０２（２００４））。ＰＣＯＳは、例えば、左右対称に肥大した卵巣、無月経および不妊症を特徴とする。常染色体優性条件として遺伝される。この疾患のその他の症状としては、例えば、多毛および肥満が挙げられる。ホルモン的には、ＰＣＯＳは、黄体形成ホルモン、インスリンおよびアンドロゲンの分泌の増大を特徴とする。

本発明の化合物の他の適応症は、例えば、ＨＩＶ感染に対する抗レトロウイルス療法によって引き起こされるような脂肪異栄養症の治療である。高活性抗レトロウイルス療法（ＨＡＡＲＴ）として知られる長期のＡＩＤＳ療法を受けている患者の中には、脂肪異栄養症と呼ばれる症候群を次第に発症する人もいる。症状としては、インスリン感受性、顔面、腕および脚から腹部および背中上部への脂肪の再分布、およびコレステロール変化が挙げられる。ＨＡＡＲＴを受けている人のうち約１４パーセントが、２型糖尿病を最終的に発症する。薬物ロシグリタゾンが、３ヶ月間の治療を受けたＨＩＶ陽性患者においてインスリン感受性を改善することが分かっている。患者は、インスリン感受性を測定する標準試験で約２０パーセント改善され、またその全身脂肪、特に、その顔面、腕および脚の脂肪量が増加し、２４パーセント増加した。比較して、プラセボを摂取している患者は、顔面、腕および脚の脂肪が２パーセント減少した。

いくつかの実施形態では、前記インスリン関連障害は、血糖濃度の上昇と関連している症状、例えば、アテローム性動脈硬化症、心疾患、卒中、高血圧症、肥満症、シンドロームＸまたは末梢血管疾患を含む。

アテローム性動脈硬化症とは、脂肪物質、コレステロールおよびその他の物質の蓄積が、動脈の内層に集中するプロセスである。この集積はプラークと呼ばれる。プラークの破裂が血栓を形成させ、この血栓が心臓への血流を遮断（心臓発作）または脳への血流を遮断（卒中）し得る。米国では、心臓発作が、男性および女性双方の第１の死因であり、卒中が第３の死因である［例えば、ＮａｔｕｒｅＭｅｄｉｃｉｎｅ，ＳｐｅｃｉａｌＦｏｃｕｓｏｎＡｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，（２００２）８：１２０９−１２６２を参照のこと］。異常に高レベルの循環脂質が、アテローム性動脈硬化症の発生の主要な病因である。高レベルの低比重リポタンパク質（ＬＤＬ）コレステロール、高レベルのトリグリセリドのまたは低レベルの高比重リポタンパク質（ＨＤＬ）コレステロールは独立に、アテローム性動脈硬化症および関連する病気の危険因子である。

心疾患としては、それだけには限らないが、心不全、冠不全、冠動脈疾患および高血圧症（ｈｉｇｈｂｌｏｏｄｐｒｅｓｓｕｒｅ）（高血圧症（ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ））が挙げられる。末梢血管疾患とは、心臓および脳の外側の血管の疾患を指す。組織の末梢血管疾患は、血管の構造変化、例えば、炎症および組織損傷によって引き起こされる。末梢動脈疾患が一例である。末梢動脈疾患（ＰＡＤ）は、冠動脈疾患および頚動脈疾患と同様の症状である。ＰＡＤでは、脂肪の蓄積が動脈壁に沿って集中し、主に、脚および足へつながる動脈における血液循環に影響を及ぼす。早期においては、一般的な症状は、活動の間の脚および臀部の筋痙攣または疲労である。このような筋痙攣は、その人が静止している時には治まる。これは、「間欠性跛行」と呼ばれる。ＰＡＤを患う人は、血栓の危険性のために、卒中および心臓発作による死亡の高い危険性を有する。

シンドロームＸは、メタボリックシンドロームとも呼ばれ、一人の人物における一群の代謝危険因子を特徴とする。それらとしては、中心性肥満（腹部の中および腹部周辺の過剰の脂肪組織）、アテローム生成性異脂肪血症（血液脂肪障害−主に高トリグリセリドおよび低ＨＤＬコレステロール）、血圧の上昇（１３０／８５ｍｍＨｇ以上）、インスリン抵抗性またはグルコース不耐性、プロトロンビン状態（例えば、血中の高フィブリノゲンまたはプラスミノゲンアクチベーター阻害剤［−１］）および炎症誘発性状態（例えば、血中の高感受性Ｃ反応性タンパク質の上昇）が挙げられる。

本明細書に開示される化合物または本発明の方法によって同定される化合物は、本明細書において上で記載されるように、唯一の活性な医薬品として投与できるが、それらは、例えば、糖尿病、血液脂質障害または肥満症の治療に用いられる薬剤をはじめとする１種以上の薬剤と併用してもよい。例えば、ＧＰＲ４１インバースアゴニストまたはアンタゴニストなどの化合物は、α−グルコシダーゼ阻害剤、アルドースレダクターゼ阻害剤、ビグアナイド、チアゾリジンジオン、メグリチニド、スルホニル尿素、インスリン、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤、スクアレン合成阻害剤、フィブラート化合物、ＬＤＬ異化促進剤、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤、リパーゼ阻害剤、セロトニンおよび／またはノルアドレナリンリリーサーまたは再取り込み阻害剤として知られる薬物の種類に属する１種以上の薬剤と併用してもよい。

α−グルコシダーゼ阻害剤は、膵臓およびまたは小腸において、α−アミラーゼ、マルターゼ、α−デキストリナーゼ、スクラーゼなどといった消化酵素を競合的に阻害する薬物の種類に属する。α−グルコシダーゼ阻害剤による可逆性の阻害は、デンプンおよび糖の消化を遅らせることによって、血糖値を遅延させ、減少させ、あるいは低下させる。α−グルコシダーゼ阻害剤のいくつかの代表的な例として、アカルボース、Ｎ−（１，３−ジヒドロキシ−２−プロピル）バリオールアミン（一般名；ボグリボース）、ミグリトールおよび当技術分野で公知のα−グルコシダーゼ阻害剤がある。

アルドースレダクターゼ阻害剤の種類は、ポリオール経路において初期律速酵素を阻害し、それによって糖尿病合併症を防ぐか、抑止する薬物である。糖尿病の高血糖状態では、ポリオール経路におけるグルコースの利用が増大し、過剰のソルビトールが細胞内に蓄積し、結果として、組織毒として作用し、したがって、糖尿病性神経障害、糖尿病性網膜症および糖尿病性腎症などの合併症の発病を惹起する。アルドースレダクターゼ阻害剤の例として、トルレスタット（ｔｏｌｕｒｅｓｔａｔ）、エパルレスタット、３，４−ジヒドロ−２，８−ジイソプロピル−３−チオキソ−２Ｈ−１，４−ベンゾキサジン−４−酢酸、２，７−ジフルオロスピロ（９Ｈ−フルオレン−９，４’−イミダゾリジン）−２’，５’−ジオン（一般名：イミレスタット（ｉｍｉｒｅｓｔａｔ））、３−［（４−ブロモ−２−フルオロフェニル）メチ］−７−クロロ−３，４−ジヒドロ−２，４−ジオキソ−１（２Ｈ）−キナゾリン酢酸（一般名：ゼナレスタット（ｚｅｎａｒｅｓｔａｔ））、６−フルオロ−２，３−ジヒドロ−２’，５’−ジオキソ−スピロ［４Ｈ−１−ベンゾピラン−４，４’−イミダゾリジン］−２−カルボキサミド（ＳＮＫ−８６０）、ゾポルレスタット（ｚｏｐｏｌｒｅｓｔａｔ）、ソルビニルおよび１−［（３−ブロモ−２−ベンゾフラニル）スルホニル］−２，４−イミダゾリジンジオン（Ｍ−１６２０９）および当技術分野で公知のアルドースレダクターゼ阻害剤が挙げられる。

ビグアナイドは、嫌気性解糖を刺激し、末梢組織においてインスリンに対する感受性を高め、腸からのグルコース吸収を阻害し、肝臓の糖新生を抑制し、脂肪酸酸化を阻害する薬物の種類である。ビグアナイドの例として、フェンホルミン、メトホルミン、ブホルミンおよび当技術分野で公知のビグアナイドが挙げられる。

インスリン分泌促進薬は、膵臓β細胞からのインスリンの分泌を促進する特性を有する薬物の種類に属する。インスリン分泌促進薬の例として、スルホニル尿素（ＳＵ）が挙げられる。スルホニル尿素（ＳＵ）は、インスリン分泌のシグナルを、細胞膜中のＳＵ受容体を介して伝達することによって、膵臓β細胞からのインスリンの分泌を促進する薬物である。スルホニル尿素の例として、トルブタミド、クロルプロパミド、トラザミド、アセトヘキサミド、４−クロロ−Ｎ−［（１−ピロリジニルアミノ）カルボニル］−ベンゼンスルホンアミド（一般名：グリコピラミド（ｇｌｙｃｏｐｙｒａｍｉｄｅ））またはそのアンモニウム塩、グリベンクラミド（グリブリド）、グリクラジド、１−ブチル−３−メタニルウレア、カルブタミド、グリボヌリド（ｇｌｉｂｏｎｕｒｉｄｅ）、グリピジド、グリキドン、グリソキセピド、グリブチアゾール（ｇｌｙｂｕｔｈｉａｚｏｌｅ）、グリブゾール（ｇｌｉｂｕｚｏｌｅ）、グリヘキサミド（ｇｌｙｈｅｘａｍｉｄｅ）、グリミジン、グリピナミド（ｇｌｙｐｉｎａｍｉｄｅ）、フェンブタミド（ｐｈｅｎｂｕｔａｍｉｄｅ）、トルシクラミド（ｔｏｌｃｙｃｌａｍｉｄｅ）、グリメピリドおよびその他の当技術分野で公知のインスリン分泌促進薬が挙げられる。その他のインスリン分泌促進薬としては、Ｎ−［［４−（１−メチルエチル）シクロヘキシル）カルボニル］−Ｄ−フェニルアラニン（ナタグリニド）、カルシウム（２Ｓ）−２−ベンジル−３−（シス−ヘキサヒドロ−２−イソインドリニルカルボニル）プロピオネート二水和物（ミチグリニド、ＫＡＤ−１２２９）およびその他の当技術分野で公知のインスリン分泌促進薬が挙げられる。

チアゾリジンジオンは、ＴＺＤとしてより一般に知られる薬物の種類に属する。チアゾリジンジオンは、インスリンに対する細胞の感受性を高めることによって血糖を低下させる２型糖尿病のための薬物の種類である。したがって、インスリンが、エネルギーのためにグルコースを血液から細胞に移動させることができる。これらの薬物はまたＨＤＬを高め得る。

チアゾリジンジオンの例として、ロシグリタゾン、ピオグリタゾンおよび当技術分野で公知のチアゾリジンジオンが挙げられる。レズリン（Ｒｅｚｕｌｉｎ）（トログリタゾン）は、米国におけるこの種類の最初の薬物であったが、肝臓毒性のために市場から回収された。より良い安全性プロフィールを有する現在入手可能な姉妹化合物として、アクトス（Ａｃｔｏｓ）（ピオグリタゾン）およびアバンジア（Ａｖａｎｄｉａ）（ロシグリタゾン）が挙げられる。これらの医薬を使用するための主な禁忌症として、肝臓疾患および心不全が挙げられる。これらの薬物はまた、体液貯留の大幅な増大およびそれによる心不全の危険性の増大を引き起こし得る。

メグリチニドは、２型糖尿病の人が食事をとった直後に生じ得る血糖の急速な上昇を停止するために用いられる。例えば、レパグリニド（プランジン（Ｐｒａｎｄｉｎ））およびナタグリニド（スターリックス（Ｓｔａｒｌｉｘ））をはじめとするこれらの化合物は、スルホニル尿素医薬が働くのと同様に、膵臓によって生成されるインスリン量を増大させることによって働く。メグリチニドは食事をする前に摂取する。この種類の薬物に伴われる副作用として、低血糖、鼻炎症状をはじめとする上気道感染、頭痛、関節および背中の疼痛、悪心、下痢および便秘が挙げられる。

種々のタイプのインスリンが、どの程度早く働き始めるか（発現）、およびどの程度長期間働き続けるか（期間）に従って分類されている。現在入手可能なタイプとして、即効型、短時間作用型、中時間作用型および長時間作用型インスリンが挙げられる。予混合即効型および中時間作用型インスリンが入手可能である。例えば、７０／３０インスリンと呼ばれる、７０％中時間作用型（ＮＰＨ）と３０％短時間作用型レギュラーインスリン；５０／５０インスリンと呼ばれる、５０％中時間作用型（ＮＰＨ）と５０％短時間作用型レギュラーインスリン；７５／２５インスリンと呼ばれる、７５％中時間作用型（ＮＰＨ）と２５％即効型ヒューマログ（Ｈｕｍａｌｏｇ）（リスプロ）；ノボログミックス７０／３０と呼ばれる、７０％中時間作用型（ＮＰＨ）と３０％即効型ノボログ（ＮｏｖｏＬｏｇ）（インスリンアスパルト（ａｓｐａｒｔ））。インスリンは通常、注射として皮膚の下の組織中に投与される（皮下）。インスリンポンプまたはジェットインジェクタ、医薬を皮膚に噴霧する装置によって投与してもよい。

インスリンは糖（グルコース）を細胞に入らせ、糖はそこでエネルギーのために使用される。インスリンがなければ、血糖値が身体に安全であるものを上回って上昇する。通常、即効型または短時間作用型および中時間作用型または長時間作用型インスリンは、身体が必要とする一定レベルおよび可変レベルのインスリンを提供するよう摂取する。短時間作用型インスリンは血糖値を迅速に低下させ、次いで、徐々に切れる。長時間作用型インスリンの中には、即効型または短時間作用型インスリンが切れ始めたときに、効果が出始めるものもある。新規長時間作用型インスリン、ランタス（Ｌａｎｔｕｓ）は、投与された後数分内に働き始め、同じ割合で約２４時間働き続ける。

即効型または短時間作用型インスリンと中時間作用型または長時間作用型インスリンとの組み合わせにより、血糖値を身体にとって安全である範囲内に一日中維持するのに役立つ。したがって、膵臓がインスリンをほとんど生成しないか、全く生成しない、または経口医薬が血糖を制御しない、１型糖尿病を患う人、２型糖尿病を患う人を、インスリンを用いて治療できる。これらの人は、インスリンを、単独でまたは経口医薬とともに摂取すればよい。例えば、重篤な病気または大手術のために血糖値が高い２型糖尿病を患う人、食事および運動で血糖値を安全な範囲内に維持できない、妊娠しているか、授乳期の２型糖尿病を患う女性。１種の経口糖尿病医薬（グリブリド）しか、妊娠期間に使用するために研究されていない。

インスリンの主要な副作用は危険なまでに低い血糖値（重症低血糖症）であり得る。極めて低い血糖値は１０〜１５分以内に発生し得る。インスリンは、特に、すでに過体重である２型を患う人において体重増加に貢献し得る。長時間作用型インスリン使用のその他のあり得る副作用として、インスリンが注射される場所での脂肪組織の喪失（脂肪異栄養症）、稀であるが、腫脹（浮腫）を含むアレルギー反応が挙げられる。

スタチン化合物は、ヒドロキシメチルグルタリルＣｏＡ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）レダクターゼを阻害することによって、血中コレステロールレベルを低下させる薬物の種類に属する。ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼは、コレステロール生合成における律速酵素である。このレダクターゼを阻害するスタチンは、ＬＤＬ受容体の活性をアップレギュレートすることによって血清ＬＤＬ濃度を低下させ、血液からのＬＤＬの除去に関与している。スタチン化合物の例として、ロスバスタチン、プラバスタチンおよびそのナトリウム塩、シンバスタチン、ロバスタチン、アトルバスタチン、フルバスタチン、セリバスタチンおよび当技術分野で公知のＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼが挙げられる。

スクアレン合成阻害剤は、スクアレンの合成を阻害することによって血中コレステロールレベルを低下させる薬物の種類に属する。スクアレン合成阻害剤の例として、（Ｓ）−α−［ビス［２，２−ジメチル−１−オキソプロポキシ）メトキシ］ホスフィニル］−３−フェノキシベンゼンブタンスルホン酸、一カリウム塩（ＢＭＳ−１８８４９４）および当技術分野で公知のスクアレン合成阻害剤が挙げられる。

フィブラート化合物は、肝臓におけるトリグリセリドの合成および分泌を阻害することとリポタンパク質リパーゼを活性化することとによって血中コレステロールレベルを低下させる薬物の種類に属する。フィブラートは、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体を活性化し、リポタンパク質リパーゼ発現を誘導することがわかっている。フィブラート化合物の例としては、ベザフィブラート、ベクロブラート（ｂｅｃｌｏｂｒａｔｅ）、ビニフィブラート（ｂｉｎｉｆｉｂｒａｔｅ）、シプロフィブラート（ｃｉｐｌｏｆｉｂｒａｔｅ）、クリノフィブラート、クロフィブラート、クロフィブリン酸、エトフィブラート、フェノフィブラート、ゲムフィブロジル、ニコフィブラート、ピリフィブラート、ロニフィブラート、シンフィブラート、テオフィブラート（ｔｈｅｏｆｉｂｒａｔｅ）および当技術分野で公知のフィブラートが挙げられる。

ＬＤＬ（低密度リポタンパク質）異化促進剤は、ＬＤＬ（低密度リポタンパク質）受容体の数を増大させることによって血中コレステロールレベルを低下させる薬物の種類に属し、例として、当技術分野で公知のＬＤＬ異化促進剤が挙げられる。

アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤は、アンジオテンシン変換酵素を阻害することによって、血糖値をある程度低下させ、ならびに、血圧を低下させる薬物の種類に属する。アンジオテンシン変換酵素の例として、カプトプリル、エナラプリル、アラセプリル、デラプリル、ラミプリル、リシノプリル、イミダプリル、ベナゼプリル、セロナプリル（ｃｅｒｏｎａｐｒｉｌ）、シラザプリル、エナラプリラート、ホシノプリル、モベルトプリル（ｍｏｖｅｌｔｏｐｒｉｌ）、ペリンドプリル、キナプリル、スピラプリル、テモカプリル、トランドラプリルおよび当技術分野で公知のアンジオテンシン変換酵素阻害剤が挙げられる。

リパーゼ阻害剤としては、例えば、オーリスタット（ゼニカル（商標））などの抗肥満症化合物が挙げられる。オーリスタットは脂肪吸収を直接阻害するが、高罹患率の下痢および膨満などの不快な胃の副作用を生じる傾向がある。

他の種類の抗肥満症薬として、セロトニンおよび／またはノルアドレナリンリリーサーまたは再取り込み阻害剤が挙げられる。例えば、シブトラミン（メリディア（Ｍｅｒｉｄｉａ）（商標））を５−ＨＴ／ノルアドレナリン再取り込み阻害剤と混合する。シブトラミンの主な副作用として、いくらかの患者で血圧の上昇および心拍数の増大があり得る。セロトニンリリーサー／再取り込み阻害剤フェンフルラミン（ポンジミン（Ｐｏｎｄｉｍｉｎ）（商標））およびデクスフェンフルラミン（レダックス（Ｒｅｄｕｘ）（商標））は、長期間（６ヶ月を超える）にわたって食物摂取および体重を低減させると報告されている。しかし、両製品とも、その使用に伴われる心臓弁の異常という予備的証拠が報告された後、使用が廃止された。

本発明のいくつかの実施形態は、本明細書に開示される化合物または本発明の方法によって同定される化合物またはその製薬上許容される塩を含む薬剤組成物を、α−グルコシダーゼ阻害剤、アルドースレダクターゼ阻害剤、ビグアナイド、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤、スクアレン合成阻害剤、フィブラート化合物、ＬＤＬ異化促進剤およびアンジオテンシン変換酵素阻害剤からなる群より選択される少なくとも１種以上のメンバーと組み合わせて含む。他の実施形態では、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤は、プレバスタチン（ｐｒｅｖａｓｔａｔｉｎ）、シンバスタチン、ロバスタチン、アトルバスタチン、フルバスタチンおよびリピトール（ｌｉｐｉｔｏｒ）からなる群より選択される。

本発明によれば、組み合わせは、それぞれの有効成分をすべて一緒に、または独立に、本明細書において上で記載されたような、生理学的に許容される担体、賦形剤、結合剤、希釈液などと混合することと、混合物または混合物類を薬剤組成物として経口投与または非経口投与することとによって使用できる。化合物または化合物の混合物を、別の活性化合物とともに併用療法または併用予防として投与する場合には、治療薬を、同時に、または異なる時点で与えられる別個の薬剤組成物として製剤してもよいし、治療薬は単一の組成物として投与してもよい。

本発明はまた、血糖安定化化合物として使用するための、ａ）候補化合物をＧＰＲ４１と接触させる工程と、ｂ）ＧＰＲ４１の機能性が調節されるかどうかを調べる工程とを含み、ＧＰＲ４１の機能性の調節が、候補化合物が血糖安定化化合物であることを示す方法によって同定される血糖安定化化合物を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなる薬剤組成物を含む医薬の製造方法を提供する。

本発明は、インスリン関連障害の治療に用いるための、ａ）候補化合物をＧＰＲ４１と接触させる工程と、ｂ）ＧＰＲ４１の機能性が調節されるかどうかを調べる工程とを含み、ＧＰＲ４１の機能性の調節が、候補化合物が血糖安定化化合物であることを示す方法によって同定される血糖安定化化合物を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなる薬剤組成物を含む医薬の製造方法をさらに提供する。

本発明は、ａ）候補化合物をＧＰＲ４１と接触させる工程と、ｂ）ＧＰＲ４１の機能性が高められるかどうかを調べる工程とを含み、ＧＰＲ４１の機能性の増大が、候補化合物が血糖安定化化合物であることを示す、血糖安定化化合物を同定する方法に関する。

一実施形態では、前記ＧＰＲ４１は哺乳類由来である。他の実施形態では、前記ＧＰＲ４１はヒトである。

特定の実施形態では、前記ＧＰＲ４１は、組換え型である。特定の実施形態では、前記の接触させる工程は、ＧＰＣＲを発現する宿主細胞と、または宿主細胞の膜と接触させる工程を含み、宿主細胞は受容体をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む。いくつかの実施形態では、前記の接触させる工程はＧＰＣＲの既知アゴニストまたは本明細書に開示されるアゴニストの存在下で実施される。

特定の実施形態では、前記方法は、候補化合物によって引き起こされる受容体の機能性の増大を、受容体を、受容体の既知リガンドまたはアゴニストに接触させる工程によって引き起こされる受容体の機能性の第２の増大と比較する工程をさらに含む。

いくつかの実施形態では、前記血糖安定化化合物は、以下からなる群より選択される化合物を含む：２−メチル−４−（４−ニトロ−フェニル）−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミド、シクロプロパンカルボン酸４−［１，２，３］チアジアゾール−４−イル−フェニルエステル、シクロプロパンカルボン酸；４−フラン−３−イル−２−メチル−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミド、４−フラン−３−イル−２−メチル−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸（２，５−ジクロロ−フェニル）−アミド、４−フラン−２−イル−２−メチル−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミド、４−フラン−３−イル−２−メチル−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸（４−クロロ−フェニル）−アミド、２−メチル−４−（４−メチルスルファニル−フェニル）−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミドおよび２−メチル−４−（３−ニトロ−フェニル）−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミドまたはその製薬上許容される塩。

本発明はまた、インスリン分泌の阻害剤として候補化合物を同定する方法であって、ａ）候補化合物をＧＰＲ４１と接触させる工程と、ｂ）ＧＰＲ４１の機能性が高められるかどうかを調べる工程とを含み、ＧＰＲ４１の機能性の増大が、候補化合物がインスリン分泌の阻害剤であることを示す方法に関する。例えば、ＧＰＲ４１の機能性を高める化合物、例えば、ＧＰＲ４１アゴニストは、インスリン分泌の減少をもたらし得る。インスリン分泌の減少は、例えば、低血糖症を患う個体において望まれる場合がある。

本発明はまた、血糖濃度の上昇をもたらす候補化合物を同定する方法であって、ａ）候補化合物をＧＰＲ４１と接触させる工程と、ｂ）ＧＰＲ４１の機能性が高められるかどうかを調べる工程とを含み、ＧＰＲ４１の機能性の増大が、候補化合物が血糖濃度の上昇をもたらすことを示す方法に関する。例えば、ＧＰＲ４１の機能性を高める化合物、例えば、ＧＰＲ４１アゴニストは、インスリン分泌の減少および血糖濃度の上昇をもたらし得る。血糖の上昇は、例えば、低血糖症を患う個体において望まれる場合がある。

特定の実施形態では、前記ＧＰＲ４１は組換え型である。特定の実施形態では、前記の接触させる工程は、ＧＰＣＲを発現する宿主細胞と、または宿主細胞の膜と接触させる工程を含み、宿主細胞は受容体をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む。いくつかの実施形態では、前記の接触させる工程をＧＰＣＲのアゴニストの存在下で実施される。

本発明の方法では、調べる工程はセカンドメッセンジャーアッセイを含み得る。細胞内シグナルの開始は、例えば、セカンドメッセンジャー、例えば、サイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）、サイクリックＧＭＰ（ｃＧＭＰ）、イノシトール三リン酸（ＩＰ３）、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）、ＭＡＰキナーゼまたはカルシウムのレベルの測定によって調べることができる。これらのセカンドメッセンジャーを測定するためのいくつかのアッセイ、例えば、ｃＡＭＰアッセイ、ＩＰ３アッセイ、ＦＬＩＰＲアッセイ、メラノフォアアッセイまたはＣＲＥリポーターアッセイが当技術分野では周知である。さらに、セカンドメッセンジャーアッセイの例は本明細書において実施例１２〜１７に開示されている。特定の実施形態では、前記セカンドメッセンジャーはｃＡＭＰである。その他の実施形態では、前記セカンドメッセンジャーはＩＰ３である。さらなる実施形態では、前記セカンドメッセンジャーはカルシウムである。

本発明はまた、ａ）候補化合物をＧＰＲ４１と接触させる工程と、ｂ）ＧＰＲ４１の機能性が高められるかどうかを調べる工程とを含み、ＧＰＲ４１の機能性の増大が、候補化合物が血糖安定化化合物であることを示す方法によって同定可能な血糖安定化化合物に関する。

例えば、本発明は、ａ）候補化合物をＧＰＲ４１と接触させる工程と、ｂ）ＧＰＲ４１の機能性が高められるかどうかを調べる工程とを含み、ＧＰＲ４１の機能性の増大が、候補化合物が血糖安定化化合物であることを示す方法によって同定される血糖安定化化合物を提供する。

一実施形態では、前記血糖安定化化合物は、以下からなる群より選択される化合物を含む：２−メチル−４−（４−ニトロ−フェニル）−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミド、シクロプロパンカルボン酸４−［１，２，３］チアジアゾール−４−イル−フェニルエステル、シクロプロパンカルボン酸；４−フラン−３−イル−２−メチル−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミド、４−フラン−３−イル−２−メチル−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸（２，５−ジクロロ−フェニル）−アミド、４−フラン−２−イル−２−メチル−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミド、４−フラン−３−イル−２−メチル−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸（４−クロロ−フェニル）−アミド、２−メチル−４−（４−メチルスルファニル−フェニル）−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミドおよび２−メチル−４−（３−ニトロ−フェニル）−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミドまたはその製薬上許容される塩。

さらに、本発明は、血糖安定化化合物を同定する工程と、次いで、前記化合物を担体と混合する工程とを含む組成物の調製方法であって、前記化合物が、ａ）候補化合物をＧＰＲ４１と接触させる工程と、ｂ）ＧＰＲ４１の機能性が高められるかどうかを調べる工程とからなり、ＧＰＲ４１の機能性の増大が、候補化合物が血糖安定化化合物であることを示す方法によって同定可能である方法に関する。例えば、本発明は、血糖安定化化合物を同定する工程と、次いで、前記化合物を担体と混合する工程とを含む組成物の調製方法であって、前記化合物が、ａ）候補化合物をＧＰＲ４１と接触させる工程と、ｂ）ＧＰＲ４１の機能性が高められるかどうかを調べる工程とからなり、ＧＰＲ４１の機能性の増大が、候補化合物が血糖安定化化合物であることを示す方法によって同定される方法を提供する。さらに、本発明は、血糖安定化化合物を同定する工程と、次いで、前記化合物を担体と混合する工程とを含む組成物の調製方法であって、前記化合物が以下からなる群より選択される化合物を含む方法を提供する：２−メチル−４−（４−ニトロ−フェニル）−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミド、シクロプロパンカルボン酸４−［１，２，３］チアジアゾール−４−イル−フェニルエステル、シクロプロパンカルボン酸；４−フラン−３−イル−２−メチル−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミド、４−フラン−３−イル−２−メチル−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸（２，５−ジクロロ−フェニル）−アミド、４−フラン−２−イル−２−メチル−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミド、４−フラン−３−イル−２−メチル−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸（４−クロロ−フェニル）−アミド、２−メチル−４−（４−メチルスルファニル−フェニル）−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミドおよび２−メチル−４−（３−ニトロ−フェニル）−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミドまたはその製薬上許容される塩。

本発明はまた、ａ）候補化合物をＧＰＲ４１と接触させる工程と、ｂ）ＧＰＲ４１の機能性が高められるかどうかを調べる工程とからなり、ＧＰＲ４１の機能性の増大が、候補化合物が血糖安定化化合物であることを示す方法によって同定される血糖安定化化合物を含む、本質的にそれからなる、または、それからなる薬剤組成物を提供する。

化合物は、当業者に周知の技術を用いて、薬剤組成物に製剤できる。

したがって、本発明は、本明細書に開示される化合物または本発明の方法によって同定される化合物またはその製薬上許容される塩もしくは誘導体を、１種以上のその製薬上許容される担体および／または予防成分と一緒に含む薬剤製剤をさらに提供する。担体は、製剤のその他の成分と適合している、およびその受容者にとって過度に有害でないという意味で「許容される」。

薬剤製剤、投与経路および投与量は上に記載してある。

本発明は、インスリン関連障害を治療または予防することを必要とする個体において、インスリン関連障害を治療または予防する方法であって、前記個体に、ａ）候補化合物をＧＰＲ４１と接触させる工程と、ｂ）ＧＰＲ４１の機能性が高められるかどうかを調べる工程とからなり、ＧＰＲ４１の機能性の増大が、候補化合物が血糖安定化化合物であることを示す方法によって同定される化合物の有効量を投与する工程を含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、前記インスリン関連障害は、低血糖症、インスリン分泌性もしくはインスリン依存性腫瘍または加齢である。一実施形態では、投与される化合物は、ＧＰＲ４１アゴニストを含む。一実施形態では、個体は哺乳類であり、他の実施形態では、個体はヒトである。

本明細書に開示される化合物または本発明の方法によって同定される化合物は、本明細書において上で記載されるように、唯一の活性な医薬品として投与できるが、それらは、１種以上の薬剤と併用してもよい。

本発明はまた、血糖安定化化合物として使用するための、ａ）候補化合物をＧＰＲ４１と接触させる工程と、ｂ）ＧＰＲ４１の機能性が高められるかどうかを調べる工程とを含み、ＧＰＲ４１の機能性の増大が、候補化合物が血糖安定化化合物であることを示すという方法によって同定される血糖安定化化合物を含む、本質的にそれからなる、または、それからなる薬剤組成物を含む医薬の製造方法を提供する。

本発明は、インスリン関連障害の治療に用いるための、ａ）候補化合物をＧＰＲ４１と接触させる工程と、ｂ）ＧＰＲ４１の機能性が高められるかどうかを調べる工程とを含み、ＧＰＲ４１の機能性の増大が、候補化合物が血糖安定化化合物であることを示す方法によって同定される血糖安定化化合物を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなる薬剤組成物を含む医薬を製造する方法をさらに提供する。

本発明は、ａ）候補化合物をＧＰＲ４１と接触させる工程と、ｂ）ＧＰＲ４１の機能性が低減するかどうかを調べる工程とを含み、ＧＰＲ４１の機能性の低減が、候補化合物が血糖安定化化合物であることを示す、血糖安定化化合物を同定する方法に関する。一実施形態では、前記血糖安定化化合物は、以下からなる群より選択される化合物を含む：２−メチル−４−［５−（２−ニトロ−４−トリフルオロメチル−フェニル）−フラン−２−イル］−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミド、４−（５−ビフェニル−２−イル−フラン−２−イル）−２−メチル−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミド、２−メチル−４−［５−（２−ニトロ−フェニル）−フラン−２−イル］−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸（２−クロロ−フェニル）−アミド、２−メチル−５−オキソ−４−（４−フェノキシ−フェニル）−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミド、２−メチル−５−オキソ−４−［５−（２−トリフルオロメトキシ−フェニル）−フラン−２−イル］−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミドおよび４−［５−（２，５−ジクロロ−フェニル）−フラン−２−イル］−２−メチル−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミドまたはその製薬上許容される塩。

本発明はまた、インスリン分泌の増強剤として候補化合物を同定する方法であって、ａ）候補化合物をＧＰＲ４１と接触させる工程と、ｂ）ＧＰＲ４１の機能性が低減するかどうかを調べる工程とを含み、ＧＰＲ４１の機能性の低減が、候補化合物がインスリン分泌の増強剤であることを示す方法に関する。例えば、ＧＰＲ４１の機能性を低減させる化合物、例えば、ＧＰＲ４１アンタゴニストまたはインバースアゴニストは、インスリン分泌の増大をもたらし得る。インスリン分泌の増大は、例えば、インスリン抵抗性を有する個体、例えば、糖尿病患者において望まれる場合がある。

本発明はまた、血糖濃度の低下をもたらす候補化合物を同定する方法であって、ａ）候補化合物をＧＰＲ４１と接触させる工程と、ｂ）ＧＰＲ４１の機能性が低減するかどうかを調べる工程とを含み、ＧＰＲ４１の機能性の低減が、候補化合物が血糖濃度の低下をもたらすことを示す方法に関する。例えば、ＧＰＲ４１の機能性を低下させる化合物、例えば、ＧＰＲ４１インバースアゴニストまたはアンタゴニストは、インスリン分泌の増大および血糖濃度の低下をもたらし得る。血糖の低下は、高血糖症を患う個体、例えば、糖尿病患者において望まれるものであり得る。

特定の実施形態では、前記ＧＰＲ４１は組換え型である。特定の実施形態では、前記接触させる工程は、ＧＰＣＲを発現する宿主細胞と、または宿主細胞の膜と接触させる工程を含み、宿主細胞は受容体をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む。いくつかの実施形態では、前記の接触させる工程をＧＰＣＲのアゴニストの存在下で実施する。

本発明の方法では、対照反応は、反応の特異性を示すよう実施できる。例えば、ＧＰＲ４１でトランスフェクトした細胞に対して偽トランスフェクト細胞を比較して、ＧＰＲ４１受容体への応答の特異性を示すことができる。

本発明はまた、ａ）候補化合物をＧＰＲ４１と接触させる工程と、ｂ）ＧＰＲ４１の機能性が低減するかどうかを調べる工程とを含み、ＧＰＲ４１の機能性の低減が、候補化合物が血糖安定化化合物であることを示す方法によって同定可能な血糖安定化化合物に関する。

例えば、本発明は、ａ）候補化合物をＧＰＲ４１と接触させる工程と、ｂ）ＧＰＲ４１の機能性が低減するかどうかを調べる工程とを含み、ＧＰＲ４１の機能性の低減が、候補化合物が血糖安定化化合物であることを示す方法によって同定される血糖安定化化合物を提供する。一実施形態では、前記血糖安定化化合物はＧＰＲ４１インバースアゴニストである。一実施形態では、前記血糖安定化化合物はＧＰＲ４１アンタゴニストである。一実施形態では、前記血糖安定化化合物は以下からなる群より選択される化合物を含む：２−メチル−４−［５−（２−ニトロ−４−トリフルオロメチル−フェニル）−フラン−２−イル］−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミド、４−（５−ビフェニル−２−イル−フラン−２−イル）−２−メチル−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミド、２−メチル−４−［５−（２−ニトロ−フェニル）−フラン−２−イル］−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸（２−クロロ−フェニル）−アミド、２−メチル−５−オキソ−４−（４−フェノキシ−フェニル）−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミド、２−メチル−５−オキソ−４−［５−（２−トリフルオロメトキシ−フェニル）−フラン−２−イル］−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミドおよび４−［５−（２，５−ジクロロ−フェニル）−フラン−２−イル］−２−メチル−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミドまたはその製薬上許容される塩。

特定の実施形態では、前記ＩＣ５０を、以下からなる群より選択されるアッセイを用いて調べる：組換えＧＰＲ４１ポリペプチドを発現するトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞を用いて実施されるＩＰ３アッセイ、および組換えＧＰＲ４１ポリペプチドを発現するトランスフェクトされたメラノフォアを用いて実施されるメラノフォアアッセイ。いくつかの実施形態では、前記血糖安定化化合物は、前記アッセイにおいてＩＣ５０が１０μＭ未満、１μＭ未満、１００ｎＭ未満または１０ｎＭ未満であるインバースアゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態では、前記血糖安定化化合物は、前記アッセイにおいてＩＣ５０が１０μＭ未満、９μＭ未満、８μＭ未満、７μＭ未満、６μＭ未満、５μＭ未満、４μＭ未満、３μＭ未満、２μＭ未満、１μＭ未満、９００ｎＭ未満、８００ｎＭ未満、７００ｎＭ未満、６００ｎＭ未満、５００ｎＭ未満、４００ｎＭ未満、３００ｎＭ未満、２００ｎＭ未満、１００ｎＭ未満、９０ｎＭ未満、８０ｎＭ未満、７０ｎＭ未満、６０ｎＭ未満、５０ｎＭ未満、４０ｎＭ未満、３０ｎＭ未満、２０ｎＭ未満、１０ｎＭ未満であるインバースアゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態では、前記血糖安定化化合物は、前記アッセイにおけるＩＣ５０が１ｎＭ〜１０μＭの間から選択される値であるインバースアゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態では、前記血糖安定化化合物は、前記アッセイにおけるＩＣ５０が１ｎＭ〜１μＭの間から選択される値であるインバースアゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態では、前記血糖安定化化合物は、前記アッセイにおけるＩＣ５０が１ｎＭ〜１００ｎＭの間から選択される値であるインバースアゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態では、前記血糖安定化化合物は、前記アッセイにおけるＩＣ５０が１ｎＭ〜１０ｎＭの間から選択される値であるインバースアゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態では、前記血糖安定化化合物はＧＰＣＲに選択的である。

さらに、本発明は、血糖安定化化合物を同定する工程と、次いで、前記化合物を担体と混合する工程とを含む組成物の調製方法であって、前記化合物がａ）候補化合物をＧＰＲ４１と接触させる工程と、ｂ）ＧＰＲ４１の機能性が低減するかどうかを調べる工程とからなり、ＧＰＲ４１の機能性の低減が、候補化合物が血糖安定化化合物であることを示す方法によって同定可能な方法に関する。例えば、本発明は、血糖安定化化合物を同定する工程と、次いで、前記化合物を担体と混合する工程とを含む組成物の調製方法であって、前記化合物がａ）候補化合物をＧＰＲ４１と接触させる工程と、ｂ）ＧＰＲ４１の機能性が低減するかどうかを調べる工程とからなり、ＧＰＲ４１の機能性の低減が、候補化合物が血糖安定化化合物であることを示す方法によって同定される方法を提供する。

本発明はまた、ａ）候補化合物をＧＰＲ４１と接触させる工程と、ｂ）ＧＰＲ４１の機能性が低減するかどうかを調べる工程とからなり、ＧＰＲ４１の機能性の低減が、候補化合物が血糖安定化化合物であることを示す方法によって同定される血糖安定化化合物を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなる薬剤組成物を提供する。

薬剤製剤、投与経路および投与量は上に記載してある。

本発明は、インスリン関連障害を治療または予防することを必要とする個体において、インスリン関連障害を治療または予防する方法であって、前記個体に、ａ）候補化合物をＧＰＲ４１と接触させる工程と、ｂ）ＧＰＲ４１の機能性が低減するかどうかを調べる工程とからなり、ＧＰＲ４１の機能性の低減が、候補化合物が血糖安定化化合物であることを示す方法によって同定される化合物の有効量を投与する工程を含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、前記インスリン関連障害は、インスリン抵抗性、耐糖能障害または糖尿病である。いくつかの実施形態では、前記インスリン関連障害は、血糖濃度の上昇と関連している症状、例えば、アテローム性動脈硬化症、心疾患、卒中、高血圧症、肥満症、シンドロームＸまたは末梢血管疾患を含む。いくつかの実施形態では、前記インスリン関連障害は、ＩＩ型糖尿病である。一実施形態では、投与される化合物は、ＧＰＲ４１インバースアゴニストまたはアンタゴニストを含む。

一実施形態では、本方法は、前記個体に、糖尿病、血液脂質障害または肥満症の治療に用いられる薬剤の有効量を、ａ）候補化合物をＧＰＲ４１と接触させる工程と、ｂ）ＧＰＲ４１の機能性が低減するかどうかを調べる工程とからなり、ＧＰＲ４１の機能性の低減が、候補化合物が血糖安定化化合物であることを示す方法によって同定される血糖安定化化合物を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなる薬剤組成物の有効量と組み合わせて投与する工程をさらに含む。例えば、一実施形態では、本方法は、前記個体に、糖尿病、血液脂質障害または肥満症の治療に用いられる薬剤の有効量を、ＧＰＲ４１インバースアゴニストを含む薬剤組成物の有効量と組み合わせて投与する工程をさらに含む。

一実施形態では、個体は哺乳類であり、他の実施形態では、個体はヒトである。

本発明によれば、組み合わせは、それぞれの有効成分をすべて一緒に、または独立に、本明細書において上で記載されたような、生理学的に許容される担体、賦形剤、結合剤、希釈液などと混合することと、混合物または混合物類を薬剤組成物として経口投与または非経口投与することとによって使用できる。化合物または化合物の混合物を、別の活性化合物とともに併用療法または併用予防として投与する場合には、治療薬を、同時に、または異なる時点で与えられる別個の薬剤組成物として製剤してもよいし、または治療薬を単一の組成物として与えてもよい。

本発明はまた、血糖安定化化合物として使用するための、ａ）候補化合物をＧＰＲ４１と接触させる工程と、ｂ）ＧＰＲ４１の機能性が低減するかどうかを調べる工程とを含み、ＧＰＲ４１の機能性の低減が、候補化合物が血糖安定化化合物であることを示す方法によって同定される血糖安定化化合物を含む、本質的にそれからなる、または、それからなる薬剤組成物を含む医薬の製造方法を提供する。

本発明は、インスリン関連障害、例えば、インスリン抵抗性、耐糖能障害または糖尿病の治療に用いるための、ａ）候補化合物をＧＰＲ４１と接触させる工程と、ｂ）ＧＰＲ４１の機能性が低減するかどうかを調べる工程とを含み、ＧＰＲ４１の機能性の低減が、候補化合物が血糖安定化化合物であることを示す方法によって同定される血糖安定化化合物を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなる薬剤組成物を含む医薬の製造方法をさらに提供する。

本発明はまた、ＧＰＲ４１を有効量のＧＰＲ４１アゴニスト、例えば、以下からなる群より選択される群から選択される化合物と接触させる工程を含む、ＧＰＲ４１機能を増大する方法を提供する：２−メチル−４−（４−ニトロ−フェニル）−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミド、シクロプロパンカルボン酸４−［１，２，３］チアジアゾール−４−イル−フェニルエステル、シクロプロパンカルボン酸；４−フラン−３−イル−２−メチル−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミド、４−フラン−３−イル−２−メチル−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸（２，５−ジクロロ−フェニル）−アミド、４−フラン−２−イル−２−メチル−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミド、４−フラン−３−イル−２−メチル−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸（４−クロロ−フェニル）−アミド、２−メチル−４−（４−メチルスルファニル−フェニル）−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミドおよび２−メチル−４−（３−ニトロ−フェニル）−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミドまたはその製薬上許容される塩。これらの化合物の構造を以下の表１に示す。本発明はまた、ＧＰＲ４１を発現する細胞を、有効量のＧＰＲ４１アゴニストと接触させる工程を含む、細胞においてＧＰＲ４１機能を増大する方法を提供する。細胞は、例えば、個体中のものであってもよいし、または細胞は単離細胞であってもよい。

（表１）

本発明はまた、ＧＰＲ４１を有効量のＧＰＲ４１インバースアゴニストまたはアンタゴニスト、例えば、以下からなる群より選択される群から選択される化合物と接触させる工程を含む、ＧＰＲ４１機能を低下させる方法を提供する：２−メチル−４−［５−（２−ニトロ−４−トリフルオロメチル−フェニル）−フラン−２−イル］−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミド、４−（５−ビフェニル−２−イル−フラン−２−イル）−２−メチル−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミド、２−メチル−４−［５−（２−ニトロ−フェニル）−フラン−２−イル］−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸（２−クロロ−フェニル）−アミド、２−メチル−５−オキソ−４−（４−フェノキシ−フェニル）−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミド、２−メチル−５−オキソ−４−［５−（２−トリフルオロメトキシ−フェニル）−フラン−２−イル］−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミドおよび４−［５−（２，５−ジクロロ−フェニル）−フラン−２−イル］−２−メチル−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミドまたはその製薬上許容される塩。これらの化合物の構造を以下の表２に示す。本発明はまた、ＧＰＲ４１を発現する細胞を、有効量のＧＰＲ４１インバースアゴニストまたはアンタゴニストと接触させる工程を含む、細胞においてＧＰＲ４１機能を低下させる方法を提供する。細胞は、例えば、個体中のものであってもよいし、または細胞は単離細胞であってもよい。

（表２）

本発明は、インスリン関連障害を治療または予防することを必要とする個体において、インスリン関連障害を治療または予防する方法であって、有効量のＧＰＲ４１モジュレーターを投与する工程を含む方法を提供する。一実施形態では、前記インスリン関連障害は低血糖症、インスリン分泌性もしくはインスリン依存性腫瘍または加齢である。一実施形態では、前記モジュレーターはアゴニストである。一実施形態では、前記アゴニストは、以下からなる群より選択される化合物を含む：２−メチル−４−（４−ニトロ−フェニル）−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミド、シクロプロパンカルボン酸４−［１，２，３］チアジアゾール−４−イル−フェニルエステル、シクロプロパンカルボン酸；４−フラン−３−イル−２−メチル−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミド、４−フラン−３−イル−２−メチル−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸（２，５−ジクロロ−フェニル）−アミド、４−フラン−２−イル−２−メチル−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミド、４−フラン−３−イル−２−メチル−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸（４−クロロ−フェニル）−アミド、２−メチル−４−（４−メチルスルファニル−フェニル）−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミドおよび２−メチル−４−（３−ニトロ−フェニル）−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミドまたはその製薬上許容される塩。

一実施形態では、前記インスリン関連障害は、インスリン抵抗性、耐糖能障害または糖尿病であり、前記モジュレーターは、インバースアゴニストまたはアンタゴニストである。一実施形態では、前記インスリン関連障害はＩＩ型糖尿病である。いくつかの実施形態では、前記インスリン関連障害は、血糖濃度の上昇と関連している状態、例えば、アテローム性動脈硬化症、心疾患、卒中、高血圧症、肥満症、シンドロームＸまたは末梢血管疾患を含む。一実施形態では、前記インバースアゴニストまたはアンタゴニストは以下からなる群より選択される化合物を含む：２−メチル−４−［５−（２−ニトロ−４−トリフルオロメチル−フェニル）−フラン−２−イル］−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミド、４−（５−ビフェニル−２−イル−フラン−２−イル）−２−メチル−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミド、２−メチル−４−［５−（２−ニトロ−フェニル）−フラン−２−イル］−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸（２−クロロ−フェニル）−アミド、２−メチル−５−オキソ−４−（４−フェノキシ−フェニル）−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミド、２−メチル−５−オキソ−４−［５−（２−トリフルオロメトキシ−フェニル）−フラン−２−イル］−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミドおよび４−［５−（２，５−ジクロロ−フェニル）−フラン−２−イル］−２−メチル−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミドまたはその製薬上許容される塩。

一実施形態では、前記方法は、前記個体に、糖尿病、血液脂質障害または肥満症の治療に用いられる薬剤の有効量を、ＧＰＲ４１インバースアゴニストまたはアンタゴニストの有効量と組み合わせて投与する工程をさらに含む。一実施形態では、個体は哺乳類であり、他の実施形態では、個体はヒトである。

本発明は、ＧＰＲ４１機能を増大させることによって治療可能または予防可能な障害を治療または予防することを必要とする個体に、以下からなる群より選択される化合物の有効量を投与する工程を含む、ＧＰＲ４１機能を増大させることによって治療可能または予防可能な障害を治療または予防する方法を提供する：２−メチル−４−（４−ニトロ−フェニル）−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミド、シクロプロパンカルボン酸４−［１，２，３］チアジアゾール−４−イル−フェニルエステル、シクロプロパンカルボン酸；４−フラン−３−イル−２−メチル−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミド、４−フラン−３−イル−２−メチル−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸（２，５−ジクロロ−フェニル）−アミド、４−フラン−２−イル−２−メチル−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミド、４−フラン−３−イル−２−メチル−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸（４−クロロ−フェニル）−アミド、２−メチル−４−（４−メチルスルファニル−フェニル）−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミドおよび２−メチル−４−（３−ニトロ−フェニル）−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミドまたはその製薬上許容される塩。一実施形態では、前記障害は、インスリン関連障害である。いくつかの実施形態では、前記インスリン関連障害は低血糖症、インスリン分泌性もしくはインスリン依存性腫瘍または加齢である。

本発明はまた、ＧＰＲ４１機能を低下させることによって治療可能または予防可能な障害を治療または予防することを必要とする個体に、２−メチル−４−［５−（２−ニトロ−４−トリフルオロメチル−フェニル）−フラン−２−イル］−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミド、４−（５−ビフェニル−２−イル−フラン−２−イル）−２−メチル−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミド、２−メチル−４−［５−（２−ニトロ−フェニル）−フラン−２−イル］−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸（２−クロロ−フェニル）−アミド、２−メチル−５−オキソ−４−（４−フェノキシ−フェニル）−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミド、２−メチル−５−オキソ−４−［５−（２−トリフルオロメトキシ−フェニル）−フラン−２−イル］−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミドおよび４−［５−（２，５−ジクロロ−フェニル）−フラン−２−イル］−２−メチル−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミドまたはその製薬上許容される塩の有効量を投与する工程を含む、ＧＰＲ４１機能を低下させることによって治療可能または予防可能な障害を治療または予防する方法を提供する。一実施形態では、前記障害はインスリン関連障害である。いくつかの実施形態では、前記インスリン関連障害は、インスリン抵抗性、耐糖能障害または糖尿病である。一実施形態では、前記インスリン関連障害はＩＩ型糖尿病である。いくつかの実施形態では、前記インスリン関連障害は、血糖濃度の上昇と関連している状態、例えば、アテローム性動脈硬化症、心疾患、卒中、高血圧症、肥満症、シンドロームＸまたは末梢血管疾患を含む。一実施形態では、前記方法は、前記個体に、糖尿病、血液脂質障害または肥満症の治療に用いられる薬剤の有効量を、有効量のＧＰＲ４１インバースアゴニストまたはアンタゴニストと組み合わせて投与する工程をさらに含む。一実施形態では、個体は哺乳類であり、他の実施形態では、個体はヒトである。

本発明はまた、血糖値を上昇させることを必要とする個体において、血糖値を上昇させる方法であって、個体に有効量のＧＰＲ４１アゴニストを投与する工程を含む方法を提供する。一実施形態では、前記アゴニストは、以下からなる群より選択される化合物を含む：２−メチル−４−（４−ニトロ−フェニル）−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミド、シクロプロパンカルボン酸４−［１，２，３］チアジアゾール−４−イル−フェニルエステル、シクロプロパンカルボン酸；４−フラン−３−イル−２−メチル−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミド、４−フラン−３−イル−２−メチル−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸（２，５−ジクロロ−フェニル）−アミド、４−フラン−２−イル−２−メチル−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミド、４−フラン−３−イル−２−メチル−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸（４−クロロ−フェニル）−アミド、２−メチル−４−（４−メチルスルファニル−フェニル）−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミドおよび２−メチル−４−（３−ニトロ−フェニル）−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミドまたはその製薬上許容される塩。

本発明はまた、血糖値を低下させることを必要とする個体において血糖値を低下させる方法であって、個体に有効量のＧＰＲ４１インバースアゴニストまたはアンタゴニストを投与する工程を含む方法を提供する。一実施形態では、前記インバースアゴニストまたはアンタゴニストは、以下からなる群より選択される化合物を含む：２−メチル−４−［５−（２−ニトロ−４−トリフルオロメチル−フェニル）−フラン−２−イル］−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミド、４−（５−ビフェニル−２−イル−フラン−２−イル）−２−メチル−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミド、２−メチル−４−［５−（２−ニトロ−フェニル）−フラン−２−イル］−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸（２−クロロ−フェニル）−アミド、２−メチル−５−オキソ−４−（４−フェノキシ−フェニル）−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミド、２−メチル−５−オキソ−４−［５−（２−トリフルオロメトキシ−フェニル）−フラン−２−イル］−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミドおよび４−［５−（２，５−ジクロロ−フェニル）−フラン−２−イル］−２−メチル−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミドまたはその製薬上許容される塩。

さらに、本発明は、インスリン分泌を低減させることを必要とする個体において、インスリン分泌を低減させる方法であって、個体に有効量のＧＰＲ４１アゴニストを投与する工程を含む方法を提供する。一実施形態では、前記アゴニストは、以下からなる群より選択される化合物を含む：２−メチル−４−（４−ニトロ−フェニル）−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミド、シクロプロパンカルボン酸４−［１，２，３］チアジアゾール−４−イル−フェニルエステル、シクロプロパンカルボン酸；４−フラン−３−イル−２−メチル−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミド、４−フラン−３−イル−２−メチル−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸（２，５−ジクロロ−フェニル）−アミド、４−フラン−２−イル−２−メチル−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミド、４−フラン−３−イル−２−メチル−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸（４−クロロ−フェニル）−アミド、２−メチル−４−（４−メチルスルファニル−フェニル）−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミドおよび２−メチル−４−（３−ニトロ−フェニル）−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミドまたはその製薬上許容される塩。

本発明はさらに、インスリン分泌を増大させることを必要とする個体においてインスリン分泌を増大させる方法であって、個体に有効量のＧＰＲ４１インバースアゴニストまたはアンタゴニストを投与する工程を含む方法を提供する。一実施形態では、ＧＰＲ４１インバースアゴニストまたはアンタゴニストは、以下からなる群より選択される化合物を含む：２−メチル−４−［５−（２−ニトロ−４−トリフルオロメチル−フェニル）−フラン−２−イル］−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミド、４−（５−ビフェニル−２−イル−フラン−２−イル）−２−メチル−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミド、２−メチル−４−［５−（２−ニトロ−フェニル）−フラン−２−イル］−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸（２−クロロ−フェニル）−アミド、２−メチル−５−オキソ−４−（４−フェノキシ−フェニル）−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミド、２−メチル−５−オキソ−４−［５−（２−トリフルオロメトキシ−フェニル）−フラン−２−イル］−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミドおよび４−［５−（２，５−ジクロロ−フェニル）−フラン−２−イル］−２−メチル−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミドまたはその製薬上許容される塩。

本発明はさらに、インスリン分泌を増大させることを必要とする個体においてインスリン分泌をグルコース依存的に増大させる方法であって、個体に有効量のＧＰＲ４１インバースアゴニストまたはアンタゴニストを投与する工程を含む方法を提供する。一実施形態では、ＧＰＲ４１インバースアゴニストまたはアンタゴニストは、以下からなる群より選択される化合物を含む：２−メチル−４−［５−（２−ニトロ−４−トリフルオロメチル−フェニル）−フラン−２−イル］−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミド、４−（５−ビフェニル−２−イル−フラン−２−イル）−２−メチル−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミド、２−メチル−４−［５−（２−ニトロ−フェニル）−フラン−２−イル］−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸（２−クロロ−フェニル）−アミド、２−メチル−５−オキソ−４−（４−フェノキシ−フェニル）−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミド、２−メチル−５−オキソ−４−［５−（２−トリフルオロメトキシ−フェニル）−フラン−２−イル］−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミドおよび４−［５−（２，５−ジクロロ−フェニル）−フラン−２−イル］−２−メチル−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミドまたはその製薬上許容される塩。

用語「グルコース依存的に」とは、インスリン分泌が、高濃度のグルコースに応じて増大されるが低濃度のグルコースに応じては増大されないことを意味する。糖尿病の治療に用いられているいくつかの薬物は、血中グルコースレベルに関わらずインスリン分泌を増大させる。これは、これらの薬物が低血糖の状態下であってもインスリン分泌を増大させるために望ましくない。インスリンの増大は、次いで、低血糖を、時には重篤なレベルにまでさらに悪化させる。高濃度のグルコースとは、血中、または細胞周辺のグルコース濃度が正常グルコース濃度範囲よりも高いことを意味し、例えば、１６．８ｍｍｏｌ／Ｌは高濃度のグルコースである。低濃度のグルコースとは、血中、または細胞周辺のグルコース濃度が正常グルコース濃度範囲よりも低いこと、例えば、３．３ｍｍｏｌ／Ｌ以下を意味する。

インスリン分泌の細胞の作用機序は、細胞内ｃＡＭＰの増大である。本明細書に開示されるように、ＧＰＲ４１は、膵臓β島細胞で発現される。ＧＰＲ４１はＧｉと共役し、そのため、ＧＰＲ４１のインバースアゴニストまたはアンタゴニストは、膵臓β島細胞においてｃＡＭＰの増大をもたらし、インスリン分泌が増大する。

本発明の１つの目的は、（ａ）血糖安定化化合物を同定するための本発明の方法を実施する、（ｂ）場合により、その化合物の構造を調べる、および（ｃ）化合物または化合物の名称または構造を提供する方法に関する。さらに、本発明は、（ａ）血糖安定化化合物を同定するための本発明の方法を実施する、（ｂ）場合により、その化合物の構造を調べる、（ｃ）場合により、化合物または化合物の名称または構造を提供する、（ｄ）その化合物を製造または合成する方法に関する。本発明はさらに、血糖安定化化合物を同定するための本発明の方法を実施する工程と、ＧＰＣＲを血糖安定化化合物と接触させる工程またはＧＰＣＲの機能性を調節するのに十分な条件下で個体に血糖安定化化合物を投与する工程とを含むＧＰＣＲの機能性を調節するプロセスに関する。

本発明の他の目的は、ヒトをはじめとする組織サンプルにおいてＧＰＲ４１を局在化し、定量化するための、および放射標識化合物の結合を阻害することによってＧＰＲ４１リガンドを同定するための、放射イメージングにおいてだけでなく、イン・ビトロおよびイン・ビボ双方のアッセイにおいても有用である表１または表２の放射標識化合物に関する。このような放射標識化合物を含む新規ＧＰＲ４１アッセイを開発することが、本発明のさらなる目的である。

本発明の化合物に組み込むことができる適切な放射性核種としては、それだけには限らないが、^３Ｈ（Ｔとも書かれる）、^１１Ｃ、^１４Ｃ、^１８Ｆ、^１２５Ｉ、^８２Ｂｒ、^１２３Ｉ、^１２４Ｉ、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ、^７５Ｂｒ、^７６Ｂｒ、^１５Ｏ、^１３Ｎ、^３５Ｓおよび^７７Ｂｒが挙げられる。本放射標識化合物に組み込まれる放射性核種は、その放射標識化合物の具体的な適用に応じて変わる。したがって、イン・ビトロＧＰＲ４１標識および競合アッセイには、通常、^３Ｈ、^１４Ｃ、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ、^３５Ｓまたは^８２Ｂｒを組み込む化合物が最も有用である。放射イメージング適用には、通常、^１１Ｃ、^１８Ｆ、^１２５Ｉ、^１２３Ｉ、^１２４Ｉ、^１３１Ｉ、^７５Ｂｒ、^７６Ｂｒまたは^７７Ｂｒが最も有用である。

「放射標識された」または「標識化合物」とは、少なくとも１種の放射性核種を組み込んでいる表１または表２の化合物であるということは理解される。いくつかの実施形態では、放射性核種は、^３Ｈ、^１４Ｃ、^１２５Ｉ、^３５Ｓおよび^８２Ｂｒからなる群より選択され、いくつかの実施形態では、放射性核種^３Ｈまたは^１４Ｃである。さらに、本発明の化合物中に表されるすべての原子が、そのような原子の最もよく現われる同位元素か、より稀な放射性同位元素または非放射性同位元素のいずれであってもよいということは理解されなければならない。

本発明のそれらの化合物に適用可能なものをはじめとする放射性同位元素を有機化合物に組み込むための合成方法は、当技術分野で周知であり、放射能レベルのトリチウムを標的分子に組み込むことが挙げられ、これとしては以下が挙げられる：Ａ．トリチウムガスを用いる触媒還元−この手順により、通常、高比放射能生成物が得られ、ハロゲン化前駆体または不飽和前駆体が必要である。Ｂ．水素化ホウ素ナトリウム［^３Ｈ］を用いる還元−この手順はかなり安価であり、還元可能な官能基、例えば、アルデヒド、へトン、ラクトン、エステルなどを含む前駆体を必要とする。Ｃ．水素化アルミニウムリチウム［^３Ｈ］を用いる還元−この手順はほとんど理論上の比放射能の生成物を提供する。また。還元可能な官能基、例えば、アルデヒド、ケトン、ラクトン、エステルなどを含む前駆体が必要である。Ｄ．トリチウムガス照射標識−この手順は、交換可能なプロトンを含む前駆体を、適した触媒の存在下でトリチウムガスに曝露することを含む。Ｅ．ヨウ化メチル［^３Ｈ］を用いるＮ−メチル化−この手順は、通常、適当な前駆体を高い比活性のヨウ化メチル（^３Ｈ）で処理することによって、Ｏ−メチルまたはＮ−メチル（^３Ｈ）生成物を調製するために用いられる。通常、この方法によって、高い比活性、例えば、約８０〜８７Ｃｉ／ｍｍｏｌが可能となる。

放射能レベルの^１２５Ｉを標的分子に組み込む合成方法はとしては、以下が挙げられる：Ａ．ザントマイヤーおよび同様の反応−この手順によって、アリールまたはヘテロアリールアミンがジアゾニウム塩、例えば、テトラフルオロボレート塩に、続いて、Ｎａ^１２５Ｉを用いて^１２５Ｉ標識化合物に変換される。代表される手順が、Ｚｈｕ，Ｄ．−Ｇ．と共同研究者によって、Ｊ．Ｏｒｅ．Ｃｈｅｍ．６７：９４３−９４８（２００２））に報告された。Ｂ．フェノールのオルト^１２５ヨウ素化−この手順により、Ｃｏｌｌｉｅｒ，Ｔ．Ｌおよび共同研究者によって、Ｊ．ＬａｂｅｌｌｅｄＣｏｍｐｄＲａｄｉｏｐｈａｒｍ．，４２：Ｓ２６４−Ｓ２６６（１９９９））に報告されるように、フェノールのオルト位置での^１２５Ｉの組み込みが可能となる。Ｃ．^１２５Ｉを用いるアリールおよびヘテロアリールブロミド交換−この方法は、通常、二段プロセスである。第１の工程は、例えば、トリアルキルスズハライドまたはヘキサアルキル二スズ［例えば、（ＣＨ_３）_３ＳｎＳｎ（ＣＨ_３）_３］の存在下、Ｐｄ触媒反応［すなわち、Ｐｄ（Ｐｈ_３Ｐ）_４］を用いるか、またはアリールもしくはヘテロアリールリチウムによる、アリールまたはヘテロアリールブロミドの対応するトリアルキルスズ中間体への変換である。代表される手順が、Ｂａｓ，Ｍ．−Ｄおよび共同研究者によってＪ．ＬａｂｅｌｌｅｄＣｏｍｐｄＲａｄｉｏｐｈａｍｕ．，４４：Ｓ２８０−Ｓ２８２（２００１））に報告された。

表１または表２の放射標識ＧＰＲ４１化合物は、化合物を同定／評価するためのスクリーニングアッセイに使用できる。一般論として、新規に合成または同定される化合物（すなわち、候補化合物）は、表１または表２の放射標識化合物の、ＧＰＲ４１受容体との結合を減少させるその能力について評価できる。したがって、候補化合物の、「表１または表２の放射標識化合物」と、ＧＰＲ４１受容体との結合について競合する能力は、その結合親和性と直接の相関がある。

本発明の一態様は、治療によってヒトまたは動物の身体を治療する方法において使用するための、本明細書における方法によって同定される血糖安定化化合物に関する。

本発明の他の態様は、治療によってヒトまたは動物の身体の、インスリン関連障害を治療する方法において使用するための、本明細書における方法によって同定される血糖安定化化合物に関する。本発明の他の態様は、インスリン関連障害を治療する方法であって、前記症状を患う被験体に、本明細書における方法によって同定される血糖安定化化合物の治療上有効な量を投与する工程を含む方法に関する。

本発明の一態様は、インスリン関連障害を治療する方法であって、前記症状を患う被験体に、本明細書における方法によって同定される血糖安定化化合物の治療上有効な量を、例えば、薬剤組成物の形で投与する工程を含む方法に関する。本発明の他の態様は、治療によるヒトまたは動物の身体のインスリン関連障害を治療する方法において使用するための、本明細書における方法によって同定される血糖安定化化合物に関する。

出願人らは、本発明の実施形態のいずれかから１種以上の候補化合物のいずれかを排除する権利を留保する。出願人らはまた、本発明の実施形態のいずれかから１種以上のモジュレーターのいずれかを排除する権利を留保する。出願人らは、本発明の実施形態のいずれかから、インスリン関連障害のいずれか、または血糖濃度の上昇と関連している症状のいずれかを排除する権利をさらに留保する。

開示される受容体および方法のその他の使用は、とりわけ、本特許文書の概説に基づいて当業者に明らかとなる。

以下の実施例は、本発明を例示するために示すものであって、いずれかの方法に含まれるよう意図されない。

実施例は本発明をさらに明確にするために提供するが、本発明をこれらの実施例の細目に制限するものではない。

（実施例１）
ヒト成人および胎児組織におけるヒトＧＰＲ４１発現のドットブロット解析
この実施例では、ヒトＧＰＲ４１の発現レベルを、ドットブロットを用いていくつかのヒト成人および胎児組織において調べた。

ヒト成人および胎児組織ｍＲＮＡを含むドットブロットは、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，ＰａｌｏＡｌｔｏ，ＣＡ）から購入した。ブロット上の組織ｍＲＮＡの順序は以下である：Ａ１＝全脳、Ａ２＝扁桃体、Ａ３＝尾状核、Ａ４＝小脳、Ａ５＝大脳皮質、Ａ６＝前頭皮質、Ａ７＝海馬、Ａ８＝延髄、Ｂ１＝後頭皮質、Ｂ２＝被殻、Ｂ３＝黒質、Ｂ４＝側頭皮質、Ｂ５＝視床、Ｂ６＝側坐核、Ｂ７＝脊髄、Ｃ１＝心臓、Ｃ２＝大動脈、Ｃ３＝骨格筋、Ｃ４＝結腸、Ｃ５＝膀胱、Ｃ６＝子宮、Ｃ７＝前立腺、Ｃ８＝胃、Ｄ１＝精巣、Ｄ２＝卵巣、Ｄ３＝膵臓、Ｄ４＝下垂体、Ｄ５＝副腎、Ｄ６＝甲状腺、Ｄ７＝唾液腺、Ｄ８＝乳腺、Ｅ１＝腎臓、Ｅ２＝肝臓、Ｅ３＝小腸、Ｅ４＝脾臓、Ｅ５＝胸腺、Ｅ６＝末梢白血球、Ｅ７＝リンパ節、Ｅ８＝骨髄、Ｆ１＝虫垂、Ｆ２＝肺、Ｆ３＝気管、Ｆ４＝胎盤、Ｇ１＝胎児脳、Ｇ２＝胎児心臓、Ｇ３＝胎児腎臓、Ｇ４＝胎児肝臓、Ｇ５＝胎児脾臓、Ｇ６＝胎児胸腺、Ｇ７＝胎児肺。ブロットは、Ｃｌｏｎｔｅｃｈによって推奨される条件下でＣｌｏｎｔｅｃｈ「ＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ」を用いてＧＰＲ４１プローブとハイブリダイズさせた。

（実施例２）
マウス組織および細胞におけるＧＰＲ４１発現のＲＴ−ＰＣＲおよびタックマン（Ｔａｑｍａｎ）解析
この実施例では、マウスＧＰＲ４１の発現レベルを、ＲＴ−ＰＣＲアッセイおよびタックマン（Ｔａｑｍａｎ）定量的ＰＣＲアッセイを用い、いくつかのマウス細胞種および組織において調べた。図２で示されるように、マウスＧＰＲ４１の最高レベルの発現は膵臓および膵島細胞において観察された。さらに、図２で示されるように、ＧＰＲ４１は、野生型およびｏｂ／ｏｂマウスと比較して、ｄｂ／ｄｂマウス由来の膵島においてアップレギュレートされた。

マウス組織におけるＧＰＲ４１発現を、以下のプライマーを用いるＲＴ−ＰＣＲによって評価した：

および

マウス組織ｃＤＮＡは、ＢｉｏＲａｄｉＳｃｒｉｐｔｃＤＮＡ合成キットを用い、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから購入した市販のポリＡＲＮＡから合成した。インスリン産生膵臓β細胞株（ＮＩＴ−１、βＴＣ−６およびＭＩＮ−６）をはじめとするマウス細胞株由来のｃＤＮＡは、トリアゾール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて単離した全ＲＮＡから調製した。

図２の下部パネルに示されるタックマン（Ｔａｑｍａｎ）定量的ＰＣＲ実験のために、５ｍＬのポリプロピレン試験管中に、１×タックマン（Ｔａｑｍａｎ）スーパーミックスを作製した。フォワードおよびリバースプライマーを加え、３００ｎＭ最終濃度とし、適当量のプローブを加えて最終濃度２００ｎＭとした。ウェルあたりの総容量は２０μＬであった。２μＬはｃＤＮＡとし、その他の１８μＬはスーパーミックスおよびヌクレアーゼ不含水とした。

プライマーはＰｒｏｌｉｇｏに発注し、プローブはＡＢＩによって合成した。プライマーおよびプローブの配列は以下である。

用いたサーモサイクラー条件を、以下の表（表３）に示す。

^＊５０℃で２分維持は、最適なＡｍｐＥｒａｓｅＵＮＧ活性にとって必要である。
^＊＊９５℃で１０分維持は、ＡｍｐｌｉＴａｑＧｏｌｄＤＮＡポリメラーゼ活性化にとって必要である。

（実施例３）
マウスＧＰＲ４１ＲＮアーゼ保護アッセイ
この実施例では、マウスＧＰＲ４１の発現レベルを、ＲＮアーゼ保護アッセイを用い、いくつかのマウス細胞種および組織において調べた。図３で示されるように、マウスＧＰＲ４１の最高レベルの発現は、膵島、およびＭＩＮ６、マウスインスリノーマ細胞株、ＮＩＴ−１およびβＴＣ−６をはじめとする膵島細胞株において観察された。

マウス組織ＲＮＡは商業的に入手した（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）。ＲＮＡ単離に用いた細胞（図中に示される）は、ＡＴＣＣによって提供される膵臓細胞株（ＮＩＴ−１：ＡＴＣＣＣＲＬ−２０５５およびβＴＣ−６：ＡＴＣＣＣＲＬ−１１５０６）であるか、ＳｔｏｎｙＢｒｏｏｋのＳＵＮＹのＪｅｆｆｒｅｙＰｅｓｓｉｎから入手した（ＭＩＮ−６）。ＲＮＡはトリアゾール試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、製造業者の使用説明書に従って単離した。

手短に言えば、マウスＧＰＲ４１の２５７ｂｐ断片を、ｐＣＲＩＩＴＯＰＯクローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングした。プラスミドを、Ｘｈｏ１を用いて線状化し、ＳｅｐｈａｇｌａｓｓＢａｎｄｐｒｅｐキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いてゲル精製した。断片をゲル精製した後、ＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼを用いるイン・ビトロ転写によってリボプローブを作製した（ＡｍｂｉｏｎＭａｘｉｓｃｒｉｐｔキット）。プローブをアクリルアミドゲル電気泳動によって精製し、２０μｇの全ＲＮＡと４７℃で一晩ハイブリダイズした。翌日、ハイブリッドを、Ｒｎアーゼで消化し、５％アクリルアミドゲルに流し、結果を検出した（Ａｍｂｉｏｎ，ＲＰＡＩＩＩキット）。イン・ビトロ転写およびＲＰＡ反応のすべての手順は、製造業者の使用説明書に従った。

ＲＰＡプローブについてのマウスＧＰＲ４１配列

ＲＰＡプローブについてのマウスＧＰＲ４１プライマー

（実施例４）
ＧＰＲ４１のＧ−アルファｉ共役
この実施例では、ＧＰＲ４１の、Ｇ−アルファｉ（Ｇαｉ）との共役を、ＧｑＧｉキメラを用いて調べた。ＧＰＲ４１の機能は、以下に記載するようにＩＰ３アッセイを用いて測定した。

Ｇｑ／ＧｉでトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞において発現されるＧＰＲ４１のＩＰ３アッセイ
細胞内ＩＰ３蓄積アッセイを、ＧＲＰ４１およびＧｑ／Ｇｉキメラの双方のための発現プラスミドで一過性にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞を用いて実施した（Ｇｑ／Ｇｉキメラの構造については、実施例１３を参照のこと）。このアッセイのためにトランスフェクションに用いたＤＮＡは、哺乳類発現ベクターｐＣＭＶにクローニングされたＧＰＲ４１およびＧＰＲ４１（ｋ）、ならびに発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングされたＧｑ／ＧｉキメラｃＤＮＡであった。ＧＰＲ４１（ｋ）は、アミノ酸２２４がリジンに突然変異しているＧＰＲ４１の単一アミノ酸変異である。

トランスフェクションはリポフェクタミントランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、製造業者の推奨に従って実施した。手短に言えば、１日目に細胞を９６ウェルプレートに３×１０^６個細胞／プレートの密度でプレーティングした。翌日、各プレートのＤＮＡ／リポフェクタミン混合物を以下の通りに調製した：ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）２５μＬ中、３ウェルあたり１μＬのＤＮＡ（４０ｎｇのｐＣＭＶ−ＧＰＲ４１）または２μＬのＤＮＡ（２０ｎｇのｐｃＤＮＡ−Ｇｑ／Ｇｉと混合したｐＣＭＶ−ＧＰＲ４１）を、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ２５μＬ中、２μＬのリポフェクタミン試薬と穏やかに混合し、得られた溶液を室温で３０分間インキュベートした。ＯＰＴＩ−ＭＥＭ９６μＬを最終容積１５０μＬとなるよう添加した。次いで、細胞を１００μＬ／ウェルのＰＢＳで１回洗浄し、次いで、ＤＮＡ−リポフェクタミン混合物をプレートに穏やかに加えた（５０μＬ／ウェル）。次いで、細胞を、５％ＣＯ_２を含む加湿雰囲気中、３７℃で４時間インキュベートした。トランスフェクション試薬に通常の細胞培地を加えた。次いで、細胞を３７℃／５％ＣＯ_２で一晩インキュベートした。

３日目に、ウェルから通常の増殖培地を注意深く除去し、０．４ｕＣｉの［^３Ｈ］−ミオ−イノシトール（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を含有するイノシトール不含／血清不含ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）１００μＬで置換した。細胞を、５％ＣＯ_２を用いて３７℃で一晩インキュベートした。４日目に、［^３Ｈ］−ミオ−イノシトール含有標識培地を除去し、１０μＭパルギリン（Ｓｉｇｍａ）および１０ｍＭ塩化リチウム（Ｓｉｇｍａ）を含有するイノシトール不含／血清不含ＤＭＥＭ１００μＬで置換した。細胞を３７℃／５％ＣＯ_２で１時間インキュベートした。次いで、溶液を注意深く除去し、ウェルあたり１６０μＬの氷冷０．１Ｍギ酸を細胞に加えた。プレートを−８０℃で少なくとも１時間インキュベートすることによって細胞を溶解した。

ＡＧ１−Ｘ８ホルメート樹脂（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）でのクロマトグラフィーを用いて細胞溶解物からのＩＰ３の分離を実施した。Ｍｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎフィルタープレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）の各ウェルあたり、４００μＬのホルメート樹脂スラリー（水１ｍＬ中、０．１ｇの樹脂）を加えた。ウェルから水を抜き、次いで、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ濾過ユニットを用いて樹脂を２００μＬの水で洗浄した。溶解した細胞を含むプレートを解凍し、溶解物を、ホルメート樹脂を含むＭｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎフィルタープレートに移した。プレートを室温で１０分間インキュベートし、次いで、濾過ユニットを用いフィルタープレートから溶解物の水を抜いた。プレートを水９２００μＬ／ウェル）で４回洗浄し、完全に水を抜いた。次いで、樹脂に溶出バッファーを加え（１８０μＬ／ウェル）、プレートを室温で５分間インキュベートした。溶出液を、真空マニホールドを用いて９６ウェルコレクションプレートに流し入れ、ＯｐｔｉｐｈａｓｅＨｉＳａｆｅ３シンチレーションカクテル（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）５ｍｌを含むシンチレーションバイアルに移し、Ｗａｌｌａｃシンチレーションカウンターでカウントした。

（実施例５）
ＧＰＲ４１のＧ−アルファ１２／１３共役
この実施例では、ＧＰＲ４１の、Ｇ−アルファ１２／１３（Ｇα１２／１３）との共役を、以下に記載されるｃＡＭＰアッセイを用いて調べた。

手短に言えば、以下の通りに実験を実施した：Ｘ軸に示される、示したＣＭＶによって駆動される発現プラスミドを、以下のキメラのうちの１種とともに用いて、２９３細胞をトランスフェクトした：（ａ）「対照」：親ＣＭＶ発現プラスミド、（ｂ）「Ｇｓ／Ｇ１２キメラ」：Ｃ末端の１１個のアミノ酸をＧ１２のＣ末端の対応するものと入れ替えたヒトＧｓをコードするＣＭＶ−Ｇｓ／Ｇ１２プラスミド、または（ｃ）「Ｇｓ／Ｇ１３キメラ」：Ｃ末端の１１個のアミノ酸をＧ１３のＣ末端の対応するものと入れ替えたヒトＧｓをコードするＣＭＶ−Ｇｓ／Ｇ１３プラスミド。２４時間後、ｃＡＭＰレベルについて、以下に記載される「ＦｌａｓｈＰｌａｔｅ」キットを用いて細胞を分析した。

細胞ベースのアッセイのために設計された、ＦｌａｓｈＰｌａｔｅ（商標）アデニリルシクラーゼキット（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＮｕｃｌｅａｒ；カタログ番号ＳＭＰ００４Ａ）を、粗原形質膜を用いて使用するために改変した。ＦｌａｓｈＰｌａｔｅウェルは、シンチラントコーティングを含み、これはまたｃＡＭＰを認識する特異的抗体も含んでいた。ウェル中に生じたｃＡＭＰを、放射活性ｃＡＭＰトレーサーの、ｃＡＭＰ抗体との結合についての直接競合によって定量化した。以下は、ＧＰＲ４１を発現する全細胞においてｃＡＭＰレベルの変化を測定するための簡単なプロトコールである。

トランスフェクトされた細胞を、一過性トランスフェクションの約２４時間後に回収した。培地を注意深く吸引して除去し、廃棄した。５ｍｌの細胞解離バッファーを各プレートに加えた。細胞をプレートからピペットで取り出し、細胞懸濁液を５０ｍｌのコニカル遠心管に回収した。次いで、細胞を室温、１，１００ｒｐｍで５分間遠心分離した。細胞ペレットを、１／２容積のＰＢＳおよび１／２容積の刺激バッファーからなる適当な容積のアッセイバッファー（約３ｍｌ／プレート）に注意深く再懸濁した。次いで、血球算定器を用いて細胞をカウントし、さらなるアッセイバッファーを、適当な数の細胞となるよう加えた（最終容積約５０μｌ／ウェル）。

ｃＡＭＰ標準および検出バッファー（１１ｍｌの検出バッファーに対して１μＣｉのトレーサー［^１２５Ｉ］ｃＡＭＰ（５０μｌ）を含む）を、製造業者の使用説明書に従って調製、維持した。適当なウェルに５０μｌのｃＡＭＰ標準を加え、続いて、９６ウェルプレートのウェルＨ１１およびＨ１２に５０μｌのＰＢＳを加えることによってアッセイを開始した。すべての標準ウェルに５０ｍｌの刺激バッファーを加えた。適当なウェルに細胞を加えた。ホルスコリンをアッセイバッファーで２×ストックに希釈し、次いで、５０μｌ／ウェルで細胞に加え、室温で６０分間インキュベートした。トレーサーｃＡＭＰを含有する１００μｌの検出ミックスをウェルに加えた。次いで、プレートをさらに２時間インキュベートし、続いて、ＷａｌｌａｃＭｉｃｒｏＢｅｔａシンチレーションカウンターにおいてカウントした。次いで、各アッセイプレート内に含まれる標準ｃＡＭＰ曲線からｃＡＭＰ／ウェルの値を推定した。

（実施例６）
ＧＰＲ４１モジュレーターの同定
この実施例では、ＧＰＲ４１アゴニストを、アフリカツメガエルメラノフォアにおいてスクリーニングプロトコールを用いて同定した。

メラノフォア技術
メラノフォアは、下等脊椎動物において見られる皮膚細胞である。それらはメラノソームと呼ばれる色素性オルガネラを含む。メラノフォアは、Ｇ−タンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）活性化の際に、これらのメラノソームを微小管ネットワークに沿って再分配できる。この色素移動の結果は、細胞の外見が明るくなることまたは暗くなることである。メラノフォアでは、Ｇｉ共役受容体の活性化に起因する細胞内ｃＡＭＰレベルの低下が、メラノソームを細胞の中心へ移動させ、その結果、色が劇的に明るくなる。次いで、ｃＡＭＰレベルが上がると、Ｇｓ共役受容体の活性化に続いて、メラノソームが再分配され、細胞が再度暗く見える。Ｇｑ共役受容体の活性化に起因するジアシルグリセロールレベルの上昇もまた、この再分配を誘導し得る。さらに、この技術は特定の受容体チロシンキナーゼの研究にも適している。メラノフォアの応答は、受容体活性化の数分内に起こり、単純な、確固たる色の変化をもたらす。この応答は、従来の吸光度マイクロプレートリーダーまたは中程度のビデオイメージングシステムを用いて容易に検出できる。メラノフォアは、その他の皮膚細胞とは異なり、神経冠に由来し、シグナル伝達タンパク質の完全補体を発現するようである。特に、この細胞は、極めて広範囲のＧタンパク質を発現し、その結果、ほとんどすべてのＧＰＣＲを機能的に発現できる。

メラノフォアを利用して、化合物、例えば、ＧＰＣＲと結合し、かつ／またはＧＰＣＲを活性化する天然リガンドを同定できる。この方法は、特異的な刺激に応じて、その色素を分散または凝集できる色素細胞株の試験細胞を導入することと、ＧＰＣＲをコードする外来クローンを発現させることとによって実施できる。色素配置の初期状態は、例えば、メラトニン、ＭＳＨまたは光を用いて設定できる。次いで、試験細胞をキメラ化合物と接触させ、細胞における色素配置が、色素配置の初期状態から変化したかどうかを調べる。候補化合物、例えば、それだけには限らないが、ＧＰＣＲと共役しているリガンドによる色素細胞の分散は、ペトリディッシュ上で暗く見え、他方、色素細胞の凝集は明るく見える。

材料および方法は、米国特許第５，４６２，８５６号および米国特許第６，０５１，３８６号の開示内容に従い、以下の通りである。これらの特許開示内容は参照によりその全文が本明細書に組み込まれる。

メラノフォアを、ヒトＧＰＲ４１のコード配列を含むプラスミドを用いてエレクトロポレーションによってトランスフェクトした。この細胞を９６ウェルプレートにプレーティングした。トランスフェクションの４８時間後、各プレートの細胞の半分を、１０ｎＭメラトニンで処理した。メラトニンは、メラノフォアにおいて内因性Ｇｉ共役受容体を活性化し、それらにその色素を凝集させる。残りの半分の細胞を血清不含培地０．７ＸＬ−１５（Ｇｉｂｃｏ）に移した。１時間後、血清不含培地中の細胞は色素が分散された状態のままであったが、メラトニン処理した細胞は色素が凝集した状態であった。この時点で、１４０，０００〜１５０，０００種の有機小分子化合物を含む専売化合物ライブラリーに由来する種々の化合物で細胞を処理した。ＧＲＰ４１が化合物と結合する場合には、メラノフォアは、化合物に応じて色の変化を受けると期待される。受容体はＧｉと共役できるので、色素が分散された細胞は用量依存的な色素凝集を受けた。

（実施例７）
Ｇｑ／Ｇｉ同時トランスフェクト細胞におけるＧＰＲ４１アゴニストの有効性
この実施例では、キメラＧアルファＧｑ／Ｇｉを用いて同時トランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞において、選択したＧＰＲ４１アゴニスト２−メチル−４−（４−ニトロ−フェニル）−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミド（図６中、ＣＰＤ１）およびシクロプロパンカルボン酸４−［１，２，３］チアジアゾール４−イル−フェニルエステル（図５中、ＣＰＤ２）の有効性を試験した。

トランスフェクションは、リポフェクタミントランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、製造業者の推奨に従って実施した。手短に言えば、１日目に、細胞を、４×１０^６個細胞／プレートという密度で９６ウェルプレートにプレーティングした。翌日、各プレートのＤＮＡ／リポフェクタミン混合物を以下の通りに調製した：ＤＭＥ（Ｇｉｂｃｏ）２００μＬ中、８ウェルあたり２．５μＬのＤＮＡ（２５０ｎｇのｐＣＭＶ−ＧＰＲ４１またはｐＣＭＶブランクベクター）および２．５μＬのＤＮＡ（２５０ｎｇのｐｃＤＮＡ３．１−Ｇｑ／Ｇｉ）を、ＤＭＥ２００μＬ中、２．５μＬのリポフェクタミン試薬と穏やかに混合し、得られた溶液を室温で３０分間インキュベートした。増殖培地を細胞から吸引して除去し、５５μｌ／ウェルのＤＭＥを加えた。次いで、ＤＮＡ−リポフェクタミン混合物を、プレートに穏やかに加えた（４５μＬ／ウェル）。次いで、細胞を、５％ＣＯ_２を含む加湿雰囲気下、３７℃で４時間インキュベートした。トランスフェクション試薬に通常の細胞増殖培地を加えた。次いで、細胞を３７℃／５％ＣＯ_２で一晩インキュベートした。

３日目に、ウェルから通常の増殖培地を注意深く除去し、０．４ｕＣｉの［^３Ｈ］−ミオ−イノシトール（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を含有するイノシトール不含／血清不含ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）１００μＬで置換した。細胞を、５％ＣＯ_２を用いて３７℃で一晩インキュベートした。４日目に、［^３Ｈ］−ミオ−イノシトール含有標識培地を除去し、１０μＭパルギリン（Ｓｉｇｍａ）および１０ｍＭ塩化リチウム（Ｓｉｇｍａ）を含有し、化合物を含むか含まないイノシトール不含／血清不含ＤＭＥＭ１００μＬで置換した。細胞を３７℃／５％ＣＯ_２で１時間インキュベートした。次いで、溶液を注意深く除去し、ウェルあたり１６０μＬの氷冷０．１Ｍギ酸を細胞に加えた。プレートを−８０℃で少なくとも１時間インキュベートすることによって細胞を溶解した。

ＡＧ１−Ｘ８ホルメート樹脂（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）でのクロマトグラフィーを用いて細胞溶解物からのＩＰ３の分離を実施した。Ｍｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎフィルタープレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）の各ウェルあたり、４００μＬのホルメート樹脂スラリー（水１ｍＬ中、０．１ｇの樹脂）を加えた。ウェルから水を抜き、次いで、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ濾過ユニットを用いて樹脂を２００μＬの水で洗浄した。溶解した細胞を含むプレートを解凍し、溶解物を、ホルメート樹脂を含むＭｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎフィルタープレートに移した。プレートを室温で１０分間インキュベートし、次いで、濾過ユニットを用いフィルタープレートから溶解物の水を抜いた。プレートを水（２００μＬ／ウェル）で４回洗浄し、完全に水を抜いた。次いで、樹脂に溶出バッファーを加え（１８０μＬ／ウェル）、プレートを室温で５分間インキュベートした。溶出液を、真空マニホールドを用いて９６ウェルコレクションプレートに流し入れ、６０μｌをＷｈａｔｍａｎＵｎｉｆｉｌｔｅｒＧＦ／Ｃ９６ウェルプレート（ＰｅｒｋｉｎＥｌｅｍｅｒ１４５０−５２５）に移し、５０μｌのＯｐｔｉｍａＧｏｌｄ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を加えた。カウントはＷａｌｌａｃシンチレーションカウンターで実施した。

（実施例８）
ＧＰＲ４１アゴニストは、ＭＩＮ６インスリノーマ細胞におけるインスリン分泌を阻害する
この実施例では、選択したＧＰＲ４１アゴニスト、シクロプロパンカルボン酸（ＣＰＣ）を、インスリノーマ細胞株におけるインスリン分泌に対するその効果についてアッセイした。

マウスインスリノーマ株、ＭＩＮ６を、マルチウェル組織培養ディッシュにプレーティングし、１５％ウシ胎児血清を補給したダルベッコの最小必須培地（ＤＭＥＭ）で２日間培養した。この細胞を低グルコース（１０ｍｇ／ｄｌ）クレブス−リンガー重炭酸塩バッファー中でリンスし、数時間断食状態におき、その後、３００ｍｇ／ｄｌグルコースおよび対象の化合物：グルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ−１）およびシクロプロパンカルボン酸（ＣＰＣ）を用いて３０分のチャレンジを行った。ＧＬＰ−１、７−３６アミド、インスリン分泌の既知阻害剤は、Ｓｉｇｍａから購入し、２５ｎＭ濃度で用い、ＣＰＣはＡｌｄｒｉｃｈから購入し、５μＭまたは１μＭで使用した。グルコースのみ（１０ｍｇ／ｄｌと３００ｍｇ／ｄｌの双方）を含む対照ウェルは比較のために流した。グルコースチャレンジから得た上清を回収し、凍結した。これらは、インスリンについてＥＬＩＳＡ（ＣｒｙｓｔａｌＣｈｅｍ，Ｉｎｃ）によって評価した。

（実施例９）
経口ブドウ糖負荷試験
アゴニスト、アンタゴニストまたはインバースアゴニストなどのＧＰＲ４１モジュレーターは、経口グルコース投与が試験された後の血漿グルコースに対するその効果について試験できる。

例えば、６７日齢の雄のＣ５７ｂｌ／６マウスを１８時間断食させ、無作為にグループ化し、選択した用量のＧＰＲ４１モジュレーターで、またはビヒクル（８０％ＰＥＧ、１０％Ｔｗｅｅｎ８０および１０％エタノールを含むＰＥＴ）を与えることができる。ＧＰＲ４１モジュレーターは、経管栄養ニードル（経口、１００μｌの容量）を介して経口的に送達する。ＧＰＲ４１モジュレーターまたはビヒクルの投与の３０分後、マウスに、デキストロースを３ｇ／ｋｇ用量で経口投与する。血糖のレベルは、ＧｌｕｃｏｍｅｔｅｒＥｌｉｔｅＸＬ（Ｂａｙｅｒ）を用いて数回の時点で測定する。

グルコース耐性はまた、グルコースの腹腔内送達を用いて試験できる。例えば、６８日齢の雄のＣ５７Ｂ１／６マウスを、１８時間断食させた後、１００ｍｇ／ｋｇのＧＰＲ４１モジュレーターで、またはＰＥＴビヒクルで処理する。ＧＰＲ４１モジュレーターまたはビヒクルの投与の３０分後、マウスにデキストロースを２ｇ／ｋｇ用量で腹腔内投与する。選択した時点でＧｌｕｃｏｍｅｔｅｒＥｌｉｔｅＸＬ（Ｂａｙｅｒ）を用いて血糖のレベルを測定する。

（実施例１０）
ＧＰＲ４１アゴニストは、経口ブドウ糖負荷試験（ｏＧＴＴ）を低下させる化合物の有益な効果を逆転させる
ｏＧＴＴにおいて血糖を低下させる効果を有する化合物、２００４年１月１４日に出願されたＷＯ２００４／０６５３８０Ａ１では化合物Ｂ１１１と呼ばれる、（２−フルオロ−４−メタンスルホニル−フェニル）−｛６−［４−（３−イソプロピル−［１，２，４］オキサジアゾール−５−イル）−ピペリジン−ｌ−イル］−５−ニトロ−ピリミジン−４−イル｝−アミンを単独か、または本明細書に開示されるＧＰＲ４１アゴニスト化合物４とともに用いた。図８に示されるように、ＧＰＲ４１アゴニストは、化合物Ｂ１１１の血糖低下効果を逆転させ、血漿グルコースの上昇を引き起こした。これらの結果は、ＧＰＲ４１アンタゴニストまたはインバースアゴニストは血糖低下効果を有し得るということを示す。

ｏＧＴＴのために、雄のＣ５７ｂｌ／６マウスを約１８時間断食させ、無作為にグループ化し、図８に示される化合物を示した用量で、またはビヒクル（８０％ＰＥＧ、１０％Ｔｗｅｅｎ８０および１０％エタノールを含むＰＥＴ）を与えた。示した化合物は、経管栄養ニードル（経口、１００μｌの容量）を介して経口的に送達した。化合物（類）またはビヒクルの投与の３０分後、マウスに、デキストロースを３ｇ／ｋｇ用量で経口投与した。ＧｌｕｃｏｍｅｔｅｒＥｌｉｔｅＸＬ（Ｂａｙｅｒ）を用いて数回の時点で血糖のレベルを測定した。

（実施例１１）
化合物合成
本明細書に開示される化合物は市販されているか、または当技術分野で公知の手順によって調製した。例えば、化合物１［すなわち、２−メチル−４−（４−ニトロ−フェニル）−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミド］は、ＡＳＩＮＥＸＬｔｄ．５ＧａｂｒｉｃｈｅｖｓｋｏｇｏＳｔ．Ｂｌｄｇ８，Ｍｏｓｃｏｗ１２３３６７，Ｒｕｓｓｉａから購入し、化合物２（シクロプロパンカルボン酸４−［１，２，３］チアジアゾール４−イル−フェニルエステル）は、Ｔｒｉｐｏｓ，Ｉｎｃ．，１６９９ＳｏｕｔｈＨａｎｌｅｙＲｏａｄ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ６３１４４−２３１９から購入し、化合物３（シクロプロパンカルボン酸）は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，３０５０ＳｐｒｕｃｅＳｔ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ６３１０３から購入した。化合物４〜９は、当技術分野で公知の方法、例えば、Ｃａｒｒｏｌｌ，ら、ＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｅｄｉｃｉｎａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ４７：３１８０−３１９２（２００４）によって本質的に記載されるジヒドロピリジンの３成分Ｈａｎｔｚｓｃｈジヒドロピリジン合成（例えば、化合物をイソプロパノール中で１８〜３６時間還流に加熱すること）によって調製した。本発明の特定の化合物を調製するための一般的な反応スキームを以下に示す：

本明細書に開示される特定の化合物はまた、カップリング工程、例えば、スズキカップリング工程を必要とした。スズキカップリング反応は、当技術分野では周知であり、種々の条件および変法、例えば、Ｓｎｉｅｃｋｕｓ，ら、ＪｏｕｒｎａｌｏｆＯｒｇａｎｉｃＣｈｅｍｉｓｔｒｙ５６：３７６３−３７６８（１９９１）による手順が報告されている。一般的な反応を以下に示す：

（実施例１２）
ＧＰＣＲ活性化を調べるためのアッセイ
ヒトＧＰＣＲの活性化を評価するためには種々のアプローチが利用可能である。以下は例示的なものであり、当業者ならば、技術者の必要性にとって優先的に有益である技術を調べる能力があると考えられる。

１．膜結合アッセイ：［^３５Ｓ］ＧＴＰγＳアッセイ
Ｇタンパク質共役受容体が活性状態にある場合には、リガンド結合または構成的活性化のいずれかの結果として、受容体はＧタンパク質と共役し、ＧＤＰの放出とその後のＧＴＰのＧタンパク質への結合とを刺激する。Ｇタンパク質受容体複合体のαサブユニットは、ＧＴＰアーゼとして作用し、ＧＴＰをＧＤＰに穏やかに加水分解し、通常、その時点で、受容体は不活性化される。活性化された受容体は、ＧＤＰをＧＴＰと交換し続ける。加水分解可能でないＧＴＰ類似体、［^３５Ｓ］ＧＴＰγＳを利用して、［^３５Ｓ］ＧＴＰγＳの、活性化された受容体を発現する膜との結合の増強を実証できる。活性化を測定するために［^３５Ｓ］ＧＴＰγＳ結合を用いることの利点は、（ａ）すべてのＧタンパク質共役受容体に一般的に適用できる、（ｂ）膜表面で近位にあり、これによって細胞内カスケートに影響を及ぼす分子をあまり拾い上げないということである。

このアッセイは、［^３５Ｓ］ＧＴＰγＳの、関連受容体を発現する膜との結合を刺激するＧタンパク質共役受容体の能力を利用する。したがって、このアッセイは、候補化合物を、内因性ＧＰＣＲおよび非内因性の構成的に活性化されたＧＰＣＲに対してスクリーニングする直接同定法において使用できる。このアッセイは一般的なものであり、すべてのＧタンパク質共役受容体での薬物発見に適用される。

［^３５Ｓ］ＧＴＰγＳアッセイは、２０ｍＭＨＥＰＥＳおよび１〜約２０ｍＭの間のＭｇＣｌ_２（この量は結果の最適化のために調整できるが、２０ｍＭが好ましい）ｐＨ７．４、約０．３〜約１．２ｎＭの間の［^３５Ｓ］ＧＴＰγＳ（この量は結果の最適化のために調整できるが、１．２が好ましい）を含む結合バッファーおよび１２．５〜７５μｇの膜タンパク質（例えば、ＧＰＲ４１を発現する２９３細胞；この量は結果の最適化のために調整できる）および１０μＭＧＤＰ（この量は最適化のために変更できる）中で１時間インキュベートする。次いで、コムギ胚芽凝集素ビーズ（２５μｌ；Ａｍｅｒｓｈａｍ）を加え、混合物をさらに３０分間室温でインキュベートした。次いで、試験管を１５００×ｇで５分間、室温で遠心分離し、次いで、シンチレーションカウンターにおいてカウントした。

２．アデニリルシクラーゼ
細胞ベースのアッセイのために設計された、ＦｌａｓｈＰｌａｔｅ（商標）アデニリルシクラーゼキット（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＮｕｃｌｅａｒ；カタログ番号ＳＭＰ００４Ａ）は、粗原形質膜を用いて使用するために改変できる。ＦｌａｓｈＰｌａｔｅウェルは、シンチラントコーティングを含むことができ、これはまたｃＡＭＰを認識する特異的抗体も含む。ウェル中に生じたｃＡＭＰは、放射活性ｃＡＭＰトレーサーの、ｃＡＭＰ抗体との結合についての直接競合によって定量化できる。以下は、受容体を発現する全細胞においてｃＡＭＰレベルの変化を測定するための簡単なプロトコールである。

トランスフェクトされた細胞を、一過性トランスフェクションの約２４時間後に回収する。培地を注意深く吸引して除去し、廃棄する。各ディッシュの細胞に１０ｍｌのＰＢＳを穏やかに加え、続いて注意深く吸引する。各プレートに１ｍｌのＳｉｇｍａ細胞解離バッファーおよび３ｍｌのＰＢＳを加える。細胞をプレートからピペットで取り出し、細胞懸濁液を５０ｍｌのコニカル遠心管に回収する。次いで、細胞を室温、１，１００ｒｐｍで５分間遠心分離する。細胞ペレットを適当な容積のＰＢＳ（約３ｍｌ／プレート）に注意深く再懸濁する。次いで、血球算定器を用いて細胞をカウントし、適当な数の細胞とするようさらなるＰＢＳを加える（約５０μｌ／ウェルの最終容積とする）。

ｃＡＭＰ標準および検出バッファー（１１ｍｌの検出バッファーに対して１μＣｉのトレーサー［^１２５Ｉ］ｃＡＭＰ（５０μｌ）を含む）を、製造業者の使用説明書に従って調製、維持する。アッセイバッファーは、スクリーニングのために新しく調製し、５０μｌの刺激バッファー、３μｌの候補化合物（１２μＭ最終アッセイ濃度）および５０μｌの細胞を含む。アッセイバッファーは、使用するまで氷上で保存する。アッセイは、例えば、９６ウェルプレートで実施することが好ましく、適当なウェルに５０μｌのｃＡＭＰ標準を加え、続いて、ウェルＨ１１およびＨ１２に５０μｌのＰＢＳＡを加えることによって開始する。すべてのウェルに５０ｍｌの刺激バッファーを加える。３μｌの化合物溶液を分注可能なピンツールを用いて、適当なウェルにＤＭＳＯ（または選択した候補化合物）を加え、１２μＭ候補化合物の最終アッセイ濃度および１００μｌ全アッセイ容積とする。次いで、ウェルに細胞を加え、室温で６０分間インキュベートする。次いで、ウェルにトレーサーｃＡＭＰを含む１００μｌの検出ミックスを加える。次いで、プレートをさらに２時間インキュベートし、続いて、ＷａｌｌａｃＭｉｃｒｏＢｅｔａシンチレーションカウンターにおいてカウントする。次いで、各アッセイプレート内に含まれる標準ｃＡＭＰ曲線からｃＡＭＰ／ウェルの値を推定する。

３．Ｇｉ共役型標的ＧＰＣＲについての細胞ベースのｃＡＭＰ
ＴＳＨＲは、Ｇｓ共役型ＧＰＣＲであり、活性化するとｃＡＭＰの蓄積を引き起こす。ＴＳＨＲは、アミノ酸残基６２３を突然変異させること（すなわち、アラニン残基をイソロイシン残基に変更すること）によって構成的に活性化できる。Ｇｉ共役型受容体は、アデニリルシクラーゼを阻害し、したがって、ｃＡＭＰ生成レベルを低下させると期待され、このため、ｃＡＭＰレベルの評価が興味深いものとなり得る。Ｇｉ共役型受容体の活性化の指標としてｃＡＭＰ生成の減少を測定するための有効な技術は、「シグナル増強剤」として非内因性の構成的に活性化されたＴＳＨＲ（ＴＳＨＲ−Ａ６２３１）（または内因性の構成的に活性なＧｓ共役型受容体）を、Ｇｉ結合型標的ＧＰＣＲと同時トランスフェクトし、ｃＡＭＰのベースラインレベルを確立することによって達成できる。内因性または非内因性型のＧｉ共役型受容体を作製したら、標的ＧＰＣＲをシグナル増強剤とともに同時トランスフェクトし、スクリーニングに使用できるのはこの物質である。いくつかの実施形態では、このアプローチを、Ｇｉ共役型受容体に対する候補化合物の直接同定に用いることが好ましい。Ｇｉ共役型ＧＰＣＲについては、このアプローチを用いる場合には、標的ＧＰＣＲのインバースアゴニストがｃＡＭＰシグナルを増大させ、アゴニストがｃＡＭＰシグナルを減少させることは留意されたい。

１日目に、２×１０^４個の２９３細胞／ウェルをプレーティングする。２日目に、２本の反応試験管を調製する（各試験管についての以下の割合はプレートあたりである）：試験管Ａは、血清不含ＤＭＥＭ（ＩｒｖｉｎｅＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）１．２ｍｌ中、全部で４μｇのＤＮＡ（例えば、ｐＣＭＶベクター；突然変異ＴＨＳＲ（ＴＳＨＲ−Ａ６２３Ｉ）を含むｐＣＭＶベクター；ＴＳＨＲ−Ａ６２３ＩおよびＧＰＣＲなど）に対して、哺乳類細胞にトランスフェクトされた各受容体の２μｇＤＮＡを混合することによって調製する；試験管Ｂは、血清不含ＤＭＥＭ１．２ｍｌ中に、１２０μｌのリポフェクタミン（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）を混合することによって調製する。次いで、試験管ＡおよびＢを反転させること（数回）によって混合し、続いて、室温で３０〜４５分間インキュベートする。混合物は「トランスフェクション混合物」と呼ぶ。プレーティングした２９３細胞を、１×ＰＢＳで洗浄し、続いて、１０ｍｌの血清不含ＤＭＥＭを加える。次いで、２．４ｍｌのトランスフェクション混合物を細胞に加え、続いて、３７℃／５％ＣＯ_２で４時間インキュベートする。次いで、トランスフェクション混合物を吸引によって除去し、続いて、２５ｍｌのＤＭＥＭ／１０％ウシ胎児血清を加える。次いで、細胞を３７℃／５％ＣＯ_２でインキュベートする。２４時間インキュベートした後、細胞を回収し、分析のために使用する。

ＦｌａｓｈＰｌａｔｅ（商標）アデニリルシクラーゼキット（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＮｕｃｌｅａｒ；カタログ番号ＳＭＰ００４Ａ）は細胞ベースのアッセイのために設計されているが、当業者の必要性に応じて粗原形質膜を用いて使用するために改変できる。ＦｌａｓｈＰｌａｔｅウェルは、シンチラントコーティングを含み、これはまたｃＡＭＰを認識する特異的抗体も含む。ウェル中に生じたｃＡＭＰは、放射活性ｃＡＭＰトレーサーの、ｃＡＭＰ抗体への結合についての直接競合によって定量化できる。以下は、対象の受容体を発現する全細胞においてｃＡＭＰレベルの変化を測定するための簡単なプロトコールである。

トランスフェクトされた細胞を、一過性トランスフェクションの約２４時間後に回収する。培地を注意深く吸引して除去し、廃棄する。各ディッシュの細胞に１０ｍｌのＰＢＳを穏やかに加え、続いて注意深く吸引する。各プレートに１ｍｌのＳｉｇｍａ細胞解離バッファーおよび３ｍｌのＰＢＳを加える。細胞をプレートからピペットで取り出し、細胞懸濁液を５０ｍｌのコニカル遠心管に回収する。次いで、細胞を、１，１００ｒｐｍで５分間、室温で遠心分離する。細胞ペレットを、適当な容積（約３ｍｌ／プレート）のＰＢＳに注意深く再懸濁する。次いで、血球算定器を用いて細胞をカウントし、適当な数の細胞とするようさらなるＰＢＳを加える（約５０μｌ／ウェルの最終容積とする）。

ｃＡＭＰ標準および検出バッファー（１１ｍｌの検出バッファーに対して１μＣｉのトレーサー［^１２５Ｉ］ｃＡＭＰ（５０μｌ）を含む）を、製造業者の使用説明書に従って調製、維持する。アッセイバッファーは、スクリーニングのために新しく調製しなくてはならず、５０μｌの刺激バッファー、３μｌの候補化合物（１２μＭ最終アッセイ濃度）および５０μｌの細胞を含む。アッセイバッファーは、使用するまで氷上で保存できる。アッセイは、適当なウェルに５０μｌのｃＡＭＰ標準を加え、続いて、ウェルＨ−１１およびＨ１２に５０μｌのＰＢＳＡを加えることによって開始できる。すべてのウェルに５０μｌの刺激バッファーを加える。３μｌの化合物溶液を分注可能なピンツールを用いて、適当なウェルに選択した化合物（例えば、ＴＳＨ）を加え、１２μＭ候補化合物の最終アッセイ濃度および１００μｌ全アッセイ容積とする。次いで、ウェルに細胞を加え、室温で６０分間インキュベートする。次いで、ウェルにトレーサーｃＡＭＰを含む１００μｌの検出ミックスを加える。次いで、プレートをさらに２時間インキュベートし、続いて、ＷａｌｌａｃＭｉｃｒｏＢｅｔａシンチレーションカウンターにおいてカウントする。次いで、各アッセイプレート内に含まれる標準ｃＡＭＰ曲線からｃＡＭＰ／ウェルの値を推定する。

４．リポーターベースのアッセイ
ａ．ＣＲＥ−ＬＵＣリポーターアッセイ（Ｇｓ結合型受容体）
ウェルあたり２×１０^４個細胞という密度で９６ウェルプレートに２９３または２９３Ｔ細胞をプレーティングし、翌日、製造業者の使用説明書に従ってリポフェクタミン試薬（ＢＲＬ）を用いてトランスフェクトする。ＤＮＡ／脂質混合物は、以下の通りに、各６ウェルトランスフェクションのために調製する：ＤＭＥＭ１００μｌ中、２６０ｎｇのプラスミドＤＮＡを、ＤＭＥＭ１００μｌ中、２μｌの脂質（２６０ｎｇのプラスミドＤＮＡは、２００ｎｇの８×ＣＲＥ−Ｌｕｃリポータープラスミドと、内因性受容体または非内因性受容体を含む５０ｎｇのｐＣＭＶまたはｐＣＭＶ単独と、１０ｎｇのＧＰＲＳ発現プラスミド（ｐｃＤＮＡ３中ＧＰＲＳ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とからなる）と穏やかに混合する。８×ＣＲＥ−Ｌｕｃリポータープラスミドは、以下の通りに調製する：ベクターＳＲＩＦ−β−ｇａｌは、ｐβｇａｌ−ベーシックベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）中ＢｇｌＶ−ＨｉｎｄＩＩＩ部位でラットソマトスタチンプロモーター（−７１／＋５１）をクローニングすることによって得る。アデノウイルス鋳型ＡｄｐＣＦ１２６ＣＣＲＥ８から、ＰＣＲによってｃＡＭＰ応答エレメントの８個のコピーを得（その開示内容が参照により本明細書に組み込まれる、Ｓｕｚｕｋｉら、ＨｕｍＧｅｎｅＴｈｅｒ７：１８８３−１８９３（１９９６）を参照のこと）、ＳＲＩＦ−β−ｇａｌベクターにＫｐｎ−ＢｇｌＶ部位でクローニングし、その結果、８×ＣＲＥ−β−ｇａｌリポーターベクターが得られる。８×ＣＲＥ−Ｌｕｃリポータープラスミドは、ルシフェラーゼ遺伝子を含む８×ＣＲＥ−β−ｇａｌリポーターベクター中のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を、ｐＧＬ３−ベーシックベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）からＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ部位で得られるものと置換することによって作製する。室温で３０分インキュベートした後、ＤＮＡ／脂質混合物を４００μｌのＤＭＥＭで希釈し、各ウェルに１００μｌの希釈した混合物を加える。細胞培養インキュベーター中で４時間インキュベートした後、各ウェルに１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ１００μｌを加える。翌日、トランスフェクトされた細胞を２００μｌ／ウェルの１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭで交換する。８時間後、ウェルを、ＰＢＳで１回洗浄した後、フェノールレッドを含まない１００μｌ／ウェルのＤＭＥＭに交換する。翌日、ＬｕｃＬｉｔｅ（商標）リポーター遺伝子アッセイキット（Ｐａｃｋａｒｄ）を用い、製造業者の使用説明書に従ってルシフェラーゼ活性を測定し、１４５０ＭｉｃｒｏＢｅｔａ（商標）シンチレーションおよび蛍光カウンター（Ｗａｌｌａｃ）で読み取る。

ｂ．ＡＰ１リポーターアッセイ（Ｇｑ結合型受容体）
Ｇｑ刺激を検出する方法は、Ｇｑ依存性ホスホリパーゼＣの、そのプロモーター中にＡＰ１エレメントを含む遺伝子の活性化を引き起こす公知の特性によるものである。Ｐａｔｈｄｅｔｅｃｔ（商標）ＡＰ−１ｃｉｓ−ＲｅｐｏｒｔｉｎｇＳｙｓｔｅｍ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カタログ番号２１９０７３）を、リン酸カルシウム沈殿物の成分が４１０ｎｇｐＡＰ１−Ｌｕｃ、８０ｎｇｐＣＭＶ受容体発現プラスミドおよび２０ｎｇＣＭＶ−ＳＥＡＰであるという点以外は、上記で、ＣＲＥＢリポーターアッセイに関して示されるプロトコールに従って使用できる。

ｃ．ＳＲＦ−ＬＵＣリポーターアッセイ（Ｇｑ結合型受容体）
Ｇｑ刺激を検出する一方法は、Ｇｑ依存性ホスホリパーゼＣの、そのプロモーター中に血清応答因子を含む遺伝子の活性化を引き起こす公知の特性によるものである。Ｐａｔｈｄｅｔｅｃｔ（商標）ＳＲＦ−Ｌｕｃ−ＲｅｐｏｒｔｉｎｇＳｙｓｔｅｍ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて、例えば、ＣＯＳ７細胞においてＧｑ共役型活性についてアッセイできる。哺乳類トランスフェクション（商標）キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カタログ番号２００２８５）を用い、製造業者の使用説明書に従い、システムのプラスミド成分および内因性または非内因性ＧＰＣＲをコードする示した発現プラスミドで細胞をトランスフェクトする。手短に言えば、４１０ｎｇＳＲＦ−Ｌｕｃ、８０ｎｇｐＣＭＶ−受容体発現プラスミドおよび２０ｎｇＣＭＶ−ＳＥＡＰ（分泌型アルカリホスファターゼ発現プラスミド；アルカリホスファターゼ活性は、サンプル間のトランスフェクション効率のばらつきを抑えるためにトランスフェクトされた細胞の培地で測定する）を、製造業者の使用説明書の通りに、リン酸カルシウム沈殿物中で混合する。沈殿物の半量を、９６ウェルプレートの３つのウェルに等しく分配し、細胞を血清不含培地上で２４時間維持する。最後の５時間は、細胞を、例えば、１μＭの候補化合物とともにインキュベートする。次いで、細胞を溶解し、Ｌｕｃｌｉｔｅ（商標）キット（Ｐａｃｋａｒｄ、カタログ番号６０１６９１１）および「Ｔｒｉｌｕｘ１４５０Ｍｉｃｒｏｂｅｔａ」液体シンチレーションおよび蛍光カウンター（Ｗａｌｌａｃ）を製造業者の使用説明書の通り用いてルシフェラーゼ活性についてアッセイする。データは、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ（商標）２．０ａ（ＧｒａｐｈＰａｄＳｏｆｔｗａｒｅＩｎｃ．）を用いて分析できる。

ｄ．細胞内ＩＰ３蓄積アッセイ（Ｇｑ結合型受容体）
１日目に、対象の受容体（内因性または非内因性）を含む細胞を、通常、１×１０^５個細胞／ウェル（ただし、数は最適化できる）で、２４ウェルプレートにプレーティングできる。２日目に、５０μｌ血清不含ＤＭＥＭ中０．２５μｇＤＮＡ／ウェルと、５０μｌ血清不含ＤＭＥＭ中２μｌリポフェクタミン／ウェルとをまず混合することによって、細胞をトランスフェクトできる。この溶液を穏やかに混合し、室温で１５〜３０分間インキュベートする。細胞を０．５ｍｌＰＢＳで洗浄し、４００μｌの血清不含培地をトランスフェクション培地と混合し、細胞に加える。次いで、細胞を３７℃／５％ＣＯ_２で３〜４時間インキュベートし、次いで、トランスフェクション培地を除去し、１ｍｌ／ウェルの通常の増殖培地で置換する。３日目に、細胞を^３Ｈ−ミオ−イノシトールで標識する。手短に言えば、培地を除去し、細胞をＰＢＳ０．５ｍｌで洗浄する。次いで、０．５ｍｌのイノシトール不含／血清不含培地（ＧＩＢＣＯＢＲＬ）／ウェルを、０．２５μＣｉの^３Ｈ−ミオ−イノシトール／ウェルとともに加え、細胞を３７℃／５％ＣＯ_２で１６〜１８時間一晩インキュベートする。４日目に、細胞をＰＢＳ０．５ｍｌで洗浄し、イノシトール不含／血清不含培地、１０μＭパルギリン、１０ｍＭ塩化リチウムを含有する０．４５ｍｌのアッセイ培地、またはセロトニン受容体を含む対照構築物を用いる場合には、０．４ｍｌのアッセイ培地および１０μＭの最終濃度のために５０μｌの１０×ケタンセリン（ｋｅｔ）を加える。次いで、細胞を、３７℃で３０分間インキュベートする。次いで、ＰＢＳ０．５ｍｌで細胞を洗浄し、２００μｌの新鮮／氷冷停止溶液（１ＭＫＯＨ、１８ｍＭホウ酸Ｎａ、３．８ｍＭＥＤＴＡ）／ウェルを加える。この溶液を、５〜１０分間または細胞が溶解するまで氷上で維持し、次いで、２００μｌの新鮮／氷冷中和溶液（７．５％ＨＣＬ）で中和する。次いで、溶解物を１．５ｍｌのエッペンドルフ試験管に移し、１ｍｌのクロロホルム／メタノール（１：２）／試験管を加える。この溶液を１５秒間ボルテックス処理し、上相をＢｉｏｒａｄＡＧｌ−Ｘ８（商標）陰イオン交換樹脂（１００〜２００メッシュ）に適用する。まず、樹脂を１：１．２５Ｗ／Ｖで水で洗浄し、０．９ｍｌの上相をカラムに載せる。カラムを５ｍＭミオ−イノシトール１０ｍｌで洗浄し、５ｍＭホウ酸Ｎａ／６０ｍＭホウ酸Ｎａ１０ｍｌで洗浄する。イノシトールトリスホスフェートを、０．１Ｍギ酸／１Ｍホウ酸アンモニウム２ｍｌを含むシンチレーションカクテル１０ｍｌを含むシンチレーションバイアルに溶出して入れる。カラムを、０．１Ｍギ酸／３Ｍホウ酸アンモニウム１０ｍｌで洗浄し、ｄｄＨ_２Ｏで２回リンスすることによって再生し、水中、４℃で保存する。

（実施例１３）
融合タンパク質調製
ａ．ＧＰＣＲ：Ｇｓ融合構築物
ＧＰＣＲ−Ｇタンパク質融合構築物の設計は、以下のように達成できる：ラットＧタンパク質Ｇｓαの５’および３’の両末端（長い形；Ｉｔｏｈ，Ｈ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８３：３７７６（１９８６））を、そこにＨｉｎｄＩＩＩ配列を含むよう設計する。正しい配列（フランキングＨｉｎｄＩＩＩ配列を含む）を確認した後、そのベクターのＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を用いてサブクローニングすることによって、ｐｃＤＮＡ３．１（−）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｖ７９５−２０）に全配列を入れる。ｐｃＤＮＡ３．１（−）にサブクローニングした後に、Ｇｓα配列の正しい方向を調べる。次いで、ＨｉｎｄＩＩＩ配列にラットＧｓα遺伝子を含む改変されたｐｃＤＮＡ３．１（−）を確認し、ここで、このベクターを「ユニバーサル」Ｇｓαタンパク質ベクターとして利用できる。ｐｃＤＮＡ３．１（−）ベクターは、ＨｉｎｄＩＩＩ部位の上流に、種々の周知の制限部位を含み、したがって、Ｇｓタンパク質の上流に、対象の受容体のコード配列を挿入する能力を提供することが有益である。この同様のアプローチを用いて、その他の「ユニバーサル」Ｇタンパク質ベクターを作製でき、また、もちろん、当業者に公知のその他の市販ベクターまたは専売ベクターも使用できる。重要な基準は、ＧＰＣＲの配列が上流にあり、Ｇタンパク質のものとインフレームであるということである。

ｂ．Ｇｑ（６アミノ酸欠失）／Ｇｉ融合構築物
Ｇｑ（欠失）／Ｇｉ融合構築物の設計は、以下の通り達成できる：ＧαｑサブユニットのＮ末端の６個のアミノ酸（ＴＬＥＳＩＭの配列（配列番号１１）を有するアミノ酸２〜７）を欠失させ、配列ＥＹＮＬＶ（配列番号１２）を有するＣ末端の５個のアミノ酸を、配列ＤＣＧＬＦ（配列番号１３）を有するＧαｉタンパク質の対応するアミノ酸で置換する。この融合構築物は、以下のプライマー：

および

ならびに鋳型として血球凝集素タグを含むマウスＧαｑ野生型版を含むプラスミド６３３１３を用いてＰＣＲによって得られる。下側のカップ中のヌクレオチドはスペーサーとして含まれる。

ＴａｑＰｌｕｓＰｒｅｃｉｓｉｏｎＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて、工程２〜４を３５回反復する以下のサイクルによって増幅する：９５℃で２分間、９５℃で２０秒間、５６℃で２０秒間、７２℃で２分間および７２℃で７分間。ＰＣＲ産物は、ｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、ＡＢＩＢｉｇＤｙｅターミネーターキット（Ｐ．Ｅ．Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて配列決定できる。融合構築物の配列を含むＴＯＰＯクローンから得たインサートを、２段階クローニングプロセスによってＨｉｎｄＩＩＩ／ＢａｍＨＩ部位で発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）に入れることができる。また、２００２年９月６日にＷＯ０２０６８６００として公開されたＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ０２／０５６２５も参照のこと。なお、その開示内容は参照によりその全文が本明細書に組み込まれる。

（実施例１４）
［^３５Ｓ］ＧＴＰγＳアッセイ
Ａ．膜調製
いくつかの実施形態では、例えば、アゴニスト、インバースアゴニストまたはアンタゴニストなどの候補化合物の同定に用いるための、対象の標的ＧＰＣＲを含む膜は以下の通り調製する：
ａ．材料
「膜スクレープバッファー（ＭｅｍｂｒａｎｅＳｃｒａｐｅＢｕｆｆｅｒ）」は、２０ｍＭＨＥＰＥＳおよび１０ｍＭＥＤＴＡからなり、ｐＨ７．４；「膜洗浄バッファー」は、２０ｍＭＨＥＰＥＳおよび０．１ｍＭＥＤＴＡからなり、ｐＨ７．４；「結合バッファー」は、２０ｍＭＨＥＰＥＳ、１００ｍＭＮａＣｌおよび１０ｍＭＭｇＣｌ_２からなり、ｐＨ７．４である。

ｂ．手順
すべての材料は、手順を通じて氷上で維持する。まず、コンフルエントな単層細胞から培地を吸引し、続いて、１０ｍｌの冷ＰＢＳでリンスし、続いて、吸引する。その後、５ｍｌの膜スクレープバッファーを加えて細胞を掻き取り、これに続いて、細胞抽出物を５０ｍｌの遠心管に移す（４℃、２０，０００ｒｐｍで１７分間遠心分離する）。その後、上清を吸引し、ペレットを３０ｍｌの膜洗浄バッファーに再懸濁し、続いて、４℃、２０，０００ｒｐｍで１７分間遠心分離する。次いで、上清を吸引し、ペレットを結合バッファーに再懸濁する。次いで、これをＢｒｉｎｋｍａｎポリトロン（商標）ホモジナイザーを用いてホモジナイズする（すべての材料が懸濁液になるまで１５〜２０秒間つぶす）。本明細書においてこれは「膜タンパク質」と呼ばれる。

ブラッドフォードタンパク質アッセイ
ホモジナイズした後、ブラッドフォードタンパク質アッセイを用いて膜のタンパク質濃度を調べ（タンパク質は、約１．５ｍｇ／ｍｌに希釈してもよく、後で使用するために、分注し、凍結する（−８０℃）。凍結する場合には、使用するためのプロトコールは以下の通りである：アッセイ当日に、凍結された膜タンパク質を室温で解凍し、続いて、ボルテックス処理し、次いで、ポリトロンで約１２×１０００ｒｐｍで約５〜１０秒間ホモジナイズする。複数の調製物のために、ホモジナイザーは、異なる調製物のホモジネーションの間に十分に浄化しなくてはならないということは留意されたい）。

ａ．材料
結合バッファー（上記の通り）；ブラッドフォード色素試薬；ブラッドフォードタンパク質標準を、製造業者の使用説明書にしたがって用いる（Ｂｉｏｒａｄ、カタログ番号５００−０００６）。

ｂ．手順
一方は膜を、一方は対照として「ブランク」を含む２連の試験管を調製する。各試験管は、８００μｌの結合バッファーを含む。その後、１０μｌのブラッドフォードタンパク質標準（１ｍｇ／ｍｌ）を各試験管に加え、次いで、１０μｌの膜タンパク質を一方の試験管だけに加える（ブランクには加えない）。その後、各試験管に２００μｌのブラッドフォード色素試薬を加え、続いて、各試験管をボルテックス処理する。５分後、試験管を再度ボルテックス処理し、中の材料をキュベットに移す。波長５９５でＣＥＣＩＬ３０４１分光光度計を用いてキュベットを読み取る。

同定アッセイ
ａ．材料
ＧＤＰバッファーは、３７．５ｍｌの結合バッファーと２ｍｇのＧＤＰ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｇ−７１２７）とからなり、その後、結合バッファーで一連の希釈を行い、０．２μＭＧＤＰを得る（各ウェル中のＧＤＰの最終濃度は０．１μＭＧＤＰである）。候補化合物を含む各ウェルは、１００μｌＧＤＰバッファー（最終濃度、０．１μＭＧＤＰ）、結合バッファー中５０μｌの膜タンパク質および結合バッファー中５０μｌの［^３５Ｓ］ＧＴＰγＳ（０．６ｎＭ）（１０ｍｌの結合バッファーあたり２．５μｌ［^３５Ｓ］ＧＴＰγＳ）からなる２００μｌの最終容積を有する。

ｂ．手順
候補化合物は９６ウェルプレート形式を用いてスクリーニングできる（これらは−８０℃で凍結できる）。膜タンパク質（または対照として、標的ＧＰＣＲを除く発現ベクターを含む膜）を、懸濁液になるまで短時間ホモジナイズする。タンパク質濃度は、上で示されるブラッドフォードタンパク質アッセイを用いて測定する。膜タンパク質（および対照）を、結合バッファーで０．２５ｍｇ／ｍｌに希釈する（最終アッセイ濃度、１２．５μｇ／ウェル）。その後、ＷａｌｌａｃＳｃｉｎｔｉｓｔｒｉｐ（商標）（Ｗａｌｌａｃ）の各ウェルに、１００μｌＧＤＰバッファーを加える。５μｌピンツールを用いて、５μｌの候補化合物をこのようなウェル中に移す（すなわち、全アッセイ容積２００μｌ中の５μｌは１：４０比であり、候補化合物の最終スクリーニング濃度は１０μＭである）。再度、混入を避けるために、各移動工程後に、ピンツールを、水（１×）、エタノール（１×）および水（２×）を含む３種のリザーバーでリンスしなければならず、過剰の液体は、各リンス後にツールから振り落とし、紙およびキムワイプで乾燥させなければならない。その後、各ウェルに５０μｌの膜タンパク質を加え（標的ＧＰＣＲを含まない膜を含む対照ウェルも用いる）、室温で５〜１０分間プレインキュベートする。その後、各ウェルに、結合バッファー中、［^３５Ｓ］ＧＴＰγＳ（０．６ｎＭ）５０μｌを加え、続いて、振盪機にて、室温で６０分間インキュベートする（プレートはホイルで覆う）。次いで、プレートを、２２℃、４０００ＲＰＭで１５分間回転させることによってアッセイを停止する。８チャンネルマニホールドでプレートを吸引し、プレートカバーで密閉する。Ｗａｌｌａｃ１４５０で設定「プロトコール３７」を用いてプレートを読み取る（製造業者の使用説明書の通り）。

（実施例１５）
サイクリックＡＭＰアッセイ
候補化合物、例えば、アゴニスト、インバースアゴニストまたはアンタゴニストを同定するための他のアッセイアプローチは、シクラーゼベースのアッセイを用いることによって達成できる。このアッセイアプローチは、直接同定に加え、上記の実施例において示されるような［^３５Ｓ］ＧＴＰγＳアプローチからの結果の確認を提供する独立アプローチとして利用できる。

候補化合物を、対象の受容体に対するインバースアゴニストおよびアゴニストとして直接同定するために、以下のプロトコールに従って、改変ＦｌａｓｈＰｌａｔｅ（商標）アデニリルシクラーゼキット（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＮｕｃｌｅａｒ、カタログ番号ＳＭＰ００４Ａ）を利用できる。

トランスフェクションの約３日後にトランスフェクトした細胞を回収する。２０ｍＭＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４および１０ｍＭＭｇＣｌ_２を含むバッファーに懸濁した細胞のホモジナイゼーションによって膜を調製する。ホモジナイゼーションは、Ｂｒｉｎｋｍａｎポリトロン（商標）を用いて氷上で約１０秒間実施する。得られたホモジネートを４℃、４９，０００Ｘｇで１５分間遠心分離する。次いで、得られたペレットを、２０ｍＭＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４および０．１ｍＭＥＤＴＡを含むバッファーに再懸濁し、１０秒間ホモジナイズし、続いて、４℃、４９，０００ｘｇで１５分間遠心分離する。次いで、得られたペレットを、使用するまで−８０℃で保存する。直接同定スクリーニングの当日、膜ペレットを室温で徐々に解凍し、２０ｍＭＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４および１０ｍＭＭｇＣｌ_２を含むバッファーに再懸濁し、最終タンパク質濃度を０．６０ｍｇ／ｍｌとする（再懸濁した膜は、使用するまで氷上におく）。

ｃＡＭＰ標準および検出バッファー（１１ｍｌの検出バッファーに対して２μＣｉのトレーサー［^１２５Ｉ］ｃＡＭＰ（１００μｌ）を含む）を、製造業者の使用説明書に従って調製、維持する。アッセイバッファーはスクリーニングのために新しく調製し、２０ｍＭＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１０ｍＭＭｇＣｌ_２、２０ｍＭホスポクレアチン（ｐｈｏｓｐｏｃｒｅａｔｉｎｅ）（Ｓｉｇｍａ）、０．１ユニット／ｍｌクレアチンホスホキナーゼ（Ｓｉｇｍａ）、５０μＭＧＴＰ（Ｓｉｇｍａ）および０．２ｍＭＡＴＰ（Ｓｉｇｍａ）を含む。その後、アッセイバッファーは、使用するまで氷上で保存する。

例えば、９６ウェルプレートウェルに、４０μｌ膜タンパク質（３０μｇ／ウェル）および５０μｌのアッセイバッファーとともに候補化合物を加える（３μｌ／ウェル、１２μＭ最終アッセイ濃度）。次いで、この混合物を、穏やかに振盪しながら、室温で３０分間インキュベートする。

インキュベートした後、各ウェルに１００μｌの検出バッファーを加え、続いて、２〜２４時間インキュベートする。次いで、ＷａｌｌａｃＭｉｃｒｏＢｅｔａ（商標）プレートリーダーで、「プロトコール３１」を用いてプレートをカウントする（製造業者の使用説明書の通り）。

（実施例１６）
細胞内カルシウム濃度を測定するための蛍光イメージングプレートリーダー（ＦＬＩＰＲ）アッセイ
それぞれのクローン株に由来する、標的受容体（実験用）およびｐＣＭＶ（陰性対照）によって安定にトランスフェクトされた細胞を、翌日アッセイするために、５．５×１０^４個細胞／完全培養培地（１０％ＦＢＳ、２ｍＭＬ−グルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウムを含むＤＭＥＭ）を含むウェルで、ポリ−Ｄ−リジン前処理９６ウェルプレート（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、３５６６４０）に播種する。ＧＰＲ４１はＧｉ共役型であるので、ＧＰＲ４１を含む細胞は、Ｇα１５、Ｇα１６またはキメラＧｑ／Ｇｉαサブユニットをさらに含み得る。しかし、ＧＰＲ４１はまた、Ｇα１２／１３とも共役するので（実施例５および図５参照のこと）、Ｇα１５、Ｇα１６またはキメラＧｑ／Ｇｉαサブユニットなどの無差別のＧタンパク質は、検出可能なカルシウム流出を引き起こすのに必要ではない場合がある。Ｆｌｕｏ４−ＡＭ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅ、Ｆ１４２０２）インキュベーションバッファーストックを調製するために、ＤＭＳＯ４６７μｌおよびプルロニックアシッド（Ｐｌｕｏｒｏｎｉｃａｃｉｄ）（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅ、Ｐ３０００）４６７μｌに１ｍｇのＦｌｕｏ４−ＡＭを溶解し、−２０℃で１ヶ月保存できる１ｍＭストック溶液とする。Ｆｌｕｏ４−ＡＭは蛍光カルシウム指示色素である。

候補化合物は洗浄バッファー（１×ＨＢＳＳ／２．５ｍＭプロベニシド（Ｐｒｏｂｅｎｉｃｉｄ）／２０ｍＭＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４）中に調製する。

アッセイ時に、ウェルから培養培地を除去し、細胞に１００μｌの４μＭＦｌｕｏ４−ＡＭ／２．５ｍＭプロベニシド（Ｐｒｏｂｅｎｉｃｉｄ）（Ｓｉｇｍａ、Ｐ８７６１）／２０ｍＭＨＥＰＥＳ／完全培地を、ｐＨ７．４にて加える。３７℃／５％ＣＯ_２で６０分間のインキュベーションを開始することが可能である。

１時間インキュベートした後、Ｆｌｕｏ４−ＡＭインキュベーションバッファーを除去し、１００μｌの洗浄バッファーで細胞を２回洗浄する。各ウェルには１００μｌの洗浄バッファーを残す。このプレートを３７℃／５％ＣＯ_２で６０分間インキュベーターに戻す。

ＦＬＩＰＲ（蛍光イメージングプレートリーダー；ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅ）を、３０秒目に５０μｌの候補化合物を加え、候補化合物によって誘発される細胞内カルシウム濃度（［Ｃａ２＋］）の一時的な変化をさらに１５０秒間記録するようプログラムする。総蛍光変化カウントを用い、ＦＬＩＰＲソフトウェアを用いてアゴニスト活性を求める。機器ソフトウェアは蛍光読み取り値を標準化し、相当する初期読み取り値をゼロとする。

前述のものは、安定にトランスフェクトされた細胞を用いるアゴニスト活性のためのＦＬＩＰＲアッセイを提供するが、当業者ならば、アンタゴニスト活性を特性決定するためにアッセイを容易に改変できる。また前記の当業者には容易に理解されるであろうが、あるいは、一過性にトランスフェクトされた細胞を用いてもよい。

（実施例１７）
ＭＡＰキナーゼアッセイ
ＭＡＰキナーゼ（マイトジェン活性化キナーゼ）をモニターして、受容体活性化を評価できる。ＭＡＰキナーゼは、いくつかのアプローチによって検出できる。１つのアプローチは、リン酸化されていない（不活性）か、またはリン酸化されている（活性）のいずれかのリン酸化状態の評価に基づくものである。リン酸化されたタンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいてより遅い移動性を有し、したがって、ウエスタンブロッティングを用いて刺激されていないタンパク質と比較できる。あるいは、リン酸化されたタンパク質に特異的な抗体も入手可能であり（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）、これを用いて、リン酸化されたキナーゼの増加を検出できる。いずれの方法においても、細胞を候補化合物で刺激し、次いで、Ｌａｅｍｍｌｉバッファーで抽出する。可溶性画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに適用し、タンパク質をニトロセルロースまたはイモビリン（Ｉｍｍｏｂｉｌｉｎ）に電気泳動的に移す。標準ウエスタンブロッティング技術によって免疫反応性バンドを検出する。可視的または化学発光シグナルをフィルム上に記録し、デンシトメトリーによって定量化できる。

他のアプローチは、リン酸化アッセイによるＭＡＰキナーゼ活性の評価に基づくものである。細胞を候補化合物で刺激し、可溶性抽出物を調製する。この抽出物を、γ−^３２Ｐ−ＡＴＰ、ＡＴＰ再生系およびＭＡＰキナーゼの特異的基質、例えば、インスリンによって調節される、リン酸化された熱および酸安定性タンパク質、すなわち、ＰＨＡＳ−Ｉとともに３０℃で１０分間インキュベートする。Ｈ_３ＰＯ_４の添加によって反応を終結させ、サンプルを氷に移す。アリコートをＷｈａｔｍａｎＰ８１クロマトグラフィーペーパー上にスポッティングし、これがリン酸化されたタンパク質を保持する。クロマトグラフィーペーパーを洗浄し、^３２Ｐについてカウントし、これは液体シンチレーションカウンターで行う。あるいは、細胞抽出物をγ−^３２Ｐ−ＡＴＰ、ＡＴＰ再生系およびストレプトアビジンによってフィルター支持体と結合しているビオチン化ミエリン塩基性タンパク質とともにインキュベートする。ミエリン塩基性タンパク質は、活性化ＭＡＰキナーゼの基質である。リン酸化反応は、３０℃で１０分間実施する。次いで、抽出物をフィルターを通して吸引することができ、これが、リン酸化されたミエリン塩基性タンパク質を保持する。フィルターを洗浄し、液体シンチレーションカウンティングによって^３２Ｐについてカウントする。

（実施例１８）
受容体結合アッセイ
本明細書に記載した方法に加え、候補化合物を評価するための他の手段は、ＧＰＲ４１受容体に対する結合親和性を調べることによるものである。この種のアッセイは、通常、ＧＰＲ４１受容体に対する放射標識リガンドを必要とする。ＧＰＲ４１受容体の既知リガンドおよびその放射標識の使用に加え、本明細書に開示されるＧＰＲ４１アゴニスト化合物を放射性同位元素で標識し、候補化合物の、ＧＰＲ４１受容体に対する親和性を評価するアッセイにおいて使用できる。

放射標識ＧＰＲ４１化合物、例えば、本明細書に開示されるＧＰＲ４１アゴニストは、化合物を同定／評価するためのスクリーニングアッセイにおいて使用できる。一般論として、新規に合成されるか同定される化合物（すなわち、候補化合物）は、放射標識ＧＰＲ４１アゴニストのＧＰＲ４１受容体との結合を減少させるその能力について評価できる。したがって、ＧＰＲ４１受容体との結合について、放射標識ＧＰＲ４１アゴニストと競合する能力は、候補化合物のＧＰＲ４１受容体に対する結合親和性と直接的に相関がある。

ＧＰＲ４１の受容体結合を調べるためのアッセイプロトコール
Ａ．ＧＰＲ４１受容体調製
本明細書において記載されるように、例えば、ＨＥＫ２９３細胞（ヒト腎臓、ＡＴＣＣ）を、ＧＰＲ４１を用いて一過性かつ安定にトランスフェクトできる。例えば、２９３細胞を、１０μｇのヒトＧＰＲ４１受容体および６０μｌのリポフェクタミンを用いて（１５ｃｍディッシュあたり）一過性にトランスフェクトし、培地交換をし、ディッシュ中で２４時間増殖させることができる（７５％コンフルエンシー）。１０ｍｌ／ディッシュのＨｅｐｅｓ−ＥＤＴＡバッファー（２０ｍＭＨｅｐｅｓ＋１０ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）を用いて細胞を回収する。次いで、ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ遠心機において、細胞を１７００ｒｐｍで２０分間遠心分離する（ＪＡ−２５．５０ローター）。続いて、ペレットを、２０ｍＭＨｅｐｅｓ＋１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ７．４に再懸濁し、５０ｍｌＤｏｕｎｃｅホモジナイザーを用いてホモジナイズし、再度遠心分離する。上清を除去した後、ペレットを、結合アッセイにおいて使用するまで−８０℃で保存する。アッセイにおいて用いる場合には、膜を氷上で２０分間解凍し、次いで、１０ｍＬのインキュベーションバッファー（２０ｍＭＨｅｐｅｓ、１ｍＭＭｇＣｌ_２、１００ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．４）を加える。次いで、膜をボルテックス処理し、粗膜ペレットを再懸濁させ、ＢｒｉｎｋｍａｎｎＰＴ−３１００ポリトロンホモジナイザーを用い、設定６で１５秒間ホモジナイズする。ＢＲＬブラッドフォードタンパク質アッセイを用いて膜タンパク質の濃度を求める。

Ｂ．結合アッセイ
全結合のためには、適当に希釈した膜５０μｌの全容積を、９６ウェルポリプロピレンマイクロタイタープレートに加え（５０ｍＭＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１０ｍＭＭｇＣｌ_２および１ｍＭＥＤＴＡを含有するアッセイバッファーで希釈；５〜５０μｇタンパク質）、続いて、１００μｌのアッセイバッファーおよび５０μｌの放射標識ＧＰＲ４１アゴニストに加えた。非特異的結合のためには、１００μｌの代わりに５０μｌのアッセイバッファーを加え、さらに５０μｌの１０μＭ冷ＧＰＲ４１を加え、その後、５０μｌの放射標識ＧＰＲ４１アゴニストを加える。次いで、プレートを室温で６０〜１２０分間インキュベートする。アッセイプレートを、Ｂｒａｎｄｅｌｌ９６ウェルプレート収穫器をつけたＭｉｃｒｏｐｌａｔｅＤｅｖｉｃｅｓＧＦ／ＣＵｎｉｆｉｌｔｅｒ濾過プレートによって濾過し、続いて、０．９％ＮａＣｌを含有する冷５０ｍＭＴｒｉｓＨＣｌ、ｐＨ７．４で洗浄することによって、結合反応を終結させる。次いで、濾過プレートの底を密閉し、各ウェルに５０μｌのＯｐｔｉｐｈａｓｅＳｕｐｅｒｍｉｘを加え、プレートの上部を密閉し、ＴｒｉｌｕｘＭｉｃｒｏＢｅｔａシンチレーションカウンターにおいてプレートをカウントする。化合物競合研究には、適当なウェルに、１００μｌのアッセイバッファーを加える代わりに、１００μｌの適当に希釈した候補化合物を加え、続いて、５０μｌの放射標識ＧＰＲ４１アゴニストを加える。

Ｃ．算出
候補化合物は、まず、１および０．１μＭでアッセイし、次いで、中間の用量が放射標識ＧＰＲ４１アゴニスト結合の約５０％の阻害を引き起こすよう（すなわち、ＩＣ_５０）選択された濃度の範囲でアッセイする。候補化合物の不在下での特異的結合（Ｂｏ）は、全結合（Ｂ_Ｔ）から非特異的結合（ＮＳＢ）を引いた差であり、同様に特異的結合（候補化合物の存在下での）（Ｂ）は、置換結合（Ｂ_Ｄ）から非特異的結合（ＮＳＢ）を引いた差である。ＩＣ_５０は、阻害応答曲線、Ｂ／Ｂｏ％対候補化合物濃度のロジット−ログプロットから求める。

Ｋｉは、ＣｈｅｎｇおよびＰｒｕｓｔｏｆｆ変換によって算出する：
Ｋｉ＝ＩＣ_５０／（１＋［Ｌ］／Ｋ_Ｄ）
（式中、［Ｌ］は、アッセイに用いた放射標識ＧＰＲ４１アゴニストの濃度であり、Ｋ_Ｄは同一結合条件下で独立に求められた放射標識ＧＰＲ４１アゴニストの解離定数である。

（実施例１９）
齧歯類糖尿病モデル
肥満症およびインスリン抵抗性を伴う２型糖尿病の齧歯類モデルを開発した。疾患の病態生理学を理解するために、また候補治療化合物を試験するために、マウスにおけるｄｂ／ｄｂおよびｏｂ／ｏｂ［Ｄｉａｂｅｔｅｓ（１９８２）３１：１〜６を参照のこと］ならびにズッカーラットにおけるｆａ／ｆａなどの遺伝モデルを開発した［Ｄｉａｂｅｔｅｓ（１９８３）３２：８３０−８３８；ＡｎｎｕＲｅｐＳａｎｋｙｏＲｅｓＬａｂ（１９９４）４６：１−５７］。ＪａｃｋｓｏｎＬａｂｏｒａｔｏｒｙによって開発されたホモ接合体動物、Ｃ５７ＢＬ／ＫｓＪ−ｄｂ／ｄｂマウスは、肥満症、高血糖性、高インスリン性およびインスリン抵抗性であるのに対し［ＪＣｌｉｎＩｎｖｅｓｔ（１９９０）８５：９６２−９６７］、ヘテロ接合体は痩せた、正常血糖である。ｄｂ／ｄｂモデルでは、マウスは、年齢とともに徐々にインスリノペニア（ｉｎｓｕｌｉｎｏｐｅｎｉａ）、糖レベルが十分に制御されない場合にヒト２型糖尿病の後期に一般的に観察される特徴を発症する。このモデルは、ヒト２型糖尿病のものに似ているために、本発明の化合物を、それだけには限らないが、血漿グルコースおよびトリグリセリドの低減をはじめとする活性について試験する。ズッカー（ｆａ／ｆａ）ラットは重篤な肥満症、高インスリン性およびインスリン抵抗性であり｛Ｃｏｌｅｍａｎ，Ｄｉａｂｅｔｅｓ（１９８２）３１：１；ＥＳｈａｆｒｉｒｉｎＤｉａｂｅｔｅｓＭｅｌｌｉｔｕｓ，ＨＲｉｆｋｉｎａｎｄＤＰｏｒｔｅ，Ｊｒ，Ｅｄｓ［ＥｌｓｅｖｉｅｒＳｃｉｅｎｃｅＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏ，ＮｅｗＹｏｒｋ，ｅｄ．４，（１９９０）２９９−３４０頁］｝、ｆａ／ｆａ突然変異は、マウスｄｂ突然変異のラット等価物であり得る［Ｆｒｉｅｄｍａｎら、Ｃｅｌｌ（１９９２）６９：２１７−２２０；Ｔｒｕｅｔｔら、ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ（１９９１）８８：７８０６］。Ｔｕｂｂｙ（ｔｕｂ／ｔｕｂ）マウスは、深刻な高血糖症を伴わない、肥満症、中程度のインスリン抵抗性および高インスリン血症を特徴とする［Ｃｏｌｅｍａｎら、Ｈｅｒｅｄｉｔｙ（１９９０）８１：４２４］。

本発明は、上記の齧歯類糖尿病モデルのいずれかまたはすべてにおいて、２型糖尿病またはその他の好ましいインスリン関連障害または先に記載した脂質代謝の障害を患うヒトにおいて、その他の哺乳類に基づくモデルにおいて、インスリン抵抗性および高血糖症を低減するためのＧＰＲ４１モジュレーターの使用を包含する。血漿グルコースおよびインスリンレベル、ならびに、それだけには限らないが、血漿遊離脂肪酸およびトリグリセリドをはじめとするその他の因子を試験できる。

ＧＰＲ４１モジュレーターの抗高血糖活性についてのイン・ビボアッセイ
遺伝子操作された肥満の糖尿病マウス（ｄｂ／ｄｂ）（雄、７〜９週齢）を、標準実験室条件、２２℃、５０％相対湿度下で飼育し（７〜９匹／ケージ）、Ｐｕｒｉｎａ齧歯類用固形飼料および水を無制限という食餌で維持した。処理の前に、各動物の尾静脈から血液を採取し、ＯｎｅＴｏｕｃｈＢａｓｉｃＧｌｕｃｏｓｅＭｏｎｉｔｏｒＳｙｓｔｅｍ（Ｌｉｆｅｓｃａｎ）を用いて血糖濃度を調べる。血漿グルコールレベルが２５０〜５００ｍｇ／ｄｌの間のマウスを用いる。各処理群は、研究の開始時に、各群における平均グルコースレベルが同等であるように分配される７匹のマウスからなる。ｄｂ／ｄｂマウスには、イソフラン麻酔を用いて挿入したマイクロ浸透圧ポンプによって投薬し、本発明の化合物、生理食塩水または無関係の化合物をマウスに皮下的に（ｓ．ｃ．）提供する。その後、血液を周期的に尾静脈からサンプリングし、血糖濃度について分析する。Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定を用いて、（生理食塩水処理に対して対象の化合物を比較して）群間の有意差を判断する。

前述のものは例示のために提供するものであって制限するものではない。２型糖尿病のその他の例示的齧歯類モデルが記載されている［ＭｏｌｌｅｒＤＥ，Ｎａｔｕｒｅ（２００１）４１４：８２１−７およびその中の参照文献ならびにＲｅｅｄＭＪら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ，ＯｂｅｓｉｔｙａｎｄＭｅｔａｂｏｌｉｓｍ（１９９９）１：７５−８６およびその中の参照文献、これらの各々の開示内容は、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる］。

（実施例２０）
マウスアテローム性動脈硬化症モデル
アディポネクチン遺伝子をノックアウトすることによって作製されたアディポネクチン依存性マウスは、アテローム性動脈硬化症になりやすく、インスリン抵抗性になりやすいことがわかっている。このマウスはまた、虚血性心疾患の適したモデルである［Ｍａｔｓｕｄａ，Ｍら、ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ（２００２）Ｊｕｌｙおよびその中に引用される参照文献、これらの開示内容は参照によりその全文が本明細書に組み込まれる］。

アディポネクチンノックアウトマウスを、標準実験室条件、２２℃、５０％相対湿度下で飼育する（７〜９匹／ケージ）。マウスには、イソフラン麻酔を用いて挿入したマイクロ浸透圧ポンプによって投薬し、本発明の化合物、生理食塩水または無関係の化合物をマウスに皮下的に（ｓ．ｃ．）提供する。新生内膜肥厚および虚血性心疾患を、種々の時間間隔で屠殺した種々の群のマウスについて調べる。Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定を用いて、（生理食塩水処理に対して注目する化合物を比較して）群間の有意差を判断する。

前述のアテローム性動脈硬化症のマウスモデルは例示のために提供するものであって制限するものではない。さらなる例として、アポリポタンパク質Ｅ依存性マウスもアテローム性動脈硬化症になりやすいことがわかっている［ＰｌｕｍｐＡＳら、Ｃｅｌｌ（１９９２）７１：３４３−３５３；その開示内容は、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる］。

使用できる他のモデルとして、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス、食餌誘導性動脈硬化病変形成を起こしやすいことが知られている近交系における、食餌誘導性アテローム性動脈硬化症のものがある。このモデルは、当業者にはよく知られている［ＫａｍａｄａＮら、ＪＡｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒＴｈｒｏｍｂ（２００１）８：１−６；ＧａｒｂｅｒＤＷら、ＪＬｉｐｉｄＲｅｓ（２００１）４２：５４５−５２；ＳｍｉｔｈＪＤら、ＪＩｎｔｅｒｎＭｅｄ（１９９７）２４２：９９−１０９；これらの各々の開示内容は、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる］。

（実施例２１）
ＨＤＬ−コレステロールおよびアテローム性動脈硬化症のイン・ビボブタモデル
対象の化合物の、高い総コレステロール／ＨＤＬ−コレステロール比およびそれに関連する症状の予防または治療における医薬としての有用性を、例えば、総コレステロール対ＨＤＬ−コレステロールの比の低下における、ＨＤＬコレステロールの上昇における、またはイン・ビボブタモデルにおけるアテローム性動脈硬化症からの保護における化合物の活性によって実証する。ブタは、ほとんどのその他の動物モデルよりもより密接にヒトの生理学、特に、脂質代謝を反映するので、動物モデルとして用いられる。制限しようとするものではない例示的イン・ビボブタモデルを以下に示す。

ヨークシャーアルビノブタ（体重２５．５±４ｋｇ）に、２％コレステロールおよび２０％牛脂を補給した標準固形飼料からなる飽和脂肪酸が豊富な、コレステロールが豊富な（ＳＦＡ−ＣＨＯ）食餌（１ｋｇ固形飼料３５ｋｇ−１ブタ体重）を５０日間与える［ＲｏｙｏＴら、ＥｕｒｏｐｅａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｌｉｎｉｃａｌＩｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ（２０００）３０：８４３−５２］。飽和脂肪酸対不飽和脂肪酸比は、標準ブタ用固形飼料中の０．６からＳＦＡ−ＣＨＯ食餌中の１．１２に改変する。動物を２群にわけ、一方の群（ｎ＝８）にはＳＦＡ−ＣＨＯ食餌を与え、プラセボで処理し、もう一方の群（ｎ−８）にはＳＦＡ−ＣＨＯ食餌を与え、モジュレーター（３．０ｍｇｋｇ−１）で処理する。対照動物には標準固形飼料を５０日間与える。血液サンプルを、ベースライン（動物を収容した２日後）および食餌を開始して５０日後に採取する。血中脂質を分析する。動物は屠殺し、剖検する。

あるいは、前述の分析は、各々異なる用量の対象の化合物で処理された複数の群を含む。用量としては、例えば、０．１ｍｇｋｇ−１、０．３ｍｇｋｇ−１、１．０ｍｇｋｇ−１、３．０ｍｇｋｇ−１、１０ｍｇｋｇ−１、３０ｍｇｋｇ−１および１００ｍｇｋｇ−１が挙げられる。あるいは、前述の分析は、複数の時点、例えば、１０週、２０週、３０週、４０週および５０週で実施する。

ＨＤＬ−コレステロール
血液をクエン酸三ナトリウム中に採取する（３．８％、１：１０）。遠心分離（１２００ｇ１５分）した後に血漿を得、直ちに処理する。自動分析器ＫｏｄａｋＥｋｔａｃｈｅｍＤＴシステム（ＥａｓｔｍａｎＫｏｄａｋＣｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ，ＵＳＡ）を用いて、総コレステロール、ＨＤＬ−コレステロールおよびＬＤＬ−コレステロールを測定する。範囲を上回るパラメーター値を有するサンプルは、製造業者によって供給される溶液で希釈し、次いで、再分析する。総コレステロール／ＨＤＬ−コレステロール比を調べる。群間でＨＤＬ−コレステロールレベルの比較を行う。群間で総コレステロール／ＨＤＬ−コレステロール比の比較を行う。

対象の化合物の投与での、ＨＤＬ−コレステロールの上昇または総コレステロール／ＨＤＬ−コレステロール比の減少は、化合物が上記の有用性を有することを示すと取る。

アテローム性動脈硬化症
胸部大動脈および腹部大動脈を無傷で採取し、腹側面に沿って縦方向に切開し、組織学的検査ならびに脂質組成および合成研究のために、胸部大動脈および腹部大動脈中の標準部位からサンプルを切り出した後に中性緩衝ホルマリンで固定する。固定した後、大動脈全体をスダンＩＶで染色し、ピンで平坦に固定し、コンピュータ化画像解析システム（ＩｍａｇｅＰｒｏＰｌｕｓ；ＭｅｄｉａＣｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ，ＳｉｌｖｅｒＳｐｒｉｎｇ，ＭＤ）と接続したＴＶカメラでデジタル画像を撮り、動脈硬化病変と関連している大動脈表面のパーセンテージを調べる［ＧｅｒｒｉｔｙＲＧら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ（２００１）５０：１６５４−６５；ＣｏｒｎｈｉｌｌＪＦら、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，ＴｈｒｏｍｂｏｓｉｓおよびＶａｓｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ（１９８５）５：４１５−２６；これらの開示内容は、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる］。群間で動脈硬化病変と関連している大動脈表面のパーセンテージの比較を行う。

対象の化合物の投与での動脈硬化病変と関連している大動脈表面のパーセンテージの減少は、化合物が上記の有用性を有することを示すと取る。

血漿遊離脂肪酸
前述のイン・ビボブタモデルは、それだけには限らないが、血漿遊離脂肪酸の低下における化合物の活性に対応するために容易に改変されるということは当業者には容易に明らかであろう。

当業者ならば認識するであろうが、本明細書に示される例示的実施例への種々の改変、付加、置換および変法を、本発明の趣旨から逸脱することなく行うことができ、したがって、それらは本発明の範囲内と考えられる。それだけには限らないが、刊行物ならびに仮および正規の特許出願をはじめとする上記で参照されるすべての文書は、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる。

ヒト成人および胎児組織におけるヒトＧＰＲ４１発現のドットブロット分析を示す図である。正常および変異マウスの選択した組織におけるマウスＧＰＲ４１発現のＲＴ−ＰＣＲおよびＴａｑＭａｎ定量的ＰＣＲ解析を示す図である。マウス細胞種および組織におけるマウスＧＰＲ４１発現のＲＮアーゼ保護アッセイ分析を示す図である。ＧＰＲ４１のＧタンパク質Ｇαｉとの共役を示す図である。ＧＰＲ４１のＧタンパク質Ｇα１２／１３との共役を示す図である。Ｇｑ／Ｇｉで同時トランスフェクトされた２９３細胞におけるＧＰＲ４１アゴニストの有効性を示す。ＧＰＲ４１アゴニストが、ＭＩＮ６インスリノーマ細胞においてインスリン放出を阻害することを示す図である。ＧＰＲ４１アゴニスト、化合物４が、経口ブドウ糖負荷試験（ｏＧＴＴ）を低下させる化合物、Ｂ１１１の有益な効果を逆転させることを示す図である。

Claims

血糖安定化化合物を同定する方法であって、
ａ）候補化合物をＧＰＲ４１と接触させる工程と、
ｂ）ＧＰＲ４１の機能性が調節されるかどうかを調べる工程と
を含み、
ＧＰＲ４１の機能性の調節が、該候補化合物が血糖安定化化合物であることを示す方法。
前記ＧＰＲ４１がヒトである、請求項１に記載の方法。
前記調べる工程がセカンドメッセンジャーアッセイを含む、請求項１に記載の方法。
前記血糖安定化化合物が以下からなる群より選択される化合物を含む、請求項１に記載の方法：
２−メチル−４−（４−ニトロ−フェニル）−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミド、シクロプロパンカルボン酸４−［１，２，３］チアジアゾール４−イル−フェニルエステル、シクロプロパンカルボン酸；４−フラン−３−イル−２−メチル−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミド、４−フラン−３−イル−２−メチル−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸（２，５−ジクロロ−フェニル）−アミド、４−フラン−２−イル−２−メチル−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミド、４−フラン−３−イル−２−メチル−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸（４−クロロ−フェニル）−アミド、２−メチル−４−（４−メチルスルファニル−フェニル）−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミド、２−メチル−４−（３−ニトロ−フェニル）−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミド、２−メチル−４−［５−（２−ニトロ−４−トリフルオロメチル−フェニル）−フラン−２−イル］−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミド、４−（５−ビフェニル−２−イル−フラン−２−イル）−２−メチル−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミド、２−メチル−４−［５−（２−ニトロ−フェニル）−フラン−２−イル］−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸（２−クロロ−フェニル）−アミド、２−メチル−５−オキソ−４−（４−フェノキシ−フェニル）−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミド、２−メチル−５−オキソ−４−［５−（２−トリフルオロメトキシ−フェニル）−フラン−２−イル］−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミドおよび４−［５−（２，５−ジクロロ−フェニル）−フラン−２−イル］−２−メチル−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミドまたはその製薬上許容される塩。
請求項１に記載の方法によって同定される血糖安定化化合物。
前記血糖安定化化合物がＧＰＲ４１アゴニストである、請求項５に記載の化合物。
前記血糖安定化化合物が以下からなる群より選択される化合物を含む、請求項６に記載の化合物：
２−メチル−４−（４−ニトロ−フェニル）−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミド、シクロプロパンカルボン酸４−［１，２，３］チアジアゾール−４−イル−フェニルエステル、シクロプロパンカルボン酸；４−フラン−３−イル−２−メチル−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミド、４−フラン−３−イル−２−メチル−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸（２，５−ジクロロ−フェニル）−アミド、４−フラン−２−イル−２−メチル−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミド、４−フラン−３−イル−２−メチル−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸（４−クロロ−フェニル）−アミド、２−メチル−４−（４−メチルスルファニル−フェニル）−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミドおよび２−メチル−４−（３−ニトロ−フェニル）−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミドまたはその製薬上許容される塩。
前記血糖安定化化合物がＧＰＲ４１インバースアゴニストまたはアンタゴニストである、請求項５に記載の化合物。
前記血糖安定化化合物が以下からなる群より選択される化合物を含む、請求項８に記載の化合物：
２−メチル−４−［５−（２−ニトロ−４−トリフルオロメチル−フェニル）−フラン−２−イル］−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミド、４−（５−ビフェニル−２−イル−フラン−２−イル）−２−メチル−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミド、２−メチル−４−［５−（２−ニトロ−フェニル）−フラン−２−イル］−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸（２−クロロ−フェニル）−アミド、２−メチル−５−オキソ−４−（４−フェノキシ−フェニル）−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミド、２−メチル−５−オキソ−４−［５−（２−トリフルオロメトキシ−フェニル）−フラン−２−イル］−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミドおよび４−［５−（２，５−ジクロロ−フェニル）−フラン−２−イル］−２−メチル−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミドまたはその製薬上許容される塩。
血糖安定化化合物を同定する工程と、次いで、該化合物を担体と混合する工程とを含む組成物の調製方法であって、該化合物が請求項１に記載の方法によって同定される、方法。
請求項５に記載の化合物を含むか、本質的に請求項５に記載の化合物からなるか、または請求項５に記載の化合物からなる、薬剤組成物。
インスリン関連障害を治療または予防することを必要とする個体において、インスリン関連障害を治療または予防する方法であって、該個体に有効量の請求項１１に記載の化合物を投与する工程を含む方法。
前記インスリン関連障害が、低血糖症、インスリン分泌性もしくはインスリン依存性腫瘍、加齢、インスリン抵抗性、耐糖能障害または糖尿病である、請求項１２に記載の方法。
前記個体に、糖尿病、血液脂質障害または肥満症の治療に用いられる薬剤の有効量を、有効量の請求項１１に記載の化合物と組み合わせて投与する工程をさらに含む、請求項１２に記載の方法。
前記個体が哺乳類である、請求項１２に記載の方法。
前記個体がヒトである、請求項１２に記載の方法。
血糖安定化化合物として用いるための、請求項１１に記載の化合物を含む医薬の製造方法。
インスリン関連障害の治療に用いるための、請求項１１に記載の化合物を含む医薬の製造方法。
血糖安定化化合物を同定する方法であって、
ａ）候補化合物をＧＰＲ４１と接触させる工程と、
ｂ）ＧＰＲ４１の機能性が低減するかどうかを調べる工程と
を含み、
ＧＰＲ４１の機能性の低減が、該候補化合物が血糖安定化化合物であることを示す方法。
前記ＧＰＲ４１がヒトである、請求項１９に記載の方法。
前記調べる工程がセカンドメッセンジャーアッセイを含む、請求項１９に記載の方法。
前記血糖安定化化合物が以下からなる群より選択される化合物を含む、請求項１９に記載の方法：
２−メチル−４−［５−（２−ニトロ−４−トリフルオロメチル−フェニル）−フラン−２−イル］−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミド、４−（５−ビフェニル−２−イル−フラン−２−イル）−２−メチル−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミド、２−メチル−４−［５−（２−ニトロ−フェニル）−フラン−２−イル］−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸（２−クロロ−フェニル）−アミド、２−メチル−５−オキソ−４−（４−フェノキシ−フェニル）−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミド、２−メチル−５−オキソ−４−［５−（２−トリフルオロメトキシ−フェニル）−フラン−２−イル］−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミドおよび４−［５−（２，５−ジクロロ−フェニル）−フラン−２−イル］−２−メチル−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミドまたはその製薬上許容される塩。
請求項１９に記載の方法によって同定される血糖安定化化合物。
前記血糖安定化化合物がＧＰＲ４１インバースアゴニストである、請求項２３に記載の化合物。
前記血糖安定化化合物がＧＰＲ４１アンタゴニストである、請求項２３に記載の化合物。
前記血糖安定化化合物が以下からなる群より選択される化合物を含む、請求項２３に記載の化合物：
２−メチル−４−［５−（２−ニトロ−４−トリフルオロメチル−フェニル）−フラン−２−イル］−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミド、４−（５−ビフェニル−２−イル−フラン−２−イル）−２−メチル−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミド、２−メチル−４−［５−（２−ニトロ−フェニル）−フラン−２−イル］−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸（２−クロロ−フェニル）−アミド、２−メチル−５−オキソ−４−（４−フェノキシ−フェニル）−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミド、２−メチル−５−オキソ−４−［５−（２−トリフルオロメトキシ−フェニル）−フラン−２−イル］−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミドおよび４−［５−（２，５−ジクロロ−フェニル）−フラン−２−イル］−２−メチル−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミドまたはその製薬上許容される塩。
血糖安定化化合物を同定する工程と、次いで、該化合物を担体と混合する工程とを含む組成物の調製方法であって、該化合物が請求項１９に記載の方法によって同定される方法。
請求項２３に記載の化合物を含むか、本質的に請求項２３に記載の化合物からなるか、または請求項２３に記載の化合物からなる、薬剤組成物。
インスリン関連障害を治療または予防することを必要とする個体において、インスリン関連障害を治療または予防する方法であって、該個体に有効量の請求項２８に記載の化合物を投与する工程を含む方法。
前記インスリン関連障害が、インスリン抵抗性、耐糖能障害または糖尿病である、請求項２９に記載の方法。
前記個体に、糖尿病、血液脂質障害または肥満症の治療に用いられる薬剤の有効量を、有効量の請求項２８に記載の化合物と組み合わせて投与する工程をさらに含む、請求項２９に記載の方法。
ＧＰＲ４１を、有効量のＧＰＲ４１インバースアゴニストまたはアンタゴニストと接触させる工程を含む、ＧＰＲ４１機能を低下させる方法。
前記インバースアゴニストまたはアンタゴニストが以下からなる群より選択される化合物を含む、請求項３２に記載のＧＰＲ４１インバースアゴニストまたはアンタゴニスト：
２−メチル−４−［５−（２−ニトロ−４−トリフルオロメチル−フェニル）−フラン−２−イル］−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミド、４−（５−ビフェニル−２−イル−フラン−２−イル）−２−メチル−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミド、２−メチル−４−［５−（２−ニトロ−フェニル）−フラン−２−イル］−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸（２−クロロ−フェニル）−アミド、２−メチル−５−オキソ−４−（４−フェノキシ−フェニル）−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミド、２−メチル−５−オキソ−４−［５−（２−トリフルオロメトキシ−フェニル）−フラン−２−イル］−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミドおよび４−［５−（２，５−ジクロロ−フェニル）−フラン−２−イル］−２−メチル−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−キノリン−３−カルボン酸ｏ−トリルアミドまたはその製薬上許容される塩。
血糖値を低下させることを必要とする個体において血糖値を低下させる方法であって、該個体に有効量のＧＰＲ４１インバースアゴニストまたはアンタゴニストを投与する工程を含む方法。
インスリン分泌を増大させることを必要とする個体においてインスリン分泌を増大させる方法であって、該個体に有効量のＧＰＲ４１インバースアゴニストまたはアンタゴニストを投与する工程を含む方法。