TWI440460B

TWI440460B - 用於治療胰島素相關病症之ｇｐｒ４１及其調節子

Info

Publication number: TWI440460B
Application number: TW094138487A
Authority: TW
Inventors: James N Leonard; Zhi Liang Chu; P Douglas Boatman; Marc A Bruce
Original assignee: Arena Pharm Inc
Priority date: 2004-11-03
Filing date: 2005-11-02
Publication date: 2014-06-11
Also published as: ES2498972T3; CN101084018B; SG170642A1; EP1812080A2; JP2013082748A; WO2006052566A3; WO2006052566A2; JP2008518635A; EP1812080B1; US20080312277A1; TW200633707A; AU2005305083B2; JP5785354B2; IL182574A0; CA2584224A1; HK1100358A1; IL182574A; CN101084018A; AU2005305083A1

Description

用於治療胰島素相關病症之GPR41及其調節子

本發明係關於藉由測定化合物是否調節GPR41功能來鑑定可穩定血糖之化合物之方法，該可穩定血糖之化合物係(例如)控制胰島素分泌之化合物。因此，本發明之化合物適用於預防或治療諸如低血糖症、胰島素分泌或胰島素依賴性腫瘤、老化、胰島素抗性、葡萄糖耐受異常或糖尿病之胰島素相關病症。

細胞將葡萄糖用作主要能源。因此，食物在利用之前首先經機體分解成葡萄糖。接著，葡萄糖自消化道釋放並進入血液中，導致血糖含量升高。作為對此葡萄糖含量升高的反應，胰腺β－胰島細胞所產生及分泌之胰島素增加。胰島素經血液循環且充當信息，向諸如脂肪組織、肌肉及肝臟之胰島素反應器官發送訊號以增加其對葡萄糖之攝取。因此，血糖增加，伴隨β－細胞所分泌之胰島素隨後增加。胰島素之增加使血糖含量回復正常。健康個體之血糖含量保持相當恆定。該稱作正常血糖含量(正常葡萄糖含量)之平衡狀態受胰島素緊密控制。

在諸如糖尿病之疾病中，缺乏該血糖含量緊密調節，此導致在糖尿病患者體內觀測到血糖含量增加。由於胰腺β－細胞產生之胰島素不足及/或諸如肌肉、肝臟及脂肪之目標器官未充分攝取葡萄糖，可出現高血糖症(高葡萄糖含量)之病狀。最終結果為血糖含量增加。因此，可認為糖尿病係兩種類型障礙所產生之結果：β－細胞之胰島素分泌障礙及主要胰島素反應器官之胰島素敏感性障礙。該胰島素敏感性障礙亦稱作胰島素抗性(由於該等器官對胰島素之效應具有抗性)，意謂為使目標器官之葡萄糖攝取量增加而需要更多的胰島素。由於β－細胞需要增加其胰島素分泌來補償胰島素抗性，胰島素抗性會導致β－細胞上的壓力增加。該逐步增強之問題首先導致胰島素耐受異常且由於胰腺不能繼續滿足胰島素之不斷增加需求，最終導致胰島素分泌之完全喪失。

糖尿病係特徵為異常葡萄糖穩定狀態導致血糖升高之一類病症的診斷術語。糖尿病具有多種類型，但最普遍之兩種類型為I型(亦稱為胰島素依賴性糖尿病或IDDM)及Ⅱ型(亦稱為非胰島素依賴性糖尿病或NIDDM)。I型糖尿病主要為發病年齡年輕之疾病，且係由於胰腺中之分泌胰島素的β－細胞受免疫系統破壞。在此狀況下，身體無法辨別出作為其自身細胞之胰腺β－細胞並破壞其自身細胞。伴隨β－細胞受到破壞，胰島素分泌完全喪失且受此影響之個體完全依靠胰島素來生存。Ⅱ型糖尿病主要為發病年齡較晚之疾病(一般在40歲以後)，但近年來更常見診斷出Ⅱ型糖尿病之年輕人。其主要特徵為胰島素抗性及β細胞耗盡且通常與肥胖症有關。Ⅱ型糖尿病比I型糖尿病更普遍且占全世界所有診斷為糖尿病案例之90－95%。

組織慢性曝露於高血糖症可導致多種併發症，其包括神經病、視網膜病及腎病之小血管問題及中風、冠狀心臟病及末梢血管疾病之大血管併發症。血糖含量之不當控制亦為除糖尿病以外之疾病的特徵，諸如肥胖症、老化及X症候群。舉例而言，X症候群之一特徵為胰島素抗性或葡萄糖不可耐受性。此外，肥胖症之特徵為胰島素過高症與胰島素抗性(與NIDDM共有之特點)、血壓過高及動脈粥樣硬化。此外，肥胖症為NIDDM之主要風險因子。超重30%或更多之受檢者發展成NIDDM之風險增至三倍，且四分之三的NIDDM患者超重。

在實驗性動物及人類中，肥胖症作為卡路里攝取與能量消耗失衡之結果與胰島素抗性及糖尿病高度有關。然而，肥胖症－糖尿病症候群所涉及之分子機制仍在研究中。在肥胖症之早期發展期間，增加胰島素分泌會平衡胰島素抗性且保護患者免於罹患高血糖症(Le Stunff等人，Diabetes 43：696－702(1989))。然而，隨著時間過去，β細胞功能退化且約20%之肥胖個體發展成非胰島素依賴性糖尿病(Pederson,P.之Diab.Metab.Rev.5：505－509(1989)及Brancati,F.L.等人之Arch.Intern.Med.159：957－963(1999))。已知肥胖症在現代社會高度普遍，其因此成為NIDDM之最主要風險因子(Hill,J.O等人，Science 280：1371－1374(1998))。然而，使一些患者易於因脂肪堆積而改變胰島素分泌之因子仍未可知。遺憾的是，治療肥胖症之有效長期療法仍不可得。

糖尿病困擾全世界數百萬人。僅在美國就有一千八百萬餘名糖尿病患者且每年有600,000例新診斷病例。糖尿病患者具有較高之罹患心臟病、失明、腎衰竭、感染、末端切除及其它病況之風險。據估計，在2002年，美國因糖尿病而支出之直接醫療費用及間接實用為$1320億。總之，糖尿病併發症為該國之主要死亡原因之一。

確實存在治療糖尿病之療法，諸如α－葡糖苷酶抑制劑類、雙胍類、噻唑烷二酮類、美格替耐(meglitinide)類、磺醯脲類及外源性胰島素。然而，該等療法僅具有有限效應且與顯著安全性及耐受性問題有關，諸如具有罹患低血糖發作、體重增加、腸胃紊亂及貧血症之風險。此外，多種治療選項均需要提供順應性挑戰之注射或每日多次給藥。

除受益於胰島素分泌增加的病症(諸如糖尿病)之外，許多病症可受益於胰島素分泌減少。例如，胰島素分泌減少可導致在低血糖症期間所需之血糖增加。另外，例如，胰島素分泌減少對於罹患胰島瘤之患者可為有益的，胰島瘤為分泌過度胰島素的腫瘤。胰島素亦可對某些瘤起生長因子之作用。另外，已知熱量限制下調胰島素分泌且此可能為熱量限制對壽命之有利影響的媒介。因此，胰島素分泌減少可有益於治療老化。在全部此等情況下，胰島素含量之減少可係有益的。

因此，需要鑑定安全且有效地調節胰島素分泌及/或血糖含量之藥劑以治療胰島素相關病症，諸如低血糖症、胰島素分泌或胰島素依賴性腫瘤、老化、胰島素抗性、葡萄糖耐受異常或糖尿病。本發明滿足該需要且同樣提供相關優點。

申請者意外發現GPR41表現於胰島細胞系中且在db/db糖尿病小鼠內GPR41上調。另外，申請者已鑑定調節GPR41功能之激動劑化合物且發現此等化合物減少胰島素分泌。另外，申請者揭示GPR41之逆相激動劑或拮抗劑，其可使用於增加胰島素分泌以用於治療胰島素相關病症，諸如胰島素抗性、葡萄糖耐受異常及糖尿病。

本發明之第一態樣描述一種用於鑑定可穩定血糖之化合物之方法，其包含：a)使候選化合物與GPR41接觸；及b)測定GPR41功能是否受到調節，其中GPR41功能之調節表示候選化合物為可穩定血糖之化合物。在一些實施例中，該GPR41為人類的。在一些實施例中，該測定包含第二信息者檢定。在一些實施例中，可穩定血糖之化合物包含選自下列各物組成之群的化合物：2－甲基－4－(4－硝基－苯基)－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺、環丙基羧酸4－[1,2,3]噻二唑－4－基－苯酯、環丙基羧酸；4－呋喃－3－基－2－甲基－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺、4－呋喃－3－基－2－甲基－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸(2,5－二氯－苯基)－醯胺、4－呋喃－2－基－2－甲基－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺、4－呋喃－3－基－2－甲基－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸(4－氯－苯基)－醯胺、2－甲基－4－(4－甲基硫基－苯基)－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺、2－甲基－4－(3－硝基－苯基)－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺、2－甲基－4－[5－(2－硝基－4－三氟甲基－苯基)－呋喃－2－基]－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺、4－(5－聯苯－2－基－呋喃－2－基)－2－甲基－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺、2－甲基－4－[5－(2－硝基－苯基)－呋喃－2－基]－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸(2－氯－苯基)－醯胺、2－甲基－5－氧代－4－(4－苯氧基－苯基)－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺,2－甲基－5－氧代－4－[5－(2－三氟甲氧基－苯基)－呋喃－2－基]－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺及4－[5－(2,5－二氯－苯基)－呋喃－2－基]－2－甲基－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺；或其醫藥學上可接受的鹽。

本發明之第二態樣描述根據第一態樣之方法所鑑定之可穩定血糖之化合物。在一些實施例中，該可穩定血糖之化合物為GPR41激動劑，例如選自下列各物組成之群的化合物：2－甲基－4－(4－硝基－苯基)－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺、環丙基羧酸4－[1,2,3]噻二唑－4－基－苯酯、環丙基羧酸；4－呋喃－3－基－2－甲基－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺、4－呋喃－3－基－2－甲基－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸(2,5－二氯－苯基)－醯胺、4－呋喃－2－基－2－甲基－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺、4－呋喃－3－基－2－甲基－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸(4－氯－苯基)－醯胺、2－甲基－4－(4－甲基硫基－苯基)－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺及2－甲基－4－(3－硝基－苯基)－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺；或其醫藥學上可接受的鹽。在一些實施例中，該可穩定血糖之化合物為GPR41之逆相激動劑或拮抗劑，例如選自下列各物組成之群的化合物：2－甲基－4－[5－(2－硝基－4－三氟甲基－苯基)－呋喃－2－基]－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺、4－(5－聯苯－2－基－呋喃－2－基)－2－甲基－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺、2－甲基－4－[5－(2－硝基－苯基)－呋喃－2－基]－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸(2－氯－苯基)－醯胺、2－甲基－5－氧代－4－(4－苯氧基－苯基)－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺、2－甲基－5－氧代－4－[5－(2－三氟甲氧基－苯基)－呋喃－2－基]－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺及4－[5－(2,5－二氯－苯基)－呋喃－2－基]－2－甲基－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺；或其醫藥學上可接受的鹽。

本發明之第三態樣描述一種用於製備組合物之方法，其包含鑑定可穩定血糖之化合物及接著使該化合物與載劑混合，其中該化合物係經由第一態樣之方法來鑑定。

本發明之第四態樣描述一種醫藥組合物，其包含第二態樣之化合物，大體上由其組成或由其組成。

本發明之第五態樣描述一種用於治療或預防有需要之個體的胰島素相關病症之方法，其包含將有效量之第四態樣化合物投與至該個體。在一些實施例中，該胰島素相關病症為低血糖症、胰島素分泌或胰島素依賴性腫瘤、老化、胰島素抗性、葡萄糖耐受異常或糖尿病。在一些實施例中，第五態樣之方法進一步包含將有效量之用於治療糖尿病、血脂病症或肥胖症的藥劑與有效量之第四態樣化合物組合投與至該個體。在一些實施例中，該個體為哺乳動物且在一些實施例中，該個體為人類。

本發明之第六態樣描述一種用於製造包含用作可穩定血糖之化合物的第四態樣化合物之醫藥品之方法，且描述一種用於製造包含用於治療胰島素相關病症的第四態樣化合物之醫藥品之方法。

本發明之第七態樣描述一種用於鑑定可穩定血糖之化合物之方法，其包含：a)使候選化合物與GPR41接觸；及b)測定GPR41功能是否增強，其中GPR41功能增強表示候選化合物為可穩定血糖之化合物。在一些實施例中，該GPR41為人類的。在一些實施例中，該測定包含第二信息者檢定。在一些實施例中，可穩定血糖之化合物包含選自下列各物組成之群的化合物：2－甲基－4－(4－硝基－苯基)－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺、環丙基羧酸4－[1,2,3]噻二唑－4－基－苯酯、環丙基羧酸；4－呋喃－3－基－2－甲基－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺、4－呋喃－3－基－2－甲基－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸(2,5－二氯－苯基)－醯胺、4－呋喃－2－基－2－甲基－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺、4－呋喃－3－基－2－甲基－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸(4－氯－苯基)－醯胺、2－甲基－4－(4－甲基硫基－苯基)－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺及2－甲基－4－(3－硝基－苯基)－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺；或其醫藥學上可接受的鹽。

本發明之第八態樣描述根據第七態樣之方法所鑑定之可穩定血糖之化合物。在一些實施例中，該可穩定血糖之化合物為GPR41激動劑，例如選自下列各物組成之群的化合物：2－甲基－4－(4－硝基－苯基)－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺、環丙基羧酸4－[1,2,3]噻二唑－4－基－苯酯、環丙基羧酸；4－呋喃－3－基－2－甲基－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺、4－呋喃－3－基－2－甲基－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸(2,5－二氯－苯基)－醯胺、4－呋喃－2－基－2－甲基－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺、4－呋喃－3－基－2－甲基－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸(4－氯－苯基)－醯胺、2－甲基－4－(4－甲基硫基－苯基)－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺及2－甲基－4－(3－硝基－苯基)－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺；或其醫藥學上可接受的鹽。

本發明之第九態樣描述一種用於製備組合物之方法，其包含鑑定可穩定血糖之化合物及接著使該化合物與載劑混合，其中該化合物係經由第七態樣之方法來鑑定。

本發明之第十態樣描述一種醫藥組合物，其包含第八態樣之化合物，大體上由其組成或由其組成。

本發明之第十一態樣描述一種用於治療或預防有需要之個體的胰島素相關病症之方法，其包含將有效量之第十態樣化合物投與至該個體。在一些實施例中，該胰島素相關病症為低血糖症、胰島素分泌或胰島素依賴性腫瘤、老化。在一些實施例中，該個體為哺乳動物且在一些實施例中，該個體為人類。

本發明之第十二態樣描述一種用於製造包含用作可穩定血糖之化合物的第八態樣化合物之醫藥品之方法，且描述一種用於製造包含用於治療胰島素相關病症的第八態樣化合物之醫藥品之方法。

本發明之第十三態樣描述一種用於鑑定可穩定血糖之化合物之方法，其包含：a)使候選化合物與GPR41接觸；及b)測定GPR41功能是否降低，其中GPR41功能降低表示候選化合物為可穩定血糖之化合物。在一些實施例中，該GPR41為人類的。在一些實施例中，該測定包含第二信息者檢定。在一些實施例中，該可穩定血糖之化合物包含選自下列各物組成之群的化合物：2－甲基－4－[5－(2－硝基－4－三氟甲基－苯基)－呋喃－2－基]－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺、4－(5－聯苯－2－基－呋喃－2－基)－2－甲基－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺、2－甲基－4－[5－(2－硝基－苯基)－呋喃－2－基]－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸(2－氯－苯基)－醯胺、2－甲基－5－氧代－4－(4－苯氧基－苯基)－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺、2－甲基－5－氧代－4－[5－(2－三氟甲氧基－苯基)－呋喃－2－基]－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺及4－[5－(2,5－二氯－苯基)－呋喃－2－基]－2－甲基－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺；或其醫藥學上可接受的鹽。

本發明之第十四態樣描述根據第十三態樣之方法所鑑定之可穩定血糖之化合物。在一些實施例中，該可穩定血糖之化合物為GPR41之逆相激動劑或拮抗劑。在一些實施例中，該可穩定血糖之化合物包含選自下列各物組成之群的化合物：2－甲基－4－[5－(2－硝基－4－三氟甲基－苯基)－呋喃－2－基]－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺、4－(5－聯苯－2－基－呋喃－2－基)－2－甲基－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺、2－甲基－4－[5－(2－硝基－苯基)－呋喃－2－基]－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸(2－氯－苯基)－醯胺、2－甲基－5－氧代－4－(4－苯氧基－苯基)－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺、2－甲基－5－氧代－4－[5－(2－三氟甲氧基－苯基)－呋喃－2－基]－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺及4－[5－(2,5－二氯－苯基)－呋喃－2－基]－2－甲基－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺；或其醫藥學上可接受的鹽。

本發明之第十五態樣描述一種用於製備組合物之方法，其包含鑑定可穩定血糖之化合物及接著使該化合物與載劑混合，其中該化合物係經由第十三態樣之方法來鑑定。

本發明之第十六態樣描述一種醫藥組合物，其包含第十四態樣之化合物，大體上由其組成或由其組成。

本發明之第十七態樣描述一種用於治療或預防有需要之個體的胰島素相關病症之方法，其包含將有效量之第十六態樣化合物投與至該個體。在一些實施例中，該胰島素相關病症為胰島素抗性、葡萄糖耐受異常或糖尿病。在一些實施例中，第十七態樣之方法進一步包含將有效量之用於治療糖尿病、血脂病症或肥胖症的藥劑與有效量之第十六態樣化合物組合投與至該個體。在一些實施例中，該個體為哺乳動物且在一些實施例中，該個體為人類。

本發明之第十八態樣描述一種用於製造包含用作可穩定血糖之化合物的第十六態樣化合物之醫藥品之方法，且描述一種用於製造包含用於治療胰島素相關病症的第十六態樣化合物之醫藥品之方法。

本發明之第十九態樣描述一種用於增強GPR41功能之方法，其包含使GPR41接觸有效量之GPR41激動劑。在一些實施例中，該激動劑包含選自下列各物組成之群的化合物：2－甲基－4－(4－硝基－苯基)－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺、環丙基羧酸4－[1,2,3]噻二唑－4－基－苯酯、環丙基羧酸；4－呋喃－3－基－2－甲基－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺、4－呋喃－3－基－2－甲基－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸(2,5－二氯－苯基)－醯胺、4－呋喃－2－基－2－甲基－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺、4－呋喃－3－基－2－甲基－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸(4－氯－苯基)－醯胺、2－甲基－4－(4－甲基硫基－苯基)－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺及2－甲基－4－(3－硝基－苯基)－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺；或其醫藥學上可接受的鹽。

本發明之第二十態樣描述一種用於降低GPR41功能之方法，其包含使GPR41接觸有效量之GPR41之逆相激動劑或拮抗劑。在一些實施例中，該逆相激動劑或拮抗劑包含選自下列各物組成之群的化合物：2－甲基－4－[5－(2－硝基－4－三氟甲基－苯基)－呋喃－2－基]－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺、4－(5－聯苯－2－基－呋喃－2－基)－2－甲基－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺、2－甲基－4－[5－(2－硝基－苯基)－呋喃－2－基]－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸(2－氯－苯基)－醯胺、2－甲基－5－氧代－4－(4－苯氧基－苯基)－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺、2－甲基－5－氧代－4－[5－(2－三氟甲氧基－苯基)－呋喃－2－基]－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺及4－[5－(2,5－二氯－苯基)－呋喃－2－基]－2－甲基－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺；或其醫藥學上可接受的鹽。

本發明之第二十一態樣描述一種用於治療或預防胰島素相關病症之方法，其包含將有效量之GPR41調節劑投與至有需要之個體。在一些實施例中，該胰島素相關病症為低血糖症、胰島素分泌或胰島素依賴性腫瘤或老化且該調節劑為激動劑，例如選自下列各物組成之群的化合物：2－甲基－4－(4－硝基－苯基)－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺、環丙基羧酸4－[1,2,3]噻二唑－4－基－苯酯、環丙基羧酸；4－呋喃－3－基－2－甲基－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺、4－呋喃－3－基－2－甲基－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸(2,5－二氯－苯基)－醯胺、4－呋喃－2－基－2－甲基－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺、4－呋喃－3－基－2－甲基－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸(4－氯－苯基)－醯胺、2－甲基－4－(4－甲基硫基－苯基)－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺及2－甲基－4－(3－硝基－苯基)－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺；或其醫藥學上可接受的鹽。在一些實施例中，該胰島素相關病症為胰島素抗性、葡萄糖耐受異常或糖尿病且該調節劑為逆相激動劑或拮抗劑，例如選自下列各物組成之群的化合物：2－甲基－4－[5－(2－硝基－4－三氟甲基－苯基)－呋喃－2－基]－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺、4－(5－聯苯－2－基－呋喃－2－基)－2－甲基－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺、2－甲基－4－[5－(2－硝基－苯基)－呋喃－2－基]－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸(2－氯－苯基)－醯胺、2－甲基－5－氧代－4－(4－苯氧基－苯基)－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺、2－甲基－5－氧代－4－[5－(2－三氟甲氧基－苯基)－呋喃－2－基]－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺及4－[5－(2,5－二氯－苯基)－呋喃－2－基]－2－甲基－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺；或其醫藥學上可接受的鹽。在一些實施例中，第二十一態樣之方法進一步包含將有效量之用於治療糖尿病、血脂病症或肥胖症之藥劑與有效量之GPR41逆相激動劑或拮抗劑組合投與至該個體。

本發明之第二十二態樣描述一種藉由增強GPR41功能來治療或預防可治療或可預防病症之方法，其包含向有需要之個體施以有效量之選自下列各物組成之群的化合物：2－甲基－4－(4－硝基－苯基)－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺、環丙基羧酸4－[1,2,3]噻二唑－4－基－苯酯、環丙基羧酸；4－呋喃－3－基－2－甲基－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺、4－呋喃－3－基－2－甲基－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸(2,5－二氯－苯基)－醯胺、4－呋喃－2－基－2－甲基－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺、4－呋喃－3－基－2－甲基－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸(4－氯－苯基)－醯胺、2－甲基－4－(4－甲基硫基－苯基)－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺及2－甲基－4－(3－硝基－苯基)－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺；或其醫藥學上可接受的鹽。在一些實施例中，該病症為胰島素相關病症，例如低血糖症、胰島素分泌或胰島素依賴性腫瘤或老化。

本發明之第二十三態樣描述一種藉由降低GPR41功能來治療或預防可治療或可預防病症之方法，其包含向有需要之個體施以有效量之選自下列各物組成之群的化合物：2－甲基－4－[5－(2－硝基－4－三氟甲基－苯基)－呋喃－2－基]－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺、4－(5－聯苯－2－基－呋喃－2－基)－2－甲基－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺、2－甲基－4－[5－(2－硝基－苯基)－呋喃－2－基]－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸(2－氯－苯基)－醯胺、2－甲基－5－氧代－4－(4－苯氧基－苯基)－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺、2－甲基－5－氧代－4－[5－(2－三氟甲氧基－苯基)－呋喃－2－基]－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺及4－[5－(2,5－二氯－苯基)－呋喃－2－基]－2－甲基－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺；或其醫藥學上可接受的鹽。在一些實施例中，該病症為胰島素相關病症，例如胰島素抗性、葡萄糖耐受異常、或糖尿病。在一些實施例中，該胰島素相關病症為Ⅱ型糖尿病。在一些實施例中，第二十三態樣之方法進一步包含將有效量之用於治療糖尿病、血脂病症或肥胖症之藥劑與有效量之GPR41逆相激動劑或拮抗劑組合投與至該個體。

本發明之第二十四態樣描述一種用於增加有需要個體的血糖含量之方法，其包含將有效量之GPR41激動劑投與至該個體，該激動劑例如為選自下列各物組成之群的化合物：2－甲基－4－(4－硝基－苯基)－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺、環丙基羧酸4－[1,2,3]噻二唑－4－基－苯酯、環丙基羧酸；4－呋喃－3－基－2－甲基－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺、4－呋喃－3－基－2－甲基－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸(2,5－二氯－苯基)－醯胺、4－呋喃－2－基－2－甲基－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺、4－呋喃－3－基－2－甲基－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸(4－氯－苯基)－醯胺、2－甲基－4－(4－甲基硫基－苯基)－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺及2－甲基－4－(3－硝基－苯基)－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺；或其醫藥學上可接受的鹽。

本發明之第二十五態樣描述一種用於降低有需要個體的血糖含量之方法，其包含將有效量之GPR41逆相激動劑或拮抗劑投與至該個體，該逆相激動劑或拮抗劑例如為選自下列各物組成之群的化合物：2－甲基－4－[5－(2－硝基－4－三氟甲基－苯基)－呋喃－2－基]－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺、4－(5－聯苯－2－基－呋喃－2－基)－2－甲基－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺、2－甲基－4－[5－(2－硝基－苯基)－呋喃－2－基]－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸(2－氯－苯基)－醯胺、2－甲基－5－氧代－4－(4－苯氧基－苯基)－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺、2－甲基－5－氧代－4－[5－(2－三氟甲氧基－苯基)－呋喃－2－基]－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺及4－[5－(2,5－二氯－苯基)－呋喃－2－基]－2－甲基－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺；或其醫藥學上可接受的鹽。

本發明之第二十六態樣描述一種用於降低有需要個體的胰島素分泌之方法，其包含將有效量之GPR41激動劑投與至該個體，該激動劑例如為選自下列各物組成之群的化合物：2－甲基－4－(4－硝基－苯基)－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺、環丙基羧酸4－[1,2,3]噻二唑－4－基－苯酯、環丙基羧酸；4－呋喃－3－基－2－甲基－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺、4－呋喃－3－基－2－甲基－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸(2,5－二氯－苯基)－醯胺、4－呋喃－2－基－2－甲基－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺、4－呋喃－3－基－2－甲基－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸(4－氯－苯基)－醯胺、2－甲基－4－(4－甲基硫基－苯基)－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺及2－甲基－4－(3－硝基－苯基)－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺；或其醫藥學上可接受的鹽。

本發明之第二十七態樣描述一種用於增加有需要個體的胰島素分泌之方法，其包含將有效量之GPR41逆相激動劑或拮抗劑投與至該個體，該逆相激動劑或拮抗劑例如為選自下列各物組成之群的化合物：2－甲基－4－[5－(2－硝基－4－三氟甲基－苯基)－呋喃－2－基]－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺、4－(5－聯苯－2－基－呋喃－2－基)－2－甲基－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺、2－甲基－4－[5－(2－硝基－苯基)－呋喃－2－基]－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸(2－氯－苯基)－醯胺、2－甲基－5－氧代－4－(4－苯氧基－苯基)－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺、2－甲基－5－氧代－4－[5－(2－三氟甲氧基－苯基)－呋喃－2－基]－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺及4－[5－(2,5－二氯－苯基)－呋喃－2－基]－2－甲基－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺；或其醫藥學上可接受的鹽。

申請者已在本文中揭示，人類GPR41係顯著表現於胰腺(參看圖1)中且小鼠GPR41係表現於胰腺及胰島細胞系中(參看圖2與圖3)。胰腺由相連之組織隔膜分割為小葉。小葉主要由稱為腺泡之外分泌細胞的葡萄狀簇組成，該等細胞分泌消化酶。郎格罕氏島(Islets of Langerhans)嵌入胰腺之外分泌組織內，其為胰腺之內分泌組分。胰島僅構成胰腺之1%。胰島含有幾種細胞類型且富集血管。胰島細胞類型包括：α、β、γ、A、B、C、D與E。β胰島細胞分泌胰島素。

申請者亦在本文中揭示，與C57野生型小鼠之胰島相比小鼠GPR41在db/db糖尿病小鼠之胰島細胞中上調(參看圖2)。另外，申請者已在本文中揭示了GPCR GPR41與G－αi及G－α 12/13的G蛋白偶合(參看圖4與圖5)。另外，申請者在本文中揭示，GPR41激動劑誘導以Gq/Gi共轉染之細胞中的IP3傳送訊號。申請者另外在本文中揭示，GPR41激動劑抑制胰島素分泌(圖7)且逆轉口服葡萄糖耐受測試(oGTT)降低化合物的有益效果(圖8)，其中使用MIN6胰島瘤細胞。

儘管人體中存在多種受體種類，G蛋白偶合受體(GPCR)種類代表最充足且當前最具治療相關性之受體種類。據估計，人類基因組中存在大約30,000－40,000種基因，且預計其中大約2%為GPCR編碼。GPCR代表醫藥產品之重要研究領域：已研究出100種已知GPCR中之約20種、所有處方藥劑中之約60%。

GPCR擁有共同的結構基元，其在22至24種疏水性胺基酸之間具有七種序列並形成七種α螺旋，各螺旋均跨膜(各跨膜係由數目來鑑定，即跨膜－1(TM－1)、跨膜－2(TM－2)等)。該等跨膜螺旋係由跨膜－2與跨膜－3、跨膜－4與跨膜－5及跨膜－6與跨膜－7之間的胺基酸鏈連接在細胞膜之外部或"細胞外"側(其分別係指"細胞外"區域1、2及3(EC－1、EC－2及EC－3))。該等跨膜螺旋亦係由跨膜－1與跨膜－2、跨膜－3與跨膜－4及跨膜－5與跨膜－6之間的胺基酸鏈連接在細胞膜之內部或"細胞內"側(其分別係指"細胞內"區域1、2及3(IC－1、IC－2及IC－3))。受體之"羧基"("C")末端位於細胞內之細胞內間隙中，且受體之"胺基"("N")末端位於細胞外部之細胞外間隙中。

一般而言，當配位體與受體結合(通常係指受體"活化")時，受體構形發生變化，促進細胞內區域與細胞內"G－蛋白質"之間的偶合。已報導，GPCR相對於G蛋白而言為"混雜"物，即一GPCR可與一種以上G蛋白交互作用。參看Kenakin,T.,43Life Sciences 1 095(1988)。儘管存在其它G蛋白，目前Gq、Gs、Gi、Gz及Go為己鑑定之G蛋白。將配位體活化之GPCR與G－蛋白質偶合會起始一訊號級聯過程(稱作"訊號轉導")。在正常情形下，訊號轉導最終導致細胞活化或細胞抑制作用。儘管不慾受限於理論，吾人認為IC－3環以及受體之羧基末端與G蛋白交互作用。

亦存在混雜G蛋白，該等蛋白質似乎將數種GPCR與諸如Gα15或Gα16之磷脂酶C路徑偶合(Offermanns & Simon,J Biol Chem 270：15175－80(1995))；或存在嵌合G蛋白，其係設計為使多種不同GPCR與諸如磷脂酶C之同一路徑偶合(Milligan & Rees,Trends in Pharmaceutical Sciences 20：118－24(1999))。

Gi偶合之GPCR會降低細胞內cAMP含量。黑素細胞(參看下文)適用於鑑定Gi－偶合之GPCR亦及鑑定該等Gi－偶合GPCR之調節劑。

在生理狀況下，GPCR係以兩種不同構形平衡存在於細胞膜中："惰性"狀態及"活性"狀態。惰性狀態下之受體不能與細胞內訊號轉導路徑連接以起始導致生物反應之訊號傳導。將受體構形轉換成活性狀態，此允許與轉導路徑連接(經由G－蛋白質)且產生生物反應。

可藉由配位體或諸如藥物之化合物使活性狀態之受體穩定。最近發現(包括但不完全限於受體胺基酸序列之修飾)提供了除配位體或藥物以外的措施來促進及穩定呈活性狀態構形之受體。該等措施藉由仿真配位體與受體結合之效果而有效地穩定活性狀態之受體。藉由該等不依賴於配位體之措施來進行穩定係稱作"構成性受體活化"。

GPR41之序列首先公開在Sawzdargo等人的文獻中(Sawzdargo et al.,Biochem.Biophys.Res.Commun., 239：543－547(1997))。Sawzdargo等人以基於人類與大鼠甘丙肽受體1(GALR1)與大鼠GALR2中之保守序列的退化引子使用PCR擴增人類染色體組DNA。一種產物含有顯示出與人類CD22基因之3－起始區之一部分100%同源的區段。Sawzdargo搜索了此區域中之開放閱讀框架且鑑定GPR40與GPR41基因。GPR41基因沒有內含子。GPR41編碼含有7個跨膜結構域、1個糖基化位點、1個PKC磷基化位點、2個PKA/PKC磷基化位點及1個位於C－端結構域之棕櫚醯基化位點的經預測之346胺基酸GPCR。GPR41蛋白與GPR42具有98%胺基酸同一性，但與GALR之相似性較少。Sawzdargo等人進一步報導GPR41基因位於CD22之下游，CD22預先定位於19q13.1。

將GPR41分類為孤兒受體，其意味未鑑定該受體之配位體。近來，Brown等人報導GPR41由丙酸鹽及其它短鏈羧酸陰離子活化(Brown等人，J.Biol.Chem. ,278：11312－11319(2003))。另外，Brown等人指出GPR41活化Gi/o家族蛋白質且GPR41主要表現於脂肪組織中。

與本文所揭示之GPR41表現於胰腺之β細胞中形成對比，WO 01/61359(申請日期2001年2月19日)指出GPR41侷限在脂肪組織內。另外，WO 01/61359指出GPR41可用作抑制脂解之化合物的篩選目標。由於GPR41偶合於Gi，因此該等化合物可為GPR41激動劑。在WO 01/61359中亦假定GPR41之激動劑可用於(例如)製造治療下列病症之醫藥品：血脂異常及與血脂異常相關病況、冠狀心臟病、動脈粥樣硬化、血栓症或肥胖症、絞痛、慢性腎衰竭、末梢血管疾病、中風、Ⅱ型糖尿病或代謝症候群之治療的藥物製造。此與本文中之揭示內容形成對比，本文中揭示GPR41之逆相激動劑或拮抗劑可用於(例如)製造治療胰島素相關病症(諸如糖尿病)的醫藥品。

定義

圍繞受體展開之科學文獻已採用多個術語來指稱對受體具有各種影響之配位體。為達成清楚及一致性，整個該專利文獻將使用以下定義。

激動劑應意謂諸如配位體或候選化合物之材料，其與受體結合時將激發細胞內反應。例如，細胞內反應可為增強GTP與膜之結合或調節諸如cAMP或IP3之第二信息者的含量。在一些實施例中，激動劑係與受體結合時可激活細胞內反應之先前未知材料(舉例而言，增強GTPγS與膜之結合或降低細胞內cAMP含量)。在一些實施例中，激動劑係與受體結合時可降低血糖含量之先前未知材料。術語激動劑亦包括作為諸如配位體或候選化合物之材料的部分激動劑，其在以比完全激動劑更低之程度或範圍與受體結合時可激發細胞內反應。

拮抗劑應意謂諸如配位體或候選化合物之材料，其與在同一部位作為激動劑之受體競爭性結合但不激發細胞內反應，且可藉此以激動劑來引起細胞內反應。在激動劑不存在時，拮抗劑不減少基線細胞內反應。在一些實施例中，拮抗劑係與受體結合時與激動劑競爭以抑制細胞內反應之先前未知材料(舉例而言，其中細胞內反應為GTPγS與膜結合或降低細胞內cAMP含量)。

在本文中，抗體係用以涵蓋單株抗體及多株抗體。術語抗體進一步係用以涵蓋IgG、IgA、IgD、IgE及IgM。抗體包括全部抗體，其包括單鏈全部抗體與包括Fab、Fab'、F(ab)2及F(ab')2之其抗原結合片段。抗體可來自任何天然或合成來源，例如來自人類、鼠科、家兔、山羊、豚鼠、倉鼠、駱駝、驢、綿羊、馬或雞。抗體可具有由解離常數或Kd值代表之結合親和力，例如小於5×10－6M、10－6M、5×10－7M、10－7M、5×10－8M、10－8M、5×10－9M、10－9M、5×10－10M、10－10M、5×10－11M、10－11M、5×10－12M、10－12M、5×10－13M、10－13M、5×10－14M、10－14M、5×10－15M及10－15M。本發明之抗體可由此項技術中已知之任何合適方法來製備。

候選化合物應意謂符合篩選技術之分子(例如化合物)。術語候選化合物特定地排除任何已經得知可調節GPR41之化合物，例如已知之GPR41激動劑。

組合物應意謂包含至少兩種化合物或兩種組份之材料；例如"醫藥組合物"為組合物。

化合物功效應意謂化合物抑制或促進受體功能之能力的量測，與受體結合親和力相反。

構成性活化受體應意謂經受構成性受體活化之受體。

構成性受體活化應意謂藉助於與使受體與其內因性配位體或其化學等效物結合不同之措施來使活化狀態之受體達到穩定。

接觸應意謂使至少兩個部分在活體外系統或活體內系統中結合在一起。

如本文所用之糖尿病係用以涵蓋以任何方法做出之常見糖尿病診斷，其包括(例如)以下清單：糖尿病症狀(例如多尿、煩渴、食慾過盛)加之大於或等於200 mg/dl之偶見血糖含量，其中偶見血糖係定義為一天中之任何時間，與食用食物或飲料之時間無關；或大於或等於126 mg/dl之8小時禁食血糖含量；或在經口施以溶解於水中的75 g無水葡萄糖之後兩小時之時，大於或等於200 mg/dl之血糖含量。此外，如本文所用之術語糖尿病亦包括如美國糖尿病協會所定義之"糖尿病先驅"狀態，禁食血糖含量為100－125 mg/dl或在經口施以葡萄糖之後兩小時的血糖含量為140－199 mg/dl。糖尿病可由包括以下之幾種條件促成：(例如)β胰島細胞的自體免疫破壞、β細胞凋亡或懷孕(妊娠期糖尿病)。

內因性應意謂哺乳動物天然產生之材料。關於(例如，但不限於)術語"受體"之內因性應意謂其係由哺乳動物(例如，但不限於人類)天然產生或為病毒。相反，術語非內因性在本文中應意謂其並非係由哺乳動物(例如，但不限於人類)天然產生或不為病毒。舉例而言(但不限於此)，呈內因性形式之受體並不具有構成性活性，但當受控變得具有構成性活性時，其在本文中最佳稱作"非內因性、構成性活化受體"。兩術語皆可用於描述"活體內"及"活體外"系統。舉例而言(但不限於此)，內因性或非內因性受體在篩選法中可與活體外篩選系統有關。

有效量意謂在研究人員、醫生或其它臨床醫師所探尋之組織、系統或個體中引起所要生物或醫學反應之活性化合物或醫藥組合物的量。舉例而言，有效劑量可為可治療胰島素相關病症之量。亦舉例而言，有效劑量可為可預防胰島素相關病症之量。

可穩定血糖之化合物用以意味一種穩定血糖含量的化合物。血糖之穩定可為直接的或間接的。例如，可穩定血糖之化合物可藉由增加胰島素分泌來穩定患有糖尿病個體中的血糖含量。另外，例如，可穩定血糖之化合物可藉由降低胰島素分泌來穩定患有低血糖症個體中的血糖含量。另外，例如，可穩定血糖之化合物可藉由增加器官或組織處的葡萄糖敏感性來穩定血糖含量。

本文中所用之葡萄糖耐受異常(IGT)用以表示與胰島素抗性相關之病況，胰島素抗性係明顯之2型糖尿病與正常葡萄糖耐受(NGT)之間的中間狀態。由以下程序診斷IGT，其中如評定餐後2小時之血糖含量來測定患病之人的餐後葡萄糖反應異常。在此測試中，給予患者經量測之量的葡萄糖且定期(通常前兩小時為每半小時且其後為每小時)量測血糖含量。在"正常"或非IGT個體中，葡萄糖含量在前兩小時期間升高至小於140 mg/dl的含量且之後迅速下降。在IGT個體中，血糖含量較高且含量下降速率較慢。

如本文所用，需要預防或治療係指看護者(例如，就人類而言為內科醫師、護士、從業護士等；就包括非人類哺乳動物之動物而言為獸醫)做出判斷，即個體或動物要求治療或受益於治療。該判斷係基於看護者專業知識領域中之多種因子而做出，但該等因子包括下列知識，即個體或動物患有或將患有可由本發明化合物治療之病況。

如本文所用之個體係指任何動物，其包括哺乳動物，較佳為小鼠、大鼠、其它齧齒動物、家兔、狗、貓、豬、牛、綿羊、馬或靈長類動物且最佳為人類。

關於術語"反應"，抑制應意謂與不存在化合物之情形相對，在化合物存在之情形下可減少或預防之反應。

胰島素相關病症意味一種與血液中或器官或組織處之胰島素含量相關之病症。如本文中所述，胰島素相關病症可由(例如)胰島素分泌過少、胰島素分泌過多或甚至由胰島素分泌正常聯同器官對胰島素抵抗而引起。胰島素相關病症用以包括(例如)將受益於胰島素分泌降低之病症，例如低血糖症、胰島瘤(一種其中胰島素為生長因子之腫瘤)或老化。另外，胰島素相關病症用以包括(例如)導致血糖升高且將受益於胰島素分泌增加的病症。該等病症包括(例如)胰島素抗性、葡萄糖耐受異常或糖尿病(諸如I型糖尿病或Ⅱ型糖尿病)。另外，在一些實施例中，術語胰島素相關病症可包括與血糖含量升高相關之疾病，例如動脈粥樣硬化、心臟病、中風、高血壓、X症候群、肥胖症及末梢血管疾病。

如本文所用之胰島素抗性係用以涵蓋由多種方法中之任何方法對胰島素抗性做出之常見診斷，該等方法包括(但不限於)：靜脈內葡萄糖耐受性測試或禁食胰島素含量之量測。已熟知，禁食胰島素含量之高度與胰島素抗性之程度良好相關。因此，吾人可將高禁食胰島素含量用作胰島素抗性之代用標記以達成鑑定具有胰島素抗性的正常葡萄糖耐受性(NGT)個體之目的。亦可使用正常葡萄糖鉗夾測試來進行胰島素抗性之診斷。

逆相激動劑意味例如配位體或候選化合物之物質，其結合於內源形式或構成活化形式之受體，以減少在無激動劑時所觀察到的受體之基線細胞內反應。細胞內反應可為(例如)調節GTP與膜之結合或調節第二信息者(諸如cAMP或IP3)之含量。在一些實施例中，逆相激動劑為預先未知的減少在無激動劑時所觀察到的受體基線細胞內反應之物質。

配位體應意謂對內因性、天然存在受體具有特異性之內因性、天然存在分子。

如本文所用，術語調節應係指增加或減少特定活性、功能或分子之量、品質、反應或效應。GPR41調節劑為調節GPR41受體之藥劑。

醫藥組合物應意謂包含至少一種化合物及醫藥學上可接受之載劑的組合物。舉例而言，醫藥組合物可包含至少一種活性成份，藉此可將該組合物用於研究動物(例如，諸如人類之哺乳動物)體內的特定有效結果。熟習此項技術者將瞭解並理解適用於測定活性成份是否具有基於技藝人士所需要的所要有效結果之技術。

受體功能應係指使受體接收刺激且調節細胞內作用之常規操作，其包括(但不限於)調節基因轉錄、調節離子流入及流出、實現催化反應及/或調節G蛋白之活性。例如，GPR41功能可結合諸如Gi或G12/13之G－蛋白質、經由諸如cAMP或IP3之第二信息者傳送訊號(當使用嵌合G－蛋白質時)、與GPR41特異性抗體特異結合、與諸如GPR41激動劑或逆相激動劑之化合物特異結合，調節胰島素分泌或調節體內之血糖含量。

第二信息者應意謂因受體活化而產生之細胞內反應。例如，第二信息者可包括三磷酸肌醇(IP3)、二醯化甘油(DAG)、環AMP(cAMP)、環GMP(cGMP)及Ca2＋。可量測第二信息者反應以測定受體活化作用。此外，可量測第二信息者反應以直接鑑定候選化合物，其包括(例如)逆相激動劑、部分激動劑、激動劑及拮抗劑。

本發明係關於一種用於鑑定可穩定血糖之化合物之方法，其包含：a)使候選化合物與GPR41接觸；及b)測定GPR41功能是否受到調節，其中GPR41功能之調節表示候選化合物為可穩定血糖之化合物。可使用該篩選方法鑑定可(例如)為GPR41之激動劑、逆相激動劑、部分激動劑或拮抗劑的化合物。

如本文所用，"GPR41"係指多肽，該多肽具有SEQ ID NO：2中所示胺基酸序列，或具有此序列之變異體或直系同源基因，其大體上保留具有如SEQ ID NO：2所引用的胺基酸序列之多肽的功能。

當然，可在未破壞功能之情形下對GPR41進行有限改變或修飾。舉例而言，GPR41係用以包括其它GPR41多肽，例如人類GPR41多肽之哺乳動物物種直系同源基因。人類GPR41之物種直系同源基因序列存在於數據庫中，例如可在GenBank登記號No.XM_145470中發現GPR41之小鼠直系同源基因且可在GenBank登記號XM_344880中發現GPR41之大鼠直系同源基因。此外，GPR41包括變異體，諸如對偶基因變異體、接合變異體及GPR41之保守胺基酸取代變異體。舉例而言，GPR41包括之變異體大體上保留野生型GPR41多肽之功能，諸如經G－αi或G－α12/13傳送訊號之能力、與GPR41特異性抗體特異結合之能力、與諸如已知配位體或激動劑之化合物特異結合之能力、與本文所揭示之激動劑或逆相激動劑化合物特異結合之能力、或調整胰島素分泌或血糖含量之能力。GPR41變異體不必具有與野生型GPR41達到相同含量之功能且不必含有野生型GPR41之每一種功能。

使用諸如局部相似性基本查詢工具(Basic Local Alignment Search Tool)("BLAST")之可得算法及程序且使用默認設置[例如，參看Karlin及Altschul,Proc Natl Acad Sci USA(1990)87：2264－8；Altschul等人，J Mol Biol(1990)215：403－410；Altschul等人，Nature Genetics(1993)3：266－72；及Altschul等人，Nucleic Acids Res(1997)25：3389－3402]，可將胺基酸序列之保守及非保守胺基酸轉化、間隙及插入與參考序列相對照。

當然，定義中包括大體上保留整個多肽之一功能之GPR41片段。舉例而言，可使用GPR41之訊號產生域或GPR41之化合物結合域來替代整個多肽。此外，GPR41可含有諸如抗原決定部位標記或其它稠合多肽之異源序列。此外，GPR41可含有標記，例如放射性標記、螢光標記或酶標記。

在一實施例中，可使用多肽來應用本發明之方法，該多肽包含SEQ ID NO：2的99%、98%、95%、92%、90%、85%、80%或75%序列同一性，其中該多肽不為GPR42。

在一些實施例中，該GPR41變異體為GPR41之非內因性、構成性活化突變體。在一實施例中，該GPR41係源自哺乳動物。在另一實施例中，該GPR41為人類的。

在特定實施例中，該GPR41為重組體。在特定實施例中，該接觸包含與表現GPCR之宿主細胞或宿主細胞之膜接觸，其中該宿主細胞包含表現載體，該表現載體包含編碼受體之聚核苷酸。在一些實施例中，該接觸係在已知之GPCR激動劑或本文所揭示之激動劑存在下進行。

在特定實施例中，該方法進一步包含將由候選化合物所引起之受體調節與藉由使該受體接觸已知之受體調節劑所引起的第二種受體調節比較的步驟。在特定實施例中，該已知調節劑為激動劑。

在一些實施例中，該測定包含第二信息者檢定，例如經由量測GTPγS與包含該GPCR之膜的結合來測定。在特定實施例中，該GTPγS以[³ ⁵ S]標記。在特定實施例中，該測定係經由量測選自下列各物組成之群的第二信息者之含量：環AMP(cAMP)、環GMP(cGMP)、三磷酸肌醇(IP3)、二醯化甘油(DAG)、MAP激酶活性及Ca² ^＋。在特定實施例中，該第二信息者為cAMP。在特定實施例中，該cAMP之量測使用全細胞腺苷醯環化酶檢定來執行。在特定實施例中，該cAMP之量測以包含該GPCR的膜來執行。在特定實施例中，該測定係經由量測細胞內之IP3。在特定實施例中，該測定進一步包括使用嵌合G蛋白(諸如Gq/Gi嵌合體)。在特定實施例中，該第二信息者為MAP激酶活性。在一些實施例中，該測定係經由CRE報導體檢定。在特定實施例中，該報導體為螢光素酶。在一些實施例中，該報導體為β半乳糖苷酶。在特定實施例中，該測定或該比較係經由量測細胞內之Ca² ^＋。

在一些實施例中，該測定係經由量測獲自哺乳動物之脂肪細胞對葡萄糖之攝取量。在一些實施例中，該測定係經由量測獲自哺乳動物之骨骼肌細胞對葡萄糖之攝取量。

在特定實施例中，該測定係經由使用黑素細胞檢定。

在一些實施例中，該可穩定血糖之化合物包含選自下列各物組成之群的化合物：2－甲基－4－(4－硝基－苯基)－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺、環丙基羧酸4－[1,2,3]噻二唑－4－基－苯酯、環丙基羧酸；4－呋喃－3－基－2－甲基－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺、4－呋喃－3－基－2－甲基－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸(2,5－二氯－苯基)－醯胺、4－呋喃－2－基－2－甲基－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺、4－呋喃－3－基－2－甲基－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸(4－氯－苯基)－醯胺、2－甲基－4－(4－甲基硫基－苯基)－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺、2－甲基－4－(3－硝基－苯基)－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺、2－甲基－4－[5－(2－硝基－4－三氟甲基－苯基)－呋喃－2－基]－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺、4－(5－聯苯－2－基－呋喃－2－基)－2－甲基－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺、2－甲基－4－[5－(2－硝基－苯基)－呋喃－2－基]－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸(2－氯－苯基)－醯胺、2－甲基－5－氧代－4－(4－苯氧基－苯基)－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺,2－甲基－5－氧代－4－[5－(2－三氟甲氧基－苯基)－呋喃－2－基]－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺及4－[5－(2,5－二氯－苯基)－呋喃－2－基]－2－甲基－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺；或其醫藥學上可接受的鹽。

本發明亦係關於一種用於鑑定作為胰島素分泌調節劑的候選化合物之方法，其包含a)使候選化合物與GPR41接觸；及b)測定GPR41功能是否受到調節，其中GPR41功能之調節表示該候選化合物為胰島素分泌調節劑。舉例而言，降低GPR41功能之化合物可導致胰島素分泌增加，諸如GPR41拮抗劑或逆相激動劑。例如，在患有諸如糖尿病之胰島素抗性之個體中，可需要增加胰島素分泌。增強GPR41功能之化合物可導致胰島素分泌減少，諸如GPR41激動劑。例如，在低血糖症個體中，可需要減少胰島素分泌。

本發明亦係關於一種用於鑑定作為血糖濃度調節劑的候選化合物之方法，其包含a)使候選化合物與GPR41接觸；及b)測定GPR41功能是否經調節，其中GPR41功能之調節表示該候選化合物為血糖濃度調節劑。本發明亦係關於一種用於鑑定作為胰島素分泌調節劑的候選化合物之方法，其包含a)使候選化合物與GPR41接觸；及b)測定GPR41功能是否受到調節，其中GPR41功能之調節表示該候選化合物為胰島素分泌調節劑。舉例而言，降低GPR41功能之化合物可導致胰島素分泌增加及血糖濃度減少，諸如GPR41逆相激動劑或拮抗劑。例如，在患有諸如糖尿病之高血糖症之個體中，可需要減少血糖。增強GPR41功能之化合物可導致胰島素分泌減少及血糖濃度增加，諸如GPR41激動劑。例如，在低血糖症個體中，可需要增加血糖。

在特定實施例中，該GPR41為重組體。在特定實施例中，該接觸包含與表現GPCR之宿主細胞或宿主細胞膜接觸，其中該宿主細胞包含表現載體，該表現載體包含編碼受體之聚核苷酸。在一些實施例中，該接觸係GPCR激動劑存在下進行。

在本發明之方法中，可進行對照反應來展示反應特異性。舉例而言，可將仿真轉染細胞與GPR41轉染細胞對照以展示GPR41受體之反應特異性。

在本發明方法之特定實施例中，該候選化合物並非其抗體或抗原結合衍生物。在特定實施例中，該候選化合物並不為肽。在特定實施例中，該候選化合物並不為多肽。

如上所述，受體功能係指使受體接收刺激且調節細胞內作用之常規操作，其包括(但不限於)調節基因轉錄、調節離子流入及流出、實現催化反應及/或調節G蛋白質之活性。例如，GPR41功能可結合諸如Gi或G12/13之G－蛋白質、經諸如cAMP或IP3之第二信息者傳送訊號(當使用嵌合G－蛋白質時)、與GPR41特異性抗體特異結合、與諸如GPR41激動劑或逆相激動劑之化合物特異結合、調節胰島素分泌或調節體內之血糖含量。

在本發明之方法中，該測定包含第二信息者檢定。例如，可藉由量測諸如環AMP(cAMP)、環GMP(cGMP)、三磷酸肌醇(IP3)、二醯化甘油(DAG)、MAP酶或鈣之第二信息者的含量來測定細胞內訊號之起始。此項技術中已熟知數種用於量測該等第二信息者之檢定，例如cAMP檢定、IP3檢定、FLIPR檢定、黑素細胞檢定或CRE－受體檢定。此外，本文之實例12－17揭示第二信息者檢定之實例。在特定實施例中，該第二信息者為cAMP。在其它實施例中，該第二信息者為IP3。在其它實施例中，該第二信息者為鈣。

在一實施例中，藉由量測GTPγS與包含該GPCR之膜的結合來進行該測定。該等檢定在此項技術中已為吾人所熟知且在本文之實例12及14中進行例示性說明。在特定實施例中，該GTPγS係經[³ ⁵ S]標記。

本發明亦係關於一種可根據以下方法鑑定的可穩定血糖之化合物：a)使用候選化合物與GPR41接觸，及b)測定GPR41功能是否受到調節，其中GPR41功能之調節表示該候選化合物為可穩定血糖之化合物。

例如，本發明提供一種根據以下方法鑑定的可穩定血糖之化合物：a)使候選化合物與GPR41接觸，及b)測定GPR41功能是否受到調節，其中GPR41功能之調節表示該候選化合物為可穩定血糖之化合物。

在一實施例中，該可穩定血糖之化合物為GPR41激動劑。例如，該可穩定血糖之化合物包含選自下列各物組成之群的化合物：2－甲基－4－(4－硝基－苯基)－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺、環丙基羧酸4－[1,2,3]噻二唑－4－基－苯酯、環丙基羧酸；4－呋喃－3－基－2－甲基－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺、4－呋喃－3－基－2－甲基－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸(2,5－二氯－苯基)－醯胺、4－呋喃－2－基－2－甲基－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺、4－呋喃－3－基－2－甲基－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸(4－氯－苯基)－醯胺、2－甲基－4－(4－甲基硫基－苯基)－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺及2－甲基－4－(3－硝基－苯基)－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺；或其醫藥學上可接受的鹽。

在一些實施例中，該可穩定血糖之化合物係GPR41激動劑。在一些實施例中，該可穩定血糖之化合物為EC50小於10 μM、小於1 μM、小於100 nM或小於10 nM之GPR41激動劑。在一些實施例中，該可穩定血糖之化合物為EC50之值選自1 nM至10 μM區間的激動劑。在一些實施例中，該可穩定血糖之化合物為EC50之值選自1 nM至1 μM區間的激動劑。在一些實施例中，該可穩定血糖之化合物為EC50之值選自1 nM至100 nM區間的激動劑。在一些實施例中，可穩定血糖之化合物為EC50之值選自1 nM至10 nM區間的激動劑。

在特定實施例中，使用選自由以下各方法組成之群的檢定來測定該EC50：使用表現重組GPR41多肽之轉染HEK293細胞來進行IP3檢定；及使用表現重組GPR41多肽之轉染黑素細胞來進行黑素細胞檢定。在一些實施例中，該可穩定血糖之化合物為在該檢定中EC50小於10 μM、小於1 μM、小於100 nM或小於10 nM的激動劑。在一些實施例中，該可穩定血糖之化合物為在該檢定中EC50小於10 μM、小於9 μM、小於8 μM、小於7 μM、小於6 μM、小於5 μM、小於4 μM、小於3 μM、小於2 μM、小於1 μM、小於900 nM、小於800 nM、小於700 nM、小於600 nM、小於500 nM、小於400 nM、小於300 nM、小於200 nM、小於100 nM、小於90 nM、小於80 nM、小於70 nM、小於60 nM、小於50 nM、小於40 nM、小於30 nM、小於20 nM、小於10 nM的激動劑。在一些實施例中，該可穩定血糖之化合物為在該檢定中EC50之值選自1 nM至10 μM區間的激動劑。在一些實施例中，該可穩定血糖之化合物為在該檢定中EC50之值選自1 nM至1 μM區間的激動劑。在一些實施例中，該可穩定血糖之化合物為在該檢定中EC50之值選自1 nM至100 nM區間的激動劑。在一些實施例中，該可穩定血糖之化合物為在該檢定中EC50之值選自1 nM至10 nM區間的激動劑。在一些實施例中，該可穩定血糖之化合物對GPCR具有選擇性。

在一些實施例中，該可穩定血糖之化合物為GPR41逆相激動劑或拮抗劑。例如，該可穩定血糖之化合物可含選自下列各物組成之群的化合物：2－甲基－4－[5－(2－硝基－4－三氟甲基－苯基)－呋喃－2－基]－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺、4－(5－聯苯－2－基－呋喃－2－基)－2－甲基－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺、2－甲基－4－[5－(2－硝基－苯基)－呋喃－2－基]－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸(2－氯－苯基)－醯胺、2－甲基－5－氧代－4－(4－苯氧基－苯基)－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺、2－甲基－5－氧代－4－[5－(2－三氟甲氧基－苯基)－呋喃－2－基]－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺及4－[5－(2,5－二氯－苯基)－呋喃－2－基]－2－甲基－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺；或其醫藥學上可接受的鹽。

在一些實施例中，該可穩定血糖之化合物為EC50小於10 μM、小於1 μM、小於100 nm或小於10 nm之GPR41之逆相激動劑或拮抗劑。在一些實施例中，該可穩定血糖之化合物為EC50之值選自1 nM至10 μM區間的逆相激動劑或拮抗劑。在一些實施例中，該可穩定血糖之化合物為EC50之值選自1 nM至1 μM區間的逆相激動劑或拮抗劑。在一些實施例中，該可穩定血糖之化合物為EC50之值選自1 nM至100 nM區間的逆相激動劑或拮抗劑。在一些實施例中，該可穩定血糖之化合物為EC50之值選自1 nM至10 nM區間的逆相激動劑或拮抗劑。

在特定實施例中，使用選自由以下各方法組成之群的檢定來測定該EC50：使用表現重組GPR41多肽之轉染HEK293細胞來進行IP3檢定；及使用表現重組GPR41多肽之轉染黑素細胞來進行黑素細胞檢定。在一些實施例中，該可穩定血糖之化合物為在該檢定中EC50小於10 μM、小於1 μM、小於100 nM或小於10 nM的逆相激動劑或拮抗劑。在一些實施例中，該可穩定血糖之化合物為在該檢定中EC50小於10 μM、小於9 μM、小於8 μM、小於7 μM、小於6 μM、小於5 μM、小於4 μM、小於3 μM、小於2 μM、小於1 μM、小於900 nM、小於800 nM、小於700 nM、小於600 nM、小於500 nM、小於400 nM、小於300 nM、小於200 nM、小於100 nM、小於90 nM、小於80 nM、小於70 nM、小於60 nM、小於50 nM、小於40 nM、小於30 nM、小於20 nM、小於10 nM的逆相激動劑或拮抗劑。在一些實施例中，該可穩定血糖之化合物為在該檢定中EC50之值選自1 nM至10 μM區間的逆相激動劑或拮抗劑。在一些實施例中，該可穩定血糖之化合物為在該檢定中EC50之值選自1 nM至1 μM區間的逆相激動劑或拮抗劑。在一些實施例中，該可穩定血糖之化合物為在該檢定中EC50之值選自1 nM至100 nM區間的逆相激動劑或拮抗劑。在一些實施例中，該可穩定血糖之化合物為在該檢定中EC50之值選自1 nM至10 nM區間的逆相激動劑或拮抗劑。在一些實施例中，該可穩定血糖之化合物對GPCR具有選擇性。

在一些實施例中，該可穩定血糖之化合物具有經口生物可用性。在一些實施例中，該經口生物可用性相對於經腹膜內投藥為至少1%、至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%或至少45%。在一些實施例中，該經口生物可用性相對於經腹膜內投藥為至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%或至少45%。在一些實施例中，該經口生物可用性可穩定血糖之化合物可進一步通過血腦屏障。

此外，本發明係關於一種用於製備組合物之方法，該方法包含鑑定可穩定血糖之化合物及接著使該化合物與載劑混合，其中該化合物可根據以下方法來鑑定：a)使候選化合物與GPR41接觸；及b)測定GPR41功能是否受到調節，其中GPR41功能之調節表示該候選化合物為可穩定血糖之化合物。舉例而言，本發明提供一種用於製備組合物之方法，其包含鑑定可穩定血糖之化合物及接著使該化合物與載劑混合，其中該化合物係根據以下方法來鑑定：a)使候選化合物與GPR41接觸；及b)測定GPR41功能是否受到調節，其中GPR41功能之調節表示該候選化合物為可穩定血糖之化合物。此外，本發明提供一種用於製備組合物之方法，該方法包含鑑定可穩定血糖之化合物及接著使該化合物與載劑混合，其中該化合物包含選自下列各物組成之群的化合物：2－甲基－4－(4－硝基－苯基)－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺、環丙基羧酸4－[1,2,3]噻二唑－4－基－苯酯、環丙基羧酸；4－呋喃－3－基－2－甲基－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺、4－呋喃－3－基－2－甲基－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸(2,5－二氯－苯基)－醯胺、4－呋喃－2－基－2－甲基－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺、4－呋喃－3－基－2－甲基－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸(4－氯－苯基)－醯胺、2－甲基－4－(4－甲基硫基－苯基)－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺及2－甲基－4－(3－硝基－苯基)－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺；或其醫藥學上可接受的鹽。

本發明亦提供一種醫藥組合物，其包含：根據以下方法鑑定之可穩定血糖之化合物：a)使候選化合物與GPR41接觸，及b)測定GPR41功能是否受到調節，其中GPR41功能之調節表示該候選化合物為可穩定血糖之化合物；大體上由其組成或由其組成。

本發明之一些實施例包括一種用於製備醫藥組合物之方法，該方法包含使至少一種根據本文所揭示的任何化合物實施例之化合物與醫藥學上可接受之載劑混合。

可使用此項技術中所熟知之技術將化合物調配成醫藥組合物。本文所述者除外，合適的醫藥學上可接受之載劑可用於彼等技術；舉例而言，參看Remington's Pharmaceutical Sciences，第16版，1980,Mack Publishing Co.(Oslo等人編輯)。

為了達成用於預防或治療之目的，本文中所揭示或由本發明之方法鑑定之化合物有可能在替代用途中可作為粗化學品或純化學品來投藥，其可適於提供作為另外包含醫藥學上可接受之載劑的醫藥調配物或組合物存在之化合物或活性成份。

因此，本發明進一步提供醫藥調配物，其包含本文中所揭示或由本發明之方法鑑定之化合物或其醫藥學上可接受之鹽或衍生物與一或多種其醫藥學上可接受之載劑及/或預防成份。該(等)載劑在與調配物之其它成份兼容之意義為"可接受的"且對其接受者而言不會過度有害。

醫藥調配物包括彼等適於經口、經直腸、經鼻、局部(包括經口腔及舌下)、經陰道或非經腸(包括經肌肉內、皮下及靜脈內)投藥者或以適於藉由吸入或吹入來投藥之形式存在者。

因此，可將本發明之化合物及習知佐劑、載劑或稀釋劑置於醫藥調配物及其單位劑量之形式中，且在該形式中可用作諸如錠劑或填充膠囊之固體或諸如溶液、懸浮液、乳液、酒劑、凝膠之液體形式或以相同物質填充之膠囊，其係用於經口使用、以經直腸投藥之栓劑形式使用或以用於非經腸(包括經皮下)用途之無菌可注射溶液形式使用。該等醫藥組合物及其單位劑型可包含具有或不具有額外活性化合物或要素之習知比例的習知成份，且該等單位劑型可含有任何適當有效量之活性成份，其相當於待用之每日所要劑量範圍。

對經口投藥而言，醫藥組合物可為(例如)錠劑、膠囊、懸浮液或液體之形式。醫藥組合物之製備形式可為含有特定量活性成份之劑型。該等劑型之實例為膠囊、錠劑、散劑、顆粒或懸浮液，其含有諸如乳糖、甘露糖醇、玉米澱粉或馬鈴薯澱粉之習知添加劑；含有諸如結晶纖維素、纖維素衍生物、阿拉伯膠、玉米澱粉或明膠之黏合劑；含有諸如玉米澱粉、馬鈴薯澱粉或羧甲基纖維素鈉之崩解劑；且含有諸如滑石粉或硬脂酸鎂之潤滑劑。該活性成份亦可作為注射組合物來投用，其中(例如)鹽水、右旋糖或水可用作合適之醫藥學上可接受之載劑。

本發明係關於一種選擇性活化人類宿主之GPR41受體的方法，其包含將選擇性活化GPR41基因產物之化合物投與至需要該治療之人類宿主。舉例而言，該化合物可為GPR41激動劑，諸如：2－甲基－4－(4－硝基－苯基)－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺、環丙基羧酸4－[1,2,3]噻二唑－4－基－苯酯、環丙基羧酸；4－呋喃－3－基－2－甲基－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺、4－呋喃－3－基－2－甲基－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸(2,5－二氯－苯基)－醯胺、4－呋喃－2－基－2－甲基－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺、4－呋喃－3－基－2－甲基－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸(4－氯－苯基)－醯胺、2－甲基－4－(4－甲基硫基－苯基)－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺及2－甲基－4－(3－硝基－苯基)－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺；或其醫藥學上可接受的鹽。

本發明係關於一種選擇性抑制人類宿主之GPR41受體的方法，其包含將選擇性抑制GPR41基因產物之化合物投與至需要該治療之人類宿主。舉例而言，該化合物可為GPR41逆相激動劑，諸如：2－甲基－4－[5－(2－硝基－4－三氟甲基－苯基)－呋喃－2－基]－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺、4－(5－聯苯－2－基－呋喃－2－基)－2－甲基－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺、2－甲基－4－[5－(2－硝基－苯基)－呋喃－2－基]－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸(2－氯－苯基)－醯胺、2－甲基－5－氧代－4－(4－苯氧基－苯基)－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺、2－甲基－5－氧代－4－[5－(2－三氟甲氧基－苯基)－呋喃－2－基]－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺及4－[5－(2,5－二氯－苯基)－呋喃－2－基]－2－甲基－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺；或其醫藥學上可接受的鹽。

本發明提供一種用於治療或預防有需要個體的胰島素相關病症之方法，其包含將有效量的根據以下方法鑑定之化合物投與至該個體：a)使候選化合物與GPR41接觸，及b)測定GPR41功能是否受到調節，其中GPR41功能之調節表示該候選化合物為可穩定血糖之化合物。在一些實施例中，該胰島素相關病症為低血糖症、胰島素分泌或胰島素依賴性腫瘤、老化、胰島素抗性、葡萄糖耐受異常或糖尿病。在一些實施例中，該胰島素相關病症包括與血糖濃度升高相關之病況，諸如動脈粥樣硬化、心臟病、中風、高血壓、肥胖症、X症候群或末梢血管疾病。在一些實施例中，該胰島素相關病症為Ⅱ型糖尿病。在一實施例中，該投藥化合物包含GPR41激動劑。在一實施例中，該投藥化合物包含GPR41之逆相激動劑或拮抗劑。

在一實施例中，該方法進一步包含將有效量之用於治療糖尿病、血脂病症或肥胖症的藥劑與有效量之醫藥組合物組合投與至該個體，該醫藥組合物包含由以下方法鑑定之可穩定血糖之化合物，大體上由該化合物組成或由該化合物組成，該方法包含：a)使候選化合物與GPR41接觸；及b)測定GPR41功能是否受到調節，其中GPR41功能之調節表示該候選化合物為可穩定血糖之化合物。舉例而言，在一實施例中，該方法進一步包含將有效量之用於治療糖尿病、血脂病症或肥胖症的藥劑與有效量之含有GPR41逆相激動劑的醫藥組合物組合投與至該個體。在一實施例中，該個體為哺乳動物且在另一實施例中，該個體為人類。

如本文所用，關於病症之術語"治療"意謂減少與特定病症有關之一或多種症狀的嚴重性。因此，治療病症不必要意謂減少與病症有關之所有症狀的嚴重性且不必要意謂完全減少與病症有關之一或多種症狀的嚴重性。同樣，術語"預防"意謂預防與特定病症有關之一或多種症狀的發生或發作且不必要意謂病症之完全預防。本發明之方法可用於治療包括(例如)低血糖或糖尿病之胰島素相關病症。

當使用本文中所揭示或由本發明之方法鑑定之化合物時，其劑量可在廣泛範圍內變化且如通常所知及內科醫師所知，其適合每一個體情形中之個體病況。例如，其係取決於待治療病症之性質及嚴重性、患者之病況、所用之化合物或急性或慢性病狀是否已經治療或是否已進行預防或除本文中所揭示或由本發明之方法鑑定之化合物之外是否投用其它活性化合物。本發明之代表性劑量包括約0.01 mg至約1000 mg、約0.01至約750 mg、約0.01至約500 mg、0.01至約250 mg、0.01mg至約200 mg、約0.01 mg至150 mg、約0.01 mg至約100 mg及約0.01 mg至約75 mg。尤其當吾人認為需要相對大量藥物時，可每日投用多倍劑量，例如2、3或4倍劑量。若適當，則取決於個人習慣且若患者之內科醫師或看護者認為適當，則可有必要向上偏離或向下偏離每日劑量。

活性成分、或其活性鹽或衍生物用於治療之所需含量不僅會隨所選特定鹽而改變，且亦會因投藥途徑、所治療病況之性質及患者年齡及病況而有所不同，且最終係由巡診醫師或臨床醫師進行判斷。一般而言，熟習此項技術者應瞭解如何由通常為動物模型之模型系統所得活體內資料來推斷其它模型(諸如人類)之活體內資料。通常，動物模型包括(但不限於)如下文實例19所述之齧齒動物糖尿病模型(Reed and Scribnerin Diabetes,Obesity and Metabolism,1：75－86(1999)已報導其它動物模型)。在一些情形下，該等外推法僅可基於動物模型相較於其它動物模型(諸如哺乳動物，例如人類)之體重，然而，該等外推法通常不僅基於體重，且與多種因子有關。代表性因子包括患者之類型、年齡、體重、性別、飲食及醫學狀況、疾病之嚴重性、投藥途徑、諸如所用特定化合物的活性、功效、藥物動力學及毒理學概況之藥理學考慮、是否利用藥物傳送系統、急性或慢性病狀是否經治療或是否進行預防或除本文中所揭示或由本發明之方法鑑定之化合物之外是否投用其它活性化合物來用作藥物組合之部分。以本發明化合物及/或組合物來治療病況之給藥方案係根據如上文所列舉之多種因子來進行選擇。因此，所採用之實際給藥方案可廣泛變化，且因此會與較佳給藥方案有所不同，且熟習此項技術者應瞭解，可對該等典型範圍以外之劑量及給藥方案進行測試且適當時可將其用於本發明方法中。

所要劑量隨即可提供為單一劑量或以適當時間間隔投藥之分次劑量，例如每天以二、三、四個或更多分劑量來投藥。分劑量本身可進一步分割成(例如)多個離散間隔之投藥。尤其當投用相對大量藥物時，可將每日劑量分割成若干(例如2、3或4)份投藥。若適當，則可有必要視個人習慣而定來增加或減少每日所示劑量。

本文中所揭示或由本發明之方法鑑定之化合物可以多種經口及非經腸劑型來投藥。熟習此項技術者顯而易見，以下劑型可包含本文所揭示或由本發明之方法鑑定之化合物或本文所揭示或由本發明之方法鑑定之化合物的醫藥學上可接受之鹽作為活性組份。

為由本文中所揭示或由本發明之方法鑑定之化合物製備醫藥組合物，合適的醫藥學上可接受之載劑可選擇固體、液體或兩者之混合物。固體形式製劑包括散劑、錠劑、丸劑、膠囊、藥包、栓劑及可分散顆粒。固體載劑可為一或多種亦可充當稀釋劑、芳香劑、增溶劑、潤滑劑、懸浮劑、黏合劑、防腐劑、錠劑崩解劑或膠囊填充材料之物質。

對散劑而言，載劑係與細粉狀活性組份混合之細粉狀固體。對錠劑而言，將活性組份與具有必要黏合能力之載劑以適當比例混合，並將其壓實成所要形狀及尺寸。

散劑及錠劑可含有不同百分量之活性化合物。散劑或錠劑中之代表量可含有0.5%至約90%之活性化合物；然而，技藝人士將瞭解何時需要該範圍以外之量。適用於散劑及錠劑之載劑為碳酸鎂、硬脂酸鎂、滑石粉、糖、乳糖、果膠、糊精、澱粉、明膠、黃耆膠、甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉、低熔點蠟、可可油及其類似物。術語"製劑"係用以包括由活性化合物與作為載劑之膠囊填充材料所提供的膠囊調配物，其中活性組份(具有或不具有載劑)經載劑包圍，因此與其結合。同樣，亦包括藥包及含片。錠劑、散劑、膠囊、丸劑、藥包及含片可用作適於經口投藥之固體形式。

為了製備栓劑，首先將諸如脂肪酸甘油酯或可可油之低熔點蠟熔融，並藉由攪拌使活性組份均勻分散於其中。接著，將已熔融之均質混合物傾入適當尺寸之模具中，使其冷卻並藉此使其凝固。

適於經陰道投藥之調配物可呈現為子宮托、棉塞、乳膏、凝膠、糊劑、發泡體或噴霧，其除了含有活性成份以外，亦含有此項技術中已知之載劑。

液體形式製劑包括溶液、懸浮液及乳液，例如水或水－丙二醇溶液。舉例而言，可將非經腸注射液體製劑調配成水性聚乙二醇溶液中之溶液。根據已知技術，可使用合適分散劑或濕潤劑及懸浮劑來調配可注射製劑，例如無菌可注射水性或油性懸浮液。無菌可注射製劑亦可為無毒非經腸可接受之稀釋劑或溶劑中的無菌可注射溶液或懸浮液，例如1,3－丁二醇中之溶液。在可接受之媒劑及溶劑中，可採用水、林格氏溶液及等張氯化鈉溶液。此外，通常將無菌非揮發性油用作溶劑或懸浮介質。為達成此目的，可採用包括合成單甘油酯或甘油二酯之任何溫和非揮發性油。此外，諸如油酸之脂肪酸在可注射製劑之製備中得到應用。

因此，可將根據本發明之化合物調配成用於非經腸投藥(例如，藉由注射來投藥，例如快速注射或連續灌輸)，並可提供為在添加有防腐劑的安瓶、預填充注射器、小體積灌輸或多劑量容器中之單位劑型。醫藥組合物可採取諸如油性或水性媒劑中的懸浮液、溶液或乳液之形式，且可含有諸如懸浮劑、穩定劑及/或分散劑之調配劑。另外，活性成份可為藉由無菌固體之無菌分離或溶液凍乾所獲得的散劑形式，在使用之前與適當媒劑(例如，無菌、無熱原質之水)組合。

適於經口使用之水溶液可藉由將活性組份溶於水中且根據需要添加合適著色劑、香料、穩定劑及增稠劑來製備。

適於經口使用之水性懸浮液可藉由將細粉狀活性組份與黏性材料(諸如天然或合成膠狀物、樹脂、甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉)或其它熟知懸浮劑分散於水中來製備。

亦包括固體形式製劑，其係用於在使用之前隨即轉化成用於經口投藥之液體形式製劑。該等液體形式包括溶液、懸浮液及乳液。除活性組份之外，該等製劑可含有著色劑、香料、穩定劑、緩衝劑、人造及天然甜味劑、分散劑、增稠劑、增溶劑及其類似物。

對表皮之局部投藥而言，可將根據本發明之化合物調配成軟膏、乳膏或洗劑或調配成經皮貼片。

舉例而言，可藉由添加合適增稠劑及/或膠凝劑來使軟膏及乳膏與水性或油性基劑調配在一起。洗劑可與水性或油性基劑調配在一起，且一般亦將含有一或多種乳化劑、穩定劑、分散劑、懸浮劑、增稠劑或著色劑。

適於在口中局部投藥之調配物包括：含片，其包含在通常為蔗糖及阿拉伯膠或黃著膠之調味基劑中的活性劑；片劑，其包含在諸如明膠及甘油或蔗糖及阿拉伯膠之惰性基劑中的活性成份；及漱口藥，其包含在合適液體載劑中之活性成份。

藉由諸如滴管、吸管或噴霧器之習知方式直接將溶液或懸浮液應用於鼻腔。該等調配物可以單一劑型或多種劑型之形式來提供。在使用滴管或吸管之後一情形中，此可藉由向患者施以適當預定體積之溶液或懸浮液來實現。在噴霧情形中，此可藉助於(例如)計量霧化噴霧泵來實現。

亦可藉助於氣溶膠調配物來實現呼吸道之投藥，其中活性成份係由具有合適推進劑之加壓包裝來提供。若本文中所揭示或由本發明之方法鑑定之化合物或含其之醫藥組合物係作為氣溶膠(例如鼻腔氣溶膠)或藉由吸入來投藥，則此可使用(例如)噴霧、噴霧器、抽汲噴霧器、吸入裝置、計量吸入器或乾粉吸入器來進行。用於投用氣溶膠形式的本文中所揭示或由本發明之方法鑑定之化合物的醫藥形式可由熟習此項技術者所熟知之方法來製備。舉例而言，可將本文中所揭示或由本發明之方法鑑定之化合物在水、水/醇混合物或適當鹽水溶液中之溶液或分散液用於其製備，同時使用習知添加劑，例如苯甲醇或其它適當防腐劑、用於增加生物可用性之吸收增強劑、增溶劑、分散劑及其它添加劑與(若適當)習知推進劑，其(例如)包括二氧化碳、諸如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷或二氯四氟乙烷之CFC及其類似物。氣溶膠隨即亦可含有諸如卵磷脂之界面活性劑。藥物劑量可藉由提供定量閥來加以控制。

用於向呼吸道投藥之調配物包括鼻內調配物，該化合物一般將具有小顆粒尺寸，例如約10微米或更小。該顆粒尺寸可藉由此項技術中已知之方法來獲得，例如微粉化。必要時，可採用適於提供活性成份的持續釋放之調配物。

或者，該等活性成份可以乾粉之形式來提供，例如該化合物在諸如乳糖、澱粉、澱粉衍生物(諸如羥丙基甲基纖維素)及聚乙烯吡咯啶酮(PVP)之適當粉末基劑中的粉末混合物。該粉末載劑隨即將在鼻腔內形成凝膠。該粉末組合物可以單位劑型之形式來提供，舉例而言，(例如)明膠之膠囊或藥桶或可藉助於吸入器來投用該散劑之發泡包裝。

該等醫藥製劑可為單位劑型。在該形式中，將製劑細分為含有適當量的活性組份之單位劑量。該單位劑型可為封裝製劑，該封裝含有離散量之製劑，諸如封包錠劑、膠囊及管瓶或安瓶中之散劑。同樣，該單位劑型可為膠囊、錠劑、藥包或其含片，或其可為適當數目之該等劑型中的任何劑型(呈封裝形式)。

用於經口投藥之錠劑或膠囊及用於經靜脈內投藥之液體為尤其適用之組合物。

胰島素相關病症包括(例如)低血糖症、胰島素分泌或胰島素依賴性腫瘤、老化、胰島素抗性、葡萄糖耐受異常或糖尿病。

低血糖症定義為異常低之血糖。低血糖症可由(例如)胰島素過多或膳食不良引起。例如，低血糖可在患糖尿病之人注射過多胰島素，進食過少，或運動而未進額外之食物時發生。低血糖症之症狀包括(例如)精神過敏或虛弱、頭痛、目昏、饑餓及過度出汗之感覺。

胰島素分泌瘤包括(例如)胰島瘤。胰島瘤係一種胰腺中稱為郎格罕氏島之區域內之β細胞瘤。儘管其通常不為癌性的，但該等腫瘤可引起身體製造額外之胰島素且可導致過低之血糖含量。除胰島素分泌瘤之外，一些不分泌胰島素的腫瘤可使用胰島素作為生長因子。雖然胰島素可能為或可能不為該腫瘤所用之唯一生長因子，但身體內胰島素量之減少可減少腫瘤的生長。

老化係隨生物體變老而發生在其內的生理過程。熱量限制下調胰島素分泌且有理由懷疑此等影響為熱量限制對壽命之有利影響的關鍵媒介。因此，對於下調胰島素之策略可用於減緩老化過程與增加壽命。

糖尿病與相關病況，諸如胰島素抗性與葡萄糖耐受異常已在上文有所描述。

另外，胰島素抗性為多囊卵巢症候群(PCOS)之常見特徵，且已使用諸如梵蒂雅(rosiglitazone)與二甲雙胍(metformin)之藥物治療PCOS(Sepilian與NagamaniJ.Clin.Endocrinol Metab. 2003，10，14；Baillargeon等人，Fertil.Steril.82：893－902(2004))。PCOS特徵在於(例如)雙側擴大多囊卵巢、閉經及不孕。其作為常染色體顯性病況而遺傳。該疾病之其它症狀包括(例如)多毛症與肥胖症。在激素方面，PCOS特徵在於(例如)黃體生成激素、胰島素與雄性激素的分泌增加。

本發明之化合物的另一適應症係治療脂肪代謝障礙，其例如係由用於HIV感染之抗逆轉錄病毒療法引起。一些長期接受稱作高效抗逆轉錄變得療法(HAART)之AIDS療法的患者日益發展成一種稱為脂肪代謝障礙的症候群。該等症狀包括胰島素敏感性、脂肪自面部、臂部及腿部向腹部與上背重新分佈及膽固醇的改變。約14%接受HAART的人最終發展成2型糖尿病。藥物梵蒂雅已展示出可改良接受該治療三個月的HIV陽性患者之胰島素敏感性。在量測胰島素敏感性之標準測試中患者具有約20%的改良，且亦增加了其總體脂，尤其其面部、臂部與腿部之脂肪量上升24%。藉由比較，服用安慰劑之患者具有2%的面部、臂部與腿部脂肪減少。

在一些實施例中，該胰島素相關病症包括與血糖濃度升高相關之病況，諸如動脈粥樣硬化、心臟病、中風、高血壓、肥胖症、X症候群及末梢血管疾病。

動脈粥樣硬化係脂肪物質、膽固醇及其它堆積物質在動脈內襯中沉積之過程。該堆積稱作斑。斑破裂引起血栓之形成，其可妨礙血液流向心臟(心臟病發作)或大腦(中風)。在美國，心臟病發作為男性及女性之第一致死原因且中風為第三致死原因[例如，參看Nature Medicine,Special Focus on Atherosclerosis,(2002)8：1209－1262]。循環脂質之異常高含量為動脈粥樣硬化發展之主要致病因子。低密度脂蛋白(LDL)膽固醇之含量升高、甘油三酯之含量升高或高密度脂蛋白(LDL)膽固醇之低含量獨立為動脈粥樣硬化及相關病狀之風險因子。

心臟病包括(但不限於)心肌功能障礙、冠狀動脈功能障礙、冠狀動脈疾病及血壓過高(高血壓)。末梢血管疾病係指心臟及大腦外部血管之疾病。器官末梢血管疾病係由血管中之結構改變引起，諸如發炎及組織損壞。末梢動脈疾病為一實例。末梢動脈疾病(PAD)係類似於冠狀動脈疾病及頸動脈疾病之病況。在PAD中，脂肪沉積物主要在通向腿部及足部之動脈中沿動脈壁堆積且影響血液循環。在早期階段，常見症狀為腿部及臀部在活動期間痙攣或疲勞。當患者站立不動時，該痙攣消退。此稱作"間歇性跛行"。由於血栓之風險，PAD患者因中風及心臟病發作而具有更高之死亡風險。

X症候群亦稱作血糖症候群，其特徵為個人體內之血糖風險因子群。其包括：腹部肥胖(腹部及周圍之脂肪組織過多)、致動脈粥樣硬化性血脂異常(血脂病症－主要為高甘油三酯及低HDL膽固醇)、血壓升高(130/85 mmHg或更高)、胰島素抗性或葡萄糖不可耐受性、血栓形成前狀態(例如，血液中之高血纖維蛋白原或纖溶酶原活化劑抑制劑[－1])及發炎前狀態(例如，血液中之高敏感性C－反應蛋白增加)。

雖然本文中所揭示或由本發明之方法鑑定之化合物可作為如上文所述之唯一活性藥劑來投藥，但其亦可與一或多種藥劑併用，該等藥劑包括(例如)用於治療糖尿病、血脂病症或肥胖症之藥劑。舉例而言，諸如GPR41逆相激動劑或拮抗劑之化合物可與一或多種屬於以下藥物種類之藥劑併用，該種類之藥物係稱作α－葡糖苷酶抑制劑類、醛糖還原酶抑制劑類、雙胍類、噻唑烷二酮類、美格替耐類、磺醯脲類、胰島素、HMG－CoA還原酶抑制劑類、角鯊烯合成抑制劑類、纖維酸酯化合物類、LDL分解血糖增強劑類、血管收縮素轉化酶(ACE)抑制劑類、脂肪酶抑制劑類、血清素及/或去甲腎上腺素釋放劑類或再攝取抑制劑類。

α－葡糖苷酶抑制劑類屬於在胰腺及或小腸中競爭性抑制諸如α－澱粉酶、麥芽糖酶、α－糊精酶、蔗糖酶等之消化酶的藥物種類。α－葡糖苷酶抑制劑之可逆抑制作用係藉由延遲澱粉及糖之消化來延緩、減少或降低血糖含量。α－葡糖苷酶抑制劑之一些代表性實例包括醣祿(acarbose)、N－(1,3－二羥基－2－丙基)維利胺(通用名稱：伏格列波糖(voglibose))、米格列醇(miglitol)及此項技術中已知之α－葡糖苷酶抑制劑。

醛糖還原酶抑制劑種類之藥物會抑制多元醇路徑中之第一階段速率限制酶，且藉此預防或阻止糖尿病併發症。在糖尿病之高血糖症狀態中，葡萄糖在多元醇路徑中之利用有所增加且細胞內積聚之過量山梨糖醇因而充當組織毒素，並因此引起諸如糖尿病性神經病、視網膜病及腎病之併發症發作。醛糖還原酶抑制劑之實例包括：托瑞司他(tolurestat)、依帕司他(epalrestat)、3,4－二氫－2,8－二異丙基－3－硫基－2H－1,4－苯幷惡嗪－4－乙酸、2,7－二氟螺(9H －茀－9,4'－咪唑啶)－2',5'－二酮(通用名稱：咪瑞司他(imirestat))、3－[(4－溴－2－氟苯基)甲基]－7－氯－3,4－二氫－2,4－二氧代－1(2H )－喹唑啉乙酸(通用名稱：折那司他(zenarestat))、6－氟－2,3－二氫－2',5'－二氧－螺[4H－1－苯幷哌喃－4,4'－咪唑啶]－2－羧醯胺(SNK－860)、唑泊司他(zopolrestat)、索泊尼爾(sorbinil)及1－[(3－溴－2－苯幷呋喃基)磺醯基]－2,4－咪唑啶二酮(M－16209)；及此項技術已知之醛糖還原酶抑制劑。

雙胍為一類刺激厭氧糖酵解、增加末梢組織中之胰島素敏感性、抑制腸之葡萄糖吸收、抑制肝糖質新生並抑制脂肪酸氧化之藥物。雙胍之實例包括苯乙雙胍、二甲雙胍、丁二胍及此項技術中已知之雙胍。

胰島素分泌增強劑屬於具有促進胰腺β細胞分泌胰島素的性質之藥物種類。胰島素分泌增強劑之實例包括磺醯脲(SU)。磺醯脲(SU)為藉由經細胞膜中之SU受體來傳遞胰島素分泌訊號而促進胰腺β細胞分泌胰島素之藥物。磺醯脲之實例包括甲苯磺丁脲、氯磺丙脲、甲磺氮卓脲、乙醯苯磺醯環己脲、4－氯－N－[(1－吡咯啶基胺基)羰基]－苯磺醯胺(通用名稱：甘油吡嗪醯胺(glycopyramide))或其銨鹽、格列本脲(優降糖，glyburide)、格列齊特、1－丁基－3－間胺醯脲、胺磺丁脲、格列波那的(glibonuride)、格列甲嗪(glipizide)、格列喹酮(gliquidone)、格列噻吡(glisoxepid)、格列丁噻唑(glybuthiazole)、格列丁唑(glibuzole)、格列己脲(glyhexamide)、格列嘧啶(glymidine)、格列平脲(glypinamide)、苯磺丁脲(phenbutamide)、甲磺環已脲(tolcyclamide)、格列美脲(glimepiride)及此項技術已知之其它胰島素分泌增強劑。其它胰島素分泌增強劑包括N－[[4－(1－甲基乙基)環己基]羰基]－D－苯基丙胺酸(那格列萘(Nateglinide))、二水合(2S)－2－苯甲基－3－(順－六氫－2－異吲哚啉基羰基)丙酸鈣(米格列奈(Mitiglinide),KAD－1229)及此項技術已知之胰島素分泌增強劑。

噻唑烷二酮屬於通常稱作TZD之藥物種類。噻唑烷二酮係用於2型糖尿病之藥物，其係藉由增加細胞對胰島素之敏感性來降低血糖。接著，胰島素可將葡萄糖自血液移入細胞中以產生能量。該等藥物亦可增加HDL。

噻唑烷二酮之實例包括羅格列酮(rosiglitazone)、吡格列酮(pioglitazone)及此項技術已知之噻唑烷二酮。雖然曲格列酮(Rezulin或troglitazone)在美國為此種類之第一藥物，但其肝臟毒性使其脫離市場。目前可獲得之具有更安全特性之同型化合物包括Actos(吡格列酮)及Avandia(羅格列酮)。使用該等藥物之主要禁忌症包括肝病及心臟衰竭。該等藥物亦可引起體液滯留之顯著增加且因此增加心臟衰竭之風險。

美格替耐係用於阻止2型糖尿病患者之血糖在進食之後迅速上升。該等化合物包括(例如)諾和隆(repaglinide,Prandin)及糖立釋(nateglinide,Starlix)，其係藉由增加胰腺所產生之胰島素的量而起作用，類似於磺醯脲藥物之作用方式。美格替耐係在進食前服用。與該類藥物有關之副作用包括低血糖、上呼吸道感染(包括竇病、頭痛、關節痛及背痛、噁心、腹瀉及便秘)。

不同類型之胰島素係根據其多快開始起作用(發作)及其持續作用多久(持續時間)來分類。目前可獲得之類型包括速效、短效、中效及長效胰島素。可獲得預混合之速效及中效胰島素，其包括：70%中效(NPH)及30%短效常規胰島素，稱作70/30胰島素；50%中效(NPH)及50%短效常規胰島素，稱作50/50胰島素；75%中效(NPH)及25%速效優泌樂(Humalog)(賴脯，lispro)，稱作75/25胰島素；70%中效(NPH)及30%速效諾和銳(NovoLog)(天冬胺酸胰島素)，稱作NovoLog Mix 70/30。胰島素一般係作為注射劑提供至皮膚下(皮下)之組織中。其亦可經由胰島素泵或噴射注射器來提供，其為將藥物噴射至皮膚中之裝置。

胰島素使糖(葡萄糖)進入細胞中，糖在其中係用於轉化能量。若無胰島素，則血糖含量將升至高於人體安全含量。通常攝取速效或短效及中效或長效胰島素來提供身體所需之恆定及可變含量之胰島素。短效胰島素迅速減少血糖含量且接著消失。當速效或短效胰島素開始消失時，一些長效胰島素開始發揮作用。甘精胰島素(Lantus)為新穎長效胰島素，其在投藥之後幾分鐘內開始起作用且以相同速率持續作用24小時。

速效或短效胰島素與中效或長效胰島素之組合有助於使血糖含量整天均保持於身體安全範圍內。因此，可使用胰島素來治療1型糖尿病患者、2型糖尿病患者，因為其胰腺僅產生少量胰島素或不產生胰島素或其經口藥物不控制其血糖。此等患者可單獨攝取胰島素或共同攝取胰島素及經口藥物，2型糖尿病患者因患有嚴重病症或因大手術而具有高血糖含量，懷孕或哺乳期之2型糖尿病女患者不能使其血糖含量在進食及鍛煉期間維持在安全範圍內。僅研究出一種在懷孕期間使用之經口糖尿病藥物(優降糖)。

胰島素之主要副作用可為危險地降低血糖含量(嚴重低血糖症)。極低血糖含量可在10至15分鐘內產生。尤其對已超重之2型患者而言，胰島素可有助於增加體重。使用長效胰島素之其它可能性副作用包括脂肪組織之流失(脂質血糖異常，其中胰島素係經注射)及罕見之包括腫脹(浮腫)的過敏性反應。

他汀類(Statin)化合物屬於藉由抑制羥甲基戊二醯基輔酶A(HMG－CoA)還原酶來降低血液膽固醇含量之藥物種類。HMG－CoA還原酶為膽固醇生物合成中之速率限制酶。他汀係藉由上調LDL受體之活性來抑制該還原酶、降低血清LDL濃度並負責自血液中清除LDL。他汀化合物之實例包括羅素他汀(rosuvastatin)、普伐他汀(pravastatin)及其鈉鹽、辛伐他汀(simvastatin)、洛伐他汀(lovastatin)、阿托伐他汀(atorvastatin)、氟伐他汀(fluvastatin)、西立伐他汀(cerivastatin)及此項技術已知之HMG－CoA還原酶抑制劑。

角鯊烯合成抑制劑屬於藉由抑制角鯊烯合成來降低血液膽固醇含量之藥物種類。角鯊烯合成抑制劑之實例包括(S)－α－[雙[2,2－二甲基－1－氧代丙氧基]甲氧基]膦醯基]－3－苯氧基苯丁磺酸、單鉀鹽(BMS－188494)及此項技術中已知之角鯊烯合成抑制劑。

纖維酸酯化合物屬於藉由抑制肝臟中之甘油三酯合成及分泌且激活脂蛋白脂肪酶來降低血液膽固醇含量之藥物種類。已知纖維酸酯類可激活由過氧化體增殖物激活之受體並誘發脂蛋白脂肪酶表現。纖維酸酯化合物之實例包括苯紮纖維酸酯(bezafibrate)、苄氯纖維酸酯(beclobrate)、比尼纖維酸酯(binifibrate)、西普纖維酸酯(ciplofibrate)、克利纖維酸酯(clinofibrate)、氯貝丁酯(clofibrate)、氯貝酸，依託纖維酸酯(etofibfate)、非諾纖維酸酯(fenofibrate)、吉非貝齊(gemfibrozil)、尼可纖維酸酯(nicofibrate)、吡纖維酸酯(pirifibrate)、氯煙纖維酸酯(ronifibrate)、雙纖維酸酯(simfibrate)、羥乙茶鹼安妥明(theofibrate)及此項技術中已知之纖維酸酯類。

LDL(低密度脂蛋白)分解血糖增強劑屬於藉由增加LDL(低密度脂蛋白)受體數目來降低血液膽固醇含量之藥物種類，實例包括此項技術中已知之LDL分解血糖增強劑。

血管收縮素轉化酶(ACE)抑制劑屬於藉由抑制血管收縮素轉化酶來部分地降低血糖含量及降低血壓之藥物種類。血管收縮素轉化酶抑制劑之實例包括卡托普利(captopril)、依拉普利(enalapril)、阿拉普利(alacepril)、地拉普利(delapril)、雷米普利(ramipril)、賴諾普利(lisinopril)、咪達普利(imidapril)、苯那普利(benazepril)、西羅普利(ceronapril)、西拉普利(cilazapril)、依那普利拉(enalaprilat)、福辛普列(fosinopril)、目維普利(moveltopril)、培哚普利(perindopril)、喹那普利(quinapril)、螺普利(spirapril)、替莫普利(temocapril)、群多普利(trandolapril)及此項技術中已知之血管收縮素轉化酶抑制劑。

脂肪酶抑制劑包括諸如奧利司他(Orlistat)(XENICAL^T ^M )之抗肥胖症化合物。奧利司他會直接抑制脂肪吸收，但亦傾向於產生高發生率之不悅胃部副作用，諸如腹瀉及脹氣。

另一種類之抗肥胖症藥物包括血清素及/或去甲腎上腺素釋放劑或再攝取抑制劑。舉例而言，西布曲明(Sibutramine)(Meridia^T ^M )為經混合之5－HT/去甲腎臟上腺素再攝取抑制劑。西布曲明之主要副作用可為增加一些患者之血壓及心率。已報導，血清素釋放劑/再攝取抑制劑芬氟拉明(fenfluramine)(Pondimin^T ^M )及右芬氟拉明(dexfenfluramine)(Redux^T ^M )在持續期(超過6個月)內會減少食物攝取及體重。然而，在與使用相關之心瓣膜異常的初步證據得到報導之後，兩產品均已停止使用。

本發明之一些實施例包括一種醫藥組合物，其包含本文中所揭示或由本發明之方法鑑定之化合物或其醫藥學上可接受之鹽與選自由以下各群組成之群的至少一員：α－葡糖苷酶抑制劑、醛糖還原酶抑制劑、雙胍、HMG－CoA還原酶抑制劑、角鯊烯合成抑制劑、纖維酸酯化合物、LDL分解血糖增強劑及血管收縮素轉化酶抑制劑。在另一實施例中，HMG－CoA還原酶抑制劑係選自由以下各物組成之群：普伐他汀(prevastatin)、辛伐他汀(simvastatin)、洛伐他汀(lovastatin)、阿托伐他汀(atorvastatin)、氟伐他汀(fluvastatin)及立普妥(lipitor)。

根據本發明，該組合可藉由下列步驟來使用：使個別活性組份一起或獨立與如上文所述之生理學上可接受的載劑、賦形劑、黏合劑、稀釋劑等混合；及將該(等)混合物以醫藥組合物之形式經口或非經口投用。在將化合物或化合物之混合物與另一活性化合物以組合治療或預防治療之形式來投藥時，可將該等治療劑調配成同時或在不同時間投藥之單獨醫藥組合物，或該等治療劑可作為單一組合物來投藥。

本發明亦提供一種用於製造包含醫藥組合物之醫藥品之方法，該醫藥組合物包含由以下方法鑑定之可穩定血糖之化合物，大體上由該化合物組成或由該化合物組成，該方法包含：a)使候選化合物與GPR41接觸；及b)測定GPR41功能是否受到調節，其中GPR41功能之調節表示該候選化合物為可穩定血糖之化合物，可用作可穩定血糖之化合物。

本發明進一步提供一種用於製造包含醫藥組合物之醫藥品之方法，該醫藥組合物包含由以下方法鑑定之可穩定血糖之化合物，大體上由該化合物組成或由該化合物組成，該方法包含：a)使候選化合物與GPR41接觸；及b)測定GPR41功能是否受到調節，其中GPR41功能之調節表示該候選化合物為可穩定血糖之化合物，可用於治療胰島素相關病症。

本發明係關於一種用於鑑定可穩定血糖之化合物之方法，其包含：a)使候選化合物與GPR41接觸；及b)測定GPR41功能是否增強，其中GPR41功能增強表示該候選化合物為可穩定血糖之化合物。

在一實施例中，該GPR41係源自哺乳動物。在另一實施例中，該GPR41為人類的。

在特定實施例中，該GPR41為重組體。在特定實施例中，該接觸包含與表現GPCR之宿主細胞或宿主細胞膜接觸，其中該宿主細胞包含表現載體，該表現載體包含編碼受體之聚核苷酸。在一些實施例中，該接觸係在已知之GPCR激動劑或本文中所揭示之激動劑存在下進行。

在特定實施例中，該方法進一步包含將由候選化合物所引起之受體功能增強與藉由使該受體接觸已知配位體或受體激動劑所引起的第二種受體功能增強比較的步驟。

在特定實施例中，該測定係經由使用黑素細胞檢定。

在一些實施例中，該可穩定血糖之化合物包含選自下列各物組成之群的化合物：2－甲基－4－(4－硝基－苯基)－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺、環丙基羧酸4－[1,2,3]噻二唑－4－基－苯酯、環丙基羧酸；4－呋喃－3－基－2－甲基－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺、4－呋喃－3－基－2－甲基－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸(2,5－二氯－苯基)－醯胺、4－呋喃－2－基－2－甲基－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺、4－呋喃－3－基－2－甲基－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸(4－氯－苯基)－醯胺、2－甲基－4－(4－甲基硫基－苯基)－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺及2－甲基－4－(3－硝基－苯基)－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺；或其醫藥學上可接受的鹽。

本發明亦係關於一種用於鑑定作為胰島素分泌抑制劑的候選化合物之方法，其包含a)使候選化合物與GPR41接觸；及b)測定GPR41功能是否增強，其中GPR41功能增強表示該候選化合物為胰島素分泌抑制劑。舉例而言，增強GPR41功能之化合物可導致胰島素分泌減少，諸如GPR41激動劑。例如，在低血糖症個體中，可需要減少胰島素分泌。

本發明亦係關於一種用於鑑定導致血糖濃度增加的候選化合物之方法，其包含a)使候選化合物與GPR41接觸；及b)測定GPR41功能是否增強，其中GPR41功能增強表示該候選化合物可導致血糖濃度增加。舉例而言，增強GPR41功能之化合物可導致胰島素分泌減少及血糖濃度增加，諸如GPR41激動劑。例如，在低血糖症個體中，可需要增加血糖。

本發明亦係關於一種可根據以下方法鑑定的可穩定血糖之化合物：a)使用候選化合物與GPR41接觸，及b)測定GPR41功能是否增強，其中GPR41功能增強表示該候選化合物為可穩定血糖之化合物。

例如，本發明提供一種根據以下方法鑑定的可穩定血糖之化合物：a)使候選化合物與GPR41接觸，及b)測定GPR41功能是否增強，其中GPR41功能增強表示該候選化合物為可穩定血糖之化合物。

在一實施例中，該可穩定血糖之化合物係GPR41激動劑。例如，該可穩定血糖之化合物包含選自下列各物組成之群的化合物：2－甲基－4－(4－硝基－苯基)－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺、環丙基羧酸4－[1,2,3]噻二唑－4－基－苯酯、環丙基羧酸；4－呋喃－3－基－2－甲基－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺、4－呋喃－3－基－2－甲基－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸(2,5－二氯－苯基)－醯胺、4－呋喃－2－基－2－甲基－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺、4－呋喃－3－基－2－甲基－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸(4－氯－苯基)－醯胺、2－甲基－4－(4－甲基硫基－苯基)－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺及2－甲基－4－(3－硝基－苯基)－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺；或其醫藥學上可接受的鹽。

在一些實施例中，該可穩定血糖之化合物係GPR41激動劑。在一些實施例中，該可穩定血糖之化合物為EC50小於10 μM、小於1 μM、小於100 nM或小於10 nM之GPR41激動劑。在一些實施例中，該可穩定血糖之化合物為EC50之值選自1 nM至10 μM區間的激動劑。在一些實施例中，該可穩定血糖之化合物為EC50之值選自1 nM至1 μM區間的激動劑。在一些實施例中，該可穩定血糖之化合物為EC50之值選自1 nM至100 nM區間的激動劑。在一些實施例中，該可穩定血糖之化合物為EC50之值選自1 nM至10 nM區間的激動劑。

在一實施例中，該可穩定血糖之化合物包含選自下列各物組成之的化合物：2－甲基－4－(4－硝基－苯基)－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺、環丙基羧酸4－[1,2,3]噻二唑－4－基－苯酯、環丙基羧酸；4－呋喃－3－基－2－甲基－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺、4－呋喃－3－基－2－甲基－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸(2,5－二氯－苯基)－醯胺、4－呋喃－2－基－2－甲基－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺、4－呋喃－3－基－2－甲基－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸(4－氯－苯基)－醯胺、2－甲基－4－(4－甲基硫基－苯基)－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺及2－甲基－4－(3－硝基－苯基)－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺；或其醫藥學上可接受的鹽。

此外，本發明係關於一種用於製備組合物之方法，該方法包含鑑定可穩定血糖之化合物及接著使該化合物與載劑混合，其中該化合物可根據以下方法來鑑定：a)使候選化合物與GPR41接觸；及b)測定GPR41功能是否增強，其中GPR41功能增強表示該候選化合物為可穩定血糖之化合物。舉例而言，本發明提供一種用於製備組合物之方法，其包含鑑定可穩定血糖之化合物及接著使該化合物與載劑混合，其中該化合物係根據以下方法來鑑定：a)使候選化合物與GPR41接觸；及b)測定GPR41功能是否增強，其中GPR41功能增強表示該候選化合物為可穩定血糖之化合物。此外，本發明提供一種用於製備組合物之方法，該方法包含鑑定可穩定血糖之化合物及接著使該化合物與載劑混合，其中該化合物包含選自下列各物組成之群的化合物：2－甲基－4－(4－硝基－苯基)－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺、環丙基羧酸4－[1,2,3]噻二唑－4－基－苯酯、環丙基羧酸；4－呋喃－3－基－2－甲基－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺、4－呋喃－3－基－2－甲基－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸(2,5－二氯－苯基)－醯胺、4－呋喃－2－基－2－甲基－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺、4－呋喃－3－基－2－甲基－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸(4－氯－苯基)－醯胺、2－甲基－4－(4－甲基硫基－苯基)－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺及2－甲基－4－(3－硝基－苯基)－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺；或其醫藥學上可接受的鹽。

本發明亦提供一種醫藥組合物，其包含：根據以下方法鑑定之可穩定血糖之化合物：a)使候選化合物與GPR41接觸，及b)測定GPR41功能是否增強，其中GPR41功能增強表示該候選化合物為可穩定血糖之化合物；大體上由其組成或由其組成。

可使用此項技術中所熟知及本文中所述之技術將化合物調配成醫藥組合物。

醫藥調配物、投藥途徑及劑量在上文中已有所描述。

本發明提供一種用於治療或預防有需要個體的胰島素相關病症之方法，其包含將有效量的根據以下方法鑑定之化合物投與至該個體：a)使候選化合物與GPR41接觸，及b)測定GPR41功能是否增強，其中GPR41功能增強表示該候選化合物為可穩定血糖之化合物。在一些實施例中，該胰島素相關病症為低血糖症、胰島素分泌或胰島素依賴性腫瘤或老化。在一實施例中，該投藥化合物包含GPR41激動劑。在一實施例中，該個體為哺乳動物且在另一實施例中該個體為人類。

雖然本文中所揭示或由本發明之方法鑑定之化合物可作為如上文所述之唯一活性藥劑來投藥，但其亦可與一或多種藥劑併用。

本發明亦提供一種用於製造包含醫藥組合物之醫藥品之方法，該醫藥組合物包含由以下方法鑑定之可穩定血糖之化合物，大體上由該化合物組成或由該化合物組成，該方法包含：a)使候選化合物與GPR41接觸；及b)測定GPR41功能是否增強，其中GPR41功能增強表示該候選化合物為可穩定血糖之化合物，可用作可穩定血糖之化合物。

本發明進一步提供一種用於製造包含醫藥組合物之醫藥品之方法，該醫藥組合物包含由以下方法鑑定之可穩定血糖之化合物，大體上由該化合物組成或由該化合物組成，該方法包含：a)使候選化合物與GPR41接觸；及b)測定GPR41功能是否增強，其中GPR41功能增強表示該候選化合物為可穩定血糖之化合物，可用於治療胰島素相關病症。

本發明係關於一種用於鑑定可穩定血糖之化合物之方法，其包含：a)使候選化合物與GPR41接觸；及b)測定GPR41功能是否降低，其中GPR41功能降低表示該候選化合物為可穩定血糖之化合物。在一實施例中，該可穩定血糖之化合物包含選自下列各物組成之群的化合物：2－甲基－4－[5－(2－硝基－4－三氟甲基－苯基)－呋喃－2－基]－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺、4－(5－聯苯－2－基－呋喃－2－基)－2－甲基－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺、2－甲基－4－[5－(2－硝基－苯基)－呋喃－2－基]－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸(2－氯－苯基)－醯胺、2－甲基－5－氧代－4－(4－苯氧基－苯基)－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺、2－甲基－5－氧代－4－[5－(2－三氟甲氧基－苯基)－呋喃－2－基]－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺及4－[5－(2,5－二氯－苯基)－呋喃－2－基]－2－甲基－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺；或其醫藥學上可接受的鹽。

在特定實施例中，該測定係經由使用黑素細胞檢定。

本發明亦係關於一種用於鑑定作為胰島素分泌增效劑的候選化合物之方法，其包含a)使候選化合物與GPR41接觸；及b)測定GPR41功能是否降低，其中GPR41功能降低表示該候選化合物為胰島素分泌增效劑。舉例而言，降低GPR41功能之化合物可導致胰島素分泌增加，諸如GPR41拮抗劑或逆相激動劑。例如，在患有諸如糖尿病之胰島素抗性之個體中，可需要增加胰島素分泌。

本發明亦係關於一種用於鑑定導致血糖濃度減少的候選化合物之方法，其包含a)使候選化合物與GPR41接觸；及b)測定GPR41功能是否降低，其中GPR41功能降低表示該候選化合物可導致血糖濃度減少。舉例而言，降低GPR41功能之化合物可導致胰島素分泌增加及血糖濃度減少，諸如GPR41逆相激動劑或拮抗劑。例如，在患有諸如糖尿病之胰島素抗性之個體中，可需要減少血糖。

本發明亦係關於一種可根據以下方法鑑定的可穩定血糖之化合物：a)使用候選化合物與GPR41接觸，及b)測定GPR41功能是否降低，其中GPR41功能降低表示該候選化合物為可穩定血糖之化合物。

例如，本發明提供一種根據以下方法鑑定的可穩定血糖之化合物：a)使候選化合物與GPR41接觸，及b)測定GPR41功能是否降低，其中GPR41功能降低表示該候選化合物為可穩定血糖之化合物。在一實施例中，該可穩定血糖之化合物係GPR41之逆相激動劑。在一實施例中，該可穩定血糖之化合物係GPR41拮抗劑。在一實施例中，該可穩定血糖之化合物包含選自下列各物組成之群的化合物：2－甲基－4－[5－(2－硝基－4－三氟甲基－苯基)－呋喃－2－基]－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺、4－(5－聯苯－2－基－呋喃－2－基)－2－甲基－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺、2－甲基－4－[5－(2－硝基－苯基)－呋喃－2－基]－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸(2－氯－苯基)－醯胺、2－甲基－5－氧代－4－(4－苯氧基－苯基)－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺、2－甲基－5－氧代－4－[5－(2－三氟甲氧基－苯基)－呋喃－2－基]－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺及4－[5－(2,5－二氯－苯基)－呋喃－2－基]－2－甲基－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺；或其醫藥學上可接受的鹽。

在一些實施例中，該可穩定血糖之化合物為EC50小於10 μM、小於1 μM、小於100 nM或小於10 nM之GPR41逆相激動劑或拮抗劑。在一些實施例中，該可穩定血糖之化合物為EC50之值選自1 nM至10 μM區間的逆相激動劑或拮抗劑。在一些實施例中，該可穩定血糖之化合物為EC50之值選自1 nM至1 μM區間的逆相激動劑或拮抗劑。在一些實施例中，該可穩定血糖之化合物為EC50之值選自1 nM至100 nM區間的逆相激動劑或拮抗劑。在一些實施例中，該可穩定血糖之化合物為EC50之值選自1 nM至10 nM區間逆相激動劑或拮抗劑。

此外，本發明係關於一種用於製備組合物之方法，該方法包含鑑定可穩定血糖之化合物及接著使該化合物與載劑混合，其中該化合物可根據以下方法來鑑定：a)使候選化合物與GPR41接觸；及b)測定GPR41功能是否降低，其中GPR41功能降低表示該候選化合物為可穩定血糖之化合物。舉例而言，本發明提供一種用於製備組合物之方法，其包含鑑定可穩定血糖之化合物及接著使該化合物與載劑混合，其中該化合物係根據以下方法來鑑定：a)使候選化合物與GPR41接觸；及b)測定GPR41功能是否降低，其中GPR41功能降低表示該候選化合物為可穩定血糖之化合物。

本發明亦提供一種醫藥組合物，其包含：根據以下方法鑑定之可穩定血糖之化合物：a)使候選化合物與GPR41接觸，及b)測定GPR41功能是否降低，其中GPR41功能降低表示該候選化合物為可穩定血糖之化合物；大體上由其組成或由其組成。

醫藥調配物、投藥途徑及劑量在上文中已有所描述。

本發明提供一種用於治療或預防有需要個體的胰島素相關病症之方法，其包含將有效量的根據以下方法鑑定之化合物投與至該個體：a)使候選化合物與GPR41接觸，及b)測定GPR41功能是否降低，其中GPR41功能降低表示該候選化合物為可穩定血糖之化合物。在一些實施例中，該胰島素相關病症為胰島素抵抗、葡萄糖耐受異常或糖尿病。在一些實施例中，該胰島素相關病症包括與血糖濃度升高相關之病況，諸如動脈粥狀硬化、心臟病、中風、高血壓、肥胖症、X症候群或末梢血管疾病。在一些實施例中，該胰島素相關病症為Ⅱ型糖尿病。在一實施例中，該投藥化合物包含GPR41之逆相激動劑或拮抗劑。

在一實施例中，該方法進一步包含將有效量之用於治療糖尿病、血脂病症或肥胖症的藥劑與有效量之醫藥組合物組合投與至該個體，該醫藥組合物包含由以下方法鑑定之可穩定血糖之化合物，大體上由該化合物組成或由該化合物組成，該方法包含：a)使候選化合物與GPR41接觸；及b)測定GPR41功能是否降低，其中GPR41功能降低表示該候選化合物為可穩定血糖之化合物。舉例而言，在一實施例中，該方法進一步包含將有效量之用於治療糖尿病、血脂病症或肥胖症的藥劑與有效量之含有GPR41逆相激動劑的醫藥組合物組合投與至該個體。

在一實施例中，該個體為哺乳動物且在另一實施例中，該個體為人類。

本發明之一些實施例包括一種醫藥組合物，其包含本文中所揭示或由本發明之方法鑑定之化合物或其醫藥學上可接受之鹽與選自由以下各物組成之群的至少一員：α－葡糖苷酶抑制劑、醛糖還原酶抑制劑、雙胍、HMG－CoA還原酶抑制劑、角鯊烯合成抑制劑、纖維酸酯化合物、LDL分解血糖增強劑及血管收縮素轉化酶抑制劑。在另一實施例中，HMG－CoA還原酶抑制劑係選自由以下各物組成之群：普伐他汀(prevastatin)、辛伐他汀(simvastatin)、洛伐他汀(lovastatin)、阿托伐他汀(atorvastatin)、氟伐他汀(fluvastatin)及立普妥(lipitor)。

本發明亦提供一種用於製造包含醫藥組合物之醫藥品之方法，該醫藥組合物包含由以下方法鑑定之可穩定血糖之化合物，大體上由該化合物組成或由該化合物組成，該方法包含：a)使候選化合物與GPR41接觸；及b)測定GPR41功能是否降低，其中GPR41功能降低表示該候選化合物為可穩定血糖之化合物，可用作可穩定血糖之化合物。

本發明進一步提供一種用於製造包含醫藥組合物之醫藥品之方法，該醫藥組合物包含由以下方法鑑定之可穩定血糖之化合物，大體上由該化合物組成或由該化合物組成，該方法包含：a)使候選化合物與GPR41接觸；及b)測定GPR41功能是否降低，其中GPR41功能降低表示該候選化合物為可穩定血糖之化合物，可用於治療諸如胰島素抗性、葡萄糖耐受異常或糖尿病之胰島素相關病症。

本發明亦提供一種用於增強GPR41功能之方法，其包含使GPR41接觸有效量之GPR41激動劑，例如選自下列各物組成之群的化合物：2－甲基－4－(4－硝基－苯基)－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺、環丙基羧酸4－[1,2,3]噻二唑－4－基－苯酯、環丙基羧酸；4－呋喃－3－基－2－甲基－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺、4－呋喃－3－基－2－甲基－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸(2,5－二氯－苯基)－醯胺、4－呋喃－2－基－2－甲基－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺、4－呋喃－3－基－2－甲基－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸(4－氯－苯基)－醯胺、2－甲基－4－(4－甲基硫基－苯基)－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺及2－甲基－4－(3－硝基－苯基)－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺；或其醫藥學上可接受的鹽。此等化合物之結構展示於以下之表1中。本發明亦提供一種用於增強GPR41之細胞內功能之方法，其包含使表達GPR41之細胞接觸有效量之GPR41激動劑。該細胞可(例如)處於個體中或該細胞可為經分離之細胞。

本發明亦提供一種用於降低GPR41功能之方法，其包含使GPR41接觸有效量之GPR41逆相激動劑或拮抗劑，例如選自下列各物組成之群的化合物：2－甲基－4－[5－(2－硝基－4－三氟甲基－苯基)－呋喃－2－基]－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺、4－(5－聯苯－2－基－呋喃－2－基)－2－甲基－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺、2－甲基－4－[5－(2－硝基－苯基)－呋喃－2－基]－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸(2－氯－苯基)－醯胺、2－甲基－5－氧代－4－(4－苯氧基－苯基)－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺、2－甲基－5－氧代－4－[5－(2－三氟甲氧基－苯基)－呋喃－2－基]－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺及4－[5－(2,5－二氯－苯基)－呋喃－2－基]－2－甲基－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺；或其醫藥學上可接受的鹽。此等化合物之結構展示於以下之表2中。本發明亦提供一種用於降低GPR41之細胞內功能之方法，其包含使表達GPR41之細胞接觸有效量之GPR41逆相激動或拮抗劑。該細胞可(例如)處於個體中或該細胞可為經分離之細胞。

本發明提供一種用於治療或預防胰島素相關病症的方法，其包含將有效量之GPR41調節劑投與至有需要之個體。在一實施例中，該胰島素相關病症為低血糖症、胰島素分泌或胰島素依賴性腫瘤或老化。在一實施例中，該調節劑為激動劑。在一實施例中，該激動劑包含選自下列各物組成之群的化合物：2－甲基－4－(4－硝基－苯基)－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺、環丙基羧酸4－[1,2,3]噻二唑－4－基－苯酯、環丙基羧酸；4－呋喃－3－基－2－甲基－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺、4－呋喃－3－基－2－甲基－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸(2,5－二氯－苯基)－醯胺、4－呋喃－2－基－2－甲基－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺、4－呋喃－3－基－2－甲基－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸(4－氯－苯基)－醯胺、2－甲基－4－(4－甲基硫基－苯基)－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺及2－甲基－4－(3－硝基－苯基)－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺；或其醫藥學上可接受的鹽。

在一實施例中，該胰島素相關病症為胰島素抗性、葡萄糖耐受異常或糖尿病，且該調節劑為逆相激動劑或拮抗劑。在一實施例中，該胰島素相關病症為Ⅱ型糖尿病。在一些施例中，該胰島素相關病症包括與血糖濃度升高相關之病況，諸如動脈粥樣硬化、心臟病、中風、高血壓、肥胖症、X症候群或末梢血管疾病。在一實施例中，該逆相激動劑或拮抗劑包含選自下列各物組成之群的化合物：2－甲基－4－[5－(2－硝基－4－三氟甲基－苯基)－呋喃－2－基]－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺、4－(5－聯苯－2－基－呋喃－2－基)－2－甲基－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺、2－甲基－4－[5－(2－硝基－苯基)－呋喃－2－基]－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸(2－氯－苯基)－醯胺、2－甲基－5－氧代－4－(4－苯氧基－苯基)－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺、2－甲基－5－氧代－4－[5－(2－三氟甲氧基－苯基)－呋喃－2－基]－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺及4－[5－(2,5－二氯－苯基)－呋喃－2－基]－2－甲基－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺；或其醫藥學上可接受的鹽。

在一實施例中，該方法進一步包含將有效量之用於治療糖尿病、血脂病症或肥胖症的藥劑與有效量之GPR41逆相激動劑或拮抗劑組合投與至該個體。在一實施例中，該個體為哺乳動物且在另一實施例中，該個體為人類。

本發明提供一種用於藉由增強GPR41功能來治療或預防可治療或可預防之病症的方法，其包含將有效量之選自下列各物組成之群的化合物投與至有需要之個體：2－甲基－4－(4－硝基－苯基)－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺、環丙基羧酸4－[1,2,3]噻二唑－4－基－苯酯、環丙基羧酸；4－呋喃－3－基－2－甲基－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺、4－呋喃－3－基－2－甲基－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸(2,5－二氯－苯基)－醯胺、4－呋喃－2－基－2－甲基－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺、4－呋喃－3－基－2－甲基－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸(4－氯－苯基)－醯胺、2－甲基－4－(4－甲基硫基－苯基)－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺及2－甲基－4－(3－硝基－苯基)－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺；或其醫藥學上可接受的鹽。在一實施例中，該病症為胰島素相關病症。在一些實施例中，該胰島素相關病症為低血糖症、胰島素分泌或胰島素依賴性腫瘤或老化。

本發明亦提供一種用於藉由降低GPR41功能來治療或預防可治療或可預防之病症的方法，其包含將有效量之以下化合物投與至有需要之個體：2－甲基－4－[5－(2－硝基－4－三氟甲基－苯基)－呋喃－2－基]－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺、4－(5－聯苯－2－基－呋喃－2－基)－2－甲基－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺、2－甲基－4－[5－(2－硝基－苯基)－呋喃－2－基]－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸(2－氯－苯基)－醯胺、2－甲基－5－氧代－4－(4－苯氧基－苯基)－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺、2－甲基－5－氧代－4－[5－(2－三氟甲氧基－苯基)－呋喃－2－基]－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺及4－[5－(2,5－二氯－苯基)－呋喃－2－基]－2－甲基－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺；或其醫藥學上可接受的鹽投藥。在一實施例中，該病症為胰島素相關病症。在一些實施例中，該胰島素相關病症為胰島素抗性、葡萄糖耐受異常或糖尿病。在一實施例中，該胰島素相關病症為Ⅱ型糖尿病。在一些實施例中，該胰島素相關病症包括與血糖濃度升高相關之病況，諸如動脈粥樣硬化、心臟病、中風、高血壓、肥胖症、X症候群或末梢血管疾病。在一實施例中，該方法進一步包含將有效量之用於治療糖尿病、血脂病症或肥胖症的藥劑與有效量之GPR41逆相激動劑或拮抗劑組合投與至該個體。在一實施例中，該個體為哺乳動物且在另一實施例中，該個體為人類。

本發明亦提供一種用於增加有需要之個體之血糖含量之方法，其包含將有效量之GPR41激動劑投與至該個體。在一實施例中，該激動劑包含選自下列各物組成之群的化合物：2－甲基－4－(4－硝基－苯基)－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺、環丙基羧酸4－[1,2,3]噻二唑－4－基－苯酯、環丙基羧酸；4－呋喃－3－基－2－甲基－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺、4－呋喃－3－基－2－甲基－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸(2,5－二氯－苯基)－醯胺、4－呋喃－2－基－2－甲基－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺、4－呋喃－3－基－2－甲基－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸(4－氯－苯基)－醯胺、2－甲基－4－(4－甲基硫基－苯基)－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺及2－甲基－4－(3－硝基－苯基)－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺；或其醫藥學上可接受的鹽。

本發明亦提供一種用於降低有需要之個體之血糖含量之方法，其包含將有效量之GPR41逆相激動劑或拮抗劑投與至該個體。在一實施例中，該逆相激動劑或拮抗劑包含選自下列各物組成之群的化合物：2－甲基－4－[5－(2－硝基－4－三氟甲基－苯基)－呋喃－2－基]－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺、4－(5－聯苯－2－基－呋喃－2－基)－2－甲基－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺、2－甲基－4－[5－(2－硝基－苯基)－呋喃－2－基]－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸(2－氯－苯基)－醯胺、2－甲基－5－氧代－4－(4－苯氧基－苯基)－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺、2－甲基－5－氧代－4－[5－(2－三氟甲氧基－苯基)－呋喃－2－基]－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺及4－[5－(2,5－二氯－苯基)－呋喃－2－基]－2－甲基－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺；或其醫藥學上可接受的鹽。

另外，本發明提供一種用於降低有需要之個體之胰島素分泌之方法，其包含將有效量之GPR41激動劑投與至該個體。在一實施例中，該激動劑包含選自下列各物組成之群的化合物：2－甲基－4－(4－硝基－苯基)－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺、環丙基羧酸4－[1,2,3]噻二唑－4－基－苯酯、環丙基羧酸；4－呋喃－3－基－2－甲基－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺、4－呋喃－3－基－2－甲基－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸(2,5－二氯－苯基)－醯胺、4－呋喃－2－基－2－甲基－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺、4－呋喃－3－基－2－甲基－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸(4－氯－苯基)－醯胺、2－甲基－4－(4－甲基硫基－苯基)－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺及2－甲基－4－(3－硝基－苯基)－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺；或其醫藥學上可接受的鹽。

本發明進一步提供一種用於增加有需要之個體之胰島素分泌之方法，其包含將有效量之GPR41逆相激動劑或拮抗劑投與至該個體。在一實施例中，GPR41逆相激動劑或拮抗劑包含選自下列各物組成之群的化合物：2－甲基－4－[5－(2－硝基－4－三氟甲基－苯基)－呋喃－2－基]－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺、4－(5－聯苯－2－基－呋喃－2－基)－2－甲基－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺、2－甲基－4－[5－(2－硝基－苯基)－呋喃－2－基]－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸(2－氯－苯基)－醯胺、2－甲基－5－氧代－4－(4－苯氧基－苯基)－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺、2－甲基－5－氧代－4－[5－(2－三氟甲氧基－苯基)－呋喃－2－基]－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺及4－[5－(2,5－二氯－苯基)－呋喃－2－基]－2－甲基－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺；或其醫藥學上可接受的鹽。

本發明進一步提供一種用於以葡萄糖依賴方式增加有需要個體之胰島素分泌的方法，其包含將有效量之GPR41逆相激動劑或拮抗劑投與至該個體。在一實施例中，GPR41逆相激動劑或拮抗劑包含選自下列各物組成之群的化合物：2－甲基－4－[5－(2－硝基－4－三氟甲基－苯基)－呋喃－2－基]－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺、4－(5－聯苯－2－基－呋喃－2－基)－2－甲基－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺、2－甲基－4－[5－(2－硝基－苯基)－呋喃－2－基]－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸(2－氯－苯基)－醯胺、2－甲基－5－氧代－4－(4－苯氧基－苯基)－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺、2－甲基－5－氧代－4－[5－(2－三氟甲氧基－苯基)－呋喃－2－基]－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺及4－[5－(2,5－二氯－苯基)－呋喃－2－基]－2－甲基－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺；或其醫藥學上可接受的鹽。

術語"以葡萄糖依賴方式"意味胰島素分泌回應高葡萄糖濃度而增加，但其不回應於低葡萄糖濃度。一些已經用來治療糖尿病之藥物增加胰島素分泌卻不顧及在血液中之葡萄糖含量。此係不當的，因為此等藥物即使在低血糖症之情況下亦增加胰島素分泌。胰島素增加則進一步使低血糖症惡化，有時達到臨限含量。高葡萄糖濃度意味在血液中或細胞周圍之葡萄糖濃度高於正常葡萄糖濃度範圍，例如16.8 mmol/L係高葡萄糖濃度。低葡萄糖濃度意味在血液中或細胞周圍之葡萄糖濃度低於正常葡萄糖濃度範圍，例如3.3 mmol/L或更少。

胰島素分泌活動之細胞機制為細胞內cAMP增加。如本文中所揭示，GPR41表現於胰腺β胰島細胞中。GPR41偶合於Gi，如此GPR41之逆相激動劑或拮抗劑將導致胰腺β胰島細胞中cAMP增加及胰島素分泌增加。

本發明之一目的係關於一種方法：a)執行本發明之方法以鑑定可穩定血糖之化合物；及b)視情況測定該化合物之結構；及c)提供該化合物或該化合物之名稱或結構。此外，本發明係關於一種方法：a)執行本發明之方法以鑑定可穩定血糖之化合物；及b)視情況測定該化合物之結構；c)視情況提供該化合物之名稱或結構；及d)製備或合成該化合物。本發明進一步係關於一種用於調節GPCR功能之方法，其包含執行本發明之方法以鑑定可穩定血糖之化合物及接著使GPCR與該可穩定血糖之化合物接觸或向患病個體施以足以調節GPCR功能之可穩定血糖之化合物。

本發明之另一目的係關於經放射性標記的表1或表2之化合物，其不僅將適用於放射成像，且適於在活體內及活體外進行檢定以定位及量化包括人類之組織樣本中的GPR41及藉由抑制放射性標記化合物之結合作用來鑑定GPR41配位體。本發明之另一目的係研究包含該等放射性標記化合物之新穎GPR41檢定。

可併入本發明化合物中之合適放射性核素包括(但不限於)³ H(亦寫作T)、¹ ¹ C、¹ ⁴ C、¹ ⁸ F、¹ ² ⁵ I、⁸ ² Br、¹ ² ³ I、¹ ² ⁴ I、¹ ² ⁵ I、¹ ³ ¹ I、⁷ ⁵ Br、⁷ ⁶ Br、¹ ⁵ O、¹ ³ N、³ ⁵ S及⁷ ⁷ Br。併入該等放射性標記化合物中之放射性核素將視該放射性標記化合物之特定應用而定。因此，對活體外GPR41標記及競爭檢定而言，併入³ H、¹ ⁴ C、¹ ² ⁵ I、¹ ³ ¹ I、³ ⁵ S或⁸ ² Br之化合物一般將最適用。對放射成像應用而言，¹ ¹ C、¹ ⁸ F、¹ ² ⁵ I、¹ ² ³ I、¹ ² ⁴ I、¹ ³ ¹ I、⁷ ⁵ Br、⁷ ⁶ Br或⁷ ⁷ Br一般將最適用。

當明瞭"放射性標記"或"標記化合物"為已併入至少一種放射性核素的表1或表2之化合物；在一些實施例中，該放射性核素係選自由³ H、¹ ⁴ C、¹ ² ⁵ I、³ ⁵ S及⁸ ² Br組成之群；在一些實施例中，該放射性核素為³ H或¹ ⁴ C。此外，應瞭解本發明化合物中所顯示之所有原子均可為該等原子之最常見同位素或較稀有之放射性同位素或非放射性同位素。

用於將放射性同位素併入有機化合物中之合成方法(包括可用於彼等本發明化合物之彼等方法)為此項技術所熟知，且包括向目標分子中併入活性含量之氚，其包括下列各種方法。A.以氚氣催化還原－此程序通常產生高比活性產物且需要鹵化或不飽和前驅物。B.以硼氫化鈉[³ H]還原－此程序相對廉價且需要含有可還原官能基之前驅物，諸如醛類、酮類、內酯類、酯類及其類似物。C.以氫化鋁鋰[³ H]還原－此程序提供接近理論比活性之產物。其亦需要含有可還原官能基之前驅物，諸如醛類、酮類、內酯類、酯類及其類似物。D.氚氣曝露標記－此程序包括使含有可交換質子之前驅物在適當催化劑存在下曝露於氚氣。E.使用碘甲烷[³ H]來進行N－甲基化－此程序一般係用於藉由以高比活性之碘甲烷(³ H)處理適當前驅物來製備O－甲基或N－甲基(³ H)產物。此方法一般可得高比活性，諸如約80－87 Ci/mmol。

用於將活性含量之¹ ² ⁵ I併入目標分子中之合成方法包括下列各種方法。A.桑德邁爾(Sandmeyer)及其類似反應－此程序將芳基或雜芳基胺轉化成諸如四氟硼酸鹽之重氮鹽，且隨後使用Na¹ ² ⁵ I將其轉化成經¹ ² ⁵ I標記之化合物。Zhu,D.－G.及其合作者在J.Org,Chem. 67：943－948(2002))中報導一代表性程序。B.酚類之鄰位¹ ² ⁵ 碘化－此程序可使¹ ² ⁵ I併入酚之鄰位，如Collier,T.L.及其合作者在J.Labelled Compd Radiopharm. ,42：S264－S266(1999)中所報導。C.將芳基溴及雜芳基溴與¹ ² ⁵ I交換－此方法一般為兩步驟方法。第一步驟為，使用(例如)Pd催化反應[即Pd(Ph₃ P)₄ ]或在鹵化三烷基錫或六烷基二錫[例如(CH₃ )₃ SnSn(CH₃ )₃ ]存在下由芳基鋰或雜芳基鋰將芳基溴或雜芳基溴轉化成相應之三烷基錫中間物。Bas,M.－D.及其合作者在J.Labelled Compd Radiopharm.. 44：S280－S282(2001))中已報導代表性程序。

經放射性標記的表1或表2之GPR41化合物可用於篩選檢定以鑑定/評估化合物。概言之，可評估新近合成或鑑定之化合物(即候選化合物)用於減少"經放射性標記的表1或表2之化合物"與GPR41受體結合之能力。因此，候選化合物與"經放射性標記的表1或表2之化合物"競爭與GPR41受體結合之能力與其結合親和力直接相關。

本發明之一態樣係關於一種由本文方法鑑定之可穩定血糖之化合物，其係用於藉由療法來治療人類或動物體之方法中。

本發明之另一態樣係關於一種由本文方法鑑定之可穩定血糖之化合物，其係用於藉由療法來治療人類或動物體之胰島素相關病症之方法中。本發明之另一態樣係關於一種用於治療胰島素相關病症之方法，其包含將治療有效量的由本文方法鑑定之可穩定血糖之化合物投與至患有該病況之受檢者中。

本發明之一態樣係關於一種用於治療胰島素相關病症之方法，其包含將治療有效量的由本文方法鑑定之可穩定血糖之化合物(例如)以醫藥組合物之形式投與至患有該病況之受檢者中。本發明之另一態樣係關於一種由本文方法鑑定之可穩定血糖之化合物，其係用於藉由療法來治療人類或動物體之胰島素相關病症之方法中。

申請者保留自本發明之任何實施例中排除任何一或多種候選化合物之權利。申請者亦保留自本發明之任何實施例中排除任何一或多種調節劑之權利。申請者另外保留自本發明之任何實施例中排除任何胰島素相關病症或任何與血糖濃度升高相關之病況之權利。

基於此專利文獻之回顧，所揭示受體及方法之其它用途對熟習此項技術者而言將變得顯而易見。

提供以下實例以說明本發明，而不慾以任何方式包含在內。

實例

提供該等實例以進一步定義本發明，而非將本發明限制於該等實例之細節。

實例1

人類GPR41在人類成熟組織及胎兒組織中表現的點漬墨法分析 在此實例中，使用點漬墨法測定幾種人類成熟與胎兒組織中的人類GPR41表現水平。

含有人類成熟與胎兒組織mRNA的墨點購自Clontech(BD Bioscience,Palo Alto,CA)。墨點上之組織mRNA順序為：A1＝全腦、A2＝扁桃體、A3＝尾狀核、A4＝小腦、A5＝大腦皮質、A6＝額葉皮質、A7＝海馬狀突起、A8＝延髓、B1＝枕葉皮質、B2＝被殼、B3＝黑質、B4＝顳葉皮質、B5＝丘腦、B6＝伏隔核、B7＝脊髓、C1＝心臟、C2＝主動脈、C3＝骨骼肌、C4＝結腸、C5＝膀胱、C6＝子宮、C7＝前列腺、C8＝胃、D1＝睾丸、D2＝卵巢、D3＝胰腺、D4＝腦垂體、D5＝腎上腺、D6＝甲狀腺、D7＝唾腺、D8＝乳腺、E1＝腎臟、E2＝肝臟、E3＝小腸、E4＝脾臟、E5＝胸腺、E6＝外周白細胞、E7＝淋巴節、E8＝骨髓、F1＝闌尾、F2＝肺、F3＝氣管、F4＝胎盤、G1＝胎兒腦、G2＝胎兒心臟、G3＝胎兒腎臟、G4＝胎兒肝臟、G5＝胎兒脾臟、G6＝f胎兒胸腺、G7＝胎兒肺。在Clontech所推薦之條件下，使用Clontech"Express Hyb"，以GPR41探針雜交墨點。

實例2

GPR41在小鼠組織及細胞中表現的RT－PCR與Taqman分析 在此實例中，使用PCR檢定與與Taqman定量PCR檢定來測定幾種小鼠細胞類型與組織中的小鼠GPR41表現水平。如圖2中所示，在胰腺與胰島細胞中觀察到小鼠GPR41之最高表現水平。另外，如圖2中所示，與野生型及ob/ob小鼠相比較，來自db/db小鼠之胰島中之GPR41上調。

藉由RT－PCR，使用以下引子評估在小鼠組織中GPR41的表現：5'－ATG GGG ACA AGC TTC TTT CT－3'(SEQ ID NO：3)與5'－CTA GCT CGG ACA CTC CTT GG－3'(SEQ ID NO：4)。小鼠組織cDNA自購自Clontech之市售聚A RNA使用BioRad iScript cDNA合成套組來合成。來自小鼠細胞系之cDNA自使用Triazol(Invitrogen)分離的總RNA製備，包括產生胰島素之胰腺β細胞系(NIT－1、βTC－6、AND MIN－6)。

對於圖2之底圖中所示之Taqman定量PCR試驗，在5 mL聚丙烯試管內製成1X TaqMan supermix。添加前置引子與反置引子以產生300 nM之最終濃度；添加適當量之探針以產生200 nM之最終濃度。每孔總體積為20 μL。2 μL為cDNA，而其它18 μL為supermix與無核酸酶之水。

引子自Proligo定購且探針藉由ABI來合成。引子與探針之序列為：5'引子：GCCGGCGCAAGAGGATA(SEQ ID NO：5)3'引子：CCGAAGCAGACGAAGAAGATG 3'(SEQ ID NO：6)探針：TTCTTGCAGCCACACTG－MGBNFQ 3'(SEQ ID NO：7)所用之熱循環器條件展示於以下之圖表中(表3)。

實例3

小鼠GPR41 RNase保護檢定 在此實例中，使用RNase保護檢定來測定幾種小鼠細胞類型及組織中之小鼠GPR41表現水平。如圖3所示，在胰島及胰島細胞系中觀察到小鼠GPR41之最高表現水平，包括MIN6(小鼠胰島瘤細胞系)、NIT－1及TC－6。

購得小鼠組織RNA(Clontech)。用於RNA分離之細胞(如圖中所示)為胰腺細胞系，其由ATCC(NIT－1：ATCC CRL－2055，與βTC－6：ATCC CRL－11506)提供或自Jeffrey Pessin at SUNY at Stony Brook(MIN－6)獲得。RNA使用Trizol藥劑(Invitrogen)根據產商之說明來分離。

簡而言之，將257 bp小鼠GPR41之片段選殖至pCRR II TOPO選殖載體(Invitrogen)中。用Xho1將質體線性化且使用Sephaglass Bandprep Kit(Amersham)進行凝膠純化。在片段凝膠純化之後，藉由使用SP6 RNA聚合酶(Ambion Maxiscript Kit)以體外轉錄來製得RNA探針。藉由丙烯醯胺凝膠電泳來純化該探針且以20 μg之總RNA在47℃雜交隔夜。在第二日以Rnase消化雜交物且使5%丙烯醯胺凝膠流過以偵測結果(Ambion,RPA III kit)。體外轉錄與RPA反應的全部程序皆遵循產商之說明。

用於RPA探針之小鼠GPR41序列為：5'－GTGGGGCTGAGGGTTACACACAGAGGTGGCACCTTGGTGATGTCGACACTGGGTGAGGGACAGGAAACCAGGGAGGTAGGCAGGACCACCTGCAGGGGAGAGCATGTGGAGCTATGGTGGTGGGGTGTAGGCAGTGTAGACAGCAATCTTGCCTGATGGGTAAGAGTCTCCCAGTGAGGGAACCCCAACTCTCAACACATTCCTCTCTGTCTCATTAGCATCTGTGACCATGGGGACAAGCTTCTTTCTTGGCAATT－3'(SEQ ID NO：8)用於RPA探針之小鼠GPR41 PCR引子為：5'－GTGGGGCTGAGGGTTACA－3'(SEQ ID NO：9)5'－AATTGCCAAGAAAGAAGC－3'(SEQ ID NO：10)

實例4

GPR41之G－α i偶合 在此實例中，GPR41與G－αi(Gαi)之偶合使用GqGi嵌合體來測定。GPR41之功能使用如下所述之IP3檢定來量測。

表現於Gq/Gi轉染之HEK293細胞中之GPR41的IP3檢定細胞內IP3積累檢定使用以GPR41與Gq/Gi嵌合體(參看Gq/Gi嵌合體構造之實例13)之表現質體瞬時轉染之HEK293細胞來執行。用於此檢定之轉染中的DNA為GPR41與GPR41(k)，將其選殖至哺乳動物表現載體pCMV中，與Gq/Gi嵌合體cDNA，將其選殖至表現載體pcDNA3.1(＋)(Invitrogen)中。GPR41(k)為GPR41之單胺基酸突變，其中胺基酸224突變為離胺酸。

轉染使用Lipofectamine轉染試劑(Invitrogen)且遵循產商建議來執行。簡而言之，在第一日，以3x10⁶ 細胞/盤之密度將細胞塗於96孔盤上。在第二日，如下製備用於各盤之DNA/Lipofectamine混合物：將每3孔1 μL之DNA(40 ng之pCMV－GPR41)，或25 μL OPTI－MEM(Gibco)中2 μL之DNA(20 ng與pcDNA－Gq/Gi結合的pCMV－GPR41)與25 μL OPTI－MEM中之2 μL Lipofectamine試劑輕輕混合且將所得溶液在室溫培養30分鐘。加入96 μL之OPTI－MEM以產生150 μL之最終體積。接著以100 μL/孔之PBS洗滌細胞一次，且接著輕輕將DNA－Liptofectamine混合物加入該盤(50 μL/孔)。接著將細胞在含有5% CO₂ 之潮濕氣氛中在37℃培養4小時。將常規細胞培養基加入轉染試劑。接著將細胞在37℃/5% CO₂ 培養隔夜。

在第3日，將常規生長培養基自孔小心移除且以100 μL之含有0.4 uCi之[³ H]－肌醇(Perkin－Elmer)的無肌醇/無血清DMEM(Gibco)來替代。將細胞以5% CO₂ 在37℃培養隔夜。在第4日，移除含[³ H]－肌醇之標記培養基且以100 μL之含有10 μM巴吉林(parglyline)(Sigma)與10 mM氯化鋰(Sigma)的無肌醇/無血清DMEM來替代。將細胞在37℃/5% CO₂ 培養1小時。接著小心移除溶液且將每孔160 μL之冰冷的0.1 M甲酸添加至該等細胞。藉由將培養盤在－80℃培養至少1小時來使用細胞溶解。

在AG1－X8甲酸酯樹脂(Bio－Rad)中使用層析法將IP3自細胞溶胞物中分離。將400 μL甲酸酯樹脂漿液(1 mL水中之0.1 g樹脂)添加至多孔過濾盤(Millipore)之每一孔中。將水自孔中吸出且接著使用Millipore過濾單元以200 μL水來洗滌樹脂。將具有溶胞細胞之培養盤解凍且將溶胞物轉移至含有甲酸酯樹脂之多孔過濾盤中。將培養盤在室溫下培養10分鐘且接著以過濾單元將溶胞物自過濾盤中吸出。以水(200 μL/孔)將培養盤洗滌四次且將水徹底排出。接著，向樹脂中添加溶離緩衝液(180 μL/孔)且在室溫下將培養盤培養5分鐘。使用真空歧管將溶離劑吸至96孔收集盤中，將其轉移至含有5 ml Optiphase HiSafe3閃爍混合液(Perkin Elmer)之閃爍瓶中且以Wallac Scintillation Counter來計數。

實例5

GPR41之G－α 12/13偶合 在此實例中，GPR41與G－α12/13(Gα12/13)之偶合使用如下所述之cAMP檢定來測定。

簡而言之，該試驗如下執行：以在X軸上指示之CMV－驅動之表現質體，連同一個以下嵌合體轉染293細胞：(a)"對照"：親本CMV表現質體，(b)"Gs/G12嵌合體"：編碼人類Gs之CMV－Gs/G12質體，其中C端11胺基酸轉換成相應於G12之C端的胺基酸，或(c)"Gs/G13嵌合體"：編碼人類Gs之CMV－Gs/G13質體，其中C端11胺基酸轉換成相應於G13之C端的胺基酸。24小時後，使用如下所述之"Flash Plate"套組分析細胞之cAMP含量分析。

可對設計用於基於細胞之檢定的A Flash Plate^T ^M 腺苷醯基環化酶套組(New England Nuclear；目錄號SMP004A)進行改良以與粗質膜一起使用。該等Flash Plate孔含有閃爍塗層，該塗層亦含有稱作cAMP之特異性抗體。孔中產生之cAMP可藉由與放射性cAMP示蹤物競爭與cAMP抗體之結合來量化。以下方法充當用於量測在表現GPR41之整個細胞中的cAMP含量變化之簡單方法。

在瞬時轉染之後大約二十四小時收集轉染細胞。小心地將培養基吸出且將其丟棄。向各盤中添加5 ml細胞解離緩衝液。將細胞自培養盤中吸出且將細胞懸浮液收集於50 ml錐形離心管中。接著，在室溫下將細胞以1,100 rpm離心5分鐘。小心地將細胞小球再懸浮於適當體積之檢定緩衝液中，其由體積之PBS及體積之螢光放射增強緩衝液組成(約3 ml/盤)。接著，使用血球計對該等細胞計數且添加額外檢定緩衝液以產生適當之細胞數目(最終體積為約50 μl/孔)。

根據製造商說明書來製備cAMP標準物質及偵測緩衝液(包含1 μCi之示蹤物[¹ ² ⁵ I]cAMP(50 μl)/11 ml偵測緩衝液)且對其進行儲存。藉由向96孔盤之適當孔中添加50 μl之cAMP標準物質，接著向H11及H12孔中添加50 μl PBS來起始檢定。向所有標準孔中添加50 μl螢光放射增強緩衝液。向適當之孔中加入細胞。以檢定緩衝液將弗斯可林(Forskolin)稀釋為2x儲備液，接著以50 μL/孔加入細胞且在室溫培養60分鐘。將100 μL含有示蹤物cAMP之偵測混合物接著加入該等孔中。接著額外將盤培養2小時，繼而以Wallac MicroBeta閃爍計數器來計數。接著自各檢定盤所含之標準cAMP曲線來推斷cAMP/孔的值。

實例6

GPR41調節劑之鑑定 在此實例中，使用爪蟾(Xenopus)黑素細胞之篩選方法來鑑定GPR41激動劑。

黑素細胞技術 黑素細胞為低等脊椎動物中所發現之皮膚細胞。其含有稱作黑素體之色素沉著細胞器。根據G蛋白質偶合受體(GPCR)活化作用，黑素細胞能使此等黑素體沿著微管網進行再分佈作用。此色素移動之結果為細胞之表觀變淺或變暗。在黑素細胞中，由Gi偶合受體活化所導致的細胞內cAMP含量減少使黑素體遷移至細胞中心，導致顏色戲劇性變淺。若在Gs偶合受體活化之後接著使cAMP含量增加，則黑素體再次分散且細胞再次呈暗色。由Gq偶合受體活化所導致之甘油二酯含量增加亦會誘發此再分散作用。此外，該技術亦適用於研究特定受體酪胺酸激酶。在受體活化之數分鐘內發生黑素細胞之反應且導致簡單、穩定之顏色變化。利用習知吸收率微盤讀取儀或普通視頻成像系統可輕易偵測到此反應。不同於其它皮膚細胞，黑素細胞源於神經脊，且似乎能表現訊號蛋白質之全部補充體。詳言之，該等細胞表現極廣範圍之G蛋白質且因此其可在功能上表現幾乎全部GPCRs。

黑素細胞可用於鑑定可鍵結至及/或活化GPCRs之化合物(包括天然配位體)。此方法可藉由引入色素細胞株之測試細胞來進行，該等細胞能夠在特定刺激之反應中使其色素分散或聚集且表現編碼GPCR之外源性純系。可使用(例如)褪黑激素、MSH或光來設置色素分佈之初始狀態。接著使該等測試細胞與化合物接觸，且測定細胞中之色素分佈是否異於色素分佈之初始狀態。由包括(但不限於)配位體之候選化合物與GPCR偶合所引起之色素細胞分散將於皮氏培養皿上呈暗色，而色素細胞之聚集將呈淺色。

根據美國專利第5,462,856號及美國專利第6,051,386號之揭示內容來獲得材料及方法。該等專利之揭示內容係以引用的方式全文併入本文中。

藉由以含有人類GPR41編碼序列之質體進行電穿孔來轉染黑素細胞。將該等細胞塗於96孔培養盤中。在轉染後48小時之後，將各培養盤中之半數細胞以10 nM之褪黑激素來進行處理。褪黑激素可激活黑素細胞中之內因性Gi偶合受體且使其色素聚集。將剩餘之半數細胞轉移至無血清之培養基0.7X L－15(Gibco)中。一小時之後，無血清培養基中之細胞仍為色素分散狀態，而以褪黑激素處理之細胞為色素聚集狀態。此時，以來自含有140,000－150,000種有機小分子化合物的專有化合物庫之不同化合物來處理該等細胞。若GPR41與化合物結合，則預期黑素細胞將在化合物之反應中經受顏色變化。由於受體可與Gi偶合，經色素分散之細胞將經受劑量依賴性色素聚集。

實例7

在Gq/Gi轉染細胞中GPR41激動劑之功效 在此實例中，在以嵌合GαGq/Gi共轉染之HEK 293細胞中測試經選擇之GPR41激動劑2－甲基－4－(4－硝基－苯基)－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺(圖6中之CPD1)與環丙基羧酸4－[1,2,3]噻二唑－4－基－苯酯(圖5中之CPD2)之功效。

轉染使用Lipofectamine轉染試劑(Invitrogen)且遵循產商建議來執行。簡而言之，在第一日，以4x10⁶ 細胞/盤之密度將細胞塗於96孔盤上。在第二日，如下製備用於各盤之DNA/Lipofectamine混合物：將每8孔2.5 μL之DNA(250 ng之pCMV－GPR41或pCMV空載體)，及200 μL DME(Gibco)中2.5 μL之DNA(250 ng pcDNA 3.1 Gq/Gi)與200 μL DME中之2.5 μL Lipofectamine試劑輕輕混合且將所得溶液在室溫培養30分鐘。將生長培養基自細胞吸出且添加55 μL/孔之DME。接著輕輕將DNA－Liptofectamine混合物加入該盤(45 μL/孔)。接著將細胞在含有5% CO₂ 之潮濕氣氛中在37℃培養4小時。將常規細胞培養基加入轉染試劑。接著將細胞在37℃/5% CO₂ 培養隔夜。

在第3日，將常規生長培養基自孔小心移除且以100 μL之含有0.4 uCi之[³ H]－肌醇(Perkin－Elmer)的無肌醇/無血清DMEM(Gibco)來替代。將細胞以5% CO₂ 在37℃培養隔夜。在第4日，移除含[³ H]－肌醇之標記培養基且以100 μL之含有10 μM巴吉林(parglyline)(Sigma)與10 mM氯化鋰(Sigma)的無肌醇/無血清DMEM(具有或無化合物)來替代。將細胞在37℃/5% CO₂ 培養3小時。接著小心移除溶液且將每孔160 μL之冰冷的0.1 M甲酸添加至該等細胞。藉由將培養盤在－80℃培養至少1小時來使用細胞溶解。

在AG1－X8甲酸酯樹脂(Bio－Rad)中使用層析法將IP3自細胞溶胞物中分離。將400 μl甲酸酯樹脂漿液(1 ml水中之0.1 g樹脂)添加至多孔過濾盤(Millipore)之每一孔中。將水自孔中吸出且接著使用Millipore過濾單元以200 μl水來洗滌樹脂。將具有溶胞細胞之培養盤解凍且將溶胞物轉移至含有甲酸酯樹脂之多孔過濾盤中。將培養盤在室溫下培養10分鐘且接著以過濾單元將溶胞物自過濾盤中吸出。以水(200 μl/孔)將培養盤洗滌四次且將水徹底排出。接著，向樹脂中添加溶離緩衝液(180 μl/孔)且在室溫下將培養盤培養5分鐘。使用真空歧管將溶離劑吸至96孔收集盤中，將60 μl轉移至Whatman Unifilter GF/C 96孔盤(Perkin Elemer 1450－525)中且添加50 μl Optima Gold(Perkin Elmer)。以Wallac Scintillation Counter執行計數。

實例8

GPR41激動劑抑制MIN6胰島瘤細胞中之胰島素分泌 在此實例中，檢定經選擇之GPR41激動劑(環丙基羧酸(CPC))在胰島瘤細胞系中對胰島素分泌之影響。

將小鼠胰島瘤系MIN6塗至多孔組織培養皿中且在補充15%胎牛血清之杜貝卡氏初代細胞培養液(Dulbecco's Minimum Essential Media)(DMEM)中培養2日。在低葡萄糖(10 mg/dl)克雷布斯－林格氏碳酸氫鹽(Krebs－Ringers Bicarbonate)緩衝液中將細胞漂洗且固定幾小時，之後以300 mg/dl葡萄糖與所關注之化合物：類葡萄糖肽1(GLP－1)與環丙基羧酸(CPC)激發30分鐘前。GLP－1，7－36醯胺，一種已知之胰島素分泌抑制劑，購自Sigma且以25 nM濃度使用，且CPC購自Aldrich且以5 μM或1 μM使用。以僅使用葡萄糖(兩者均為10 mg/dl與300 mg/dl)之對照孔進行比較。收集且冷凍來自葡萄糖激發之上清夜。將此等藉由用於胰島素之ELISA(Crystal Chem,Inc.)來評估。

實例9

口服葡萄糖耐受測試 在口服葡萄糖投藥測試後，可測得GPR41調節劑，諸如激動劑、拮抗劑或逆相激動劑對血漿葡萄糖之影響。

例如，使67日齡之雄性C57b1/6小鼠禁食18小時且隨機分組接受選擇劑量之GPR41調節劑或載劑(PET，其含有80% PEG、10% Tween80與10%乙醇)。將GPR41調節劑經由管飼針(經口，體積為100 μL)口服傳遞。GPR41調節劑或載劑投藥三十分鐘後，將右旋糖以3 g/kg劑量口服投與至小鼠。使用Glucometer Elite XL(Bayer)在幾個時間點上測定血糖含量。

葡萄糖耐受量亦可使用腹腔注射傳遞葡萄糖來測試。例如，在18小時之禁食後，將68日齡雄性C57B1/6小鼠以100 mg/kg之GPR41調節劑或以PET載劑處理。GPR41調節劑或載劑投藥三十分鐘後，將右旋糖以2 g/kg劑量腹腔注射投與至小鼠。使用Glucometer Elite XL(Bayer)在選擇之時間點上測定血糖含量。

實例10

GPR41激動劑逆轉口服葡萄糖耐受測試(oGTT)降低化合物的有益效果 在oGTT中具有降低血糖效應之化合物，(2－氟－4－甲磺醯基－苯基)－{6－[4－(3－異丙基－[1,2,4]噁二唑－5－基)－哌啶－1－基]－5－硝基－嘧啶－4－基}－胺，係在2004年1月14日申請之WO 2004/065380 A1中參考為化合物B111，其單獨或連同本文中所揭示之GPR41激動劑化合物4一起使用。如圖8中所示，GPR41激動劑逆轉了化合物B111之降低血糖效應，從而引起血漿葡萄糖增加。此等結果顯示GPR41拮抗劑或逆相激動劑可具有降低血糖之效應。

對於oGTT，使雄性C57b1/6小鼠禁食約18小時且將其隨機分組接受指定劑量之圖8中所指定之化合物或載劑(PET，其含有80% PEG、10% Tween80與10%乙醇)。將該(等)指定化合物經由管飼針(口服，體積為100 μL)口服傳遞。該(等)化合物或載劑投藥三十分鐘後，將右旋糖以3 g/kg劑量口服投與至小鼠。使用Glucometer Elite XL(Bayer)在幾個時間點上測定血糖含量。

實例11

化合物合成 本文揭示之化合物係可購得的或由此項技術中已知之程序來製備。例如，化合物1[意即，2－甲基－4－(4－硝基－苯基)－5－氧代－1,4,5,6,7,8－六氫－喹啉－3－羧酸鄰－甲苯醯胺]係購自ASINEX Ltd.5 Gabrichevskogo St.Bldg 8,Moscow 123367,Russia；化合物2(環丙基羧酸4－[1,2,3]噻二唑－4－基－苯酯)係購自Tripos,Inc.,1699 South Hanley Road,St.Louis,MO 63144－2319；且化合物3(環丙基羧酸)係購自Sigma－Aldrich,3050 Spruce St.,St.Louis,MO 63103。化合物4至化合物9由此項技術中已知之方法來製備，例如藉由基本上由Carroll等人Journal of Medicinal Chemistry 47：3180－3192(2004)所描述之二氫吡啶的3組份Hantzsch二氫吡啶合成法(Hantzsch Dihydropyridine Synthesis)(例如，在異丙醇中回流中將該等組份加熱18－36小時)。用於製備本發明之特定化合物之一般反應流程如下所示：

本文揭示之特定化合物亦需要另外之偶合步驟，例如Suzuki偶合步驟。Suzuki偶合反應在此項技術中係眾所周知的且已報道了多種條件與變化，例如Snieckus等人Journal of Organic Chemistry 56：3763－3768(1991)的程序。一般反應如下所示：

實例12

用於測定GPCR活化作用之檢定 多種方法均可用於評估人類GPCR之活化作用。以下內容具有說明性；熟習此項技術者具有用於測定彼等優先有益於技藝人士需要的技術之能力。

1.膜結合檢定：[³ ⁵ S]GTPγS檢定當G蛋白質偶合受體處於活性狀態時，由於配位體結合或構成性活化作用，受體偶合至G蛋白質且刺激GDP之釋放及隨後之GTP與G蛋白質結合。G蛋白質受體複合物之α次單位充當GTP酶且使GTP緩慢水解為GDP，此時受體通常不具有活性。活化受體持續將GDP轉化成GTP。可利用不可水解之GTP類似物[³ ⁵ S]GTPγS來證明[³ ⁵ S]GTPγS與表現活化受體之膜的結合作用得到增強。使用[³ ⁵ S]GTPγS結合來量測活化作用之優勢在於：(a)其一般可應用於全部G蛋白質偶合受體；(b)其與膜表面最接近，使其獲得影響細胞內級聯之分子的可能性更小。

該檢定利用G蛋白質偶合受體之能力來刺激[³ ⁵ S]GTPγS與表現相關受體之膜的結合。因此，該檢定可用於直接鑑定方法以自候選化合物中篩選內因性GPCR及非內因性構成性活化GPCR。該檢定具有通用性且應用於所有蛋白質偶合受體之藥物發現。

將[³ ⁵ S]GTPγS檢定在20 mM HEPES與1至約20 mM MgCl₂ (雖然20 mM較佳，但此量可經調節以使結果最優化)、具有約0.3至約1.2 nM[³ ⁵ S]GTPγS(雖然1.2為較佳，但此量可經調節以使結果最優化)及12.5至75 μg膜蛋白質(例如，表現GPR41之293細胞；此量可經調節以達到最優化)之結合緩衝液(pH 7.4)與10 μM GDP(此量可改變以達到最優化)中培養1小時。接著，添加麥胚凝集素珠粒(25 μl；Amersham)且將該混合物在室溫下再培養30分鐘。接著，在室溫下將該等試管以1500 x g離心5分鐘且接著在閃爍計數器中計數。

2.腺苷醯基環化酶可對設計用於基於細胞之檢定的Flash Plate^T ^M 腺苷醯基環化酶套組(New England Nuclear；目錄號SMP004A)進行改良以與粗質膜一起使用。該等Flash Plate孔可含有閃爍塗層，該塗層亦含有稱作cAMP之特異性抗體。孔中多產生之cAMP可藉由與放射性cAMP示蹤劑競爭與cAMP抗體之結合來量化。以下方法充當用於量測在表現受體之整個細胞中的cAMP含量變化之簡單方法。

在瞬時轉染之後大約二十四小時收集轉染細胞。小心地將培養基吸出且將其丟棄。向各細胞盤中緩慢添加10 ml PBS，接著將其小心地吸出。向各培養盤中添加1 ml Sigma細胞解離緩衝液及3 ml PBS。將細胞自培養盤中吸出且將細胞懸浮液收集於50 ml錐形離心管中。接著，在室溫下將細胞以1,100 rpm離心5分鐘。小心地將細胞小球再懸浮於適當體積之PBS(約3 ml/培養盤)中。接著，使用血球計對該等細胞計數且添加額外PBS以產生適當數目之細胞(最終體積為約50 μl/孔)。

根據製造商說明書來製備cAMP標準物質及偵測緩衝液(包含1 μ Ci之示蹤劑[¹ ² ⁵ I]cAMP(50 μl)/11 ml偵測緩衝液)且對其進行儲存。用於篩選之檢定緩衝液係新近製備且含有50 μl螢光放射增強緩衝液、3 μl候選化合物(最終檢定濃度為12 μM)及50 μl細胞。在使用之前，將檢定緩衝液一直儲存於冰上。例如，較佳於96孔培養盤中進行之檢定係藉由向適當孔中添加50 μl之cAMP標準物質、接著向H11及H12孔中添加50 μl PBSA來起始。向所有孔中添加50 μl螢光放射增強緩衝液。使用能夠分配3 μl化合物溶液之針形器具將DMSO(或所選之候選化合物)添加至適當孔中，其具有最終檢定濃度為12 μM之候選化合物及100 μl之總檢定體積。接著向孔中添加細胞且在室溫下培養60分鐘。接著向孔中添加100 μl含示蹤劑cAMP之偵測混合物。接著，將培養盤再培養2小時，繼而以Wallac MicroBeta閃爍計數器來計數。接著，由各檢定盤中所含之標準cAMP曲線來推斷cAMP/孔之值。

3.用於Gi偶合目標GPCR之基於細胞的cAMP TSHR係在活化時引起cAMP積累之Gs偶合GPCR。TSHR可藉由使胺基酸殘基623突變而得以構成性活化(即將丙胺酸殘基變換成異白胺酸殘基)。吾人預期Gi偶合受體會抑制腺苷醯基環化酶，且因此減少cAMP產生之水平，其可使cAMP含量之評估具挑戰性。cAMP產生之減少表示Gi偶合受體的活化，用於量測該減少之有效技術可藉由具有Gi連接目標GPCR的作為"訊號增強劑"之共轉染、非內因性構成性活化TSHR(TSHR－A623I)(或內因性構型活化Gs偶合受體)來實現以確定cAMP之基線含量。在Gi偶合受體之內因性或非內因性型式形成之後，接著將目標GPCR與訊號增強劑共轉染且此材料可用於篩選。在一些實施例中，此方法較佳用於直接鑑定Gi偶合受體之候選化合物。注意對Gi偶合GPCR而言，當使用此方法時，目標GPCR之反向激動劑將使cAMP訊號增強且激動劑將使cAMP訊號減弱。

第一天，每孔濾出2×10⁴ 個293細胞。第二天，製成兩個反應試管(各試管需遵循之比例為每個培養盤)：試管A係藉由在1.2 ml無血清DMEM(Irvine Scientific,Irvine,CA)中混合轉染至哺乳動物細胞中之各受體的2 μg DNA(總計4 μg DNA)(例如，pCMV載體、具有突變THSR(TSHR－A623I)之pCMV載體、TSHR－A623I與GPCR等)來製備；試管B係藉由在1.2 ml無血清DMEM中混合120 μl Liptofectamine(Gibco BRL)來製備。接著，藉由將試管A及試管B倒置(若干次)來使其混雜，繼而將其在室溫下培養30－45分鐘。該混合物係指"轉染混合物"。以1XPBS來洗滌經塗布之293細胞，繼而添加10 ml無血清DMEM。接著，將2.4 ml之轉染混合物添加至細胞中，隨後使其在37℃/5% CO₂ 下培養4小時。接著藉由吸取作用來移除該轉染混合物，繼而添加25 ml之DMEM/10%胎牛血清。接著，在37℃/5% CO₂ 下培養細胞。在培養24小時之後，收集細胞且將其用於分析。

Flash Plate^T ^M 腺苷醯基環化酶套組(New England Nuclear；目錄號SMP004A)係設計用於基於細胞之檢定，但可視熟練技藝人士之需要進行改良以與粗質膜一起使用。該等Flash Plate孔含有閃爍塗層，該塗層亦含有稱作cAMP之特異性抗體。孔中所產生之cAMP可藉由與放射性cAMP示蹤劑競爭與cAMP抗體之結合來量化。以下方法充當用於量測在表現所關注受體之整個細胞中的cAMP含量變化之簡單方法。

在瞬時轉染之後大約二十四小時收集轉染細胞。小心地將培養基吸出且將其丟棄。向各細胞盤中緩慢添加10 ml PBS，接著將其小心地吸出。向各培養盤中添加1 ml Sigma細胞解離緩衝液及3 ml PBS。將細胞自培養盤中吸出且將細胞懸浮液收集至50 ml錐形離心管中。接著，在室溫下使細胞以1,100 rpm離心5分鐘。小心地將細胞小球再懸浮於適當體積之PBS(約3 ml/培養盤)中。接著，使用血球計對該等細胞計數且添加額外之PBS以產生適當數目之細胞(最終體積為約50 μl/孔)。

根據製造商說明書來製備cAMP標準物質及偵測緩衝液(包含1 μCi之示蹤劑[¹ ² ⁵ I]cAMP(50 μl)/11 ml偵測緩衝液)並對其進行儲存。用於篩選之檢定緩衝液應新近製備且含有50 μl螢光放射增強緩衝液、3 μl候選化合物(最終檢定濃度為12 μM)及50 μl細胞。在使用前之將檢定緩衝液一直儲存於冰上。該檢定可藉由向適當孔中添加50 μl cAMP標準物質、接著向H－11及H12孔中添加50 μl PBSA來起始。向各孔中添加50 μl螢光放射增強緩衝液。使用能分配3 μl化合物溶液之針形器具，將所選化合物(例如TSH)添加至適當孔中，其具有最終檢定濃度為12 μM之候選化合物及100 μl之總檢定體積。接著向孔中添加細胞且在室溫下培養60分鐘。接著向孔中添加100 μl含示蹤劑cAMP之偵測混合物。接著將培養盤再培養2小時，繼而以Wallac MicroBeta閃爍計數器計數。由各檢定盤中所含之標準cAMP曲線來推斷cAMP/孔之值。

4.基於報導體之檢定a. CRE－LUC報導體檢定(Gs相關受體)在96孔培養盤上，使293或293T細胞以每孔2×10⁴ 個細胞之密度濾出，且根據製造商說明書在隨後幾天中使用Liptofectamine(BRL)進行轉染。如下所述來製備用於各6孔轉染之DNA/脂質混合物：使100 μl DMEM中之260 ng質體DNA與100 μl DMEM中之2 μl脂質緩慢混合(該260 ng質體DNA係由200 ng之8xCRE－Luc報導體質體、僅包含內因性受體或非內因性受體或pCMV之50 ng pCMV及10 ng GPRS表現質體(pcDNA3中之GPRS(Invitrogen))組成)。如下所述來製備8XCRE－Luc報導體質體：藉由在pβgal－Basic載體(Clontech)中於BglV－Hind Ⅲ部位選殖大鼠生長抑素激活子(－71/＋51)來獲得載體SRIF－β－gal。藉由腺病毒模板AdpCF126CCRE8之PCR來獲得CAMP反應要素之八個(8)複本(參看Suzuki等人，Hum Gene Ther 7：1883－1893(1996)；其揭示內容係以引用的方式全文併入本文中)且將其於Kpn－BglV部位選殖於SRIF－β－gal載體中，由此產生8xCRE－β－gal報導體載體。藉由在HindIII－BamHI部位以獲自pGL3－鹼性載體(Promega)之螢光素酶基因置換8xCRE－β－gal報導體載體中之β－半乳糖苷酶基因來產生8xCRE－Luc報導體質體。在室溫下培養30分鐘之後，將DNA/脂質混合物以400 μl DMEM稀釋且向各孔中添加100 μl經稀釋之混合物。將具有10% FCS之100 μl DMEM在細胞培養恆溫箱中培養四小時，之後將其添加至各孔中。第二天，將經轉染之細胞與具有10% FCS之200 μl DMEM/孔交換。八(8)小時之後，將該等孔以PBS洗滌一次，之後將其轉換成不含酚紅之100 μl DMEM/孔。第二天，根據製造商說明書使用LucLite^T ^M 報導體基因檢定套組(Packard)來量測螢光素酶活性，且在1450 MicroBeta^T ^M 閃爍及發光計數器(Wallac)上讀數。

b. AP1報導體檢定(Gq相關受體)一種用於偵測Gq螢光放射增強之方法係取決於Gq依賴性磷脂酶C之已知特性以在其激活子中引起含有AP1要素的基因之活化。Pathdetect^T ^M AP－1順式報導系統(Stratagene，目錄號219073)可根據上文所述之關於CREB報導體檢定的方法來使用，而磷酸鈣沉澱物之組份為410 ng pAPl－Luc、80 ng pCMV－受體表現質體及20 ng CMV－SEAP。

c. SRF－LUC報導體檢定(Gq相關受體)一種用於偵測Gq螢光放射增強之方法係取決於Gq依賴性磷脂酶C之已知特性以在其激活子中引起含有血清反應因子的基因之活化。可使用Pathdetect^T ^M SRF－Luc－報導系統(Stratagene)來檢定(例如)COS7細胞中之Gq偶合活性。使細胞轉染該系統之質體組份且根據製造商說明書使用Mammalian Transfection^T ^M 套組(Stratagene,Catalogue #200285)來指示編碼內因性或非內因性GPCR之表現質體。簡言之，根據製造商說明書，使410 ng SRF－Luc、80 ng pCMV－受體表現質體及20 ng CMV－SEAP(所分泌之鹼性磷酸酶表現質體；鹼性磷酸酶活性係在經轉染細胞之培養基中進行量測以對照樣本之間的轉染效率變化)與磷酸鈣沉澱物結合。將半數沉澱物平均分配於96孔培養盤之3個孔中，且使細胞於無血清培養基中保持24小時。最後5小時，於(例如)1 μM之候選化合物中培養細胞。接著使細胞溶解且根據製造商說明書使用Luclite^T ^M 套組(Packard，目錄號6016911)及"Trilux 1450 Microbeta"液體閃爍及發光計數器(Wallac)來檢定螢光素酶活性。可使用GraphPad Prism^T ^M 2.0a(GraphPad Software Inc.)來分析資料。

d.細胞內IP3積累檢定(Gq－相關受體)第1天，可將包含所關注受體(內因性或非內因性)之細胞塗於24孔培養盤上，一般1×10⁵ 個細胞/孔(儘管可將此數目最優化)。第2天，可藉由首先使50 μl無血清DMEM/孔中之0.25 μg DNA與50 μl無血清DMEM/孔中之2 μl Liptofectamine混合來轉染細胞。緩慢混合該等溶液且使其在室溫下培養15－30分鐘。以0.5 ml PBS來洗滌細胞且使400 μl無血清培養基與經轉染之培養基混合且將其添加至細胞中。接著在37℃/5% CO₂ 下將細胞培養3－4小時且接著移除轉染培養基，並以1 ml/孔之常規生長培養基替代之。第3天，以³ H－肌醇來標記細胞。簡言之，將培養基移除且以0.5 ml PBS洗滌細胞。接著，每孔添加0.5 ml無肌醇/無血清培養基(GIBCO BRL)且每孔添加0.25 μCi之³ H－肌醇，且將該等細胞在37℃/5% CO₂ 下培養16－18小時隔夜。第4天，0.5 ml PBS洗滌細胞且若使用含有血清素受體之對照建構，則添加0.45 ml含有無肌醇/無血清培養基、10 μM巴吉林、10 mM氯化鋰或0.4 ml檢定培養基及50 μl 10x酮舍林(ketanserin)(ket)之檢定培養基，直至最終濃度為10 μM。接著，在37℃下使細胞培養30分鐘。接著以0.5 mlPBS洗滌細胞且每孔添加200 μl新鮮/冰冷之停止溶液(1M KOH、18 mM硼酸鈉、3.8 mM EDTA)。將溶液於冰上保持5－10分鐘或直至細胞已溶解，且接著以200 μl新鮮/冰冷之中和溶液(7.5 % HCL)來中和之。接著將溶胞物轉移至1.5 ml艾本德(eppendorf)試管中且添加1 ml氯仿/甲醇(1：2)/孔。將溶液攪拌15秒鐘且將上層相用於Biorad AG1－X8^T ^M 陰離子交換樹脂(100－200網格)。首先將樹脂以1：1.25 W/V之水洗滌，且將0.9 ml上層相裝入管柱中。以10 ml 5 mM肌醇及10 ml 5 mM硼酸鈉/60 mM甲酸鈉來洗滌該管柱。將三磷酸肌醇溶離於含有10 ml閃爍混合液(具有2 ml 0.1 M甲酸/1M甲酸銨)之閃爍瓶中。藉由以10 ml 0.1 M甲酸/3 M甲酸銨洗滌且以dd H₂ O漂洗兩次來使管柱再生，且將其儲存與4℃之水中。

實例13

製備融合蛋白質 a. GPCR：Gs融合建構GPCR－G蛋白質融合建構之設計可如下所述來完成：大鼠G蛋白質Gsa(長形式；Itoh,H.等人，Proc.Natl.Acad.Sci. 83：3776(1986))之5'及3'末端皆係設計為包括其上之Hind III序列。在確認正確序列(包括側接HindIII序列)之後，整個序列係藉由使用該載體之HindIII限制部位進行次選殖而穿梭進入pcDNA3.1(－)(Invitrogen，目錄號V795－20)中。在pcDNA3.1(－)中次選殖之後，測定Gsα序列之正確方向。接著，驗證在HindIII序列上含有大鼠Gsα基因之經修飾pcDNA3.1(－)；此載體此時可用作"通用"Gsα蛋白質載體。該pcDNA3.1(－)載體在HindIII部位之上游含有各種熟知之限制部位，因此，有利地提供在Gs蛋白質之上游插入所要受體的編碼序列之能力。亦可利用此方法來形成其它"通用"G蛋白質載體且當然可利用技藝人士已知之其它市售或專有載體，其重要標準為GPCR之序列在上游且與G蛋白質之序列匹配。

b. Gq(6胺基酸缺失)/Gi融合建構Gq(del)/Gi融合建構之設計可如下所述來完成：刪除Gαq－次單位之N端六(6)胺基酸(胺基酸2至7，其具有TLESIM(SEQ ID NO：11)之序列)，且具有EYNLV(SEQ ID NO：12)序列之C末端五(5)胺基酸係由具有DCGLF(SEQ ID NO：13)序列之Gαi蛋白質的相應胺基酸來替代。此融合建構可使用以下引子由PCR獲得：5'－gatcAAGCTTCCATGGCGTGCTGCCTGAGCGAGGAG－3'(SEQ ID NO：14)與5'－gatcGGATCCTTAGAACAGGCCGCAGTCCTTCAGGTTCAGCTGCAGGATGGTG－3'(SEQ ID NO：15)及含有以血球凝集素標記作為模板的小鼠Gαq－野生型式之質體63313。包括作為間隔物之底蓋中的核苷酸。

TaqPlus精密DNA聚合酶(Stratagene)可藉由以下循環而用於擴增，其中將步驟2至4重複35次：在95℃下2分鐘、在95℃下20秒鐘、在56℃下20秒鐘、在72℃下2分鐘及在72℃下7分鐘。可將PCR產物選殖於pCRII－TOPO載體(Invitrogen)中且使用ABI Big Dye Terminator套組(P.E.Biosystems)來定序。可藉由兩步驟選殖方法使含有融合建構序列之TOPO純系插入物穿梭進入HindIII/BamHI部位之表現載體pcDNA3.1(＋)中。亦參看2002年9月6日出版之WO 02068600,PCT申請號為PCT/US02/05625，其揭示內容係以引用的方式全文併入本文中。

實例14

[ ³⁵ S]GTPγS檢定 A.膜製備在一些實施例中，包含用於鑑定候選化合物(例如激動劑、反向激動劑或拮抗劑)的所關注目標GPCR之膜係如下所述來製備：a.材料"刮膜緩衝液"包含20 mM HEPES及10 mM EDTA,pH 7.4；"洗膜緩衝液"包含20 mM HEPES及0.1 mM EDTA,pH 7.4；"結合緩衝液"包含20 mM HEPES、100 mM NaCl及10 mM MgCl₂ ,pH 7.4。

b.程序在此程序中，所有材料均始終保持於冰上。首先，將培養基自長滿之單層細胞中吸出，繼而以10 ml冷PBS漂洗，繼而將其吸出。其後，添加5 ml刮膜緩衝液來刮除細胞；接著，將細胞萃取物轉移至50 ml離心管中(在4℃下，以20,000 rpm離心17分鐘)。其後，吸出清液且使小球再懸浮於30 ml洗膜緩衝液中，繼而使其在4℃下以20,000 rpm離心17分鐘。接著吸出清液且使小球再懸浮於結合緩衝液中。接著，使用Brinkman Polytron^T ^M 均質器(15－20秒鐘實現，直至所有材料均在懸浮液中)來使其均質化。其在本文中係指"膜蛋白質"。

Bradford蛋白質檢定在均質之後，使用Bradford蛋白質檢定來測定膜之蛋白質濃度(可將蛋白質稀釋至約1.5 mg/ml，等分且冷凍(－80℃)以供後續使用；當冷凍時，使用之方法將如下所述：在檢定當天，使冷凍之膜蛋白質在室溫下解凍，繼而攪拌且接著以約12×1,000 rpm由Polytron使其均質化，歷經約5－10秒鐘；應注意，對多次製備而言，在不同製劑之均質化作用之間應將均質器徹底清潔)。

a.材料根據製造商說明書(Biorad，目錄號500－0006)，使用結合緩衝劑(如上所述)、Bradford染色劑、Bradford蛋白質標準物質。

b.程序準備兩個試管，一個包括膜且一個作為"空白"對照物。各試管含有800 μl結合緩衝液。其後，向各試管中添加10 μl Bradford蛋白質標準物質(1 mg/ml)，且接著僅向一個試管(非空白試管)中添加10 μl蛋白質。其後，向各試管中添加200 μl Bradford染色劑，接著攪拌各試管。五(5)分鐘之後，再攪拌該等試管且將其中之材料轉移至比色皿中。在595波長下，使用CECIL 3041光譜光度計來讀取比色皿。

鑑定檢定a.材料GDP緩衝液係由37.5 ml結合緩衝液及2 mg GDP(Sigma，目錄號G－7127)組成，繼而連續稀釋結合緩衝液以獲得0.2 μM GDP(各孔中之GDP最終濃度為0.1 μM GDP)；各孔包含最終體積為200 μl之候選化合物，該候選化合物係由100 μl GDP緩衝液(最終濃度為0.1 μM GDP)、結合緩衝液中之50 μl膜蛋白質及結合緩衝液中之50 μl[³ ⁵ S]GTPγS(0.6 nM)(每10 ml結合緩衝液中含有2.5 μl[³ ⁵ S]GTPγS)組成。

b.程序可使用96孔培養盤格式來篩選候選化合物(該等化合物可在－80℃下冷凍)。將膜蛋白質(或具有包括目標GPCR(作為對照物)的表現載體之膜)簡單地均質化，直至形成懸浮液。使用上文所述之Bradford蛋白質檢定來測定蛋白質濃度。將結合緩衝液中之膜蛋白質(及對照物)稀釋至0.25 mg/ml(最終檢定濃度為12.5 μg/孔)。其後，向Wallac Scintistrip^T ^M (Wallac)之各孔中添加100 μl GDP緩衝液。使用5 μl針形器具以將5 μl候選化合物轉移至該孔中(意即，5 μl在200 μl總檢定體積中之比例為1：40，以致候選化合物之最終篩選濃度為10 μM)。另外，為了避免污染，在各轉移步驟之後應將該針形器具在包含水(1X)、乙醇(1X)及水(2X)之三個貯器中進行漂洗－每次漂洗之後應將過量液體自該器具中搖出且以紙及無塵紙使其乾燥。其後，向各孔中添加50 μl之膜蛋白質(亦採用包含不具有目標GPCR的膜之對照孔)且在室溫下預培養5－10分鐘。其後，向各孔中添加結合緩衝液中之50 μl[³ ⁵ S]GTPγS(0.6 nM)，繼而在室溫下於震盪器中培養60分鐘(培養盤係以箔覆蓋)。接著，藉由在22℃下使培養盤以4000 RPM旋轉15分鐘來停止檢定。以8信道歧管來吸取該等培養盤且以培養盤蓋密封之。使用"Prot.#37"設定在Wallac 1450上讀取培養盤(根據製造商說明書)。

實例15

循環AMP檢定 用於鑑定諸如激動劑、反向激動劑或拮抗劑之候選化合物的另一檢定方法可藉由利用基於環化酶之檢定來實現。除直接鑑定之外，此檢定方法亦可用作提供如上文實例所述之[³ ⁵ S]GTPγS方法的結果驗證之獨立方法。

根據以下方法，經改良之Flash Plate^T ^M 腺苷醯基環化酶套組(New England Nuclear；目錄號SMP004A)可用於在諸如反向激動劑及激動劑之候選化合物中直接鑑定所關注之受體。

在轉染之後約3天時，收集經轉染細胞。藉由使含有20 mM HEPES(pH 7.4)及10 mM MgCl₂ 之緩衝液中的懸浮細胞均質化來製備膜。使用Brinkman Polytron^T ^M ，在冰上進行約10秒鐘之均質化作用。在4℃下將所得均質物以49,000 X g離心15分鐘。接著，將所得小球再懸浮於含有20 mM HEPES(pH 7.4)及0.1 mM EDTA之緩衝液中，將其均質化10秒鐘，繼而在4℃下以49,00o x g離心15分鐘。接著將所得小球儲存於－80℃，直至使用。在直接鑑定篩選當天，在室溫下使膜小球緩慢解凍，使其再懸浮於含有20 mM HEPES(pH 7.4)及10 mM MgCl₂ 之緩衝液中以產生0.60 mg/ml之最終蛋白質濃度(將懸浮膜置於冰上，直至使用)。

根據製造商說明書來製備cAMP標準物質及偵測緩衝液(包含2 μCi之示蹤劑[¹ ² ⁵ I]cAMP(100 μl)/11 ml偵測緩衝液)並對其進行儲存。用於篩選之檢定緩衝液係新近製備且含有20 mM HEPES(pH 7.4)、10 mM MgCl₂ 、20 mM磷酸肌酸(Sigma)、0.1單位/毫升肌酸磷酸激酶(Sigma)、50 μM GTP(Sigma)及0.2 mM ATP(Sigma)；接著將檢定緩衝液儲存於冰上，直至使用。

將候選化合物添加至(例如)96孔培養盤之孔中(3 μl/孔；最終檢定濃度為12 μM)，同時添加40 μl膜蛋白質(30 μg/孔)及50 μl檢定緩衝液。接著在室溫下將此混合物培養30分鐘，同時輕微震盪。

在培養之後，向各孔中添加100 μl偵測緩衝液，繼而將其培養2－24小時。接著，使用"Prot.#31"由Wallac MicroBeta^T ^M 培養盤讀取儀來對培養盤計數(根據製造商說明書)。

實例16

用於量測細胞內鈣濃度之螢光成像板讀取儀(FLIPR)檢定 將來自個別無性繁殖系之經目標受體(實驗性)及pCMV(陰性對照物)穩定轉染的細胞以5.5×10⁴ 個細胞/孔接種至經聚－D－離胺酸預處理之含有完全培養基(具有10% FBS、2 mM L－麩醯胺酸、1 mM丙酮酸鈉之DMEM)的96孔培養盤(Becton－Dickinson,#356640)中，以用於第二天之檢定。由於GPR41係經Gi偶合，包含GPR41之細胞可進一步包含Gα15、Gα16或嵌合Gq/Giα次單位。然而，由於GPR41亦與Gα12/13偶合(參看實例5及圖5)，為了引起可偵測之鈣流量，可不需要諸如Gα15、Gα16或嵌合Gq/Giα次單位之混合G蛋白質。為製備Fluo4－AM(分子探針，#F14202)培養緩衝液儲備液，將1 mg Fluo4－AM溶解於467 μl DMSO及467 μl泊洛尼克酸(Pluoronic acid)(分子探針，#P3000)中以產生1 mM儲備溶液，該儲備溶液可於－20℃下儲存一個月。Fluo4－AM為螢光鈣指示劑染料。

於洗滌緩衝液(1X HBSS/2.5 mM Probenicid/20 mM HEPES,pH 7.4)中製備候選化合物。

在檢定時，將培養基自孔中移除且使細胞負載100 μl之4 μM Fluo4－AM/2.5 mM Probenicid(Sigma,#P8761)/20 mM HEPES/完全培養基(pH 7.4)。在37℃/5% CO₂ 下，使培養進行60分鐘。

在培養1小時之後，移除Fluo4－AM培養緩衝液且以100 μl洗滌緩衝液將細胞洗滌2次。各孔中留下100 μl洗滌緩衝液。再次將培養盤置於37℃/5% CO₂ 下之恆溫箱中，歷經60分鐘。

使FLIPR(螢光成像板讀取儀，分子裝置)程序化以在第30秒鐘添加50 μl候選化合物且在另外150秒鐘內記錄由候選化合物引起之細胞內鈣濃度([Ca2＋])的短暫變化。使用FLIPR軟件，將總螢光變化數用於測定激動劑活性。該工具軟件使螢光讀取標準化以在零時產生等效最初讀數。

儘管前述內容提供使用穩定轉染細胞來測定激動劑活性之FLIPR檢定，普通技術者將易於修改該檢定以表徵激動劑活性。普通技術者亦將易於瞭解，另外可使用瞬時轉染細胞。

實例17

MAP激酶檢定 可對MAP激酶(經有絲分裂促進劑活化之激酶)進行監控以評估受體活性。可藉由數種方法來偵測MAP激酶。一種方法係基於對磷酸化狀態之評估，即非磷酸化(非活化)或磷酸化(活化)狀態。磷酸化蛋白質在SDS－PAGE中具有較緩慢之移動力且因此可使用西方墨點法與未受激之蛋白質相比。或者，可購得對磷酸化蛋白質具有特異性之抗體(New England Biolab)，其可用於偵測磷酸化激酶之增加。在任一方法中，以候選化合物來刺激細胞且接著以Laemmli緩衝液進行萃取。將可溶性溶離份應用於SDS－PAGE凝膠中且藉由電泳法將蛋白質轉移至硝基纖維素或Immobilin中。藉由標準西方墨點技術來偵測免疫反應帶。將可見訊號或化學發光訊號記錄於膠片上且可藉由光密度分析法對其進行量化。

另一種方法係基於藉由磷酸化檢定來評估MAP激酶活性。以候選化合物來刺激細胞且製成可溶性萃取物。在30℃下以γ－³ ² P－ATP、ATP再生系統及用於MAP激酶之特異性基質(諸如經胰島素調節之磷酸化熱穩定及酸穩定蛋白質或PHAS－I)將萃取物培養10分鐘。藉由添加H₃ PO₄ 使反應終止且將樣本轉移至冰上。將等分試樣塗於Whatman P81層析紙上，其保留磷酸化蛋白質。洗滌層析紙且以液體閃爍計數器對³ ² P計數。或者，由γ－³ ² P－ATP、ATP再生系統及藉由抗生蛋白鏈菌素與過濾器載體結合之生物素化髓磷脂鹼性蛋白質來培養細胞萃取物。髓磷脂鹼性蛋白質係用於活化MAP激酶之基質。使磷酸化反應在30℃下進行10分鐘。接著，經由過濾器吸出萃取物，磷酸化髓磷脂鹼性蛋白質殘留。洗滌過濾器且藉由液體閃爍計數器對³ ² P計數。

實例18

受體結合檢定 除本文所述之方法以外，另一種用於評估候選化合物之方法係藉由測定與GPR41受體結合之結合親和力來實現。此類型之檢定一般需要GPR41受體之放射性標記配位體。除使用GPR41受體之已知配位體及其放射性標記以外，可由放射性同位素來標記本文中所揭示之GPR41激動劑化合物且將其用於用以評估候選化合物與GPR41受體的親和力之檢定。

經放射性標記的諸如本文中所揭示之GPR41激動劑之GPR41化合物可用於用以鑑定/評估化合物之篩選檢定。概言之，可評估新近合成或鑑定之化合物(即候選化合物)用於減少放射性標記GPR41激動劑與GPR41受體的結合之能力。因此，與放射性標記GPR41激動劑競爭與GPR41受體結合之能力與候選化合物及GPR41受體之結合親和力直接相關。

用於測定GPR41之受體結合之檢定方法A.製備GPR41受體 舉例而言，HEK293細胞(人類腎臟，ATCC)可如本文所述由GPR41瞬時轉染或穩定轉染。舉例而言，可以10 μg人類GPR41受體及60 μl Liptofectamine(每個盤均為15 cm)瞬時轉染293細胞，且使該等細胞在更換培養基之盤中生長24小時(75%融合)。以每盤10 ml Hepes－EDTA緩衝液(20 mM Hepes＋10 mM EDTA,pH 7.4)來移除細胞。接著，在Beckman Coulter離心機中以17,000 rpm(JA－25.50轉子)使細胞離心20分鐘。隨後，使小球再懸浮於20 mM Hepes及1 mM EDTA(pH 7.4)中且以50 ml杜恩斯(Dounce)均質器使其均質化，並再次離心。在移除清液之後，將小球儲存於－80℃，直至用於結合檢定。當用於結合檢定時，使膜在冰上解凍20分鐘且接著添加10 ml培養緩衝液(20 mM Hepes、1 mM MgCl₂ 、100 mM NaCl,pH 7.4)。接著，攪拌該等膜以使膜小球粗產物再懸浮且用Brinkmann PT－3100 Polytron均質器以設定6使其均質化15秒鐘。使用BRL Bradford蛋白質檢定來測定膜蛋白質之濃度。

B.結合檢定 對於總結合性而言，將總體積為50 μl之適當稀釋膜(稀釋於含有50 mM Tris HCl(pH 7.4)、10 mM MgCl₂ 及1 mM EDTA之檢驗緩衝液中；5－50 μg蛋白質)添加至96孔聚丙烯微量滴定盤中，繼而添加100 μl檢定緩衝液及50 μl放射性標記GPR41激動劑。對於非特異性結合而言，在添加50 μl放射性標記GPR41激動劑之前，添加50 μl而非100 μl檢定緩衝液且額外添加50 μl之10 μM冷GPR41。接著，將培養盤在室溫下培養60－120分鐘。使檢定盤在具有Brandell 96孔培養盤收集器之微定量盤式裝置GF/C Unifilter過濾盤中進行過濾，繼而以含0.9% NaCl之50 mM冷Tris HCl(pH 7.4)洗滌之，藉此來終止該結合反應。接著，將過濾盤之底部密封，向各孔中添加50 μl Optiphase Supermix，將檢定盤之頂部密封，並以Trilux MicroBeta閃爍計數器對該等培養盤計數。為了進行化合物競爭性研究，將100 μl經適當稀釋之測試化合物添加至適當孔中，而非添加100 μl檢定緩衝液，繼而添加50 μl放射性標記GPR41激動劑。

C.計算 最初在1及0.1 μM濃度下且接著在所選濃度範圍內檢定該等候選化合物，以致中劑量將會引起放射性標記GPR41激動劑結合之約50%抑制作用(即IC₅ ₀ )。若不存在候選化合物(B_O )，則特異性結合係總結合(B_T )減去非特異性結合(NSB)之差值；且類似地，特異性結合(若存在候選化合物)(B)係位移結合(B_D )減去非特異性結合(NSB)之差值。由抑制作用反應曲線來測定IC₅ ₀ ，該曲線為% B/B_O 與候選化合物濃度之分對數－對數曲線。

由Cheng及Prustoff轉換方程來計算K_i ：K_i ＝IC₅ ₀ /(1＋[L]/K_D )，其中[L]為檢定中所用之放射性標記GPR41激動劑的濃度，且K_D 係在相同結合條件下獨立測定之放射性標記GPR41激動劑的解離常數。

實例19

齧齒動物糖尿病模型 已研究與肥胖症及胰島素抗性有關之2型糖尿病的齧齒動物模型。已研究諸如db/db及ob/ob[參看Diabetes(1982)31：1－6]小鼠及fa/fa zucker大鼠之遺傳模型，以瞭解疾病之病理學且測試候選性治療化合物[Diabetes(1983)32：830－838；Annu Rep Sankyo Res Lab(1994)46：1－57]。Jackson實驗室所研究之純合動物C57 BL/KsJ－db/db小鼠患有肥胖、高血糖、高胰島素症且具有胰島素抗性[J Clin Invest (1990)85：962－967]，而雜合體則瘦削且血糖量正常。在db/db模型中，小鼠隨著年齡增長逐漸發展成胰島素缺乏，當糖含量之控制不足時，其係通常在人類2型糖尿病晚期中所發現之特徵。由於此模型類似於人類2型糖尿病之模型，本發明化合物之活性測試包括(但不限於)降低血漿葡萄糖及甘油三酯。Zucker(fa/fa)大鼠嚴重肥胖、患有高胰島素症且具有胰島素抗性{Coleman,Diabetes(1982)31：1；E Shafrir in Diabetes Mellitus,H Rifkin and D Porte,Jr編輯[Elsevier Science Publishing Co,New York，第4版，(1990]，第299－340頁]}，且fa/fa突變可為鼠科db突變之大鼠等效物[Friedman等人，Cell(1992)69：217－220；Truett等人，Proc Natl Acad Sci USA(1991)88：7806]。Tubby(tub/tub)小鼠之特徵為肥胖、中等胰島素抗性及高胰島素血症，無顯著高血糖症[Coleman等人，Heredity(1990)81：424]。

本發明涵蓋GPR41調節劑之用途，其係用於減少上述齧齒動物糖尿病模型中的任何或所有模型、患有2型糖尿病或其它先前所述的較佳胰島素相關病症或脂質代謝病症之人類或基於其它哺乳動物的模型中之胰島素抗性及高血糖症。可測試血漿葡萄糖及胰島素含量與其它因子，該等因子包括(但不限於)血漿游離脂肪酸及甘油三酯。

GPR41調節劑用於抗高血糖活性之活體內檢定將基因改變之肥胖糖尿病小鼠(db/db)(雄性，7－9週齡)收養於22℃及50%相對濕度之標準實驗室條件下，且保持Purina齧齒動物食物之飲食及隨意飲水。在治療之前，自各動物之尾部靜脈收集血液且使用單觸式鹼性葡萄糖監控系統(Lifescan)來測定血糖濃度。使用血漿葡萄糖含量介於250至500 mg/dl之間的小鼠。各治療組係由所分配之七隻小鼠組成，以便在研究開始時使各組之平均葡萄糖含量相等。藉由微滲透泵對db/db小鼠給藥，與使用異氟烷麻醉相結合，以向小鼠皮下(s.c.)提供本發明之化合物、鹽水或無關化合物。其後，每隔一段時間自尾部靜脈血液抽取血液樣本且分析血糖濃度。使用Student t－測試來評估各組之間的顯著區別(將所關心之化合物與鹽水治療相對照)。

前述內容係以說明而非限制性方式來提供。已描述2型糖尿病之其它說明性齧齒動物模型[Moller DE,Nature(2001)414：821－7及其參照案；與Reed MJ等人，Diabetes,Obesity and Metabolism(1999)1：75－86及其參照案；各文獻之揭示內容均係以引用的方式全文併入本文中]。

實例20

小鼠動脈粥樣硬化模型 藉由剔除脂聯素基因所產生之脂聯素－不足小鼠已顯示出易患動脈粥樣硬化及胰島素抗性。該等小鼠亦為適用於缺血性心臟病之模型[Matsuda,M等人，J Biol Chem(2002)7月及其引用之參照案，其揭示內容均係以引用的方式全文併入本文中]。

將脂聯素基因剔除小鼠(7－9隻小鼠/籠)收養於22℃及50%相對濕度之標準實驗室條件下。藉由微滲透泵對該等小鼠給藥，與使用異氟烷麻醉相結合，以向小鼠皮下(s.c.)提供本發明之化合物、鹽水或無關化合物。以不同時間間隔來測定不同小組之犧牲小鼠的新生血管內膜增厚及缺血性心臟病。使用Student t－測試來評估各組之間的顯著區別(將所關心之化合物與鹽水治療相對照)。

前述動脈粥樣硬化小鼠模型係以說明而非限制性方式來提供。以另一實例說明之，載脂蛋白E－不足小鼠亦顯示出易患動脈粥樣硬化[Plump AS等人，Cell(1992)71：343－353；其揭示內容係以引用的方式全文併入本文中]。

另一可用模型為C57BL/6J小鼠之飲食誘發動脈粥樣硬化模型，該等小鼠係已知易於形成飲食誘發動脈粥樣硬化病變之近親品系。此模型為熟習此項技術者所知[Kamada N等人，J Atheroscler Thromb(2001)8：1－6；Garber DW等人，J Lipid Res(2001)42：545－52；Smith JD等人，J Intern Med(1997)242：99－109；各文獻之揭示內容均係以引用的方式全文併入本文中]。

實例21

HDL－膽固醇及動脈粥樣硬化之活體內豬模型 已證明所關心化合物作為醫學藥劑用於預防或治療總膽固醇/HDL－膽固醇高比率及與其相關病況之效用，例如該化合物在活體內豬模型中降低總膽固醇與HDL－膽固醇之比率的活性、增加HDL－膽固醇之活性或預防動脈粥樣硬化之活性。因為豬比其它動物模型更密切地反映人類生理學(尤其關於脂質血糖)，所以將其用作動物模型。

在50天中，以富含飽和脂肪酸且富含膽固醇(SFA－CHO)之飲食來餵養Yorkshire白化豬(體重25.5±4 kg)(每35公斤豬體重喂以1 kg食物)，該飲食包含補充有2%膽固醇及20%牛脂之標準食物[Royo T等人，European Journal of Clinical Investigation(2000)30：843－52]。飽和脂肪酸與不飽和脂肪酸之比率自普通豬食物之0.6變化至SFA－CHO飲食之1.12。將動物分成兩組，一組(n＝8)喂以SFA－CHO飲食且以安慰劑治療(每公斤施以3.0 mg)。在50天時期內，以標準食物來餵養對照組動物。在基線處收集血液樣本(在動物接收之後2天)，並在飲食開始之後50天時收集血液樣本。分析血脂。處死該等動物且對其進行屍體剖檢。

換言之，前述分析包含複數個組，各組係以不同劑量之所要化合物進行治療。例如，劑量包括每公斤0.1 mg、每公斤0.3 mg、每公斤1.0 mg、每公斤3.0 mg、每公斤10 mg、每公斤30 mg及每公斤100 mg。換言之，在複數個時間點進行前述分析，例如10週、20週、30週、40週及50週。

HDL－膽固醇 將血液收集於檸檬酸三鈉(3.8%,1：10)中。在離心之後獲得血漿(15分鐘，1200 g)且立即對其進行處理。使用自動分析器Kodak Ektachem DT系統(Eastman Kodak Company,Rochester,NY,USA)來量測總膽固醇、HDL－膽固醇及LDL－膽固醇。以製造商所提供之溶液來稀釋參數值高出範圍之樣本且接著再次進行分析。測定總膽固醇/HDL－膽固醇比率。在各組之間進行HDL－膽固醇含量對照。在各組之間進行總膽固醇/HDL－膽固醇比率對照。

將投用所要化合物時會增加HDL－膽固醇或減少總膽固醇/HDL－膽固醇比率視為具有上述效用之化合物的指示。

動脈粥樣硬化 將胸部及腹部主動脈完全移除，沿腹部表面縱向剖開，且在自胸部及腹部主動脈之標準部位切除樣本之後將其固定於中性緩衝之福爾馬林中以用於組織檢驗、脂質組合物及合成研究。在固定之後，將整個主動脈以蘇丹(Sudan)IV染色且將其釘平，由與計算機化影像分析系統(Image Pro Plus；Media Cybernetics,Silver Spring,MD)相連之TV攝影機來獲得數字影像以測定涉及動脈粥樣硬化病變之主動脈表面百分比[Gerrity RG等人，Diabetes(2001)50：1654－65；Cornhill JF等人，Arteriosclerosis,Thrombosis,and Vascular Biology(1985)5：415－26；其揭示內容係以引用的方式全文併入本文中]。在各組之間進行涉及動脈粥樣硬化病變之主動脈表面百分比對照。

將投用所要化合物時會減少涉及動脈粥樣硬化病變之主動脈表面百分比視為具有上述效用之化合物的指示。

血漿游離脂肪酸 顯而易見，熟習此項技術者易於修改前述活體內豬模型，以說明而非限制該化合物用於降低血漿游離脂肪酸之活性。

熟習此項技術者應瞭解，可對上文所述之說明性實例進行各種修正、補充、替換及變化而不悖離本發明之精神，且因此認為其係在本發明之範疇內。上文所引用之所有文獻包括(但不限於)印刷出版物及臨時與正規專利申請案，其均係以引用的方式全文併入本文中。

圖1展示人類GPR41在人類成熟組織及胎兒組織中表現的點漬墨法分析。

圖2展示小鼠GPR41在正常與突變小鼠之選定組織中表現的RT－PCR與TaqMan定量PCR分析。

圖3展示小鼠GPR41在小鼠細胞類型與組織中表現的RNase保護檢定分析。

圖4展示GPR41與G蛋白G－αi之偶合。

圖5展示GPR41與G蛋白G－αi 12/13之偶合。

圖6展示在Gq/Gi共轉染之293細胞中GPR41激動劑之功效。

圖7展示在MIN6胰島瘤細胞中GPR41激動劑抑制胰島素釋放。

圖8展示GPR41激動劑(化合物4)逆轉口服葡萄糖耐受測試(oGTT)降低化合物(B111)的有益效果。

<110> 美商艾尼納製藥公司<120> 用於治療胰島素相關病症之GPR41及其調節子<130> 94.US1.PRO <140> 094138487 <141> 2005－11－02 <150> 06/624,867 <151> 2004－11－03 <160> 15 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 1041 <212> DNA <213> 人類<400> 1 <210> 2 <211> 346 <212> PRT <213> 人類<400> 2 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> 人造<220> <223> 引子<400> 3<210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> 人造<220> <223> 引子<400> 4<210> 5 <211> 17 <212> DNA <213> 人造<220> <223> 引子<400> 5<210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> 人造<220> <223> 引子<400> 6<210> 7 <211> 17 <212> DNA <213> 人造<220> <223> 探針<400> 7<210> 8 <211> 257 <212> DNA <213> 人造<220> <223> 探針<400> 8<210> 9 <211> 18 <212> DNA <213> 人造<220> <223> 引子<400> 9<210> 10 <211> 18 <212> DNA <213> 人造<220> <223> 引子<400> 10<210> 11 <211> 6 <212> PRT <213> 人造<220> <223> 肽<400> 11<210> 12 <211> 5 <212> PRT <213> 人造<220> <223> 肽<400> 12<210> 13 <211> 5 <212> PRT <213> 人造<220> <223> 肽<400> 13<210> 14 <211> 36 <212> DNA <213> 人造<220> <223> 引子<400> 14<210> 15 <211> 53 <212> DNA <213> 人造<220> <223> 引子<400> 15

Claims

一種用於鑑定穩定血糖之化合物之方法，其包含：a)使候選化合物與GPR41接觸，及b)測定GPR41功能是否受到調節，其中GPR41功能之調節表示該候選化合物為穩定血糖之化合物，該GPR41具有如SEQ ID NO：2所示胺基酸序列，或其實質上保留具有如SEQ ID NO：2所示胺基酸序列之多肽之功能之變異體或同源物。
如請求項1之方法，其中該GPR41為人類的。
如請求項1之方法，其中該測定包含第二信息者檢定。
如請求項1之方法，其中該穩定血糖之化合物包含選自由下列各物組成之群的化合物：2-甲基-4-(4-硝基-苯基)-5-氧代-1,4,5,6,7,8-六氫-喹啉-3-羧酸鄰-甲苯醯胺、環丙基羧酸4-[1,2,3]噻二唑-4-基-苯酯；4-呋喃-3-基-2-甲基-5-氧代-1,4,5,6,7,8-六氫-喹啉-3-羧酸鄰-甲苯醯胺、4-呋喃-3-基-2-甲基-5-氧代-1,4,5,6,7,8-六氫-喹啉-3-羧酸(2,5-二氯-苯基)-醯胺、4-呋喃-2-基-2-甲基-5-氧代-1,4,5,6,7,8-六氫-喹啉-3-羧酸鄰-甲苯醯胺、4-呋喃-3-基-2-甲基-5-氧代-1,4,5,6,7,8-六氫-喹啉-3-羧酸(4-氯-苯基)-醯胺、2-甲基-4-(4-甲基硫基-苯基)-5-氧代-1,4,5,6,7,8-六氫-喹啉-3-羧酸鄰-甲苯醯胺、2-甲基-4-(3-硝基-苯基)-5-氧代-1,4,5,6,7,8-六氫-喹啉-3-羧酸鄰-甲苯醯胺、2-甲基-4-[5-(2-硝基-4-三氟甲基 -苯基)-呋喃-2-基]-5-氧代-1,4,5,6,7,8-六氫-喹啉-3-羧酸鄰-甲苯醯胺、4-(5-聯苯-2-基-呋喃-2-基)-2-甲基-5-氧代-1,4,5,6,7,8-六氫-喹啉-3-羧酸鄰-甲苯醯胺、2-甲基-4-[5-(2-硝基-苯基)-呋喃-2-基]-5-氧代-1,4,5,6,7,8-六氫-喹啉-3-羧酸(2-氯-苯基)-醯胺、2-甲基-5-氧代-4-(4-苯氧基-苯基)-1,4,5,6,7,8-六氫-喹啉-3-羧酸鄰-甲苯醯胺、2-甲基-5-氧代-4-[5-(2-三氟甲氧基-苯基)-呋喃-2-基]-1,4,5,6,7,8-六氫-喹啉-3-羧酸鄰-甲苯醯胺及4-[5-(2,5-二氯-苯基)-呋喃-2-基]-2-甲基-5-氧代-1,4,5,6,7,8-六氫-喹啉-3-羧酸鄰-甲苯醯胺，或其醫藥學上可接受的鹽。
一種根據請求項1之方法鑑定之穩定血糖之化合物，其中該穩定血糖之化合物包含選自由下列各物組成之群的化合物：2-甲基-4-(4-硝基-苯基)-5-氧代-1,4,5,6,7,8-六氫-喹啉-3-羧酸鄰-甲苯醯胺、環丙基羧酸4-[1,2,3]噻二唑-4-基-苯酯；4-呋喃-3-基-2-甲基-5-氧代-1,4,5,6,7,8-六氫-喹啉-3-羧酸鄰-甲苯醯胺、4-呋喃-3-基-2-甲基-5-氧代-1,4,5,6,7,8-六氫-喹啉-3-羧酸(2,5-二氯-苯基)-醯胺、4-呋喃-2-基-2-甲基-5-氧代-1,4,5,6,7,8-六氫-喹啉-3-羧酸鄰-甲苯醯胺、4-呋喃-3-基-2-甲基-5-氧代-1,4,5,6,7,8-六氫-喹啉-3-羧酸(4-氯-苯基)-醯胺、2-甲基-4-(4-甲基硫基-苯基)-5-氧代-1,4,5,6,7,8-六氫-喹啉-3-羧酸鄰-甲苯醯胺及2-甲基-4-(3-硝基-苯基)-5-氧代-1,4,5,6,7,8-六氫-喹啉-3-羧酸鄰-甲苯醯胺；或其醫藥學上可接受的鹽。
一種根據請求項1之方法鑑定之穩定血糖之化合物，其中該穩定血糖之化合物包含選自由下列各物組成之群的化合物：2-甲基-4-[5-(2-硝基-4-三氟甲基-苯基)-呋喃-2-基]-5-氧代-1,4,5,6,7,8-六氫-喹啉-3-羧酸鄰-甲苯醯胺、4-(5-聯苯-2-基-呋喃-2-基)-2-甲基-5-氧代-1,4,5,6,7,8-六氫-喹啉-3-羧酸鄰-甲苯醯胺、2-甲基-4-[5-(2-硝基-苯基)-呋喃-2-基]-5-氧代-1,4,5,6,7,8-六氫-喹啉-3-羧酸(2-氯-苯基)-醯胺、2-甲基-5-氧代-4-(4-苯氧基-苯基)-1,4,5,6,7,8-六氫-喹啉-3-羧酸鄰-甲苯醯胺、2-甲基-5-氧代-4-[5-(2-三氟甲氧基-苯基)-呋喃-2-基]-1,4,5,6,7,8-六氫-喹啉-3-羧酸鄰-甲苯醯胺及4-[5-(2,5-二氯-苯基)-呋喃-2-基]-2-甲基-5-氧代-1,4,5,6,7,8-六氫-喹啉-3-羧酸鄰-甲苯醯胺，或其醫藥學上可接受的鹽。
一種用於製備組合物之方法，其包含鑑定可穩定血糖之化合物且接著將該化合物與載劑混合，其中該化合物係由如請求項4之方法鑑定。
一種醫藥組合物，其包含如請求項5或6之化合物。
一種如請求項5或6之化合物於製造用於治療或預防個體之胰島素相關病症之醫藥品的用途。
如請求項9之用途，其中該胰島素相關病症為低血糖症、胰島素分泌或胰島素依賴性腫瘤、老化、胰島素抗性、葡萄糖耐受異常或糖尿病。
如請求項9之用途，其中該醫藥品係與用於治療糖尿病、血脂病症或肥胖症之藥劑組合投與至該個體。
如請求項9之用途，其中該個體為哺乳動物。
如請求項9之用途，其中該個體為人類。
一種用於製造醫藥品之方法，該醫藥品包含如請求項5或6之化合物作為穩定血糖之化合物。
一種用於鑑定穩定血糖之化合物之方法，其包含：a)使候選化合物與GPR41接觸，且b)測定GPR41功能是否降低，其中GPR41功能降低表示該候選化合物為穩定血糖之化合物，該GPR41具有如SEQ ID NO：2所示胺基酸序列，或其實質上保留具有如SEQ ID NO：2所示胺基酸序列之多肽之功能之變異體或同源物。
如請求項15之方法，其中該GPR41為人類的。
如請求項15之方法，其中該測定包含第二信息者檢定。
如請求項15之方法，其中該穩定血糖之化合物包含選自由下列各物組成之群的化合物：2-甲基-4-[5-(2-硝基-4-三氟甲基-苯基)-呋喃-2-基]-5-氧代-1,4,5,6,7,8-六氫-喹啉-3-羧酸鄰-甲苯醯胺、4-(5-聯苯-2-基-呋喃-2-基)-2-甲基-5-氧代-1,4,5,6,7,8-六氫-喹啉-3-羧酸鄰-甲苯醯胺、2-甲基-4-[5-(2-硝基-苯基)-呋喃-2-基]-5-氧代-1,4,5,6,7,8-六氫-喹啉-3-羧酸(2-氯-苯基)-醯胺、2-甲基-5-氧代-4-(4-苯氧基-苯基)-1,4,5,6,7,8-六氫-喹啉-3-羧酸鄰-甲苯醯胺、2-甲基-5-氧代-4-[5-(2-三氟甲氧基-苯基)-呋喃-2-基]-1,4,5,6,7,8-六氫-喹啉-3-羧酸鄰-甲苯醯胺及4-[5-(2,5-二氯-苯基)-呋喃-2-基]-2-甲基-5-氧代-1,4,5,6,7,8-六氫-喹啉-3-羧酸鄰-甲苯醯胺，或其醫藥學上可接受的鹽。
一種根據如請求項15之方法鑑定之穩定血糖之化合物，其中該穩定血糖之化合物包含選自由下列各物組成之群的化合物：2-甲基-4-[5-(2-硝基-4-三氟甲基-苯基)-呋喃-2-基]-5-氧代-1,4,5,6,7,8-六氫-喹啉-3-羧酸鄰-甲苯醯胺、4-(5-聯苯-2-基-呋喃-2-基)-2-甲基-5-氧代-1,4,5,6,7,8-六氫-喹啉-3-羧酸鄰-甲苯醯胺、2-甲基-4-[5-(2-硝基-苯基)-呋喃-2-基]-5-氧代-1,4,5,6,7,8-六氫-喹啉-3-羧酸(2-氯-苯基)-醯胺、2-甲基-5-氧代-4-(4-苯氧基-苯基)-1,4,5,6,7,8-六氫-喹啉-3-羧酸鄰-甲苯醯胺、2-甲基-5-氧代-4-[5-(2-三氟甲氧基-苯基)-呋喃-2-基]-1,4,5,6,7,8-六氫-喹啉-3-羧酸鄰-甲苯醯胺及4-[5-(2,5-二氯-苯基)-呋喃-2-基]-2-甲基-5-氧代-1,4,5,6,7,8-六氫-喹啉-3-羧酸鄰-甲苯醯胺，或其醫藥學上可接受的鹽。
一種用於製備組合物之方法，其包含鑑定可穩定血糖之化合物且接著將該化合物與載劑混合，其中該化合物係由如請求項18之方法鑑定。
一種醫藥組合物，其包含如請求項19之化合物。
一種如請求項19之組合物於製造用於治療或預防個體之胰島素相關病症之醫藥品的用途。
如請求項22之用途，其中該胰島素相關病症為胰島素抗性、葡萄糖耐受異常或糖尿病。
如請求項22之用途，其中該醫藥品係與用於治療糖尿病、血脂病症或肥胖症之藥劑組合投與至該個體。
一種用於降低GPR41功能之體外方法，其包含使GPR41與有效量之GPR41反向激動劑或拮抗劑接觸，其中該反向激動劑或拮抗劑包含選自由下列各物組成之群的化合物：2-甲基-4-[5-(2-硝基-4-三氟甲基-苯基)-呋喃-2-基]-5-氧代-1,4,5,6,7,8-六氫-喹啉-3-羧酸鄰-甲苯醯胺、4-(5-聯苯-2-基-呋喃-2-基)-2-甲基-5-氧代-1,4,5,6,7,8-六氫-喹啉-3-羧酸鄰-甲苯醯胺、2-甲基-4-[5-(2-硝基-苯基)-呋喃-2-基]-5-氧代-1,4,5,6,7,8-六氫-喹啉-3-羧酸(2-氯-苯基)-醯胺、2-甲基-5-氧代-4-(4-苯氧基-苯基)-1,4,5,6,7,8-六氫-喹啉-3-羧酸鄰-甲苯醯胺、2-甲基-5-氧代-4-[5-(2-三氟甲氧基-苯基)-呋喃-2-基]-1,4,5,6,7,8-六氫-喹啉-3-羧酸鄰-甲苯醯胺及4-[5-(2,5-二氯-苯基)-呋喃-2-基]-2-甲基-5-氧代-1,4,5,6,7,8-六氫-喹啉-3-羧酸鄰-甲苯醯胺，或其醫藥學上可接受的鹽。
一種GPR41反向激動劑或拮抗劑於製造用於降低個體之血糖含量之醫藥品的用途。
一種GPR41反向激動劑或拮抗劑於製造用於增加個體之胰島素分泌之醫藥品的用途。