JPWO2006115297A1 - Barlpを用いた化合物の評価方法及び摂食・体重制御物質 - Google Patents
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Abstract
本発明は、摂食又は体重を制御する化合物の評価方法であって、BARLP遺伝子を導入し、BARLPを発現する細胞を調製する工程と、該細胞に被検化合物を接触させる工程と、該BARLPに対する該被検化合物の特異的結合を検出する工程と、を含むことを特徴とする化合物の評価方法、及び、BARLP遺伝子が不活性化されている非ヒト遺伝子改変動物を用いて被検化合物の評価を行う工程をさらに含む化合物の評価方法を提供する。かかる発明により、BARLPと生体機能との関連について知見を得、BARLPを標的とした化合物の評価方法や当該評価によって得られたBARLPのリガンドを提供することが可能となる。
Description
本発明は、BARLP(以下、BARLP遺伝子は「BARLP遺伝子」又は単に「BARLP」と表し、BARLPタンパク質は「BARLPタンパク質」又は単に「BARLP」と表す。)を用いた化合物の評価方法に関する。また、本発明は、BARLPの発現制御作用を有する体重制御物質に関する。
生体内の機能を調節するホルモン、神経伝達物質又は生理活性物質の多くは、細胞膜上に存在するグアノシン三リン酸結合タンパク質(以下、「Gタンパク質」という)共役型レセプター(以下、GPCRという)を介して標的細胞にシグナルを伝達し、固有の機能を発揮する。かかるレセプターは、細胞膜を7回貫通するという共通の構造を有し、Gタンパク質共役型レセプタースーパーファミリーを形成している。
Gタンパク質共役型レセプターは、これまでにすでに数百種が単離されているが、そのリガンドが不明である、いわゆるオーファンレセプターも多く存在する。
このようなレセプターやリガンドが単離され、機能が解明されることにより、生体内で生じる生理機能を解明することが可能となるとともに、当該機能をコントロールすることができるアゴニスト又はアンタゴニストのスクリーニングが可能となり、医薬品の開発に貢献することが期待されている。
BARLP(Biogenic amine receptor−like protein:GPR61ともいう)は、Leeら(非特許文献1)とCikosら(非特許文献2)によってクローニングされたGPCRである。ヒトBARLP遺伝子はオープンリーディングフレームが1353bpで451アミノ酸をコードする(Accession No.AF258342)。また、BARLPは、主に脳に発現しており、中でも大脳皮質(cerebral cortex)、後頭極(occipital pole)、前頭葉(frontal lobe)、側頭葉(temporal lobe)、扁桃体(amygdala)及び海馬(hippocampus)等に強く発現している。一方、被殼(putamen)、尾状核(caudate nucleus)等でも発現が認められ、脊髄(spinal cord)、脳梁(corpus callosum)等では発現が認められない。
また、BARLPは、脳で機能する種々の生体アミン受容体(例えば、セロトニン、ヒスタミン、アドレナリン及びドーパミンの各受容体)と、アミノ酸レベルで28〜31%と高い相同性を示す。
これらの知見より、BARLPは、知覚、認知、記憶あるいは精神機能に代表される高次脳機能調節に関与する分子の一つであると考えられる。
Molec.Brain Res.第86巻、13−22頁、2001年 Biochem.Biophys.Acta 第1521巻、66−72頁、2001年
Gタンパク質共役型レセプターは、これまでにすでに数百種が単離されているが、そのリガンドが不明である、いわゆるオーファンレセプターも多く存在する。
このようなレセプターやリガンドが単離され、機能が解明されることにより、生体内で生じる生理機能を解明することが可能となるとともに、当該機能をコントロールすることができるアゴニスト又はアンタゴニストのスクリーニングが可能となり、医薬品の開発に貢献することが期待されている。
BARLP(Biogenic amine receptor−like protein:GPR61ともいう)は、Leeら(非特許文献1)とCikosら(非特許文献2)によってクローニングされたGPCRである。ヒトBARLP遺伝子はオープンリーディングフレームが1353bpで451アミノ酸をコードする(Accession No.AF258342)。また、BARLPは、主に脳に発現しており、中でも大脳皮質(cerebral cortex)、後頭極(occipital pole)、前頭葉(frontal lobe)、側頭葉(temporal lobe)、扁桃体(amygdala)及び海馬(hippocampus)等に強く発現している。一方、被殼(putamen)、尾状核(caudate nucleus)等でも発現が認められ、脊髄(spinal cord)、脳梁(corpus callosum)等では発現が認められない。
また、BARLPは、脳で機能する種々の生体アミン受容体(例えば、セロトニン、ヒスタミン、アドレナリン及びドーパミンの各受容体)と、アミノ酸レベルで28〜31%と高い相同性を示す。
これらの知見より、BARLPは、知覚、認知、記憶あるいは精神機能に代表される高次脳機能調節に関与する分子の一つであると考えられる。
Molec.Brain Res.第86巻、13−22頁、2001年 Biochem.Biophys.Acta 第1521巻、66−72頁、2001年
しかしながら、BARLPと直接、特定脳機能との関連を示す報告はないのが現状であった。
本発明は、上記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、BARLPと特定脳機能を含む生体機能との関連について知見を得、BARLPを標的とした化合物の評価方法や当該評価によって得られたBARLPのリガンドを提供することを目的とする。
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、BARLPの発現量と体重又は摂食量との間に一定の関係があることを見出し、この関係に基づいてBARLPを標的とする化合物の評価が可能となることを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明の化合物の評価方法は、摂食又は体重を制御する化合物の評価方法であって、BARLP遺伝子を導入し、BARLPを発現する細胞を調製する工程と、当該細胞に被検化合物を接触させる工程と、当該BARLPに対する該被検化合物の特異的結合を検出する工程と、を含むことを特徴とする。
また、本発明の化合物の評価方法は、摂食又は体重を制御する化合物の評価方法であって、BARLP遺伝子を導入し、BARLPを発現する細胞を調製する工程と、当該細胞に被検化合物を接触させる工程と、当該接触により生じた細胞内情報伝達物質の活性を測定する工程と、当該活性と被検化合物を接触させない場合の該細胞内情報伝達物質の活性とを比較する工程と、を含むことを特徴とする。
さらに、本発明の化合物の評価方法は、摂食又は体重を制御する化合物の評価方法であって、BARLP遺伝子を導入し、BARLPを発現する細胞を調製する工程と、当該細胞に被検化合物を接触させる工程と、当該BARLP又はBARLPを介した細胞内情報伝達物質の発現レベルを測定する工程と、被検化合物を接触させていない場合と比較して、該BARLPの発現レベルを増加又は減少させた被検化合物を選択する工程と、を含むことを特徴とする。
さらに、本発明の化合物の評価方法は、BARLP遺伝子が不活性化されている非ヒト遺伝子改変動物を用いて被検化合物の評価を行う工程をさらに含むことを特徴とする。かかる工程を経ることにより、生体内における被検化合物の挙動を併せて評価することが可能となり、より効果的な化合物の評価が可能となる。
また、本発明の化合物の評価方法は、摂食又は体重を制御する化合物の評価方法であって、BARLP遺伝子が不活性化されている非ヒト遺伝子改変動物に被検化合物を投与する工程と、当該投与により生じた当該ヒト遺伝子改変動物の表現系の変化を検出し、正常動物の表現系との相違を比較する工程と、を含むことを特徴とする。
また、本発明の化合物の評価方法は、摂食又は体重を制御する化合物の評価方法であって、被検化合物を、BARLPに接触させる工程と、当該接触によるBARLPの活性の変化を検出する工程と、を含むことを特徴とする。
以上述べたような化合物の評価方法により、BARLPに結合する化合物(例えば、アゴニスト又はアンタゴニスト)の評価が可能となり、被検化合物の活性測定や所望の活性を有する化合物のスクリーニングが可能となる。
さらに、本発明のリガンドは、上記のいずれかの化合物の評価方法により単離されたことを特徴とする。かかるリガンドにより、摂食又は体重を制御することが可能となり、摂食や体重制御に関与する疾患の予防又は治療に有効な薬剤を提供することが可能となる。
また、本発明の摂食又は体重制御物質は、BARLPの機能制御作用を有することを特徴とする。かかる体重制御物質により、摂食又は体重を制御することが可能となり、摂食や体重制御に関与する疾患の予防又は治療に有効な薬剤を提供することが可能となる。
すなわち、本発明によれば、BARLPの発現量と体重又は摂食量との間に一定の関係があり、当該関係に基づき、BARLPを標的とした化合物の評価をすることが可能となる。また、当該評価によって得られたBARLPのリガンド(例えば、体重を制御する物質)を提供することが可能となる。
本発明は、上記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、BARLPと特定脳機能を含む生体機能との関連について知見を得、BARLPを標的とした化合物の評価方法や当該評価によって得られたBARLPのリガンドを提供することを目的とする。
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、BARLPの発現量と体重又は摂食量との間に一定の関係があることを見出し、この関係に基づいてBARLPを標的とする化合物の評価が可能となることを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明の化合物の評価方法は、摂食又は体重を制御する化合物の評価方法であって、BARLP遺伝子を導入し、BARLPを発現する細胞を調製する工程と、当該細胞に被検化合物を接触させる工程と、当該BARLPに対する該被検化合物の特異的結合を検出する工程と、を含むことを特徴とする。
また、本発明の化合物の評価方法は、摂食又は体重を制御する化合物の評価方法であって、BARLP遺伝子を導入し、BARLPを発現する細胞を調製する工程と、当該細胞に被検化合物を接触させる工程と、当該接触により生じた細胞内情報伝達物質の活性を測定する工程と、当該活性と被検化合物を接触させない場合の該細胞内情報伝達物質の活性とを比較する工程と、を含むことを特徴とする。
さらに、本発明の化合物の評価方法は、摂食又は体重を制御する化合物の評価方法であって、BARLP遺伝子を導入し、BARLPを発現する細胞を調製する工程と、当該細胞に被検化合物を接触させる工程と、当該BARLP又はBARLPを介した細胞内情報伝達物質の発現レベルを測定する工程と、被検化合物を接触させていない場合と比較して、該BARLPの発現レベルを増加又は減少させた被検化合物を選択する工程と、を含むことを特徴とする。
さらに、本発明の化合物の評価方法は、BARLP遺伝子が不活性化されている非ヒト遺伝子改変動物を用いて被検化合物の評価を行う工程をさらに含むことを特徴とする。かかる工程を経ることにより、生体内における被検化合物の挙動を併せて評価することが可能となり、より効果的な化合物の評価が可能となる。
また、本発明の化合物の評価方法は、摂食又は体重を制御する化合物の評価方法であって、BARLP遺伝子が不活性化されている非ヒト遺伝子改変動物に被検化合物を投与する工程と、当該投与により生じた当該ヒト遺伝子改変動物の表現系の変化を検出し、正常動物の表現系との相違を比較する工程と、を含むことを特徴とする。
また、本発明の化合物の評価方法は、摂食又は体重を制御する化合物の評価方法であって、被検化合物を、BARLPに接触させる工程と、当該接触によるBARLPの活性の変化を検出する工程と、を含むことを特徴とする。
以上述べたような化合物の評価方法により、BARLPに結合する化合物(例えば、アゴニスト又はアンタゴニスト)の評価が可能となり、被検化合物の活性測定や所望の活性を有する化合物のスクリーニングが可能となる。
さらに、本発明のリガンドは、上記のいずれかの化合物の評価方法により単離されたことを特徴とする。かかるリガンドにより、摂食又は体重を制御することが可能となり、摂食や体重制御に関与する疾患の予防又は治療に有効な薬剤を提供することが可能となる。
また、本発明の摂食又は体重制御物質は、BARLPの機能制御作用を有することを特徴とする。かかる体重制御物質により、摂食又は体重を制御することが可能となり、摂食や体重制御に関与する疾患の予防又は治療に有効な薬剤を提供することが可能となる。
すなわち、本発明によれば、BARLPの発現量と体重又は摂食量との間に一定の関係があり、当該関係に基づき、BARLPを標的とした化合物の評価をすることが可能となる。また、当該評価によって得られたBARLPのリガンド(例えば、体重を制御する物質)を提供することが可能となる。
図1は、BARLP(−/−)とWTマウスにおける体重の変化を示す図である。
図2は、8〜11週齢のBARLP(−/−)とWTマウスの摂食量を比較した図である。
図3は、12〜15週齢のBARLP(−/−)とWTマウスの摂食量を比較した図である。
図4は、16〜19週齢のBARLP(−/−)とWTマウスの摂食量を比較した図である。
図5は、20〜23週齢のBARLP(−/−)とWTマウスの摂食量を比較した図である。
図6は、BARLP(−/−)とWTマウスとの自発運動量の変化を示す図である。
図7は、17週齢のBARLP(−/−)とWTマウスの直腸温を比較した図である。
図8は、19週齢のBARLP(−/−)とWTマウスの直腸温を比較した図である。
図2は、8〜11週齢のBARLP(−/−)とWTマウスの摂食量を比較した図である。
図3は、12〜15週齢のBARLP(−/−)とWTマウスの摂食量を比較した図である。
図4は、16〜19週齢のBARLP(−/−)とWTマウスの摂食量を比較した図である。
図5は、20〜23週齢のBARLP(−/−)とWTマウスの摂食量を比較した図である。
図6は、BARLP(−/−)とWTマウスとの自発運動量の変化を示す図である。
図7は、17週齢のBARLP(−/−)とWTマウスの直腸温を比較した図である。
図8は、19週齢のBARLP(−/−)とWTマウスの直腸温を比較した図である。
以下、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。
本発明における「BARLP遺伝子」は、由来となる生物種は特に限定されず、例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、イヌ又はウサギが挙げられる。中でも、評価される化合物の投与対象がヒトであることから、ヒトBARLP遺伝子であることが好ましい。
また、本発明に係るBARLP遺伝子には、BARLPと同等の生理機能を有し、GPCRとして機能するタンパク質をコードするものであれば1又は2以上の塩基の置換、欠失、付加又は挿入がある遺伝子も含まれる。ここで、当該遺伝子としては、かかるタンパク質をコードする遺伝子であればその配列は特に制限されないが、相同性が50%以上であることが好ましく、70%以上であることがより好ましく、80%以上であることがさらに好ましく、90%以上(例えば、91、92、93、94、95、96、97、98、99%以上)であることが特に好ましい。
また、本発明に係るBARLP遺伝子には、BARLP遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸も含まれる。ここで、「ストリンジェントな条件でハイブリダイズする」とは、二つの核酸断片が、Molecular Cloning:A Laboratory Manual、第2版、コールドスプリングハーバー(1989)、9.47−9.62及び11.45−11.61に記載されたハイブリダイゼーション条件下で、相互にハイブリダイズすることを意味する。より具体的には、例えば、約45℃にて6.0×SSCでハイブリダイゼーションを行った後に、50℃にて2.0xSSCで洗浄する条件が挙げられる。ストリンジェンシー選択のため、洗浄工程における塩濃度を、例えば低ストリンジェンシーとしての約2.0xSSC、50℃から、高ストリンジェンシーとしての約0.2×SSC、50℃まで選択することができる。さらに、洗浄工程の温度を低ストリンジェンシー条件の室温、約22℃から、高ストリンジェンシー条件の約65℃まで上昇させることができる。
上述したように、BARLPは中枢神経系において知覚、認知、記憶あるいは精神機能に代表される高次脳機能調節に関わる分子と推定されていたが、本発明者らは、BARLPが体重及び摂食量の制御に関与していることを見出した。すなわち、BARLPを欠損した非ヒト哺乳動物において、運動量や体温の変化がないにもかかわらず体重と摂食量の増加が観察された。これは、BARLPの発現量又は機能を制御する物質(例えば、アゴニスト、アンタゴニスト等)により体重及び摂食の制御が可能となることを意味している。
(1)化合物の評価
BARLP遺伝子又はタンパク質を用いて、BARLPに作用する化合物の評価をすることができる。BARLPに対する作用を検出する方法として、被検化合物の当該受容体に対する特異的結合を検出する方法、被検化合物の接触によって変化した遺伝子の発現量を検出する方法、及び、当該接触によって生じたBARLPを介した細胞内情報伝達の活性を検出する方法が挙げられる。以下、順に説明する。
先ず、被検化合物の当該受容体に対する特異的結合を検出することにより、被検化合物を評価する方法について説明する。
本発明の化合物の評価方法は、BARLP遺伝子を導入し、BARLPを発現する細胞を調製する工程と、当該細胞に被検化合物を接触させる工程と、当該BARLPに対する当該被検化合物の特異的結合を検出する工程と、を含むことを特徴とする。
また、本発明の第2の化合物の評価方法は、BARLP遺伝子を導入し、BARLPを発現する細胞を調製する工程と、当該細胞に被検化合物を接触させる工程と、当該接触により生じた細胞内情報伝達物質の活性を測定する工程と、当該活性と被検化合物を接触させない場合の該細胞内情報伝達物質の活性とを比較する工程と、を含むことを特徴とする。
被検化合物としては、特に制限はなく、例えば、天然化合物、有機化合物、無機化合物、タンパク質、ペプチド等の単一化合物、並びに、化合物ライブラリー、遺伝子ライブラリーの発現産物、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物、原核細胞抽出物、真核単細胞抽出物若しくは動物細胞抽出物等を挙げることができる。上記被験試料は必要に応じて適宜標識して用いることができる。標識としては、例えば、放射標識、蛍光標識等を挙げることができる。また、上記被験試料に加えて、これらの被験試料を複数種混合した混合物も含まれる。
また、BARLP遺伝子を発現する細胞は、当業者が公知の方法で調製すればよく、具体的な方法としては特に制限はないが、例えば以下の方法によることができる。すなわち、BARLP遺伝子又はその一部からなる核酸を好適なプロモーター及び転写調節エレメントを含む発現ベクターにクローニングし、クローニングされた核酸を有するベクターを宿主細胞に導入することにより調製する。ここで、前記ベクターとしては、発現ベクターとして利用可能なものであれば特に限定されないが、例えば、pCMV−Tag、pcDNA3.1、pBlueBacHis2、pCI−neo、pcDNAI、pMC1neo、pXT1、pSG5、pEF1/V5−HisB、pCR2.1、pET11、λgt11又はpCR3.1が挙げられる。
次に、BARLP遺伝子又はその一部からなる核酸が導入された発現ベクターを宿主細胞に導入する。かかる宿主細胞としては、遺伝子の発現に通常使用されるものであれば特に限定されず、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、微生物のいずれであってもよく、具体的には、例えば、COS1、COS7、CHO、NIH/3T3、293、Raji、CV11、C1271、MRC−5、CPAE、HeLa、293T又はSf9が挙げられる。また、発現ベクターを宿主細胞に導入する方法としては、公知の方法であれば特に限定されないが、具体的には、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム法、DEAE−デキストラン法、リポフェクション法又は遺伝子銃が挙げられる。
次に、このようにして調製したBARLPを発現する細胞に被検化合物を接触させる。接触させる方法としては特に制限はなく、例えば、BARLPが精製された状態であれば、精製標品に被験試料を添加することにより行うことができる。また、細胞内(細胞膜上を含む)に発現した状態又は細胞抽出液内に発現した状態であれば、それぞれ、細胞の培養液または当該細胞抽出液に被験試料を添加することにより行うことができる。被験試料がタンパク質の場合には、例えば、当該タンパク質をコードするDNAを含むベクターを、BARLPが発現している細胞へ導入する、または当該ベクターをBARLPが発現している細胞抽出液に添加することで行うことも可能である。
細胞表面に発現した受容体と被検化合物との結合は、例えば、結合した化合物に付された標識による検出(例えば、結合量を放射活性や蛍光強度による検出)のほか、被検化合物の細胞表面上の前記受容体への結合によって生じた細胞内へのシグナル伝達(例えば、Gタンパク質の活性化、Ca2+、またはcAMPの濃度変化(FLIPR(Fluorometric Imaging Plate Reader)等が使用できる)、ホスホリパーゼCの活性化、pHの変化、受容体のインターナリゼーション)を指標に検出することができる。また、前記シグナル伝達によって生じたシグナル伝達上の分子(BARLPも含む)の発現レベルや活性を指標にすることもできる。ここで、当該発現レベルを指標とする場合、発現レベルの測定法は特に制限されないが、例えば、ノーザンブロッティング、ウェスタンブロッティング又はDNAチップが挙げられる。ここで、本発明における「発現レベル」とは、BARLPを介した情報伝達経路上に存在するタンパク質をコードする遺伝子の転写産物の絶対量又は相対量をいう。この場合、当該遺伝子にはDNA又はmRNAのいずれもが含まれる。また、発現の検出対象がタンパク質の場合、その「発現レベル」とは、BARLPを介した情報伝達経路上に存在するタンパク質の翻訳産物の絶対量又は相対量をいう。また、シグナル伝達上の分子の活性を指標にする場合、活性測定方法は特に制限されず、測定の対象となる分子の種類によって好適な方法を選択すればよい。
一方、単離されたBARLPタンパク質を化合物の評価に直接使用することもできる。すなわち、被検化合物をBARLPに接触させ、次に、接触によって生じたBARLPタンパク質の活性の変化を検出する方法である。
かかる接触の方法としては特に制限はなく、具体的には、例えば、緩衝液(リン酸緩衝液等)等の溶液中で混合することにより接触させる方法や、BARLPタンパク質をメンブレン上に固定し、メンブレン上で被検化合物と接触させる方法が挙げられる。
次に、接触によって生じたBARLPの活性の変化を検出する。
タンパク質の活性測定方法としては、使用するタンパク質の性質により適宜設定すればよく、具体的には、例えば、BARLPに対するリガンドの結合活性を指標にする方法が挙げられる。
前記のリガンドの結合活性を指標にする方法としては特に制限はないが、具体的には、例えば、BARLPが固定されたメンブレンに対する被検化合物の親和性を測定することによって結合活性を測定する方法が挙げられる。ここで用いられる被検化合物は、検出が容易なように放射性同位体等で標識されていてもよい。また、前記結合活性の検出方法として、放射性同位体で標識したリガンドと競合してBARLPへ結合する化合物を検出する方法も挙げられ、かかる方法を用いた場合には、被検化合物の標識は不要である。
以上のように、本発明の化合物の評価方法により化合物を検出した結果、被検化合物の存在下における結合活性が、被検化合物の非存在下における結合活性(対照)より低い値を示した場合には、当該被検化合物は、本発明に係るBARLPとリガンドとの結合を阻害する活性を有すると判定される。このような化合物は、前記受容体に結合して細胞内へのシグナル伝達を誘導する活性を有する化合物(アゴニスト)及び当該活性を有しない化合物(アンタゴニスト)等が含まれる。アゴニストは、前記受容体に対するリガンド及びそのアナログと同様の生理活性を有しており、一方、アンタゴニストは、前記受容体に対するリガンド及びそのアナログが有する生理活性を抑制する。このため、これらアゴニストやアンタゴニストは、本発明に係るBARLPを介したシグナル伝達系の異常などに起因する疾患の治療などのための医薬組成物として有用である。
また、本発明の化合物の評価方法により、BARLPへの被検化合物結合後の細胞内シグナル伝達を促進又は阻害する物質のスクリーニングを行うことができる。すなわち、上述した方法によって複数の被検化合物を評価することにより、アゴニスト又はアンタゴニストとして機能する化合物を選択することができる。かかる選択の結果、被検化合物非存在下においてリガンド及びそのアナログを作用させた場合の細胞内シグナル伝達の変化と比較して、その変化が抑制されれば、当該被検化合物は、BARLPへの被検化合物結合後の細胞内シグナル伝達を阻害する化合物であると判定される。逆に、被検化合物が細胞内シグナル伝達を増強させれば、当該化合物は、BARLPへの被検化合物結合後の細胞内シグナル伝達を促進する化合物であると判定される。このようなスクリーニング方法によって選択された化合物は、摂食、体重の制御に基づく肥満又は痩せの抑制に有効であり、かかる病態の予防又は治療に有用である。
また、本発明の化合物の評価方法においては、上述した評価方法に加え、BARLP遺伝子が不活性化されている非ヒト遺伝子改変動物を用いて被検化合物の評価を行う工程をさらに含んでいてもよい。
ここで、「BARLP遺伝子が不活性化されている」とは、通常、BARLP遺伝子の遺伝子対の一方又は双方に、ヌクレオチドの挿入、欠失、置換等の遺伝子変異を有することにより当該遺伝子の発現が抑制されている状態を指す。正常なBARLPタンパク質としての機能が減少または喪失している変異BARLPタンパク質が発現している場合も、この「BARLP遺伝子の発現の抑制」に含まれる。上記「抑制」には、BARLP遺伝子の発現が完全に抑制されている場合のほか、当該遺伝子の遺伝子対の一方の遺伝子の発現のみが抑制されている場合も含まれる。本発明においては、BARLP遺伝子の発現が特異的に抑制されていることが好ましい。また、遺伝子変異の存在する部位は、当該遺伝子の発現が抑制されるような部位であれば特に制限されず、例えばエクソン部位、プロモーター部位等を挙げることができる。
本発明においてBARLP遺伝子の改変の対象となる動物は、通常、ヒト以外の哺乳動物であり、好ましくはマウス、ラット、ハムスター、ウサギ等のげっ歯類であり、その中でも特にマウスが好ましい。本発明においてBARLP遺伝子の改変の対象となるES細胞もまた、げっ歯類に由来するものが好ましく、特にマウス由来が好ましい。なお、一般的に称される「ノックアウト動物」も本発明の遺伝子改変動物に含まれる。
本発明の非ヒト遺伝子改変動物及び遺伝子改変ES細胞において、BARLP遺伝子の発現を人為的に抑制する手段としては、BARLP遺伝子全体又はその一部を欠損させる方法や、BARLP遺伝子の発現制御領域の全部またはその一部を欠損させる方法等を例示することができるが、好ましくはBARLP遺伝子の遺伝子対の一方または双方に外来遺伝子を挿入することによりBARLP遺伝子を不活性化する方法である。即ち、本発明の好ましい態様において、遺伝子改変動物及び遺伝子改変ES細胞は、BARLP遺伝子の遺伝子対の一方または双方に外来遺伝子が挿入されていることを特徴とする。
本発明の遺伝子改変動物は、当業者においては一般的に公知の遺伝子工学技術により作製することができる。例えば、以下のようにして遺伝子改変マウスを作製することができる。まず、マウスからBARLP遺伝子のエクソン部分を含むDNAを単離し、このDNA断片に適当なマーカー遺伝子を挿入し、ターゲッティングベクターを構築する。このターゲッティングベクターをエレクトロポレーション法などによりマウスのES細胞株に導入し、相同組み換えを生じた細胞株を選抜する。挿入するマーカー遺伝子としては、ネオマイシン耐性遺伝子などの抗生物質耐性遺伝子が好ましい。抗生物質耐性遺伝子を挿入した場合には、抗生物質を含む培地で培養するだけで相同組み換えを生じた細胞株を選抜することができる。また、より効率的な選抜を行うためには、ターゲッティングベクターにチミジンキナーゼ遺伝子などを結合させておくことも可能である。これにより、非相同組み換えを起こした細胞株を排除することができる。また、PCRおよびサザンブロットにより相同組み換え体の検定を行い、BARLP遺伝子の遺伝子対の一方が不活性化された細胞株を効率よく得ることもできる。
相同組み換えを生じた細胞株を選抜する場合、相同組み換え箇所以外にも、遺伝子挿入による未知の遺伝子破壊の恐れがあることから、複数のクローンを用いてキメラ作製を行うことが好ましい。得られたES細胞株をマウス胚盤葉にインジェクションしキメラマウスを得ることができる。このキメラマウスを交配させることで、BARLP遺伝子の遺伝子対の一方を不活性化したマウスを得ることができる。さらに、このマウスを交配させることで、BARLP遺伝子の遺伝子対の双方を不活性化したマウスを取得することができる。マウス以外のES細胞が樹立された動物においても、同様の手法により、遺伝子改変を行うことができる。
次に、こうして作製された非ヒト遺伝子改変動物に被検化合物を投与する。遺伝子改変動物への被験化合物の投与は、経口的または非経口的に行うことができる。
次に、当該非ヒト遺伝子改変動物における摂食量又は体重を測定する。摂食量及び体重の測定は当業者に公知の方法で行うことができる。
最後に、被検化合物を投与していない非ヒト遺伝子改変動物と比較して、表現系の相違を比較する。具体的には、例えば、インビトロの評価系(上述の化合物の評価方法)によって評価された被検化合物を非ヒト遺伝子改変動物及び野生型のそれぞれに投与し(対照として投与しない群を設定してもよい)、野生型では摂食や体重を制御する作用が見られるが、非ヒト遺伝子改変動物では見られないような化合物を選択することにより、当該被検化合物がBARLPに特異的に作用していることを確認することができる。こうして選択された化合物は、摂食又は体重を制御する化合物であり、疾患の治療又は予防のための薬剤として有用であると考えられる。
また、本発明の化合物の評価方法において、上述した非ヒト遺伝子改変動物を用いた被検化合物の評価を行う工程をさらに含むことにより、より人体に近い環境下でBARLPを標的とした化合物の評価を行うことが可能となる。すなわち、インビトロの試験では知り得ない被検化合物の薬効や副作用を観察することが可能となり、より効率的な化合物の評価が可能となる。
また、本発明の化合物の評価方法の別の態様として、BARLP遺伝子が不活性化されている非ヒト遺伝子改変動物に被検化合物を投与する工程と、当該投与により生じた該ヒト遺伝子改変動物の表現系の変化を検出し、正常動物の表現系との相違を比較する工程と、を含むことを特長とする。
BARLP遺伝子が不活性化されている非ヒト遺伝子改変動物としては、前記で説明したのと同じ遺伝子改変動物を使用することができる。
BARLP遺伝子が不活性化されている非ヒト遺伝子改変動物に被検化合物を投与する方法としては、経口的又は非経口的な投与が挙げられる。
次に、当該非ヒト遺伝子改変動物における表現系(例えば、摂食量又は体重)を検討する。摂食量及び体重の測定は当業者に公知の方法で行うことができる。
最後に、被検化合物を投与していない非ヒト遺伝子改変動物と比較して、表現系の相違を比較する。具体的には、例えば、インビトロの評価系(上述の化合物の評価方法)によって評価された被検化合物を非ヒト遺伝子改変動物及び野生型のそれぞれに投与し(対照として投与しない群を設定してもよい)、野生型では摂食や体重を制御する作用が見られるが、非ヒト遺伝子改変動物では見られないような化合物を選択することにより、当該被検化合物がBARLPに特異的に作用していることを確認することができる。こうして選択された化合物は、摂食又は体重を制御する化合物であり、疾患の治療又は予防のための薬剤として有用であると考えられる。
また、上述した本発明の化合物の評価方法により、PET(positron emission tomography)に用いるリガンドの評価を行うことができる。PETは、水、酸素、ブドウ糖、アミノ酸といった生体内に存在する物質あるいは目的とする受容体に対するリガンドを放射線標識して体内に投与することにより、非侵襲的に生体機能を観察する方法であり、研究や臨床において利用されている。PETの特徴は、トレーサーとして用いるリガンドに依存した機能特異的なイメージングを可能にする点にあり、新たなトレーサーの開発は未知の生体機能の解明や疾患の診断に不可欠である。本発明の化合物の評価方法によれば、被検化合物としてPETリガンド候補物質を適用することにより、当該物質のインビトロでの評価を行うことが可能となる。
(2)摂食又は体重制御物質
次に、本発明の摂食又は体重制御物質について説明する。
本発明の摂食又は体重制御物質は、BARLPの機能制御作用を有することを特徴とする。ここで、「BARLPの機能制御作用」は、BARLPの機能を制御する作用であればその原因となる生理学的根拠は特に制限されず、例えば、BARLPの発現を抑制及び亢進することによって生じる機能異常が挙げられる。また、「BARLPの機能制御作用」には、BARLPの機能を抑制する場合と亢進する場合のいずれをも含む。
本発明の知見より、BARLPを発現していないマウスでは摂食量の亢進と体重の増加が観察される。すなわち、BARLPの発現又は機能を抑制する物質は体重の増加に寄与することから、痩せや摂食障害を伴う疾患(例えば、拒食症、神経性食欲不振症、摂食障害、食欲不振症又は無食欲)の予防又は治療薬として有効である。一方、BARLPの発現又は機能を増強する物質は体重の減少に寄与することから、肥満又は肥満を伴う疾患(例えば、肥満症、糖尿病、ホルモン分泌異常、痛風、脂肪肝、高コレステロール血症、高脂血症、動脈硬化又は緑内障)の予防又は治療薬として有効である。
BARLPの発現を抑制又は増強する物質としては特に制限はなく、例えば、天然化合物、有機化合物、無機化合物、タンパク質、ペプチド等の単一化合物、BARLPの抗体、アンチセンス、RNAi又はリボザイムが挙げられる。
本発明の摂食又は体重制御物質(上述した、本発明の化合物の評価方法により選択された化合物を含む)をヒトや他の動物の医薬として使用する場合には、これらの物質自体を直接患者に投与する以外に、公知の製剤学的方法により製剤化して投与を行うことも可能である。例えば、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤として経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、又は懸濁液剤の注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、薬理学上許容される担体若しくは媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤等と適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化することが考えられる。
錠剤、カプセル剤に混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガントガム、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸のような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖又はサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油又はチェリーのような香味剤が用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、上記の材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用蒸留水のようなベヒクルを用いて通常の製剤実施に従って処方することができる。
注射用の水溶液としては、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、例えばD−ソルビトール、D−マンノース、D−マンニトール、塩化ナトリウムが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール、具体的にはエタノール、ポリアルコール、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート80(TM)、HCO−50と併用してもよい。
油性液としてはゴマ油、大豆油があげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールと併用してもよい。また、緩衝剤、例えばリン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、無痛化剤、例えば、塩酸プロカイン、安定剤、例えばベンジルアルコール、フェノール、酸化防止剤と配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填させる。
患者への投与は、例えば、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射などのほか、鼻腔内的、経気管支的、筋内的、経皮的、または経口的に当業者に公知の方法により行いうる。投与量は、患者の体重や年齢、投与方法などにより変動するが、当業者であれば適当な投与量を適宜選択することが可能である。また、当該化合物がDNAによりコードされうるものであれば、当該DNAを遺伝子治療用ベクターに組込み、遺伝子治療を行うことも考えられる。投与量、投与方法は、患者の体重や年齢、症状などにより変動するが、当業者であれば適宜選択することが可能である。
化合物の投与量は、症状により差異はあるが、経口投与の場合、一般的に成人(体重60kgとして)においては、1日あたり約0.1から100mg、好ましくは約1.0から50mg、より好ましくは約1.0から20mgであると考えられる。
非経口的に投与する場合は、その1回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法によっても異なるが、例えば注射剤の形では通常成人(体重60kgとして)においては、通常、1日当り約0.01から30mg、好ましくは約0.1から20mg、より好ましくは約0.1から10mg程度を静脈注射により投与するのが好都合であると考えられる。
本発明における「BARLP遺伝子」は、由来となる生物種は特に限定されず、例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、イヌ又はウサギが挙げられる。中でも、評価される化合物の投与対象がヒトであることから、ヒトBARLP遺伝子であることが好ましい。
また、本発明に係るBARLP遺伝子には、BARLPと同等の生理機能を有し、GPCRとして機能するタンパク質をコードするものであれば1又は2以上の塩基の置換、欠失、付加又は挿入がある遺伝子も含まれる。ここで、当該遺伝子としては、かかるタンパク質をコードする遺伝子であればその配列は特に制限されないが、相同性が50%以上であることが好ましく、70%以上であることがより好ましく、80%以上であることがさらに好ましく、90%以上(例えば、91、92、93、94、95、96、97、98、99%以上)であることが特に好ましい。
また、本発明に係るBARLP遺伝子には、BARLP遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸も含まれる。ここで、「ストリンジェントな条件でハイブリダイズする」とは、二つの核酸断片が、Molecular Cloning:A Laboratory Manual、第2版、コールドスプリングハーバー(1989)、9.47−9.62及び11.45−11.61に記載されたハイブリダイゼーション条件下で、相互にハイブリダイズすることを意味する。より具体的には、例えば、約45℃にて6.0×SSCでハイブリダイゼーションを行った後に、50℃にて2.0xSSCで洗浄する条件が挙げられる。ストリンジェンシー選択のため、洗浄工程における塩濃度を、例えば低ストリンジェンシーとしての約2.0xSSC、50℃から、高ストリンジェンシーとしての約0.2×SSC、50℃まで選択することができる。さらに、洗浄工程の温度を低ストリンジェンシー条件の室温、約22℃から、高ストリンジェンシー条件の約65℃まで上昇させることができる。
上述したように、BARLPは中枢神経系において知覚、認知、記憶あるいは精神機能に代表される高次脳機能調節に関わる分子と推定されていたが、本発明者らは、BARLPが体重及び摂食量の制御に関与していることを見出した。すなわち、BARLPを欠損した非ヒト哺乳動物において、運動量や体温の変化がないにもかかわらず体重と摂食量の増加が観察された。これは、BARLPの発現量又は機能を制御する物質(例えば、アゴニスト、アンタゴニスト等)により体重及び摂食の制御が可能となることを意味している。
(1)化合物の評価
BARLP遺伝子又はタンパク質を用いて、BARLPに作用する化合物の評価をすることができる。BARLPに対する作用を検出する方法として、被検化合物の当該受容体に対する特異的結合を検出する方法、被検化合物の接触によって変化した遺伝子の発現量を検出する方法、及び、当該接触によって生じたBARLPを介した細胞内情報伝達の活性を検出する方法が挙げられる。以下、順に説明する。
先ず、被検化合物の当該受容体に対する特異的結合を検出することにより、被検化合物を評価する方法について説明する。
本発明の化合物の評価方法は、BARLP遺伝子を導入し、BARLPを発現する細胞を調製する工程と、当該細胞に被検化合物を接触させる工程と、当該BARLPに対する当該被検化合物の特異的結合を検出する工程と、を含むことを特徴とする。
また、本発明の第2の化合物の評価方法は、BARLP遺伝子を導入し、BARLPを発現する細胞を調製する工程と、当該細胞に被検化合物を接触させる工程と、当該接触により生じた細胞内情報伝達物質の活性を測定する工程と、当該活性と被検化合物を接触させない場合の該細胞内情報伝達物質の活性とを比較する工程と、を含むことを特徴とする。
被検化合物としては、特に制限はなく、例えば、天然化合物、有機化合物、無機化合物、タンパク質、ペプチド等の単一化合物、並びに、化合物ライブラリー、遺伝子ライブラリーの発現産物、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物、原核細胞抽出物、真核単細胞抽出物若しくは動物細胞抽出物等を挙げることができる。上記被験試料は必要に応じて適宜標識して用いることができる。標識としては、例えば、放射標識、蛍光標識等を挙げることができる。また、上記被験試料に加えて、これらの被験試料を複数種混合した混合物も含まれる。
また、BARLP遺伝子を発現する細胞は、当業者が公知の方法で調製すればよく、具体的な方法としては特に制限はないが、例えば以下の方法によることができる。すなわち、BARLP遺伝子又はその一部からなる核酸を好適なプロモーター及び転写調節エレメントを含む発現ベクターにクローニングし、クローニングされた核酸を有するベクターを宿主細胞に導入することにより調製する。ここで、前記ベクターとしては、発現ベクターとして利用可能なものであれば特に限定されないが、例えば、pCMV−Tag、pcDNA3.1、pBlueBacHis2、pCI−neo、pcDNAI、pMC1neo、pXT1、pSG5、pEF1/V5−HisB、pCR2.1、pET11、λgt11又はpCR3.1が挙げられる。
次に、BARLP遺伝子又はその一部からなる核酸が導入された発現ベクターを宿主細胞に導入する。かかる宿主細胞としては、遺伝子の発現に通常使用されるものであれば特に限定されず、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、微生物のいずれであってもよく、具体的には、例えば、COS1、COS7、CHO、NIH/3T3、293、Raji、CV11、C1271、MRC−5、CPAE、HeLa、293T又はSf9が挙げられる。また、発現ベクターを宿主細胞に導入する方法としては、公知の方法であれば特に限定されないが、具体的には、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム法、DEAE−デキストラン法、リポフェクション法又は遺伝子銃が挙げられる。
次に、このようにして調製したBARLPを発現する細胞に被検化合物を接触させる。接触させる方法としては特に制限はなく、例えば、BARLPが精製された状態であれば、精製標品に被験試料を添加することにより行うことができる。また、細胞内(細胞膜上を含む)に発現した状態又は細胞抽出液内に発現した状態であれば、それぞれ、細胞の培養液または当該細胞抽出液に被験試料を添加することにより行うことができる。被験試料がタンパク質の場合には、例えば、当該タンパク質をコードするDNAを含むベクターを、BARLPが発現している細胞へ導入する、または当該ベクターをBARLPが発現している細胞抽出液に添加することで行うことも可能である。
細胞表面に発現した受容体と被検化合物との結合は、例えば、結合した化合物に付された標識による検出(例えば、結合量を放射活性や蛍光強度による検出)のほか、被検化合物の細胞表面上の前記受容体への結合によって生じた細胞内へのシグナル伝達(例えば、Gタンパク質の活性化、Ca2+、またはcAMPの濃度変化(FLIPR(Fluorometric Imaging Plate Reader)等が使用できる)、ホスホリパーゼCの活性化、pHの変化、受容体のインターナリゼーション)を指標に検出することができる。また、前記シグナル伝達によって生じたシグナル伝達上の分子(BARLPも含む)の発現レベルや活性を指標にすることもできる。ここで、当該発現レベルを指標とする場合、発現レベルの測定法は特に制限されないが、例えば、ノーザンブロッティング、ウェスタンブロッティング又はDNAチップが挙げられる。ここで、本発明における「発現レベル」とは、BARLPを介した情報伝達経路上に存在するタンパク質をコードする遺伝子の転写産物の絶対量又は相対量をいう。この場合、当該遺伝子にはDNA又はmRNAのいずれもが含まれる。また、発現の検出対象がタンパク質の場合、その「発現レベル」とは、BARLPを介した情報伝達経路上に存在するタンパク質の翻訳産物の絶対量又は相対量をいう。また、シグナル伝達上の分子の活性を指標にする場合、活性測定方法は特に制限されず、測定の対象となる分子の種類によって好適な方法を選択すればよい。
一方、単離されたBARLPタンパク質を化合物の評価に直接使用することもできる。すなわち、被検化合物をBARLPに接触させ、次に、接触によって生じたBARLPタンパク質の活性の変化を検出する方法である。
かかる接触の方法としては特に制限はなく、具体的には、例えば、緩衝液(リン酸緩衝液等)等の溶液中で混合することにより接触させる方法や、BARLPタンパク質をメンブレン上に固定し、メンブレン上で被検化合物と接触させる方法が挙げられる。
次に、接触によって生じたBARLPの活性の変化を検出する。
タンパク質の活性測定方法としては、使用するタンパク質の性質により適宜設定すればよく、具体的には、例えば、BARLPに対するリガンドの結合活性を指標にする方法が挙げられる。
前記のリガンドの結合活性を指標にする方法としては特に制限はないが、具体的には、例えば、BARLPが固定されたメンブレンに対する被検化合物の親和性を測定することによって結合活性を測定する方法が挙げられる。ここで用いられる被検化合物は、検出が容易なように放射性同位体等で標識されていてもよい。また、前記結合活性の検出方法として、放射性同位体で標識したリガンドと競合してBARLPへ結合する化合物を検出する方法も挙げられ、かかる方法を用いた場合には、被検化合物の標識は不要である。
以上のように、本発明の化合物の評価方法により化合物を検出した結果、被検化合物の存在下における結合活性が、被検化合物の非存在下における結合活性(対照)より低い値を示した場合には、当該被検化合物は、本発明に係るBARLPとリガンドとの結合を阻害する活性を有すると判定される。このような化合物は、前記受容体に結合して細胞内へのシグナル伝達を誘導する活性を有する化合物(アゴニスト)及び当該活性を有しない化合物(アンタゴニスト)等が含まれる。アゴニストは、前記受容体に対するリガンド及びそのアナログと同様の生理活性を有しており、一方、アンタゴニストは、前記受容体に対するリガンド及びそのアナログが有する生理活性を抑制する。このため、これらアゴニストやアンタゴニストは、本発明に係るBARLPを介したシグナル伝達系の異常などに起因する疾患の治療などのための医薬組成物として有用である。
また、本発明の化合物の評価方法により、BARLPへの被検化合物結合後の細胞内シグナル伝達を促進又は阻害する物質のスクリーニングを行うことができる。すなわち、上述した方法によって複数の被検化合物を評価することにより、アゴニスト又はアンタゴニストとして機能する化合物を選択することができる。かかる選択の結果、被検化合物非存在下においてリガンド及びそのアナログを作用させた場合の細胞内シグナル伝達の変化と比較して、その変化が抑制されれば、当該被検化合物は、BARLPへの被検化合物結合後の細胞内シグナル伝達を阻害する化合物であると判定される。逆に、被検化合物が細胞内シグナル伝達を増強させれば、当該化合物は、BARLPへの被検化合物結合後の細胞内シグナル伝達を促進する化合物であると判定される。このようなスクリーニング方法によって選択された化合物は、摂食、体重の制御に基づく肥満又は痩せの抑制に有効であり、かかる病態の予防又は治療に有用である。
また、本発明の化合物の評価方法においては、上述した評価方法に加え、BARLP遺伝子が不活性化されている非ヒト遺伝子改変動物を用いて被検化合物の評価を行う工程をさらに含んでいてもよい。
ここで、「BARLP遺伝子が不活性化されている」とは、通常、BARLP遺伝子の遺伝子対の一方又は双方に、ヌクレオチドの挿入、欠失、置換等の遺伝子変異を有することにより当該遺伝子の発現が抑制されている状態を指す。正常なBARLPタンパク質としての機能が減少または喪失している変異BARLPタンパク質が発現している場合も、この「BARLP遺伝子の発現の抑制」に含まれる。上記「抑制」には、BARLP遺伝子の発現が完全に抑制されている場合のほか、当該遺伝子の遺伝子対の一方の遺伝子の発現のみが抑制されている場合も含まれる。本発明においては、BARLP遺伝子の発現が特異的に抑制されていることが好ましい。また、遺伝子変異の存在する部位は、当該遺伝子の発現が抑制されるような部位であれば特に制限されず、例えばエクソン部位、プロモーター部位等を挙げることができる。
本発明においてBARLP遺伝子の改変の対象となる動物は、通常、ヒト以外の哺乳動物であり、好ましくはマウス、ラット、ハムスター、ウサギ等のげっ歯類であり、その中でも特にマウスが好ましい。本発明においてBARLP遺伝子の改変の対象となるES細胞もまた、げっ歯類に由来するものが好ましく、特にマウス由来が好ましい。なお、一般的に称される「ノックアウト動物」も本発明の遺伝子改変動物に含まれる。
本発明の非ヒト遺伝子改変動物及び遺伝子改変ES細胞において、BARLP遺伝子の発現を人為的に抑制する手段としては、BARLP遺伝子全体又はその一部を欠損させる方法や、BARLP遺伝子の発現制御領域の全部またはその一部を欠損させる方法等を例示することができるが、好ましくはBARLP遺伝子の遺伝子対の一方または双方に外来遺伝子を挿入することによりBARLP遺伝子を不活性化する方法である。即ち、本発明の好ましい態様において、遺伝子改変動物及び遺伝子改変ES細胞は、BARLP遺伝子の遺伝子対の一方または双方に外来遺伝子が挿入されていることを特徴とする。
本発明の遺伝子改変動物は、当業者においては一般的に公知の遺伝子工学技術により作製することができる。例えば、以下のようにして遺伝子改変マウスを作製することができる。まず、マウスからBARLP遺伝子のエクソン部分を含むDNAを単離し、このDNA断片に適当なマーカー遺伝子を挿入し、ターゲッティングベクターを構築する。このターゲッティングベクターをエレクトロポレーション法などによりマウスのES細胞株に導入し、相同組み換えを生じた細胞株を選抜する。挿入するマーカー遺伝子としては、ネオマイシン耐性遺伝子などの抗生物質耐性遺伝子が好ましい。抗生物質耐性遺伝子を挿入した場合には、抗生物質を含む培地で培養するだけで相同組み換えを生じた細胞株を選抜することができる。また、より効率的な選抜を行うためには、ターゲッティングベクターにチミジンキナーゼ遺伝子などを結合させておくことも可能である。これにより、非相同組み換えを起こした細胞株を排除することができる。また、PCRおよびサザンブロットにより相同組み換え体の検定を行い、BARLP遺伝子の遺伝子対の一方が不活性化された細胞株を効率よく得ることもできる。
相同組み換えを生じた細胞株を選抜する場合、相同組み換え箇所以外にも、遺伝子挿入による未知の遺伝子破壊の恐れがあることから、複数のクローンを用いてキメラ作製を行うことが好ましい。得られたES細胞株をマウス胚盤葉にインジェクションしキメラマウスを得ることができる。このキメラマウスを交配させることで、BARLP遺伝子の遺伝子対の一方を不活性化したマウスを得ることができる。さらに、このマウスを交配させることで、BARLP遺伝子の遺伝子対の双方を不活性化したマウスを取得することができる。マウス以外のES細胞が樹立された動物においても、同様の手法により、遺伝子改変を行うことができる。
次に、こうして作製された非ヒト遺伝子改変動物に被検化合物を投与する。遺伝子改変動物への被験化合物の投与は、経口的または非経口的に行うことができる。
次に、当該非ヒト遺伝子改変動物における摂食量又は体重を測定する。摂食量及び体重の測定は当業者に公知の方法で行うことができる。
最後に、被検化合物を投与していない非ヒト遺伝子改変動物と比較して、表現系の相違を比較する。具体的には、例えば、インビトロの評価系(上述の化合物の評価方法)によって評価された被検化合物を非ヒト遺伝子改変動物及び野生型のそれぞれに投与し(対照として投与しない群を設定してもよい)、野生型では摂食や体重を制御する作用が見られるが、非ヒト遺伝子改変動物では見られないような化合物を選択することにより、当該被検化合物がBARLPに特異的に作用していることを確認することができる。こうして選択された化合物は、摂食又は体重を制御する化合物であり、疾患の治療又は予防のための薬剤として有用であると考えられる。
また、本発明の化合物の評価方法において、上述した非ヒト遺伝子改変動物を用いた被検化合物の評価を行う工程をさらに含むことにより、より人体に近い環境下でBARLPを標的とした化合物の評価を行うことが可能となる。すなわち、インビトロの試験では知り得ない被検化合物の薬効や副作用を観察することが可能となり、より効率的な化合物の評価が可能となる。
また、本発明の化合物の評価方法の別の態様として、BARLP遺伝子が不活性化されている非ヒト遺伝子改変動物に被検化合物を投与する工程と、当該投与により生じた該ヒト遺伝子改変動物の表現系の変化を検出し、正常動物の表現系との相違を比較する工程と、を含むことを特長とする。
BARLP遺伝子が不活性化されている非ヒト遺伝子改変動物としては、前記で説明したのと同じ遺伝子改変動物を使用することができる。
BARLP遺伝子が不活性化されている非ヒト遺伝子改変動物に被検化合物を投与する方法としては、経口的又は非経口的な投与が挙げられる。
次に、当該非ヒト遺伝子改変動物における表現系(例えば、摂食量又は体重)を検討する。摂食量及び体重の測定は当業者に公知の方法で行うことができる。
最後に、被検化合物を投与していない非ヒト遺伝子改変動物と比較して、表現系の相違を比較する。具体的には、例えば、インビトロの評価系(上述の化合物の評価方法)によって評価された被検化合物を非ヒト遺伝子改変動物及び野生型のそれぞれに投与し(対照として投与しない群を設定してもよい)、野生型では摂食や体重を制御する作用が見られるが、非ヒト遺伝子改変動物では見られないような化合物を選択することにより、当該被検化合物がBARLPに特異的に作用していることを確認することができる。こうして選択された化合物は、摂食又は体重を制御する化合物であり、疾患の治療又は予防のための薬剤として有用であると考えられる。
また、上述した本発明の化合物の評価方法により、PET(positron emission tomography)に用いるリガンドの評価を行うことができる。PETは、水、酸素、ブドウ糖、アミノ酸といった生体内に存在する物質あるいは目的とする受容体に対するリガンドを放射線標識して体内に投与することにより、非侵襲的に生体機能を観察する方法であり、研究や臨床において利用されている。PETの特徴は、トレーサーとして用いるリガンドに依存した機能特異的なイメージングを可能にする点にあり、新たなトレーサーの開発は未知の生体機能の解明や疾患の診断に不可欠である。本発明の化合物の評価方法によれば、被検化合物としてPETリガンド候補物質を適用することにより、当該物質のインビトロでの評価を行うことが可能となる。
(2)摂食又は体重制御物質
次に、本発明の摂食又は体重制御物質について説明する。
本発明の摂食又は体重制御物質は、BARLPの機能制御作用を有することを特徴とする。ここで、「BARLPの機能制御作用」は、BARLPの機能を制御する作用であればその原因となる生理学的根拠は特に制限されず、例えば、BARLPの発現を抑制及び亢進することによって生じる機能異常が挙げられる。また、「BARLPの機能制御作用」には、BARLPの機能を抑制する場合と亢進する場合のいずれをも含む。
本発明の知見より、BARLPを発現していないマウスでは摂食量の亢進と体重の増加が観察される。すなわち、BARLPの発現又は機能を抑制する物質は体重の増加に寄与することから、痩せや摂食障害を伴う疾患(例えば、拒食症、神経性食欲不振症、摂食障害、食欲不振症又は無食欲)の予防又は治療薬として有効である。一方、BARLPの発現又は機能を増強する物質は体重の減少に寄与することから、肥満又は肥満を伴う疾患(例えば、肥満症、糖尿病、ホルモン分泌異常、痛風、脂肪肝、高コレステロール血症、高脂血症、動脈硬化又は緑内障)の予防又は治療薬として有効である。
BARLPの発現を抑制又は増強する物質としては特に制限はなく、例えば、天然化合物、有機化合物、無機化合物、タンパク質、ペプチド等の単一化合物、BARLPの抗体、アンチセンス、RNAi又はリボザイムが挙げられる。
本発明の摂食又は体重制御物質(上述した、本発明の化合物の評価方法により選択された化合物を含む)をヒトや他の動物の医薬として使用する場合には、これらの物質自体を直接患者に投与する以外に、公知の製剤学的方法により製剤化して投与を行うことも可能である。例えば、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤として経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、又は懸濁液剤の注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、薬理学上許容される担体若しくは媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤等と適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化することが考えられる。
錠剤、カプセル剤に混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガントガム、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸のような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖又はサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油又はチェリーのような香味剤が用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、上記の材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用蒸留水のようなベヒクルを用いて通常の製剤実施に従って処方することができる。
注射用の水溶液としては、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、例えばD−ソルビトール、D−マンノース、D−マンニトール、塩化ナトリウムが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール、具体的にはエタノール、ポリアルコール、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート80(TM)、HCO−50と併用してもよい。
油性液としてはゴマ油、大豆油があげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールと併用してもよい。また、緩衝剤、例えばリン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、無痛化剤、例えば、塩酸プロカイン、安定剤、例えばベンジルアルコール、フェノール、酸化防止剤と配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填させる。
患者への投与は、例えば、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射などのほか、鼻腔内的、経気管支的、筋内的、経皮的、または経口的に当業者に公知の方法により行いうる。投与量は、患者の体重や年齢、投与方法などにより変動するが、当業者であれば適当な投与量を適宜選択することが可能である。また、当該化合物がDNAによりコードされうるものであれば、当該DNAを遺伝子治療用ベクターに組込み、遺伝子治療を行うことも考えられる。投与量、投与方法は、患者の体重や年齢、症状などにより変動するが、当業者であれば適宜選択することが可能である。
化合物の投与量は、症状により差異はあるが、経口投与の場合、一般的に成人(体重60kgとして)においては、1日あたり約0.1から100mg、好ましくは約1.0から50mg、より好ましくは約1.0から20mgであると考えられる。
非経口的に投与する場合は、その1回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法によっても異なるが、例えば注射剤の形では通常成人(体重60kgとして)においては、通常、1日当り約0.01から30mg、好ましくは約0.1から20mg、より好ましくは約0.1から10mg程度を静脈注射により投与するのが好都合であると考えられる。
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は、以下の実施例に限定されるものではない。
試験例1
(BARLP(−/−)マウス)
相同組換えにより作製されたヘテロBARLP(+/−)(Deltagen社)の掛け合わせによりBARLP(−/−)マウスを作製した。遺伝子型は、離乳期のマウスに対してPCRにより確認した。
[実施例1]
(BARLP(−/−)マウスの体重の検討)
以下の試験には、7週齢のBARLP(−/−)及び野生型(WT)を使用した。マウスの飼育中、水とペレットフード(CE−2:クレア社)は自由に摂取させた。また、試験に用いるマウスは、室温23±2℃、湿度55±15%、12時間毎の明暗環境下で、個別のケージにて飼育した。体重は14週間に渡って観察した。図1に示すとおり、BARLP(−/−)とWTとを比較して、BARLP(−/−)が有意な体重の増加を示した。
[実施例2]
(BARLP(−/−)マウスの摂食量の検討)
また、摂食量は8週齢(図2)、12週齢(図3)、16週齢(図4)、20週齢(図5)からそれぞれ4日間の摂食量から一日あたりの平均摂食量を算出した。図2〜5に示すとおり、WTと比較してBARLP(−/−)の摂食量が有意に多いことが確認できた。
[実施例3]
(BARLP(−/−)マウスの自発運動量(Locomotor activity)の検討)
BARLP(−/−)マウスの自発運動量は、18週齢のマウスを用いてアクティビティモニタリングシステム(NS−AS01:Neuroscience社)により測定した。その際、自発運動量は、24個のテストケージ上からそれぞれ赤外線センサーによりモニターした。また、試験中、全てのマウスにはケージ内で水と餌を自由に摂取させた。自発運動量は、60分ごとのデータをまとめたものを実験動物自発運動観察装置(ABsystem−24A:Neuroscience社)により解析した。自発運動量の観察は7日間行った。図6に示すとおり、BARLP(−/−)とWTマウスとの間で自発運動量には有意な相違がなく、実施例1及び2で示したBARLP(−/−)マウスにおける体重と摂食量の増加と運動量とは相関がないことが確認できた。
[実施例4]
(BARLP(−/−)マウスの直腸温の検討)
直腸温は、朝9:00〜11:00に直腸プローブを取り付けたデジタル温度計(BAT−12:Physitemp Instruments社)により測定した。直腸プローブは肛門内2センチまで挿入した。直腸温は、17週齢と19週齢のマウスについて測定した。図7(17週齢)及び図8(19週齢)に示すとおり、BARLP(−/−)とWTマウス間で直腸温には有意な相違はなく、実施例1及び2で示したBARLP(−/−)マウスにおける体重と摂食量の増加と体温とは相関がないことが確認できた。
試験例1
(BARLP(−/−)マウス)
相同組換えにより作製されたヘテロBARLP(+/−)(Deltagen社)の掛け合わせによりBARLP(−/−)マウスを作製した。遺伝子型は、離乳期のマウスに対してPCRにより確認した。
[実施例1]
(BARLP(−/−)マウスの体重の検討)
以下の試験には、7週齢のBARLP(−/−)及び野生型(WT)を使用した。マウスの飼育中、水とペレットフード(CE−2:クレア社)は自由に摂取させた。また、試験に用いるマウスは、室温23±2℃、湿度55±15%、12時間毎の明暗環境下で、個別のケージにて飼育した。体重は14週間に渡って観察した。図1に示すとおり、BARLP(−/−)とWTとを比較して、BARLP(−/−)が有意な体重の増加を示した。
[実施例2]
(BARLP(−/−)マウスの摂食量の検討)
また、摂食量は8週齢(図2)、12週齢(図3)、16週齢(図4)、20週齢(図5)からそれぞれ4日間の摂食量から一日あたりの平均摂食量を算出した。図2〜5に示すとおり、WTと比較してBARLP(−/−)の摂食量が有意に多いことが確認できた。
[実施例3]
(BARLP(−/−)マウスの自発運動量(Locomotor activity)の検討)
BARLP(−/−)マウスの自発運動量は、18週齢のマウスを用いてアクティビティモニタリングシステム(NS−AS01:Neuroscience社)により測定した。その際、自発運動量は、24個のテストケージ上からそれぞれ赤外線センサーによりモニターした。また、試験中、全てのマウスにはケージ内で水と餌を自由に摂取させた。自発運動量は、60分ごとのデータをまとめたものを実験動物自発運動観察装置(ABsystem−24A:Neuroscience社)により解析した。自発運動量の観察は7日間行った。図6に示すとおり、BARLP(−/−)とWTマウスとの間で自発運動量には有意な相違がなく、実施例1及び2で示したBARLP(−/−)マウスにおける体重と摂食量の増加と運動量とは相関がないことが確認できた。
[実施例4]
(BARLP(−/−)マウスの直腸温の検討)
直腸温は、朝9:00〜11:00に直腸プローブを取り付けたデジタル温度計(BAT−12:Physitemp Instruments社)により測定した。直腸プローブは肛門内2センチまで挿入した。直腸温は、17週齢と19週齢のマウスについて測定した。図7(17週齢)及び図8(19週齢)に示すとおり、BARLP(−/−)とWTマウス間で直腸温には有意な相違はなく、実施例1及び2で示したBARLP(−/−)マウスにおける体重と摂食量の増加と体温とは相関がないことが確認できた。
BARLPの発現量と体重又は摂食量との間に一定の関係があり、当該関係に基づき、BARLPを標的とした化合物の評価をすることが可能となる。また、当該評価によって得られたBARLPのリガンド(例えば、体重を制御する物質)を提供することが可能となる。
これら評価及び物質により、痩せや摂食障害を伴う疾患(例えば、拒食症、神経性食欲不振症、摂食障害、食欲不振症又は無食欲)の予防又は治療薬が提供される。また、BARLPの発現を増強する物質は体重の減少に寄与することから、肥満又は肥満を伴う疾患(例えば、肥満症、糖尿病、ホルモン分泌異常、痛風、脂肪肝、高コレステロール血症、高脂血症、動脈硬化又は緑内障)の予防又は治療薬が提供される。
これら評価及び物質により、痩せや摂食障害を伴う疾患(例えば、拒食症、神経性食欲不振症、摂食障害、食欲不振症又は無食欲)の予防又は治療薬が提供される。また、BARLPの発現を増強する物質は体重の減少に寄与することから、肥満又は肥満を伴う疾患(例えば、肥満症、糖尿病、ホルモン分泌異常、痛風、脂肪肝、高コレステロール血症、高脂血症、動脈硬化又は緑内障)の予防又は治療薬が提供される。
Claims (9)
- 摂食又は体重を制御する化合物の評価方法であって、
BARLP遺伝子を導入し、BARLPを発現する細胞を調製する工程と、
該細胞に被検化合物を接触させる工程と、
該BARLPに対する該被検化合物の特異的結合を検出する工程と、を含むことを特徴とする化合物の評価方法。 - 摂食又は体重を制御する化合物の評価方法であって、
BARLP遺伝子を導入し、BARLPを発現する細胞を調製する工程と、
該細胞に被検化合物を接触させる工程と、
該接触により生じた細胞内情報伝達物質の活性を測定する工程と、
該活性と被検化合物を接触させない場合の該細胞内情報伝達物質の活性とを比較する工程と、を含むことを特徴とする化合物の評価方法。 - 摂食又は体重を制御する化合物の評価方法であって、
BARLP遺伝子を導入し、BARLPを発現する細胞を調製する工程と、
該細胞に被検化合物を接触させる工程と、
該BARLP又はBARLPを介した細胞内情報伝達物質の発現レベルを測定する工程と、
被検化合物を接触させていない場合と比較して、該BARLPの発現レベルを増加又は減少させた被検化合物を選択する工程と、を含むことを特徴とする化合物の評価方法。 - BARLP遺伝子が不活性化されている非ヒト遺伝子改変動物を用いて被検化合物の評価を行う工程をさらに含むことを特徴とする請求項1〜3のいずれか一項に記載の化合物の評価方法。
- 摂食又は体重を制御する化合物の評価方法であって、
BARLP遺伝子が不活性化されている非ヒト遺伝子改変動物に被検化合物を投与する工程と、
該投与により生じた該ヒト遺伝子改変動物の表現系の変化を検出し、正常動物の表現系との相違を比較する工程と、を含むことを特徴とする化合物の評価方法。 - 摂食又は体重を制御する化合物の評価方法であって、
被検化合物を、BARLPに接触させる工程と、
該接触によるBARLPの活性の変化を検出する工程と、を含むことを特徴とする化合物の評価方法。 - 請求項1〜6のいずれか一項に記載の化合物の評価方法により単離されたことを特徴とするBARLPリガンド。
- BARLPの機能制御作用を有することを特徴とする摂食又は体重制御物質。
- 前記摂食又は体重制御物質が、天然化合物、有機化合物、無機化合物、タンパク質、ペプチド、抗体、アンチセンス、RNAi及びリボザイムからなる群より選択されるいずれか一つであることを特徴とする請求項8に記載の物質。
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