JP2009538623A - 視床下部プロオピオメラノコルチン（ｐｏｍｃ）由来生物活性ペプチドに関連する障害の処置において有用な、視床下部プロオピオメラノコルチン（ｐｏｍｃ）由来生物活性ペプチドの分泌の調節因子を同定するための方法における、ｇｐｒ１０１受容体の使用 - Google Patents

視床下部プロオピオメラノコルチン（ｐｏｍｃ）由来生物活性ペプチドに関連する障害の処置において有用な、視床下部プロオピオメラノコルチン（ｐｏｍｃ）由来生物活性ペプチドの分泌の調節因子を同定するための方法における、ｇｐｒ１０１受容体の使用 Download PDF

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Abstract

本発明は、候補化合物を視床下部プロオピオメラノコルチン（ＰＯＭＣ）由来生物活性ペプチドの分泌の調節因子としてスクリーニングするためにＧＰＲ１０１ Ｇタンパク質結合受容体（ＧＰＣＲ）を使用する方法に関する。ＧＰＲ１０１受容体の調節因子は、視床下部ＰＯＭＣ由来生物活性ペプチドの分泌を調節し、およびＰＯＭＣ由来生物活性ペプチド関連疾患の治療において有用である。ＰＯＭＣ由来生物活性ペプチドとしては、α−メラニン細胞刺激ホルモン（α−ＭＳＨ）、β−メラニン細胞刺激ホルモン（β−ＭＳＨ）およびγ−メラニン細胞刺激ホルモン（γ−ＭＳＨ）が挙げられるが、これらに限定されない。

Description

発明の分野
本発明は、視床下部プロオピオメラノコルチン（ＰＯＭＣ）由来生物活性ペプチドの分泌の調節因子として候補化合物をスクリーニングするためにＧＰＲ１０１Ｇタンパク質結合受容体（ＧＰＣＲ）を使用する方法に関する。ＧＰＲ１０１受容体の調節因子は、視床下部ＰＯＭＣ由来生物活性ペプチドの分泌を調節し、およびＰＯＭＣ由来生物活性ペプチド関連疾患の治療において有用である。ＰＯＭＣ由来生物活性ペプチドとしては、α−メラニン細胞刺激ホルモン（α−ＭＳＨ）、β−メラニン細胞刺激ホルモン（β−ＭＳＨ）およびγ−メラニン細胞刺激ホルモン（γ−ＭＳＨ）が挙げられるが、これらに限定されない。ＧＰＲ１０１受容体のアゴニストおよび部分アゴニストは、視床下部α−ＭＳＨ、β−ＭＳＨおよびγ−ＭＳＨ分泌を刺激し、ならびに例えば、肥満およびそれに関連した状態（２型糖尿病、インスリン抵抗性、およびメタボリック症候群を含むが、これらに限定されない）、炎症関連障害および発熱の治療および予防において有用である。ＧＰＲ１０１受容体の逆アゴニストおよびアンタゴニストは、α−ＭＳＨ、β−ＭＳＨおよびγ−ＭＳＨ分泌を阻害し、ならびに例えば、悪液質などの疾患の治療および予防において有用である。
（発明の背景）
以下の議論は、本発明の理解を容易にするために意図されるが、本発明に対する先行技術であることが意図されるのではなく、そのことが認められるわけでもない。
Ａ．肥満
脂肪組織の重量の増加によって定義される肥満は、２型糖尿病、高脂血症、および冠性心疾患などの心臓血管性障害および代謝性障害の高いリスク、ならびに付随する罹患率および死亡率を与える。循環器病の多重リスク要因であるメタボリック症候群は、肥満、高トリグリセリド血症、低ＨＤＬコレステロール、高血圧および空腹時高グルコース（ｈｉｇｈ ｆａｓｔｉｎｇ ｇｌｕｃｏｓｅ）に関連するものを含む、５つの判断基準に基づいて定義される［非特許文献１］。
肥満は今や、西欧諸国における主要な保健医療問題であり、いくつかの第三世界諸国において増加しつつある。肥満の人数の増加は高脂肪含量の食事の嗜好の増加に大部分起因するが、これはまた、より重要な要因、多くの人々の生活における活動の減少であり得る。最近１０年間で、米国において肥満の発生率は３０％増加しており、現在米国の人口の約３０％が肥満と考えられている。
ある人が過体重または肥満に分類されるか否かは、一般的に、身長の平方（ｍ２）で体重（ｋｇ）を除算することによって計算される、肥満度指数（ＢＭＩ）に基づいて決定される。このように、ＢＭＩの単位はｋｇ／ｍ２であり、人生の各１０年間における最小死亡率と関連するＢＭＩ範囲を計算することが可能である。過体重は、２５．０〜２９．９ｋｇ／ｍ２の範囲のＢＭＩとして定義され、肥満は３０ｋｇ／ｍ２以上のＢＭＩとして定義される（以下の表Ａを参照のこと）。
表Ａ 肥満度指数（ＢＭＩ）による体重の分類
Figure 2009538623
 ＢＭＩが増加するに従って、他のリスク要因とは独立している種々の原因からの死亡のリスクが増加する。肥満に伴う最も一般的な疾患は、循環器病（特に高血圧）、糖尿病（肥満は糖尿病の発生を悪化させる）、胆嚢疾患、癌、および生殖疾患である。研究は、体重の適度な減少さえもが、冠性心疾患を発症するリスクの有意な減少に相当し得ることを示してきた。
しかし、脂肪（脂肪組織）に対する、筋肉である体重の割合を考慮に入れていないという点で、ＢＭＩの定義に伴う問題点が存在している。この点を考慮するために、肥満は、体脂肪含量に基づいて定義することもできる：男性では２５％より上、女性では３０％より上である。
肥満は、同様に、循環器病を発症するリスクを顕著に増加させる。冠不全、アテローム性疾患、および心不全は、肥満によって誘導される心血管系の合併症の最前線にある。全体の集団が理想体重であるならば、冠不全のリスクは２５％減少し、心不全のリスクおよび脳血管発作のリスクは３５％減少すると見積もられている。冠動脈疾患の発生は、３０％過体重である５０歳未満の被験体において２倍である。糖尿病患者は、寿命の３０％減少に直面している。４５歳以後、糖尿病の人は、糖尿病でない人よりも、顕著な心臓病になる可能性が約３倍であり、脳卒中になる可能性が約５倍までである。これらの知見は、２型糖尿病および冠性心疾患のリスク要因と、肥満の予防に基づくこれらの状態の予防に対する複合的なアプローチの潜在的な価値との間の相互関連を強調する［非特許文献２］。
糖尿病は、腎臓病、眼疾患、および神経系の問題の発生にもまた関係付けられてきた。腎症とも呼ばれる腎臓病は、腎臓の「フィルター機構」が損傷し、タンパク質が尿中に過剰量で漏れ出し、最終的には腎臓が機能しなくなるときに起こる。糖尿病は、眼の後ろの網膜に対する損傷の主要原因でもあり、白内障および緑内障のリスクを増加する。最後に、糖尿病は、痛みを感じる能力に干渉し、深刻な感染に寄与する、とりわけ、脚および足の神経損傷に関連する。まとめると、糖尿病合併症は、国家の主要な死因の１つである。
第１の治療は、患者に対して、彼らの食事の脂肪含量を減少すること、および彼らの身体的活動を増加することなどの、食事およびライフスタイルのアドバイスを提供することである。しかし、多くの患者はこのことが困難であることを見出し、これらの努力からの結果を維持するために、薬物治療からのさらなる援助を必要とする。
大部分の現在市販されている製品は、効力の欠如または受け入れ難い副作用プロフィールのせいで、肥満のための治療としては成功していなかった。これまでに最も成功した薬物は、間接的に作用する５−ヒドロキシトリプタミン（５−ＨＴ）アゴニストであるｄ−フェンフルラミン（レダックス（Ｒｅｄｕｘ）（登録商標））であったが、しかし患者の３分の１までにおける心臓弁欠損の報告が、１９９８年にＦＤＡによるその取り消しを招いた。
加えて、２種類の薬物が、米国および欧州において最近参入してきた：膵リパーゼの阻害によって脂肪の吸収を妨害する薬物であるオーリスタット（Ｏｒｌｉｓｔａｔ）（ゼニカル（Ｘｅｎｉｃａｌ）（登録商標））、および５−ＨＴ／ノルアドレナリン再取り込み阻害剤であるシブトラミン（Ｓｉｂｕｔｒａｍｉｎｅ）（レダクチル（Ｒｅｄｕｃｔｉｌ）（登録商標））である。しかし、これらの製品に付随する副作用は、これらの長期的な有用性を制限する可能性がある。ゼニカル（登録商標）を用いる治療は、ある患者においては胃腸障害を誘導すると報告されているのに対して、シブトラミンは、ある患者においては血圧の上昇と関連付けられてきた。
安全に体重を減少させる薬剤についての医学的な満たされていない必要性が存在している。本発明は、この重要な目的、ならびに他の重要な目的に向けられている。
Ｂ．視床下部におけるプロオピオメラノコルチン（ＰＯＭＣ）
視床下部弓状核は、１つは食事摂取量を大いに増加させ（食欲促進性）および１つは食事摂取量を減少させる（食欲不振誘発性）、２つの別個のニューロンサブセットを含有する。食事摂取量を増加させるニューロンのサブセットは、２つの食欲促進性分子、神経ペプチドＹ（ＮＰＹ）とアグーチ関連ペプチド（ＡｇＲＰ）、を共発現する。食事摂取量を減少させるニューロンのサブセットは、プロオピオメラノコルチン（ＰＯＭＣ）を発現する。
ＰＯＭＣは、視床下部において副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）、β−エンドルフィン、α−ＭＳＨ、β−ＭＳＨおよびγ−メラニン細胞刺激ホルモン（γ−ＭＳＨ）を含む（しかし、これらに限定されない）多数の生物活性ペプチドをタンパク質分解によってもたらすプロホルモンである。齧歯動物は、ほとんどの種とは異なり、β−ＭＳＨのためのＮ末端タンパク質分解性切断部位を有さず、従って、β−ＭＳＨ欠損体である。α−ＭＳＨおよびβ−ＭＳＨは、同等に高い親和性でメラノコルチン−４受容体（ＭＣ４Ｒ）に結合し（ＭＣ４Ｒに対するアゴニストであり）、ならびにγ−ＭＳＨは、排他的にメラノコルチン−３受容体（ＭＣ３Ｒ）に結合する（ＭＣ３Ｒに対するアゴニストである）。α−ＭＳＨおよびβ−ＭＳＨが食欲不振誘発性であることが証明された。細胞内ｃＡＭＰの上昇は、ＰＯＭＣ発現およびＰＯＭＣ由来生物活性ペプチドの分泌を刺激する。（例示的ＰＯＭＣ ｍＲＮＡおよびアミノ酸配列は、ヒトについてはＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）アクセッション番号ＢＣ０６５８３２、マウスについてはＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）アクセッション番号ＢＣ０６１２１５、およびラットについてはＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）アクセッション番号ＢＣ０５８４４３で見つけることができる）（例示的ＮＰＹ ｍＲＮＡおよびアミノ酸配列は、ヒトについてはＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）アクセッション番号ＮＭ＿０００９０５、マウスについてはＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）アクセッション番号ＮＭ＿０２３４５６、およびラットについてはＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）アクセッション番号ＮＭ＿０１２６１４で見つけることができる）。
すべてのＰＯＭＣ由来ペプチドを遺伝的に欠くヒトおよびマウスは、重度に肥満である。ＭＣ４Ｒを欠くヒトおよびマウスは、著しく肥満および過食症性である。ＭＣ４Ｒの共優性突然変異は、ヒトにおける早期発症、重症肥満の５％以下についての原因であり、従って、ヒトにおける重症肥満の最も一般的な１遺伝子的原因である。最近、ヒトにおけるβ−ＭＳＨのミスセンス突然変異は、早期発症、重症肥満および過食症、ＭＣ４Ｒ欠損症の特徴、につながることが証明された。
ＡＣＴＨおよびα−ＭＳＨは、解熱性である（熱、すなわち発熱、を下げる）ことが証明された。
α−ＭＳＨ（これは、ニューロンにおいてばかりでなく、下垂体細胞、ケラチノサイトおよびマクロファージにおいても発現される）およびγ−ＭＳＨ、ならびにＭＣ１ＲおよびＭＣ３Ｒに対する他のアゴニストは、抗炎症性であることが証明された。
例えば、Ｐｒｉｔｃｈａｒｄら、Ｊ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ（２００２）１７２：４１１−４２１；Ｂａｒｓｈら、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ（２００２）３：５８９−６００；Ｃｏｎｅ，Ｎａｔｕｒｅ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ（２００５）８：５７１−５７８；Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｏｂｅｓｉｔｙ（２００６）１４：１Ｓ−８Ｓ；Ｙａｎｇら、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９９６）７０６：２４３−２４８；Ｂｏｕｔｉｌｌｉｅｒら、Ｐｉｔｕｉｔａｒｙ（１９９８）１：３３−４３；Ｌｅｅら、Ｃｅｌｌ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ（２００６）３：１３５−１４０；Ｂｉｅｂｅｒｍａｎｎら、Ｃｅｌｌ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ（２００６）３：１４１−１４６；Ｌｅｉｂｅｌ，Ｃｅｌｌ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ（２００６）３：７９−８１；Ｈｅｎｅｋａら、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ（２００６）１１４：８−１８；Ｙｏｏｎら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ（２００３）２７８：３２９１４−３２９２０；Ｍｕｒｐｈｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８３）２２１：１９２−１９３；およびＵｓｕｉら、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ（１９８９）６２：１４１−１４６を参照のこと。
Ｃ．ＧＰＲ１０１
ＣＰＲ１０１は、視床下部において発現されると報告されている（Ｌｅｅら、Ｇｅｎｅ（２００１）２７５：１８３−９１）およびＧとの結合と一致して細胞内ｃＡＭＰを上昇させると報告されている（特許文献１）オーファンＧタンパク質結合受容体（ＧＰＣＲ）である。脳におけるＧＰＲ１０１の発現は、視床下部をはじめとする個別の核において主として検出されている（Ｂａｔｅｓら、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ（２００６））。ＧＰＲ１０１についてのコーディング領域は、単一エキソンの中に含まれる。
Ｄ．Ｇタンパク質結合受容体
多数の受容体クラスがヒトにおいて存在しているが、圧倒的に最も大量にあり、かつ治療的に関連性があるものは、Ｇタンパク質結合受容体（ＧＰＣＲ）クラスに代表される。ヒトゲノムの中には約３０，０００〜４０，０００個の遺伝子が存在すると見積もられており、これらの中のおよそ２％がＧＰＣＲをコードすると見積もられている。
ＧＰＣＲは、医薬品の開発のための重要な領域を表している：１００個の既知のＧＰＣＲの中の約２０個から、すべての処方医薬品の約６０％が開発されてきた。例えば、１９９９年には、上位１００種類の処方薬物の商品名の中で、以下の薬物がＧＰＣＲと相互作用する（その薬物に関連して治療される主要な疾患および／または障害を括弧内に示す）：
クラリチン（Ｃｌａｒｉｔｉｎ）（登録商標）（アレルギー）
プロザック（Ｐｒｏｚａｃ）（登録商標）（うつ病）
バソテック（Ｖａｓｏｔｅｃ）（登録商標）（高血圧）
パキシル（Ｐａｘｉｌ）（登録商標）（うつ病）
ゾロフト（Ｚｏｌｏｆｔ）（登録商標）（うつ病）
ジプレキサ（Ｚｙｐｒｅｘａ）（登録商標）（精神異常）
コザール（Ｃｏｚａａｒ）（登録商標）（高血圧）
イミトレックス（Ｉｍｉｔｒｅｘ）（登録商標）（片頭痛）
ザンタック（Ｚａｎｔａｃ）（登録商標）（逆流）
プロプルシド（Ｐｒｏｐｕｌｓｉｄ）（登録商標）（逆流性疾患）
リスパーダル（Ｒｉｓｐｅｒｄａｌ）（登録商標）（統合失調症）
セレベント（Ｓｅｒｅｖｅｎｔ）（登録商標）（喘息）
ペプシド（Ｐｅｐｃｉｄ）（登録商標）（逆流）
ガスター（Ｇａｓｔｅｒ）（登録商標）（潰瘍）
アトロベント（Ａｔｒｏｖｅｎｔ）（登録商標）（気管支痙攣）
エフェクソル（Ｅｆｆｅｘｏｒ）（登録商標）（うつ病）
デパコート（Ｄｅｐａｋｏｔｅ）（登録商標）（てんかん）
カージュラ（Ｃａｒｄｕｒａ）（登録商標）（前立腺肥大）
アレグラ（Ａｌｌｅｇｒａ）（登録商標）（アレルギー）
ルプロン（Ｌｕｐｒｏｎ）（登録商標）（前立腺癌）
ゾラデックス（Ｚｏｌａｄｅｘ）（登録商標）（前立腺癌）
ディプリバン（Ｄｉｐｒｉｖａｎ）（登録商標）（知覚麻痺）
ブスパー（ＢｕＳｐａｒ）（登録商標）（不安）
ベントリン（Ｖｅｎｔｏｌｉｎ）（登録商標）（気管支痙攣）
ハイトリン（Ｈｙｔｒｉｎ）（登録商標）（高血圧）
ウェルブトリン（Ｗｅｌｌｂｕｔｒｉｎ）（登録商標）（うつ病）
ジルテック（Ｚｙｒｔｅｃ）（登録商標）（鼻炎）
プラビックス（Ｐｌａｖｉｘ）（登録商標）（ＭＩ／脳卒中）
トプロール（Ｔｏｐｒｏｌ）−ＸＬ（登録商標）（高血圧）
テノーミン（Ｔｅｎｏｒｍｉｎ）（登録商標）（アンギナ）
キサラタン（Ｘａｌａｔａｎ）（登録商標）（緑内障）
シングレア（Ｓｉｎｇｕｌａｉｒ）（登録商標）（喘息）
ディオバン（Ｄｉｏｖａｎ）（登録商標）（高血圧）
ハルナール（Ｈａｒｎａｌ）（登録商標）（前立腺肥大）
（Ｍｅｄ Ａｄ Ｎｅｗｓ １９９９データ）。
ＧＰＣＲは、７個のαヘリックスを形成する２２個から２４個の間の疎水性アミノ酸の７個の配列を有する、共通の構造モチーフを共有し、その各々が膜を貫通する（各貫通は、数字によって、すなわち、膜貫通−１（ＴＭ−１）、膜貫通−２（ＴＭ−２）などによって同定される）。これらの膜貫通ヘリックスは、膜貫通−２と膜貫通−３の間、膜貫通−４と膜貫通−５の間、および膜貫通−６と膜貫通−７の間の、細胞膜の外部、すなわち、「細胞外」側のアミノ酸の鎖（これらは、それぞれ、「細胞外」領域１、２、および３（ＥＣ−１、ＥＣ−２、およびＥＣ−３）と呼ばれる）によって結合されている。膜貫通ヘリックスは、膜貫通−１と膜貫通−２の間、膜貫通−３と膜貫通−４の間、および膜貫通−５と膜貫通−６の間の、細胞膜の内部、すなわち、「細胞内」側のアミノ酸の鎖（これらは、それぞれ、「細胞内」領域１、２、および３（ＩＣ−１、ＩＣ−２、およびＩＣ−３）と呼ばれる）によってもまた結合されている。受容体の「カルボキシ」（「Ｃ」）末端は細胞内の細胞内空間に存在し、受容体の「アミノ」（「Ｎ」）末端は細胞の外部の細胞外空間に存在する。
一般的に、リガンドが受容体と結合するとき（しばしば、受容体の「活性化」と呼ばれる）、細胞内領域と細胞内「Ｇタンパク質」の間の結合を容易にする受容体のコンホメーションの変化が存在する。ＧＰＣＲがＧタンパク質に関して「乱交性」であること、すなわち、ＧＰＣＲが１種類より多くのＧタンパク質と相互作用し得ることが報告されてきた。Ｋｅｎａｋｉｎ、Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９８８）４３：１０９５−１１０１を参照のこと。他のＧタンパク質が存在しているが、現在、Ｇｑ、Ｇｓ、Ｇｉ、Ｇｚ、およびＧｏが同定されているＧタンパク質である。リガンドによって活性化される、Ｇタンパク質とのＧＰＣＲの結合は、シグナルカスケードプロセスを開始する（「シグナル伝達」と呼ばれる）。通常の条件下では、シグナル伝達は、最終的には、細胞活性化または細胞阻害を生じる。理論に束縛されることを望まないが、受容体のＩＣ−３ループならびにカルボキシ末端がＧタンパク質と相互作用すると考えられている。
Ｇｓ共役ＧＰＣＲは細胞内ｃＡＭＰレベルを上昇させる。Ｇｉ、Ｇｏ、またはＧｚに結合したＧＰＣＲは細胞内ｃＡＭＰレベルを低下させる。Ｇｑ−共役ＧＰＣＲは、細胞内ＩＰ３およびＣａ２＋レベルを上昇させる。
Ｇ１５もしくはＧ１６などの、ホスホリパーゼＣ経路にいくつかのクラスのＧＰＣＲを共役させるらしい乱交性のＧタンパク質［ＯｆｆｅｒｍａｎｎｓおよびＳｉｍｏｎ、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ（１９９５）２７０：１５１７５−８０］、または同じ経路、例えば、ホスホリパーゼＣ経路に多数の異なるＧＰＣＲを共役させるように設計されたキメラＧタンパク質［ＭｉｌｌｉｇａｎおよびＲｅｅｓ、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９９９）２０：１１８−２４］もまた存在する。ホスホリパーゼＣ経路に共役されたＧＰＣＲは、細胞内ＩＰ３およびＣａ２＋レベルを上昇させる。
生理的条件下では、ＧＰＣＲは、２つの異なるコンホメーション：「不活性状態」と「活性状態」の間の平衡状態で、細胞膜中に存在する。不活性状態の受容体は、生物学的応答に導くシグナル伝達を開始するために、細胞内シグナル伝達経路に連結することができない。受容体のコンホメーションを活性状態に変化させることは、シグナル伝達経路への連結を可能にし（Ｇタンパク質を介して）、そして生物学的応答を生じる。
受容体は、リガンド、または薬物のような化合物によって、活性化状態で安定化される可能性がある。受容体のアミノ酸配列に対する修飾を含むがこれに排他的に限定されない最近の発見は、受容体を活性状態のコンホメーションにあるように促進または安定化するための、リガンドまたは薬物以外の手段を提供している。これらの手段は、受容体へのリガンド結合の効果を刺激することによって、活性状態の受容体を安定化する。リガンドから独立したこのような手段による安定化は、「構成的受容体活性化」と呼ばれている。
国際公開第０１／３６４７１号パンフレット
Ｇｒｕｎｄｙら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ（２００４）１０９：４３３−４３８ Ｐｅｒｒｙら、ＢＭＪ（１９９５）３１０：５６０−５６４
ヒトＧＰＲ１０１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は配列番号１に示され；上記コードされたヒトＧＰＲ１０１ポリペプチドのアミノ酸配列は配列番号２に示される。マウスＧＰＲ１０１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は配列番号３に示され；上記コードされたマウスＧＰＲ１０１ポリペプチドのアミノ酸配列は配列番号４に示される。ラットＧＰＲ１０１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は配列番号５に示され；上記コードされたラットＧＰＲ１０１ポリペプチドのアミノ酸配列は配列番号８に示される。
意外にも、本出願人は、視床下部弓状核内のＧＰＲ１０１受容体が食欲不振誘発性ＰＯＭＣニューロンサブセットによって発現されること、および少なくとも食欲促進性ＮＰＹ／ＡｇＲＰニューロンサブセットに関してその発現が選択的であることを発見した。ＧＰＲ１０１受容体の調節因子は、ＰＯＭＣ由来生物活性ペプチドの分泌を調節し、およびＰＯＭＣ由来生物活性ペプチド関連疾患の治療において有用である。ＰＯＭＣ由来生物活性ペプチドとしては、α−メラニン細胞刺激ホルモン（α−ＭＳＨ）、β−メラニン細胞刺激ホルモン（β−ＭＳＨ）およびγ−メラニン細胞刺激ホルモン（γ−ＭＳＨ）が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明は、候補化合物をＰＯＭＣ由来生物活性ペプチドの分泌の調節因子としてスクリーニングするためにＧＰＲ１０１を使用する方法、およびＰＯＭＣ由来生物活性ペプチド関連疾患の治療における前記調節因子の使用に関する。ＧＰＲ１０１のアゴニストおよび部分アゴニストは、視床下部α−ＭＳＨ、β−ＭＳＨおよびγ−ＭＳＨ分泌を刺激し、ならびに肥満およびそれに関連した状態（２型糖尿病、インスリン抵抗性、およびメタボリック症候群を含むが、これらに限定されない）の治療および予防において有用である。ＧＰＲ１０１のアゴニストおよび部分アゴニストは、満腹を促進するのに有用である。ＧＰＲ１０１のアゴニストおよび部分アゴニストは、過食症の治療および予防において有用である。ＧＰＲ１０１のアゴニストおよび部分アゴニストは、発熱の治療および予防において有用である。ＧＰＲ１０１のアゴニストおよび部分アゴニストは、炎症関連障害の治療および予防において有用である。ＧＰＲ１０１のアゴニストおよび部分アゴニストは、体重を減少させる際、脂肪蓄積（ａｄｉｐｏｓｉｔｙ）を減少させる際、体脂肪率を減少させる際、および食事摂取量を減少させる際に有用である。ＧＰＲ１０１の逆アゴニストおよびアンタゴニストは、視床下部α−ＭＳＨ、β−ＭＳＨおよびγ−ＭＳＨ分泌を阻害し、ならびに悪液質などの疾患の治療および予防において有用である。ＧＰＲ１０１の逆アゴニストおよびアンタゴニストは、体重を増加させる際、脂肪蓄積を増加させる際、体脂肪率を増加させる際、および食事摂取量を増加させる際に有用である。
第一の態様において、本発明は、候補化合物を視床下部プロオピオメラノコルチン（ＰＯＭＣ）由来生物活性ペプチドの分泌の調節因子として同定する方法を特徴とし、この方法は、
（ａ）（ｉ）配列番号２のアミノ酸配列；
（ｉｉ）特異的プライマー配列番号７および配列番号８を使用してヒトＤＮＡサンプルに対するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅することができるポリヌクレオチドによってコードされているＧタンパク質結合受容体のアミノ酸配列；
（ｉｉｉ）配列番号４のアミノ酸配列；
（ｉｖ）配列番号６のアミノ酸配列；
（ｖ）配列番号１、配列番号３または配列番号５の相補体にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされているＧタンパク質結合受容体のアミノ酸配列；
（ｖｉ）配列番号２、配列番号４または配列番号６に対して少なくとも約７０％の同一性を有するアミノ酸配列を有するＧタンパク質結合受容体のアミノ酸配列；
（ｖｉｉ）配列番号２、配列番号４または配列番号６のアミノ酸配列の変異体を有するＧタンパク質結合受容体のアミノ酸配列；
（ｖｉｉｉ）（ｉ）から（ｖｉｉ）のうちのいずれか１つの生物活性フラグメント
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＧＰＣＲ（該受容体は、Ｇタンパクに結合する）と候補化合物を接触させる工程；および
（ｂ）前記ＧＰＣＲの機能性を阻害または刺激する前記化合物の能力を決定する工程
を含み、ここで、
前記ＧＰＣＲの機能性を阻害または刺激するその化合物の能力が、その化合物が視床下部プロオピオメラノコルチン（ＰＯＭＣ）由来生物活性ペプチドの分泌の調節因子であることの指標となる。
一定の実施形態において、前記ＧＰＣＲは、配列番号２のアミノ酸配列、または配列番号２に対して少なくとも約７０％の同一性を有するＧタンパク質結合受容体のアミノ酸配列を含む。
一定の実施形態において、前記ＰＯＭＣ由来生物活性ペプチドは、ＡＣＴＨ、β−エンドルフィン、α−ＭＳＨ、β−ＭＳＨおよびγ−ＭＳＨからなる群より選択される。ＰＯＭＣ由来生物活性ペプチドは、本発明の実施形態に個々に含まれる場合もあり、任意の組み合わせで含まれる場合もあると、明白に考えられる。
加えて、本発明は、この第一の態様の工程（ａ）および（ｂ）を含み、さらに、
（ｃ）工程（ｂ）における受容体の機能性を阻害または刺激する化合物を場合によっては合成する工程；
（ｄ）工程（ｂ）における受容体の機能性を阻害または刺激する化合物と、本発明のＧタンパク質結合受容体を発現し、ＰＯＭＣ由来生物活性ペプチドを分泌できる細胞とを、または脊椎動物視床下部細胞とを、または脊椎動物視床下部組織とをインビトロで接触させる工程；および
（ｅ）本発明のＧタンパク質結合受容体を発現し、ＰＯＭＣ由来生物活性ペプチドを分泌できる細胞からの、または脊椎動物視床下部細胞からの、または脊椎動物視床下部組織からのＰＯＭＣ由来生物活性ペプチドの分泌を、その化合物が調節するかどうかを決定する工程
を含む、候補化合物を視床下部プロオピオメラノコルチン（ＰＯＭＣ）由来生物活性ペプチドの分泌の調節因子として同定する方法を特徴とし、この場合、本発明のＧタンパク質結合受容体を発現し、ＰＯＭＣ由来生物活性ペプチドを分泌できる細胞からの、または脊椎動物視床下部細胞からの、または脊椎動物視床下部組織からのＰＯＭＣ由来生物活性ペプチドの分泌を調節するその候補化合物の能力が、その化合物がＰＯＭＣ由来生物活性ペプチドの分泌の調節因子であることの指標となる。
加えて、本発明は、この第一の態様の工程（ａ）および（ｂ）を含み、さらに、
（ｃ）工程（ｂ）における受容体の機能性を阻害または刺激する化合物を場合によっては合成する工程；
（ｄ）工程（ｂ）における受容体の機能性を阻害または刺激する化合物を脊椎動物に投与する工程；および
（ｅ）その化合物が、その脊椎動物におけるＰＯＭＣ由来生物活性ペプチドの分泌を調節するかどうかを決定する工程
を含む、候補化合物を視床下部プロオピオメラノコルチン（ＰＯＭＣ）由来生物活性ペプチドの分泌の調節因子として同定する方法を特徴とし、この場合、その脊椎動物におけるＰＯＭＣ由来生物活性ペプチドの分泌を調節するその候補化合物の能力が、その化合物がＰＯＭＣ由来生物活性ペプチドの分泌の調節因子であることの指標となる。
加えて、本発明は、この第一の態様の工程（ａ）および（ｂ）を含み、さらに、
（ｃ）工程（ｂ）における受容体の機能性を阻害または刺激する化合物を場合によっては合成する工程；
（ｄ）工程（ｂ）における受容体の機能性を阻害または刺激する化合物と、本発明のＧタンパク質結合受容体を発現し、ＰＯＭＣポリペプチドもしくはｍＲＮＡを発現できる細胞とを、または脊椎動物視床下部細胞とを、または脊椎動物視床下部組織とをインビトロで接触させる工程；および
（ｅ）本発明のＧタンパク質結合受容体を発現し、ＰＯＭＣポリペプチドもしくはｍＲＮＡを発現できる細胞における、または脊椎動物視床下部細胞における、または脊椎動物視床下部組織におけるＰＯＭＣポリペプチドまたはｍＲＮＡの発現を、その化合物が調節するかどうかを決定する工程
を含む、候補化合物を視床下部プロオピオメラノコルチン（ＰＯＭＣ）由来生物活性ペプチドの分泌の調節因子として同定する方法を特徴とし、この場合、本発明のＧタンパク質結合受容体を発現し、ＰＯＭＣポリペプチドもしくはｍＲＮＡを発現できる細胞における、または脊椎動物視床下部細胞における、または脊椎動物視床下部組織におけるＰＯＭＣポリペプチドまたはｍＲＮＡの発現を調節するその候補化合物の能力が、その化合物がＰＯＭＣ由来生物活性ペプチドの分泌の調節因子であることの指標となる。
加えて、本発明は、この第一の態様の工程（ａ）および（ｂ）を含み、さらに、
（ｃ）工程（ｂ）における受容体の機能性を阻害または刺激する化合物を場合によっては合成する工程；
（ｄ）工程（ｂ）における受容体の機能性を阻害または刺激する化合物を脊椎動物に投与する工程；および
（ｅ）その化合物が、その脊椎動物におけるＰＯＭＣポリペプチドまたはｍＲＮＡの発現を調節するかどうかを決定する工程
を含む、候補化合物を視床下部プロオピオメラノコルチン（ＰＯＭＣ）由来生物活性ペプチドの分泌の調節因子として同定する方法を特徴とし、この場合、その脊椎動物におけるＰＯＭＣポリペプチドまたはｍＲＮＡの発現を調節するその候補化合物の能力が、その化合物がＰＯＭＣ由来生物活性ペプチドの分泌の調節因子であることの指標となる。
一定の実施形態において、工程（ｅ）のＰＯＭＣ由来生物活性ペプチドは、ＡＣＴＨ、β−エンドルフィン、α−ＭＳＨ、β−ＭＳＨおよびγ−ＭＳＨからなる群より選択される。ＰＯＭＣ由来生物活性ペプチドは、本発明の実施形態に個々に含まれる場合もあり、任意の組み合わせで含まれる場合もあると、明白に考えられる。
一定の実施形態において、本発明のＧタンパク質結合受容体は、配列番号２のアミノ酸配列を有するＧタンパク質結合受容体であり、または配列番号２に対して少なくとも約７０％の同一性を有するアミノ酸配列を有する内因性もしくは非内因性Ｇタンパク質結合受容体である。
一定の実施形態において、本発明のＧタンパク質結合受容体を発現し、ＰＯＭＣ由来生物活性ペプチドを分泌できる細胞、または本発明のＧタンパク質結合受容体を発現し、ＰＯＭＣポリペプチドもしくはｍＲＮＡを発現できる細胞は、視床下部細胞、下垂体細胞、皮膚細胞または白血球である。一定の実施形態において、本発明のＧタンパク質結合受容体を発現し、ＰＯＭＣ由来生物活性ペプチドを分泌できる細胞、または本発明のＧタンパク質結合受容体を発現し、ＰＯＭＣポリペプチドもしくはｍＲＮＡを発現できる細胞は、不死化細胞である。一定の実施形態において、本発明のＧタンパク質結合受容体を発現し、ＰＯＭＣ由来生物活性ペプチドを分泌できる細胞、または本発明のＧタンパク質結合受容体を発現し、ＰＯＭＣポリペプチドもしくはｍＲＮＡを発現できる細胞は、不死化細胞でない。
一定の実施形態において、その化合物がＰＯＭＣ由来生物活性ペプチドの分泌を調節するかどうかの前記判定は、視床下部スライスアッセイを含む方法によって行われる。一定の実施形態において、前記視床下部スライスアッセイは、ラット視床下部スライスアッセイである。一定の実施形態において、前記視床下部スライスは、ＰＯＭＣニューロンを含む。一定の実施形態において、前記視床下部スライスは、ＧＰＲ１０１を含むＰＯＭＣニューロンを含む。
一定の実施形態において、前記脊椎動物視床下部組織は、哺乳動物視床下部組織である。一定の実施形態において、哺乳動物視床下部組織は、ラットまたはマウス視床下部組織などの（しかし、これらに限定されない）、非ヒト哺乳動物視床下部組織である。一定の実施形態において、前記脊椎動物視床下部組織は、ヒト視床下部組織である。
一定の実施形態において、その化合物が脊椎動物におけるＰＯＭＣ ｍＲＮＡの発現を調節するかどうかの前記判定は、インサイチュハイブリダイゼーション組織化学分析を含む方法によって行われる。一定の実施形態において、その化合物が脊椎動物におけるＰＯＭＣ ｍＲＮＡの発現を調節するかどうかの前記判定は、視床下部組織のインサイチュハイブリダイゼーション組織化学分析を含む方法によって行われる。一定の実施形態において、その化合物が脊椎動物におけるＰＯＭＣ ｍＲＮＡの発現を調節するかどうかの前記判定は、視床下部弓状核組織を含む視床下部組織のインサイチュハイブリダイゼーション組織化学分析を含む方法によって行われる。一定の実施形態において、その化合物が脊椎動物におけるＰＯＭＣ ｍＲＮＡの発現を調節するかどうかの前記判定は、視床下部組織から作製された連続切片を用いて行われるインサイチュハイブリダイゼーション組織化学分析を含む方法によって行われる。
一定の実施形態において、前記方法は、前記ＧＰＣＲのアゴニストの同定を含む。一定の実施形態において、前記方法は、前記ＧＰＣＲの部分アゴニストの同定を含む。一定の実施形態において、前記候補化合物は、肥満またはそれに関連した状態のための医薬としてスクリーニングされる。一部の実施形態において、前記肥満に関連した状態は、高血圧、うっ血性心筋症、静脈瘤、肺塞栓症、冠性心疾患、卒中、特発性頭蓋内圧亢進、異常感覚性大腿痛、呼吸困難、閉塞性睡眠時無呼吸症、低換気症候群、ピックウィック症候群、喘息、不動（ｉｍｍｏｂｉｌｉｔｙ）、変性骨関節炎、腰痛、線条萎縮すなわち「伸展裂創」、下肢の静脈うっ血、リンパ浮腫、蜂巣炎、間擦疹、癰、黒色表皮腫、懸垂線維腫、胃食道逆流障害、非アルコール性脂肪肝／脂肪性肝炎、胆石症、ヘルニア、大腸癌、緊張性失禁、肥満関連糸球体症、乳および子宮癌、うつ病および低い自己評価、生活の質の悪化、メタボリック症候群、インスリン抵抗性、２型糖尿病、異脂肪血症、アテローム性硬化症、女性の高アンドロゲン血症、多嚢胞卵巣症候群、月経困難症、不妊症、妊娠合併症、および男性性腺機能低下症からなる群より選択される。一部の実施形態において、前記肥満に関連した状態は、高血圧、インスリン抵抗性、メタボリック症候群、２型糖尿病、異脂肪血症、アテローム性硬化症、冠性心疾患、および卒中からなる群より選択される。肥満の関連した個々の状態それぞれは本発明の範囲内の独立した実施形態であると、明白に考えられる。
一定の実施形態において、前記方法は、前記ＧＰＣＲのアゴニストの同定を含む。一定の実施形態において、前記方法は、前記ＧＰＣＲの部分アゴニストの同定を含む。一定の実施形態において、前記候補化合物は、満腹を促進するための医薬としてスクリーニングされる。
一定の実施形態において、前記方法は、前記ＧＰＣＲのアゴニストの同定を含む。一定の実施形態において、前記方法は、前記ＧＰＣＲの部分アゴニストの同定を含む。一定の実施形態において、前記候補化合物は、過食症のための医薬としてスクリーニングされる。
一定の実施形態において、前記方法は、前記ＧＰＣＲのアゴニストの同定を含む。一定の実施形態において、前記方法は、前記ＧＰＣＲの部分アゴニストの同定を含む。一定の実施形態において、前記候補化合物は、発熱のための医薬としてスクリーニングされる。
一定の実施形態において、前記方法は、前記ＧＰＣＲのアゴニストの同定を含む。一定の実施形態において、前記方法は、前記ＧＰＣＲの部分アゴニストの同定を含む。一定の実施形態において、前記候補化合物は、炎症関連障害のための医薬としてスクリーニングされる。一定の実施形態において、前記炎症関連障害は、炎症性腸疾患（例えば、クローン病および潰瘍性大腸炎）、炎症性関節炎（例えば、関節リウマチおよび乾癬性関節炎）、乾癬、喘息、慢性閉塞性肺疾患、敗血症性ショック、虚血／再潅流傷害、播種性血管内凝固、アテローム性硬化症、骨粗しょう症、再狭窄、全身性エリテマトーデス、急性移植拒絶反応、心筋梗塞、膵炎、肝炎、静脈血栓症、多発性損傷、うっ血性心不全、末梢神経損傷、および脳炎症関連障害からなる群より選択される。一部の実施形態において、前記炎症関連障害は、炎症性腸疾患、炎症性関節炎、敗血症ショック、虚血／再潅流傷害、アテローム性硬化症、骨粗しょう症、再狭窄、心筋梗塞、うっ血性心不全、および脳炎症関連障害からなる群より選択される。個々の炎症関連障害それぞれは本発明の範囲内の独立した実施形態であると、明白に考えられる。一部の実施形態において、前記脳炎症関連障害は、脳の傷害または外傷、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病、プリオン関連疾患、脳虚血、ＡＩＤＳによる認知症およびアルツハイマー病からなる群より選択される。個々の脳炎症関連障害それぞれは本発明の範囲内の独立した実施形態であると、明白に考えられる。
一定の実施形態において、前記方法は、前記ＧＰＣＲのアゴニストの同定を含む。一定の実施形態において、前記方法は、前記ＧＰＣＲの部分アゴニストの同定を含む。一定の実施形態において、前記候補化合物は、体重、脂肪蓄積、体脂肪率および食事摂取量からなる群より選択されるエネルギー恒常性関連パラメータを減少させる薬剤としてスクリーニングされる。一定の実施形態において、前記候補化合物は、体重を減少させる薬剤としてスクリーニングされる。一定の実施形態において、前記候補化合物は、脂肪蓄積を減少させる薬剤としてスクリーニングされる。一定の実施形態において、前記候補化合物は、体脂肪率を減少させる薬剤としてスクリーニングされる。一定の実施形態において、前記候補化合物は、食事摂取量を減少させる薬剤としてスクリーニングされる。
一定の実施形態において、前記方法は、前記ＧＰＣＲのアゴニストの同定を含む。一定の実施形態において、前記方法は、前記ＧＰＣＲの部分アゴニストの同定を含む。一定の実施形態において、前記候補化合物は、ＰＯＭＣ由来生物活性ペプチドの分泌レベルを増加させることによって改善されるＰＯＭＣ由来生物活性ペプチド関連疾患のための医薬としてスクリーニングされる。一定の実施形態において、前記分泌レベルは、視床下部分泌レベルである。
一定の実施形態において、前記方法は、前記ＧＰＣＲの逆アゴニストの同定を含む。一定の実施形態において、前記方法は、前記ＧＰＣＲのアンタゴニストの同定を含む。一定の実施形態において、前記候補化合物は、悪液質のための医薬としてスクリーニングされる。一部の実施形態において、前記悪液質は、ＡＩＤＳ関連体重減少、癌関連体重減少および食欲不振関連体重減少からなる群より選択される。ＡＩＤＳ関連体重減少、癌関連体重減少および食欲不振関連体重減少は、本発明の範囲内の独立した実施形態であると、明白に考えられる。
一定の実施形態において、前記方法は、前記ＧＰＣＲの逆アゴニストの同定を含む。一定の実施形態において、前記方法は、前記ＧＰＣＲのアンタゴニストの同定を含む。一定の実施形態において、前記候補化合物は、体重、脂肪蓄積、体脂肪率および食事摂取量からなる群より選択されるエネルギー恒常性関連パラメータを増加させる薬剤としてスクリーニングされる。一定の実施形態において、前記候補化合物は、体重を増加させる薬剤としてスクリーニングされる。一定の実施形態において、前記候補化合物は、脂肪蓄積を増加させる薬剤としてスクリーニングされる。一定の実施形態において、前記候補化合物は、体脂肪率を増加させる薬剤としてスクリーニングされる。一定の実施形態において、前記候補化合物は、食事摂取量を増加させる薬剤としてスクリーニングされる。
一定の実施形態において、前記方法は、前記ＧＰＣＲの逆アゴニストの同定を含む。一定の実施形態において、前記方法は、前記ＧＰＣＲのアンタゴニストの同定を含む。一定の実施形態において、前記候補化合物は、ＰＯＭＣ由来生物活性ペプチドの分泌レベルを減少させることによって改善されるＰＯＭＣ由来生物活性ペプチド関連疾患のための医薬としてスクリーニングされる。一定の実施形態において、前記分泌レベルは、視床下部分泌レベルである。
一定の実施形態において、前記ＧＰＣＲの機能性を刺激する候補化合物は、視床下部ＰＯＭＣ由来生物活性ペプチドの分泌を刺激する化合物である。前記ＧＰＣＲのアゴニストおよび部分アゴニストは、視床下部ＰＯＭＣ由来生物活性ペプチドの分泌を刺激し、ならびに肥満またはそれに関連した状態のための医薬として有用である。前記ＧＰＣＲのアゴニストおよび部分アゴニストは、ＰＯＭＣ由来生物活性ペプチドを刺激し、ならびに満腹を促進するための医薬として有用である。前記ＧＰＣＲのアゴニストおよび部分アゴニストは、視床下部ＰＯＭＣ由来生物活性ペプチドの分泌を刺激し、ならびに過食症のための医薬として有用である。前記ＧＰＣＲのアゴニストおよび部分アゴニストは、視床下部ＰＯＭＣ由来生物活性ペプチドの分泌を刺激し、ならびに発熱のための医薬として有用である。前記ＧＰＣＲのアゴニストおよび部分アゴニストは、視床下部ＰＯＭＣ由来生物活性ペプチドの分泌を刺激し、ならびに炎症関連障害のための医薬として有用である。前記ＧＰＣＲのアゴニストおよび部分アゴニストは、視床下部ＰＯＭＣ由来生物活性ペプチドの分泌を刺激し、ならびに体重を減少させるための医薬として有用である。前記ＧＰＣＲのアゴニストおよび部分アゴニストは、視床下部ＰＯＭＣ由来生物活性ペプチドの分泌を刺激し、ならびに脂肪蓄積を減少させるための医薬として有用である。前記ＧＰＣＲのアゴニストおよび部分アゴニストは、視床下部ＰＯＭＣ由来生物活性ペプチドの分泌を刺激し、ならびに体脂肪率を減少させるための医薬として有用である。前記ＧＰＣＲのアゴニストおよび部分アゴニストは、視床下部ＰＯＭＣ由来生物活性ペプチドの分泌を刺激し、ならびに食事摂取量を減少させるための医薬として有用である。
一定の実施形態において、ＧＰＣＲの機能性を阻害する候補化合物は、視床下部ＰＯＭＣ由来生物活性ペプチドの分泌を阻害する化合物である。前記ＧＰＣＲの逆アゴニストおよびアンタゴニストは、視床下部ＰＯＭＣ由来生物活性ペプチドの分泌を阻害し、ならびに悪液質のための医薬として有用である。前記ＧＰＣＲの逆アゴニストおよびアンタゴニストは、視床下部ＰＯＭＣ由来生物活性ペプチドの分泌を阻害し、ならびに体重を増加させるための医薬として有用である。前記ＧＰＣＲの逆アゴニストおよびアンタゴニストは、視床下部ＰＯＭＣ由来生物活性ペプチドの分泌を阻害し、ならびに脂肪蓄積を増加させるための医薬として有用である。前記ＧＰＣＲの逆アゴニストおよびアンタゴニストは、視床下部ＰＯＭＣ由来生物活性ペプチドの分泌を阻害し、ならびに体脂肪率を増加させるための医薬として有用である。前記ＧＰＣＲの逆アゴニストおよびアンタゴニストは、視床下部ＰＯＭＣ由来生物活性ペプチドの分泌を阻害し、ならびに食事摂取量を増加させるための医薬として有用である。
一定の実施形態において、前記方法は、その候補化合物が前記受容体のアゴニストであるかどうかの判定を含む。一定の実施形態において、前記方法は、その候補化合物が、前記受容体の部分アゴニストであるかどうかの判定を含む。一定の実施形態において、前記方法は、その候補化合物が前記受容体の逆アゴニストであるかどうかの判定を含む。一定の実施形態において、前記方法は、その候補化合物が前記受容体のアンタゴニストであるかどうかの判定を含む。
一定の実施形態において、前記受容体は、組換え体である。
一定の実施形態において、前記接触は、候補化合物と、組換え型前記受容体を含む宿主細胞との、または組換え型前記受容体を含む宿主細胞の膜との接触を含む。一部の実施形態において、前記宿主細胞は、前記受容体をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む。一定の実施形態において、前記宿主細胞は、真核細胞である。一部の実施形態において、前記真核細胞は、酵母細胞である。一部の実施形態において、前記真核細胞は、メラニン保有細胞である。一部の実施形態において、前記真核細胞は、哺乳動物宿主細胞である。一部の実施形態において、前記哺乳動物細胞は、ＨＥＫ−２９３細胞、ＣＯＳ−７細胞またはＣＨＯ細胞である。
一部の実施形態において、前記判定は、前記ＧＰＣＲを含む膜を用いて行われる。一定の実施形態において、前記ＧＰＣＲを含む膜は、単離される。
一定の実施形態において、前記ＧＰＣＲは、検出可能なレベルの構成的活性を示す。一部の実施形態において、前記構成的活性は、細胞内ｃＡＭＰレベルを増加させる活性である。一部の実施形態において、前記構成的活性は、Ｇに結合するＧＰＣＲと一致して細胞内ｃＡＰＭレベルを増加させる活性である。一部の実施形態において、前記構成的活性は、メラニン保有細胞を色素分散させる活性である。
一部の実施形態において、前記接触は、前記ＧＰＣＲの公知リガンドが不在の状態で行われる。例証として、および限定としてではなく、一部の実施形態において、前記接触は、前記受容体の公知アゴニストが不在の状態で行われる。一部の実施形態において、前記同定は、直接的同定である。
一部の実施形態において、前記接触は、前記ＧＰＣＲの公知リガンドが存在する状態で行われる。一部の実施形態において、前記接触は、前記ＧＰＣＲの公知調節因子が存在する状態で行われる。一部の実施形態において、前記接触は、前記ＧＰＣＲの公知アゴニストが存在する状態で行われる。一部の実施形態において、前記ＧＰＣＲの前記公知アゴニストは、内因性ヒトＧＰＲ１０１の公知アゴニストである。前記ＧＰＣＲの公知アゴニストが存在する状態での前記接触と関連がある一部の実施形態において、前記候補化合物は、その公知アゴニストを前記ＧＰＣＲと接触させる前に、前記ＧＰＣＲと接触させる。前記ＧＰＣＲの公知アゴニストが存在する状態での前記接触と関連がある一部の実施形態において、前記候補化合物は、その公知アゴニストを前記ＧＰＣＲと接触させる数分前までの間に、前記ＧＰＣＲと接触させる。前記ＧＰＣＲの公知アゴニストが存在する状態での前記接触と関連がある一部の実施形態において、前記候補化合物は、その公知アゴニストを前記ＧＰＣＲと接触させる約５分前まで、約１０分前まで、または約３０分前までの間に、前記ＧＰＣＲと接触させる。
一定の実施形態において、前記ＰＣＲは、ゲノムＰＣＲである。一定の実施形態において、前記ヒトＤＮＡは、ヒトゲノムＤＮＡである。
一部の実施形態において、ＰＣＲは、ＲＴ−ＰＣＲである。一部の実施形態において、前記ヒトＤＮＡは、ＧＰＲ１０１を発現する組織または細胞に由来するヒトｃＤＮＡである。一部の実施形態において、前記ヒトｃＤＮＡは、脳または視床下部に由来する。一部の実施形態において、前記ヒトｃＤＮＡは、ＰＯＭＣニューロン細胞に由来する。
一部の実施形態において、特異的プライマー配列番号７および配列番号８を使用してヒトＤＮＡサンプルに対するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅することができるポリヌクレオチドによってコードされているＧタンパク質結合受容体は、内因性ＧＰＲ１０１ Ｇタンパク質結合受容体である。
一部の実施形態において、前記ＧＰＣＲは、内因性である。一部の実施形態において、前記内因性ＧＰＣＲは、脊椎動物ＧＰＣＲである。一部の実施形態において、前記内因性ＧＰＣＲは、哺乳動物ＧＰＣＲである。一部の実施形態において、前記内因性ＧＰＣＲは、ヒトＧＰＣＲである。一定の実施形態において、前記内因性脊椎動物、哺乳動物またはヒトＧＰＣＲは、ＧＰＲ１０１である。一部の実施形態において、前記ＧＰＣＲは、非内因性である。
一部の実施形態において、配列番号１、配列番号３または配列番号５の相補体にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされているＧタンパク質結合受容体は、内因性ＧＰＣＲである。一部の実施形態において、前記内因性ＧＰＣＲは、脊椎動物ＧＰＣＲである。一部の実施形態において、前記内因性ＧＰＣＲは、哺乳動物ＧＰＣＲである。一部の実施形態において、前記内因性ＧＰＣＲは、ヒトＧＰＣＲである。一定の実施形態において、前記内因性脊椎動物、哺乳動物またはヒトＧＰＣＲは、ＧＰＲ１０１である。一部の実施形態において、配列番号１、配列番号３または配列番号５の相補体にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされているＧタンパク質結合受容体は、非内因性ＧＰＣＲである。
一定の実施形態において、前記判定は、第二メッセンジャーのレベルの測定を含む方法によるものである。一部の実施形態において、前記判定は、サイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）、サイクリックＧＭＰ（ｃＧＭＰ）、イノシトール１，４，５−三リン酸（ＩＰ３）、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）、ＭＰＡキナーゼ活性、ＭＡＰＫ／ＥＲＫキナーゼ キナーゼ−１（ＭＥＫＫ１）活性、およびＣａ２＋からなる群より選択される第二メッセンジャーのレベルの測定を含む方法によるものである。一部の実施形態において、前記第二メッセンジャーは、ｃＡＭＰである。一定の実施形態において、前記第二メッセンジャーは、ｃＡＭＰである。
一定の実施形態において、前記判定は、メラニン保有細胞アッセイの使用を含む方法によるものである。一定の実施形態において、前記判定は、メラニン保有細胞色素分散レベルの測定を含む方法によるものである。
一部の実施形態において、前記判定は、ＧＰＣＲを含む膜に結合するＧＴＰγＳのレベルの測定を含む方法によるものである。
一部の実施形態において、前記判定は、ｃＡＭＰ応答性レポーターアッセイの使用を含む方法によるものである。
一部の実施形態において、前記候補化合物は、脊椎動物ＧＰＲ１０１受容体のリガンドであることが分かっている化合物ではない。一部の実施形態において、前記候補化合物は、脊椎動物ＧＰＲ１０１受容体に対するアゴニスト、部分アゴニスト、逆アゴニストまたはアンタゴニストであることが分かっている化合物ではない。一部の実施形態において、前記脊椎動物は、哺乳動物である。一部の実施形態において、前記脊椎動物は、ヒトである。
一定の実施形態において、前記候補化合物は、小分子である。一部の実施形態において、前記候補化合物は、小分子であるが、但し、その小分子がポリペプチド、抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または脂質でないことを条件とする。一部の実施形態において、前記候補化合物は、小分子であるが、但し、その小分子がポリペプチドでないことを条件とする。一部の実施形態において、前記候補化合物は、小分子であるが、但し、その小分子が抗体またはその抗原結合フラグメントでないことを条件とする。一部の実施形態において、前記候補化合物は、小分子であるが、その小分子が脂質でないことを条件とする。
一部の実施形態において、前記方法は、候補化合物に起因する前記受容体の調節と、前記受容体とその公知調節因子の接触に起因する前記受容体の第二の調節とを比較する工程をさらに含む。
一部の実施形態において、前記方法は、前記調節因子を医薬組成物に調合する工程をさらに含む。一部の実施形態において、前記調節因子は、前記ＧＰＣＲのアゴニストである。一部の実施形態において、前記調節因子は、前記ＧＰＣＲの部分アゴニストである。一部の実施形態において、前記調節因子は、前記ＧＰＣＲの逆アゴニストである。一部の実施形態において、前記調節因子は、前記ＧＰＣＲのアンタゴニストである。
一部の実施形態において、前記方法は、前記調節因子の合成をさらに含む。一部の実施形態において、前記調節因子は、前記ＧＰＣＲのアゴニストである。一部の実施形態において、前記調節因子は、前記ＧＰＣＲの部分アゴニストである。一部の実施形態において、前記調節因子は、前記ＧＰＣＲの逆アゴニストである。一部の実施形態において、前記調節因子は、前記ＧＰＣＲのアンタゴニストである。
一部の実施形態において、前記方法は、場合によっては、前記調節因子の構造を決定する工程；および前記調節因子または前記調節因子の名前もしくは構造を提供する工程をさらに含む。一部の実施形態において、前記調節因子は、前記ＧＰＣＲのアゴニストである。一部の実施形態において、前記調節因子は、前記ＧＰＣＲの部分アゴニストである。一部の実施形態において、前記調節因子は、前記ＧＰＣＲの逆アゴニストである。一部の実施形態において、前記調節因子は、前記ＧＰＣＲのアンタゴニストである。
一部の実施形態において、前記方法は、場合によっては、前記調節因子の構造を決定する工程；場合によっては、前記調節因子または前記調節因子の名前もしくは構造を提供する工程；および前記調節因子を製造または合成する工程をさらに含む。一部の実施形態において、前記調節因子は、前記ＧＰＣＲのアゴニストである。一部の実施形態において、前記調節因子は、前記ＧＰＣＲの部分アゴニストである。一部の実施形態において、前記調節因子は、前記ＧＰＣＲの逆アゴニストである。一部の実施形態において、前記調節因子は、前記ＧＰＣＲのアンタゴニストである。
第二の態様において、本発明は、第一の態様の方法に従って同定することができる調節因子を特徴とする。
一部の実施形態において、前記調節因子は、第一の態様の方法に従って同定される。
一定の実施形態において、前記調節因子は、前記ＧＰＣＲのアゴニスト、部分アゴニスト、逆アゴニスト、またはアンタゴニストである。一部の実施形態において、前記調節因子は、前記ＧＰＣＲのアゴニストである。一部の実施形態において、前記調節因子は、前記ＧＰＣＲの部分アゴニストである。一部の実施形態において、前記調節因子は、前記ＧＰＣＲの逆アゴニストである。一部の実施形態において、前記調節因子は、前記ＧＰＣＲのアンタゴニストである。一部の実施形態において、ＧＰＣＲは、脊椎動物ＧＰＲ１０１受容体である。一部の実施形態において、前記ＧＰＣＲは、哺乳動物ＧＰＲ１０１受容体である。一部の実施形態において、前記ＧＰＣＲは、ヒトＧＰＲ１０１受容体である。
一定の実施形態において、前記調節因子は、小分子である。一部の実施形態において、前記調節因子は、小分子であるが、但し、その小分子がポリペプチド、抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または脂質でないことを条件とする。一部の実施形態において、前記調節因子は、小分子であるが、但し、その小分子がポリペプチドでないことを条件とする。一部の実施形態において、前記調節因子は、小分子であるが、但し、その小分子が抗体またはその抗原結合フラグメントでないことを条件とする。一部の実施形態において、前記調節因子は、小分子であるが、その小分子が脂質でないことを条件とする。
一部の実施形態において、前記調節因子は、ヒト、マウスまたはラットＧＰＲ１０１に対して、好ましくはヒトＧＰＲ１０１に対して、約１０μＭ未満の、約１μＭ未満の、約１００ｎＭ未満の、または約１０ｎＭ未満のＥＣ５０を有するアゴニストまたは部分アゴニストである。一部の実施形態において、前記調節因子は、約１０ｎＭから１０μＭの間隔から選択される値より小さいＥＣ５０を有するアゴニストまたは部分アゴニストである。一部の実施形態において、前記調節因子は、１０ｎＭから１μＭの間隔から選択される値より小さいＥＣ５０を有するアゴニストまたは部分アゴニストである。一部の実施形態において、前記調節因子は、１０ｎＭから１００ｎＭの間隔から選択される値より小さいＥＣ５０を有するアゴニストまたは部分アゴニストである。一部の実施形態において、前記調節因子は、トランスフェクトされたＣＨＯ細胞からの膜を用いて行われるＧＴＰγＳ結合アッセイで、またはトランスフェクトされたメラニン保有細胞において行われる色素分散アッセイで、トランスフェクトされたＣＨＯ細胞においてもしくはトランスフェクトされたＣＨＯ細胞からの膜を用いて行われるｃＡＭＰアッセイで、またはトランスフェクトされた２９３細胞において行われるｃＡＭＰアッセイで、約１０μＭ未満の、約１μＭ未満の、約１００ｎＭ未満の、または約１０ｎＭ未満のＥＣ５０を有するアゴニストまたは部分アゴニストである（この場合、該トランスフェクトされたＣＨＯ細胞、または該トランスフェクトされたメラニン保有細胞、または該トランスフェクトされた２９３細胞は、配列番号２、配列番号４および配列番号６から選択されるアミノ酸配列を有する組換えＧＰＲ１０１受容体を発現する）。一部の実施形態において、前記組換えＧＰＲ１０１受容体は、配列番号２のアミノ酸配列を有する。一部の実施形態において、前記調節因子は、前記アッセイにおいて約１０μＭ未満の、約１μＭ未満の、約１００ｎＭ未満の、または約１０ｎＭ未満のＥＣ５０を有するアゴニストまたは部分アゴニストである。一部の実施形態において、前記調節因子は、前記アッセイにおいて約１０ｎＭから約１０μＭの間隔から選択される値より小さいＥＣ５０を有するアゴニストまたは部分アゴニストである。一部の実施形態において、前記調節因子は、前記アッセイにおいて約１０ｎＭから約１μＭの間隔から選択される値より小さいＥＣ５０を有するアゴニストまたは部分アゴニストである。一部の実施形態において、前記調節因子は、前記アッセイにおいて約１０ｎＭから約１００ｎＭの間隔から選択される値より小さいＥＣ５０を有するアゴニストまたは部分アゴニストである。
一部の実施形態において、前記調節因子は、ヒト、マウスまたはラットＧＰＲ１０１に対して、好ましくはヒトＧＰＲ１０１に対して、約１０μＭ未満の、約１μＭ未満の、約１００ｎＭ未満の、または約１０ｎＭ未満のＩＣ５０を有する逆アゴニストまたはアンタゴニストである。一部の実施形態において、前記調節因子は、約１０ｎＭから１０μＭの間隔から選択される値より小さいＩＣ５０を有する逆アゴニストまたはアンタゴニストである。一部の実施形態において、前記調節因子は、１０ｎＭから１μＭの間隔から選択される値より小さいＩＣ５０を有する逆アゴニストまたはアンタゴニストである。一部の実施形態において、前記調節因子は、１０ｎＭから１００ｎＭの間隔から選択される値より小さいＩＣ５０を有する逆アゴニストまたはアンタゴニストである。一部の実施形態において、前記調節因子は、トランスフェクトされたＣＨＯ細胞からの膜を用いて行われるＧＴＰγＳアッセイで、またはトランスフェクトされたメラニン保有細胞において行われる色素分散アッセイで、トランスフェクトされたＣＨＯ細胞においてもしくはトランスフェクトされたＣＨＯ細胞からの膜を用いて行われるｃＡＭＰアッセイで、またはトランスフェクトされた２９３細胞において行われるｃＡＭＰアッセイで、約１０μＭ未満の、約１μＭ未満の、約１００ｎＭ未満の、または約１０ｎＭ未満のＩＣ５０を有する逆アゴニストまたはアンタゴニストである（この場合、該トランスフェクトされたＣＨＯ細胞、または該トランスフェクトされたメラニン保有細胞、または該トランスフェクトされた２９３細胞は、配列番号２、配列番号４および配列番号６から選択されるアミノ酸配列を有する組換えＧＰＲ１０１受容体を発現する）。一部の実施形態において、前記組換えＧＰＲ１０１受容体は、配列番号２のアミノ酸配列を有する。一部の実施形態において、前記調節因子は、前記アッセイにおいて約１０μＭ未満の、約１μＭ未満の、約１００ｎＭ未満の、または約１０ｎＭ未満のＩＣ５０を有する逆アゴニストまたはアンタゴニストである。一部の実施形態において、前記調節因子は、前記アッセイにおいて約１０ｎＭから約１０μＭの間隔から選択される値より小さいＩＣ５０を有する逆アゴニストまたはアンタゴニストである。一部の実施形態において、前記調節因子は、前記アッセイにおいて約１０ｎＭから約１μＭの間隔から選択される値より小さいＩＣ５０を有する逆アゴニストまたはアンタゴニストである。一部の実施形態において、前記調節因子は、前記アッセイにおいて約１０ｎＭから約１００ｎＭの間隔から選択される値より小さいＩＣ５０を有する逆アゴニストまたはアンタゴニストである。
本発明の１つの態様において、前記ＧＰＲ１０１調節因子は、選択的ＧＰＲ１０１調節因子であり、この場合の選択的ＧＰＲ１０１調節因子は、ＧＰＲ１６１よりＧＰＲ１０１受容体に対して少なくとも約１０倍の、少なくとも約１００倍のまたは少なくとも約１０００倍の選択性を有する。
一定の実施形態において、前記調節因子は、経口活性である。
一定の実施形態において、前記調節因子は、血液脳関門を横断することができる。
第三の態様において、本発明は、脊椎動物ＧＰＲ１０１受容体の調節因子と医薬的に許容される担体とを含む医薬組成物を特徴とする。一部の実施形態において、前記脊椎動物は、哺乳動物である。一部の実施形態において、前記脊椎動物は、ヒトである。一部の実施形態において、前記ヒトＧＰＲ１０１受容体の調節因子は、配列番号２のアミノ酸配列を有するヒトＧＰＲ１０１の調節因子である。
一部の実施形態において、前記調節因子は、第二の態様によるものである。
一定の実施形態において、前記脊椎動物ＧＰＲ１０１受容体の調節因子は、前記脊椎動物ＧＰＲ１０１受容体のアゴニスト、部分アゴニスト、逆アゴニストまたはアンタゴニストである。一定の実施形態において、前記脊椎動物ＧＰＲ１０１受容体の調節因子は、前記脊椎動物ＧＰＲ１０１受容体のアゴニストである。一定の実施形態において、前記脊椎動物ＧＰＲ１０１受容体の調節因子は、前記脊椎動物ＧＰＲ１０１受容体の部分アゴニストである。一定の実施形態において、前記脊椎動物ＧＰＲ１０１受容体の調節因子は、前記脊椎動物ＧＰＲ１０１受容体の逆アゴニストである。一定の実施形態において、前記脊椎動物ＧＰＲ１０１受容体の調節因子は、前記脊椎動物ＧＰＲ１０１受容体のアンタゴニストである。
一定の実施形態において、前記調節因子は、小分子である。一部の実施形態において、前記調節因子は、小分子であるが、但し、その小分子がポリペプチド、抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または脂質でないことを条件とする。一部の実施形態において、前記調節因子は、小分子であるが、但し、その小分子がポリペプチドでないことを条件とする。一部の実施形態において、前記調節因子は、小分子であるが、但し、その小分子が抗体またはその抗原結合フラグメントでないことを条件とする。一部の実施形態において、前記調節因子は、小分子であるが、その小分子が脂質でないことを条件とする。
一部の実施形態において、前記調節因子は、ヒト、マウスまたはラットＧＰＲ１０１に対して、好ましくはヒトＧＰＲ１０１に対して、約１０μＭ未満の、約１μＭ未満の、約１００ｎＭ未満の、または約１０ｎＭ未満のＥＣ５０を有するアゴニストまたは部分アゴニストである。一部の実施形態において、前記調節因子は、約１０ｎＭから１０μＭの間隔から選択される値より小さいＥＣ５０を有するアゴニストまたは部分アゴニストである。一部の実施形態において、前記調節因子は、１０ｎＭから１μＭの間隔から選択される値より小さいＥＣ５０を有するアゴニストまたは部分アゴニストである。一部の実施形態において、前記調節因子は、１０ｎＭから１００ｎＭの間隔から選択される値より小さいＥＣ５０を有するアゴニストまたは部分アゴニストである。一部の実施形態において、前記調節因子は、トランスフェクトされたＣＨＯ細胞からの膜を用いて行われるＧＴＰγＳアッセイで、またはトランスフェクトされたメラニン保有細胞において行われる色素分散アッセイで、トランスフェクトされたＣＨＯ細胞においてもしくはトランスフェクトされたＣＨＯ細胞からの膜を用いて行われるｃＡＭＰアッセイで、またはトランスフェクトされた２９３細胞において行われるｃＡＭＰアッセイで、約１０μＭ未満の、約１μＭ未満の、約１００ｎＭ未満の、または約１０ｎＭ未満のＥＣ５０を有するアゴニストまたは部分アゴニストである（この場合、該トランスフェクトされたＣＨＯ細胞、または該トランスフェクトされたメラニン保有細胞、または該トランスフェクトされた２９３細胞は、配列番号２、配列番号４および配列番号６から選択されるアミノ酸配列を有する組換えＧＰＲ１０１受容体を発現する）。一部の実施形態において、前記組換えＧＰＲ１０１受容体は、配列番号２のアミノ酸配列を有する。一部の実施形態において、前記調節因子は、前記アッセイにおいて約１０μＭ未満の、約１μＭ未満の、約１００ｎＭ未満の、または約１０ｎＭ未満のＥＣ５０を有するアゴニストまたは部分アゴニストである。一部の実施形態において、前記調節因子は、前記アッセイにおいて約１０ｎＭから約１０μＭの間隔から選択される値より小さいＥＣ５０を有するアゴニストまたは部分アゴニストである。一部の実施形態において、前記調節因子は、前記アッセイにおいて約１０ｎＭから約１μＭの間隔から選択される値より小さいＥＣ５０を有するアゴニストまたは部分アゴニストである。一部の実施形態において、前記調節因子は、前記アッセイにおいて約１０ｎＭから約１００ｎＭの間隔から選択される値より小さいＥＣ５０を有するアゴニストまたは部分アゴニストである。
一部の実施形態において、前記調節因子は、ヒト、マウスまたはラットＧＰＲ１０１に対して、好ましくはヒトＧＰＲ１０１に対して、約１０μＭ未満の、約１μＭ未満の、約１００ｎＭ未満の、または約１０ｎＭ未満のＩＣ５０を有する逆アゴニストまたはアンタゴニストである。一部の実施形態において、前記調節因子は、約１０ｎＭから１０μＭの間隔から選択される値より小さいＩＣ５０を有する逆アゴニストまたはアンタゴニストである。一部の実施形態において、前記調節因子は、約１０ｎＭから１μＭの間隔から選択される値より小さいＩＣ５０を有する逆アゴニストまたはアンタゴニストである。一部の実施形態において、前記調節因子は、約１０ｎＭから１００ｎＭの間隔から選択される値より小さいＩＣ５０を有する逆アゴニストまたはアンタゴニストである。一部の実施形態において、前記調節因子は、トランスフェクトされたＣＨＯ細胞からの膜を用いて行われるＧＴＰγＳ結合アッセイで、またはトランスフェクトされたメラニン保有細胞において行われる色素分散アッセイで、トランスフェクトされたＣＨＯ細胞においてもしくはトランスフェクトされたＣＨＯ細胞からの膜を用いて行われるｃＡＭＰアッセイで、またはトランスフェクトされた２９３細胞において行われるｃＡＭＰアッセイで、約１０μＭ未満の、約１μＭ未満の、約１００ｎＭ未満の、または約１０ｎＭ未満のＩＣ５０を有する逆アゴニストまたはアンタゴニストである（この場合、該トランスフェクトされたＣＨＯ細胞、または該トランスフェクトされたメラニン保有細胞、または該トランスフェクトされた２９３細胞は、配列番号２、配列番号４および配列番号６から選択されるアミノ酸配列を有する組換えＧＰＲ１０１受容体を発現する）。一部の実施形態において、前記組換えＧＰＲ１０１受容体は、配列番号２のアミノ酸配列を有する。一部の実施形態において、前記調節因子は、前記アッセイにおいて約１０μＭ未満の、約１μＭ未満の、約１００ｎＭ未満の、または約１０ｎＭ未満のＩＣ５０を有する逆アゴニストまたはアンタゴニストである。一部の実施形態において、前記調節因子は、前記アッセイにおいて約１０ｎＭから約１０μＭの間隔から選択される値より小さいＩＣ５０を有する逆アゴニストまたはアンタゴニストである。一部の実施形態において、前記調節因子は、前記アッセイにおいて約１０ｎＭから約１μＭの間隔から選択される値より小さいＩＣ５０を有する逆アゴニストまたはアンタゴニストである。一部の実施形態において、前記調節因子は、前記アッセイにおいて約１０ｎＭから約１００ｎＭの間隔から選択される値より小さいＩＣ５０を有する逆アゴニストまたはアンタゴニストである。
本発明の１つの態様において、前記ＧＰＲ１０１調節因子は、選択的ＧＰＲ１０１調節因子であり、この場合の選択的ＧＰＲ１０１調節因子は、ＧＰＲ１６１よりＧＰＲ１０１受容体に対して少なくとも約１０倍の、少なくとも約１００倍のまたは少なくとも約１０００倍の選択性を有する。
一定の実施形態において、前記調節因子は、経口活性である。
一定の実施形態において、前記調節因子は、血液脳関門を横断することができる。
第四の態様において、本発明は、脊椎動物ＧＰＲ１０１受容体の調節因子と医薬的に許容される担体とを混合することを含む、医薬組成物の作製方法を特徴とする。一部の実施形態において、前記脊椎動物は、哺乳動物である。一部の実施形態において、前記脊椎動物は、ヒトである。一部の実施形態において、前記ヒトＧＰＲ１０１受容体の調節因子は、配列番号２のアミノ酸配列を有するヒトＧＰＲ１０１の調節因子である。
一部の実施形態において、前記調節因子は、第二の態様によるものである。
一定の実施形態において、前記脊椎動物ＧＰＲ１０１受容体の調節因子は、前記脊椎動物ＧＰＲ１０１受容体のアゴニスト、部分アゴニスト、逆アゴニストまたはアンタゴニストである。一定の実施形態において、前記脊椎動物ＧＰＲ１０１受容体の調節因子は、前記脊椎動物ＧＰＲ１０１受容体のアゴニストである。一定の実施形態において、前記脊椎動物ＧＰＲ１０１受容体の調節因子は、前記脊椎動物ＧＰＲ１０１受容体の部分アゴニストである。一定の実施形態において、前記脊椎動物ＧＰＲ１０１受容体の調節因子は、前記脊椎動物ＧＰＲ１０１受容体の逆アゴニストである。一定の実施形態において、前記脊椎動物ＧＰＲ１０１受容体の調節因子は、前記脊椎動物ＧＰＲ１０１受容体のアンタゴニストである。
一定の実施形態において、前記調節因子は、小分子である。一部の実施形態において、前記調節因子は、小分子であるが、但し、その小分子がポリペプチド、抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または脂質でないことを条件とする。一部の実施形態において、前記調節因子は、小分子であるが、但し、その小分子がポリペプチドでないことを条件とする。一部の実施形態において、前記調節因子は、小分子であるが、但し、その小分子が抗体またはその抗原結合フラグメントでないことを条件とする。一部の実施形態において、前記調節因子は、小分子であるが、その小分子が脂質でないことを条件とする。
一部の実施形態において、前記調節因子は、ヒト、マウスまたはラットＧＰＲ１０１に対して、好ましくはヒトＧＰＲ１０１に対して、約１０μＭ未満の、約１μＭ未満の、約１００ｎＭ未満の、または約１０ｎＭ未満のＥＣ５０を有するアゴニストまたは部分アゴニストである。一部の実施形態において、前記調節因子は、約１０ｎＭから１０μＭの間隔から選択される値より小さいＥＣ５０を有するアゴニストまたは部分アゴニストである。一部の実施形態において、前記調節因子は、１０ｎＭから１μＭの間隔から選択される値より小さいＥＣ５０を有するアゴニストまたは部分アゴニストである。一部の実施形態において、前記調節因子は、１０ｎＭから１００ｎＭの間隔から選択される値より小さいＥＣ５０を有するアゴニストまたは部分アゴニストである。一部の実施形態において、前記調節因子は、トランスフェクトされたＣＨＯ細胞からの膜を用いて行われるＧＴＰγＳ結合アッセイで、またはトランスフェクトされたメラニン保有細胞において行われる色素分散アッセイで、トランスフェクトされたＣＨＯ細胞においてもしくはトランスフェクトされたＣＨＯ細胞からの膜を用いて行われるｃＡＭＰアッセイで、またはトランスフェクトされた２９３細胞において行われるｃＡＭＰアッセイで、約１０μＭ未満の、約１μＭ未満の、約１００ｎＭ未満の、または約１０ｎＭ未満のＥＣ５０を有するアゴニストまたは部分アゴニストである（この場合、該トランスフェクトされたＣＨＯ細胞、または該トランスフェクトされたメラニン保有細胞、または該トランスフェクトされた２９３細胞は、配列番号２、配列番号４および配列番号６から選択されるアミノ酸配列を有する組換えＧＰＲ１０１受容体を発現する）。一部の実施形態において、前記組換えＧＰＲ１０１受容体は、配列番号２のアミノ酸配列を有する。一部の実施形態において、前記調節因子は、前記アッセイにおいて約１０μＭ未満の、約１μＭ未満の、約１００ｎＭ未満の、または約１０ｎＭ未満のＥＣ５０を有するアゴニストまたは部分アゴニストである。一部の実施形態において、前記調節因子は、前記アッセイにおいて約１０ｎＭから約１０μＭの間隔から選択される値より小さいＥＣ５０を有するアゴニストまたは部分アゴニストである。一部の実施形態において、前記調節因子は、前記アッセイにおいて約１０ｎＭから約１μＭの間隔から選択される値より小さいＥＣ５０を有するアゴニストまたは部分アゴニストである。一部の実施形態において、前記調節因子は、前記アッセイにおいて約１０ｎＭから約１００ｎＭの間隔から選択される値より小さいＥＣ５０を有するアゴニストまたは部分アゴニストである。
一部の実施形態において、前記調節因子は、ヒト、マウスまたはラットＧＰＲ１０１に対して、好ましくはヒトＧＰＲ１０１に対して、約１０μＭ未満の、約１μＭ未満の、約１００ｎＭ未満の、または約１０ｎＭ未満のＩＣ５０を有する逆アゴニストまたはアンタゴニストである。一部の実施形態において、前記調節因子は、約１０ｎＭから１０μＭの間隔から選択される値より小さいＩＣ５０を有する逆アゴニストまたはアンタゴニストである。一部の実施形態において、前記調節因子は、約１０ｎＭから１μＭの間隔から選択される値より小さいＩＣ５０を有する逆アゴニストまたはアンタゴニストである。一部の実施形態において、前記調節因子は、約１０ｎＭから１００ｎＭの間隔から選択される値より小さいＩＣ５０を有する逆アゴニストまたはアンタゴニストである。一部の実施形態において、前記調節因子は、トランスフェクトされたＣＨＯ細胞からの膜を用いて行われるＧＴＰγＳ結合アッセイで、またはトランスフェクトされたメラニン保有細胞において行われる色素分散アッセイで、トランスフェクトされたＣＨＯ細胞においてもしくはトランスフェクトされたＣＨＯ細胞からの膜を用いて行われるｃＡＭＰアッセイで、またはトランスフェクトされた２９３細胞において行われるｃＡＭＰアッセイで、約１０μＭ未満の、約１μＭ未満の、約１００ｎＭ未満の、または約１０ｎＭ未満のＩＣ５０を有する逆アゴニストまたはアンタゴニストである（この場合、該トランスフェクトされたＣＨＯ細胞、または該トランスフェクトされたメラニン保有細胞、または該トランスフェクトされた２９３細胞は、配列番号２、配列番号４および配列番号６から選択されるアミノ酸配列を有する組換えＧＰＲ１０１受容体を発現する）。一部の実施形態において、前記組換えＧＰＲ１０１受容体は、配列番号２のアミノ酸配列を有する。一部の実施形態において、前記調節因子は、前記アッセイにおいて約１０μＭ未満の、約１μＭ未満の、約１００ｎＭ未満の、または約１０ｎＭ未満のＩＣ５０を有する逆アゴニストまたはアンタゴニストである。一部の実施形態において、前記調節因子は、前記アッセイにおいて約１０ｎＭから約１０μＭの間隔から選択される値より小さいＩＣ５０を有する逆アゴニストまたはアンタゴニストである。一部の実施形態において、前記調節因子は、前記アッセイにおいて約１０ｎＭから約１μＭの間隔から選択される値より小さいＩＣ５０を有する逆アゴニストまたはアンタゴニストである。一部の実施形態において、前記調節因子は、前記アッセイにおいて約１０ｎＭから約１００ｎＭの間隔から選択される値より小さいＩＣ５０を有する逆アゴニストまたはアンタゴニストである。
本発明の１つの態様において、前記ＧＰＲ１０１調節因子は、選択的ＧＰＲ１０１調節因子であり、この場合の選択的ＧＰＲ１０１調節因子は、ＧＰＲ１６１よりＧＰＲ１０１受容体に対して少なくとも約１０倍の、少なくとも約１００倍のまたは少なくとも約１０００倍の選択性を有する。
一定の実施形態において、前記調節因子は、経口活性である。
一定の実施形態において、前記調節因子は、血液脳関門を横断することができる。
第五の態様において、本発明は、視床下部プロオピオメラノコルチン（ＰＯＭＣ）由来生物活性ペプチドの分泌を増加させる方法を特徴とし、この方法は、その必要がある脊椎動物に、脊椎動物ＧＰＲ１０１の調節因子のまたは該調節因子と医薬的に許容される担体とを含む医薬組成物の治療有効量を投与することを含む。
本発明は、ＰＯＭＣ由来生物活性ペプチドの分泌レベルを増加させることによって改善されるＰＯＭＣ由来生物活性ペプチド関連疾患を治療または予防する方法も提供し、この方法は、その必要がある脊椎動物に、脊椎動物ＧＰＲ１０１の調節因子のまたは該調節因子と医薬的に許容される担体とを含む医薬組成物の治療有効量を投与することを含む。一定の実施形態において、前記分泌レベルは、視床下部分泌レベルである。
本発明は、肥満またはそれに関連した状態を治療または予防する方法にも関し、この方法は、その必要がある脊椎動物に、脊椎動物ＧＰＲ１０１の調節因子のまたは該調節因子と医薬的に許容される担体とを含む医薬組成物の治療有効量を投与することを含む。一部の実施形態において、前記肥満に関連した状態は、高血圧、うっ血性心筋症、静脈瘤、肺塞栓症、冠性心疾患、卒中、特発性頭蓋内圧亢進、異常感覚性大腿痛、呼吸困難、閉塞性睡眠時無呼吸症、低換気症候群、ピックウィック症候群、喘息、不動、変性骨関節炎、腰痛、線条萎縮すなわち「伸展裂創」、下肢の静脈うっ血、リンパ浮腫、蜂巣炎、間擦疹、癰、黒色表皮腫、懸垂線維腫、胃食道逆流障害、非アルコール性脂肪肝／脂肪性肝炎、胆石症、ヘルニア、大腸癌、緊張性失禁、肥満関連糸球体症、乳および子宮癌、うつ病および低い自己評価、生活の質の悪化、メタボリック症候群、インスリン抵抗性、２型糖尿病、異脂肪血症、アテロー性硬化症、女性の高アンドロゲン血症、多嚢胞卵巣症候群、月経困難症、不妊症、妊娠合併症、および男性性腺機能低下症からなる群より選択される。一部の実施形態において、前記肥満に関連した状態は、高血圧、インスリン抵抗性、メタボリック症候群、２型糖尿病、異脂肪血症、アテローム性硬化症、冠性心疾患、および卒中からなる群より選択される。肥満の関連した個々の状態それぞれは本発明の範囲内の独立した実施形態であると、明白に考えられる。
本発明は、満腹を促進する方法にも関し、この方法は、その必要がある脊椎動物に、脊椎動物ＧＰＲ１０１の調節因子のまたは該調節因子と医薬的に許容される担体とを含む医薬組成物の治療有効量を投与することを含む。一定の実施形態において、前記脊椎動物は、肥満である。一定の実施形態において、前記脊椎動物は、過体重である。
本発明は、過食症を治療または予防する方法にも関し、この方法は、その必要がある脊椎動物に、脊椎動物ＧＰＲ１０１の調節因子のまたは該調節因子と医薬的に許容される担体とを含む医薬組成物の治療有効量を投与することを含む。一定の実施形態において、前記脊椎動物は、肥満である。一定の実施形態において、前記脊椎動物は、過体重である。
本発明は、発熱を治療または予防する方法にも関し、この方法は、その必要がある脊椎動物に、脊椎動物ＧＰＲ１０１の調節因子のまたは該調節因子と医薬的に許容される担体とを含む医薬組成物の治療有効量を投与することを含む。
本発明は、炎症関連障害を治療または予防する方法にも関する。一定の実施形態において、前記炎症関連障害は、炎症性腸疾患（例えば、クローン病および潰瘍性大腸炎）、炎症性関節炎（例えば、関節リウマチおよび乾癬性関節炎）、乾癬、喘息、慢性閉塞性肺疾患、敗血症性ショック、虚血／再潅流傷害、播種性血管内凝固、アテローム性硬化症、骨粗しょう症、再狭窄、全身性エリテマトーデス、急性移植拒絶反応、心筋梗塞、膵炎、肝炎、静脈血栓症、多発性損傷、うっ血性心不全、末梢神経損傷、および脳炎症関連障害からなる群より選択される。一部の実施形態において、前記炎症関連障害は、炎症性腸疾患、炎症性関節炎、敗血症ショック、虚血／再潅流傷害、アテローム性硬化症、骨粗しょう症、再狭窄、心筋梗塞、うっ血性心不全、および脳炎症関連障害からなる群より選択される。個々の炎症関連障害それぞれは本発明の範囲内の独立した実施形態であると、明白に考えられる。一部の実施形態において、前記脳炎症関連障害は、脳の傷害または外傷、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病、プリオン関連疾患、脳虚血、ＡＩＤＳによる認知症およびアルツハイマー病からなる群より選択される。個々の脳炎症関連障害それぞれは本発明の範囲内の独立した実施形態であると、明白に考えられる。
本発明は、体重を減少させる方法にも関し、この方法は、その必要がある脊椎動物に、脊椎動物ＧＰＲ１０１の調節因子のまたは該調節因子と医薬的に許容される担体とを含む医薬組成物の治療有効量を投与することを含む。一定の実施形態において、前記脊椎動物は、肥満である。一定の実施形態において、前記脊椎動物は、過体重である。
本発明は、脂肪蓄積を減少させる方法にも関し、この方法は、その必要がある脊椎動物に、脊椎動物ＧＰＲ１０１の調節因子のまたは該調節因子と医薬的に許容される担体とを含む医薬組成物の治療有効量を投与することを含む。一定の実施形態において、前記脊椎動物は、肥満である。一定の実施形態において、前記脊椎動物は、過体重である。
本発明は、体脂肪率を減少させる方法にも関し、この方法は、その必要がある脊椎動物に、脊椎動物ＧＰＲ１０１の調節因子のまたは該調節因子と医薬的に許容される担体とを含む医薬組成物の治療有効量を投与することを含む。一定の実施形態において、前記脊椎動物は、肥満である。一定の実施形態において、前記脊椎動物は、過体重である。
本発明は、食事摂取量を減少させる方法にも関し、この方法は、その必要がある脊椎動物に、脊椎動物ＧＰＲ１０１の調節因子のまたは該調節因子と医薬的に許容される担体とを含む医薬組成物の治療有効量を投与することを含む。一定の実施形態において、前記脊椎動物は、肥満である。一定の実施形態において、前記脊椎動物は、過体重である。
一定の実施形態において、前記脊椎動物は、哺乳動物である。一定の実施形態において、前記脊椎動物は、ヒトである。一部の実施形態において、前記ヒトＧＰＲ１０１受容体の調節因子は、配列番号２のアミノ酸配列を有するヒトＧＰＲ１０１の調節因子である。
一部の実施形態において、前記調節因子は、第二の態様によるものである。
一定の実施形態において、前記調節因子は、アゴニストである。一部の実施形態において、前記調節因子は、部分アゴニストである。
一定の実施形態において、前記調節因子は、小分子である。一部の実施形態において、前記調節因子は、小分子であるが、但し、その小分子がポリペプチド、抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または脂質でないことを条件とする。一部の実施形態において、前記調節因子は、小分子であるが、但し、その小分子がポリペプチドでないことを条件とする。一部の実施形態において、前記調節因子は、小分子であるが、但し、その小分子が抗体またはその抗原結合フラグメントでないことを条件とする。一部の実施形態において、前記調節因子は、小分子であるが、その小分子が脂質でないことを条件とする。
一部の実施形態において、前記調節因子は、ヒト、マウスまたはラットＧＰＲ１０１に対して、好ましくはヒトＧＰＲ１０１に対して、約１０μＭ未満の、約１μＭ未満の、約１００ｎＭ未満の、または約１０ｎＭ未満のＥＣ５０を有するアゴニストまたは部分アゴニストである。一部の実施形態において、前記調節因子は、約１０ｎＭから１０μＭの間隔から選択される値より小さいＥＣ５０を有するアゴニストまたは部分アゴニストである。一部の実施形態において、前記調節因子は、１０ｎＭから１μＭの間隔から選択される値より小さいＥＣ５０を有するアゴニストまたは部分アゴニストである。一部の実施形態において、前記調節因子は、１０ｎＭから１００ｎＭの間隔から選択される値より小さいＥＣ５０を有するアゴニストまたは部分アゴニストである。一部の実施形態において、前記調節因子は、トランスフェクトされたＣＨＯ細胞からの膜を用いて行われるＧＴＰγＳ結合アッセイで、またはトランスフェクトされたメラニン保有細胞において行われる色素分散アッセイで、トランスフェクトされたＣＨＯ細胞においてもしくはトランスフェクトされたＣＨＯ細胞からの膜を用いて行われるｃＡＭＰアッセイで、またはトランスフェクトされた２９３細胞において行われるｃＡＭＰアッセイで、約１０μＭ未満の、約１μＭ未満の、約１００ｎＭ未満の、または約１０ｎＭ未満のＥＣ５０を有するアゴニストまたは部分アゴニストである（この場合、該トランスフェクトされたＣＨＯ細胞、または該トランスフェクトされたメラニン保有細胞、または該トランスフェクトされた２９３細胞は、配列番号２、配列番号４および配列番号６から選択されるアミノ酸配列を有する組換えＧＰＲ１０１受容体を発現する）。一部の実施形態において、前記組換えＧＰＲ１０１受容体は、配列番号２のアミノ酸配列を有する。一部の実施形態において、前記調節因子は、前記アッセイにおいて約１０μＭ未満の、約１μＭ未満の、約１００ｎＭ未満の、または約１０ｎＭ未満のＥＣ５０を有するアゴニストまたは部分アゴニストである。一部の実施形態において、前記調節因子は、前記アッセイにおいて約１０ｎＭから約１０μＭの間隔から選択される値より小さいＥＣ５０を有するアゴニストまたは部分アゴニストである。一部の実施形態において、前記調節因子は、前記アッセイにおいて約１０ｎＭから約１μＭの間隔から選択される値より小さいＥＣ５０を有するアゴニストまたは部分アゴニストである。一部の実施形態において、前記調節因子は、前記アッセイにおいて約１０ｎＭから約１００ｎＭの間隔から選択される値より小さいＥＣ５０を有するアゴニストまたは部分アゴニストである。
本発明の１つの態様において、前記ＧＰＲ１０１調節因子は、選択的ＧＰＲ１０１調節因子であり、この場合の選択的ＧＰＲ１０１調節因子は、ＧＰＲ１６１よりＧＰＲ１０１受容体に対して少なくとも約１０倍の、少なくとも約１００倍のまたは少なくとも約１０００倍の選択性を有する。
一定の実施形態において、前記調節因子は、経口活性である。
一定の実施形態において、前記調節因子は、血液脳関門を横断することができる。
第六の態様において、本発明は、視床下部プロオピオメラノコルチン（ＰＯＭＣ）由来生物活性ペプチドの分泌を減少させる方法を特徴とし、この方法は、その必要がある脊椎動物に、脊椎動物ＧＰＲ１０１の調節因子のまたは該調節因子と医薬組成物とを含む医薬組成物の治療有効量を投与することを含む。
本発明は、ＰＯＭＣ由来生物活性ペプチドの分泌レベルを減少させることによって改善されるＰＯＭＣ由来生物活性ペプチド関連疾患を治療または予防する方法も提供し、この方法は、その必要がある脊椎動物に、脊椎動物ＧＰＲ１０１の調節因子のまたは該調節因子と医薬的に許容される担体とを含む医薬組成物の治療有効量を投与することを含む。一定の実施形態において、前記分泌レベルは、視床下部分泌レベルである。
本発明は、悪液質を治療または予防する方法にも関する。一部の実施形態において、前記悪液質は、ＡＩＤＳ関連体重減少、癌関連体重減少および食欲不振関連体重減少からなる群より選択される。ＡＩＤＳ関連体重減少、癌関連体重減少および食欲不振関連体重減少は、本発明の範囲内の独立した実施形態であると、明白に考えられる。
本発明は、体重を増加させる方法にも関し、この方法は、その必要がある脊椎動物に、脊椎動物ＧＰＲ１０１の調節因子のまたは該調節因子と医薬的に許容される担体とを含む医薬組成物の治療有効量を投与することを含む。
本発明は、脂肪蓄積を増加させる方法にも関し、この方法は、その必要がある脊椎動物に、脊椎動物ＧＰＲ１０１の調節因子のまたは該調節因子と医薬的に許容される担体とを含む医薬組成物の治療有効量を投与することを含む。
本発明は、体脂肪率を増加させる方法にも関し、この方法は、その必要がある脊椎動物に、脊椎動物ＧＰＲ１０１の調節因子のまたは該調節因子と医薬的に許容される担体とを含む医薬組成物の治療有効量を投与することを含む。
本発明は、食事摂取量を増加させる方法にも関し、この方法は、その必要がある脊椎動物に、脊椎動物ＧＰＲ１０１の調節因子のまたは該調節因子と医薬的に許容される担体とを含む医薬組成物の治療有効量を投与することを含む。
一定の実施形態において、前記脊椎動物は、哺乳動物である。一定の実施形態において、前記脊椎動物は、ヒトである。一部の実施形態において、前記ヒトＧＰＲ１０１受容体の調節因子は、配列番号２のアミノ酸配列を有するヒトＧＰＲ１０１の調節因子である。
一部の実施形態において、前記調節因子は、第二の態様によるものである。
一定の実施形態において、前記調節因子は、逆アゴニストである。一部の実施形態において、前記調節因子は、アンタゴニストである。
一定の実施形態において、前記調節因子は、小分子である。一部の実施形態において、前記調節因子は、小分子であるが、但し、その小分子がポリペプチド、抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または脂質でないことを条件とする。一部の実施形態において、前記調節因子は、小分子であるが、但し、その小分子がポリペプチドでないことを条件とする。一部の実施形態において、前記調節因子は、小分子であるが、但し、その小分子が抗体またはその抗原結合フラグメントでないことを条件とする。一部の実施形態において、前記調節因子は、小分子であるが、その小分子が脂質でないことを条件とする。
ある実施形態において、調節因子は、ヒト、マウス、またはラットのＧＰＲ１０１、好ましくはヒトＧＰＲ１０１に対して、約１０μＭ未満、約１μＭ未満、約１００ｎＭ未満、または約１０ｎＭ未満のＩＣ５０を有する逆アゴニストまたはアンタゴニストである。ある実施形態において、調節因子は、約１０ｎＭから１０μＭまでの間隔から選択される値未満のＩＣ５０を有する逆アゴニストまたはアンタゴニストである。ある実施形態において、調節因子は、約１０ｎＭから１μＭまでの間隔から選択される値未満のＩＣ５０を有する逆アゴニストまたはアンタゴニストである。ある実施形態において、調節因子は、約１０ｎＭから１００ｎＭまでの間隔から選択される値未満のＩＣ５０を有する逆アゴニストまたはアンタゴニストである。ある実施形態において、調節因子は、トランスフェクトされたＣＨＯ細胞からの膜を用いて実行されるＧＴＰγＳ結合アッセイにおいて、またはトランスフェクトされたメラニン保有細胞中で実行される色素分散アッセイにおいて、またはトランスフェクトされたＣＨＯ細胞もしくはトランスフェクトされたＣＨＯ細胞からの膜を用いて実行されるｃＡＭＰアッセイまたはトランスフェクトされた２９３細胞中で実行されるｃＡＭＰアッセイにおいて、約１０μＭ未満、約１μＭ未満、約１００ｎＭ未満、または約１０ｎＭ未満のＩＣ５０を有する逆アゴニストまたはアンタゴニストであり、ここで、トランスフェクトされたＣＨＯ細胞、またはトランスフェクトされたメラニン保有細胞、またはトランスフェクトされた２９３細胞は、配列番号２、配列番号４、および配列番号６から選択されるアミノ酸配列を有する組換えＧＰＲ１０１受容体を発現する。ある実施形態において、組換えＧＰＲ１０１受容体は、配列番号２のアミノ酸配列を有する。ある実施形態において、調節因子は、上記のアッセイにおいて、約１０μＭ未満、約１μＭ未満、約１００ｎＭ未満、または約１０ｎＭ未満のＩＣ５０を有する逆アゴニストまたはアンタゴニストである。ある実施形態において、調節因子は、上記のアッセイにおいて、約１０ｎＭから１０μＭまでの間隔から選択される値未満のＩＣ５０を有する逆アゴニストまたはアンタゴニストである。ある実施形態において、調節因子は、上記のアッセイにおいて、約１０ｎＭから１μＭまでの間隔から選択される値未満のＩＣ５０を有する逆アゴニストまたはアンタゴニストである。ある実施形態において、調節因子は、上記のアッセイにおいて、約１０ｎＭから１００ｎＭまでの間隔から選択される値未満のＩＣ５０を有する逆アゴニストまたはアンタゴニストである。
本発明の１つの態様において、前記ＧＰＲ１０１調節因子は、選択的ＧＰＲ１０１調節因子であり、この場合の選択的ＧＰＲ１０１調節因子は、ＧＰＲ１６１よりＧＰＲ１０１受容体に対して少なくとも約１０倍の、少なくとも約１００倍のまたは少なくとも約１０００倍の選択性を有する。
一定の実施形態において、前記調節因子は、経口活性である。
一定の実施形態において、前記調節因子は、血液脳関門を横断することができる。
第七の態様において、本発明は、プロオピオメラノコルチン（ＰＯＭＣ）由来生物活性ペプチドの分泌を増加させるための薬物の製造における脊椎動物ＧＰＲ１０１の調節因子の使用を特徴とする。一部の実施形態において、本発明は、脊椎動物においてプロオピオメラノコルチン（ＰＯＭＣ）由来生物活性ペプチドの分泌を増加させるための薬物の製造における脊椎動物ＧＰＲ１０１の調節因子の使用を特徴とする。
本発明は、ＰＯＭＣ由来生物活性ペプチドの分泌レベルを増加させることによって改善されるＰＯＭＣ由来生物活性ペプチド関連疾患を治療または予防するための薬物の製造における脊椎動物ＧＰＲ１０１の調節因子の使用にも関する。一部の実施形態において、本発明は、脊椎動物においてＰＯＭＣ由来生物活性ペプチドの分泌レベルを増加させることによって改善されるＰＯＭＣ由来生物活性ペプチド関連疾患を治療または予防するための薬物の製造における脊椎動物ＧＰＲ１０１の調節因子の使用に関する。一定の実施形態において、前記分泌レベルは、視床下部分泌レベルである。
本発明は、肥満またはそれに関連した状態を治療または予防するための薬物の製造における脊椎動物ＧＰＲ１０１の調節因子の使用にも関する。ある実施形態において、肥満に関連する状態は以下からなる群より選択される：高血圧、うっ血性心筋症、静脈瘤、肺塞栓症、冠性心疾患、脳卒中、特発性頭蓋内高血圧症、知覚異常性大腿神経痛、呼吸困難、閉塞性睡眠時無呼吸、低換気症候群、ピックウィック症候群、喘息、不動、変形性関節症、腰痛、線条萎縮すなわち「伸展裂創」、脚の静脈うっ滞、リンパ浮腫、蜂巣炎、間擦疹、癰、黒色表皮症、軟性線維腫、胃食道逆流障害、非アルコール性脂肪肝／脂肪性肝炎、胆石症、ヘルニア、結腸癌、緊張性尿失禁、肥満関連糸球体症、乳癌および子宮癌、うつ病および低い自己評価、損なわれた生活の質、メタボリック症候群、インスリン抵抗性、２型糖尿病、異脂肪血症、アテローム性動脈硬化症、女性の高アンドロゲン血症、多嚢胞性卵巣症候群、月経困難症、不妊症、妊娠合併症、および男性の性腺機能低下症。ある実施形態において、肥満に関連する状態は、高血圧、インスリン抵抗性、メタボリック症候群、２型糖尿病、異脂肪血症、アテローム性動脈硬化症、冠性心疾患、および脳卒中からなる群より選択される。脂肪に関連した個々の状態それぞれは本発明の範囲内の独立した実施形態であると、明白に考えられる。一部の実施形態において、本発明は、脊椎動物において肥満またはそれに関連した状態を治療または予防するための薬物の製造における脊椎動物ＧＰＲ１０１の調節因子の使用に関する。
本発明は、満腹を促進するための薬物の製造における脊椎動物ＧＰＲ１０１の調節因子の使用にも関する。一部の実施形態において、本発明は、脊椎動物において満腹を促進するための薬物の製造における脊椎動物ＧＰＲ１０１の調節因子の使用に関する。
本発明は、過食症を治療または予防するための薬物の製造における脊椎動物ＧＰＲ１０１の調節因子の使用にも関する。一部の実施形態において、本発明は、脊椎動物において過食症を治療または予防するための薬物の製造における脊椎動物ＧＰＲ１０１の調節因子の使用に関する。
本発明は、発熱を治療または予防するための薬物の製造における脊椎動物ＧＰＲ１０１の調節因子の使用にも関する。一部の実施形態において、本発明は、脊椎動物において発熱を治療または予防するための薬物の製造における脊椎動物ＧＰＲ１０１の調節因子の使用に関する。
本発明は、炎症関連障害を治療または予防するための薬物の製造における脊椎動物ＧＰＲ１０１の調節因子の使用にも関する。一定の実施形態において、前記炎症関連障害は、炎症性腸疾患（例えば、クローン病および潰瘍性大腸炎）、炎症性関節炎（例えば、関節リウマチおよび乾癬性関節炎）、乾癬、喘息、慢性閉塞性肺疾患、敗血症性ショック、虚血／再潅流傷害、播種性血管内凝固、アテローム性硬化症、骨粗しょう症、再狭窄、全身性エリテマトーデス、急性移植拒絶反応、心筋梗塞、膵炎、肝炎、静脈血栓症、多発性損傷、うっ血性心不全、末梢神経損傷、および脳炎症関連障害からなる群より選択される。一部の実施形態において、前記炎症関連障害は、炎症性腸疾患、炎症性関節炎、敗血症ショック、虚血／再潅流傷害、アテローム性硬化症、骨粗しょう症、再狭窄、心筋梗塞、うっ血性心不全、および脳炎症関連障害からなる群より選択される。個々の炎症関連障害それぞれは本発明の範囲内の独立した実施形態であると、明白に考えられる。一部の実施形態において、前記脳炎症関連障害は、脳の傷害または外傷、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病、プリオン関連疾患、脳虚血、ＡＩＤＳによる認知症およびアルツハイマー病からなる群より選択される。個々の脳炎症関連障害それぞれは本発明の範囲内の独立した実施形態であると、明白に考えられる。一部の実施形態において、本発明は、脊椎動物において炎症関連障害を治療または予防するための薬物の製造における脊椎動物ＧＰＲ１０１の調節因子の使用にも関する。
本発明は、体重を減少させるための薬物の製造における脊椎動物ＧＰＲ１０１の調節因子の使用にも関する。一部の実施形態において、本発明は、脊椎動物において体重を減少させるための薬物の製造における脊椎動物ＧＰＲ１０１の調節因子の使用に関する。
本発明は、脂肪蓄積を減少させるための薬物の製造における脊椎動物ＧＰＲ１０１の調節因子の使用にも関する。一部の実施形態において、本発明は、脊椎動物において脂肪蓄積を減少させるための薬物の製造における脊椎動物ＧＰＲ１０１の調節因子の使用に関する。
本発明は、体脂肪率を減少させるための薬物の製造における脊椎動物ＧＰＲ１０１の調節因子の使用にも関する。一部の実施形態において、本発明は、脊椎動物において体脂肪率を減少させるための薬物の製造における脊椎動物ＧＰＲ１０１の調節因子の使用に関する。
本発明は、食事摂取量を減少させるための薬物の製造における脊椎動物ＧＰＲ１０１の調節因子の使用にも関する。一部の実施形態において、本発明は、脊椎動物において食事摂取量を減少させるための薬物の製造における脊椎動物ＧＰＲ１０１の調節因子の使用に関する。
一定の実施形態において、前記脊椎動物は、哺乳動物である。一定の実施形態において、前記脊椎動物は、ヒトである。一部の実施形態において、前記ヒトＧＰＲ１０１受容体の調節因子は、配列番号２のアミノ酸配列を有するヒトＧＰＲ１０１の調節因子である。
一部の実施形態において、前記調節因子は、第二の態様によるものである。
一定の実施形態において、前記調節因子は、アゴニストである。一部の実施形態において、前記調節因子は、部分アゴニストである。
一定の実施形態において、前記調節因子は、小分子である。一部の実施形態において、前記調節因子は、小分子であるが、但し、その小分子がポリペプチド、抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または脂質でないことを条件とする。一部の実施形態において、前記調節因子は、小分子であるが、但し、その小分子がポリペプチドでないことを条件とする。一部の実施形態において、前記調節因子は、小分子であるが、但し、その小分子が抗体またはその抗原結合フラグメントでないことを条件とする。一部の実施形態において、前記調節因子は、小分子であるが、その小分子が脂質でないことを条件とする。
一部の実施形態において、前記調節因子は、ヒト、マウスまたはラットＧＰＲ１０１に対して、好ましくはヒトＧＰＲ１０１に対して、約１０μＭ未満の、約１μＭ未満の、約１００ｎＭ未満の、または約１０ｎＭ未満のＥＣ５０を有するアゴニストまたは部分アゴニストである。一部の実施形態において、前記調節因子は、約１０ｎＭから１０μＭの間隔から選択される値より小さいＥＣ５０を有するアゴニストまたは部分アゴニストである。一部の実施形態において、前記調節因子は、１０ｎＭから１μＭの間隔から選択される値より小さいＥＣ５０を有するアゴニストまたは部分アゴニストである。一部の実施形態において、前記調節因子は、１０ｎＭから１００ｎＭの間隔から選択される値より小さいＥＣ５０を有するアゴニストまたは部分アゴニストである。一部の実施形態において、前記調節因子は、トランスフェクトされたＣＨＯ細胞からの膜を用いて行われるＧＴＰγＳ結合アッセイで、またはトランスフェクトされたメラニン保有細胞において行われる色素分散アッセイで、トランスフェクトされたＣＨＯ細胞においてもしくはトランスフェクトされたＣＨＯ細胞からの膜を用いて行われるｃＡＭＰアッセイで、またはトランスフェクトされた２９３細胞において行われるｃＡＭＰアッセイで、約１０μＭ未満の、約１μＭ未満の、約１００ｎＭ未満の、または約１０ｎＭ未満のＥＣ５０を有するアゴニストまたは部分アゴニストである（この場合、該トランスフェクトされたＣＨＯ細胞、または該トランスフェクトされたメラニン保有細胞、または該トランスフェクトされた２９３細胞は、配列番号２、配列番号４および配列番号６から選択されるアミノ酸配列を有する組換えＧＰＲ１０１受容体を発現する）。一部の実施形態において、前記組換えＧＰＲ１０１受容体は、配列番号２のアミノ酸配列を有する。一部の実施形態において、前記調節因子は、前記アッセイにおいて約１０μＭ未満の、約１μＭ未満の、約１００ｎＭ未満の、または約１０ｎＭ未満のＥＣ５０を有するアゴニストまたは部分アゴニストである。一部の実施形態において、前記調節因子は、前記アッセイにおいて約１０ｎＭから約１０μＭの間隔から選択される値より小さいＥＣ５０を有するアゴニストまたは部分アゴニストである。一部の実施形態において、前記調節因子は、前記アッセイにおいて約１０ｎＭから約１μＭの間隔から選択される値より小さいＥＣ５０を有するアゴニストまたは部分アゴニストである。一部の実施形態において、前記調節因子は、前記アッセイにおいて約１０ｎＭから約１００ｎＭの間隔から選択される値より小さいＥＣ５０を有するアゴニストまたは部分アゴニストである。
本発明の１つの態様において、前記ＧＰＲ１０１調節因子は、選択的ＧＰＲ１０１調節因子であり、この場合の選択的ＧＰＲ１０１調節因子は、ＧＰＲ１６１よりＧＰＲ１０１受容体に対して少なくとも約１０倍の、少なくとも約１００倍のまたは少なくとも約１０００倍の選択性を有する。
一定の実施形態において、前記調節因子は、経口活性である。
一定の実施形態において、前記調節因子は、血液脳関門を横断することができる。
第八の態様において、本発明は、プロオピオメラノコルチン（ＰＯＭＣ）由来生物活性ペプチドの分泌を減少させるための薬物の製造における脊椎動物ＧＰＲ１０１の調節因子の使用を特徴とする。一部の実施形態において、本発明は、脊椎動物においてプロオピオメラノコルチン（ＰＯＭＣ）由来生物活性ペプチドの分泌を減少させるための薬物の製造における脊椎動物ＧＰＲ１０１の調節因子の使用を特徴とする。
本発明は、ＰＯＭＣ由来生物活性ペプチドの分泌レベルを減少させることによって改善されるＰＯＭＣ由来生物活性ペプチド関連疾患を治療または予防するための薬物の製造における脊椎動物ＧＰＲ１０１の調節因子の使用にも関する。一部の実施形態において、本発明は、脊椎動物においてＰＯＭＣ由来生物活性ペプチドの分泌レベルを減少させることによって改善されるＰＯＭＣ由来生物活性ペプチド関連疾患を治療または予防するための薬物の製造における脊椎動物ＧＰＲ１０１の調節因子の使用に関する。一定の実施形態において、前記分泌レベルは、視床下部分泌レベルである。
本発明は、悪液質を治療または予防するための薬物の製造における脊椎動物ＧＰＲ１０１の調節因子の使用にも関する。一部の実施形態において、前記悪液質は、ＡＩＤＳ関連体重減少、癌関連体重減少および食欲不振関連体重減少からなる群より選択される。ＡＩＤＳ関連体重減少、癌関連体重減少および食欲不振関連体重減少は、本発明の範囲内の独立した実施形態であると、明白に考えられる。一部の実施形態において、本発明は、脊椎動物において悪液質を治療または予防するための薬物の製造における脊椎動物ＧＰＲ１０１の調節因子の使用に関する。
本発明は、体重を増加させるための薬物の製造における脊椎動物ＧＰＲ１０１の調節因子の使用にも関する。一部の実施形態において、本発明は、脊椎動物において体重を増加させるための薬物の製造における脊椎動物ＧＰＲ１０１の調節因子の使用に関する。
本発明は、脂肪蓄積を増加させるための薬物の製造における脊椎動物ＧＰＲ１０１の調節因子の使用にも関する。一部の実施形態において、本発明は、脊椎動物において脂肪蓄積を増加させるための薬物の製造における脊椎動物ＧＰＲ１０１の調節因子の使用に関する。
本発明は、体脂肪率を増加させるための薬物の製造における脊椎動物ＧＰＲ１０１の調節因子の使用にも関する。一部の実施形態において、本発明は、脊椎動物において体脂肪率を増加させるための薬物の製造における脊椎動物ＧＰＲ１０１の調節因子の使用に関する。
本発明は、食事摂取量を増加させるための薬物の製造における脊椎動物ＧＰＲ１０１の調節因子の使用にも関する。一部の実施形態において、本発明は、脊椎動物において食事摂取量を増加させるための薬物の製造における脊椎動物ＧＰＲ１０１の調節因子の使用に関する。
一定の実施形態において、前記脊椎動物は、哺乳動物である。一定の実施形態において、前記脊椎動物は、ヒトである。一部の実施形態において、前記ヒトＧＰＲ１０１受容体の調節因子は、配列番号２のアミノ酸配列を有するヒトＧＰＲ１０１の調節因子である。
一部の実施形態において、前記調節因子は、第二の態様によるものである。
一定の実施形態において、前記調節因子は、逆アゴニストである。一部の実施形態において、前記調節因子は、アンタゴニストである。
一定の実施形態において、前記調節因子は、小分子である。一部の実施形態において、前記調節因子は、小分子であるが、但し、その小分子がポリペプチド、抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または脂質でないことを条件とする。一部の実施形態において、前記調節因子は、小分子であるが、但し、その小分子がポリペプチドでないことを条件とする。一部の実施形態において、前記調節因子は、小分子であるが、但し、その小分子が抗体またはその抗原結合フラグメントでないことを条件とする。一部の実施形態において、前記調節因子は、小分子であるが、その小分子が脂質でないことを条件とする。
一部の実施形態において、前記調節因子は、ヒト、マウスまたはラットＧＰＲ１０１に対して、好ましくはヒトＧＰＲ１０１に対して、約１０μＭ未満の、約１μＭ未満の、約１００ｎＭ未満の、または約１０ｎＭ未満のＩＣ５０を有する逆アゴニストまたはアンタゴニストである。一部の実施形態において、前記調節因子は、約１０ｎＭから１０μＭの間隔から選択される値より小さいＩＣ５０を有する逆アゴニストまたはアンタゴニストである。一部の実施形態において、前記調節因子は、１０ｎＭから１μＭの間隔から選択される値より小さいＩＣ５０を有する逆アゴニストまたはアンタゴニストである。一部の実施形態において、前記調節因子は、１０ｎＭから１００ｎＭの間隔から選択される値より小さいＩＣ５０を有する逆アゴニストまたはアンタゴニストである。一部の実施形態において、前記調節因子は、トランスフェクトされたＣＨＯ細胞からの膜を用いて行われるＧＴＰγＳ結合アッセイで、またはトランスフェクトされたメラニン保有細胞において行われる色素分散アッセイで、トランスフェクトされたＣＨＯ細胞においてもしくはトランスフェクトされたＣＨＯ細胞からの膜を用いて行われるｃＡＭＰアッセイで、またはトランスフェクトされた２９３細胞において行われるｃＡＭＰアッセイで、約１０μＭ未満の、約１μＭ未満の、約１００ｎＭ未満の、または約１０ｎＭ未満のＩＣ５０を有する逆アゴニストまたはアンタゴニストである（この場合、該トランスフェクトされたＣＨＯ細胞、または該トランスフェクトされたメラニン保有細胞、または該トランスフェクトされた２９３細胞は、配列番号２、配列番号４および配列番号６から選択されるアミノ酸配列を有する組換えＧＰＲ１０１受容体を発現する）。一部の実施形態において、前記組換えＧＰＲ１０１受容体は、配列番号２のアミノ酸配列を有する。一部の実施形態において、前記調節因子は、前記アッセイにおいて約１０μＭ未満の、約１μＭ未満の、約１００ｎＭ未満の、または約１０ｎＭ未満のＩＣ５０を有する逆アゴニストまたはアンタゴニストである。一部の実施形態において、前記調節因子は、前記アッセイにおいて約１０ｎＭから約１０μＭの間隔から選択される値より小さいＩＣ５０を有する逆アゴニストまたはアンタゴニストである。一部の実施形態において、前記調節因子は、前記アッセイにおいて約１０ｎＭから約１μＭの間隔から選択される値より小さいＩＣ５０を有する逆アゴニストまたはアンタゴニストである。一部の実施形態において、前記調節因子は、前記アッセイにおいて約１０ｎＭから約１００ｎＭの間隔から選択される値より小さいＩＣ５０を有する逆アゴニストまたはアンタゴニストである。
本発明の１つの態様において、前記ＧＰＲ１０１調節因子は、選択的ＧＰＲ１０１調節因子であり、この場合の選択的ＧＰＲ１０１調節因子は、ＧＰＲ１６１よりＧＰＲ１０１受容体に対して少なくとも約１０倍の、少なくとも約１００倍のまたは少なくとも約１０００倍の選択性を有する。
一定の実施形態において、前記調節因子は、経口活性である。
一定の実施形態において、前記調節因子は、血液脳関門を横断することができる。
第九の態様において、本発明は、視床下部プロオピオメラノコルチン（ＰＯＭＣ）由来生物活性ペプチドの分泌の調節因子を同定するために化合物をスクリーニングする方法を特徴とし、この方法は、
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列、
（ｂ）特異的プライマー配列番号７および配列番号８を使用してヒトＤＮＡサンプルに対するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅することができるポリヌクレオチドによってコードされているＧタンパク質結合受容体のアミノ酸配列、
（ｃ）配列番号４のアミノ酸配列、
（ｄ）配列番号６のアミノ酸配列、
（ｅ）配列番号１、配列番号３または配列番号５の相補体にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされているＧタンパク質結合受容体のアミノ酸配列、
（ｆ）配列番号２、配列番号４または配列番号６に対して少なくとも約７０％の同一性を有するアミノ酸配列を有するＧタンパク質結合受容体のアミノ酸配列、
（ｇ）配列番号２、配列番号４または配列番号６のアミノ酸配列の変異体を有するＧタンパク質結合受容体のアミノ酸配列、
（ｈ）（ａ）から（ｇ）のうちのいずれか１つの生物活性フラグメント
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＧＰＣＲの使用を特徴とし；
（ａ’）候補化合物と前記ＧＰＣＲを、該受容体と該候補化合物との相互作用を可能にする条件下で、接触させる工程、および
（ｂ’）前記化合物の前記受容体への結合を検出する工程
を含む。
一定の実施形態において、前記ＧＰＣＲは、配列番号２のアミノ酸配列、または配列番号２に対して少なくとも約７０％の同一性を有するＧタンパク質結合受容体のアミノ酸配列を含む。
一定の実施形態において、前記ＰＯＭＣ由来生物活性ペプチドは、ＡＣＴＨ、β−エンドルフィン、α−ＭＳＨ、β−ＭＳＨおよびγ−ＭＳＨからなる群より選択される。ＰＯＭＣ由来生物活性ペプチドは、本発明の実施形態に個々に含まれる場合もあり、任意の組み合わせで含まれる場合もあると、明白に考えられる。
加えて、本発明は、この第九の態様の工程（ａ’）および（ｂ’）を含み、さらに、
（ｃ’）工程（ｂ’）における受容体に結合する化合物を場合によっては合成する工程；
（ｄ’）工程（ｂ’）における受容体に結合する化合物と、本発明のＧタンパク質結合受容体を発現し、ＰＯＭＣ由来生物活性ペプチドを分泌できる細胞とを、または脊椎動物視床下部細胞とを、または脊椎動物視床下部組織とをインビトロで接触させる工程；および
（ｅ’）本発明のＧタンパク質結合受容体を発現し、ＰＯＭＣ由来生物活性ペプチドを分泌できる細胞からの、または脊椎動物視床下部細胞からの、または脊椎動物視床下部組織からのＰＯＭＣ由来生物活性ペプチドの分泌を、その化合物が調節するかどうかを決定する工程
を含む、候補化合物を視床下部プロオピオメラノコルチン（ＰＯＭＣ）由来生物活性ペプチドの分泌の調節因子として同定する方法を特徴とし、この場合、本発明のＧタンパク質結合受容体を発現し、ＰＯＭＣ由来生物活性ペプチドを分泌できる細胞からの、または脊椎動物視床下部細胞からの、または脊椎動物視床下部組織からのＰＯＭＣ由来生物活性ペプチドの分泌を調節するその候補化合物の能力が、その化合物がＰＯＭＣ由来生物活性ペプチドの分泌の調節因子であることの指標となる。
加えて、本発明は、この第九の態様の工程（ａ’）および（ｂ’）を含み、さらに、
（ｃ’）場合によっては、工程（ｂ’）における受容体に結合する化合物を合成する工程；
（ｄ’）工程（ｂ’）における受容体に結合する化合物を脊椎動物に投与する工程；および
（ｅ’）その化合物が、その脊椎動物におけるＰＯＭＣ由来生物活性ペプチドの分泌を調節するかどうかを決定する工程
を含む、候補化合物を視床下部プロオピオメラノコルチン（ＰＯＭＣ）由来生物活性ペプチドの分泌の調節因子として同定する方法を特徴とし、この場合、その脊椎動物におけるＰＯＭＣ由来生物活性ペプチドの分泌を調節するその候補化合物の能力が、その化合物がＰＯＭＣ由来生物活性ペプチドの分泌の調節因子であることの指標となる。
加えて、本発明は、この第九の態様の工程（ａ’）および（ｂ’）を含み、さらに、
（ｃ’）場合によっては、工程（ｂ’）における受容体に結合する化合物を合成する工程；
（ｄ’）工程（ｂ’）における受容体に結合する化合物と、本発明のＧタンパク質受容体を発現し、ＰＯＭＣポリペプチドもしくはｍＲＮＡを発現できる細胞とを、または脊椎動物視床下部細胞とを、または脊椎動物視床下部組織とをインビトロで接触させる工程；および
（ｅ’）本発明のＧタンパク質結合受容体を発現し、ＰＯＭＣ由来生物活性ペプチドを分泌できる細胞における、または脊椎動物視床下部細胞における、または脊椎動物視床下部組織におけるＰＯＭＣポリペプチドまたはｍＲＮＡの発現を、その化合物が調節するかどうかを決定する工程
を含む、候補化合物を視床下部プロオピオメラノコルチン（ＰＯＭＣ）由来生物活性ペプチドの分泌の調節因子として同定する方法を特徴とし、この場合、本発明のＧタンパク質結合受容体を発現し、ＰＯＭＣ由来生物活性ペプチドを分泌できる細胞における、または脊椎動物視床下部細胞における、または脊椎動物視床下部組織におけるＰＯＭＣポリペプチドまたはｍＲＮＡの発現を調節するその候補化合物の能力が、その化合物がＰＯＭＣ由来生物活性ペプチドの分泌の調節因子であることの指標となる。
加えて、本発明は、この第九の態様の工程（ａ’）および（ｂ’）を含み、さらに、
（ｃ’）場合によっては、工程（ｂ’）における受容体に結合する化合物を合成する工程；
（ｄ’）工程（ｂ’）における受容体に結合する化合物を脊椎動物に投与する工程；および
（ｅ’）その化合物が、その脊椎動物におけるＰＯＭＣポリペプチドまたはｍＲＮＡの発現を調節するかどうかを決定する工程
を含む、候補化合物を視床下部プロオピオメラノコルチン（ＰＯＭＣ）由来生物活性ペプチドの分泌の調節因子として同定する方法を特徴とし、この場合、その脊椎動物におけるＰＯＭＣポリペプチドまたはｍＲＮＡの発現を調節するその候補化合物の能力が、その化合物がＰＯＭＣ由来生物活性ペプチドの分泌の調節因子であることの指標となる。
一定の実施形態において、工程（ｅ’）のＰＯＭＣ由来生物活性ペプチドは、ＡＣＴＨ、β−エンドルフィン、α−ＭＳＨ、β−ＭＳＨおよびγ−ＭＳＨからなる群より選択される。ＰＯＭＣ由来生物活性ペプチドは、本発明の実施形態に個々に含まれる場合もあり、任意の組み合わせで含まれる場合もあると、明白に考えられる。
一定の実施形態において、本発明のＧタンパク質結合受容体は、配列番号２のアミノ酸配列を有するＧタンパク質結合受容体であり、または配列番号２に対して少なくとも約７０％の同一性を有するアミノ酸配列を有する内因性もしくは非内因性Ｇタンパク質結合受容体である。
一定の実施形態において、本発明のＧタンパク質結合受容体を発現し、ＰＯＭＣ由来生物活性ペプチドを分泌できる細胞、または本発明のＧタンパク質結合受容体を発現し、ＰＯＭＣポリペプチドもしくはｍＲＮＡを発現できる細胞は、視床下部細胞、下垂体細胞、皮膚細胞または白血球である。一定の実施形態において、本発明のＧタンパク質結合受容体を発現し、ＰＯＭＣ由来生物活性ペプチドを分泌できる細胞、または本発明のＧタンパク質結合受容体を発現し、ＰＯＭＣポリペプチドもしくはｍＲＮＡを発現できる細胞は、不死化細胞である。一定の実施形態において、本発明のＧタンパク質結合受容体を発現し、ＰＯＭＣ由来生物活性ペプチドを分泌できる細胞、または本発明のＧタンパク質結合受容体を発現し、ＰＯＭＣポリペプチドもしくはｍＲＮＡを発現できる細胞は、不死化細胞でない。
一定の実施形態において、その化合物がＰＯＭＣ由来生物活性ペプチドの分泌を調節するかどうかの前記判定は、視床下部スライスアッセイを含む方法によって行われる。一定の実施形態において、前記視床下部スライスアッセイは、ラット視床下部スライスアッセイである。一定の実施形態において、前記視床下部スライスは、ＰＯＭＣニューロンを含む。一定の実施形態において、前記視床下部スライスは、ＧＰＲ１０１を含むＰＯＭＣニューロンを含む。
一定の実施形態において、前記脊椎動物視床下部組織は、哺乳動物視床下部組織である。一定の実施形態において、前記哺乳動物視床下部組織は、ラットまたはマウス視床下部組織などの（しかし、これらに限定されない）、非ヒト哺乳動物視床下部組織である。一定の実施形態において、前記脊椎動物視床下部組織は、ヒト視床下部組織である。
一定の実施形態において、その化合物が脊椎動物におけるＰＯＭＣ ｍＲＮＡの発現を調節するかどうかの前記判定は、インサイチュハイブリダイゼーション組織化学分析を含む方法によって行われる。一定の実施形態において、その化合物が脊椎動物におけるＰＯＭＣ ｍＲＮＡの発現を調節するかどうかの前記判定は、視床下部組織のインサイチュハイブリダイゼーション組織化学分析を含む方法によって行われる。一定の実施形態において、その化合物が脊椎動物におけるＰＯＭＣ ｍＲＮＡの発現を調節するかどうかの前記判定は、視床下部弓状核組織を含む視床下部組織のインサイチュハイブリダイゼーション組織化学分析を含む方法によって行われる。一定の実施形態において、その化合物が脊椎動物におけるＰＯＭＣ ｍＲＮＡの発現を調節するかどうかの前記判定は、視床下部組織から作製された連続切片を用いて行われるインサイチュハイブリダイゼーション組織化学分析を含む方法によって行われる。
一定の実施形態において、前記スクリーニングは、視床下部プロオピオメラノコルチン（ＰＯＭＣ）由来生物活性ペプチドの分泌を刺激する化合物についてのスクリーニングである。一定の実施形態において、前記スクリーニングは、前記ＧＰＣＲのアゴニストについてのスクリーニングである。一定の実施形態において、前記スクリーニングは、前記ＧＰＣＲの部分アゴニストについてのスクリーニングである。
一定の実施形態において、前記スクリーニングは、視床下部プロオピオメラノコルチン（ＰＯＭＣ）由来生物活性ペプチドの分泌を阻害する化合物についてのスクリーニングである。一定の実施形態において、前記スクリーニングは、前記ＧＰＣＲの逆アゴニストについてのスクリーニングである。一定の実施形態において、前記スクリーニングは、前記ＧＰＣＲのアンタゴニストについてのスクリーニングである。
一定の実施形態において、前記受容体は、組換え体である。
一定の実施形態において、前記接触は、候補化合物と、組換え型前記受容体を含む宿主細胞との、または組換え型前記受容体を含む宿主細胞の膜との接触を含む。一部の実施形態において、前記宿主細胞は、前記受容体をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む。一定の実施形態において、前記宿主細胞は、真核細胞である。一部の実施形態において、前記真核細胞は、酵母細胞である。一部の実施形態において、前記真核細胞は、メラニン保有細胞である。一部の実施形態において、前記真核細胞は、哺乳動物宿主細胞である。一部の実施形態において、前記哺乳動物細胞は、ＨＥＫ−２９３細胞、ＣＯＳ−７細胞またはＣＨＯ細胞である。
一部の実施形態において、前記判定は、前記ＧＰＣＲを含む膜を用いて行われる。
一部の実施形態において、前記候補化合物は、脊椎動物ＧＰＲ１０１受容体のリガンドであることが分かっている化合物ではない。一部の実施形態において、前記候補化合物は、脊椎動物ＧＰＲ１０１受容体に対するアゴニスト、部分アゴニスト、逆アゴニストまたはアンタゴニストであることが分かっている化合物ではない。一部の実施形態において、前記脊椎動物は、哺乳動物である。一部の実施形態において、前記脊椎動物は、ヒトである。
一定の実施形態において、前記候補化合物は、小分子である。一部の実施形態において、候補化合物は、小分子であるが、但し、その小分子がポリペプチド、抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または脂質でないことを条件とする。一部の実施形態において、候補化合物は、小分子であるが、但し、その小分子がポリペプチドでないことを条件とする。一部の実施形態において、前記候補化合物は、小分子であるが、但し、その小分子が抗体またはその抗原結合フラグメントでないことを条件とする。一部の実施形態において、前記候補化合物は、小分子であるが、但し、その小分子が脂質でないことを条件とする。
一定の実施形態において、前記方法は、その候補化合物が前記受容体のアゴニストであるかどうかの判定を含む。一定の実施形態において、前記方法は、その候補化合物が、前記受容体の部分アゴニストであるかどうかの判定を含む。一定の実施形態において、前記方法は、その候補化合物が前記受容体の逆アゴニストであるかどうかの判定を含む。一定の実施形態において、前記方法は、その候補化合物が前記受容体のアンタゴニストであるかどうかの判定を含む。
一部の実施形態において、前記方法は、前記調節因子を医薬組成物に調合する工程をさらに含む。一部の実施形態において、前記調節因子は、前記ＧＰＣＲのアゴニストである。一部の実施形態において、前記調節因子は、前記ＧＰＣＲの部分アゴニストである。一部の実施形態において、前記調節因子は、前記ＧＰＣＲの逆アゴニストである。一部の実施形態において、前記調節因子は、前記ＧＰＣＲのアンタゴニストである。
一部の実施形態において、前記方法は、前記調節因子の合成をさらに含む。一部の実施形態において、前記調節因子は、前記ＧＰＣＲのアゴニストである。一部の実施形態において、前記調節因子は、前記ＧＰＣＲの部分アゴニストである。一部の実施形態において、前記調節因子は、前記ＧＰＣＲの逆アゴニストである。一部の実施形態において、前記調節因子は、前記ＧＰＣＲのアンタゴニストである。
一部の実施形態において、前記方法は、場合によっては、前記調節因子の構造を決定する工程；および前記調節因子または前記調節因子の名前もしく構造を提供する工程をさらに含む。一部の実施形態において、前記調節因子は、前記ＧＰＣＲのアゴニストである。一部の実施形態において、前記調節因子は、前記ＧＰＣＲの部分アゴニストである。一部の実施形態において、前記調節因子は、前記ＧＰＣＲの逆アゴニストである。一部の実施形態において、前記調節因子は、前記ＧＰＣＲのアンタゴニストである。
一部の実施形態において、前記方法は、場合によっては、前記調節因子の構造を決定する工程；場合によっては、前記調節因子または前記調節因子の名前もしくは構造を提供する工程；および前記調節因子を製造または合成する工程をさらに含む。一部の実施形態において、前記調節因子は、前記ＧＰＣＲのアゴニストである。一部の実施形態において、前記調節因子は、前記ＧＰＣＲの部分アゴニストである。一部の実施形態において、前記調節因子は、前記ＧＰＣＲの逆アゴニストである。一部の実施形態において、前記調節因子は、前記ＧＰＣＲのアンタゴニストである。
第十の態様において、本発明は、
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列、
（ｂ）特異的プライマー配列番号７および配列番号８を使用してヒトＤＮＡサンプルに対するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅することができるポリヌクレオチドによってコードされているＧタンパク質結合受容体のアミノ酸配列、
（ｃ）配列番号４のアミノ酸配列、
（ｄ）配列番号６のアミノ酸配列、
（ｅ）配列番号１、配列番号３または配列番号５の相補体にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされているＧタンパク質結合受容体のアミノ酸配列、
（ｆ）配列番号２、配列番号４または配列番号６に対して少なくとも約７０％の同一性を有するアミノ酸配列を有するＧタンパク質結合受容体のアミノ酸配列、
（ｇ）配列番号２、配列番号４または配列番号６のアミノ酸配列の変異体を有するＧタンパク質結合受容体のアミノ酸配列、
（ｈ）（ａ）から（ｇ）のうちのいずれか１つの生物活性フラグメント
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＧＰＣＲのリガンドとして候補化合物を同定する方法を特徴とし、この方法は、
（ａ’）前記ＧＰＣＲとそのＧＰＣＲの場合によっては標識されている公知リガンドとを候補化合物が存在するまたは不在の状態で接触させる工程、
（ｂ’）前記公知リガンドと前記ＧＰＣＲとの複合体を検出する工程；および
（ｃ’）その候補化合物が不在の状態においてより少ない複合体が、その候補化合物が存在する状態で形成されるかどうか決定する工程
を含み、ここで、前記決定が、前記受容体のリガンドである候補化合物の指標となる。本発明は、候補化合物をＰＯＭＣ由来生物活性ペプチド関連疾患のための医薬としてスクリーニングする方法も特徴とし、この方法は、
（ａ）候補化合物とＧＰＣＲとを、該受容体と該候補化合物との相互作用を可能にする条件下で接触させる工程（この場合、前記受容体は、
（ｉ）配列番号２のアミノ酸配列；
（ｉｉ）特異的プライマー配列番号７および配列番号８を使用してヒトＤＮＡサンプルに対するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅することができるポリヌクレオチドによってコードされているＧタンパク質結合受容体のアミノ酸配列；
（ｉｉｉ）配列番号４のアミノ酸配列；
（ｉｖ）配列番号６のアミノ酸配列；
（ｖ）配列番号１、配列番号３または配列番号５の相補体にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされているＧタンパク質結合受容体のアミノ酸配列；
（ｖｉ）配列番号２、配列番号４または配列番号６に対して少なくとも約７０％の同一性を有するアミノ酸配列を有するＧタンパク質結合受容体のアミノ酸配列；
（ｖｉｉ）配列番号２、配列番号４または配列番号６のアミノ酸配列の変異体を有するＧタンパク質結合受容体のアミノ酸配列；および
（ｖｉｉｉ）（ｉ）から（ｖｉｉ）のうちのいずれか１つの生物活性フラグメント
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む）；および
（ｂ）前記ＧＰＣＲに結合するリガンドを検出する工程
を含む。
一定の実施形態において、前記ＧＰＣＲは、配列番号２のアミノ酸配列、または配列番号２に対して少なくとも約７０％の同一性を有するＧタンパク質結合受容体のアミノ酸配列を含む。
一定の実施形態において、前記ＰＯＭＣ由来生物活性ペプチドは、ＡＣＴＨ、β−エンドルフィン、α−ＭＳＨ、β−ＭＳＨおよびγ−ＭＳＨからなる群より選択される。ＰＯＭＣ由来生物活性ペプチドは、本発明の実施形態に個々に含まれる場合もあり、任意の組み合わせで含まれる場合もあると、明白に考えられる。
一定の実施形態において、前記受容体は、組換え体である。
一定の実施形態において、前記接触は、候補化合物と、組換え型前記受容体を含む宿主細胞との、または組換え型前記受容体を含む宿主細胞の膜との接触を含む。一部の実施形態において、前記宿主細胞は、前記受容体をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む。一定の実施形態において、前記宿主細胞は、真核細胞である。一部の実施形態において、前記真核細胞は、酵母細胞である。一部の実施形態において、前記真核細胞は、メラニン保有細胞である。一部の実施形態において、前記真核細胞は、哺乳動物宿主細胞である。一部の実施形態において、前記哺乳動物細胞は、ＨＥＫ−２９３細胞、ＣＯＳ−７細胞またはＣＨＯ細胞である。
一部の実施形態において、前記判定は、前記ＧＰＣＲを含む膜を用いて行われる。
一定の実施形態において、前記スクリーニングは、視床下部プロオピオメラノコルチン（ＰＯＭＣ）由来生物活性ペプチドの分泌の調節因子についてのスクリーニングである。一定の実施形態において、前記ＰＯＭＣ由来生物活性ペプチドは、ＡＣＴＨ、β−エンドルフィン、α−ＭＳＨ、β−ＭＳＨおよびγ−ＭＳＨからなる群より選択される。ＰＯＭＣ由来生物活性ペプチドは、本発明の実施形態に個々に含まれる場合もあり、任意の組み合わせで含まれる場合もあると、明白に考えられる。
一定の実施形態において、候補化合物は、肥満もしくはそれに関連した状態の危険があるか、または肥満もしくはそれに関連した状態に進行している脊椎動物を特定するための放射線イメージング剤としてスクリーニングされる。一定の実施形態において、正常レベルより下の脳内でのＧＰＲ１０１受容体の発現レベルは、その脊椎動物が、肥満もしくはそれに関連した状態の危険があるか、または肥満もしくはそれに関連した状態に進行している、あるいは炎症関連障害の危険があるまたは炎症関連障害に進行していることの指標となる。一定の実施形態において、正常レベルより下の視床下部におけるＧＰＲ１０１受容体の発現レベルは、その脊椎動物が、肥満もしくはそれに関連した状態の危険があるか、または肥満もしくはそれに関連した状態に進行していることの指標となる。一定の実施形態において、前記脊椎動物は、哺乳動物である。一定の実施形態において、前記脊椎動物は、ヒトである。
第十一の態様において、本発明は、視床下部プロオピオメラノコルチン（ＰＯＭＣ）由来生物活性ペプチドの分泌の調節因子として候補化合物をスクリーニングするためのＧＰＣＲの使用を特徴とし、この場合のＧＰＣＲは、
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列；
（ｂ）特異的プライマー配列番号７および配列番号８を使用してヒトＤＮＡサンプルに対するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅することができるポリヌクレオチドによってコードされているＧタンパク質結合受容体のアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号４のアミノ酸配列；
（ｄ）配列番号６のアミノ酸配列；
（ｅ）配列番号１、配列番号３または配列番号５の相補体にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされているＧタンパク質結合受容体のアミノ酸配列；
（ｆ）配列番号２、配列番号４または配列番号６に対して少なくとも約７０％の同一性を有するアミノ酸配列を有するＧタンパク質結合受容体のアミノ酸配列；
（ｇ）配列番号２、配列番号４または配列番号６のアミノ酸配列の変異体を有するＧタンパク質結合受容体のアミノ酸配列；
（ｈ）（ａ）から（ｇ）のうちのいずれか１つの生物活性フラグメント
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。
一定の実施形態において、前記ＧＰＣＲは、配列番号２のアミノ酸配列、または配列番号２に対して少なくとも約７０％の同一性を有するＧタンパク質結合受容体のアミノ酸配列を含む。
一定の実施形態において、前記ＰＯＭＣ由来生物活性ペプチドは、ＡＣＴＨ、β−エンドルフィン、α−ＭＳＨ、β−ＭＳＨおよびγ−ＭＳＨからなる群より選択される。ＰＯＭＣ由来生物活性ペプチドは、本発明の実施形態に個々に含まれる場合もあり、任意の組み合わせで含まれる場合もあると、明白に考えられる。
一定の実施形態において、前記スクリーニングは、視床下部プロオピオメラノコルチン（ＰＯＭＣ）由来生物活性ペプチドの分泌を刺激する化合物についてのスクリーニングである。一定の実施形態において、前記スクリーニングは、前記ＧＰＣＲのアゴニストについてのスクリーニングである。一定の実施形態において、前記スクリーニングは、前記ＧＰＣＲの部分アゴニストについてのスクリーニングである。
一定の実施形態において、前記スクリーニングは、肥満またはそれに関連した状態のための医薬についてのスクリーニングである。一部の実施形態において、前記肥満に関連した状態は、高血圧、うっ血性心筋症、静脈瘤、肺塞栓症、冠性心疾患、卒中、特発性頭蓋内圧亢進、異常感覚性大腿痛、呼吸困難、閉塞性睡眠時無呼吸症、低換気症候群、ピックウィック症候群、喘息、不動、変性骨関節炎、腰痛、線条萎縮すなわち「伸展裂創」、下肢の静脈うっ血、リンパ浮腫、蜂巣炎、間擦疹、癰、黒色表皮腫、懸垂線維腫、胃食道逆流障害、非アルコール性脂肪肝／脂肪性肝炎、胆石症、ヘルニア、大腸癌、緊張性失禁、肥満関連糸球体症、乳および子宮癌、うつ病および低い自己評価、生活の質の悪化、メタボリック症候群、インスリン抵抗性、２型糖尿病、異脂肪血症、アテローム性硬化症、女性の高アンドロゲン血症、多嚢胞卵巣症候群、月経困難症、不妊症、妊娠合併症、および男性性腺機能低下症からなる群より選択される。一部の実施形態において、前記肥満に関連した状態は、高血圧、インスリン抵抗性、メタボリック症候群、２型糖尿病、異脂肪血症、アテローム性硬化症、冠性心疾患、および卒中からなる群より選択される。肥満の関連した個々の状態それぞれは本発明の範囲内の独立した実施形態であると、明白に考えられる。一定の実施形態において、前記スクリーニングは、前記ＧＰＣＲのアゴニストについてのスクリーニングである。一定の実施形態において、前記スクリーニングは、前記ＧＰＣＲの部分アゴニストについてのスクリーニングである。
一定の実施形態において、前記スクリーニングは、満腹を促進する医薬についてのスクリーニングである。一定の実施形態において、前記スクリーニングは、前記ＧＰＣＲのアゴニストについてのスクリーニングである。一定の実施形態において、前記スクリーニングは、前記ＧＰＣＲの部分アゴニストについてのスクリーニングである。
一定の実施形態において、前記スクリーニングは、過食症のための医薬についてのスクリーニングである。一定の実施形態において、前記スクリーニングは、前記ＧＰＣＲのアゴニストについてのスクリーニングである。一定の実施形態において、前記スクリーニングは、前記ＧＰＣＲの部分アゴニストについてのスクリーニングである。
一定の実施形態において、前記スクリーニングは、発熱のための医薬についてのスクリーニングである。一定の実施形態において、前記スクリーニングは、前記ＧＰＣＲのアゴニストについてのスクリーニングである。一定の実施形態において、前記スクリーニングは、前記ＧＰＣＲの部分アゴニストについてのスクリーニングである。
一定の実施形態において、前記スクリーニングは、炎症関連障害のための医薬についてのスクリーニングである。一定の実施形態において、前記炎症関連障害は、炎症性腸疾患（例えば、クローン病および潰瘍性大腸炎）、炎症性関節炎（例えば、関節リウマチおよび乾癬性関節炎）、乾癬、喘息、慢性閉塞性肺疾患、敗血症性ショック、虚血／再潅流傷害、播種性血管内凝固、アテローム性硬化症、骨粗しょう症、再狭窄、全身性エリテマトーデス、急性移植拒絶反応、心筋梗塞、膵炎、肝炎、静脈血栓症、多発性損傷、うっ血性心不全、末梢神経損傷、および脳炎症関連障害からなる群より選択される。一部の実施形態において、前記炎症関連障害は、炎症性腸疾患、炎症性関節炎、敗血症ショック、虚血／再潅流傷害、アテローム性硬化症、骨粗しょう症、再狭窄、心筋梗塞、うっ血性心不全、および脳炎症関連障害からなる群より選択される。個々の炎症関連障害それぞれは本発明の範囲内の独立した実施形態であると、明白に考えられる。一部の実施形態において、前記脳炎症関連障害は、脳の傷害または外傷、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病、プリオン関連疾患、脳虚血、ＡＩＤＳによる認知症およびアルツハイマー病からなる群より選択される。個々の脳炎症関連障害それぞれは本発明の範囲内の独立した実施形態であると、明白に考えられる。一定の実施形態において、前記スクリーニングは、前記ＧＰＣＲのアゴニストについてのスクリーニングである。一定の実施形態において、前記スクリーニングは、前記ＧＰＣＲの部分アゴニストについてのスクリーニングである。
一定の実施形態において、前記スクリーニングは、体重、脂肪蓄積、体脂肪率および食事摂取量からなる群より選択されるエネルギー恒常性関連パラメータを減少させる薬剤についてのスクリーニングである。一定の実施形態において、前記スクリーニングは、体重を減少させる薬剤についてのスクリーニングである。一定の実施形態において、前記スクリーニングは、脂肪蓄積を減少させる薬剤についてのスクリーニングである。一定の実施形態において、前記スクリーニングは、体脂肪率を減少させる薬剤についてのスクリーニングである。一定の実施形態において、前記スクリーニングは、食事摂取量を減少させる薬剤についてのスクリーニングである。一定の実施形態において、前記スクリーニングは、前記ＧＰＣＲのアゴニストについてのスクリーニングである。一定の実施形態において、前記スクリーニングは、前記ＧＰＣＲの部分アゴニストについてのスクリーニングである。
一定の実施形態において、前記スクリーニングは、その調節因子が前記ＧＰＣＲのアゴニストであるかどうかの判定を含む。一定の実施形態において、前記スクリーニングは、その調節因子が、前記ＧＰＣＲの部分アゴニストであるかどうかの判定を含む。
一定の実施形態において前記スクリーニングは、視床下部プロオピオメラノコルチン（ＰＯＭＣ）由来生物活性ペプチドの分泌を阻害する化合物についてのスクリーニングである。一定の実施形態において、前記スクリーニングは、前記ＧＰＣＲの逆アゴニストについてのスクリーニングである。一定の実施形態において、前記スクリーニングは、前記ＧＰＣＲのアンタゴニストについてのスクリーニングである。
一定の実施形態において、前記スクリーニングは、悪液質のための医薬についてのスクリーニングである。一部の実施形態において、前記悪液質は、ＡＩＤＳ関連体重減少、癌関連体重減少および食欲不振関連体重減少からなる群より選択される。ＡＩＤＳ関連体重減少、癌関連体重減少および食欲不振関連体重減少は、本発明の範囲内の独立した実施形態であると、明白に考えられる。一定の実施形態において、前記スクリーニングは、前記ＧＰＣＲの逆アゴニストについてのスクリーニングである。一定の実施形態において、前記スクリーニングは、前記ＧＰＣＲのアンタゴニストについてのスクリーニングである。
一定の実施形態において、前記スクリーニングは、体重、脂肪蓄積、体脂肪率および食事摂取量からなる群より選択されるエネルギー恒常性関連パラメータを増加させる薬剤についてのスクリーニングである。一定の実施形態において、前記スクリーニングは、体重を増加させる薬剤についてのスクリーニングである。一定の実施形態において、前記スクリーニングは、脂肪蓄積を増加させる薬剤についてのスクリーニングである。一定の実施形態において、前記スクリーニングは、体脂肪率を増加させる薬剤についてのスクリーニングである。一定の実施形態において、前記スクリーニングは、食事摂取量を増加させる薬剤についてのスクリーニングである。一定の実施形態において、前記スクリーニングは、前記ＧＰＣＲの逆アゴニストについてのスクリーニングである。一定の実施形態において、前記スクリーニングは、前記ＧＰＣＲのアンタゴニストについてのスクリーニングである。
一定の実施形態において、前記スクリーニングは、その調節因子が、前記ＧＰＣＲの逆アゴニストであるかどうかの判定を含む。一定の実施形態において、前記スクリーニングは、その調節因子が、前記ＧＰＣＲのアンタゴニストであるかどうかの判定を含む。
本発明は、ＰＯＭＣ由来生物活性ペプチド関連疾患のための医薬として候補化合物をスクリーニングするためのＧＰＣＲの使用にも関し、この場合のＧＰＣＲは、
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列；
（ｂ）特異的プライマー配列番号７および配列番号８を使用してヒトＤＮＡサンプルに対するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅することができるポリヌクレオチドによってコードされているＧタンパク質結合受容体のアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号４のアミノ酸配列；
（ｄ）配列番号６のアミノ酸配列；
（ｅ）配列番号１、配列番号３または配列番号５の相補体にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされているＧタンパク質結合受容体のアミノ酸配列；
（ｆ）配列番号２、配列番号４または配列番号６に対して少なくとも約７０％の同一性を有するアミノ酸配列を有するＧタンパク質結合受容体のアミノ酸配列；
（ｇ）配列番号２、配列番号４または配列番号６のアミノ酸配列の変異体を有するＧタンパク質結合受容体のアミノ酸配列；
（ｈ）（ａ）から（ｇ）のうちのいずれか１つの生物活性フラグメント
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。
一定の実施形態において、前記ＧＰＣＲは、配列番号２のアミノ酸配列、または配列番号２に対して少なくとも約７０％の同一性を有するアミノ酸配列を有するＧタンパク質結合受容体のアミノ酸配列を含む。
一定の実施形態において、前記ＰＯＭＣ由来生物活性ペプチドは、ＡＣＴＨ、β−エンドルフィン、α−ＭＳＨ、β−ＭＳＨおよびγ−ＭＳＨからなる群より選択される。ＰＯＭＣ由来生物活性ペプチドは、本発明の実施形態に個々に含まれる場合もあり、任意の組み合わせで含まれる場合もあると、明白に考えられる。
一定の実施形態において、前記ＰＯＭＣ由来生物活性ペプチド関連疾患は、ＰＯＭＣ由来生物活性ペプチドの分泌レベルを増加させることによって改善される。一定の実施形態において、ＰＯＭＣ由来生物活性ペプチド関連疾患は、ＰＯＭＣ由来生物活性ペプチドの分泌レベルを減少させることによって改善される。一定の実施形態において、前記分泌レベルは、視床下部分泌レベルである。
一定の実施形態において、前記スクリーニングは、前記ＧＰＣＲのリガンドについてのスクリーニングである。
出願人らは、本発明の実施形態のいずれかから任意の１種以上の候補化合物を除外する権利を保持している。出願人らは、本発明の実施形態のいずれかから任意の１種以上の調節因子を除外する権利を保持している。例として、かつ限定としてではなく、出願人らは、本発明の実施形態のいずれかから任意の１種以上のアゴニスト、部分アゴニスト、逆アゴニストまたはアンタゴニストを除外する権利を保持している。出願人らは、本発明の実施形態のいずれかから任意のポリヌクレオチドおよびポリペプチドを除外する権利を保持している。出願人らは、さらに、本発明の実施形態のいずれかから任意の肥満に関連する状態、任意の炎症関連障害、任意の悪液質またはエネルギー恒常性に関連する任意のパラメータを除外する権利を保持している。本発明の肥満に関連する状態を、個別に１つの実施形態に、または任意の組み合わせのいずれかに含め得ること、本発明の肥満に関連する状態を、個別に１つの実施形態に、または任意の組み合わせのいずれかに含め得ること、任意の炎症関連障害を、個別に１つの実施形態に、または任意の組み合わせのいずれかに含め得ること、任意の悪液質を、個別に１つの実施形態に、または任意の組み合わせのいずれかに含め得ること、およびエネルギー恒常性に関連する任意のパラメータを、個別に１つの実施形態に、または任意の組み合わせのいずれかに含め得ることもまた明確に意図される。
さらなる労力を伴うことなく、当業者は、先の記載を使用して、本発明をその全文の内容まで実施することができると考えられる。前述の詳細な説明は、理解の明確化のみのために与えられ、そこからの不必要な制限と理解されるべきではない。本発明の範囲内での改変が、当業者には明らかになり得るからである。
本願の全体にわたって、種々の刊行物、特許、および公開特許出願が引用される。本願において引用されるこれらの刊行物、特許、および公開特許出願の開示は、参照によりそれらの全体が本明細書で本開示に援用される。刊行物、特許、または公開特許出願の出願人による本明細書での引用は、出願人による、上記刊行物、特許、または公開特許出願の先行技術としての認可ではない。
本願は、示された日付に米国速達郵便で米国特許商標庁に出願した、以下の仮特許出願からの優先権の利益を請求する：２００６年５月３１日出願、米国仮特許出願番号６０／８０９，６３４。前述の仮特許出願の開示は、その全体が参照により本明細書に援用される。
例証として、および限定としてではなく、図１は、ＧＰＲ１０１と関連のない内因性、構成的活性Ｇ結合ＧＰＣＲのＧα融合タンパク質構築物である「ターゲット受容体」に対する候補化合物の第一スクリーニングからの結果を示すものである。「化合物Ａ」についての結果をウェルＡ２に提供する。「化合物「Ｂ」についての結果をウェルＧ９に提供する。（実施例６参照）。 ＧＰＲ１０１は、細胞内ｃＡＭＰのレベルを増加させる検出可能な構成的活性を示す（実施例１２参照）。 ラット組織におけるＧＰＲ１０１発現のＲＴ−ＰＣＲ分析。（実施例１３参照）。 Ｂ．視床下部弓状核を含む、ラット脳におけるＧＰＲ１０１発現のインサイチュハイブリダイゼーション組織化学分析。（実施例１３参照）。 Ｃ．視床下部弓状核を含む、ラット脳におけるＧＰＲ１０１発現の免疫組織化学分析。（実施例１３参照）。 ラット視床下部弓状核のＰＯＭＣニューロンによるＧＰＲ１０１の発現の分析。（実施例１４）。 ラット視床下部弓状核のＮＰＹ／ＡｇＲＰニューロンによるＧＰＲ１０１の発現の分析。（実施例１４）。 マウス組織におけるＧＰＲ１０１発現のＴａｑＭａｎ分析。（実施例１５参照）。 Ａ．ＰＯＭＣおよび副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン（ＣＲＨ）の発現との比較でのヒト視床下部におけるＧＰＲ１０１の発現のインサイチュハイブリダイゼーション組織化学分析。Ｂ．ヒト視床下部弓状核におけるＰＯＭＣニューロンでのＧＰＲ１０１の発現。矢印は、ＧＰＲ１０１を発現する領域内のＰＯＭＣニューロンを示す。三角形は、ＧＰＲ１０１を検出可能に発現しない領域内のＰＯＭＣニューロンを示す。（実施例１６参照）。 Ａ．ＰＯＭＣおよび副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン（ＣＲＨ）の発現との比較でのヒト視床下部におけるＧＰＲ１０１の発現のインサイチュハイブリダイゼーション組織化学分析。Ｂ．ヒト視床下部弓状核におけるＰＯＭＣニューロンでのＧＰＲ１０１の発現。矢印は、ＧＰＲ１０１を発現する領域内のＰＯＭＣニューロンを示す。三角形は、ＧＰＲ１０１を検出可能に発現しない領域内のＰＯＭＣニューロンを示す。（実施例１６参照）。 Ａ．食事誘発肥満およびｄｂ／ｄｂマウスにおけるＧＰＲ１０１発現のＴａｑＭａｎ分析。Ｂ．食事誘発肥満およびｄｂ／ｄｂマウスにおけるＧＰＲ１０１発現のインサイチュハイブリダイゼーション組織化学分析分析（実施例１７参照）。 Ａ．食事誘発肥満およびｄｂ／ｄｂマウスにおけるＧＰＲ１０１発現のＴａｑＭａｎ分析。Ｂ．食事誘発肥満およびｄｂ／ｄｂマウスにおけるＧＰＲ１０１発現のインサイチュハイブリダイゼーション組織化学分析分析（実施例１７参照）。 肥満Ｆａ／Ｆａ ＺｕｃｋｅｒラットにおけるＧＰＲ１０１の視床下部発現の分析（実施例１８参照）。
詳細な説明
定義
脂肪蓄積とは、本明細書で使用される場合、体脂肪をいう。
アゴニストとは、ＧＰＣＲによって媒介される細胞内応答を誘発するために、ＧＰＣＲへの結合によってＧＰＣＲを活性化する因子（例えば、リガンド、候補化合物）を意味する。
アルツハイマー病は、１つより多くの認知領域における機能の有意な喪失を特徴とする、および多くの場合、行動または人格の変化を随伴する、進行性神経変性疾患である。アルツハイマー病は、認知症の最も一般的な原因である。一部の実施形態において、アルツハイマー病は、軽度認知障害（ＭＣＩ）を包含する。
本明細書で使用されるアミノ酸の省略形は表Ｂに示す：
（表Ｂ）
Figure 2009538623
 アンタゴニストとは、アゴニストまたは部分アゴニストとほぼ同じ部位でＧＰＣＲに結合し、好ましくは、競合的に結合するが、活性型のＧＰＣＲによって開始される細胞内応答を活性化せず、それによって、アゴニストまたは部分アゴニストによる細胞内応答を阻害可能である因子（例えば、リガンド、候補化合物）を意味する。アンタゴニストは、代表的には、アゴニストまたは部分アゴニストの非存在下でベースライン細胞内応答を減少しない。
抗体は、本明細書では、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を含めることを意図する。本発明の抗体は、当該分野で公知である任意の適切な方法によって調製されてもよい。
ＧＰＣＲポリペプチドまたはアミノ酸配列の生物学的に活性なフラグメントとは、天然に存在するＧＰＣＲの構造的な機能および生化学的な機能を有するポリペプチドまたはアミノ酸配列のフラグメントを意味する。特定の実施形態において、生物学的に活性なフラグメントは、Ｇタンパク質と共役する。特定の実施形態において、生物学的に活性なフラグメントは、リガンドに結合する。
脳炎症関連障害は、脳の傷害または外傷、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病、プリオン関連疾患、脳虚血（例えば、虚血性発作）、ＡＩＤＳによる認知症およびアルツハイマー病を含む（しかし、これらに限定されない）と解釈する。
悪液質は、慢性疾患または情動障害の過程で発生する一般的な体重減少および衰弱を意味するものとする。
候補化合物とは、スクリーニング技術が受け入れ可能である分子（例えば、非限定的に、化学化合物）を意味し、本明細書では、試験化合物と交換可能に使用される。
脳虚血は、血管の狭窄または閉塞に起因する脳への血液供給不足を意味するものとする。
コドンとは、一般的に、リン酸基に結合されたヌクレオシド［アデノシン（Ａ）、グアノシン（Ｇ）、シチジン（Ｃ）、ウリジン（Ｕ）、およびチミジン（Ｔ）］を含み、翻訳されるときにアミノ酸をコードする、３個のヌクレオチド（またはヌクレオチドの等価物）の集団を意味する。
組成物とは、少なくとも１つの成分を含む物質を意味する。
化合物の効力または効力とは、受容体の結合親和性とは対照的に、Ｇタンパク質結合受容体の機能性を刺激または阻害する化合物の能力の尺度を意味する。化合物の効力を測定する例示的な手段は、本特許文書の実施例の節に開示されている。
肥満に関連する状態は、以下を含むことを意図するがこれらに限定されない：高血圧、うっ血性心筋症、静脈瘤、肺塞栓症、冠性心疾患、脳卒中、特発性頭蓋内高血圧症、知覚異常性大腿神経痛、呼吸困難、閉塞性睡眠時無呼吸、低換気症候群、ピックウィック症候群、喘息、不動、変形性関節症、腰痛、線条萎縮すなわち「伸展裂創」、脚の静脈うっ滞、リンパ浮腫、蜂巣炎、間擦疹、癰、黒色表皮症、軟性線維腫、胃食道逆流障害、非アルコール性脂肪肝／脂肪性肝炎、胆石症、ヘルニア、結腸癌、緊張性尿失禁、肥満関連糸球体症、乳癌および子宮癌、うつ病および低い自己評価、損なわれた生活の質、メタボリック症候群、インスリン抵抗性、２型糖尿病、異脂肪血症、アテローム性動脈硬化症、女性の高アンドロゲン血症、多嚢胞性卵巣症候群、月経困難症、不妊症、妊娠合併症、および男性の性腺機能低下症。ある実施形態において、肥満に関連する状態は、高血圧、インスリン抵抗性、メタボリック症候群、２型糖尿病、異脂肪血症、アテローム性動脈硬化症、冠性心疾患、および脳卒中からなる群より選択される。
構成的に活性な受容体とは、受容体のリガンドまたはその化学的等価物への受容体の結合を通して以外の手段によって、活性状態で安定化されている受容体を意味する。構成的に活性な受容体は、内因性または非内因性であり得る。
構成的に活性化された受容体とは、構成的に活性であるように、または構成的により活性であるように修飾されている内因性受容体を意味する。
構成的な受容体活性化とは、受容体のリガンドまたはその化学的等価物への結合の非存在下での受容体の活性化を意味する。
接触するまたは接触とは、インビトロ系においてまたはインビボ系においてに関わらず、少なくとも２つの部分が一緒にされることを意味する。
直接的に同定するまたは直接的に同定されるとは、語句「候補化合物」または「試験化合物」との関連において、Ｇタンパク質結合受容体への既知のリガンド（例えば、既知のアゴニスト）の非存在下での、Ｇタンパク質結合受容体に対する化合物のスクリーニングを意味する。
異脂肪血症とは、本明細書で使用される場合、異常な濃度の血清脂質、例えば、ＨＤＬ（低濃度）、ＬＤＬ（高濃度）、ＶＬＤＬ（高濃度）、トリグリセリド（高濃度）、リポタンパク質（ａ）（高濃度）、遊離脂肪酸（高濃度）、および他の血清脂質、またはその組み合わせをいう。
内因性は、脊椎動物（例えば、哺乳動物またはヒトであるが、これらに限定されない）が天然に産生する物質を意味する。例えば、しかし、非限定的に、用語「受容体」と関連する内因性は、脊椎動物（例えば、哺乳動物またはヒトであるが、これらに限定されない）によって天然に産生される物質を意味する。内因性は、遺伝子の対立遺伝子改変体、ならびにそのようにコードされている対立遺伝子ポリペプチド改変体を含むことが理解される。本明細書で使用される場合、「内因性ＧＰＣＲ」および「ネイティブＧＰＣＲ」は交換可能に使用される。対照的に、非内因性という用語は、この状況において、脊椎動物（例えば、哺乳動物またはヒトであるが、これらに限定されない）によって天然に産生されない物質を意味する。
発現ベクターは、発現ベクターのための適切な組換え宿主細胞中で、クローニングされたＤＮＡの転写および転写されたｍＲＮＡの翻訳のために必要とされるＤＮＡ配列を意味する。適切に構築された発現ベクターは、宿主細胞中での自律的な複製のための複製起点、選択マーカー、限られた数の有用な制限酵素部位、高コピー数のための潜在能力、および活性なプロモーターを含むべきである。転写されるためにクローニングされるＤＮＡは、発現ベクターの中の構成的にまたは条件的に活性なプロモーターに作動可能に連結される。
Ｇタンパク質結合受容体融合タンパク質およびＧＰＣＲ融合タンパク質は、本明細書に開示される本発明の状況において、各々が、少なくとも１つのＧタンパク質、最も好ましくは、このようなＧタンパク質のアルファ（α）サブユニット（これはＧＴＰを結合するサブユニットである）に融合された、内因性の構成的に活性なＧＰＣＲ、または非内因性の構成的に活性化されたＧＰＣＲを含む、非内因性タンパク質を意味し、このＧタンパク質は、好ましくは、内因性ＧＰＣＲと天然に共役するＧタンパク質と同じ型である。好ましい型において、Ｇタンパク質は、ＧＰＣＲのＣ末端に直接的に融合可能であり、または２つの間にスペーサーが存在してもよい。
宿主細胞は、そこに組み込まれたベクターを有することが可能である細胞を意味する。現在の状況において、ベクターは、代表的には、ＧＰＣＲまたはＧＰＣＲ融合タンパク質の発現が起こることを可能にするために、適切なプロモーター配列との作動可能な接続にあるＧＰＣＲまたはＧＰＣＲ融合タンパク質をコードする核酸を含む。
本明細書において用いる場合、耐糖能障害（ＩＧＴ）は、真性２型糖尿病と正常耐糖能（ＮＧＴ）の中間であるインスリン抵抗性に関連した状態を示すと解釈する。ＩＧＴは、罹患者の食後ブドウ糖反応を食事の２時間後のブドウ糖レベルによって評価して異常であると判定する手順によって診断する。この試験では、測定した量のブドウ糖をその患者に与え、血糖レベルを定期的に、通常、最初の２時間は半時間ごとにおよびその後は１時間ごとに、測定する。「正常」または非ＩＧＴ被験者の場合、ブドウ糖レベルは、最初の２時間の間に１４０ｍｇ／ｄＬ未満のレベルに上昇し、その後、急速に降下する。ＩＧＴ被験者の場合、血糖レベルは、より高く、降下レベルは、より低速である。
予防または治療の必要があるとは、本明細書で使用される場合、介護者（例えば、ヒトの場合においては医師、看護師、ナース・プラクティショナーなど；非ヒト哺乳動物を含む動物の場合においては獣医）によって行われる、被験体または動物が治療を必要としているか、または治療から利益を受ける判断をいう。この判断は、介護者の経験の範囲にあるが、本発明の化合物によって治療可能である状態の結果として、被験体または動物が病気であるか、または病気になるであろうという知識を含む、種々の要因に基づいて行われる。
炎症関連障害は、炎症性腸疾患（例えば、クローン病および潰瘍性大腸炎）、炎症性関節炎（例えば、関節リウマチおよび乾癬性関節炎）、乾癬、喘息、慢性閉塞性肺疾患、敗血症性ショック、虚血／再潅流傷害、播種性血管内凝固、アテローム性硬化症、骨粗しょう症、再狭窄、全身性エリテマトーデス、急性移植拒絶反応、心筋梗塞、膵炎、肝炎、静脈血栓症、多発性損傷、うっ血性心不全、末梢神経損傷、および脳炎症関連障害を含む（しかし、これらに限定されない）と解釈する。一部の実施形態において、炎症関連障害は、炎症性腸疾患、炎症性関節炎、敗血症ショック、虚血／再潅流傷害、アテローム性硬化症、骨粗しょう症、再狭窄、心筋梗塞、うっ血性心不全、および脳炎症関連障害からなる群より選択される。
阻害するまたは阻害とは、用語「応答」との関連において、化合物の非存在下においてとは反対に、化合物の存在下で、応答が減少または妨害されることを意味する。
本明細書において用いる場合、インスリン抵抗性は、静脈耐糖能試験または空腹時インスリンレベルの測定をはじめとする（しかし、これらに限定されない）多数の方法のいずれかによって行われるインスリン抵抗性の通常の診断を包含すると解釈する。空腹時インスリンレベルの高さとインスリン抵抗性度の間には卓越した相関関係があることは周知である。従って、どの正常耐糖能（ＮＧＴ）被験者がインスリン抵抗性を有するかを特定するために、上昇した空腹時インスリンレベルをインスリン抵抗性の代用マーカーとして使用することができる。インスリン抵抗性の診断は、正常血糖グルコースクランプ試験を使用して行うこともできる。
逆アゴニストとは、ＧＰＣＲに結合し、活性型の受容体によって開始されたベースライン細胞内応答を、アゴニストまたは部分アゴニストの非存在下で観察される正常な基礎レベル活性より下に阻害する因子（例えば、リガンド、候補化合物）を意味する。
リガンドとは、本明細書で使用される場合、ＧＰＣＲに特異的に結合する分子を意味する。内因性リガンドは、ネイティブＧＰＣＲに結合する内因性分子である。ＧＰＣＲのリガンドは、ＧＰＣＲのアゴニスト、部分アゴニスト、逆アゴニスト、またはアンタゴニストである可能性があるが、これらに限定されない。
メタボリック症候群とは、本明細書で定義されるように、および成人治療パネルＩＩＩ（ＡＴＰ ＩＩＩ；Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ：Ｔｈｉｒｄ Ｒｅｐｏｒｔ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ Ｐｒｏｇｒａｍ Ｅｘｐｅｒｔ Ｐａｎｅｌ ｏｎ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ，Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｉｇｈ Ｂｌｏｏｄ Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ ｉｎ Ａｄｕｌｔｓ（Ａｄｕｌｔ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ
Ｐａｎｅｌ ＩＩＩ），Ｅｘｅｃｕｔｉｖｅ Ｓｕｍｍａｒｙ；Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｈｅａｒｔ，Ｌｕｎｇ ａｎｄ Ｂｌｏｏｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，２００１（ＮＩＨ ｐｕｂ．Ｎｏ ０１−３６７０））に従って、ヒトが、肥満、高トリグリセリド血症、低ＨＤＬグリセロール、高血圧、および空腹時高血糖に関連する５つの判断基準の内の３つ以上に合致する場合に起こる。
本明細書で使用される場合、調節するまたは修飾するという用語は、特定の活性、機能、または分子の量、質、または効果の増加または減少をいうことを意味する。
調節因子は、本明細書中上記で定義されたアゴニスト、部分アゴニスト、逆アゴニスト、およびアンタゴニストを含むと理解される。
肥満は、本明細書で使用される場合、体重のＷＨＯ分類に従って、３０．０以上の肥満度指数（ＢＭＩ）として定義される［Ｋｏｐｅｌｍａｎ，Ｎａｔｕｒｅ（２０００）４０４：６３５−６４３；この開示はその全体が参照により本明細書に援用される］。特定の実施形態において、肥満は、体脂肪含量に基づいて定義される：男性では２５％より上、女性では３０％より上である。
過体重とは、本明細書で使用される場合、２７〜２９．９の肥満度指数（ＢＭＩ）として定義される。
パーキンソン病は、運動症状、例えば、振戦、運動緩慢、筋肉硬直、歩行機能不全および姿勢不安定を特徴とする慢性、進行性神経変性疾患である。研究者たちにより、黒質におけるドーパミン作動性ニューロンの変性が主病態生理メカニズムとして特定された。
部分アゴニストとは、完全アゴニストよりも少ない範囲または程度ではあるが、ＧＰＣＲによって媒介される細胞内応答を誘発するために、ＧＰＣＲへの結合によってＧＰＣＲを活性化する因子（例えば、リガンド、候補化合物）を意味する。
薬学的組成物は、少なくとも１つの活性成分を含み、それによって、組成物が、哺乳動物（例えば、ヒトであるがこれに限定されない）における特定の有効な結果のための治験に受け入れ可能である組成物を意味する。当業者は、例えば、当業者の必要性に基づいて、活性成分が所望の有効な結果を有するか否かを決定するために適切な技術を理解および評価する。
ポリヌクレオチドとは、一本鎖または二重鎖型のいずれかである１つより多くのヌクレオチドのＲＮＡ、ＤＮＡ、またはＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド配列をいう。本発明のポリヌクレオチドは、合成、組換え、エキソビボ生成、またはこれらの組み合わせ、ならびに当該分野で公知の任意の精製方法利用することを含む任意の公知の方法によって調製されてもよい。
ポリペプチドとは、ポリマーの長さに関わらず、アミノ酸のポリマーをいう。従って、ペプチド、オリゴペプチド、およびタンパク質は、ポリペプチドの定義の中に含まれる。この用語はまた、ポリペプチドの発現後修飾を特定または除外しない。例えば、グリコシル基、アセチル基、リン酸基、脂質基などの共有結合を含むポリペプチドは、ポリペプチドという用語に明確に含まれる。
本明細書において用いる場合、ＰＯＭＣ由来生物活性ペプチドは、生物活性を刺激または阻害できる、ＰＯＭＣのタンパク質分解的切断を含む方法などにより、ＰＯＭＣから得られるペプチドを指すものとする。例証として、および限定としてではなく、前記生物活性は、ＧＰＣＲの活性化であり得る。
本明細書において用いる場合、ＰＯＭＣ由来生物活性ペプチド関連疾患は、ＰＯＭＣ由来生物活性ペプチドの分泌レベルを増加または減少させることによって改善される疾患を指すものとし、この場合、前記分泌レベルは、視床下部分泌レベルを包含するが、必ずしも視床下部分泌レベルに限定されないものと解釈する。
プライマーは、標的ヌクレオチド配列に相補的である特定のヌクレオチド配列を示すために本明細書で使用され、標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズするために使用される。プライマーは、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、または逆転写酵素によって触媒されるヌクレオチド重合のための開始点として働く。
受容体機能とは、遺伝子転写の調節、イオンの流入もしくは流出の調節、触媒反応をもたらすこと、および／またはＧタンパク質を通しての活性の調節、例えば、二次メッセンジャー応答を誘発することを含むがこれらに限定されない、細胞内で刺激を受け取り、効果を調節するための受容体の正常の操作をいう。
二次メッセンジャーは、受容体活性化の結果として生じる細胞内応答を意味する。二次メッセンジャーには、例えば、イノシトール１，４，５−三リン酸（ＩＰ３）、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）、サイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）、サイクリックＧＭＰ（ｃＧＭＰ）、ＭＡＰキナーゼ活性、ＭＡＰＫ／ＥＲＫキナーゼキナーゼ−１（ＭＥＫＫ１）活性、およびＣａ２＋を含めることができる。二次メッセンジャー応答は、受容体活性化の決定のために測定することができる。加えて、二次メッセンジャー応答は、例えば、受容体の逆アゴニスト、部分アゴニスト、アゴニスト、およびアンタゴニストとしての候補化合物の同定のために測定することができる。
本明細書において用いる場合、選択的ＧＰＲ１０１リガンドは、ＧＰＲ１６１（ＲＥ２受容体としても知られている；例えば、ヒトＧＰＲ１６１についてはＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）アクセッション番号ＣＡＩ２２６２４を参照のこと）などの１つまたはそれ以上の密接に関連した受容体よりもＧＰＲ１０１受容体に対して選択性を有するＧＰＲ１０１のリガンドを指す。
本明細書において用いる場合、選択的ＧＰＲ１０１調節因子は、ＧＰＲ１６１（ＲＥ２受容体としても知られている；例えば、ヒトＧＰＲ１６１についてはＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）アクセッション番号ＣＡＩ２２６２４を参照のこと）などの１つまたはそれ以上の密接に関連した受容体よりもＧＰＲ１０１受容体に対して選択性を有するＧＰＲ１０１の調節因子を指す。例証として、および限定としてではなく、選択的ＧＰＲ１０１調節因子は、選択的ＧＰＲ１０１アゴニスト、部分アゴニスト、逆アゴニストまたはアンタゴニストであり得る。
小分子とは、モルあたり約１０，０００グラム未満の分子量を有する化合物を意味と解釈され、これには、ペプチド、ペプチド模倣物、アミノ酸、アミノ酸アナログ、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドアナログ、ヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、有機化合物または無機化合物（すなわち、ヘテロ有機化合物または有機金属化合物を含む）、およびその塩、エステル、および他の薬学的に受容可能な型が含まれる。特定の好ましい実施形態において、小分子は、モルあたり約５，０００グラム未満の分子量を有する有機化合物または無機化合物である。特定の実施形態において、小分子は、モルあたり約１，０００グラム未満の分子量を有する有機化合物または無機化合物である。特定の好ましい実施形態において、小分子は、モルあたり約５００グラム未満の分子量を有する有機化合物または無機化合物である。
刺激するまたは刺激とは、用語「応答」との関連において、化合物の非存在下においてとは反対に、化合物の存在下で、応答が増加されることを意味する。
卒中は、脳に血液を供給する血管に影響を及ぼす心血管疾患であり、本明細書では、脳血栓、卒中の最も一般的なタイプ、を含むと解釈する。脳血栓は、脳部分に血液をもたらす動脈内に血餅（血栓）が形成し、血流を遮断すると発生する。血餅は、通常、アテローム性硬化症によって損傷された動脈内で形成する。
本明細書において用いる場合、被験者は、好ましくは脊椎動物であり、該脊椎動物としては、魚類（例えば、商業養殖魚、ペット用魚類など）、両生類（例えば、カエル、ヒキガエル、ペット用両生類）、爬虫類（例えば、ヘビ、トカゲ、カメ、ペット用爬虫類など）、鳥類（例えば、ニワトリ、シチメンチョウ、ペット用鳥類など）および哺乳類（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ブタ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、非ヒト霊長類（例えば、アカゲザルおよびチンパンジー）、非ヒト哺乳動物、ペット用非ヒト哺乳動物、ヒトなど）が挙げられるが、これらに限定されない。一定の実施形態において、被験者は、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ブタ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、非ヒト霊長類またはヒトである（これらは、本発明の実施形態に個々に含まれる場合もあり、任意の組み合わせで含まれる場合もある）。一定の実施形態において、被験者は、人間の愛玩動物（例えば、イヌ、ネコなど）、家畜（例えば、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ニワトリなど）、競技用動物（例えば、ウマ、イヌなど）、荷物運搬用動物（例えば、ラバ、ラクダなど）または外来動物（例えば、動物園において見出される動物など）であり、これらは、本発明の実施形態に個々に含まれる場合もあり、任意の組み合わせで含まれる場合もある。一定の実施形態において、被験者は、哺乳動物である。一定の実施形態において、被験者は、非ヒト哺乳動物である。一定の実施形態において、被験者は、ヒトである。
治療有効量とは、本明細書で使用される場合、研究者、獣医、医師、または他の臨床家によって探索される、組織、系、動物、被験体、またはヒトにおいて生物学的応答または医薬品の応答を誘発する活性化合物または医薬品の量をいい、この応答は以下の１つ以上を含む：
（１）疾患を予防すること；例えば、疾患、状態、または障害になる素因を有する可能性があるが、その疾患の病理または徴候をまだ経験していないかまたは示していない被験体において、疾患、状態、または障害を予防すること、
（２）疾患を抑制すること；例えば、疾患、状態、または障害の病理または徴候を経験しているかまたは示している被験体において、疾患、状態、または障害を抑制すること（すなわち、病理および／または徴候のさらなる発生を阻止すること）、および
（３）疾患を改善すること；例えば、疾患、状態、または障害の病理または徴候を経験しているかまたは示している被験体において、疾患、状態、または障害を改善すること（すなわち、病理および／または徴候を逆転すること）。
改変体は、この用語が本明細書で使用される場合、参照ポリヌクレオチドまたはポリペプチドからそれぞれ異なるが、本質的な特性を保持しているポリヌクレオチドまたはポリペプチドである。ポリヌクレオチドの代表的な改変体は、別の参照ポリヌクレオチドとはヌクレオチド配列が異なる。改変体のヌクレオチド配列の変化は、参照ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を変化させてもよいし、または変化させなくてもよい。ポリペプチドの代表的な改変体は、別の参照ポリペプチドとはアミノ酸配列が異なる。改変体および参照ポリペプチドは、任意の組み合わせの１つ以上の置換、付加、欠失によってアミノ酸配列が異なってもよい。ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの改変体は、対立遺伝子改変体などの天然に存在するものであってもよいし、または天然に存在することが知られていない改変体であってもよい。ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの天然に存在しない改変体は、変異誘発技術または直接的合成によって作製されてもよい。
Ａ．緒言
以下の節の順番は、提示の効率のために示され、本開示または添付の特許請求の範囲に対する限定として意図されておらず、そのように解釈されるべきでもない。
Ｂ．受容体発現
１．目的のＧＰＣＲポリペプチド
本発明のＧＰＣＲは、以下からなる群より選択されるアミノ酸配列またはその改変体または生物学的に活性なフラグメントを含み得る：
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列；
（ｂ）特異的プライマー配列番号７および配列番号８を使用してヒトＤＮＡサンプルに対するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅することができるポリヌクレオチドによってコードされているＧタンパク質結合受容体のアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号４のアミノ酸配列；
（ｄ）配列番号６のアミノ酸配列；
（ｅ）配列番号１、配列番号３または配列番号５の相補体にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされているＧタンパク質結合受容体のアミノ酸配列；
（ｆ）配列番号２、配列番号４または配列番号６に対して少なくとも約７０％の同一性を有するアミノ酸配列を有するＧタンパク質結合受容体のアミノ酸配列；
（ｇ）配列番号２、配列番号４または配列番号６のアミノ酸配列の変異体を有するＧタンパク質結合受容体のアミノ酸配列；
（ｈ）（ａ）から（ｇ）のうちのいずれか１つの生物活性フラグメント
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むことができる。
一定の実施形態において、本発明のＧＰＣＲは、配列番号２のアミノ酸配列を含む。
一定の実施形態において、ポリメラーゼ連鎖反応によって増幅することができるポリヌクレオチドによってコードされているＧタンパク質結合受容体は、内因性Ｇタンパク質結合受容体である。一部の実施形態において、ポリメラーゼ連鎖反応によって増幅することができるポリヌクレオチドによってコードされている、および内因性Ｇタンパク質結合受容体である、Ｇタンパク質結合受容体は、ヒトＧタンパク質結合受容体である。一部の実施形態において、ポリメラーゼ連鎖反応によって増幅することができるポリヌクレオチドによってコードされている、および内因性Ｇタンパク質結合受容体である、Ｇタンパク質結合受容体は、ヒトＧＰＲ１０１受容体である。一定の実施形態において、ポリメラーゼ連鎖反応によって増幅することができるポリヌクレオチドによってコードされているＧタンパク質結合受容体は、配列番号２またはその対立遺伝子である。一定の実施形態において、ポリメラーゼ連鎖反応によって増幅することができるポリヌクレオチドによってコードされているＧタンパク質結合受容体は、配列番号２の対立遺伝子である。一部の実施形態において、ポリメラーゼ連鎖反応によって増幅することができるポリヌクレオチドによってコードされているＧタンパク質結合受容体は、検出可能なレベルの構成的活性を示す。一部の実施形態において、前記構成的活性は、Ｇに結合するＧタンパク質結合受容体と一致して細胞内ｃＡＰＭレベルを増加させる活性である。一部の実施形態において、前記構成的活性は、メラニン保有細胞を色素分散させる活性である。一部の実施形態において、ポリメラーゼ連鎖反応によって増幅することができるポリヌクレオチドによってコードされているＧタンパク質結合受容体は、Ｇに結合する。
一部の実施形態において、前記ヒトＤＮＡは、ゲノムＤＮＡである。
一部の実施形態において、前記ポリメラーゼ連鎖反応は、逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）である。ＲＴ−ＰＣＲ技術は、当業者に周知である。一部の実施形態において、前記ヒトＤＮＡは、ＧＰＲ１０１を発現する組織または細胞に由来するヒトｃＤＮＡである。一部の実施形態において、前記ＧＰＲ１０１を発現するヒト組織は、脳または視床下部である。一定の実施形態において、前記ｃＤＮＡは、ＧＰＲ１０１を発現するヒト細胞からのものである。一部の実施形態において、前記ｃＤＮＡは、ＰＯＭＣニューロン細胞からのものである。一部の実施形態において、前記細胞は、細胞株である。
一部の実施形態において、本発明のＧＰＣＲは、組換え体である。一部の実施形態において、前記組換え型ＧＰＣＲは、組換え型ヒトＧＰＲ１０１である。
一定の実施形態において、本主題方法において使用することができるＧＰＣＲは、検出可能なレベルの構成的活性を示す。一部の実施形態において、前記構成的活性は、Ｇに結合するＧＰＣＲと一致して細胞内ｃＡＭＰのレベルを増加させる活性である。一部の実施形態において、前記構成的活性は、メラニン保有細胞を色素分散させる活性である。一部の実施形態において、前記ＧＰＣＲは、Ｇに結合する。
一部の実施形態において、本発明のＧＰＣＲは、内因性である。一部の実施形態において、本発明のＧＰＣＲは、哺乳動物ＧＰＲ１０１である。一部の実施形態において、内因性である本発明のＧＰＣＲは、哺乳動物ＧＰＲ１０１である。一部の実施形態において、内因性である本発明のＧＰＣＲは、ヒトＧＰＲ１０１である。
一部の実施形態において、本発明のＧＰＣＲは、非内因性である。
例証として、および限定としてではなく、Ｎ末端メチオニン残基の欠失は、本主題発明において使用することができ生物活性フラグメントをもたらすと考えられる。例証として、および限定としてではなく、配列番号２のアミノ酸２−５０８、配列番号４のアミノ酸２−５１１および配列番号６のアミノ酸２−５０８は、本発明の範囲内の生物活性フラグメントであると明白に考えられる。一部の実施形態において、本発明の生物活性フラグメントは、その末端が、Ｎ末端メチオニン残基と検出可能なレベルの構成的活性を示すＨＡエピトープタグとを含むペプチドに場合によっては融合している、フラグメントである。一部の実施形態において、前記構成的活性は、Ｇに結合する生物活性フラグメントと一致して細胞内ｃＡＭＰのレベルを増加させる活性である。一部の実施形態において、前記構成的活性は、メラニン保有細胞を色素分散させる活性である。一部の実施形態において、本発明の生物活性フラグメントは、そのＮ末端が、Ｎ末端メチオニン残基とＨＡエピトープタグとを含むペプチドに場合によっては融合している、フラグメントであり、Ｇに結合する。一定の実施形態において、前記フラグメントは、そのＮ末端で、Ｎ末端メチオニン残基とＨＡエピトープタグから本質的に成るペプチドに融合している。Ｎ末端メチオニン残基とＨＡエピトープタグから本質的に成るペプチドをポリペプチドフラグメントのＮ末端に融合させるための技術は、当該技術分野において周知であり、市場で入手することができる（例えば、カリフォルニア州、マウンテン・ビューのＣｌｏｎｔｅｃｈ）。
配列番号２のヒトＧＰＲ１０１の、または配列番号４のマウスＧＰＲ１０１の、または配列番号６のラットＧＰＲ１０１の対立遺伝子変異体は、本発明の範囲内であると考えられる。ヒトＧＰＲ１０１は、本発明の範囲内であると考えられる。
配列番号２のヒトＧＰＲ１０１の脊椎動物オルソログである変異体は、本発明の範囲内であると考えられる。配列番号２のヒトＧＰＲ１０１の哺乳動物オルソログは、本発明の範囲内であると考えられる。例証として、および限定としてではなく、マウスＧＰＲ１０１（例えば、配列番号４）、ラットＧＰＲ１０１（例えば、配列番号６）、ウシＧＰＲ１０１（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）アクセッション番号ＸＰ＿５８２６５０）、イヌＧＰＲ１０１（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）アクセッション番号ＸＰ＿５４９２８７）および非ヒト霊長類ＧＰＲ１０１は、本発明の範囲内であると考えられる。
一定の実施形態において、配列番号２のアミノ酸配列の変異体、配列番号４のアミノ酸配列の変異体、または配列番号６のアミノ酸配列の変異体を有するＧタンパク質結合受容体は、検出可能なレベルの構成的活性を示す。一定の実施形態において、配列番号２のアミノ酸配列の変異体、配列番号４のアミノ酸配列の変異体、または配列番号６のアミノ酸配列の変異体を有するＧタンパク質結合受容体は、構成的に活性である。一部の実施形態において、前記構成的活性は、細胞内ｃＡＭＰのレベルを増加させる活性である。一部の実施形態において、前記構成的活性は、Ｇに結合するＧタンパク質結合受容体と一致して細胞内ｃＡＭＰのレベルを増加させる活性である。一部の実施形態において、前記構成的活性は、メラニン保有細胞を色素分散させる活性である。一部の実施形態において、配列番号２のアミノ酸配列の変異体、配列番号４のアミノ酸配列の変異体、または配列番号６のアミノ酸配列の変異体を有するＧタンパク質結合受容体は、Ｇに結合する。
配列番号２、配列番号４または配列番号６とそれぞれ少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有する配列番号２、配列番号４または配列番号６の変異体は、本発明の範囲内であると考えられる。一定の実施形態において、配列番号２、配列番号４または配列番号６とそれぞれ少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有する配列番号２、配列番号４または配列番号６の変異体は、ＧＰＣＲである。一部の実施形態において、前記配列番号２、配列番号４または配列番号６の変異体は、内因性ＧＰＣＲである。一部の実施形態において、前記配列番号２、配列番号４または配列番号６の変異体は、非内因性ＧＰＣＲである。一部の実施形態において、内因性ＧＰＣＲである前記配列番号２、配列番号４または配列番号６の変異体は、哺乳動物ＧＰＣＲである。一部の実施形態において、配列番号２、配列番号４または配列番号６とそれぞれ少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有する配列番号２、配列番号４または配列番号６の変異体は、検出可能なレベルの構成的活性を示す。一部の実施形態において、前記構成的活性は、Ｇに結合するその変異体に一致して細胞内ｃＡＭＰのレベルを増加させる活性である。一部の実施形態において、前記構成的活性は、メラニン保有細胞を色素分散させる活性である。一定の実施形態において、配列番号２、配列番号４または配列番号６とそれぞれ少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有する配列番号２、配列番号４または配列番号６の変異体は、Ｇに結合する。同一性パーセントは、公知のコンピュータプログラムを使用して従来どおり決定することができる。
一定の実施形態において、本主題方法において使用することができる変異体ＧＰＣＲは、配列番号２に対して少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有する。例えば、配列番号２との９５％の「同一性」を有する変異体ＧＰＣＲとは、その変異体のアミノ酸配列が、配列番号２の１００のアミノ酸それぞれにつき５以下のアミノ酸改変を含む場合があることを除き、配列番号２のアミノ酸１−５０８と同一であることを意味する。従って、例えば、配列番号２のアミノ酸配列との少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を得るために、配列番号２のアミノ酸１−５０８と比較して、その配列内のアミノ酸残基の５％（１００のうち５）以下に挿入、欠失または別のアミノ酸での置換があってもよい。これらの改変は、アミノもしくはカルボキシ末端で行われる場合もあり、または主としてその配列内の残基の間にもしくはその配列内の１つ以上の隣接する基の中に散在する、末端位置の間のどこかで行われる場合もある。
一部の実施形態において、本主題方法において使用することができる変異体ＧＰＣＲは、配列番号１、配列番号３または配列番号５の相補体にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされているＧＰＣＲである。一部の実施形態において、本主題方法において使用することができる変異体ＧＰＣＲは、配列番号１の相補体にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされているＧＰＣＲである。一部の実施形態において、前記配列番号１、配列番号３または配列番号５の相補体にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされているＧＰＣＲは、内因性ＧＰＣＲである。一部の実施形態において、前記配列番号１、配列番号３または配列番号５の相補体にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされているＧＰＣＲは、非内因性ＧＰＣＲである。一部の実施形態において、前記配列番号１、配列番号３または配列番号５の相補体にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされており、内因性ＧＰＣＲであるＧＰＣＲは、哺乳動物内因性ＧＰＣＲである。一部の実施形態において、前記配列番号１、配列番号３または配列番号５の相補体にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされているＧＰＣＲは、配列番号２もしくはその対立遺伝子、配列番号４もしくはその対立遺伝子、または配列番号６もしくはその対立遺伝子である。一部の実施形態において、前記配列番号１、配列番号３または配列番号５の相補体にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされているＧＰＣＲは、配列番号２、配列番号４または配列番号６の脊椎動物オルソログである。一定の実施形態において、前記脊椎動物は、哺乳動物である。一定の実施形態において、前記配列番号１、配列番号３または配列番号５の相補体にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされているＧＰＣＲは、検出可能なレベルの構成的活性を示す。一部の実施形態において、前記構成的活性は、Ｇに結合するＧＰＣＲと一致して細胞内ｃＡＭＰのレベルを増加させる活性である。一部の実施形態において、前記構成的活性は、メラニン保有細胞を色素分散させる活性である。一定の実施形態において、前記配列番号１、配列番号３または配列番号５の相補体にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされているＧＰＣＲは、Ｇに結合する。ハイブリダイゼーション技術は、当業者には周知である（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ Ｔ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙを参照のこと）。例示的ストリンジェントハイブリダイゼーション条件は、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１×ＳＳＣ＝１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭ クエン酸ナトリウム）、および１％ ＳＤＳを含む溶液中、４２℃でのハイブリダイゼーション反応の実施、ならびに０．１〜０．２×ＳＳＣおよび０．１％ ＳＤＳを含む溶液中、６５℃での洗浄を含む。一定の実施形態において、ストリンジェントハイブリダイゼーション条件は、０．１〜０．２×ＳＳＣを含む溶液中、５５〜６５℃での洗浄を含む。一定の実施形態において、ストリンジェントハイブリダイゼーション条件は、０．１〜０．２×ＳＳＣおよび０．１％ ＳＤＳを含む溶液中、５５℃での洗浄を含む。一定の実施形態において、ストリンジェントハイブリダイゼーション条件は、０．１〜０．２×ＳＳＣおよび０．１％ ＳＤＳを含む溶液中、６０℃での洗浄を含む。一定の実施形態において、ストリンジェントハイブリダイゼーション条件は、０．１〜０．２×ＳＳＣおよび０．１％ ＳＤＳを含む溶液中、６５℃での洗浄を含む。一定の実施形態において、ストリンジェントハイブリダイゼーション条件は、０．１×ＳＳＣを含む溶液中での洗浄を含む。一定の実施形態において、ストリンジェントハイブリダイゼーション条件は、０．１×ＳＳＣおよび０．１％ ＳＤＳを含む溶液中での洗浄を含む。一定の実施形態において、ストリンジェントハイブリダイゼーション条件は、０．２×ＳＳＣを含む溶液中での洗浄を含む。一定の実施形態において、ストリンジェントハイブリダイゼーション条件は、０．２×ＳＳＣおよび０．１％ ＳＤＳを含む溶液中での洗浄を含む。
一部の実施形態において、本主題方法において使用することができるＧＰＣＲは、配列番号２のアミノ酸位置３９８のアラニンがアラニン以外のアミノ酸で置換されている配列番号２のアミノ酸配列を含む、非内因性、構成的活性受容体である。一部の実施形態において、前記アラニン以外のアミノ酸は、リシンである。一部の実施形態において、前記アラニン以外のアミノ酸は、アルギニンである。一部の実施形態において、前記アラニン以外のアミノ酸は、ヒスチジンである。
一定の実施形態において、本発明のＧＰＣＲは、Ｇタンパク質との融合タンパク質の一部を構成する。
ａ．配列同一性
特定の実施形態において、同一性パーセントは、当該分野において周知であるＢａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（「ＢＬＡＳＴ」）を使用して評価される［例えば、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ（１９９０）８７：２２６４−２２６８；Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ（１９９０）２１５：４０３−４１０；Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９９３）３：２６６−２７２；ならびにＡｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ（１９９７）２５：３３８９−３４０２を参照のこと；この各々の開示は、その全体が参照により本明細書に援用される］。ＢＬＡＳＴプログラムは、デフォルトパラメータを用いて、またはユーザーによって提供される改変パラメータを用いて使用されてもよい。好ましくは、パラメータはデフォルトパラメータである。
一部の実施形態において、グローバル配列アラインメントとも呼ばれる、照会配列（例えば、配列番号２のアミノ酸配列）と取り調べる配列の間の最高の全体的な一致を決定するための好ましい方法は、Ｂｒｕｔｌａｇら［Ｃｏｍｐ Ａｐｐ Ｂｉｏｓｃｉ（１９９０）６：２３７−２４５；この開示はその全体が参照により本明細書に援用される］のアルゴリズムに基づくＦＡＳＴＤＢコンピュータプログラムを使用して決定することができる。配列アラインメントにおいて、照会配列と取り調べる配列の両方がアミノ酸配列である。上記グローバル配列アラインメントの結果は同一性パーセントである。ＦＡＳＴＤＢアミノ酸配列アラインメントにおいて使用される好ましいパラメータは以下の通りである：マトリックス（Ｍａｔｒｉｘ）＝ＰＡＭ ０、ｋ−組（ｔｕｐｌｅ）＝２、ミスマッチペナルティー（Ｍｉｓｍａｔｃｈ Ｐｅｎａｌｔｙ）＝ｌ、結合ペナルティー（Ｊｏｉｎｉｎｇ Ｐｅｎａｌｔｙ）＝２０、ランダム化グループ（Ｒａｎｄｏｍｉｚａｔｉｏｎ Ｇｒｏｕｐ）＝２５、長さ（Ｌｅｎｇｔｈ）＝０、カットオフスコア（Ｃｕｔｏｆｆ Ｓｃｏｒｅ）＝ｌ、ウィンドウサイズ（Ｗｉｎｄｏｗ Ｓｉｚｅ）＝配列長、ギャップペナルティー＝５、ギャップサイズペナルティー＝０．０５、ウィンドウサイズ＝２４７または取り調べるアミノ酸配列の長さのうちのどちらか短い方。
取り調べる配列が、内部欠失によってではなくＮ末端またはＣ末端の欠失に起因して照会配列よりも短い場合、同一性パーセントの結果は、手動で補正されなければならない。なぜなら、ＦＡＳＴＤＢプログラムは、グローバル同一性パーセントを計算するときに、取り調べる配列のＮ末端またはＣ末端の短縮を考慮しないからである。照会配列と比較して、Ｎ末端またはＣ末端において短縮された取り調べる配列については、照会配列の全体の塩基のパーセントとして、対応する取り調べる配列の残基と一致／アラインされない取り調べる配列のＮ末端およびＣ末端である照会配列の残基の数を計算することによって、同一性パーセントは補正される。残基が一致／アラインされるか否かは、ＦＡＳＴＤＢ配列アラインメントの結果によって決定される。次いで、このパーセンテージは、同一性パーセントから減算され、特定のパラメータを使用して上記のＦＡＳＴＤＢプログラムによって計算されて、最終同一性パーセントスコアに到達する。この最終同一性パーセントスコアが、本発明の目的のために使用されるものである。照会配列と一致／アラインされない取り調べる配列のＮ末端およびＣ末端に対する残基のみが、同一性パーセントスコアを手動で調整する目的のために考慮される。これは、取り調べる配列の最も遠いＮ末端またはＣ末端の残基の外側の照会（ｑｕｅｒｅｙ）アミノ酸残基のみである。
例えば、９０アミノ酸残基の取り調べる配列が、同一性パーセントを決定するために、１００残基の照会配列とアラインされる。欠失が取り調べる配列のＮ末端に存在し、それゆえに、ＦＡＳＴＤＢアラインメントは、Ｎ末端の最初の残基とは一致／アラインしない。１０個の不対残基は配列の１０％を表し（Ｎ末端およびＣ末端で一致しない残基の数／照会配列中の残基の総数）、それゆえに、１０％は、ＦＡＳＴＤＢプログラムによって計算される同一性パーセントスコアから減算される。残りの９０％が完全に一致した場合、最終同一性パーセントは９０％になる。
別の例において、９０残基の取り調べる配列は、１００残基の照会配列と比較される。今回は、欠失は内部であり、それゆえに、照会配列と一致／アラインしない取り調べる配列のＮ末端またはＣ末端には残基は存在しない。この場合、ＦＡＳＴＤＢによって計算される同一性パーセントは手動で補正されない。再度、照会配列と一致／アラインしない、ＦＡＳＴＤＢアラインメントにおいて示されるような対象の配列のＮ末端またはＣ末端の外側の残基の位置のみが、手動で補正される。他の補正は、本発明の目的のためには行われない。
ｂ．融合タンパク質
特定の実施形態において、目的のポリペプチドは融合タンパク質であり、例えば、親和性タグドメインまたはレポータードメインを含み得る。適切な親和性タグは、別の部分、通常は別のポリペプチド、最も通常は抗体に特異的に結合し得る任意のアミノ酸配列を含む。適切な親和性タグには、当該分野において公知であるように、エピトープタグ、例えば、Ｖ５タグ、ＦＬＡＧタグ、ＨＡタグ（赤血球凝集素インフルエンザウイルス由来）、ｍｙｃタグなどが含まれる。適切な親和性タグには、当該分野において公知であるように、そのための結合する基質が知られているドメイン、例えば、ＨＩＳタグ、ＧＳＴタグ、およびＭＢＰタグ、ならびに特定の結合パートナー、例えば、抗体、特に、モノクローナル抗体がそのために利用可能である他のタンパク質からのドメインもまた含まれる。適切な親和性タグは、適切な結合パートナー、例えば、ＩｇＧ Ｆｃ受容体を使用して特異的に結合されかつ検出され得る、ＩｇＧ Ｆｃ領域などの任意のタンパク質−タンパク質相互作用ドメインもまた含む。このような融合タンパク質は、そのＮ末端メチオニン残基が欠失されたか、または代替的なアミノ酸で置換されたかのいずれかであるＧＰＣＲとインフレームで融合された異種Ｎ末端ドメイン（例えば、エピトープタグ）を含み得ることが明確に意図される。
適切なレポータードメインには、ポリペプチドの存在下でレポート可能である任意のドメインが含まれる。親和性タグは、例えば、タグに特異的に結合する標識抗体を使用してポリペプチドの存在レポートするために使用され得ることが認識されているが、発光レポータードメインがより通常使用される。適切な発光レポータードメインには、ルシフェラーゼ（例えば、ホタル、Ｖａｒｇｕｌａ、Ｒｅｎｉｌｌａ ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、またはＲｅｎｉｌｌａ ｍｕｅｌｌｅｒｉ由来）、またはその発光改変体が含まれる。他の適切なレポータードメインには、蛍光タンパク質（例えば、クラゲ、サンゴ、および他の腔腸動物から、Ａｅｑｕｏｒｉａ種、Ｒｅｎｉｌｌａ種、Ｐｔｉｌｏｓａｒｃｕｓ種、Ｓｔｙｌａｔｕｌａ種からのこのような蛍光タンパク質として）、またはその発光改変体が含まれる。これらのレポータータンパク質の発光改変体は、当該分野において非常に周知であり、ネイティブなレポータータンパク質と比較して、より明るく、より薄暗く、または異なる励起および／もしくは発光スペクトルを有する可能性がある。例えば、ある改変体は、当該分野において公知であるように、これらがもはや、緑色に見えず、そして青色、シアンブルー色、黄色、濃い黄赤色（それぞれ、ＢＦＰ、ＣＦＰ、ＹＦＰ ｅＹＦＰ、およびＲＦＰと呼ばれる）に見ることができ、または他の発光スペクトルを有するように、変化される。他の適切なレポータードメインは、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、および分泌型胚性アルカリホスファターゼなどの、生化学的なまたは色の変化を通してポリペプチドの存在をレポートし得るドメインを含む。
これもまた当該分野において公知であるように、親和性タグまたはレポータードメインは、目的のポリペプチド中の任意の位置に存在し得る。しかし、多くの実施形態において、これらは、目的のポリペプチドのＣ末端またはＮ末端に存在する。
２．目的のＧＰＣＲポリペプチドをコードする核酸
核酸を操作するための遺伝コードおよび組換え技術は公知であるので、および目的のＧＰＣＲポリペプチドのアミノ酸配列が上記のように記載されるので、目的のＧＰＣＲポリペプチドをコードする核酸の設計および産生は、十分に当業者の範囲内にある。特定の実施形態において、標準的な組換えＤＮＡ技術（Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第３版，Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，１９９５；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版（１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）の方法が使用される。例えば、ＧＰＣＲコード配列は、本明細書に記載される必要がない種々の組換え方法の任意の１つまたはその組み合わせを使用して、ＧＰＣＲコード配列のライブラリーから単離されてもよい。タンパク質をコードしている核酸配列中でのヌクレオチドの引き続く置換、欠失、および／または付加もまた、標準的な組換えＤＮＡ技術を使用して行われてもよい。
例えば、部位特異的変異誘発およびサブクローニングが、目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド中で核酸残基を導入／欠失／置換するために使用されてもよい。他の実施形態において、ＰＣＲが使用されてもよい。目的のポリペプチドをコードする核酸はまた、オリゴヌクレオチドから化学合成によって完全に作製されてもよい（例えば、Ｃｅｌｌｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００２）２９７：１０１６−８）。
ある実施形態において、目的のポリペプチドをコードする核酸のコドンは、特定の種、特に哺乳動物、例えば、マウス、ラット、ハムスター、非ヒト霊長類、またはヒトの種の細胞中での発現のために最適化される。ある実施形態において、目的のポリペプチドをコードする核酸のコドンは、特定の種、特に両生類種の細胞中での発現のために最適化される。
ａ．ベクター
本発明はさらに、対象の核酸を含むベクター（「構築物」とも呼ばれる）を提供する。本発明の多くの実施形態において、対象の核酸配列は、配列が、例えば、プロモーターを含む発現制御配列に作動可能に連結された後で宿主中で発現される。対象の核酸はまた、代表的には、宿主染色体ＤＮＡのエピソームとして、またはその不可欠な部分としてのいずれかで、宿主細胞中で複製可能な発現ベクター中にも配置される。通例、発現ベクターは、所望のＤＮＡ配列で形質転換された細胞の検出を可能にするために、選択マーカー、例えば、テトラサイクリンまたはネオマイシンを含む（例えば、米国特許第４，７０４，３６２号を参照のこと、これは、参照により本明細書に援用される）。単一発現ベクターまたは二重発現カセットベクターを含むベクターは、当該分野において周知である（Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第３版，Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，１９９５；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，（１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）。適切なベクターには、ウイルスベクター、プラスミド、コスミド、人工染色体（ヒト人工染色体）、細菌人工染色体、酵母人工染色体など）、ミニ染色体などが含まれる。レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、およびアデノ関連ウイルスベクターが使用されてもよい。
種々の発現ベクターが、細胞中で目的のポリペプチドを産生する目的のために当業者に利用可能であり、そしてこれには、市販されている（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡから）発現ベクターが含まれる。市販されている発現ベクターには、非限定的な例として、ＣＭＶプロモーターベースのベクターが含まれる。１つの適切な発現ベクターはｐＣＭＶである。発現ベクターはアデノウイルスであり得る。例示的なアデノウイルスベクターは、ＡｄＥａｓｙＴＭとしてＱｂｉｏｇｅｎｅ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）から購入し得る［Ｈｅ ＴＣら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ（１９９８）９５：２５０９−２５１４；および米国特許第５，９２２，５７６号；これらの各々の開示はその全体が参照により本明細書に援用される］。他の適切な発現ベクターは、当業者に容易に明らかである。
対象の核酸は、通常、目的の対象のポリペプチドをコードする単一のオープンリーディングフレームを含むが、しかし、特定の実施形態において、目的のポリペプチドの発現のための宿主細胞は、真核生物細胞、例えば、ヒト細胞などの哺乳動物細胞であり得、オープンリーディングフレームはイントロンによって中断され得る。対象の核酸は、代表的には、対象核酸に加えて、ＲＮＡの安定性、翻訳効率などを方向付け得る３’および５’非翻訳領域（ＵＴＲ）を含み得る、転写単位の一部である。対象の核酸は、対象の核酸に加えて、目的のポリペプチドの転写および発現を方向付けるプロモーター、および転写ターミネーターを含む発現カセットの一部でもあり得る。
真核生物プロモーターは、真核生物宿主細胞中で機能的である任意のプロモーターであり得、これらには、ウイルスプロモーターおよび真核生物遺伝子に由来するプロモーターが含まれる。例示的な真核生物プロモーターには以下が含まれるがこれらに限定されない：マウスメタロチオネインＩ遺伝子配列のプロモーター（Ｈａｍｅｒら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎ．１：２７３−２８８，１９８２）；ヘルペスウイルスのＴＫプロモーター（ＭｃＫｎｉｇｈｔ、Ｃｅｌｌ ３１：３５５−３６５，１９８２）；ＳＶ４０初期ウイルスプロモーター（Ｂｅｎｏｉｓｔら、Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）２９０：３０４−３１０，１９８１）；酵母ｇａｌｌ遺伝子配列プロモーター（Ｊｏｈｎｓｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）７９：６９７１−６９７５，１９８２）；Ｓｉｌｖｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８１：５９５１−５９ＳＳ，１９８４）、ＣＭＶプロモーター、ＥＦ−１プロモーター、エクジソン応答性プロモーター、テトラサイクリン応答性プロモーターなど。ウイルスプロモーターは、これらが一般的に特に強力なプロモーターであるので、特に目的のものであり得る。特定の実施形態において、標的病原体のプロモーターであるプロモーターが使用される。本発明における使用のためのプロモーターは、これらが導入される細胞型（および／または動物）において機能的であるように選択される。特定の実施形態において、プロモーターはＣＭＶプロモーターである。
特定の実施形態において、対象のベクターは、選択マーカーの発現もまた提供し得る。適切なベクターおよび選択マーカーは当該分野で周知であり、Ａｕｓｕｂｅｌら（Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第３版，Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，１９９５）およびＳａｍｂｒｏｏｋら、（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第３版，（２００１）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）において議論されている。種々の異なる遺伝子が選択マーカーとして利用され、対象のベクターの中で選択マーカーとして利用される特定の遺伝子が、便宜上、主に選択される。既知の選択マーカー遺伝子には以下が含まれる：チミジンキナーゼ遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子、ＣＡＤ、アデノシンデアミナーゼ遺伝子、アスパラギンシンテターゼ遺伝子、抗生物質耐性遺伝子、例えば、ｔｅｒｔ、ａｍｐｒ、Ｃｍｒもしくはｃａｔ、ｋａｎｒもしくはｎｅｏｒ（アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ遺伝子）、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ遺伝子など。
上述のように、目的のポリペプチドは、親和性ドメインおよび／またはレポータードメインを含む融合タンパク質であり得る。例えば、ＧＰＣＲのＣ末端またはＮ末端においてレポーターまたはタグとＧＰＣＲの間の融合物を作製するための方法は十分に当業者の範囲内であり（例えば、ＭｃＬｅａｎら、Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａ．Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１９９９ ５６：１１８２−９１；Ｒａｍｓａｙら、Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，２００１，３１５−３２３）、これ以上の説明はしない。このような融合タンパク質は、そのＮ末端メチオニン残基が欠失しているか、または代わりのアミノ酸で置換されているかのいずれかであるＧＰＣＲとインフレームで融合している異種Ｎ末端ドメイン（例えば、エピトープタグ）を含んでもよいことが明確に意図される。目的のポリペプチドは、ネイティブなポリペプチドから最初に作製されてもよく、次いで、上記のような適切なレポータータグに作動可能に連結されることが認識される。
対象の核酸は、通常、目的のポリペプチドをコードしている核酸の構築を容易にするために、制限部位、マルチプルクローニングサイト、プライマー結合部位、ライゲーション可能末端、組換え部位などもまた含み得る。
ｂ．宿主細胞
本発明はさらに、対象の核酸を含むベクターを含む宿主細胞を提供する。適切な宿主細胞には、原核生物細胞、例えば、細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）ならびに真核生物細胞、例えば、動物細胞（例えば、昆虫、哺乳動物、魚類、両生類、鳥類、または爬虫類細胞）、植物細胞（例えば、トウモロコシまたはシロイヌナズナ細胞）、または真菌細胞（例えば、酵母細胞、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞）が含まれる。特定の実施形態において、目的のポリペプチドをコードしている核酸の発現のために適切な任意の細胞が宿主細胞として使用され得る。通常、動物宿主細胞株が使用され、その例は以下の通りである：サル腎臓細胞（ＣＯＳ細胞）、ＳＶ４０により形質転換されたサル腎臓ＣＶＩ細胞（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５ １）；ヒト胚腎臓細胞（ＨＥＫ−２９３［「２９３」］、Ｇｒａｈａｍら、Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．３６：５９（１９７７））；ＨＥＫ−２９３Ｔ［「２９３Ｔ」］細胞；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ １０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ、ＵｒｌａｕｂおよびＣｈａｓｉｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）７７：４２１６，（１９８０）；シリアゴールデンハムスター細胞ＭＣＢ３９０１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−９５９５）；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３−２５１（１９８０））；サル腎臓細胞（ＣＶＩ ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ，ＡＴＣＣ ＣＣＬ ３４）；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８，ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５）；ヒト肝臓細胞（ｈｅｐ Ｇ２，ＨＢ ８０６５）；マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ ０６０５６２，ＡＴＣＣ ＣＣＬ ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒら、Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ３８３：４４−６８（１９８２））；ＮＩＨ／３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１６５８）；およびマウスＬ細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−Ｉ）。
特定の実施形態において、メラニン保有細胞が使用される。メラニン保有細胞は、下等脊椎動物において見出される皮膚細胞である。関連する材料および方法は、米国特許第５，４６２，８５６号および米国特許第６，０５１，３８６号の開示に従う。これらの特許の開示は、それらの全体が参照により本明細書に援用される。
さらなる細胞株は当業者に明らかになり、広範な種々の細胞株が、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖａ．２０１１０−２２０９から利用可能である。
Ｃ．候補化合物のスクリーニング
１．一般的ＧＰＣＲスクリーニングアッセイ技術
Ｇタンパク質受容体が活性になるとき、これは、Ｇタンパク質（例えば、Ｇｑ、Ｇｓ、Ｇｉ、Ｇｚ、Ｇｏ）に結合し、Ｇタンパク質へのＧＴＰの結合を刺激する。次いで、Ｇタンパク質はＧＴＰａｓｅとして働き、ＧＴＰをＧＤＰにゆっくりと加水分解し、それによって、受容体は、通常の条件下で、非活性化される。しかし、活性化された受容体はＧＤＰをＧＴＰに交換することを継続する。ＧＴＰの加水分解不可能なアナログである［３５Ｓ］ＧＴＰγＳは、活性化受容体を発現する膜への結合の増強をモニターするために使用することができる。［３５Ｓ］ＧＴＰγＳは、リガンドの非存在下および存在下での膜へのＧタンパク質への結合をモニターするために使用できることが報告されている。このモニタリングの当業者に周知でありかつ利用可能である数ある例の中で、１つの例は、ＴｒａｙｎｏｒおよびＮａｈｏｒｓｋｉによって１９９５年に報告された。このアッセイ系の好ましい使用は、候補化合物の初期のスクリーニングのためである。なぜなら、この系は、受容体の細胞内ドメインと相互作用する特定のＧタンパク質に関わりなく、すべてのＧタンパク質結合受容体に一般的に適用可能であるからである。
２．特定のＧＰＣＲスクリーニングアッセイ技術
一旦、化合物が、「一般的」Ｇタンパク質結合受容体アッセイ（すなわち、アゴニストまたは逆アゴニストである化合物を選択するためのアッセイ）を使用して同定されると、ある実施形態において、化合物が受容体部位において相互作用したことを確認するためのさらなるスクリーニングが好ましい。例えば、「一般的」アッセイによって同定された化合物は受容体に結合しないかもしれないが、しかし、その代わりに、細胞内ドメインからＧタンパク質を単に「取り外す」可能性がある。
ａ．Ｇｓ、Ｇｚ、およびＧｉ
Ｇｓは、酵素アデニリルシクラーゼを刺激する。他方、Ｇｉ（およびＧｚおよびＧｏ）はアデニリルシクラーゼを阻害する。アデニリルシクラーゼはＡＴＰのｃＡＭＰへの転換を触媒し；従って、Ｇｓタンパク質を結合する活性型ＧＰＣＲは細胞レベルのｃＡＭＰの増加と関連する。他方、Ｇｉ（またはＧｚ、Ｇｏ）タンパク質を結合する活性型ＧＰＣＲは、細胞レベルのｃＡＭＰの減少と関連する。一般的には、「Ｉｎｄｉｒｅｃｔ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ Ｓｙｎａｐｔｉｃ Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ」第８章，Ｆｒｏｍ Ｎｅｕｒｏｎ Ｔｏ Ｂｒａｉｎ（第３版）Ｎｉｃｈｏｌｓ，Ｊ．Ｇ．ら編、Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．（１９９２）を参照のこと。従って、ｃＡＭＰを検出するアッセイは、候補化合物が、例えば、受容体に対する逆アゴニスト（すなわち、このような化合物はｃＡＭＰのレベルを減少させる）であるか否かを決定するために利用することができる。ｃＡＭＰを測定するための当該分野で公知である種々のアプローチが利用できる；ある実施形態において、好ましいアプローチは、ＥＬＩＳＡベースの形式での抗ｃＡＭＰ抗体の使用に依存する。利用可能な別の型のアッセイは、全細胞二次メッセンジャーレポーター系アッセイである。遺伝子上のプロモーターは、特定の遺伝子がコードするタンパク質の発現を駆動する。サイクリックＡＭＰは、ｃＡＭＰ応答性ＤＮＡ結合タンパク質または転写因子（ＣＲＥＢ）の結合を促進することによって遺伝子発現を駆動し、これが次には、ｃＡＭＰ応答性エレメントと呼ばれる特定の部位でプロモーターに結合し、遺伝子の発現を駆動する。レポーター遺伝子、例えば、β−ガラクトシダーゼまたはルシフェラーゼの前に、複数のｃＡＭＰ応答性エレメントを含むプロモーターを有するレポーター系を構築することができる。従って、活性化されたＧｓ結合受容体はｃＡＭＰの蓄積を引き起こし、これは次には、遺伝子を活性化し、レポータータンパク質の発現を活性化する。次いで、β−ガラクトシダーゼまたはルシフェラーゼなどのレポータータンパク質は、標準的な生化学的アッセイを使用して検出できる（Ｃｈｅｎら、１９９５）。
ｂ．ＧｏおよびＧｑ
ＧｑおよびＧｏは酵素ホスホリパーゼＣの活性化に関連し、これは次には、リン脂質ＰＩＰ２を加水分解し、２種の細胞内メッセンジャー：ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）およびイノシトール１，４，５−三リン酸（ＩＰ３）を放出する。ＩＰ３の蓄積の増加は、Ｇｑ−およびＧｏ−関連受容体の活性化に関連する。一般的には、「Ｉｎｄｉｒｅｃｔ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ Ｓｙｎａｐｔｉｃ Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ」第８章，Ｆｒｏｍ Ｎｅｕｒｏｎ Ｔｏ Ｂｒａｉｎ（第３版）Ｎｉｃｈｏｌｓ，Ｊ．Ｇ．ら編、Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．（１９９２）を参照のこと。ＩＰ３の蓄積を検出するアッセイは、候補化合物が、例えば、ＧｑまたはＧｏ関連受容体に対する逆アゴニスト（このような化合物はＩＰ３のレベルを減少させる）であるか否かを決定するために利用することができる。Ｇｑ関連受容体は、Ｇｑ依存性ホスホリパーゼＣが、ＡＰ１エレメントを含む遺伝子の活性化を引き起こすという点で、ＡＰ１レポーターアッセイを使用して試験することもできる；従って、活性化されたＧｑ−関連受容体はこのような遺伝子の発現の増加を証明し、それによって、それに対する逆アゴニストがこのような発現の減少を証明し、アゴニストはこのような発現の増加を証明する。このような検出のための商業的に利用可能なアッセイが利用可能である。
３．ＧＰＣＲ融合タンパク質
逆アゴニストまたはアゴニストの直接的同定のための候補化合物のスクリーニングにおける使用のための、内因性で構成的に活性なＧＰＣＲまたは非内因性で構成的に活性化されたＧＰＣＲの使用は、定義により、受容体がそれに結合した内因性リガンドの非存在下においてさえ活性であるという点で、興味深いスクリーニングの課題を提供する。従って、例えば、候補化合物の存在下での非内因性受容体と、その化合物の非存在下での非内因性受容体の間を区別するために、このような化合物が逆アゴニストもしくはアゴニストであり得るか、またはこのような受容体に対して効果を有さないか否かに関する理解を可能にするためのこのような区別の目的で、ある実施形態において、このような区別を増強し得るアプローチを利用することが好ましい。ある実施形態において、好ましいアプローチは、ＧＰＣＲ融合タンパク質の使用である。
一般的に、一旦、非内因性ＧＰＣＲが上記のアッセイ技術（ならびに当業者に公知の他の技術）を使用して構成的に活性化されたことが決定されると、内因性ＧＰＣＲと結合する優勢なＧタンパク質を決定することが可能である。ＧＰＣＲへのＧタンパク質の結合は、評価することができるシグナル伝達経路を提供する。ある実施形態において、スクリーニングは、哺乳動物またはメラニン保有細胞発現系を使用して行うことが好ましい。このような系は、その中に内因性Ｇタンパク質を有することが予想されるからである。従って、定義により、このような系において、非内因性で構成的に活性化されたＧＰＣＲは、継続的にシグナル伝達を行う。ある実施形態において、例えば、受容体に対する逆アゴニストの存在下で、特にスクリーニングの状況下で、逆アゴニストと接触されるときに、受容体間でより容易に区別できる可能性がより高いように、このシグナルが増強されることが好ましい。
ＧＰＣＲ融合タンパク質は、ＧＰＣＲとのＧタンパク質結合の効率を増強することが意図される。ＧＰＣＲ融合タンパク質は、内因性で構成的に活性なＧＰＣＲまたは非内因性で構成的に活性化されたＧＰＣＲのいずれかを用いるスクリーニングのために好ましくあり得る。なぜなら、このようなアプローチは、このようなスクリーニング技術において生成されるシグナルを増加するからである。このことは、顕著な「シグナル対ノイズ」比を容易にする際に重要であり；このような顕著な比は、本明細書に開示されるような候補化合物のスクリーニングのために好ましい。
ＧＰＣＲ融合タンパク質の発現のために有用な構築物の構築は、当業者の範囲内にある。市販の発現ベクターおよび系は、研究者の特定の必要性に合致し得る種々のアプローチを提供する。このようなＧＰＣＲ融合タンパク質構築物の構築における重要な判断基準には以下が含まれるがこれらに限定されない：ＧＰＣＲ配列とＧタンパク質配列の両方がインフレームにあること（好ましくは、内因性ＧＰＣＲのための配列は、Ｇタンパク質の上流である）、およびＧＰＣＲの発現に際して、Ｇタンパク質もまた発現可能であるように、ＧＰＣＲの「終止」コドンが欠失または置換されること。ＧＰＣＲはＧタンパク質に直接的に連結することができ、またはこれらの２つの間にスペーサー残基が存在し得る（好ましくは、約１２を超えない残基であるが、この数は当業者によって容易に確認できる）。利便性に基づき、スペーサーを使用することが好ましい。ある実施形態において、非内因性ＧＰＣＲに結合するＧタンパク質が、ＧＰＣＲ融合タンパク質構築物の作製の前に同定されていることが好ましい。同定されているＧタンパク質がわずかなので、Ｇタンパク質の配列を含む構築物（すなわち、ユニバーサルＧタンパク質構築物、以下の実施例４（ａ）を参照のこと）がその中のＧＰＣＲ配列の挿入のために利用可能であることが好ましい；これは、異なる配列を有する種々の異なるＧＰＣＲの大スケールスクリーニングの状況においてさらなる効率を提供する。
上記に述べたように、Ｇｉ、Ｇｚ、およびＧｏに結合する活性型ＧＰＣＲは、これらの型のＧＰＣＲのチャレンジに基づき、ｃＡＭＰ作製アッセイの形成を阻害することが予想される［すなわち、ｃＡＭＰシグナルは活性化の際に減少し、従って、例えば、アゴニスト（これはこのシグナルをさらに減少させる）チャレンジの直接的な同定を行う］。本明細書に開示されるように、これらの型の受容体については、実行可能なシクラーゼベースのアッセイを確立するための試みにおいて、ＧＰＣＲの内因性Ｇタンパク質に基づかないＧＰＣＲ融合タンパク質を作製することが可能であることが確認された。従って、例えば、内因性Ｇｉ結合受容体は、Ｇｓタンパク質−このような融合構築物に融合可能であり、発現の際に、内因性ＧＰＣＲを「駆動」または「強制」して、例えば、「天然の」Ｇｉタンパク質ではなくＧｓタンパク質と結合して、その結果、シクラーゼベースのアッセイを確立することができる。従って、Ｇｉ、Ｇｚ、およびＧｏ結合受容体については、ある実施形態において、ＧＰＣＲ融合タンパク質が使用され、アッセイがアデニリルシクラーゼ活性の検出に基づく場合、融合構築物はＧｓ（または酵素アデニリルシクラーゼの形成を刺激する等価なＧタンパク質）を用いて確立されることが好ましい。
（表Ｃ）
Figure 2009538623
 同等の効果があるものは、Ｇｓ、Ｇｉ、Ｇｚ、またはＧｏタンパク質と融合されたＧｑタンパク質を利用するＧタンパク質融合構築物である。ある実施形態において、好ましい融合構築物は、Ｇタンパク質αサブユニット（「Ｇαｑ」）の最初の６個のアミノ酸が欠失しており、ＧαｑのＣ末端の最後の５個のアミノ酸が、目的のＧタンパク質のＧαの対応するアミノ酸で置き換えられているＧｑタンパク質を用いて達成することができる。例えば、融合構築物は、Ｇｉタンパク質と融合したＧｑ（６アミノ酸欠失）を有することができ、「Ｇｑ／Ｇｉ」融合構築物を生じる。この融合構築物は、二次メッセンジャー、例えば、イノシトール三リン酸またはジアシルグリセロールがｃＡＭＰ産生の代わりに測定可能であるように、内因性Ｇｉ結合受容体をその非内因性Ｇタンパク質、Ｇｑに結合させる。
４．シグナルエンハンサーＧｓ結合ＧＰＣＲとの標的Ｇｉ結合ＧＰＣＲの同時トランスフェクション（ｃＡＭＰベースアッセイ）
Ｇｉ結合受容体はアデニリルシクラーゼを阻害することが知られており、それゆえに、ｃＡＭＰ産生のレベルを減少し、これは、ｃＡＭＰレベルの評価を困難にし得る。特定の実施形態において、活性化の際にＧｉを優勢に結合する受容体の活性化の表示として、ｃＡＭＰの産生の減少を測定する際の有効な技術は、シグナルエンハンサー、例えば、活性化の際にＧｓと優勢に結合する、非内因性で構成的に活性化された受容体（例えば、ＴＳＨＲ−Ａ６２３Ｉ；以下を参照のこと）を、Ｇｉ結合ＧＰＣＲとともに同時トランスフェクトによって達成することができる。明白であるように、Ｇｓ結合受容体の活性化は、ｃＡＭＰの産生の増加に基づいて決定することができる。Ｇｉ結合受容体の活性化は、ｃＡＭＰ産生の減少に導く。従って、同時トランスフェクションアプローチは、これらの「反対の」影響を有利に利用することが意図される。例えば、非内因性で構成的に活性化されたＧｓ結合受容体（「シグナルエンハンサー」）の、発現ベクター単独との同時トランスフェクションは、ベースラインｃＡＭＰシグナルを提供する（すなわち、Ｇｉ結合受容体はｃＡＭＰレベルを減少させるが、この「減少」は、構成的に活性化されたＧｓ共役シグナルエンハンサーによって確立されるｃＡＭＰレベルの実質的な増加と関連する）。「標的受容体」とのシグナルエンハンサーの同時トランスフェクションまでには、Ｇｉ共役標的受容体の逆アゴニストは測定されるｃＡＭＰレベルを増加させるのに対して、Ｇｉ共役標的受容体のアゴニストはこのシグナルを減少させる。
このアプローチを使用して直接的に同定される候補化合物は、これらが受容体を増強するシグナルを標的としないこと確実にするために独立して評価されるべきである（このことは、同時トランスフェクトされた受容体に対するスクリーニングの前またはその後で行うことができる）。
Ｄ．医薬品化学
候補化合物
当該分野で公知である任意の分子を、本明細書のＧＰＣＲの活性を調節（増加または減少）するその能力について試験することができる。活性を調節する化合物を同定するために、候補化合物は、受容体を発現する細胞に直接的に提供することができる。
本発明のこの実施形態は、受容体の量または活性を調節、例えば、これを阻害、これに拮抗、またはこれを作用させる分子の化学ライブラリーをスクリーニングするために十分に適している。化学ライブラリーは、ペプチドライブラリー、ペプチド模倣物ライブラリー、化学合成ライブラリー、組換え、例えば、ファージディスプレイライブラリー、およびインビトロ翻訳に基づくライブラリー、他の非ペプチド合成有機ライブラリーなどであり得る。本発明のこの実施形態は、血漿および組織抽出物を含むがこれらに限定されない、内因性候補化合物を含有する生物学的材料をスクリーニングするため、ならびに生物学的活性を有することが知られている内因性化合物のライブラリーをスクリーニングするためにも十分に適している。
ある実施形態において、候補化合物の直接的同定は、コンビナトリアルケミストリー技術を介して生成される化合物とともに実施され、それによって、数千もの化合物が、このような分析のためにランダムに調製される。候補化合物は、化学ライブラリーのメンバーであり得る。これは、任意の便宜的な数の対象メンバー、例えば、１０個から数百個、数千個、数百万個までの適切な化合物、例えば、ペプチド、ペプトイド、および他のオリゴマー性化合物（環状または直鎖状）、ならびに鋳型に基づく小分子、例えば、ベンゾジアゼピン、ヒダントイン、ビアリール、炭素環式化合物および多環式化合物（例えば、ナフタレン、フェノチアジン、アクリジン、ステロイドなど）、炭水化物およびアミノ酸誘導体、ジヒドロピリジン、ベンズヒドリル、ならびに複素環（例えば、トリジン、インドール、チアゾリジンなど）を含み得る。引用される数字および列挙される化合物の型は、例示であるが限定ではない。好ましい化学ライブラリーは、低分子量の化学化合物および潜在的な治療剤を含む。
例示的な化学ライブラリーは、いくつかの供給元から市販されている（ＡｒＱｕｌｅ，Ｔｒｉｐｏｓ／ＰａｎＬａｂｓ，ＣｈｅｍＤｅｓｉｇｎ，Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ）。ある場合において、これらの化学ライブラリーは、メンバー化合物が付着された基材上のライブラリーの各メンバーの同一性をコードするコンビナトリアルストラテジーを使用して生成され、従って、有効な調節因子である分子の直接的かつ即時的な同定を可能にする。従って、多くのコンビナトリアルアプローチにおいて、化合物のプレート上での位置が化合物の組成を特定する。また、１つの例において、単一のプレート位置は、目的の相互作用を含むウェルへの投与によってスクリーニング可能である１〜２０種の化学物質を有し得る。従って、調節が検出されるならば、相互作用する対のますます小さなプールが調節活性のためにアッセイできる。このような方法によって、多くの候補化合物がスクリーニングできる。
使用のために適切な多くの多様なライブラリーは当該分野で公知であり、本発明に従って試験される化合物を提供するために使用できる。代替的には、ライブラリーは、標準的な方法を使用して構築できる。さらに、より一般的な、構造的に制約された、有機的な多様性（例えば、非ペプチド）ライブラリーもまた使用できる。例として、ベンゾジアゼピンライブラリー（例えば、Ｂｕｎｉｎら、１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：４７０８−４７１２を参照のこと）が使用されてもよい。
本発明の別の実施形態において、コンビナトリアルケミストリーは、本発明のＧＰＣＲの調節因子を同定するために使用できる。コンビナトリアルケミストリーは、その多くが構造的に類似している可能性がある数百万もの化合物を含むライブラリーを作製することが可能である。高スループットスクリーニングプログラムは、既知の標的についての親和性のためにこれらの膨大なライブラリーをスクリーニングすることが可能であるが、より小さな寸法のライブラリーを達成するが最大の化学的多様性を提供する新たなアプローチが開発されてきた（例えば、Ｍａｔｔｅｒ、１９９７，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４０：１２１９−１２２９を参照のこと）。
コンビナトリアルケミストリーの１つの方法である、親和性フィンガープリンティングは、タンパク質の規定されたパネルの結合親和性について、小分子の個別のライブラリーを試験するために以前に使用されてきた。スクリーニングによって得られるフィンガープリントは、他のタンパク質または目的の受容体（本発明においては、本発明の受容体）についての対象のライブラリーメンバーの親和性を予測するために使用される。このフィンガープリントは、ライブラリー化合物が同様に反応し得るか否かを予測するために、目的のタンパク質と反応することが知られている他の化合物から得られたフィンガープリントと比較される。例えば、複合体またはタンパク質成分との相互作用について、大きなライブラリー中のすべてのリガンドを試験するよりはむしろ、その活性を有することが知られている他の化合物と類似のフィンガープリントを有するリガンドのみを試験することができる（例えば、Ｋａｕｖａｒら、１９９５，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２：１０７−１１８；Ｋａｕｖａｒ、１９９５，Ａｆｆｉｎｉｔｙ ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ．８：２５−２８；およびＫａｕｖａｒ、Ｔｏｘｉｃ−Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｂｙ Ｐａｔｔｅｒｎ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｉｎ Ｎｅｗ Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ａｇｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，Ｄ．Ｋｕｒｔｚ．Ｌ．ＳｔａｎｋｅｒおよびＪ．Ｈ．Ｓｋｅｒｒｉｔｔ．編，１９９５，ＡＯＡＣ：Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，３０５−３１２を参照のこと）。
ある実施形態において、候補化合物はポリペプチドである。ある好ましい実施形態において、候補化合物は小分子である。ある実施形態において、候補化合物は抗体でもその抗原結合フラグメントでもない。
調節因子として同定された候補化合物
一般的に、このようなスクリーニングの結果は、独特なコア構造を有する化合物であり；その後、これらの候補化合物は、その医薬品特性をさらに増強するために、好ましいコア構造の周辺にさらなる化学修飾を受けてもよい。このような技術は当業者に公知であり、本特許文書中で詳細には扱わない。
特定の実施形態において、本発明の調節因子は経口で有効である。当業者に利用可能である多数のコンピュータによるアプローチが、薬物の経口的な生物学的利用能の予測のために開発されてきた［Ｏｏｍｓら、Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ（２００２）１５８７：１１８−２５；ＣｌａｒｋおよびＧｒｏｏｔｅｎｈｕｉｓ、Ｃｕｒｒ ＯｐｉｎＤｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｄｅｖｅｌ（２００２）５：３８２−９０；Ｃｈｅｎｇら、Ｊ Ｃｏｍｐｕｔ Ｃｈｅｍ（２００２）２３：１７２−８３；ＮｏｒｉｎｄｅｒおよびＨａｅｂｅｒｌｅｉｎ，Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ（２００２）５４：２９１−３１３；Ｍａｔｔｅｒら、Ｃｏｍｂ Ｃｈｅｍ Ｈｉｇｈ Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｓｃｒｅｅｎ（２００１）４：４５３−７５；ＰｏｄｌｏｇａｒおよびＭｕｅｇｇｅ、Ｃｕｒｒ Ｔｏｐ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ（２００１）１：２５７−７５；これらの各々の開示は、その全体が参照により本明細書に援用される）。さらに、ポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）が、非ヒト霊長類およびヒトの身体を含む、薬物の経口投与後の哺乳動物の身体の中で、経口生物学的利用能の評価を含む、薬物分布の直接的測定を得るために多くのグループによって首尾よく使用されてきた［Ｎｏｄａら、Ｊ Ｎｕｃｌ Ｍｅｄ（２００３）４４：１０５−８；Ｇｕｌｙａｓら、Ｅｕｒ Ｊ Ｎｕｃｌ Ｍｅｄ ＭｏＩ Ｉｍａｇｉｎｇ（２００２）２９：１０３１−８；Ｋａｎｅｒｖａら、Ｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ（１９９９）１４５：７６−８１；これらの各々の開示は、その全体が参照により本明細書に援用される］。ある実施形態において、本発明の調節因子は経口で有効である。
特定の実施形態において、経口で有効である本発明の調節因子は、血液脳関門を通過することが可能である。当業者に利用可能である多数のコンピュータによるアプローチが、血液脳関門の浸透の予測のために開発されてきた［Ｏｏｍｓら、Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ（２００２）１５８７：１１８−２５；ＣｌａｒｋおよびＧｒｏｏｔｅｎｈｕｉｓ、Ｃｕｒｒ ＯｐｉｎＤｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｄｅｖｅｌ（２００２）５：３８２−９０；Ｃｈｅｎｇら、Ｊ Ｃｏｍｐｕｔ Ｃｈｅｍ（２００２）２３：１７２−８３；ＮｏｒｉｎｄｅｒおよびＨａｅｂｅｒｌｅｉｎ、Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ
Ｒｅｖ（２００２）５４：２９１−３１３；Ｍａｔｔｅｒら、Ｃｏｍｂ Ｃｈｅｍ Ｈｉｇｈ Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｓｃｒｅｅｎ（２００１）４：４５３−７５；ＰｏｄｌｏｇａｒおよびＭｕｅｇｇｅ、Ｃｕｒｒ Ｔｏｐ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ（２００１）１：２５７−７５；これらの各々の開示は、その全体が参照により本明細書に援用される）。多数のインビトロ方法が、薬物の血液脳関門の浸透性を予測するために開発されてきた［Ｌｏｈｍａｎｎら、Ｊ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔ（２００２）１０：２６３−７６；Ｈａｎｓｅｎら、Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｍｅｄ Ａｎａｌ（２００２）２７：９４５−５８；Ｏｔｉｓら、Ｊ Ｐｈａｒｍｏｃｏｌ Ｔｏｘｉｃｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ（２００１）４５：７１−７；Ｄｅｈｏｕｃｋら、Ｊ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ（１９９０）５４：１７９８−８０１；これらの各々の開示は、その全体が参照により本明細書に援用される］。さらに、多数のストラテジーが、血液脳関門を通過する薬物送達を増強するために開発されてきた［Ｓｃｈｅｒｒｍａｎｎ、Ｖａｓｃｕｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ（２００２）３８：３４９−５４；Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ、Ａｒｃｈ Ｎｅｕｒｏｌ（２００２）５９：３５−４０；Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ、Ｎｅｕｒｏｎ（２００２）３６：５５５−８；これらの各々の開示は、その全体が参照により本明細書に援用される］。最後に、ポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）が、非ヒト霊長類およびヒトの身体を含む、哺乳動物の身体の中で、脳内でのそれを含む薬物分布の直接的測定を得るために多くのグループによって首尾よく使用されてきた。［Ｎｏｄａら、Ｊ Ｎｕｃｌ Ｍｅｄ（２００３）４４：１０５−８；Ｇｕｌｙａｓら、Ｅｕｒ Ｊ Ｎｕｃｌ Ｍｅｄ Ｍｏｌ Ｉｍａｇｉｎｇ（２００２）２９：１０３１−８；Ｋａｎｅｒｖａら、Ｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ（１９９９）１４５：７６−８１；これらの各々の開示は、その全体が参照により本明細書に援用される］。
ある実施形態において、上記調節因子はＧＰＲ１０１に対して選択的であり、ここで、ＧＰＲ１０１に対して選択的である調節因子は、１種以上の密接に関連する受容体、例えば、ＧＰＲ１６１（ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）登録番号ＣＡＩ２２６２４）を超えて、ＧＰＲ１０１に対する選択性を有する調節因子をいうことが理解される。特定の実施形態において、ＧＰＲ１０１選択性調節因子は、ＧＰＲ１６１よりも、ＧＰＲ１０１に対して少なくとも約１０倍、少なくとも約１００倍または少なくとも約１０００倍の選択性を有するＧＰＲ１０１選択性アゴニストまたは部分アゴニストである。特定の実施形態において、ＧＰＲ１０１選択性調節因子は、ＧＰＲ１６１よりも、ＧＰＲ１０１に対して少なくとも約１０倍、少なくとも約１００倍または少なくとも約１０００倍の選択性を有するＧＰＲ５選択性逆アゴニストまたはアンタゴニストである。ある好ましい実施形態において、ＧＰＲ１０１はヒトＧＰＲ１０１である。
ある実施形態において、調節因子は、ヒト、マウス、またはラットのＧＰＲ１０１、好ましくはヒトＧＰＲ１０１に対して、約１０μＭ未満、約１μＭ未満、約１００ｎＭ未満、または約１０ｎＭ未満のＥＣ５０を有するアゴニストまたは部分アゴニストである。ある実施形態において、調節因子は、約１０ｎＭから１０μＭまでの間隔から選択される値未満のＥＣ５０を有するアゴニストまたは部分アゴニストである。ある実施形態において、調節因子は、約１０ｎＭから１μＭまでの間隔から選択される値未満のＥＣ５０を有するアゴニストまたは部分アゴニストである。ある実施形態において、調節因子は、約１０ｎＭから１００ｎＭまでの間隔から選択される値未満のＥＣ５０を有するアゴニストまたは部分アゴニストである。一部の実施形態において、前記調節因子は、トランスフェクトされたＣＨＯ細胞からの膜を用いて行われるＧＴＰγＳ結合アッセイで、またはトランスフェクトされたメラニン保有細胞において行われる色素分散アッセイで、トランスフェクトされたＣＨＯ細胞においてもしくはトランスフェクトされたＣＨＯ細胞からの膜を用いて行われるｃＡＭＰアッセイで、またはトランスフェクトされた２９３細胞において行われるｃＡＭＰアッセイで、約１０μＭ未満の、約１μＭ未満の、約１００ｎＭ未満の、または約１０ｎＭ未満のＥＣ５０を有するアゴニストまたは部分アゴニストである（この場合、該トランスフェクトされたＣＨＯ細胞、または該トランスフェクトされたメラニン保有細胞、または該トランスフェクトされた２９３細胞は、配列番号２、配列番号４および配列番号６から選択されるアミノ酸配列を有する組換えＧＰＲ１０１受容体を発現する）。一部の実施形態において、前記組換えＧＰＲ１０１受容体は、配列番号２のアミノ酸配列を有する。一部の実施形態において、前記調節因子は、前記アッセイにおいて約１０μＭ未満の、約１μＭ未満の、約１００ｎＭ未満の、または約１０ｎＭ未満のＥＣ５０を有するアゴニストまたは部分アゴニストである。一部の実施形態において、前記調節因子は、前記アッセイにおいて約１０ｎＭから１０μＭの間隔から選択される値より小さいＥＣ５０を有するアゴニストまたは部分アゴニストである。一部の実施形態において、前記調節因子は、前記アッセイにおいて約１０ｎＭから１μＭの間隔から選択される値より小さいＥＣ５０を有するアゴニストまたは部分アゴニストである。一部の実施形態において、前記調節因子は、前記アッセイにおいて約１０ｎＭから１００ｎＭの間隔から選択される値より小さいＥＣ５０を有するアゴニストまたは部分アゴニストである。
一部の実施形態において、前記調節因子は、ヒト、マウスまたはラットＧＰＲ１０１に対して、好ましくはヒトＧＰＲ１０１に対して、約１０μＭ未満の、約１μＭ未満の、約１００ｎＭ未満の、または約１０ｎＭ未満のＩＣ５０を有する逆アゴニストまたはアンタゴニストである。一部の実施形態において、前記調節因子は、約１０ｎＭから１０μＭの間隔から選択される値より小さいＩＣ５０を有する逆アゴニストまたはアンタゴニストである。一部の実施形態において、前記調節因子は、１０ｎＭから１μＭの間隔から選択される値より小さいＩＣ５０を有する逆アゴニストまたはアンタゴニストである。一部の実施形態において、前記調節因子は、１０ｎＭから１００ｎＭの間隔から選択される値より小さいＩＣ５０を有する逆アゴニストまたはアンタゴニストである。一部の実施形態において、前記調節因子は、トランスフェクトされたＣＨＯ細胞からの膜を用いて行われるＧＴＰγＳアッセイで、またはトランスフェクトされたメラニン保有細胞において行われる色素分散アッセイで、トランスフェクトされたＣＨＯ細胞においてもしくはトランスフェクトされたＣＨＯ細胞からの膜を用いて行われるｃＡＭＰアッセイで、またはトランスフェクトされた２９３細胞において行われるｃＡＭＰアッセイで、約１０μＭ未満の、約１μＭ未満の、約１００ｎＭ未満の、または約１０ｎＭ未満のＩＣ５０を有する逆アゴニストまたはアンタゴニストである（この場合、該トランスフェクトされたＣＨＯ細胞、または該トランスフェクトされたメラニン保有細胞、または該トランスフェクトされた２９３細胞は、配列番号２、配列番号４および配列番号６から選択されるアミノ酸配列を有する組換えＧＰＲ１０１受容体を発現する）。一部の実施形態において、前記組換えＧＰＲ１０１受容体は、配列番号２のアミノ酸配列を有する。一部の実施形態において、前記調節因子は、前記アッセイにおいて約１０μＭ未満の、約１μＭ未満の、約１００ｎＭ未満の、または約１０ｎＭ未満のＩＣ５０を有する逆アゴニストまたはアンタゴニストである。一部の実施形態において、前記調節因子は、前記アッセイにおいて約１０ｎＭから約１０μＭの間隔から選択される値より小さいＩＣ５０を有する逆アゴニストまたはアンタゴニストである。一部の実施形態において、前記調節因子は、前記アッセイにおいて約１０ｎＭから約１μＭの間隔から選択される値より小さいＩＣ５０を有する逆アゴニストまたはアンタゴニストである。一部の実施形態において、前記調節因子は、前記アッセイにおいて約１０ｎＭから約１００ｎＭの間隔から選択される値より小さいＩＣ５０を有する逆アゴニストまたはアンタゴニストである。
Ｅ．医薬組成物
本発明は、治療（および予防）（および調節、例えば増加または減少）方法を提供するものであり、この方法は、前記治療（または予防）（または調節）が必要な被験者に本発明の化合物（例えば、調節因子またはリガンド）の治療有効量を投与することによる（例えば、２００２年８月２９日に国際公開第０２／０６６５０５号として公開されたされたＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＩＢ０２／０１４６１も参照のこと；この開示は、その全体が本明細書に参照として取り入れられている）。１つの態様において、前記調節因子またはリガンドは、小分子である。１つの態様において、前記調節因子は、小分子であるが、但し、その小分子がポリペプチド、抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または脂質でないことを条件とする。１つの態様において、前記調節因子は、小分子であるが、但し、その小分子がポリペプチドでないことを条件とする。１つの態様において、前記調節因子は、小分子であるが、但し、その小分子が抗体またはその抗原結合フラグメントでないことを条件とする。１つの態様において、前記調節因子は、小分子であるが、但し、その小分子が脂質でないことを条件とする。１つの態様において、前記調節因子は、本発明のＧＰＣＲのアゴニストまたは部分アゴニストである。１つの態様において、前記調節因子は、脊椎動物ＧＰＲ１０１受容体のアゴニストまたは部分アゴニストである。１つの態様において、前記調節因子は、哺乳動物ＧＰＲ１０１受容体のアゴニストまたは部分アゴニストである。１つの態様において、前記調節因子は、ヒトＧＰＲ１０１受容体のアゴニストまたは部分アゴニストである。１つの態様において、前記調節因子は、アゴニストである。１つの態様において、前記調節因子は、部分アゴニストである。１つの態様において、前記調節因子は、本発明のＧＰＣＲの逆アゴニストまたはアンタゴニストである。１つの態様において、前記調節因子は、脊椎動物ＧＰＲ１０１受容体の逆アゴニストまたはアンタゴニストである。１つの態様において、前記調節因子は、哺乳動物ＧＰＲ１０１受容体の逆アゴニストまたはアンタゴニストである。１つの態様において、前記調節因子は、ヒトＧＰＲ１０１受容体の逆アゴニストまたはアンタゴニストである。１つの態様において、前記調節因子は、逆アゴニストである。１つの態様において前記調節因子は、アンタゴニストである。１つの態様において、前記調節因子またはリガンドは、実質的に精製されている。１つの態様において、前記被験者は、脊椎動物である。１つの態様において、前記被験者は、哺乳動物である。１つの態様において、前記被験者は、ヒトである。
本発明の調節因子およびリガンドは、単独で、または当業者周知の技術を用いてそれらが適する担体もしくは賦形剤（単数もしくは複数）と混合されている医薬組成物で、非ヒト脊椎動物（例えば、非ヒト哺乳動物）（下の実施例を参照のこと）および／またはヒトに投与することができる。適切な医薬的に許容される担体を当業者は利用することがでる。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８０，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，（Ｏｓｌｏら、ｅｄｓ．）を参照のこと。
その後、その医薬組成物を治療有効用量で提供する。治療有効用量は、例証として、および限定としてではなく、本明細書に記載する方法によって決定されるような疾患の症状または生理状態の予防または改善をもたらすために十分な調節因子またはリガンドの量を指し、この場合の疾患の症状または生理状態の予防または改善としては、ＰＯＭＣ由来生物活性ペプチド関連疾患の治療または予防、肥満またはそれに関連した状態の治療または予防、満腹の促進、過食症の治療または予防、発熱の治療または予防、炎症関連障害の治療または予防、被験者における体重の減少、被験者における脂肪蓄積の減少、体脂肪率の減少、食事摂取量の減少、および悪液質の治療または予防が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明の調節因子は、単独で提供することができ、または他の医薬的にもしくは生理的に許容される化合物との組み合わせで提供することができると明白に考えられる。ＰＯＭＣ由来生物活性ペプチドの分泌レベルを増加させることによって改善されるＰＯＭＣ由来生物活性ペプチド関連疾患、肥満およびそれに関連した状態、過食症、発熱、脳炎症関連障害ならびに悪液質をはじめとする（しかし、これらに限定されない）本発明の疾患を治療するための他の化合物は、現在、当該技術分野において周知である。一定の実施形態において、前記分泌レベルは、視床下部分泌レベルである。
本発明の化合物は、単独の活性医薬品として投与できる（すなわち、単独療法）のに対して、本発明の化合物は、本明細書に記載される疾患／状態／障害の治療のための他の医薬品と組み合わせて使用することもできる（すなわち、組み合わせ治療）。それゆえに、本発明の別の態様は、本明細書に記載されるような１種以上のさらなる医薬品と組み合わせて、脊椎動物（例えば、哺乳動物、ヒト）ＧＰＲ１０１受容体のアゴニストまたは部分アゴニスト（これらに限定されない）のような本発明の化合物（例えば、調節因子、リガンド）の治療有効量を、治療の必要がある被験体に投与する工程を包含する治療の方法を含む。他の医薬品との本発明の化合物の組み合わせ治療の範囲は、本明細書中、上記または下記に列挙したものに限定されないことが理解されるが、しかし、被験体における本発明の疾患、状態、または障害の治療のために有用である任意の医薬品または薬学的組成物との任意の組み合わせを原理的には含む。
本発明の１つの態様において、他の薬学的または生理学的に受容可能な化合物は、以下のような抗肥満剤である：アポリポタンパク質−β分泌／ミクロソームトリグリセリド輸送タンパク質（ａｐｏ−Ｂ／ＭＴＰ）阻害剤、ＭＣＲ−４アンタゴニスト、コレシストキニン（ｃｈｏｌｅｓｃｙｓｔｏｋｉｎｉｎ）−Ａ（ＣＣＫ−Ａ）アゴニスト、セロトニンおよびノルエピネフリン再取り込み阻害剤（例えば、シブトラミン）、交感神経様作動薬、β３アドレナリン作動性受容体アゴニスト、ドーパミンアゴニスト（例えば、ブロモクリプチン）、メラニン細胞刺激ホルモン受容体アナログ、カンナビノイド１受容体アンタゴニスト［例えば、ＳＲ１４１７１６；Ｎ−（ピペリジン−１−イル）−５−（４−クロロフェニル）−１−（２，４−ジクロロフェニル）−４−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボキサミド］、メラニン凝集ホルモンアンタゴニスト、レプトン（ＯＢタンパク質）、レプチンアナログ、レプチン受容体アゴニスト、ガラニンアンタゴニスト、リパーゼ阻害剤（テトラヒドロリプスタチン、すなわち、オーリスタット（Ｏｒｌｉｓｔａｔ）など）、食欲抑制剤（ボンベシンアゴニストなど）、ニューロペプチド−Ｙアンタゴニスト、甲状腺ホルモン様剤、ジヒドロエピアンドロステロンまたはそのアナログ、糖質コルチコイド受容体アゴニストまたはアンタゴニスト、オレキシン受容体アンタゴニスト、ウロコルチン結合タンパク質アンタゴニスト、グルカゴン様ペプチド−１受容体アゴニスト、毛様体神経栄養因子（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．，Ｔａｒｒｙｔｏｗｎ，ＮＹおよびＰｒｏｃｔｅｒ ＆ Ｇａｍｂｌｅ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ，ＯＨから利用可能であるＡｘｏｋｉｎｅ（商標）など）、ヒトアグーチ関連タンパク質（ＡＧＲＰ）アンタゴニスト、選択的５−ＨＴ２Ｃセロトニン受容体アゴニスト（例えば、塩酸ロルカセリン）、グレリン受容体アンタゴニスト、ヒスタミン３受容体アンタゴニストまたは逆アゴニスト、ニューロメディンＵ受容体アゴニスト、ノルアドレナリン作動性食欲減退剤（例えば、フェンテルミン、マジンドールなど）、および食欲抑制剤（例えば、ブプロピオン）。ある実施形態において、抗肥満剤は、オーリスタット、シブトラミン、ブロモクリプチン、エフェドリン、レプチン、プソイドエフェドリンおよび選択的５−ＨＴ２Ｃセロトニン受容体アゴニスト（例えば、塩酸ロルカセリン）からなる群より選択される。
本発明の１つの態様において、前記他の医薬的にもしくは生理的に許容される化合物は、抗炎症剤、例えば、非ステロイド系抗炎症薬（例えば、セレコキシブ、ロフェコキシブ）、アミノサリチレート（例えば、スルファサラジン、メサラミン、アゾジサリチレート、バラサラジド）、ヒドロキシクロロキン、金チオグルコース、金チオリンゴ酸ナトリウム、オーラノフィン、ペニシリン、レフルノミド、コルチコステロイド（例えば、プレドニゾン、プレドニゾロン、ブデソニド、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン）、免疫抑制剤（例えば、アザチオプリン、シクロスポリン、メトトレキサート、６−メルカプトプリン）および生物学的薬剤（例えば、エタネルセプト、インフリキシマブ、アジポネクチン、またはそれらの経口活性類似体）である。
本発明の１つの態様において、前記他の医薬的にもしくは生理的に許容される化合物は、解熱剤（ａｎｔｉ−ｐｙｒｅｘｉａ ａｇｅｎｔ）、例えば、アセトアミノフェンおよびイブプロフェンである。
本発明の態様に従って、本発明の化合物は、本明細書に引用される医薬品、または１種以上のクラスの薬物に属する薬剤と組み合わせて使用することができる。
投与の経路
投与の適切な経路には、当該分野で公知である方法を使用する、経口、鼻、直腸、経粘膜、経皮、または腸の投与、筋肉内、皮下、髄内注射を含む非経口送達、ならびに、くも膜下腔内、直接的脳室内、静脈内、腹腔内、鼻内、肺内（吸入）、または眼球内の注射が含まれる。他の特に好ましい投与の経路は、エアロゾルおよびデポー製剤である。持続放出製剤、特に、本発明の医薬のデポーは明確に意図される。特定の実施形態において、投与の経路は経口である。
組成物／製剤
本発明に従う使用のための薬学的または生理学的に受容可能な組成物および医薬は、賦形剤および助剤を含む、１種以上の薬学的または生理学的に受容可能なキャリアを使用する従来的な様式で製剤化されてもよい。本発明の化合物（例えば、調節因子、リガンド）は、当該分野で周知の技術を使用して薬学的に受容可能な組成物に製剤化することができる。適切な製剤は、選択される投与の経路に依存する。
本明細書に記載される特定の医薬には、薬学的または生理学的に受容可能なキャリアおよび少なくとも１種の本発明の調節因子が含まれる。注射のためには、本発明の薬剤は、水溶液中で、好ましくは、Ｈａｎｋｓ液、Ｒｉｎｇｅｒ液、または生理食塩水緩衝液、例えば、リン酸もしくは重炭酸緩衝液などの生理学的に適合可能な緩衝液中で製剤化されてもよい。経粘膜投与のためには、障壁に透過されるために適切な浸透剤が製剤中で使用される。このような浸透剤は、一般的に当該分野で公知である。
経口的に摂取することができる薬学的にまたは生理学的に受容可能な調製物には、ゼラチン製の押し込み型カプセル、ならびにゼラチン製のソフト密封カプセル、およびグリセロールまたはソルビトールなどの可塑剤が含まれる。押し込み型カプセルは、ラクトースなどの充填剤、デンプンなどの結合剤、および／またはタルクもしくはステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤、および選択的に、安定剤と混合した活性成分を含み得る。ソフトカプセル中では、活性化合物は、脂肪油、流動パラフィン、または液体ポリエチレングリコールなどの適切な液体中に溶解または懸濁されてもよい。加えて、安定剤が加えられてもよい。経口投与のためのすべての製剤は、このような投与のために適切な投薬量であるべきである。口腔投与のためには、組成物は、従来的な様式で製剤化した錠剤またはロゼンジの型で摂取されてもよい。
吸入による投与のためには、本発明に従う使用のための化合物は、噴霧器のための加圧パックからのエアロゾルスプレー提示の型で首尾よく送達され、適切な気体噴霧剤、例えば、二酸化炭素の使用を伴う。加圧エアロゾルの場合においては、投薬量単位は、定量した量を送達するためのバルブを提供することによって決定されてもよい。化合物の粉末混合物および適切な粉末基剤、例えば、ラクトースまたはデンプンを含む、吸入剤または吸入器における使用のための、例えば、ゼラチンのカプセルおよびカートリッジが製剤化されてもよい。
化合物は、注射によって、例えば、ボーラス注射または連続的注入によって、非経口投与のために製剤化されてもよい。注射のための製剤は、単位投薬量で、例えば、アンプルまたは複数用量容器中で、保存剤の添加を伴って、提示されてもよい。組成物は、水性ビヒクル中の懸濁液、溶液、またはエマルジョンのような型を取り得、懸濁剤、安定剤、および／または分散剤のような処方剤を含んでもよい。
非経口投与のための薬学的または生理学的に受容可能である製剤には、水溶型の活性化合物の水溶液が含まれる。水性懸濁液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランなどの、懸濁液の粘性を増加させる物質を含んでもよい。任意選択で、懸濁液は、適切な安定剤、または、高度に濃縮された溶液の調製を可能にするために化合物の溶解度を増加する薬剤もまた含んでもよい。
代替的には、活性成分は、使用前に、滅菌した、ピロゲンを含まない水などの適切なビヒクルとの構成のための粉末型または凍結乾燥型であってもよい。
以前に記載された製剤に加えて、化合物は、デポー調製物としても製剤化され得る。このような長時間作用する製剤は、移植によって（例えば、皮下または筋肉内に）、または筋肉内注射によって投与されてもよい。従って、例えば、化合物は、適切なポリマー性もしくは疎水性材料（例えば、受容可能な油中のエマルジョンとして）もしくはイオン交換樹脂とともに、または溶けにくい誘導体として、例えば、溶けにくい塩として製剤化されてもよい。
特定の実施形態において、化合物は、制御放出系を経由して送達できる。１つの実施形態において、ポンプが使用されてもよい（Ｌａｎｇｅｒ、前出；Ｓｅｆｔｏｎ、１９８７，ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１４：２０１−２４０；Ｂｕｃｈｗａｌｄら、１９８０，Ｓｕｒｇｅｒｙ ８８：５０７−５１６；Ｓａｕｄｅｋら、１９８９，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２１：５７４−５７９）。別の実施形態において、ポリマー材料が使用できる（Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，ＬａｎｇｅｒおよびＷｉｓｅ編，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ，１９７４；Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ，Ｄｒｕｇ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ，ＳｍｏｌｅｎおよびＢａｌｌ編，Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８４；ＲａｎｇｅｒおよびＰｅｐｐａｓ、１９８３，Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．Ｒｅｖ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３：６１；Ｌｅｖｙら、１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２８：１９０−１９２；Ｄｕｒｉｎｇら、１９８９，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．２５：３５１−３５６；Ｈｏｗａｒｄら、１９８９，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７１：８５８−８６３）。他の制御放出系は、Ｌａｎｇｅｒ（１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５３３）による概説において議論されている。
加えて、化合物は、治療剤を含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスなどの持続放出系を使用して送達されてもよい。種々の持続放出材料が確立されており、当業者に周知である。持続放出カプセルは、それらの化学的性質に依存して、数週間から１００日を超えるまでの期間、化合物を放出する可能性がある。
治療試薬の化学的性質および生物学的安定性に依存して、調節因子安定化のためのさらなるストラテジーが利用されてもよい。
薬学的または生理学的に受容可能な組成物は、適切な固相またはゲル相のキャリアまたは賦形剤もまた含んでもよい。このようなキャリアまたは賦形剤の例には、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、種々の糖類、デンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、およびポリエチレングリコールなどのポリマーが含まれるがこれらに限定されない。
有効投薬量
本発明における使用のために適切な薬学的または生理学的に受容可能な組成物には、活性成分がそれらの意図される目的を達成するための有効量で含まれる組成物が含まれる。より具体的には、治療有効量は、治療される被験体の徴候の発生を予防するため、または既存の徴候を改善するために有効な量を意味する。有効量の決定は、とりわけ、本明細書に提供される詳細な開示に鑑みて、十分に当業者の能力内にある。
本発明の方法において使用される任意の化合物について、治療有効量は、最初に細胞培養アッセイから見積もることができる。例えば、用量は、インビトロアッセイにおいて、ＧＰＲ１０１を含む細胞中のｃＡＭＰの細胞内レベルを増加することが示された濃度の点または範囲を含むかまたは網羅する循環濃度範囲を達成するために、動物モデルの中で処方することができる。このような情報は、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定するために使用することができる。
治療有効量とは、患者における徴候の改善を生じる化合物の量をいう。このような化合物の毒性および治療効力は、例えば、ＬＤ５０（試験集団の５０％に対して致死的である用量）およびＥＤ５０（試験集団の５０％において治療的に有効な用量）を決定するために、細胞培養または実験用動物において、標準的な薬学的手順によって決定することができる。毒性効果と治療効果の間の用量比が治療指数であり、ＬＤ５０とＥＤ５０の間の比として表現することができる。高い治療指数を示す化合物が好ましい。
これらの細胞培養アッセイおよび動物研究から得られたデータは、ヒトにおける使用のための投薬量の範囲を処方する際に使用することができる。このような化合物の投薬量は、好ましくは、毒性をほとんど伴わないか、または全く伴わないＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にある。この投薬量は、利用される剤形および利用される投与の経路に依存して、この範囲内で変動し得る。正確な処方、投与の経路、および投薬量は、患者の状態を考慮して、担当医が選択することができる（例えば、Ｆｉｎｇｌら、１９７５，「Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」所収、第１章を参照のこと）。
投薬量および投薬間隔は、患者の状態に依存して、本発明の障害を予防または治療するために十分である活性化合物の血漿レベルを提供するために、従属的に調整されてもよい。これらの効果を達成するために必要な投薬量は、対象の特性および投与の経路に依存する。
投薬間隔もまた、最小有効濃度の値を使用して決定することができる。化合物は、そのときの１０〜９０％、好ましくは、３０〜９９％の間、および最も好ましくは５０〜９０％について、最小有効濃度より上の血漿レベルを維持するレジメンを使用して投与されるべきである。局所的投与または選択的取り込みの場合において、薬物の有効局所的濃度は、血漿濃度とは関連しなくてもよい。
当然、投与される組成物の量は、治療される被験体、被験体の体重、苦痛の重篤度、投与の様式、および処方する担当医の判断に依存している。
所望の結果を達成するために、毎日または規則的な基準で投与可能である本発明の調節因子の量についての好ましい投薬量範囲は、０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重である。他の好ましい投薬量範囲は、０．１〜３０ｍｇ／ｋｇ体重である。他の好ましい投薬量範囲は、０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重である。他の好ましい投薬量範囲は、０．１〜３．０ｍｇ／ｋｇ体重である。当然、これらの毎日の投薬量は、一日の経過の間に定期的に、少量で送達または投与することができる。これらの投薬量範囲は、好ましい範囲であるのみであって、本発明に対する限定であることは意味しないことが注目される。上記所望の結果には、被験体の視床下部プロオピオメラノコルチン（ＰＯＭＣ）由来生物活性ペプチドの分泌の分泌の増大、被験体の満腹の促進、被験体の体重の減少、被験体の脂肪蓄積の減少、被験体の体脂肪率の減少、被験体の食物摂取の減少、肥満またはそれに関連する状態の予防または治療、過食症の予防または治療、発熱の予防または治療、および炎症関連障害の予防または治療が含まれるがこれらに限定されない。
Ｆ．治療方法
本発明は、とりわけ、脊椎動物ＧＰＲ１０１受容体の調節因子のまたは該調節因子と医薬的に許容される担体とを含む医薬組成物の治療有効量をその必要がある脊椎動物に投与することを含む、視床下部プロオピオメラノコルチン（ＰＯＭＣ）由来生物活性ペプチドの分泌を増加させる方法をはじめとする（しかし、これらに限定されない）方法を特徴とする。本発明は、脊椎動物ＧＰＲ１０１受容体の調節因子のまたは該調節因子と医薬的に許容される担体とを含む医薬組成物の治療有効量をその必要がある脊椎動物に投与することを含む、ＰＯＭＣ由来生物活性ペプチドの分泌レベルを増加させることにより改善されるＰＯＭＣ由来生物活性ペプチド関連疾患の治療または予防方法も特徴とする。ＰＯＭＣ由来生物活性ペプチドの分泌レベルを増加させることによって改善されるＰＯＭＣ由来生物活性ペプチド関連疾患は、肥満またはそれに関連した状態、過食症、発熱および炎症関連障害を含む（しかし、これらに限定されない）と解釈するものとする。一定の実施形態において、前記分泌レベルは、視床下部分泌レベルである。本発明は、脊椎動物ＧＰＲ１０１受容体の調節因子のまたは該調節因子と医薬的に許容される担体とを含む医薬組成物の治療有効量をその必要がある脊椎動物に投与することを含む、肥満またはそれに関連した状態の治療または予防方法も特徴とする。ある実施形態において、肥満に関連する状態は以下からなる群より選択される：高血圧、うっ血性心筋症、静脈瘤、肺塞栓症、冠性心疾患、脳卒中、特発性頭蓋内高血圧症、知覚異常性大腿神経痛、呼吸困難、閉塞性睡眠時無呼吸、低換気症候群、ピックウィック症候群、喘息、不動、変形性関節症、腰痛、線条萎縮すなわち「伸展裂創」、脚の静脈うっ滞、リンパ浮腫、蜂巣炎、間擦疹、癰、黒色表皮症、軟性線維腫、胃食道逆流障害、非アルコール性脂肪肝／脂肪性肝炎、胆石症、ヘルニア、結腸癌、緊張性尿失禁、肥満関連糸球体症、乳癌および子宮癌、うつ病および低い自己評価、損なわれた生活の質、メタボリック症候群、インスリン抵抗性、２型糖尿病、異脂肪血症、アテローム性動脈硬化症、女性の高アンドロゲン血症、多嚢胞性卵巣症候群、月経困難症、不妊症、妊娠合併症、および男性の性腺機能低下症。特定の実施形態において、肥満に関連する状態は、高血圧、インスリン抵抗性、メタボリック症候群、２型糖尿病、異脂肪血症、アテローム性動脈硬化症、冠性心疾患、および脳卒中からなる群より選択される。肥満に関連した個々の状態それぞれは、本発明の範囲内の独立した実施形態であると明白に考えられる。本発明は、脊椎動物ＧＰＲ１０１受容体の調節因子のまたは該調節因子と医薬的に許容される担体とを含む医薬組成物の治療有効量をその必要がある脊椎動物に投与することを含む、満腹を促進する方法も特徴とする。本発明は、脊椎動物ＧＰＲ１０１受容体の調節因子のまたは該調節因子と医薬的に許容される担体とを含む医薬組成物の治療有効量をその必要がある脊椎動物に投与することを含む、過食症を治療または予防する方法も特徴とする。本発明は、脊椎動物ＧＰＲ１０１受容体の調節因子のまたは該調節因子と医薬的に許容される担体とを含む医薬組成物の治療有効量をその必要がある脊椎動物に投与することを含む、発熱を治療または予防する方法も特徴とする。本発明は、脊椎動物ＧＰＲ１０１受容体の調節因子のまたは該調節因子と医薬的に許容される担体とを含む医薬組成物の治療有効量をその必要がある脊椎動物に投与することを含む、炎症関連障害を治療または予防する方法も特徴とする。一定の態様において、前記炎症関連障害は、炎症性腸疾患（例えば、クローン病および潰瘍性大腸炎）、炎症性関節炎（例えば、関節リウマチおよび乾癬性関節炎）、乾癬、喘息、慢性閉塞性肺疾患、敗血症性ショック、虚血／再潅流傷害、播種性血管内凝固、アテローム性硬化症、骨粗しょう症、再狭窄、全身性エリテマトーデス、急性移植拒絶反応、心筋梗塞、膵炎、肝炎、静脈血栓症、多発性損傷、うっ血性心不全、末梢神経損傷、および脳炎症関連障害からなる群より選択される。一部の実施形態において、前記炎症関連障害は、炎症性腸疾患、炎症性関節炎、敗血症ショック、虚血／再潅流傷害、アテローム性硬化症、骨粗しょう症、再狭窄、心筋梗塞、うっ血性心不全、および脳炎症関連障害からなる群より選択される。個々の炎症関連障害それぞれは本発明の範囲内の独立した実施形態であると、明白に考えられる。一部の実施形態において、前記脳炎症関連障害は、脳の傷害または外傷、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病、プリオン関連疾患、脳虚血、ＡＩＤＳによる認知症およびアルツハイマー病からなる群より選択される。個々の脳炎症関連障害それぞれは本発明の範囲内の独立した実施形態であると、明白に考えられる。本発明は、脊椎動物ＧＰＲ１０１受容体の調節因子のまたは該調節因子と医薬的に許容される担体とを含む医薬組成物の治療有効量をその必要がある脊椎動物に投与することを含む、体重を減少させる方法も特徴とする。本発明は、脊椎動物ＧＰＲ１０１受容体の調節因子のまたは該調節因子と医薬的に許容される担体とを含む医薬組成物の治療有効量をその必要がある脊椎動物に投与することを含む、脂肪蓄積を減少させる方法も特徴とする。本発明は、脊椎動物ＧＰＲ１０１受容体の調節因子のまたは該調節因子と医薬的に許容される担体とを含む医薬組成物の治療有効量をその必要がある脊椎動物に投与することを含む、体脂肪率を減少させる方法も特徴とする。本発明は、脊椎動物ＧＰＲ１０１受容体の調節因子のまたは該調節因子と医薬的に許容される担体とを含む医薬組成物の治療有効量をその必要がある脊椎動物に投与することを含む、食事摂取量を減少させる方法も特徴とする。一定の実施形態において、前記調節因子は、アゴニストまたは部分アゴニストである。一部の実施形態において、前記調節因子は、アゴニストである。一部の実施形態において、前記調節因子は、部分アゴニストである。一部の実施形態において、前記調節因子は、経口活性である。一部の実施形態において、前記経口活性調節因子は、さらに、血液脳関門を横断することができる。一部の実施形態において、前記調節因子は、医薬組成物で被験者に投与される。一部の実施形態において、前記調節因子は、医薬組成物で被験者に提供される。一部の実施形態において、前記調節因子は、経口摂取される医薬組成物で被験者に提供される。一部の実施形態において、前記脊椎動物は、哺乳動物である。一定の実施形態において、前記哺乳動物は、マウス、ラット、ウサギ、非ヒト霊長類、またはヒトである。一部の実施形態において、前記被験者は、非ヒト哺乳動物である。一定の実施形態において、前記脊椎動物は、ヒトである。
本発明は、とりわけ、脊椎動物ＧＰＲ１０１受容体の調節因子のまたは該調節因子と医薬的に許容される担体とを含む医薬組成物の治療有効量をその必要がある脊椎動物に投与することを含む、視床下部プロオピオメラノコルチン（ＰＯＭＣ）由来生物活性ペプチドの分泌を減少させる方法をはじめとする（しかし、これらに限定されない）方法を特徴とする。本発明は、脊椎動物ＧＰＲ１０１受容体の調節因子のまたは該調節因子と医薬的に許容される担体とを含む医薬組成物の治療有効量をその必要がある脊椎動物に投与することを含む、ＰＯＭＣ由来生物活性ペプチドの分泌レベルを減少させることにより改善されるＰＯＭＣ由来生物活性ペプチド関連疾患の治療または予防方法も特徴とする。ＰＯＭＣ由来生物活性ペプチドの分泌レベルを減少させることにより改善されるＰＯＭＣ由来生物活性ペプチド関連疾患は、悪液質を含む（しかし、これに限定されない）と解釈するものとする。一定の実施形態において、前記分泌レベルは、視床下部分泌レベルである。本発明は、脊椎動物ＧＰＲ１０１受容体の調節因子のまたは該調節因子と医薬的に許容される担体とを含む医薬組成物の治療有効量をその必要がある脊椎動物に投与することを含む、悪液質を治療または予防する方法も特徴とする。一部の実施形態において、前記悪液質は、ＡＩＤＳ関連体重減少、癌関連体重減少および食欲不振関連体重減少からなる群より選択される。ＡＩＤＳ関連体重減少、癌関連体重減少および食欲不振関連体重減少は、本発明の範囲内の独立した実施形態であると、明白に考えられる。本発明は、脊椎動物ＧＰＲ１０１受容体の調節因子のまたは該調節因子と医薬的に許容される担体とを含む医薬組成物の治療有効量をその必要がある脊椎動物に投与することを含む、体重を増加させる方法も特徴とする。本発明は、脊椎動物ＧＰＲ１０１受容体の調節因子のまたは該調節因子と医薬的に許容される担体とを含む医薬組成物の治療有効量をその必要がある脊椎動物に投与することを含む、脂肪蓄積を増加させる方法も特徴とする。本発明は、脊椎動物ＧＰＲ１０１受容体の調節因子のまたは該調節因子と医薬的に許容される担体とを含む医薬組成物の治療有効量をその必要がある脊椎動物に投与することを含む、体脂肪率を増加させる方法も特徴とする。本発明は、脊椎動物ＧＰＲ１０１受容体の調節因子のまたは該調節因子と医薬的に許容される担体とを含む医薬組成物の治療有効量をその必要がある脊椎動物に投与することを含む、食事摂取量を増加させる方法も特徴とする。一定の実施形態において、前記調節因子は、逆アゴニストまたはアンタゴニストである。一部の実施形態において、前記調節因子は、逆アゴニストである。一部の実施形態において、前記調節因子は、アンタゴニストである。一部の実施形態において、前記調節因子は、経口活性である。一部の実施形態において、前記経口活性調節因子は、さらに、血液脳関門を横断することができる。一部の実施形態において、前記調節因子は、医薬組成物で被験者に投与される。一部の実施形態において、前記調節因子は、医薬組成物で被験者に提供される。一部の実施形態において、前記調節因子は、経口摂取される医薬組成物で被験者に提供される。一部の実施形態において、前記脊椎動物は、哺乳動物である。一定の実施形態において、前記哺乳動物は、マウス、ラット、ウサギ、非ヒト霊長類、またはヒトである。一部の実施形態において、前記被験者は、非ヒト哺乳動物である。一定の実施形態において、前記脊椎動物は、ヒトである。
Ｇ．他の有用性
哺乳動物ＧＰＲ１０１などの本発明のＧＰＣＲの受容体機能を調節する（すなわち、阻害または刺激する）薬剤は、ＧＰＣＲと候補化合物を接触させる工程、および受容体機能に対する候補化合物の効果を決定することによって同定されてもよい。ヒトＧＰＲ１０１などの哺乳動物のＧＰＲ１０１の機能を調節する化合物の選択性は、１種以上の他のＧタンパク質結合受容体に対するその効果に対して、ＧＰＲ１０１に対するその効果を比較することによって評価することができる。特定の実施形態において、ＧＰＲ１０１調節因子は、ＧＰＲ１６１受容体よりも、ＧＰＲ１０１に対して少なくとも約１０倍、少なくとも約１００倍、または少なくとも約１０００倍の選択性を有する、選択的ＧＰＲ１０１調節因子（例えば、アゴニストまたは部分アゴニストだが、これらに限定されない）である。ＧＰＲ１０１の機能を調節する化合物の同定後、このような候補化合物は、それらの活性を確認または定量するために、インビボモデルを含むがこれに限定されない他のアッセイにおいてさらに試験されてもよい。ＧＰＲ１０１機能の調節因子は、例えば、正常なまたは異常なＧＰＲ１０１の機能が含まれる疾患および生理学的状態の治療において、治療的に有用である。
哺乳動物ＧＰＲ１０１などの哺乳動物のＧＰＣＲのリガンドである薬剤は、ＧＰＣＲと候補化合物を接触させる工程、および候補化合物が受容体に結合するか否かを決定することによって同定されてもよい。ヒトＧＰＲ１０１などの哺乳動物ＧＰＲ１０１に結合する化合物の選択性は、１種以上の他のＧタンパク質結合受容体に対するその結合に対して、ＧＰＲ１０１に対するその結合を比較することによって評価することができる。一部の実施形態において、ＧＰＲ１０１リガンドは、ＧＰＲ１６１受容体よりも、ＧＰＲ１０１に対して少なくとも約１０倍、少なくとも約１００倍、または少なくとも約１０００倍の選択性を有する、選択的ＧＰＲ１０１リガンドである。ＧＰＲ１０１受容体機能の調節因子であるリガンドは、正常なまたは異常なＧＰＲ１０１の機能が含まれる疾患および生理学的状態の治療において、治療的に有用である。
本発明は、哺乳動物ＧＰＲ１０１などの本発明のＧＰＣＲの調節因子またはリガンドとして同定された本発明の化合物の放射性同位体標識バージョンにも関し、これらは、放射線イメージングにおいて有用であろうし、ヒトをはじめとする組織サンプル中のＧＰＲ１０１を局在定位および定量するための、ならびにＧＰＲ１０１の公知リガンドなどの放射性同位体標識化合物の結合の阻害に関する方法においてまたは直接結合する方法においてＧＰＲ１０１リガンドを同定するための、インビトロおよびインビボ、両方でのアッセイにおいても有用であろう。本発明のさらなる目的は、そうした放射性同位体標識化合物を含む本発明のＧＰＣＲ、例えば、哺乳動物ＧＰＲ１０１、例えばヒトＧＰＲ１０１に関する新規アッセイを開発することである。例証として、および限定としてではなく、放射線イメージングによって可視化される正常範囲より下の低減された脳ＧＰＲ１０１によって、肥満もしくはそれに関連した状態の危険がある、または炎症関連障害の危険がある被験者が特定される。一部の実施形態において、前記脳ＧＰＲ１０１は、視床下部ＧＰＲ１０１である。一部の実施形態において、前記脳ＧＰＲ１０１は、視床下部弓状核ＧＰＲ１０１である。一部の実施形態において、前記被験者は、ヒトである。
本発明は、放射線イメージング法にも関し、この方法は、該放射線イメージングが必要な哺乳動物に、哺乳動物ＧＰＲ１０１受容体の調節因子またはリガンドである放射性標識化合物を投与することを含む。１つの態様において、前記哺乳動物ＧＰＲ１０１受容体のリガンドは、その哺乳動物ＧＰＲ１０１受容体の調節因子ではない。一部の実施形態において、前記哺乳動物は、ヒトである。一部の実施形態において、前記放射線イメージング法は、その哺乳動物が、肥満もしくはそれに関連した状態の危険があるかどうか、または肥満もしくはそれに関連した状態に進行しているかどうかを特定するための方法であり、この場合、その哺乳動物における正常範囲より下の脳ＧＰＲ１０１レベルは、その哺乳動物に肥満もしくはそれに関連した状態の危険があることまたは肥満もしくはそれに関連した状態に進行していることの指標となる。一部の実施形態において、前記放射線イメージング法は、哺乳動物ＧＰＲ１０１のアゴニストもしくは部分アゴニストでまたは該アゴニストもしくは部分アゴニストと医薬的に許容される担体とを含む医薬組成物で肥満またはそれに関連した状態を予防または治療する哺乳動物を特定するための方法であり、この場合、哺乳動物における正常範囲より下の脳ＧＰＲ１０１レベルによって、哺乳動物ＧＰＲ１０１のアゴニストもしくは部分アゴニストでまたは該アゴニストもしくは部分アゴニストと医薬的に許容される担体とを含む医薬組成物で肥満またはそれに関連した状態を予防または治療する哺乳動物が特定される。一部の実施形態において、前記放射線イメージング法は、その哺乳動物が、炎症関連障害の危険があるかどうか、または炎症性関連疾患に進行しているかどうかを特定するための方法であり、この場合、その哺乳動物における正常範囲より下の脳ＧＰＲ１０１レベルは、その哺乳動物に炎症関連障害の危険があることまたは炎症関連障害に進行していることの指標となる。一部の実施形態において、前記放射線イメージング法は、哺乳動物ＧＰＲ１０１のアゴニストもしくは部分アゴニストでまたは該アゴニストもしくは部分アゴニストと医薬的に許容される担体とを含む医薬組成物で炎症関連障害を予防または治療する哺乳動物を特定するための方法であり、この場合、哺乳動物における正常範囲より下の脳ＧＰＲ１０１レベルによって、哺乳動物ＧＰＲ１０１のアゴニストもしくは部分アゴニストでまたは該アゴニストもしくは部分アゴニストと医薬的に許容される担体とを含む医薬組成物で炎症関連障害を予防または治療する哺乳動物が特定される。一部の実施形態において、前記脳ＧＰＲ１０１は、視床下部ＧＰＲ１０１である。一部の実施形態において、前記脳ＧＰＲ１０１は、視床下部弓状核ＧＰＲ１０１である。放射線イメージング技術は、当業者に周知である（例えば、Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ｑ Ｊ Ｎｕｃｌ Ｍｅｄ（１９９７）４１：１６３−９を参照のこと）。
本発明は、本発明のＧＰＣＲ、例えば、哺乳動物ＧＰＲ１０１、例えばヒトＧＰＲ１０１、の調節因子またはリガンドとして同定された本発明の化合物の放射性同位体標識バージョンを包含する。
本発明は、哺乳動物ＧＰＲ１０１、例えば、ヒトＧＰＲ１０１などの本発明のＧＰＣＲに結合するリガンドを検出するために有用である試験化合物の放射性標識されたバージョンにも関する。ある実施形態において、本発明は、哺乳動物ＧＰＲ１０１、例えば、ヒトＧＰＲ１０１などの本発明のＧＰＣＲに結合するリガンドを検出するために有用である上記放射性標識された試験化合物のライブラリーを明確に意図する。特定の実施形態において、上記ライブラリーは、少なくとも約１０個、少なくとも約１０２個、少なくとも約１０３個、少なくとも約１０５個、または少なくとも約１０６個の上記放射性標識された試験化合物を含む。このような放射性同位元素標識された試験化合物を含む、哺乳動物ＧＰＲ１０１、例えば、ヒトＧＰＲ１０１などの本発明のＧＰＣＲに関連する新規なアッセイを開発することは本発明のさらなる目的である。
ある実施形態において、化合物の放射性標識されたバージョンは、１つ以上の原子が、典型的には天然に見出される（すなわち、天然に存在する）原子量または質量数とは異なる原子量または質量数を有する原子によって置き換えまたは置換されているという事実を別にすれば、その化合物と同一である。本発明の化合物中に取り込まれ得る適切な放射性核種には、２Ｈ（ジューテリウム）、３Ｈ（トリチウム）、１１Ｃ、１３Ｃ、１４Ｃ、１３Ｎ、１５Ｎ、１５Ｏ、１７Ｏ、１８Ｏ、１８Ｆ、３５Ｓ、３６Ｃｌ、８２Ｂｒ、７５Ｂｒ、７６Ｂｒ、７７Ｂｒ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、および１３１Ｉが含まれるがこれらに限定されない。即時性の放射性標識化合物に取り込まれる放射性核種は、その放射性標識される化合物の特定の適用に依存する。例えば、インビトロＧＰＲ１０１受容体標識および競合アッセイのためには、３Ｈ、１４Ｃ、８２Ｂｒ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、または３５Ｓを取り込んでいる化合物が一般的に最も有用である。放射性イメージング適用のためには、１１Ｃ、１８Ｆ、１２５Ｉ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１３１Ｉ、７５Ｂｒ、７６Ｂｒ、または７７Ｂｒが一般的に最も有用である。ある実施形態において、放射性核種は、３Ｈ、１１Ｃ、１８Ｆ、１４Ｃ、１２５Ｉ、１２４Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ、および８２Ｂｒからなる群より選択される。
放射性同位元素を有機化合物に取り込むための適切な方法は、本発明の化合物に適用可能であり、当該分野で周知である。これらの合成方法、例えば、活性レベルのトリチウムを標的分子に取り込むことは、以下の通りである：
Ａ．トリチウムガスを用いる触媒還元−この手順は、通常、高比活性生成物を生じ、ハロゲン化または不飽和前駆体を必要とする。
Ｂ．水素化ホウ素ナトリウム［３Ｈ］を用いる還元−この手順はやや高価であり、アルデヒド、ケトン、ラクトン、エステルなどのような還元可能な官能基を含む前駆体を必要とする。
Ｃ．水素化アルミニウムリチウム［３Ｈ］を用いる還元−この手順は、ほぼ理論的な比活性で生成物を提供する。これもまた、アルデヒド、ケトン、ラクトン、エステルなどのような還元可能な官能基を含む前駆体を必要とする。
Ｄ．トリチウムガス曝露標識−この手順は、適切な触媒の存在下で、交換可能なプロトンを含む前駆体をトリチウムガスに曝露することを含む。
Ｅ．ヨウ化メチル［３Ｈ］を使用するＮ−メチル化−この手順は、通常、高比活性ヨウ化メチル［３Ｈ］で適切な前駆体を処理することによって、Ｏ−メチルまたはＮ−メチル（３Ｈ）生成物を調製するために利用される。この方法は、一般的に、より高い比活性、例えば、約７０〜９０Ｃｉ／ｍｍｏｌなどを可能にする。
活性レベルの１２５Ｉを標的分子に取り込むための合成方法には以下が含まれる：
Ａ．Ｓａｎｄｍｅｙｅｒおよび同様の反応−この手順は、アリールまたはヘテロアリールアミンを、ジアゾニウム塩、例えば、テトラフルオロホウ酸塩に転換し、続いて、Ｎａ１２５Ｉを使用して１２５Ｉ標識化合物に転換する。代表的な手順は、Ｚｈｕ，Ｄ．−Ｇ．および共同研究者により、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２００２，６７，９４３−９４８において報告された。
Ｂ．フェノールのオルト１２５ヨウ素化−この手順は、Ｃｏｌｌｉｅｒ，Ｔ．Ｌ．および共同研究者によってＪ．Ｌａｂｅｌｅｄ Ｃｏｍｐｄ Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ．１９９９，４２，Ｓ２６４−Ｓ２６６において報告されたように、フェノールのオルト位における１２５ヨウ素の取り込みを可能にする。
Ｃ．臭化アリールおよび臭化ヘテロアリールの１２５Ｉとの交換−この方法は、一般的に、２段階プロセスである。第１段階は、ハロゲン化トリアルキルスズまたはヘキサアルキル二スズ［例えば、（ＣＨ３）３ＳｎＳｎ（ＣＨ３）３］の存在下で、例えば、Ｐｄ触媒反応を使用して［すなわち、Ｐｄ（Ｐｈ３Ｐ）４］、またはアリールまたはヘテロアリールリチウムを通しての、臭化アリールおよび臭化ヘテロアリールの、対応するトリアルキルスズ中間体への転換である。代表的な手順は、Ｂａｓ，Ｍ．−Ｄ．および共同研究者によって、Ｊ．Ｌａｂｅｌｅｄ Ｃｏｍｐｄ Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ．２００１，４４，Ｓ２８０−Ｓ２８２において報告された。
ある実施形態において、化合物の放射性標識されたバージョンは、放射性核種を含む１つ以上の置換基の付加を別にすれば、その化合物と同一である。さらなるある実施形態において、化合物はポリペプチドである。さらなるある実施形態において、化合物は、抗体またはその抗原結合フラグメントである。さらなるある実施形態において、上記抗体はモノクローナルである。適切な上記放射性核種には、２Ｈ（ジューテリウム）、３Ｈ（トリチウム）、１１Ｃ、１３Ｃ、１４Ｃ、１３Ｎ、１５Ｎ、１５Ｏ、１７Ｏ、１８Ｏ、１８Ｆ、３５Ｓ、３６Ｃｌ、８２Ｂｒ、７５Ｂｒ、７６Ｂｒ、７７Ｂｒ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、および１３１Ｉが含まれるがこれらに限定されない。即時性の放射性標識化合物に取り込まれる放射性核種は、その放射性標識される化合物の特定の適用に依存する。例えば、インビトロＧＰＲ１０１受容体標識および競合アッセイのためには、３Ｈ、１４Ｃ、８２Ｂｒ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、または３５Ｓを取り込んでいる化合物が一般的に最も有用である。放射性イメージング適用のためには、１１Ｃ、１８Ｆ、１２５Ｉ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１３１Ｉ、７５Ｂｒ、７６Ｂｒ、または７７Ｂｒが一般的に最も有用である。ある実施形態において、放射性核種は、３Ｈ、１１Ｃ、１８Ｆ、１４Ｃ、１２５Ｉ、１２４Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ、および８２Ｂｒからなる群より選択される。
放射性核種を含む１個以上の置換基を付加するための方法は当業者の範囲内にあり、酵素的方法［Ｍａｒｃｈａｌｏｎｉｃ ＪＪ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ（１９６９）１１３：２９９−３０５；Ｔｈｏｒｅｌｌ ＪＩおよびＪｏｈａｎｓｓｏｎ ＢＧ、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ（１９６９）２５１：３６３−９；これらの各々の開示は、その全体が参照により本明細書に援用される］による、およびまたはクロラミン（Ｃｈｌｏｒａｍｉｎｅ）−Ｔ／ヨードゲン（Ｉｏｄｏｇｅｎ）／ヨードビーズ（Ｉｏｄｏｂｅａｄ）法［Ｈｕｎｔｅｒ ＷＭおよびＧｒｅｅｎｗｏｏｄ ＦＣ、Ｎａｔｕｒｅ（１９６２）１９４：４９５−６；Ｇｒｅｅｎｗｏｏｄ ＦＣら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ（１９６３）８９：１１４−２３；これらの各々の開示は、その全体が参照により本明細書に援用される］による、放射性同位元素ヨウ素の付加を含むがこれに限定されない。
上記の技術は、例示的であり、限定するものではないことが意図される。試験化合物または本発明のＧタンパク質結合受容体のリガンドであることが知られている化合物を放射性標識する他の技術は、当業者に周知である。
開示された受容体および方法の他の使用は、とりわけ、本特許文書の再検討に基づき当業者に明らかになる。
以下の実施例は、本発明の説明のために提示され、限定のためではない。特定の核酸配列およびアミノ酸配列が本明細書に開示されるが、当業者は、以下に報告されるものと同じかまたは実質的に同様の結果を達成しながら、これらの配列に対してわずかな修飾を作成する能力があると考えられる。このような修飾アプローチは、本開示の範囲内にあると見なされる。さらなる労力を伴うことなく、当業者は、先の記載を使用して、その最も完全な程度まで、本発明を実施することができると考えられている。以下の詳細な実施例は、単に例示として解釈されるべきであり、いかなる場合においても、何であれ、先の開示の限定であると解釈されるべきではない。当業者は、これらの手順からの適切なバリエーションを即座に認識する。
本発明の対象に関連し、かつ当業者に公知である組換えＤＮＡ技術は、例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ Ｔら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；米国特許第６，３９９，３７３号；およびＷＯ ０２／０６６５０５として２００２年８月２９日に公開されたＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＩＢ０２／０１４６１において見出すことができ；これらの各々の開示は、その全体が参照により本明細書に援用される。
実施例１
内因性ヒトＧＰＲ１０１の全長クローニング
内因性ヒトＧＰＲ１０１をコードするポリヌクレオチドは、
プライマー５’−ＧＣＴＧＴＴＧＣＣＡＴＧＡＣＧＴＣＣＡＣＣＴＧＣＡＣ−３’（配列番号７；センス）および
５’−ＧＧＡＣＡＧＴＴＣＡＡＧＧＴＴＴＧＣＣＴＴＡＧＡＡＣ−３’（配列番号８；アンチセンス）、
ならびに鋳型としてヒトゲノムＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用する、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によってクローニングした。ＴａｑＰｌｕｓ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ＤＮＡ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を、以下のサイクルによって、ステップ２からステップ４を３５回反復して、増幅のために使用した：
９４℃、３分間；９４℃、２０秒間；６５℃、２０秒間；７２℃、２分間；７２℃、７分間。
１．５Ｋｂ ＰＣＲフラグメントを単離し、ｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯベクターにクローニングし、ＡＢＩ Ｂｉｇ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒキット（Ｐ．Ｅ． Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）を使用して完全に配列決定した。ヒトＧＰＲ１０１の核酸配列を配列番号１に示し、ヒトＧＰＲ１０１のコードされたアミノ酸配列を配列番号２示す。
実施例２
受容体発現
タンパク質の発現の技術のために種々の細胞が利用可能である（酵母細胞、哺乳動物細胞およびメラニン保有細胞が挙げられるが、これらに限定されない）。特定の実施形態において、酵母細胞が使用される。特定の実施形態において、哺乳動物細胞が使用される。特定の実施形態において、メラニン保有細胞が使用される。哺乳動物細胞のＣＨＯ、ＣＯＳ−７、ＭＣＢ３９０１、２９３、および２９３Ｔ細胞は特に好ましいが、利用される特定の哺乳動物細胞は、当業者の特定の必要性に基礎を置くことができる。実施例９を含む、メラニン保有細胞に関連するような下記を参照のこと。
ａ．一過性トランスフェクション
１日目に、１０ｃｍディッシュあたり４×１０６個の２９３細胞をプレートする。２日目に、２つの反応チューブを調製する（各チューブについての以下の割合はプレートあたりである）：チューブＡは、０．５ｍＬ無血清ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）中で４μｇ ＤＮＡ（例えば、ｐＣＭＶベクター；本発明のＧＰＣＲをコードするポリヌクレオチドを含むｐＣＭＶベクターなど）を混合することによって調製し；チューブＢは、０．５ｍＬ無血清ＤＭＥＭ中で２４μＬリポフェクタミン（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）を混合することによって調製する。チューブＡおよびＢは、逆さまにすること（数回）によって混合し、続いて、室温で３０〜４５分間のインキュベーションを行う。この混合物は、「トランスフェクション混合物」と称する。プレートした２９３細胞は、１×ＰＢＳで洗浄し、続いて５ｍＬ無血清ＤＭＥＭの添加を行う。１ｍＬのトランスフェクション混合物を細胞に加え、続いて３７℃／５％ ＣＯ２で４時間のインキュベーションを行う。トランスフェクション混合物は吸引によって取り出し、１０ｍＬのＤＭＥＭ／１０％ウシ胎仔血清の添加を行う。細胞は３７℃／５％ ＣＯ２でインキュベートする。４８時間のインキュベーション後、細胞を収集し、分析のために利用する。
ｂ．安定な細胞株
約１２×１０６個の２９３細胞を、１５ｃｍ組織培養プレートにプレートする。１０％のウシ胎仔血清、ならびに１％のピルビン酸ナトリウム、Ｌ−グルタミン、および抗生物質を含むＤＭＥ高グルコース培地中で増殖させる。２９３細胞のプレーティングの２４時間後（または〜８０％コンフルエンシーまで）、細胞を、１２μｇのＤＮＡ（例えば、本発明のＧＰＣＲをコードするポリヌクレオチドを含むｐＣＭＶ−ｎｅｏｒベクター）を使用してトランスフェクトする。１２μｇのＤＮＡを、６０μＬのリポフェクタミンおよび血清を含まない２ｍＬのＤＭＥ高グルコース培地と合わせる。培地をプレートから吸引し、細胞を１回、血清を含まない培地で洗浄する。ＤＮＡ、リポフェクタミン、および培地の混合物を、血清を含まない１０ｍＬの培地とともにプレートに加える。３７℃で４時間から５時間のインキュベーション後、培地を吸引し、血清を含まない２５ｍＬの培地を加える。トランスフェクションの２４時間後、培地を再度吸引し、血清を含む新鮮な培地を加える。トランスフェクションの４８時間後、培地を吸引し、５００μｇ／ｍＬの最終濃度でジェネティシン（Ｇ４１８薬物）を含む、血清を含む培地を加える。トランスフェトした細胞は、ここで、Ｇ４１８耐性遺伝子を含むポジティブにトランスフェクトした細胞の選択を受ける。培地は、選択を行うときに、４日から５日毎に置き換える。選択の間、細胞は、安定なプールを作製するため、または安定なクローン選択のために分けるために増殖させる。
実施例３
ＧＰＣＲ活性化の決定のためのアッセイ（例えば、スクリーニングアッセイ）
種々のアプローチが、目的のＧＰＣＲまたは「標的ＧＰＣＲ」の活性化を評価するために利用可能である。以下は例示である；当業者は、当業者の必要性のために優先的に有益であるこれらの技術を決定する能力があると考えられている。
１．膜結合アッセイ：［３５Ｓ］ＧＴＰγＳアッセイ
Ｇタンパク質結合受容体がその活性状態にあるときに、リガンド結合または構成的活性化のいずれかの結果として、受容体はＧタンパク質に結合し、ＧＤＰの放出を刺激し、続いてＧタンパク質へのＧＴＰの結合を刺激する。Ｇタンパク質受容体複合体のαサブユニットはＧＴＰａｓｅとして働き、ＧＴＰをＧＤＰにゆっくりと加水分解し、その時点で、受容体は通常非活性化される。活性化された受容体はＧＤＰをＧＴＰに交換することを継続する。ＧＴＰの加水分解不可能なアナログである［３５Ｓ］ＧＴＰγＳは、活性化受容体を発現する膜への［３５Ｓ］ＧＴＰγＳの結合の増強を実証するために使用することができる。活性化を測定するために［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ結合を使用することの利点は以下の点である：（ａ）これは、一般的にすべてのＧタンパク質結合受容体に適用可能であること；（ｂ）これは、膜の表面に近接しており、細胞内カスケードに影響を与える分子を拾い上げる可能性をより少なくすること。
このアッセイは、関連する受容体を発現している膜への［３５Ｓ］ＧＴＰγＳの結合を刺激する、Ｇタンパク質結合受容体の能力を利用する。それゆえに、このアッセイは、ＧＰＣＲの調節因子として候補化合物をスクリーニングするために使用することができる。このアッセイは一般的であり、すべてのＧタンパク質結合受容体において薬物発見への適用を有する。
［３５Ｓ］ＧＴＰγＳアッセイは、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳおよび１〜約２０ｍＭの間のＭｇＣｌ２（この量は結果の最適化のために調整可能であるが、２０ｍＭが好ましい）、ｐＨ７．４、約０．３〜約１．２ｎＭの間の［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ結合緩衝液（この量は結果の最適化のために調整可能であるが、１．２が好ましい）、および１２．５〜７５μｇ膜タンパク質（例えば、本発明のＧＰＣＲを発現している２９３細胞；この量は最適化のために調整可能である）、および１０μＭ ＧＤＰ（この量は結果の最適化のために調整可能である）中で、１時間インキュベートする。次いで、コムギ胚芽凝集素ビーズ（２５μＬ；Ａｍｅｒｓｈａｍ）を加え、この混合物をさらに３０分間、室温でインキュベートする。次いで、チューブを１５００×ｇで５分間、室温にて遠心分離し、次いで、シンチレーションカウンターで計数する。
２．アデニリルシクラーゼ
細胞ベースのアッセイのために設計されたＦｌａｓｈ Ｐｌａｔｅ（商標）アデニリルシクラーゼキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ；カタログ番号ＳＭＰ００４Ａ）は、粗原形質膜を用いる使用のために改変することができる。Ｆｌａｓｈ Ｐｌａｔｅウェルは、シンチラントコーティングを含むことができ、これはまた、ｃＡＭＰを認識する特異的抗体を含む。ウェル中で生成したｃＡＭＰは、ｃＡＭＰ抗体への放射活性ｃＡＭＰトレーサーの結合に対する直接的競合によって定量することができる。以下は、受容体を発現する全細胞中でのｃＡＭＰレベルの変化の測定のための短いプロトコールとして役立つ。
トランスフェクトされた細胞は、一過性トランスフェクションの約２４時間から４８時間後に収集する。培地を注意深く吸引して除き、廃棄する。１０ｍＬのＰＢＳを、細胞の各ディッシュに穏やかに加え、その後注意深く吸引する。１ｍＬのＳｉｇｍａ細胞脱離緩衝液および３ｍＬのＰＢＳを各プレートに加える。細胞を、ピペットを用いてプレートから取り出し、細胞懸濁液を、５０ｍＬコニカル遠心分離チューブに収集する。次いで、細胞を、室温にて１，１００ｒｐｍで５分間遠心分離する。細胞ペレットを、適切な量（約３ｍＬ／プレート）のＰＢＳに注意深く再懸濁する。次いで、血球計を使用して細胞を計数し、さらなるＰＢＳを加えて、適切な数の細胞を得る（約５０μＬ／ウェルの最終量）。
ｃＡＭＰ標準および検出緩衝液（１１ｍＬ検出緩衝液に対して１μＣｉのトレーサー［１２５Ｉ］ｃＡＭＰ（５０μＬ）を含む）を調製し、製造業者の指示書に従って維持する。アッセイ緩衝液をスクリーニングのために新鮮に調製し、これは５０μＬの刺激緩衝液、３μＬの試験化合物（１２μＭ最終アッセイ濃度）および５０μＬ細胞を含む。アッセイ緩衝液は、利用するまで氷上に保存する。例えば、９６ウェルプレート中で好ましく実行されるアッセイは、適切なウェルへの５０μＬのｃＡＭＰ標準の添加、続いてウェルＨ−１１およびＨ１２への５０μＬのＰＢＳの添加によって開始する。５０μＬの刺激緩衝液はすべてのウェルに加える。ＤＭＳＯ（または選択した候補化合物）は、３μＬの化合物溶液を分散可能であるピンツール（ｐｉｎ ｔｏｏｌ）を使用して適切なウェルに加え、試験化合物は１２μＭの最終アッセイ濃度および１００μＬの全体のアッセイ容量となる。次いで、細胞をウェルに加え、室温で６０分間インキュベートする。次いで、トレーサーｃＡＭＰを含む１００μＬの検出ミックスをウェルに加える。次いで、プレートは、さらに２時間インキュベートし、続いて、Ｗａｌｌａｃ ＭｉｃｒｏＢｅｔａシンチレーションカウンター中で計数する。次いで、ｃＡＭＰ／ウェルの値は、各アッセイプレート中に含まれる標準ｃＡＭＰ曲線から外挿する。
３．Ｇｉ共役標的ＧＰＣＲのための細胞ベースのｃＡＭＰアッセイ
ＴＳＨＲは、活性化の際にｃＡＭＰの蓄積を引き起こすＧｓ共役ＧＰＣＲである。ＴＳＨＲは、アミノ酸残基６２３を変異させること（すなわち、アラニン残基をイソロイシン残基に変化させること）によって継続的に活性化される。Ｇｉ結合受容体は、アデニリルシクラーゼを阻害し、それゆえに、ｃＡＭＰ産生のレベルを減少させることが予想され、このことがｃＡＭＰレベルの評価を困難にする可能性がある。Ｇｉ結合受容体の活性化の指標としてのｃＡＭＰの産生の減少を測定するための有効な技術は、最も好ましくは、ベースラインレベルのｃＡＭＰを確立するためのＧｉ共役標的ＧＰＣＲとともに、「シグナルエンハンサー」としての、非内因性で構成的に活性化されたＴＳＨＲ（ＴＳＨＲ−Ａ６２３Ｉ）（または、内因性で構成的に活性なＧｓ結合受容体）を同時トランスフェクトすることによって達成することができる。Ｇｉ結合受容体は、シグナルエンハンサーとともに同時トランスフェクトされ、スクリーニングのために使用できるのはこの物質である。このようなアプローチは、ｃＡＭＰアッセイが使用される場合に効果的にシグナルを生成するために利用できる。ある実施形態において、このアプローチは、Ｇｉ結合受容体に対抗する候補化合物の同定において好ましく使用される。Ｇｉ共役ＧＰＣＲについては、このアプローチが使用される場合、標的ＧＰＣＲの逆アゴニストがｃＡＭＰシグナルを増加し、アゴニストがｃＡＭＰシグナルを減少することが注目される。
１日目に、１０ｃｍディッシュあたり４×１０６個の２９３細胞をプレートする。２日目に、２つの反応チューブを調製する（各チューブについての以下の割合はプレートあたりである）：チューブＡは、０．５ｍＬ無血清ＤＭＥＭ（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）中で、全体で４μｇＤＮＡ（例えば、ｐＣＭＶベクター；変異誘発ＴＨＳＲ（ＴＳＨＲ−Ａ６２３Ｉ）を有するｐＣＭＶベクター；ＴＳＨＲ−Ａ６２３Ｉおよび標的ＧＰＣＲなど）のために、トランスフェクトされた各受容体の２μｇＤＮＡを哺乳動物細胞に混合することによって調製し；チューブＢは、０．５ｍＬ無血清ＤＭＥＭ中で、２４μＬリポフェクタミン（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）を混合することによって調製する。次いで、チューブＡおよびＢは、逆さまにすること（数回）によって混合し、続いて、室温で３０〜４５分間のインキュベーションを行う。この混合物は、「トランスフェクション混合物」と称する。プレートした２９３細胞は、１×ＰＢＳで洗浄し、続いて５ｍＬ無血清ＤＭＥの添加を行う。次いで、１．０ｍＬのトランスフェクション混合物を細胞に加え、続いて、３７℃／５％ＣＯ２で４時間のインキュベーションを行う。次いで、トランスフェクション混合物は、吸引によって取り出し、続いて、１０ｍＬのＤＭＥＭ／１０％ウシ胎仔血清の添加を行う。次いで、細胞は３７℃／５％ＣＯ２でインキュベートする。約２８〜４８時間のインキュベーション後、次いで、細胞を収集し、分析のために利用する。
Ｆｌａｓｈ Ｐｌａｔｅ（商標）アデニリルシクラーゼキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ；カタログ番号ＳＭＰ００４Ａ）は、細胞ベースのアッセイのために設計されているが、当業者の必要性に依存して、粗原形質膜を用いる使用のために改変することができる。Ｆｌａｓｈ Ｐｌａｔｅウェルは、シンチラントコーティングを含み、これはまた、ｃＡＭＰを認識する特異的抗体を含む。ウェル中で生成したｃＡＭＰは、ｃＡＭＰ抗体への放射性ｃＡＭＰトレーサーの結合についての直接的競合によって定量することができる。以下は、受容体を発現する全細胞中でのｃＡＭＰレベルの変化の測定のための短いプロトコールとして役立つ。
トランスフェクトされた細胞は、一過性トランスフェクションの約２４時間から４８時間後に収集する。培地を注意深く吸引して除き、廃棄する。１０ｍＬのＰＢＳを、細胞の各ディッシュに穏やかに加え、その後注意深く吸引する。１ｍＬのＳｉｇｍａ細胞脱離緩衝液および３ｍＬのＰＢＳを各プレートに加える。細胞をピペットを用いてプレートから取り出し、細胞懸濁液を、５０ｍＬコニカル遠心分離チューブに収集する。次いで、細胞を、室温にて１，１００ｒｐｍで５分間遠心分離する。細胞ペレットを、適切な量（約３ｍＬ／プレート）のＰＢＳに注意深く再懸濁する。次いで、血球計を使用して細胞を計数し、さらなるＰＢＳを加えて、適切な数の細胞を得る（約５０μＬ／ウェルの最終量）。
ｃＡＭＰ標準および検出緩衝液（１１ｍＬ検出緩衝液に対して１μＣｉのトレーサー［１２５Ｉ］ｃＡＭＰ（５０μＬ）を含む）を調製し、製造業者の指示書に従って維持する。アッセイ緩衝液をスクリーニングのために新鮮に調製し、これは５０μＬの刺激緩衝液、３μＬの試験化合物（１２μＭ最終アッセイ濃度）および５０μＬ細胞を含むべきである。アッセイ緩衝液は、利用するまで氷上に保存することができる。アッセイは、適切なウェルへの５０μＬのｃＡＭＰ標準の添加、続いてウェルＨ−１１およびＨ１２への５０μＬのＰＢＳの添加によって開始することができる。５０μＬの刺激緩衝液はすべてのウェルに加える。選択した候補化合物（例えば、ＴＳＨ）は、３μＬの化合物溶液を分散可能であるピンツールを使用して適切なウェルに加え、１２μＭの最終アッセイ濃度の試験化合物および１００μＬの全体のアッセイ容量となる。次いで、細胞をウェルに加え、室温で６０分間インキュベートする。次いで、トレーサーｃＡＭＰを含む１００μＬの検出ミックスをウェルに加える。次いで、プレートは、さらに２時間インキュベートし、続いて、Ｗａｌｌａｃ ＭｉｃｒｏＢｅｔａシンチレーションカウンター中で計数する。次いで、ｃＡＭＰ／ウェルの値は、各アッセイプレート中に含まれる標準ｃＡＭＰ曲線から外挿する。
４．レポーターベースのアッセイ
ａ．ＣＲＥ−Ｌｕｃレポーターアッセイ（Ｇｓ関連受容体）
２９３および２９３Ｔ細胞は、ウェルあたり２×１０４細胞の密度で、９６ウェルプレート上にプレートし、翌日に、リポフェクタミン試薬（ＢＲＬ）を使用して、製造業者の指示書に従ってトランスフェクトした。ＤＮＡ／液体混合物は、以下のようにして各６ウェルトランスフェクションについて調製する：１００μＬのＤＭＥＭ中２６０ｎｇのプラスミドＤＮＡを、１００μＬのＤＭＥＭ中の２μＬの液体と穏やかに混合する（２６０ｎｇのプラスミドＤＮＡは、２００ｎｇの８×ＣＲＥ−Ｌｕｃレポータープラスミド、内因性受容体または非内因性受容体またはｐＣＭＶ単独を含む５０ｎｇのｐＣＭＶ、および１０ｎｇのＧＰＲＳ発現プラスミド（ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中のＧＰＲＳ）からなる）。８×ＣＲＥ−Ｌｕｃレポータープラスミドは、以下のようにして調製した：ベクターＳＲＩＦ−β−ｇａｌは、ｐβｇａｌ−Ｂａｓｉｃベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）中のＢｇｌＶ−ＨｉｎｄＩＩＩ部位においてラットソマトスタチンプロモーター（−７１／＋５１）をクローニングすることによって得た。８コピーのｃＡＭＰ応答エレメントを、アデノウイルス鋳型ＡｄｐＣＦ１２６ＣＣＲＥ８からＰＣＲによって入手し［Ｓｕｚｕｋｉら、Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ（１９９６）７：１８８３−１８９３；この開示はその全体が参照により本明細書に援用される）、Ｋｐｎ−ＢｇｌＶ部位においてＳＲＩＦ−β−ｇａｌベクターにクローニングし、８×ＣＲＥ−β−ｇａｌレポーターベクターを生じた。８×ＣＲＥ−Ｌｕｃレポータープラスミドは、８×ＣＲＥ−β−ｇａｌレポーターベクター中のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ部位においてｐＧＬ３−基本ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）から得られたルシフェラーゼ遺伝子で置き換えることによって生成した。３０分間の室温でのインキュベーション後、ＤＮＡ／脂質混合物は、４００μＬのＤＭＥＭで希釈し、１００μＬの希釈混合物を各ウェルに加える。１０％ ＦＣＳを有する１００μＬのＤＭＥＭを、４時間のインキュベーション後に、細胞培養インキュベーター中で各ウェルに加える。翌日、トランスフェクトされた細胞は、１０％ ＦＣＳを有する２００μＬ／ウェルのＤＭＥＭで交換する。８時間後、ウェルは、ＰＢＳを用いる１回の洗浄後、フェノールレッドを含まない１００μＬ／ウェルのＤＭＥＭに交換する。ルシフェラーゼ活性は、翌日、製造業者の指示書に従って、ＬｕｃＬｉｔｅ（商標）レポーター遺伝子アッセイキット（Ｐａｃｋａｒｄ）を使用して測定し、１４５０ ＭｉｃｒｏＢｅｔａ（商標）シンチレーションおよび発光カウンター（Ｗａｌｌａｃ）上で読み取る。
ｂ．ＡＰ１レポーターアッセイ（Ｇｑ−関連受容体）
Ｇｑ刺激を検出するための方法は、遺伝子のプロモーター中にＡＰ１エレメントを含む遺伝子の活性化を引き起こす、Ｇｑ依存性ホスホリパーゼＣの既知の特性に依存する。Ｐａｔｈｄｅｔｅｃｔ（商標）ＡＰ−１シス−レポーティング系（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カタログ番号２１９０７３）は、リン酸カルシウム沈殿の成分が、４１０ｎｇ ｐＡＰｌ−Ｌｕｃ、８０ｎｇ ｐＣＭＶ−受容体発現プラスミド、および２０ｎｇ ＣＭＶ−ＳＥＡＰ（分泌性アルカリホスファターゼ発現プラスミド；アルカリホスファターゼ活性は、サンプル間のトランスフェクション効率の変動について制御するために、トランスフェクション細胞の培地中で測定する）であったこと以外は、ＣＲＥＢレポーターアッセイに関して、上記に示すプロトコールに従って利用することができる。
ｃ．ＳＲＦ−Ｌｕｃレポーターアッセイ（Ｇｑ−関連受容体）
Ｇｑ刺激を検出するための１つの方法は、遺伝子のプロモーター中に血清応答因子を含む遺伝子の活性化を引き起こす、Ｇｑ依存性ホスホリパーゼＣの既知の特性に依存する。Ｐａｔｈｄｅｔｅｃｔ（商標）ＳＲＦ−Ｌｕｃ−レポーティング系（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）は、例えば、ＣＯＳ７細胞中でのＧｑ共役活性についてアッセイするために利用することができる。細胞は、この系のプラスミド成分、および内因性または非内因性ＧＰＣＲをコードする示された発現プラスミドを用いて、製造業者の指示書に従って、Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ（商標）キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カタログ番号２００２８５）を使用してトランスフェクトする。手短に述べると、４１０ｎｇ ＳＲＦ−Ｌｕｃ、８０ｎｇ ｐＣＭＶ−受容体発現プラスミド、および２０ｎｇ ＣＭＶ−ＳＥＡＰを、製造業者の指示書に従って、リン酸カルシウム沈殿中で合わせる。沈殿物の半分を、９６ウェルプレートの３ウェルに対して均一に分配し、無血清培地中の細胞上に２４時間保持した。最後の５時間に、細胞は、例えば、１μＭ試験化合物とともにインキュベートする。次いで、細胞を溶解し、製造業者の指示書に従って、Ｌｕｃｌｉｔｅ（商標）キット（Ｐａｃｋａｒｄ、カタログ番号６０１６９１１）および「Ｔｒｉｌｕｘ １４５０ Ｍｉｃｒｏｂｅｔａ」液体シンチレーションおよび発光カウンター（Ｗａｌｌａｃ）を使用して、ルシフェラーゼ活性についてアッセイする。データは、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（商標）２．０ａ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．）を使用して分析することができる。
ｄ．細胞内ＩＰ３蓄積アッセイ（Ｇｑ−関連受容体）
１日目に、受容体（内因性または非内因性）を含む細胞を、２４ウェルプレートに、通常は１×１０５細胞／ウェル（この数は最適化することができる）でプレートすることができる。２日目に、細胞は、５０μＬ無血清ＤＭＥＭ／ウェル中の０．２５μｇ ＤＮＡおよび５０μＬ無血清ＤＭＥＭ／ウェル中の２μＬリポフェクタミンを最初に混合することによってトランスフェクトすることができる。溶液を穏やかに混合し、室温で１５〜３０分間インキュベートする。細胞を０．５ｍＬ ＰＢＳで洗浄し、そして４００μＬの無血清培地をトランスフェクション培地と混合し、細胞に加える。次いで、細胞は、３７℃／５％ＣＯ２で３〜４時間インキュベートし、次いで、トランスフェクション培地を除去し、１ｍＬ／ウェルの通常増殖培地で置き換える。３日目に、３Ｈ−ミオ−イノシトールで細胞を標識する。手短に述べると、培地を除去し、細胞を０．５ｍＬ ＰＢＳで洗浄する。次いで、ウェルあたり０．５ｍＬイノシトールなし／血清なし培地（ｉｎｏｓｉｔｏｌ−ｆｒｅｅ／ｓｅｒｕｍ ｆｒｅｅ ｍｅｄｉａ）（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）を、０．２５μＣｉの３Ｈ−ミオ−イノシトール／ウェルで加え、細胞は、３７℃／５％ ＣＯ２にて、１６〜１８時間で一晩インキュベートする。４日目に、細胞は０．５ｍＬ ＰＢＳで洗浄し、イノシトールなし／血清なし培地、１０μＭ パーギリン、１０ｍＭ塩化リチウム、または０．４ｍＬのアッセイ培地および任意に５０μＬの試験化合物を１０μＭの最終濃度まで含む０．４５ｍＬのアッセイ培地を加える。次いで、細胞を３０分間、３７℃でインキュベートする。次いで、細胞を、０．５ｍＬ ＰＢＳで洗浄し、ウェルあたり２００μＬの新鮮な／氷冷停止溶液（１Ｍ ＫＯＨ；１８ｍＭホウ酸Ｎａ；３．８ｍＭ ＥＤＴＡ）を加える。この溶液を、５〜１０分間、または細胞が溶解するまで氷上に保持し、次いで、細胞が２００μＬの新鮮な／氷冷中和溶液（７．５％ ＨＣＬ）によって中和する。次いで、この溶解物を１．５ｍＬエッペンドルフチューブに移し、チューブあたり１ｍＬのクロロホルム／メタノール（１：２）を加える。この溶液を１５秒間ボルテックスし、上相をＢｉｏｒａｄ ＡＧｌ−Ｘ８（商標）陰イオン交換樹脂（１００〜２００メッシュ）に適用する。最初に、樹脂を１：１．２５Ｗ／Ｖの水で洗浄し、０．９ｍＬの上相をカラムにロードする。このカラムを、１０ｍＬの５ｍＭ ミオ−イノシトール、および１０ｍＬの５ｍＭホウ酸Ｎａ／６０ｍＭギ酸Ｎａで洗浄する。イノシトール三リン酸を、２ｍＬの０．１Ｍギ酸／１Ｍギ酸アンモニウムを用いて、１０ｍＬのシンチレーションカクテルを含むシンチレーションバイアルに溶出させる。カラムを１０ｍＬの０．１Ｍギ酸／３Ｍギ酸アンモニウムを用いる洗浄により再生し、ｄｄＨ２Ｏで２回すすぎ、水中にて４℃で保存する。
実施例４
融合タンパク質の調製
ａ．ＧＰＣＲ：Ｇｓ融合構築物
ＧＰＣＲ−Ｇタンパク質融合構築物の設計は、以下のようにして達成することができる：ラットＧタンパク質Ｇｓα（長鎖型；Ｉｔｏｈ，Ｈ．ら、８３ ＰＮＡＳ ３７７６（１９８６））の５’末端と３’末端の両方を、その上にＨｉｎｄＩＩＩ（５’−ＡＡＧＣＴＴ−３’）配列を含むように操作する。正確な配列（隣接するＨｉｎｄＩＩＩを含む）の確認後、全体の配列を、このベクターのＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を使用するサブクローニングによってｐｃＤＮＡ３．１（−）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｖ７９５−２０）にシャトルする。Ｇｓα配列の正確な方向を、ｐｃＤＮＡ３．１（−）へのサブクローニング後に決定する。次いで、ＨｉｎｄＩＩＩ配列においてラットＧｓα遺伝子を含む修飾ｐｃＤＮＡ３．１（−）を確証する；このベクターは、ここで、「汎用」Ｇｓαタンパク質ベクターとして利用可能である。ｐｃＤＮＡ３．１（−）ベクターは、ＨｉｎｄＩＩＩ部位の上流に種々の周知の制限部位を含み、従って、Ｇｓタンパク質の上流に、内因性で構成的に活性なＧＰＣＲのコード配列を挿入する能力を有利に提供する。この同じアプローチは、他の「汎用」Ｇタンパク質ベクターを作製するために利用することができ、そして、当然ながら、当業者に公知である他の市販のまたは私有のベクターが利用可能である−重要な判断基準は、ＧＰＣＲの配列が上流にあり、Ｇタンパク質の配列とインフレームにあることである。
ｂ．Ｇｑ（６アミノ酸欠失）／Ｇｉ融合構築物
Ｇｑ（欠失）／Ｇｉ融合構築物はキメラＧタンパク質であり、それによって、Ｇｑタンパク質αサブユニット（「Ｇαｑ」）の最初の６アミノ酸が欠失し、ＧαｑのＣ末端の最後の５アミノ酸が、Ｇαｉサブユニットの最後のアミノ酸と置き換えられる。Ｇｑ（欠失）Ｇｉ融合構築物は、内因性Ｇｉ結合受容体を、その非内因性Ｇタンパク質、Ｇｑ（Ｇｑ（欠失）／Ｇｉの型である）に結合させ、その結果、二次メッセンジャー、例えば、イノシトール三リン酸またはジアシルグリセロールまたはＣａ２＋が、ｃＡＭＰ産生の代わりに測定できる。
Ｇｑ（欠失）／Ｇｉ融合構築物は以下のようにして設計した：ＴＬＥＳＩＭ（配列番号９）の配列を有する、ＧαｑサブユニットのＮ末端の６アミノ酸（アミノ酸２〜７）を欠失させ、配列ＥＹＮＬＶ（配列番号１０）を有するＣ末端の５アミノ酸を、配列ＤＣＧＬＦ（配列番号１１）を有する、Ｇαｉタンパク質の対応するアミノ酸で置き換えた。この融合構築物は、以下のプライマー：
５’−ｇａｔｃａａｇｃｔｔｃＣＡＴＧＧＣＧＴＧＣＴＧＣＣＴＧＡＧＣＧＡＧＧＡＧ−３’（配列番号１２）および
５’−ｇａｔｃｇｇａｔｃｃＴＴＡＧＡＡＣＡＧＧＣＣＧＣＡＧＴＣＣＴＴＣＡＧＧＴＴＣＡＧＣＴＧＣＡＧＧＡＴＧＧＴＧ−３’（配列番号１３）
ならびに、ヘマグルチニンタグとともにマウスＧαｑ野生型バージョンを含む、鋳型としてのプラスミド６３３１３（ＡＴＣＣ（登録商標）番号６３３１３）を使用するＰＣＲによって得た。小文字のヌクレオチドには、Ｈｉｎｄｌｌｌ／ＢａｍＨＩのクローニング部位およびスペーサーが含まれる。
ＴａｑＰｌｕｓ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を、以下のサイクルによって、ステップ２からステップ４を３５回反復して、増幅のために利用した：９５℃、２分間；９５℃、２０秒間；５６℃、２０秒間；７２℃、２分間；および７２℃、７分間。ＰＣＲ産物は、ｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、ＡＢＩ Ｂｉｇ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒキット（Ｐ．Ｅ．Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して配列決定した。融合構築物の配列を含むＴＯＰＯクローンからの挿入物は、２段階クローニングプロセスにより、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＢａｍＨＩ部位で発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）にシャトルした。Ｇｑ（欠失）／Ｇｉ構築物の核酸配列については配列番号１４を、そのコードされるアミノ酸配列については配列番号１５を参照のこと。
実施例５
［３５Ｓ］ＧＴＰγＳアッセイ
１．膜の調製
ある実施形態において、標的ＧＰＣＲを含み、および、例えば、逆アゴニスト、アゴニスト、またはアンタゴニストとしての候補化合物の同定における使用のための膜は、好ましくは、以下のように調製する。
ａ．方法
「膜かき取り緩衝液（Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｓｃｒａｐｅ Ｂｕｆｆｅｒ）」は、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳおよび１０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４から構成され；「膜洗浄緩衝液」は、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳおよび０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４から構成され；「結合緩衝液」は、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、および１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｐＨ７．４から構成される。
ｂ．手順
すべての材料は、手順の全体を通して氷上に保持する。最初に、培地を、コンフルエントな細胞の単層から吸引し、続いて、１０ｍＬ冷ＰＢＳですすぎ、続いて吸引する。その後、５ｍＬの膜かき取り緩衝液を、細胞をかき取るために加える；これに続き、５０ｍＬ遠心チューブへの細胞抽出物の移動を行う（２０，０００ｒｐｍにて４℃、１７分間、遠心分離する）。その後、上清を吸引し、ペレットを３０ｍＬ膜洗浄緩衝液に再懸濁し、続いて、２０，０００ｒｐｍで１７分間、４℃の遠心分離を行う。次いで、上清を吸引し、ペレットを結合緩衝液に再懸濁する。次いで、これを、Ｂｒｉｎｋｎａｎ Ｐｏｌｙｔｒｏｎ（商標）ホモジナイザーを使用して均質化する（すべての物質が懸濁するまで１５〜２０秒間のバースト）。これを、本明細書では「膜タンパク質」と称する。
２．Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイ
均質化後、膜のタンパク質濃度は、Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイを使用して決定する（タンパク質は、約１．５ｍｇ／ｍＬに希釈し、アリコートとし、そして後での使用のために凍結する（−８０℃）ことができ、凍結する場合、使用のためのプロトコールは以下の通りである：アッセイの日に、凍結した膜タンパク質を室温にて融解し、続いてボルテックスし、次いで、Ｐｏｌｙｔｒｏｎを用いて、約１２×１，０００ｒｐｍで約５〜１０秒間均質化する；複数の試料のためには、ホモジナイザーは、異なる調製物の均質化の間に徹底的に洗浄するべきであることが注意される）。
ａ．材料
結合緩衝液（上記に従う）；Ｂｒａｄｆｏｒｄ色素試薬；Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質標準を、製造業者の指示書に従って利用する（Ｂｉｏｒａｄ、カタログ番号５００−０００６）。
ｂ．手順
２つ組のチューブを調製し、１つは膜を含み、１つは対照「ブランク」としてである。各々が８００μＬ結合緩衝液を含んだ。その後、１０μＬのＢｒａｄｆｏｒｄタンパク質標準（ｌｍｇ／ｍＬ）を各チューブに加え、次いで、１０μＬの膜タンパク質を一方のチューブのみに加える（ブランクには加えない）。その後、２００μＬのＢｒａｄｆｏｒｄ色素試薬を各チューブに加え、続いて、各々のボルテックスを行う。５分後、チューブを再ボルテックスし、その中の物質をキュベットに移す。次いで、このキュベットを、５９５ｎｍの波長にて、ＣＥＣＩＬ ３０４１分光光度計を使用して読み取る。
３．同定アッセイ
ａ．材料
ＧＤＰ緩衝液は、３７．５ｍＬ結合緩衝液および２ｍｇ ＧＤＰ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｇ−７１２７）から構成され、次いて、０．２μＭ ＧＤＰを得るために、結合緩衝液中での一連の希釈を行う（各ウェル中のＧＤＰの最終濃度は０．１μＭ ＧＤＰであった）；候補化合物を含む各ウェルは、１００μＬ ＧＤＰ緩衝液（最終濃度、０．１μＭ ＧＤＰ）、結合緩衝液中の５０μＬ膜タンパク質、および結合緩衝液中の５０μＬ［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ（０．６ｎＭ）（１０ｍＬ結合緩衝液あたり２．５μＬ［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ）からなる２００μＬの最終容量を有する。
ｂ．手順
候補化合物は、好ましくは、９６プレート形式を使用してスクリーニングする（これらは−８０℃で凍結可能である）。膜タンパク質（または対照として、標的ＧＰＣＲを除外している発現ベクターを有する膜）は、懸濁するまで手短に均質化する。次いで、タンパク質濃度を、上記のようなＢｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイを使用して決定する。次いで、膜タンパク質（および対照）を、結合緩衝液中で０．２５ｍｇ／ｍＬまで希釈する（最終アッセイ濃度、１２．５μｇ／ウェル）。その後、１００μＬ ＧＤＰ緩衝液を、Ｗａｌｌａｃ Ｓｃｉｎｔｉｓｔｒｉｐ（商標）（Ｗａｌｌａｃ）の各ウェルに加える。次いで、５μＬピンツールを使用して、５μＬの候補化合物をこのようなウェルに移す（すなわち、２００μＬの全体のアッセイ容量中５μＬは、１：４０比率であり、その結果、候補化合物の最終スクリーニング濃度は１０μＭである）。再度、夾雑を回避するために、各移動工程後、ピンツールは、水（１×）、エタノール（１×）、および水（２×）を含む３つのリザーバー中ですすぐべきであり−過剰の液体は、各すすぎ後にツールから振り落とし、紙およびキムワイプを用いて乾燥させるべきである。その後、５０μＬの膜タンパク質を各ウェルに加え（標的ＧＰＣＲなしの膜を含む対照ウェルもまた利用する）、室温にて５〜１０分間、プレインキュベートする。その後、結合緩衝液中の５０μＬの［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ（０．６ｎＭ）を各ウェルに加え、続いて、室温にて６０分間、シェーカー上でのインキュベーションを行う（再度、この例においては、プレートをホイルで覆った）。次いで、プレートを、２２℃にて、４０００ＲＰＭで１５分間遠心分離することによって、アッセイを停止させる。次いで、プレートを、８チャンネルマニフォールドを用いて吸引し、プレートカバーで密封する。次いで、プレートを、設定「Ｐｒｏｔ．＃３７」を使用して、Ｗａｌｌａｃ １４５０上で読み取る（製造業者の指示書に従う）。
実施例６
サイクリックＡＭＰアッセイ
例えば、逆アゴニスト、アゴニスト、またはアンタゴニストのような候補化合物を同定するための別のアッセイアプローチは、シクラーゼベースのアッセイを利用することによって達成する。候補化合物をそのように同定することに加えて、このアッセイアプローチは、前出の実施例５に示されるような［３５Ｓ］ＧＴＰγＳアプローチからの結果の確認を提供するための独立したアプローチとして利用することができる。
修飾したＦｌａｓｈ Ｐｌａｔｅ（商標）アデニリルシクラーゼキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ；カタログ番号ＳＭＰ００４Ａ）を、以下のプロトコールに従って、標的ＧＰＣＲの調節因子としての候補化合物の同定のために好ましく利用する。
標的ＧＰＣＲでトランスフェクトした細胞は、トランスフェクションの約３日後に収集する。膜は、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４および１０ｍＭ ＭｇＣｌ２を含む緩衝液中での懸濁細胞の均質化によって調製する。均質化は、Ｂｒｉｎｋｍａｎ Ｐｏｌｙｔｒｏｎ（商標）を使用して、約１０秒間、氷上で実施する。得られるホモジネートは、４℃にて、４９，０００×ｇで１５分間遠心分離する。次いで、得られるペレットは、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４および０．１ｍＭ ＥＤＴＡを含む緩衝液中に再懸濁し、１０秒間均質化し、続いて、４℃にて、４９，０００×ｇで１５分間の遠心分離を行う。次いで、得られるペレットを、利用するまで−８０℃で保存する。直接的同定スクリーニングの日に、膜ペレットは、室温でゆっくりと融解し、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４および１０ｍＭ ＭｇＣｌ２を含む緩衝液に再懸濁して、０．６０ｍｇ／ｍＬの最終タンパク質濃度を生じる（再懸濁した膜は、使用するまで氷上に配置する）。
ｃＡＭＰ標準および検出緩衝液（１１ｍＬの検出緩衝液中に２μＣｉのトレーサー｛［１２５Ｉ］ｃＡＭＰ（１００μＬ）を含む）は、製造業者の指示書に従って、調製および維持する。アッセイ緩衝液は、スクリーニングのために新鮮に調製し、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、２０ｍＭホスホクレアチン（Ｓｉｇｍａ）、０．１単位／ｍＬクレアチンホスホキナーゼ（Ｓｉｇｍａ）、５０μＭ ＧＴＰ（Ｓｉｇｍａ）、および０．２ｍＭ ＡＴＰ（Ｓｉｇｍａ）を含み；次いで、アッセイ緩衝液は、利用されるまで氷上で保存する。
候補化合物は、４０μＬ膜タンパク質（３０μｇ／ウェル）および５０μＬのアッセイＢ緩衝液とともに、好ましくは、例えば、９６ウェルプレートウェル（３μＬ／ウェル；１２μＭ最終アッセイ濃度）に加える。次いで、この混合物は、穏やかに振盪しながら、室温で３０分間インキュベートした。
インキュベーション後、１００μＬの検出緩衝液を各ウェルに加え、続いて、２〜２４時間のインキュベーションを行う。次いで、プレートを、「Ｐｒｏｔ．＃３１」を使用して、Ｗａｌｌａｃ ＭｉｃｒｏＢｅｔａ（商標）プレートリーダー中で計数する（製造業者の指示書に従う）。
例として、かつ限定としてではなく、得られた例示的なスクリーニングアッセイプレート（９６ウェル形式）の結果は、図１に提示する。各バーは、各ウェル中で異なる化合物についての結果を表し、「標的ＧＰＣＲ」は、ＧＰＲ１０１とは無関係の、内因性で構成的に活性なＧｓ共役ＧＰＣＲのＧｓα融合タンパク質構築物である。図１に提示した結果は、各プレートの平均結果（ｍ）に基づく標準偏差もまた提供し、そして、一次スクリーニングからの「リード」としての逆アゴニストの選択のための、平均プラス２つの任意の選択は、少なくとも平均プレート応答マイナス２標準偏差でパーセント応答を減少する候補化合物の選択を含む。逆に、一次スクリーニングからの「リード」としてのアゴニストの選択のための任意選択は、少なくとも平均プレート応答プラス２標準偏差でパーセント応答を増加する候補化合物の選択を含む。これらの選択プロセスに基づいて、以下のウェルの候補化合物は、それぞれ、ウェルＡ２およびＧ９において、上記内因性ＧＰＣＲに対する推定の逆アゴニスト（化合物Ａ）およびアゴニスト（化合物Ｂ）として直接的に同定した。図１を参照のこと。明確化のために以下のことに注意のこと：これらの化合物は、このＧＰＣＲの内因性リガンドのいかなる治験もなしで直接的に同定した。受容体機能に基づき、化合物の結合親和性に基づかないアッセイ技術に焦点を当てることによって、この受容体の機能的活性を減少可能な化合物（化合物Ａ）ならびに受容体の機能的活性を増加可能な化合物（化合物Ｂ）を確認することが可能である。
実施例７
細胞内カルシウム濃度の測定のための蛍光イメージングプレートリーダー（ＦＬＩＰＲ）アッセイ
標的受容体（実験用）およびｐｃＭＶ（陰性対照）が安定にトランスフェクトされた、それぞれのクローン性株からの細胞を、翌日のアッセイのために、完全培養培地（１０％ ＦＢＳ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウムを有するＤＭＥＭ）を有するウェルあたり、５．５×１０４細胞で、ポリ−Ｄ−リジンで前処理した９６ウェルプレート（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，＃３５６６４０）に播種する。Ｆｌｕｏ４−ＡＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ，＃Ｆ１４２０２）インキュベーション緩衝液ストックを調製するために、１ｍｇ Ｆｌｕｏ４−ＡＭを、４６７μＬ ＤＭＳＯおよび４６７μＬプルオロニック酸（Ｐｌｕｏｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ，＃Ｐ３０００）に溶解して１ｍＭストック溶液を得、これは、１ヶ月間、−２０℃で保存可能である。Ｆｌｕｏ４−ＡＭは、蛍光カルシウム指標色素である。
候補化合物は、洗浄緩衝液（１×ＨＢＳＳ／２．５ｍＭプロベニシド（Ｐｒｏｂｅｎｉｃｉｄ）／２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４）中で調製する。
アッセイの時点で、培養培地はウェルから除去し、細胞に、１００μＬの４μＭ Ｆｌｕｏ４−ＡＭ／２．５ｍＭプロベニシド（Ｓｉｇｍａ，＃Ｐ８７６１）／２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ／完全培地、ｐＨ７．４をロードする。３７℃／５％ ＣＯ２でのインキュベーションは、６０分間進行することを許容する。
１時間のインキュベーション後、Ｆｌｕｏ４−ＡＭインキュベーション緩衝液を除去し、細胞は１００μＬ洗浄緩衝液で２回洗浄する。各ウェルに、１００μＬ洗浄緩衝液を残す。プレートを、３７℃／５％ ＣＯ２で６０分間、インキュベーターに戻す。
ＦＬＩＰＲ（Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ）は、３０秒で５０μＬ候補化合物を加えるために、および次の１５０秒間の間に候補化合物によって誘発される細胞内カルシウム濃度（「Ｃａ２＋」）の一過性の変化を記録するために、プログラムする。全体の蛍光変化の計数は、ＦＬＩＰＲソフトウェアを使用してアゴニスト活性を決定するために使用する。機器のソフトウェアは、蛍光の読み取りを標準化して、ゼロ点における等価な初期の読み取りを与える。
例示として、かつ限定ではなく、当業者は、既知のアゴニストとの引き続く接触によって誘発される細胞内（「Ｃａ２＋」）の一過性の増加を阻害する候補化合物の能力を評価することによって、候補化合物が受容体の逆アゴニストとしてスクリーニング可能であることを認める。
ある実施形態において、標的受容体を含む細胞は、Ｇα１５、Ｇα１６、またはＧｑ（欠失）／ＧｉキメラＧタンパク質をさらに含む。
前述は、安定にトランスフェクトされた細胞を使用してアゴニスト活性についてのＦＬＩＰＲアッセイを提供するが、当業者は、アンタゴニスト活性を特徴付けするためにアッセイを容易に改変可能である。当業者は、代替的に、一過性にトランスフェクトされた細胞が使用可能であることもまた容易に認識する。
実施例８
ＭＡＰキナーゼアッセイ
ＭＡＰキナーゼ（マイトジェン活性化キナーゼ）が、受容体活性化を評価するためにモニターされてもよい。ＭＡＰキナーゼは、いくつかのアプローチによって検出することができる。１つのアプローチは、非リン酸化（不活性型）またはリン酸化（活性型）のいずれかである、リン酸化状態の評価に基づく。リン酸化タンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでより遅い移動度を有し、それゆえに、ウェスタンブロッティングを使用して、刺激されていないタンパク質と比較することができる。代替として、リン酸化タンパク質に特異的な抗体（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）が利用可能であり、これは、リン酸化キナーゼの増加を検出するために使用することができる。いずれの方法においても、細胞は試験化合物を用いて刺激し、次いで、Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液で抽出する。可溶性画分は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに適用し、タンパク質は、ニトロセルロースまたはイモビリン（Ｉｍｍｏｂｉｌｉｎ）に電気泳動的に転写する。免疫反応性バンドは、標準的なウェスタンブロッティング技術によって検出する。可視シグナルまたは化学発光シグナルはフィルム上に記録し、デンシトメトリーによって定量され得る。
別のアプローチは、リン酸化アッセイを介するＭＡＰキナーゼ活性の評価に基づく。細胞は、試験化合物を用いて刺激し、可溶性抽出物を調製する。この抽出物は、γ−３２Ｐ−ＡＴＰ、ＡＴＰ再生系、およびＭＡＰキナーゼの特異的基質、例えば、インスリンまたはＰＨＡＳ−１によって調節されるリン酸化される熱および酸安定性タンパク質とともに、３０℃で１０分間インキュベートする。反応は、Ｈ３ＰＯ４の添加によって終結させ、サンプルは氷に移す。アリコートを、Ｗｈａｔｍａｎ Ｐ８１クロマトグラフィーペーパーにスポットし、これは、リン酸化タンパク質を保持する。このクロマトグラフィーペーパーを洗浄し、液体シンチレーションカウンターによって３２Ｐを計数する。代替として、細胞抽出物は、γ−３２Ｐ−ＡＴＰ、ＡＴＰ再生系、およびフィルター支持体にストレプトアビジンによって結合されたビオチン化ミエリン塩基性タンパク質とともにインキュベートする。ミエリン塩基性タンパク質は、活性化ＭＡＰキナーゼの基質である。リン酸化反応は、３０℃で１０分間実行する。次いで、リン酸化ミエリン塩基性タンパク質を保持しているフィルターを通して、抽出物を吸引することができる。このフィルターを洗浄し、液体シンチレーションカウンターによって３２Ｐを計数する。
実施例９
メラニン保有細胞技術
メラニン保有細胞は、下等脊椎動物において見出される皮膚細胞である。これらは、メラノソームと呼ばれる、色素を有するオルガネラを含む。メラニン保有細胞は、Ｇタンパク質結合受容体（ＧＰＣＲ）活性化の際に、微小管ネットワークに沿ってこれらのメラノソームを再分配可能である。この色素移動の結果は、細胞の見かけの明化または暗化である。メラニン保有細胞の中では、Ｇｉ結合受容体の活性から生じる細胞内ｃＡＭＰのレベルの減少は、メラノソームが細胞の中心部に移動することを引き起こし、色の劇的な明化を生じる。次いで、ｃＡＭＰレベルが上昇すると、Ｇｓ結合受容体の活性化の後に、メラノソームが再分配され、細胞は再度暗く見える。Ｇｑ結合受容体の活性化から生じるジアシルグリセロールのレベルの増加もまた、この再分配を誘導することができる。加えて、この技術は、特定の受容体型チロシンキナーゼの研究にもまた適している。メラニン保有細胞の応答は、受容体活性化の数分以内に起こり、単純で強固な色の変化を生じる。この応答は、従来的な吸収マイクロプレートリーダーまたは適当なビデオイメージングシステムを使用して、容易に検出することができる。他の皮膚細胞とは異なり、メラニン保有細胞は神経堤に由来し、シグナル伝達タンパク質の完全な相補物を発現するようである。特に、この細胞は極度の広範囲のＧタンパク質を発現し、それゆえに、ほとんどすべてのＧＰＣＲを機能的に発現可能である。
メラニン保有細胞は、天然のリガンドを含む、ＧＰＣＲに対する化合物を同定するために利用することができる。この方法は、特定の刺激に応答する細胞の色素を分散または凝集することが可能である色素細胞株の試験細胞を導入すること、およびＧＣＰＲをコードする外因性クローンを発現させることによって、実施することができる。刺激剤、例えば、メラトニンは、色素配置の初期状態を設定し、ＧＰＣＲの活性化が色素分散を誘導する場合、色素は試験細胞中で凝集する。しかし、色素配置の初期状態を設定するために刺激剤を用いて細胞を刺激するとき、ＧＰＣＲの活性化が色素凝集を誘導する場合、色素は分散する。次いで、試験細胞は、化学化合物と接触され、細胞中の色素配置が、色素配置の初期の状態から変化したか否かを決定する。ＧＰＣＲに結合するリガンドを含むがこれに限定されない候補化合物に起因する色素細胞の分散はペトリディッシュ中で暗く見えるのに対して、色素細胞の凝集は明るく見える。
材料および方法は、米国特許第５，４６２，８５６号および同第６，０５１，３８６号の開示に従うことができる。これらの特許の開示は、その全体が参照により本明細書に援用される。
細胞は、例えば、９６ウェル形式（プレートあたり１種の受容体）でプレートする。トランスフェクションの４８時間後、各プレート上の細胞の半分を、１０ｎＭメラトニンで処理する。メラトニンは、メラニン保有細胞中の内因性Ｇｉ結合受容体を活性化し、これらの色素が凝集することを引き起こす。細胞の残りの半分は、無血清培地０．７×Ｌ−１５（Ｇｉｂｃｏ）に移す。１時間後、無血清培地中の細胞は色素分散状態のままであるが、メラトニン処理細胞は色素凝集状態である。この時点で、細胞を、試験／候補化合物の用量反応で処理する。プレートしたＧＰＣＲは試験／候補化合物に結合し、メラニン保有細胞は、化合物に応答して色の変化を受けることが予想される。受容体がＧｓまたはＧｑのいずれかの結合受容体であるならば、メラトニンが凝集したメラニン保有細胞は色素分散を受ける。対照的に、受容体がＧｉ結合受容体であるならば、色素分散細胞は、用量依存性色素凝集を受けることが予測される。
（実施例１０）
ＧＰＲ１０１調節因子（例えば、アゴニスト）活性についての酵母レポーターアッセイ
酵母細胞系レポーターアッセイは、以前に文献に記載されている（例えば、Ｍｉｒｅｔら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ（２００２）２７７：６８８１−６８８７；Ｃａｍｐｂｅｌｌら、Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ Ｌｅｔｔ（１９９９）９：２４１３−２４１８；Ｋｉｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９０）２５０：１２１−１２３；ＷＯ ９９／１４３４４；ＷＯ ００／１２７０４；および米国特許第６，１００，０４２号を参照のこと）。簡単に言うと、内因性酵母Ｇ−アルファ（ＧＰＡ１）を欠失させ、多数の技術を用いて構築されたＧタンパク質キメラで置換したような酵母細胞を設計作製した。加えて、内因性酵母アルファ−細胞ＧＰＣＲ、Ｓｔｅ３を欠失させて、選択した哺乳動物ＧＰＣＲの相同発現を可能にした。酵母の場合、真核細胞において保存されるフェロモンシグナル伝達経路（例えば、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ経路）の要素は、Ｆｕｓ１の発現を駆動する。Ｆｕｓ１プロモータ（Ｆｕｓ１ｐ）の制御下でβ−ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）を置換することにより、受容体活性化が酵素の読取値をもたらすシステムが開発された。
Ａｇａｔｅｐらによって記載された酢酸リチウム法（Ａｇａｔｅｐら、１９９８，Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｂｙ ｔｈｅ ｌｉｔｈｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ／ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ ｃａｒｒｉｅｒ ＤＮＡ／ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ（ＬｉＡｃ／ｓｓ−ＤＮＡ／ＰＥＧ）ｐｒｏｔｏｃｏｌ．Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｔｉｐｓ Ｏｎｌｉｎｅ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｊｏｕｒｎａｌｓ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ）を適応させることにより、酵母細胞を形質転換させる。簡単に言うと、酵母細胞を酵母トリプトンプレート（ＹＴ）上で一晩増殖させる。担体１本鎖ＤＮＡ（１０μｇ）、それぞれ２μｇの２つのＦｕｓ１ｐ−ＬａｃＺレポータープラスミド（１つはＵＲＡ選択マーカーを有し、１つはＴＲＰ選択マーカーを有する）、酵母発現ベクター（２μｇの複製起点）中の２μｇのＧＰＲ１０１（例えば、ヒト受容体）および酢酸リチウム／ポリエチレングリコール／ＴＥ緩衝液をピペットでエッペンドルフ管に移す。前記受容体を含有する酵母発現プラスミド／受容体なし対照の酵母発現プラスミドは、ＬＥＵマーカーを有する。酵母細胞をこの混合物に接種し、３０℃で６０分間、反応を進行させる。その後、それらの酵母細胞に４２℃で１５分間、熱ショックを与える。その後、それらの細胞を洗浄し、選択プレート上に広げる。前記選択プレートは、ＬＥＵ、ＵＲＡおよびＴＲＰを含まない合成酵母培地（ＳＤ−ＬＵＴ）である。３０℃で２〜３日間、インキュベートした後、選択プレート上で増殖するコロニーをＬａｃＺアッセイで試験する。
β−ガラクトシダーゼについての蛍光酵素アッセイを行うために、本主題ＧＰＲ１０１受容体を有する酵母細胞を液体ＳＤ−ＬＵＴ培地中で一晩、不飽和濃度まで増殖させる（すなわち、細胞は、まだ分裂中であり、静止期に達していない）。それらを新たな培地で最適なアッセイ濃度に希釈し、９０μＬの酵母細胞を９６ウェル黒色ポリスチレンプレート（Ｃｏｓｔａｒ）に添加する。ＤＭＳＯに溶解し、１０％ＤＭＳＯ溶液で１０Ｘ濃度に希釈した試験化合物をそれらのプレートに添加し、プレートを３０℃で４時間置いておく。４時間後、β−ガラクトシダーゼのための基質をそれぞれのウェルに添加する。これらの実験では、フルオレセイン ジ（β−Ｄ−ガラクトピラノシド）（ＦＤＧ；蛍光読取りを可能にする、フルオレセインを放出する酵素のための基質）を使用する。ウェル当たり２０μＬの５００μＭ ＦＤＧ／２．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００を添加する（前記界面活性剤は、細胞を透過性にするために必要である）。細胞をその基質と共に６０分間インキュベートした後、ウェル当たり２０μＬの１Ｍ 炭酸ナトリウムを添加して反応を停止させ、蛍光シグナルを強化する。その後、それらのプレートを蛍光計において４８５／５３５ｎｍで読み取る。
空ベクターで形質転換された酵母細胞におけるものに対する、および１％ ＤＭＳＯが存在する状態で化合物を用いずに得られたシグナルに対する、ＧＰＲ１０１形質転換酵母細胞における蛍光シグナルの増加は、試験化合物が、ＧＰＲ１０１受容体の機能性を刺激する化合物、例えば、該受容体のアゴニストまたは部分アゴニストであることの指標となる。
空ベクターで形質転換された酵母細胞におけるものに対する、および１％ ＤＭＳＯが存在する状態で化合物を用いずに得られたシグナルに対する、ＧＰＲ１０１形質転換酵母細胞における蛍光シグナルの減少は、試験化合物が、ＧＰＲ１０１受容体の機能性を阻害する化合物、例えば、該受容体の逆アゴニストまたはアンタゴニストであることの指標となる。
（実施例１１）
受容体結合アッセイ
試験化合物を、本発明のＧタンパク質結合受容体のリガンドであることが分かっている化合物と該受容体との複合体の形成を減少させるその能力について評価することができる。一定の実施形態において、前記既知リガンドを放射性標識する。その放射性標識された既知リガンドを、化合物を同定／評価するためのスクリーニングアッセイにおいて使用することができる。一般的に言うと、新たに合成または同定する化合物（すなわち、試験化合物）を、前記放射性標識既知リガンドと前記受容体との複合体の形成を減少させるその能力により、前記受容体への前記放射性標識既知リガンドの結合を減少させるその能力について評価することができる。
他の態様では、試験化合物を放射性標識し、本発明の主題ＧＰＣＲのリガンドであることを、本主題ＧＰＣＲを含む細胞にまたは本主題ＧＰＣＲを含む膜に結合するその能力を評価することによって証明することができる。
試験化合物が不在の状態での放射性標識既知リガンドの特異的結合レベルより低い、試験化合物が存在する状態での放射性標識既知リガンドの特異的結合レベルは、前記放射性標識既知リガンドと前記受容体とで形成される複合体が、試験化合物が不在の状態でより試験化合物が存在する状態でのほうが少ないことの指標となる。
本発明のＧタンパク質結合受容体のリガンドであることが分かっている化合物と該受容体との複合体を検出するためのアッセイプロトコル
Ａ．受容体の作製
６０ｕＬのリポフェクタミン（１５ｃｍ皿１枚当たり）を使用して、本発明のＧタンパク質結合受容体をコードするポリヌクレオチドを含む１０ｕｇの発現ベクターで２９３細胞を一過的にトランスフェクトする。それらの一過的にトランスフェクトされた細胞をその皿の中で、培地交換して、２４時間増殖させ（集密度７５％）、１０ｍＬ／皿のＨｅｐｅｓ−ＥＤＴＡ緩衝液（２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ＋ １０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）で除去する。その後、それらの細胞をＢｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ遠心機で２０分間、１７，０００ｒｐｍ（ＪＡ−２５．５０ローター）で遠心分離する。その後、そのペレットを、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ＋ １ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４に再懸濁させ、５０ｍＬ Ｄｏｕｎｃｅホモジナイザーで均質化し、再び遠心分離する。上清を除去した後、ペレットを、結合アッセイにおいて使用するまで、−８０℃で保管する。前記アッセイにおいて使用するとき、氷上で２０分間、膜を解凍し、その後、１０ｍＬのインキュベーション緩衝液（２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）を添加する。その後、それらの膜を渦攪拌してその粗膜ペレットを再懸濁させ、Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ ＰＴ−３１００ Ｐｌｙｔｒｏｎホモジナイザーで１５秒間、設定６で均質化する。ＢＲＬ Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイを用いて、膜タンパク質の濃度を決定する。
Ｂ．結合アッセイ
全結合については、５０ｕＬの適切に希釈した膜（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、および１ｍＭ ＥＤＴＡを含有するアッセイ緩衝液で希釈；５〜５０ｕｇのタンパク質）の全量を９６ウェルポリプロピレンマイクロタイタープレートに添加し、その後、１００ｕＬのアッセイ緩衝液および５０ｕＬの放射性標識既知リガンドを添加する。非特異的結合については、１００ｕＬの代わりに５０ｕＬのアッセイ緩衝液を添加し、５０μＬの前記放射性標識既知リガンドを添加する前に、放射性標識されていない追加の５０ｕＬの前記既知リガンド（１０ｕＭ）を添加する。その後、プレートを室温で６０〜１２０分間インキュベートする。Ｂｒａｎｄｅｌｌ ９６ウェルプレートハーベスターでＭｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｄｅｖｉｃｅｓ ＧＦ／Ｃ Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒ濾過プレートによりアッセイプレートを濾過することによって結合反応を停止させ、その後、０．９％ ＮａＣｌを含有する冷たい５０ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ、ｐＨ７．４で洗浄する。その後、その濾過プレートの底を封止し、５０ｕＬのＯｐｔｉｐｈａｓｅ Ｓｕｐｅｒｍｉｘをそれぞれのウェルに添加し、プレートの上部を封止し、Ｔｒｉｌｕｘ ＭｉｃｒｏＢｅｔａシンチレーションカウンタでプレートをカウントする。前記放射性標識既知リガンドと前記受容体との複合体が、試験化合物が存在する状態で、より少なく形成されるかどうかを判定するために、１００ｕＬのアッセイ緩衝液を添加する代わりに、１００ｕＬの適切に希釈された前記試験化合物を適するウェルに添加し、その後、５０ｕＬの前記放射性標識既知リガンドを添加する。
（実施例１２）
内因性ＧＰＲ１０１は、細胞内ｃＡＭＰレベルを増加させる構成的活性を阻害する
ヒトＨＥＫ２９３細胞を、ｐＣＭＶベクターで、または内因性ヒトＧＰＲ１０１をコードする一定量のｃＤＮＡプラスミドで、ヒトＨＥＫ２９３細胞を一過的にトランスフェクトした。トランスフェクションは、リポフェクタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して行った。トランスフェクションの４８時間後、Ｐｅｒｋｉｎ ＥｌｍｅｒからのＡｄｅｎｙｌｙｌ Ｃｙｃｌａｓｅ Ｆｌａｓｈｐｌａｔｅ Ａｓｓａｙキット［カタログ＃：ＳＭＰ００４Ｂ］を使用して、下で説明するとおり、全細胞ｃＡＭＰを判定した。
トランスフェクトされた細胞を抗ｃＡＭＰ抗体コーティングウェルに入れた。すべての条件は、三重反復で試験した。１２５Ｉ−ｃＡＭＰを含有するＤｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｍｉｘ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒキットの中に供給されていたもの）をそれぞれのウェルに添加し、そのプレートを１時間、室温でインキュベートさせておいた。その後、それらのウェルを吸引して未結合の１２５Ｉ−ｃＡＭＰを除去した。Ｗａｌｌａｃ Ｍｉｃｒｏｂｅｔａ Ｃｏｕｎｔｅｒを使用して、結合した１２５Ｉ−ｃＡＭＰを検出した。それぞれのサンプル中のｃＡＭＰの量は、そのプレートの幾つかのウェルに既知濃度のｃＡＭＰを配置することによって得た標準曲線との比較によって決定した。結果を図２に提示する。
図２に示すように、内因性ヒトＧＰＲ１０１は、検出可能に構成的活性であり、Ｇに結合するのと一致して、細胞内ｃＡＭＰレベルを増加させる用量依存性構成的活性を示す。
（実施例１３）
ラットにおけるＧＰＲ１０１の発現
Ａ．ラット組織におけるＧＰＲ１０１発現のＲＴ−ＰＣＲ分析
ラット組織におけるＧＰＲ１０１の発現をＲＴ−ＰＣＲによって調査した。様々な組織から単離されたラットＲＮＡをＺｙａｇｅｎ（カリフォルニア州、サンディエゴ）から入手した。ＢｉｏＲａｄからのｉＳｃｒｉｐｔ ｃＤＮＡ合成キットをその製造業者のプロトコルに従って使用して、全ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。以下のプライマーを使用するＲＴ−ＰＣＲを用いて、ＧＰＲ１０１発現を評価した：
５’−ＣＴＴＴＣＴＴＣＴＧＧＣＣＴＣＴＣＡＡＣＡＴＣＣ−３’（配列番号１６；センス）および
５’−ＣＡＧＡＡＧＧＣＡＴＴＡＣＧＧＴＣＡＴＣＡＡＡＡ−３’（配列番号１７；アンチセンス）。
結果を図３Ａに提示する。予想２６５ｂｐ増幅産物の位置を示す。ラットＧＰＲ１０１は、視床下部をはじめとする脳において選択的に発現されることが判明した。
Ｂ．視床下部弓状核をはじめとするラット脳におけるＧＰＲ１０１発現のインサイチュハイブリダイゼーション組織化学分析
ラット脳におけるＧＰＲ１０１の発現を、インサイチュハイブリダイゼーション組織化学によって調査した。インサイチュハイブリダイゼーション組織化学は、下で説明するとおりに行った（例えば、Ｂａｇｎｏｌら，Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ（１９９９）１９：ＲＣ２６（１−７）を参照のこと）。
Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．（マサチューセッツ州、ウィルミントン）から入手した３００ｇから３５０ｇの雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを用いて、インサイチュハイブリダイゼーションを行った。迅速な断頭術によってラットを死亡させた。脳を除去し、イソペンタン（−４０℃）中で凍結させ、−８０℃で保管した。クリオスタットを用いて視床下部およびｐｏｍｓの１０μｍの連続切片を作製し、ポリリシンを下塗りしたスライドに解凍マウントし、加工するまで−８０℃で保管した。
ＲＮａｓｉｎ（４０単位）、ＤＴＴ（２ｍＭ）、ＡＴＰ、ＣＴＰおよびＧＴＰ（０．３３ｍＭ）、［α−３３Ｐ］−ＵＴＰ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、５０μＣｉ、ＮＥＧ３０７ Ｈ００１ＭＣ）ならび適切なポリメラーゼ（Ｔ７、５０単位、またはＴ３、２０単位）を含有する転写緩衝液中で線形化プラスミド（配列番号５を有するラットｃＤＮＡを挿入したプラスミド）をインキュベートすることによるインビトロ転写によって、センスおよびアンチセンス３２Ｐ−放射性標識プローブを生成した。プローブをＤＮアーゼで処理し、エタノール沈殿法によって精製し、２Ｘハイブリダイゼーションミックス（８Ｘ ＳＥＴ、２Ｘ デンハルト溶液、０．４％ ＳＤＳ、２００ｍＭ ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、５００ｕｇ／ｍＬ ｔＲＮＡ、５０ｕｇ／ｍＬ ポリＡ、および５０ｕｇ／ｍＬ ポリＣ）に再懸濁させた。
冷凍庫から組織切片を取り出し、３０分間、放置して空気乾燥させた。その後、切片を、室温で３０分間、リン酸緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．４）中４％のパラホルムアルデヒドで固定し、１Ｘ ＰＢＳで３回すすぎ、０．１Ｍトリエタノールアミン（ＴＥＡ）、ｐＨ８．０中で２時間、アセチル化し、その後、０．２５％無水酢酸を含有する同緩衝液中で短時間、インキュベートした。その後、スライドを１Ｘ ＰＢＳで５分間すすぎ、濃度勾配のあるアルコール系列によって脱水し、空気乾燥させた。放射性標識プローブを２Ｘハイブリダイゼーション緩衝液で希釈して、スライドあたり８×１０６ｃｐｍの近似濃度にした。硫酸デキストラン／ホルムアミド（２０％）を、２Ｘハイブリダイゼーション緩衝液とで１：１の比になるように添加した。希釈されたプローブをスライド上に配置し、カバーガラスをかぶせ、１Ｘ ＰＢＳで加湿したプラスチックトレーの中で、１６〜１８時間、５５℃でインキュベートした。１ｍＭ ＤＴＴ／４Ｘ ＳＳＣ（６００ｍＭ 塩化ナトリウムおよび６０ｍＭ クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．２）でカバーガラスを浮かせて外し、その後、切片を１０分間、４Ｘ ＳＳＣで１回洗浄し、ロッカーを用いて室温で６０分間、リボヌクレアーゼＡ（２００ｕｇ／ｍＬ）中でインキュベートし、その後、２Ｘ、１Ｘおよび０．５Ｘ ＳＳＣでそれぞれ５分間すすいだ。１時間、６５℃で０．１Ｘ ＳＳＣの最終ストリンジェンシーまで切片を洗浄し、その後、０．１Ｘ ＳＳＣで２回洗浄して、それらを室温に冷却した。その後、３００ｍＭ 酢酸アンモニウムを含有する濃度勾配のあるアルコール（７０％および９５％）によってスライドを脱水し、２〜７日間、Ｘ線感受性フィルム（Ｂｉｏ−Ｍａｘ，Ｋｏｄａｋ、ニューヨーク州、ロチェスターのＥａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ Ｃｏ．）に曝露し、写真乳剤（ＩＢ１６５４４３３、Ｋｏｄａｋ）に浸漬し、乾燥させ、発現レベルに依存して２〜４週間、４℃で乾燥剤と共にスライドボックス内に保管した。それらの浸漬スライドを製造業者の推奨基準（Ｋｏｄａｋ Ｄ１９）に従って現像した後、それらの切片を水で広範に洗浄し、チオニンで染色し、アルコールで脱水し、顕微鏡検査用のキシレン系マウント剤で封入した。銀粒子分布により暗視野で放射活性プローブを可視化した。
標識アンチセンスプローブを使用した結果を図３Ｂに示す。ＧＰＲ１０１の発現が、尾状核−被殻（Ｃａｕｄａｔｅ−Ｐｕｔａｍｅｎ：ＣＰ）；線条体底（ＦＳ）；傍線条核（Ｐａｒａｓｔｒｉａｌ ｎｕｃｌｅｕｓ：ＰＳ）；視索上核（ＳＯ）；内側視索前核（ＭＰＯ）；視床下部傍室核（ＰＨＶ）；視交叉後部（ＲＣＨ）；視床下部背内側核（ＤＭＨ）；視床下部弓状核（ＡＲＨ）；視床下部後核（ＰＨ）；扁桃内側核（ＭＥＡ）；および傍小脳脚内側核（ｍｅｄｉａｌ ｐａｒａｂｒａｎｃｈｉａｌ ｎｕｃｌｅｕｓ：ＭＰＢ）において検出された。ハイブリダイゼーションの特異性をセンスプローブを使用する対照実験によって確認し、この条件下では特異的ハイブリダイゼーションシグナルは観察されなかった。
Ｃ．視床下部弓状核をはじめとするラット脳におけるＧＰＲ１０１発現の免疫組織化学分析
ラット、マウスおよびヒトＧＰＲ１０１受容体のカルボキシ末端に特異的なプロテインＡ親和性精製ウサギ抗ペプチドポリクローナル抗体を使用して、免疫組織化学により、ラット脳におけるＧＰＲ１０１の発現を調査した。免疫組織化学は、下で説明するとおりに行った（Ｗｉｌｓｏｎら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ（１９９９）１４０：２３８７−２３９７を参照のこと）。
Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．（マサチューセッツ州、ウィルミントン）から入手した３００ｇから３５０ｇの雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを用いて、免疫組織化学を行った。組織標本作製のために、ラットに麻酔をし、その後、２５０ｍＬ ０．９％ ＮａＣｌおよび２．２％亜硝酸ナトリウムで潅流し、その後、０．１Ｍ リン酸緩衝液中４％のパラホルムアルデヒド（５００ｍＬ）で潅流した。脳を除去し、同固定液中で２時間、４℃でインキュベートし、その後、２０％リン酸緩衝サッカロース溶液で一晩、４℃で凍結保護した。クリオスタットによって作製した視床下部（３０μｍ）の連続切片を、使用するまで、凍結保存溶液（５０ｍＭ カリウムＰＢＳ中、３０％のスクロースおよび３０％のエチレングリコール）中、−２０℃で保管した。
免疫組織化学のために、浮動性切片を５０ｍＭ カリウムＰＢＳ（ＫＰＢＳ）で洗浄し、０．３％過酸化水素と共にインキュベートし（３０分）、５０ｍＭ ＫＢＰＳですすぎ、ブロッキング溶液（カリフォルニア州、バーリンゲームのＶｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と共に１５分間、１：５希釈でインキュベートした。５０ｍＭ ＫＰＢＳ、０．４％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１％ ＢＳＡおよび１％正常ヤギ血清から成る抗体希釈液中で３０分間、２２℃で切片をインキュベートし、その後、ＧＰＲ１０１抗体に移した。４℃で４８時間後、０．０２％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を伴う５０ｍＭのＫＰＢＳで組織を洗浄し、ビオチン化ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）と共に１時間、２２℃でインキュベートし、その後、ホースラディッシュペルオキシダーゼに結合したアビジン−ビオチン複合体と共に１時間、２２℃でインキュベートした。０．１Ｍ酢酸ナトリウムに溶解した、０．０４％ ３，３’−ジアミノベンジジン四塩酸塩、２．５％塩化ニッケルおよび０．０１％ Ｈ２Ｏ２でそのホースラディッシュペルオキシダーゼ反応生成物を可視化した。０．９％ ＮａＣｌで２回続けて洗浄することによって反応を停止させ、その後、浮動性組織をゼラチンコーティングスライドにマウントした。最後に、それらの切片を濃度勾配のあるアルコールおよびキシレンで処理し、その後、Ｐｅｒｍｏｕｎｔを用いてカバーガラスをかぶせた。
結果を図３Ｃに示す。ＧＰＲ１０１の発現が、尾状核−被殻（ＣＰ）；分界条床核（ＢＳＴａｄ）、前部、前外側領域；分界条床核（ＢＳＴｄｍ）、前部、背内側領域；分界条床核（ＢＳＴａｖ）、前部、前腹側領域；前交連（ａｃ）；外側視索前領域（ＬＰＯ）；分界条床核（ＢＳＴ）；内側視索前核（ＭＰＮ）；視交叉上核（ＳＣＨ）；視索上核（ＳＯ）；視交叉後部（ＲＣＨ）；視床下部前核（ＡＨＮ）；視床下部傍室核（ＰＨＶｍｐｄ）、内側小細胞部、腹側ゾーン；視床下部傍室核（ＰＨＶｌｐ）、外側小細胞部；視床下部背内側核（ＤＭＨａ）、前部；視床下部弓状核（ＡＲＨ）；脳弓周囲領域（ＰｅＦ）；外側視床下部領域（ＬＨＡ）；隆起核（ＴＵ）；視床下部後核（ＰＨ）；視床下部後傍室核（ＰＶｐ）；および腹側乳頭前核（ＰＭｖ）において検出された。ブロッキング免疫ペプチドを使用する対照実験によって免疫染色の特異性を確認した。
（実施例１４）
ラット視床下部弓状核におけるＮＰＹ／ＡｇＲＰニューロンに勝るＰＯＭＣニューロンにおけるＧＰＲ１０１の選択的発現
ＧＰＲ１０１のための放射性標識アンチセンスプローブとＰＯＭＣまたはＮＰＹのためのジゴキシゲニン（Ｄｉｇ）標識アンチセンスプローブとを併用して、インサイチュハイブリダイゼーションにより、視床下部弓状核におけるＰＯＭＣニューロンによるおよびＮＰＹ／ＡｇＲＰニューロンによるＧＰＲ１０１の発現を調査した。ラットＧＰＲ１０１プローブは、配列番号５のヌクレオチド配列に対応するものであった。ラットＰＯＭＣプローブは、ラットＰＯＭＣコーディング配列に対応するものであった（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）アクセッション番号ＢＣ０５８４４３を参照のこと）。ラットＮＰＹプローブは、ラットＮＰＹコーティング配列に対応するものであった（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）アクセッション番号ＮＭ＿０１２６１４を参照のこと）。インサイチュハイブリダイゼーションは、本質的には下で説明するとおりに行った（Ｗｉｌｓｏｎら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ（１９９９）１４０：２３８７−２３９７を参照のこと）。
明サイクルの開始の１〜２時間後、迅速な断頭術によってラットを死亡させた。脳を除去し、イソペンテン（−４０℃）中で凍結させ、−８０℃で保管した。視床下部弓状核からの１０μｍ連続切片をクリオスタットで作製し、ポリリシンを下塗りしたスライドに解凍マウントし、加工するまで−８０℃で保管した。
ＲＮａｓｉｎ（４０単位）、ＤＴＴ（２ｍＭ）、ＡＴＰ、ＣＴＰおよびＧＴＰ（０．３３ｍＭ）、［α−３３Ｐ］−ＵＴＰ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、５０μＣｉ、ＮＥＧ３０７ Ｈ００１ＭＣ）ならび適切なポリメラーゼ（Ｔ７、５０単位、またはＴ３、２０単位）を含有する転写緩衝液中で線形化プラスミドをインキュベートすることによるインビトロ転写によって、センスおよびアンチセンス３２Ｐ−放射性標識ＧＰＲ１０１プローブプローブを生成した。プローブをＤＮアーゼで処理し、エタノール沈殿法によって精製し、２Ｘハイブリダイゼーションミックス（８Ｘ ＳＥＴ、２Ｘ デンハルト溶液、０．４％ ＳＤＳ、２００ｍＭ ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、５００ｕｇ／ｍＬ ｔＲＮＡ、５０ｕｇ／ｍＬ ポリＡ、および５０ｕｇ／ｍＬ ポリＣ）に再懸濁させた。ジゴキシゲニン標識プローブは、同様の仕方で生成したが、１４０〜３２０μＭ ジゴキシゲニン−ＵＴＰ（インディアナ州、インディアナポリスのＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を用い；反応物に４００μＭの最終濃度までコンジュゲート化ＵＴＰを補足した。Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−５０カラムを用いてＲＮＡプローブを遊離ヌクレオチドから分離した。ハイブリダイゼーションの特異性は、センスプローブを使用する対照試験によって確認した。センスプローブを使用して特異的ハイブリダイゼーションは観察されなかった。
ハイブリダイゼーション前、切片を１５分間、空気乾燥させ、１時間、２２℃で、ＰＢＳ中４％のパラホルムアルデヒドで固定した。それらの切片を２×ＳＳＣ（３００ｍＭ 塩化ナトリウムおよび３０ｍＭ クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．２）で３回、蒸留水で１回すすぎ（５分／すすぎ）、その後、０．１Ｍ トリエタノールアミン、ｐＨ８．０、および無水酢酸（０．２５％）で１０分間、２２℃で処理した。それらの切片を水ですすぎ、濃度勾配のあるアルコールによって脱水し、放置して空気乾燥させた。
放射性標識およびジゴキシゲニン標識プローブを一緒にハイブリダイゼーション緩衝液（５０％ホルムアミド、１０％硫酸デキストラン、３×ＳＳＣ、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）、１×デンハルト溶液、０．１ｍｇ／ｍＬ 酵母トランスファーＲＮＡ、および１０ｍＭ ジチオトレイトール）で希釈して、２〜２．５×１０６ｃｐｍ／７０μＬの近似濃度にした。非放射活性プローブのための近似希釈度は、予備実験から推定した。希釈したプローブ（７０μＬ）をそれぞれのスライド上に配置し、それらの切片にカバーガラスをかぶせた。５０％ホルムアミド−５０％水で湿らせた濾紙で覆ったプラスチックトレーの中に切片を配置した。トレーを封止し、５５℃で１６時間インキュベートした。カバーガラスを２×ＳＳＣで浮かせて外し、切片を２×ＳＳＣで３回すすぎ、リボヌクレアーゼＡ（２００μｇ／ｍＬ）中で６０分間、３７℃でインキュベートし、その後、２、１、０．５および０．１×ＳＳＣですすいだ。７０℃で６０分間の０．１×ＳＳＣの最終ストリンジェンシーまで切片を洗浄し、その後、放置して室温に冷却した。
ハイブリダイゼーションおよび洗浄後、ジゴキシゲニン標識プローブの検出のために、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含有する０．１Ｍ リン酸緩衝液、ｐＨ７．５でのすすぎ、およびブロッキング溶液（１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび０．５％カゼインを含有する０．１Ｍ リン酸緩衝液、ｐＨ７．５）中、２〜４時間、室温でのインキュベーションによって切片を処理した。ブロッキング溶液で１：３００希釈した、アルカリホスファターゼにコンジュゲートさせたヒツジ抗ジゴキシゲニン抗体（Ｆａｂフラグメント、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）と共に切片を２時間、室温でインキュベートした。その後、切片を０．１Ｍ リン酸緩衝液で３回、Ｔｒｉｓ緩衝食塩水で２回、およびアルカリ基質緩衝液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、および５０ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｐＨ９．５）で１回洗浄し、その後、５％ポリビニルアルコール、０．０２５％レバニソール、０．４５％ ４−ニトロブルーテトラゾリウムクロライド、および０．３５％ ５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−ホスフェート，４−トルイジン塩を含有するアルカリ基質緩衝液中で呈色反応を行った。切片を暗所で１２〜２４時間、室温でインキュベートし、顕微鏡で検査して、反応完了を判定した。その後、スライドを水で広範に洗浄し、０．１Ｍ グリシンおよび０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、ｐＨ２．２中で１０分間、室温でインキュベートして抗体を除去し、その後、水で洗浄した。最後に、切片を１時間、２．５％グルタルアルデヒドで固定し、水で洗浄し、空気乾燥させた。切片を、先ず、１〜７日間、Ｘ線フィルムに曝露し、その後、乳剤（ＫＤ−５、ニュージャージー州、パラマスのＩｌｆｏｒｄ）に浸漬し、光を通さない箱の中で７〜３５日間、４℃で保管した。浸漬したスライドの現像（Ｋｏｄａｋ Ｄ−１９、ニューヨーク州、ロチェスターのＥａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ Ｃｏ．）後、切片を一般にはアルコールで脱水し、顕微鏡写真撮影のためにキシレン系マウント剤（Ｐｅｒｍｏｕｎｔ、ニューヨーク州、フェアローンのＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で封入した。
ビデオカメラ（ＮＴＳＣ ７５０ＣＥ）に接続したＯｌｙｍｐｕｓ ＢＸ５１顕微鏡を使用し、Ｓｔｅｒｅｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒ（登録商標）ｖ６．５５．２ソフトウェア（Ｍｉｃｒｏｂｒｉｇｈｔｆｉｅｌｄ、ＶＴ）を使用して、ＧＰＲ１０１およびＰＯＭＣまたはＮＰＹ ｍＲＮＡのいずれかを含有する細胞の分布の画像を得た。非放射活性リボプローブは、明視野で紫色の沈殿として可視化し、放射活性プローブは、銀粒子分布により暗視野で可視化した。
結果を図４Ａ（ＰＯＭＣについて）および図４Ｂ（ＮＰＹについて）に提示する。視床下部弓状核におけるＰＯＭＣニューロンの極めて大多数がＧＰＲ１０１を発現することが認められた（図４Ａ）のに対し、ＮＰＹニューロンによるＧＰＲ１０１の発現は本質的に検出できなかった（図４Ｂ）。下の表Ｄは、１２０μＭ離れた位置の多数の連続切片について観察された、ＧＰＲ１０１を発現するラット視床下部弓状核の体軸方向伸長でのＰＯＭＣニューロンの百分率を示す。
表Ｄ ラット視床下部弓状核におけるＰＯＭＣニューロンによるＧＰＲ１０１の発現
Figure 2009538623
 （実施例１５）
マウス組織でのマウスにおけるＧＰＲ１０１発現のＴａｑＭａｎ分析
マウス組織におけるＧＰＲ１０１の発現をＴａｑＭａｎ分析によって調査した。様々な組織（Ｃ５７Ｂ１／６Ｊ脳および膵臓を除く）から単離されたマウスＲＮＡをＺｙａｇｅｎ（カリフォルニア州、サンディエゴ）から入手した。定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）分析のために、ＢｉｏＲａｄからのｉＳｃｒｉｐｔ ｃＤＮＡ合成キットをその製造業者のプロトコルに従って使用して、全ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。Ｃ５７Ｂ１／６Ｊ脳および膵臓を研究所内で回収し、Ｔｒｉｚｏｌ標準手順を用いてＲＮＡを抽出した。
ｑＰＣＲ反応は、以下の温度および時間でＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７９００ＨＴマシーンを使用して行った：
５０℃、２分間；９５℃、１０分間；その後、４０サイクルの９５℃、１５秒および６０℃、１分。
マウスＧＰＲ１０１のｑＰＣＲ分析のために使用したプライマーおよびプローブ配列は、以下のとおりであった：
フォワードプライマー − ５’−ＴＣＡＧＧＣＴＡＧＣＡＧＣＧＣＡＡＡＧ−３’（配列番号１８）
リバースプライマー − ５’−ＡＡＴＧＴＴＧＣＡＣＴＧＡＴＴＧＧＣＡＴＣＴ−３’（配列番号１９）
ＴａｑＭａｎ ＭＧＢプローブ−６ＦＡＭ − ５’−ＣＡＧＡＣＡＣＣＧＧＣＣＧＣ−３’（配列番号２０）
結果を図５に提示する。マウスＧＰＲ１０１は、視床下部をはじめとする脳において選択的に発現されることが判明した。
（実施例１６）
ヒト視床下部におけるＧＰＲ１０１の発現の分析
Ａ．ＰＯＭＣおよび副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン（ＣＲＨ）の発現との比較でのヒト視床下部におけるＧＰＲ１０１の発現のインサイチュハイブリダイゼーション組織化学分析
ＧＰＲ１０１発現とＰＯＭＣ発現（ＰＯＭＣニューロン）およびＣＲＨ発現（ＣＲＨニューロン）の間のヒト視床下部内での共局在化を、死後にドナーから得た視床下部組織から作製した連続切片を用いて行ったインサイチュハイブリダイゼーション組織化学分析によって調査した。アンチセンスプローブは、本質的には実施例１３Ｂにおいて説明したとおりに合成した。ヒトＧＰＲ１０１プローブは、配列番号１のヌクレオチド配列に対応するものであった。ヒトＰＯＭＣプローブは、ヒトＰＯＭＣコーディング配列に対応するものであった（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）アクセッション番号ＢＣ０６５８３２を参照のこと）。ヒトＣＲＨプローブは、ヒトＣＲＨコーディング配列に対応するものであった（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）アクセッション番号ＢＣ０１１０３１を参照のこと）。
連続的に切断したヒト視床下部のインサイチュハイブリダイゼーション組織化学分析は、本質的には実施例１３Ｂにおいて説明したとおりに行った。銀粒子分布により暗視野で放射活性プローブを可視化した。
ＢＭＩ２７を有する６５歳の男性から死後に得た視床下部組織についての代表的結果を図６Ａに示す。番号１６０および１７７の連続切片についてはＧＰＲ１０１発現を示す。番号１５３の連続切片についてはＣＲＨ発現を示す。番号１７１の切片についてはＰＯＭＣ発現を示す。図６Ａの点検から、ヒト視床下部におけるＧＰＲ１０１発現は、ＣＲＨ発現とよりＰＯＭＣ発現とのほうが空間的に一致することは明白である。
ＧＰＲ１０１は、ヒト脳における尾状核、被殻、淡蒼球においておよび孤束核においても検出された。
Ｂ．ヒト視床下部弓状核におけるＰＯＭＣニューロンでのＧＰＲ１０１の発現
ＧＰＲ１０１のための放射性標識（３３Ｐ標識）アンチセンスプローブとＰＯＭＣのためのジゴキシゲニン（Ｄｉｇ）標識アンチセンスプローブとを併用して、インサイチュハイブリダイゼーション組織化学分析により、ヒト視床下部弓状核におけるＰＯＭＣニューロンによるＧＰＲ１０１の発現を調査した。この分析は、本質的には実施例１４において説明したとおり、死後のドナーから得たヒト視床下部弓状核から作製した連続切片を用いて行った。ヒトＧＰＲ１０１プローブは、配列番号１のヌクレオチド配列に対応するものであった。ヒトＰＯＭＣプローブは、ヒトＰＯＭＣコーディング配列に対応するものであった（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）アクセッション番号ＢＣ０６５８３２を参照のこと）。
結果を図６Ｂに提示する。ヒト視床下部弓状核内の多くのＰＯＭＣニューロンがＧＰＲ１０１を発現することが判明した。
（実施例１７）
食事誘発肥満およびｄｂ／ｄｂマウスにおけるＧＰＲ１０１の視床下部発現の分析
Ａ．ＴａｑＭａｎ分析
食事誘発肥満マウスおよびｄｂ／ｄｂマウスの視床下部をはじめとする脳領域におけるＧＰＲ１０１の発現をＴａｑＭａｎ分析によって調査した。前記脳領域は、視床下部（Ｈｙｐｏ）、尾状核−被殻（Ｃｐｕ）および皮質であった。すべての組織は、研究所内でＣ５７Ｂ１／６Ｊおよびｄｂ／ｄｂ雄マウス（ｄｂ／ｄｂマウスは、レプチン受容体遺伝子の突然変異から重度過食症および肥満を有する）から回収し、Ｔｒｉｚｏｌ標準手順を用いてＲＮＡを抽出した。食事誘発肥満（ＤＩＯ）には、５９％Ｋｃａｌ／ｇｍの脂肪を含有する高脂肪食（Ｂｉｏ−Ｓｅｒｖｅ Ｓ３２８２）を２５週間にわたって給餌し、これに対して対照（Ｃｏｎｔｒｏｌ）マウスには、固形飼料（Ｔｅｋｌａｂ ８６０４）を給餌した。定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）分析のために、ＢｉｏＲａｄからのｉＳｃｒｉｐｔ ｃＤＮＡ合成キットをその製造業者のプロトコルに従って使用して、全ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。
ｑＰＣＲ反応は、以下の温度および時間でＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７９００ＨＴマシーンを使用して行った：
５０℃、２分；９５℃、１０分；その後、４０サイクルの９５℃、１５秒および６０℃、１分。
マウスＧＰＲ１０１のｑＰＣＲ分析のために使用したプライマーおよびプローブ配列は、以下のとおりであった：
フォワードプライマー − ５’−ＴＣＡＧＧＣＴＡＧＣＡＧＣＧＣＡＡＡＧ−３’（配列番号１８）
リバースプライマー − ５’−ＡＡＴＧＴＴＧＣＡＣＴＧＡＴＴＧＧＣＡＴＣＴ−３’（配列番号１９）
ＴａｑＭａｎ ＭＧＢプローブ−６ＦＡＭ − ５’−ＣＡＧＡＣＡＣＣＧＧＣＣＧＣ−３’（配列番号２０）
ベータ−アクチン（ｂ−アクチン）の発現を内部対照として使用した。
結果を図７Ａに提示する。対照マウスについて観察されたＧＰＲ１０１の視床下部発現は、食事誘発肥満マウスおよびｄｂ／ｄｂマウスにおいて維持された。食事誘発肥満マウスおよびｄｂ／ｄｂマウスは、本発明の化合物、例えばマウスＧＰＲ１０１に対するアゴニストまたは部分アゴニスト活性を有する化合物、での治療的介入についての肥満の動物モデルとしても使用することができる。
Ｂ．インサイチュハイブリダイゼーション組織化学分析
食事誘発肥満マウスおよびｄｂ／ｄｂマウスにおけるＧＰＲ１０１の発現は、視床下部から作製した連続切片を用いて行ったインサイチュハイブリダイゼーション組織化学分析によって調査した。インサイチュハイブリダイゼーション組織化学分析は、本質的には実施例１３Ｂにおいて説明したとおりに行った。配列番号３のヌクレオチド１１９７−１５３６に対応するポリヌクレオチドを使用して、アンチセンスプローブを作製した。
結果を図７Ｂに提示する。対照マウスについて観察されたＧＰＲ１０１の発現は、食事誘発肥満マウスおよびｄｂ／ｄｂマウスにおいて維持された。食事誘発肥満マウスおよびｄｂ／ｄｂマウスは、本発明の化合物、例えばマウスＧＰＲ１０１に対するアゴニストまたは部分アゴニスト活性を有する化合物、での治療的介入についての肥満の動物モデルとしても使用することができる。
（実施例１８）
肥満Ｆａ／Ｆａ ＺｕｃｋｅｒラットにおけるＧＰＲ１０１の視床下部発現の分析
肥満Ｆａ／Ｆａ Ｚｕｃｋｅｒ雄ラットの視床下部をはじめとする脳領域におけるＧＰＲ１０１の発現をＴａｑＭａｎ分析によって調査した。前記脳領域は、視床下部（Ｈｙｐｏ）、尾状核−被殻（Ｃｐｕ）および皮質であった。すべての組織は、研究所内でＳｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）、痩せたｆａ／Ｆａ Ｚｕｃｌｅｒ、および肥満Ｆａ／Ｆａ Ｚｕｃｋｅｒ雄ラットから回収し、Ｔｒｉｚｏｌ標準手順を用いてＲＮＡを抽出した。定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）分析のために、ＢｉｏＲａｄからのｉＳｃｒｉｐｔ ｃＤＮＡ合成キットをその製造業者のプロトコルに従って使用して、全ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。
ｑＰＣＲ反応は、以下の温度および時間でＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７９００ＨＴマシーンを使用して行った：
５０℃、２分；９５℃、１０分；その後、４０サイクルの９５℃、１５秒および６０℃、１分。
ラットＧＰＲ１０１のｑＰＣＲ分析のために使用したプライマーおよびプローブ配列は、以下のとおりであった：
フォワードプライマー − ５’−ＧＧＧＣＴＧＧＡＡＣＴＧＡＧＣＡＣＴＧＡ−３’（配列番号２１）
リバースプライマー − ５’− ＣＧ ＧＴＣＣＧＴＧＴＴＴＧＣＣＴＴＴ−３’（配列番号２２）
ＴａｑＭａｎ ＭＧＢプローブ−６ＦＡＭ − ５’−ＴＣＣＡＧＧＣＴＡＧＣＡＧＣＧ−３’（配列番号２３）
ベータ−アクチン（ｂ−アクチン）の発現を内部対照として使用した。
結果を図８に提示する。対照マウスについて観察されたＧＰＲ１０１の視床下部発現は、肥満Ｆａ／Ｆａ Ｚｕｃｋｅｒラットにおいて維持された。肥満Ｆａ／Ｆａ Ｚｕｃｋｅｒラットは、本発明の化合物、例えばラットＧＰＲ１０１に対するアゴニストまたは部分アゴニスト活性を有する化合物、での治療的介入についての肥満の動物モデルとしても使用することができる。
（実施例１９）
ＧＰＲ１０１アゴニストによる視床下部α−ＭＳＨ分泌のエクスビボ刺激
インビトロ視床下部スライスアッセイ（例えば、Ｆｏｎｇら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｌｅｔｔ（２０００）２８３：５−８およびＡｂｂｏｔｔら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ（２００３）１４４：３９４３−３９４９を参照のこと）を用いて、本発明の化合物、例えば、ラットＧＰＲ１０１に対するアゴニスト活性を有する化合物がα−ＭＳＨなどのＰＯＭＣ由来生物活性ペプチドの視床下部分泌を刺激することを証明することができる。
ラットを迅速な断頭術によって死亡させ、脳を除去する。Ｖｉｂｒａｔｏｍｅと氷冷低カルシウム培地（次の成分から成る：１０ｍＭ Ｄ−グルコース、２６ｍＭ ＮａＨＣＯ３、１１４ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、１．２ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、９．１ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．２ｍＭ ＣａＣｌ２；ｐＨ７．４）を使用して、全ラット視床下部からスライス（４００μｍ厚）を作製する。それらのスライスをその低カルシウム培地中で放置して室温にする。その後、それらのスライスを人工脳脊髄液（ａＣＳＦ；１０ｍＭ Ｄ−グルコース、２６ｍＭ ＮａＨＣＯ３、１１４ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、１．２ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１．３ｍＭ ＭｇＳＯ４、２．４ｍＭ ＣａＣｌ２；ｐＨ７．４）に移し、１時間、３７℃で放置して平衡させる。その後、それらのスライスを、本発明の化合物（例えばラットＧＰＲ１０１に対するアゴニスト活性を有する化合物）が存在する状態または不在の状態（ビヒクルのみ）で１時間、３７℃でインキュベートする。前記化合物の好ましい濃度は、０．００１〜１００μＭである。他の好ましい濃度は、１ｎＭ、１０ｎＭ、１００ｎＭ、１μＭ、１０μＭ、２５μＭ、５０μＭおよび１００μＭからなる群より選択される。その１時間のインキュベーションの後、上清を回収し、凍結させる。
その後、それらの上清サンプルをＣ１８カラムに通し、凍結乾燥させる。Ｐｈｏｅｎｉｘ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓから入手したＥＬＩＳＡキットを使用して、α−ＭＳＨ分泌（その上清に放出されたα−ＭＳＨの量）を測定する。その上清へのα−ＭＳＨの放出を、視床下部スライスアッセイにおいて５６ｎＭ ＫＣｌの作用によって惹起される最大放出に対する百分率として表す。
（実施例２０）
マウスにおいて高脂肪食によって誘発される脂肪蓄積増加に対するＧＰＲ１０１アゴニストのインビボ効果
ＧＰＲ１０１受容体のアゴニストは、高脂肪食によって誘発される脂肪蓄積増加からの防御をもたらすことを証明することができる。年齢および性別を合わせた週齢５〜３０週の野生型Ｃ５７Ｂ１／６Ｊマウスの２つの群を個別に収容し、水および食餌を自由に入手できるようにする。それらのマウスを人工的明（１２時間）／暗（１２時間）サイクルで維持し、一定の湿度（７０％）および温度（２２℃）条件下で飼育する。４〜１５週間にわたってマウスが高脂肪食（例えば、Ｄ１２２６６Ｂ、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｅｔ、３１．８％脂肪／Ｋｃａｌ；またはＢｉｏ−Ｓｅｒｖｅ Ｓ３２８２、５９％Ｋｃａｌ／ｇｍの脂肪）を自由に入手できるようにする。この４〜１５週間の過程を通して、マウスＧＰＲ１０１受容体に対するアゴニスト活性を有するＧＰＲ１０１受容体のアゴニストまたはビヒクルのみを毎日、尾静脈に注射する。ＧＰＲ１０１アゴニストの好ましい用量は、０．１〜１００ｍｇ／ｋｇである。他の好ましい用量は、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、３．０ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇおよび１００ｍｇ／ｋｇからなる群より選択される。
その４〜１５週間の終了時、マウスをＣＯ２吸入によって安楽死させ、精巣上体および鼠径部の脂肪パッドを回収し、脂肪蓄積の尺度として計量する。これらの結果は、前記ＧＰＲ１０１アゴニストが、高脂肪食によって誘導される脂肪蓄積増加（精巣上体および鼠径部の脂肪パッドの重量増加）からの防御をもたらす（すなわち、減少させる）ことの証拠となり得る。
前記ＧＰＲ１０１アゴニストは、選択的ＧＰＲ１０１アゴニストであり得ると明白に考えられる。３１．８％より少ないまたは多い脂肪／Ｋｃａｌを有する高脂肪食を使用することもできると明白に考えられる。前記アゴニストの投与は静脈投与以外である場合もある、例えば、前記アゴニストの投与は腹腔内または経口投与である場合もあると明白に考えられる。週齢５週より若いまたは週齢３０週より高齢のマウスを使用することもできると明白に考えられる。注射の期間は、４週より短い場合もあり、または１５週より長い場合もあると明白に考えられる。マウス以外の非ヒト哺乳動物、例えばラット、を使用することもできると明白に考えられる。
固形飼料食（例えば、Ｔｅｋｌａｂ ８６０４）を給餌した肥満ｄｂ／ｄｂマウスにおいておよび肥満Ｆａ／Ｆａ ＺｕｃｋｅｒラットにおいてＧＰＲ１０１アゴニストが脂肪蓄積を減少させることを証明できることも明白に考えられる。
（実施例２１）
マウスにおいて高脂肪食によって誘発される体脂肪率増加に対するＧＰＲ１０１アゴニストのインビボ効果
ＧＰＲ１０１受容体のアゴニストは、高脂肪食によって誘発される体脂肪率増加からの防御をもたらすことを証明することができる。年齢および性別を合わせた週齢５〜３０週の野生型Ｃ５７Ｂ１／６Ｊマウスの２つの群を個別に収容し、水および食餌を自由に入手できるようにする。それらのマウスを人工的明（１２時間）／暗（１２時間）サイクルで維持し、一定の湿度（７０％）および温度（２２℃）条件下で飼育する。４〜１５週間にわたってマウスが高脂肪食（例えば、Ｄ１２２６６Ｂ、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｅｔ、３１．８％脂肪／Ｋｃａｌ；またはＢｉｏ−Ｓｅｒｖｅ Ｓ３２８２、５９％Ｋｃａｌ／ｇｍの脂肪）を自由に入手できるようにする。この４〜１５週間の過程を通して、マウスＧＰＲ１０１受容体に対するアゴニスト活性を有するＧＰＲ１０１受容体のアゴニストまたはビヒクルのみを毎日、尾静脈に注射する。ＧＰＲ１０１アゴニストの好ましい用量は、０．１〜１００ｍｇ／ｋｇである。他の好ましい用量は、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、３．０ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇおよび１００ｍｇ／ｋｇからなる群より選択される。
その４〜１５週間の終了時、マウスをＣＯ２吸入によって安楽死させ、二重エネルギーＸ線吸収測定法（ＤＥＸＡ）（Ｌｕｎａｒ ＰＩＸＩｍｕｓ、ウィスコンシン州、マディソンのＬｕｎａｒ ＰＩＸＩｍｕｓ Ｃｏｒｐ．）を使用する密度計測によって体組成を判定することにより体脂肪率を評価する。Ｌｕｎａｒ ＰＩＸＩｍｕｓ ２．２．０ソフトウェアをその製造業者の説示に従って使用して、データを分析する。これらの結果は、前記ＧＰＲ１０１アゴニストが、高脂肪食によって誘導される体脂肪率増加からの防御をもたらす（すなわち、減少させる）ことの証拠となり得る。
前記ＧＰＲ１０１アゴニストは、選択的ＧＰＲ１０１アゴニストであり得ると明白に考えられる。３１．８％より少ないまたは多い脂肪／Ｋｃａｌを有する高脂肪食を使用することもできると明白に考えられる。前記アゴニストの投与は静脈投与以外である場合もある、例えば、前記アゴニストの投与は腹腔内または経口投与である場合もあると明白に考えられる。週齢５週より若いまたは週齢３０週より高齢のマウスを使用することもできると明白に考えられる。注射の期間は、４週より短い場合もあり、または１５週より長い場合もあると明白に考えられる。マウス以外の非ヒト哺乳動物、例えばラット、を使用することもできると明白に考えられる。
固形飼料食（例えば、Ｔｅｋｌａｂ ８６０４）を給餌した肥満ｄｂ／ｄｂマウスにおいておよび肥満Ｆａ／Ｆａ ＺｕｃｋｅｒラットにおいてＧＰＲ１０１アゴニストが体脂肪率を減少させることを証明できることも明白に考えられる。
（実施例２２）
マウスにおいて高脂肪食によって誘発される体重増加に対するＧＰＲ１０１アゴニストのインビボ効果
ＧＰＲ１０１受容体のアゴニストは、高脂肪食によって誘発される体重増加からの防御をもたらすことを証明することができる。年齢および性別を合わせた週齢５〜３０週の野生型Ｃ５７Ｂ１／６Ｊマウスの２つの群を個別に収容し、水および食餌を自由に入手できるようにする。それらのマウスを人工的明（１２時間）／暗（１２時間）サイクルで維持し、一定の湿度（７０％）および温度（２２℃）条件下で飼育する。４〜１５週間にわたってマウスが高脂肪食（例えば、Ｄ１２２６６Ｂ、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｅｔ、３１．８％脂肪／Ｋｃａｌ；またはＢｉｏ−Ｓｅｒｖｅ Ｓ３２８２、５９％Ｋｃａｌ／ｇｍの脂肪）を自由に入手できるようにする。この４〜１５週間の過程を通して、マウスＧＰＲ１０１受容体に対するアゴニスト活性を有するＧＰＲ１０１受容体のアゴニストまたはビヒクルのみを毎日、尾静脈に注射する。ＧＰＲ１０１アゴニストの好ましい用量は、０．１〜１００ｍｇ／ｋｇである。他の好ましい用量は、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、３．０ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇおよび１００ｍｇ／ｋｇからなる群より選択される。
その４〜１５週間の過程を通して週に１度、マウスを計量する。これらの結果は、前記ＧＰＲ１０１アゴニストが、高脂肪食によって誘導される体重増加からの防御をもたらす（すなわち、減少させる）ことの証拠となり得る。
前記ＧＰＲ１０１アゴニストは、選択的ＧＰＲ１０１アゴニストであり得ると明白に考えられる。３１．８％より少ないまたは多い脂肪／Ｋｃａｌを有する高脂肪食を使用することもできると明白に考えられる。前記アゴニストの投与は静脈投与以外である場合もある、例えば、前記アゴニストの投与は腹腔内または経口投与である場合もあると明白に考えられる。週齢５週より若いまたは週齢３０週より高齢のマウスを使用することもできると明白に考えられる。注射の期間は、４週より短い場合もあり、または１５週より長い場合もあると明白に考えられる。マウス以外の非ヒト哺乳動物、例えばラット、を使用することもできると明白に考えられる。
固形飼料食（例えば、Ｔｅｋｌａｂ ８６０４）を給餌した肥満ｄｂ／ｄｂマウスにおいておよび肥満Ｆａ／Ｆａ ＺｕｃｋｅｒラットにおいてＧＰＲ１０１アゴニストが体重を減少させることを証明できることも明白に考えられる。水を自由に入手できるようにし、ペレット状固形飼料（例えば、Ｓａｓａｋｉら、Ｊ Ｖｅｔ Ｍｅｄ Ｓｃｉ（１９９８）６０：４６５−４６９を参照のこと）を給餌したイヌにおいてＧＰＲ１０１アゴニストが体重増加を減少させることを証明できることも明白に考えられる。
（実施例２３）
ラットにおける食餌摂取量に対するＧＰＲ１０１アゴニストのインビボ効果
ＧＰＲ１０１受容体のアゴニストが絶食ラットにおける食餌摂取量を抑制することを証明することができる。雄（体重２５０〜２７５ｇ）Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｙ（ＳＤ）ラットをＨａｒｌａｎ（カリフォルニア州、サンディエゴ）から購入し、温度制御された環境で、１７時間／７時間の明／暗サイクル（午前１０：００に消灯）で、ケージ当たり４匹収容する。２週間の間、水および固形飼料（ＬａｂＤｉｅｔ ８６０４）を無制限に入手できる。この期間に、２つの機会に動物を慣らした。試験の朝、動物を食事および敷きわらなしで個々に収容し、消灯の３０分前に尾静脈への注射によって化合物またはビヒクルを投与する。消灯時、予め計量した量の固形飼料を動物に与え、餌入れの近くに動物を配置する。２時間後、残りの固形飼料を計量し、試験を終了する。
ＧＰＲ１０１アゴニストの好ましい用量は、０．１〜１００ｍｇ／ｋｇである。他の好ましい用量は、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、３．０ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇおよび１００ｍｇ／ｋｇからなる群より選択される。前記ＧＰＲ１０１アゴニストは、選択的ＧＰＲ１０１アゴニストであり得ると明白に考えられる。前記アゴニストの投与は静脈投与以外である場合もある、例えば、前記アゴニストの投与は腹腔内または経口投与である場合もあると明白に考えられる。ラット以外の非ヒト哺乳動物、例えばマウスまたは非ヒト霊長類、を使用することもできると明白に考えられる。
絶食させた肥満ｄｂ／ｄｂマウスにおいておよび肥満Ｆａ／Ｆａ ＺｕｃｋｅｒラットにおいてＧＰＲ１０１アゴニストが食餌摂取量を減少させることを証明できることも明白に考えられる。
（実施例２４）
ウサギにおける発熱に対するＧＰＲ１０１アゴニストのインビボ効果
本発明の化合物、例えば、ＧＰＲ１０１に対するアゴニスト活性を有する化合物は、ここで説明する発熱のウサギモデル（例えば、Ｍｕｒｐｈｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８３）２２１：１９２−１９３を参照のこと）を使用して熱を下げること（すなわち、解熱活性を有すること、発熱の治療に有効であること）を証明することができる。成体ニュージーランド・ホワイトラビットの側脳室にカニューレを内植し、２３℃の人工気候室内に従来のストックで拘束する。サーミスタプローブ（Ｙｅｌｌｏｗ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｎｏ．７０１）を直腸の中に１０ｃｍ挿入し、適所でテーピングする。Ｄａｔａｌｏｇｇｅｒデジタル温度記録計（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）に接続されたＭＩＮＣ １１コンピュータを用いて１０分間隔で自動的に温度測定を行う。１時間ベースライン温度を決定した後、白血球性発熱物質を静脈内注射する。例えばＧＰＲ１０１に対するアゴニスト活性を有する化合物の、解熱効果の試験は、同じ動物に対して２回の別個の実験で行い、それぞれの実験前にそれぞれの動物について白血球性発熱物質に対する対照（ビヒクルのみ）応答を判定する。その化合物のそれぞれの用量を、発熱物質の試験注射の３０分後に脳室内注射し、その後４時間にわたって１０分間隔で温度を測定する。発熱物質のすべての注射は、耐性の発現を最小にするために少なくとも４８時間離す。
前記ＧＰＲ１０１アゴニストの好ましい用量は、０．１〜１００ｍｇ／ｋｇである。他の好ましい用量は、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、３．０ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇおよび１００ｍｇ／ｋｇからなる群より選択される。前記ＧＰＲ１０１アゴニストは、選択的ＧＰＲ１０１アゴニストであり得ると明白に考えられる。前記化合物の投与は脳室内投与以外である場合もある、例えば、前記化合物の投与は静脈内、腹腔内または経口投与である場合もあると明白に考えられる。
ウサギ以外の非ヒト哺乳動物、例えばマウス、ラットまたは非ヒト霊長類、を使用することもできると明白に考えられる。例示的ラットモデルは、Ｑｉｎ−Ｈｅｎｇら、Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ（１９９８）２７５（Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ Ｃｏｍｐ Ｐｈｙｓｉｏｌ ４４：）Ｒ５２４−Ｒ５３０において見出すことができる。
（実施例２５）
マウスにおけるアテローム発生に対するＧＰＲ１０１アゴニストのインビボ効果
雄アポＥ−／−マウス（メイン州、バーハーバーのＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）に正常固体飼料を給餌する。アポリポタンパクＥ欠損（アポＥ−／−）マウスは、固形飼料食を用いて広範なアテローム硬化性病変を発現する、アテローム性硬化症の確立された動物モデルである（Ｚｈａｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９２）２５８：４６８−４７１）。週齢１２週の時点で、マウスＧＰＲ１０１に対するアゴニスト活性を有するＧＰＲ１０１のアゴニストまたはビヒクルのみを尾静脈に毎日注射する。前記ＧＰＲ１０１アゴニストの好ましい用量は、０．１〜１００ｍｇ／ｋｇである。他の好ましい用量は、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、３．０ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇおよび１００ｍｇ／ｋｇからなる群より選択される。
そのＧＰＲ１０１アゴニスト注射の１４日後、ペントバルビタール（５０ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射でマウスを麻酔し、大動脈洞および大動脈弓を含む心臓を回収する。実験開始時に注射をしていないマウスからも心臓を回収する。３つの実験群のそれぞれに１０匹のマウスを使用する。
１０％ホルマリンで一晩固定した後、最適切断温度（Ｏｐｔｉｍａｌ Ｃｕｔｔｉｎｇ Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ：ＯＣＴ；Ｓａｋｕｒａ Ｆｉｎｅｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｃｏ．， Ｌｔｄ）コンパウンド包埋された大動脈洞の凍結断面（１０μｍ厚）をスライドにマウントする。プラークサイズの分析のために、それぞれのマウスからの（１００μｍ離れた）３つの断片をＯｉｌ Ｒｅｄ Ｏで染色した。病変サイズおよび病変内の脂質滴の直径を画像分析用コンピュータソフトウェアで定量し、平均値を決定する。ＧＰＲ１０１アゴニストを注射した群についての平均値を、ビヒクルのみを注射したグループの平均値と比較する。
データを平均±ＳＥＭとして提示し、ならびにそれらの分布パターンに依存してスチューデントｔ検定またはマン−ホイットニーＵ検定によって分析する。ｐ＜０．０５の値を統計的に有意とみなす。例えば、Ｏｋａｍｏｔｏら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ（２００２）１０６：２７６７−２７７０を参照のこと）。
これらの結果は、前記ＧＰＲ１０１アゴニストがアテローム発生の阻害剤であることの証拠となり得る。
他の実施形態では、非観血的インビボ技術（例えば、Ｆａｙａｄら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ（１９９８）９８：１５４１−１５４７を参照のこと）を用いて、ＧＰＲ１０１アゴニストがアポＥ−／−マウスにおけるアテローム発生の阻害剤であることを証明できると明白に考えられる。他の実施形態では、前記アゴニストの投与が静脈投与以外である、例えば、前記アゴニストの投与が腹腔内または経口投与であると明白に考えられる。他の実施形態では、週齢１２週以外で、週齢１２週より早くまたは遅く、治療を始めることが明白に考えられる。他の実施形態では、１４日より短いまたは長い間、治療を継続することが明白に考えられる。注射は１日１回以外である場合もあると明白に考えられる。
（実施例２６）
マウスにおける慢性炎症性関節炎に対するＧＰＲ１０１アゴニストのインビボ効果
週齢１３〜１４週の雄と雌の両方のＭＲＬ−ｌｐｒマウス（メイン州、バーハーバーのＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）を使用する。ＭＲＬ−ｌｐｒマウスは、細胞浸潤、パンヌス形成、骨および軟骨破壊、ならびに血清リウマチ因子の存在をはじめとするヒト関節リウマチに類似した特徴を有する慢性炎症性関節炎を自然発現する。通常、この疾病は、その動物の寿命の終わりのほうで発現するが、フロイント完全アジュバント（ＣＦＡ）の注射は、早期発症を起こさせ、その関節炎の重症度を増す（Ｒａｋａｙら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９９３）１５１：５０８１−５０８７）。
それぞれの実験の第０日に、すべての群のマウスの胸部および鼠径部にＣＦＡを皮内注射する（０．０５ｍＬのＣＦＡに１ｍＬ当たり１０ｍｇの熱不活化結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）Ｈ３７ Ｒａ（ミシガン州、デトロイトのＤｉｆｃｏ）を補足）。直ちに、マウスＧＰＲ１０１に対するアゴニスト活性を有するＧＰＲ１０１のアゴニストまたはビヒクルのみを尾静脈に毎日注射する。前記ＧＰＲ１０１アゴニストの好ましい用量は、０．１〜１００ｍｇ／ｋｇである。他の好ましい用量は、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、３．０ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇおよび１００ｍｇ／ｋｇからなる群より選択される。
治療は、３０日間継続する。腫脹を定量するために、マイクロメーターで足首幅を測定する。スチューデントｔ検定を用いて、足首幅測定値の対のセットの統計的比較を行う。
組織病理分析
ＣＦＡプライミング後３０日の時点で、後足を緩衝ホルマリンで固定する。４８時間、１０％ギ酸中で脱石灰した後、パラフィン包埋のために組織を処理する。足根中足関節の連続切片を５ｍｍ厚に切断し、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色する。実験プロトコルについて知らない人物が切片を検査する。最低１０個の切片／関節を評価し、評点付けして、滑膜下（ｓｕｂｓｙｎｏｖｉａｌ）炎症（０、正常；１、限局性炎症性浸潤；２、細胞組織構造の優位を占める炎症性浸潤）、骨膜過形成（０、正常；１、１つの関節に見られる連続する最低３層の厚さの骨膜表層；２、幾つかの関節において検出される最低３層の厚さの骨膜表層）、パンヌス形成および軟骨侵食（０、正常；１、顕性軟骨消失を伴わない軟骨表面を部分的に覆うパンヌス；２、顕性軟骨消失につながるパンヌス）、骨破壊（０、正常；１、パンヌスまたは破骨細胞活性による骨の検出可能な破壊；２、パンヌスおよび破骨細胞活性が骨の有意な部分を破壊した）の半定量測定値を得、最終的に、総合病理は、これらの基準についての値の合計によって導出される総合評価である［例えば、Ｇｏｎｇら、Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ（１９９７）１８６：１３１−１３７を参照のこと］。スチューデントｔ検定を用いて組織病理の統計的分析を行う。
これらの結果は、前記ＧＰＲ１０１アゴニストが慢性炎症性関節炎の阻害剤であること、例えば、前記ＧＰＲ１０１アゴニストが、関節リウマチの阻害剤であることの証拠となり得る。
他の実施形態では、前記アゴニストの投与が静脈投与以外である、例えば、前記アゴニストの投与が腹腔内または経口投与であると明白に考えられる。他の実施形態では、週齢１３〜１４週以外で、週齢１３〜１４週より早くまたは遅く、治療を始めることが明白に考えられる。他の実施形態では、３０日より短いまたは長い間、治療を継続することが明白に考えられる。注射は１日１回以外である場合もあると明白に考えられる。

Claims (62)

  1. 候補化合物を視床下部プロオピオメラノコルチン（ＰＯＭＣ）由来生物活性ペプチドの分泌の調節因子として同定する方法であって、該方法は、
    （ａ）ＧＰＣＲを含む組換え宿主細胞またはその膜と該候補化合物を接触させる工程であって、ここで、該受容体は、
    （ｉ）配列番号２のアミノ酸配列；
    （ｉｉ）特異的プライマー配列番号７および配列番号８を使用してヒトＤＮＡサンプルに対するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅することができるポリヌクレオチドによってコードされているＧタンパク質結合受容体のアミノ酸配列；
    （ｉｉｉ）配列番号４のアミノ酸配列；
    （ｉｖ）配列番号６のアミノ酸配列；
    （ｖ）配列番号１、配列番号３または配列番号５の相補体にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされているＧタンパク質結合受容体のアミノ酸配列；
    （ｖｉ）配列番号２、配列番号４または配列番号６に対して少なくとも約７０％の同一性を有するアミノ酸配列を有するＧタンパク質結合受容体のアミノ酸配列；
    （ｖｉｉ）配列番号２、配列番号４または配列番号６のアミノ酸配列の変異体を有するＧタンパク質結合受容体のアミノ酸配列；および
    （ｖｉｉｉ）（ｉ）から（ｖｉｉ）のうちのいずれか１つの生物活性フラグメント
    からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、かつ該受容体は、Ｇタンパク質に結合する、工程、および
    （ｂ）該ＧＰＣＲの機能性を阻害または刺激する該化合物の能力を決定する工程
    を含み、ここで、
    該ＧＰＣＲの機能性を阻害または刺激する該化合物の能力が、その化合物が視床下部プロオピオメラノコルチン（ＰＯＭＣ）由来生物活性ペプチドの分泌の調節因子であることを示す
    、
    方法。
  2. 前記ＧＰＣＲが、配列番号２のアミノ酸配列、または配列番号２に対して少なくとも約７０％の同一性を有するアミノ酸配列を有するＧタンパク質結合受容体のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
  3. 前記ＧＰＣＲの機能性を刺激する前記化合物の能力が、該化合物が視床下部プロオピオメラノコルチン（ＰＯＭＣ）由来生物活性ペプチドの分泌を刺激する化合物であることを示す、請求項１または請求項２に記載の方法。
  4. 前記ＰＯＭＣ由来生物活性ペプチドが、ＡＣＴＨ、β−エンドルフィン、α−ＭＳＨ、β−ＭＳＨおよびγ−ＭＳＨからなる群より選択される、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 前記ＧＰＣＲのアゴニストを同定する工程を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 前記ＧＰＣＲの部分アゴニストを同定する工程を含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 前記候補化合物が、肥満またはそれに関連した状態を治療または予防するための医薬としてスクリーニングされる、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 前記肥満に関連した状態が、高血圧、インスリン抵抗性、メタボリック症候群、２型糖尿病、異脂肪血症、アテローム性硬化症、冠性心疾患および卒中からなる群より選択される、請求項７に記載の方法。
  9. 前記候補化合物が、満腹を促進するための医薬としてスクリーニングされる、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
  10. 前記候補化合物が、過食症を治療または予防するための医薬としてスクリーニングされる、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
  11. 前記候補化合物が、発熱を治療または予防するための医薬としてスクリーニングされる、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
  12. 前記候補化合物が、炎症関連障害を治療または予防するための医薬としてスクリーニングされる、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
  13. 前記ＧＰＣＲの逆アゴニストを同定する工程を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
  14. 前記ＧＰＣＲのアンタゴニストを同定する工程を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
  15. 前記候補化合物が、悪液質を治療または予防するための医薬としてスクリーニングされる、請求項１から４、１３および１４のいずれか一項に記載の方法。
  16. 前記悪液質が、ＡＩＤＳ関連体重減少、癌関連体重減少および食欲不振関連体重減少からなる群より選択される、請求項１５に記載の方法。
  17. 前記候補化合物が、体重、脂肪蓄積、体脂肪率および食事摂取量からなる群より選択されるエネルギー恒常性関連パラメータを調節するための医薬としてスクリーニングされる、請求項１から６、１３および１４のいずれか一項に記載の方法。
  18. 前記アゴニストまたは部分アゴニストを医薬として調合する工程をさらに含む、請求項５から１２および１７のいずれか一項に記載の方法。
  19. 前記逆アゴニストまたはアンタゴニストを医薬として調合する工程をさらに含む、請求項１３から１７のいずれか一項に記載の方法。
  20. 前記決定する工程が、第二メッセンジャーのレベルの測定によるものである、請求項１から１９のいずれか一項に記載の方法。
  21. 前記第二メッセンジャーが、ｃＡＭＰである、請求項２０に記載の方法。
  22. 前記決定する工程が、メラニン保有細胞アッセイの使用を含む方法によるものであるか、または前記ＧＰＣＲを含む膜へのＧＴＰγＳの結合の測定を含む方法によるものであるか、またはｃＡＭＰ応答性レポーターアッセイの使用を含む方法によるものである、請求項１から１９のいずれか一項に記載の方法。
  23. 請求項１から２２のいずれか一項に記載の方法に従って同定することができる調節因子。
  24. 脊椎動物ＧＰＲ１０１受容体の調節因子と医薬的に許容される担体とを含む医薬組成物。
  25. 脊椎動物ＧＰＲ１０１受容体の調節因子と医薬的に許容される担体を混合することを含む、医薬組成物の作製方法。
  26. 視床下部プロオピオメラノコルチン（ＰＯＭＣ）由来生物活性ペプチドの分泌を増加させる方法であって、該方法は、増加を必要とする脊椎動物に、該脊椎動物ＧＰＲ１０１受容体のアゴニストもしくは部分アゴニストの治療有効量または該アゴニストもしくは部分アゴニストと医薬的に許容される担体とを含む医薬組成物の治療有効量を投与することを含む、方法。
  27. 肥満またはそれに関連した状態を治療または予防する方法であって、該方法は、治療または予防を必要とする脊椎動物に、該脊椎動物ＧＰＲ１０１受容体のアゴニストもしくは部分アゴニストの治療有効量または該アゴニストもしくは部分アゴニストと医薬的に許容される担体とを含む医薬組成物の治療有効量を投与することを含む、方法。
  28. 前記肥満に関連した状態が、高血圧、インスリン抵抗性、メタボリック症候群、２型糖尿病、異脂肪血症、アテローム性硬化症、冠性心疾患および卒中からなる群より選択される、請求項２７に記載の方法。
  29. 脊椎動物において満腹を促進する方法であって、該方法は、満腹を必要とする脊椎動物に、該脊椎動物ＧＰＲ１０１受容体のアゴニストもしくは部分アゴニストの治療有効量または該アゴニストもしくは部分アゴニストと医薬的に許容される担体とを含む医薬組成物の治療有効量を投与することを含む、方法。
  30. 過食症を治療または予防する方法であって、該方法は、治療または予防を必要とする脊椎動物に、該脊椎動物ＧＰＲ１０１受容体のアゴニストもしくは部分アゴニストの治療有効量または該アゴニストもしくは部分アゴニストと医薬的に許容される担体とを含む医薬組成物の治療有効量を投与することを含む、方法。
  31. 発熱を治療または予防する方法であって、該方法は、治療または予防を必要とする脊椎動物に、該脊椎動物ＧＰＲ１０１受容体のアゴニストもしくは部分アゴニストの治療有効量または該アゴニストもしくは部分アゴニストと医薬的に許容される担体とを含む医薬組成物の治療有効量を投与することを含む、方法。
  32. 炎症関連障害を治療または予防する方法であって、該方法は、治療または予防を必要とする脊椎動物に、該脊椎動物ＧＰＲ１０１受容体のアゴニストもしくは部分アゴニストの治療有効量または該アゴニストもしくは部分アゴニストと医薬的に許容される担体とを含む医薬組成物の治療有効量を投与することを含む、方法。
  33. 体重を減少させる、脂肪蓄積を減少させる、体脂肪率を減少させる、または食事摂取を減少させる方法であって、該方法は、減少を必要とする脊椎動物に、該脊椎動物ＧＰＲ１０１受容体のアゴニストもしくは部分アゴニストの治療有効量または該アゴニストもしくは部分アゴニストと医薬的に許容される担体とを含む医薬組成物の治療有効量を投与することを含む、方法。
  34. 前記脊椎動物が、哺乳動物またはヒトである、請求項２６から３３のいずれか一項に記載の方法。
  35. 視床下部プロオピオメラノコルチン（ＰＯＭＣ）由来生物活性ペプチドの分泌を減少させる方法であって、該方法は、減少を必要とする脊椎動物に、該脊椎動物ＧＰＲ１０１受容体の逆アゴニストもしくはアンタゴニストの治療有効量または該逆アゴニストもしくはアンタゴニストと医薬的に許容される担体とを含む医薬組成物の治療有効量を投与することを含む、方法。
  36. 悪液質を治療または予防する方法であって、該方法は、治療または予防を必要とする脊椎動物に、該脊椎動物ＧＰＲ１０１受容体の逆アゴニストもしくはアンタゴニストの治療有効量または該逆アゴニストもしくはアンタゴニストと医薬的に許容される担体とを含む医薬組成物の治療有効量を投与することを含む、方法。
  37. 前記悪液質が、ＡＩＤＳ関連体重減少、癌関連体重減少および食欲不振関連体重減少からなる群より選択される、請求項３６に記載の方法。
  38. 体重を増加させる、脂肪蓄積を増加させる、体脂肪率を増加させる、または食事摂取を増加させる方法であって、該方法は、増加を必要とする脊椎動物に、該脊椎動物ＧＰＲ１０１受容体の逆アゴニストもしくはアンタゴニストの治療有効量または該逆アゴニストもしくはアンタゴニストと医薬的に許容される担体とを含む医薬組成物の治療有効量を投与することを含む、方法。
  39. 前記脊椎動物が、哺乳動物またはヒトである、請求項３５から３８のいずれか一項に記載の方法。
  40. 視床下部プロオピオメラノコルチン（ＰＯＭＣ）由来生物活性ペプチドの分泌を増加させるための薬物の製造における脊椎動物ＧＰＲ１０１受容体のアゴニストまたは部分アゴニストの使用。
  41. 肥満またはそれに関連した状態を治療または予防するための薬物の製造における脊椎動物ＧＰＲ１０１受容体のアゴニストまたは部分アゴニストの使用。
  42. 前記肥満に関連した状態が、高血圧、インスリン抵抗性、メタボリック症候群、２型糖尿病、異脂肪血症、アテローム性硬化症、冠性心疾患および卒中からなる群より選択される、請求項４１に記載の使用。
  43. 満腹を促進するための薬物の製造における脊椎動物ＧＰＲ１０１受容体のアゴニストまたは部分アゴニストの使用。
  44. 過食症を治療または予防するための薬物の製造における脊椎動物ＧＰＲ１０１受容体のアゴニストまたは部分アゴニストの使用。
  45. 発熱を治療または予防するための薬物の製造における脊椎動物ＧＰＲ１０１受容体のアゴニストまたは部分アゴニストの使用。
  46. 炎症関連障害を治療または予防するための薬物の製造における脊椎動物ＧＰＲ１０１受容体のアゴニストまたは部分アゴニストの使用。
  47. 体重を減少させるための、脂肪蓄積を減少させるための、体脂肪率を減少させるための、または食事摂取量を減少させるための薬物の製造における脊椎動物ＧＰＲ１０１受容体のアゴニストまたは部分アゴニストの使用。
  48. 視床下部プロオピオメラノコルチン（ＰＯＭＣ）由来生物活性ペプチドの分泌を減少させるための薬物の製造における脊椎動物ＧＰＲ１０１受容体の逆アゴニストまたはアンタゴニストの使用。
  49. 脊椎動物において悪液質を治療または予防するための薬物の製造における該脊椎動物ＧＰＲ１０１受容体の逆アゴニストまたはアンタゴニストの使用。
  50. 前記悪液質が、ＡＩＤＳ関連体重減少、癌関連体重減少および食欲不振関連体重減少からなる群より選択される、請求項４９に記載の使用。
  51. 体重を増加させるための、脂肪蓄積を増加させるための、体脂肪率を増加させるための、または食事摂取量を増加させるための薬物の製造における脊椎動物ＧＰＲ１０１受容体の逆アゴニストまたはアンタゴニストの使用。
  52. ＰＯＭＣ由来生物活性ペプチド関連疾患のための医薬として候補化合物をスクリーニングする方法であって、該方法は、
    （ａ）ＧＰＣＲを含む組換え宿主細胞またはその膜と候補化合物を、該受容体と該候補化合物との相互作用を可能にする条件下で接触させる工程であって、該受容体は、
    （ｉ）配列番号２のアミノ酸配列；
    （ｉｉ）特異的プライマー配列番号７および配列番号８を使用してヒトＤＮＡサンプルに対するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅することができるポリヌクレオチドによってコードされているＧタンパク質結合受容体のアミノ酸配列；
    （ｉｉｉ）配列番号４のアミノ酸配列；
    （ｉｖ）配列番号６のアミノ酸配列；
    （ｖ）配列番号１、配列番号３または配列番号５の相補体にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされているＧタンパク質結合受容体のアミノ酸配列；
    （ｖｉ）配列番号２、配列番号４または配列番号６に対して少なくとも約７０％の同一性を有するアミノ酸配列を有するＧタンパク質結合受容体のアミノ酸配列；
    （ｖｉｉ）配列番号２、配列番号４または配列番号６のアミノ酸配列の変異体を有するＧタンパク質結合受容体のアミノ酸配列；および
    （ｖｉｉｉ）（ｉ）から（ｖｉｉ）のうちのいずれか１つの生物活性フラグメント
    からなる群より選択されるアミノ酸を含む、工程、および
    （ｂ）該ＧＰＣＲに結合するリガンドを検出する工程
    を含む、
    ＰＯＭＣ由来生物活性ペプチド関連疾患のための医薬として候補化合物をスクリーニングする方法。
  53. 前記ＧＰＣＲが、配列番号２、または配列番号２に対して少なくとも約７０％の同一性を有するアミノ酸配列を有するＧタンパク質結合受容体のアミノ酸配列を含む、請求項５２に記載の方法。
  54. 前記ＰＯＭＣ由来生物活性ペプチドが、ＡＣＴＨ、β−エンドルフィン、α−ＭＳＨ、β−ＭＳＨおよびγ−ＭＳＨからなる群より選択される、請求項５２または請求項５３に記載の方法。
  55. 前記スクリーニングが、肥満もしくはそれに関連した状態の危険があるか、または肥満もしくはそれに関連した状態に進行している脊椎動物を特定するための放射線イメージング剤についてのスクリーニングである、請求項５２から５４のいずれか一項に記載の方法。
  56. 視床下部プロオピオメラノコルチン（ＰＯＭＣ）由来生物活性ペプチドの分泌の調節因子として、またはＰＯＭＣ由来生物活性ペプチド関連疾患のための医薬として候補化合物をスクリーニングするためのＧＰＣＲの使用であって、該ＧＰＣＲは、
    （ａ）配列番号２のアミノ酸配列；
    （ｂ）特異的プライマー配列番号７および配列番号８を使用してヒトＤＮＡサンプルに対するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅することができるポリヌクレオチドによってコードされているＧタンパク質結合受容体のアミノ酸配列；
    （ｃ）配列番号４のアミノ酸配列；
    （ｄ）配列番号６のアミノ酸配列；
    （ｅ）配列番号１、配列番号３または配列番号５の相補体にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされているＧタンパク質結合受容体のアミノ酸配列；
    （ｆ）配列番号２、配列番号４または配列番号６に対して少なくとも約７０％の同一性を有するアミノ酸配列を有するＧタンパク質結合受容体のアミノ酸配列；
    （ｇ）配列番号２、配列番号４または配列番号６のアミノ酸配列の変異体を有するＧタンパク質結合受容体のアミノ酸配列；
    （ｈ）（ａ）から（ｇ）のうちのいずれか１つの生物活性フラグメント
    からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、使用。
  57. 前記ＧＰＣＲが、配列番号２のアミノ酸配列、または配列番号２に対して少なくとも約７０％の同一性を有するアミノ酸配列を有するＧタンパク質結合受容体のアミノ酸配列を含む、請求項５６に記載の使用。
  58. 前記ＰＯＭＣ由来生物活性ペプチドが、ＡＣＴＨ、β−エンドルフィン、α−ＭＳＨ、β−ＭＳＨおよびγ−ＭＳＨからなる群より選択される、請求項５６または請求項５７に記載の使用。
  59. 前記スクリーニングが、前記ＧＰＣＲのアゴニストについてのスクリーニングである、請求項５６から５８のいずれか一項に記載の使用。
  60. 前記スクリーニングが、前記ＧＰＣＲの部分アゴニストについてのスクリーニングである、請求項５６から５９のいずれか一項に記載の使用。
  61. 前記スクリーニングが、前記ＧＰＣＲの逆アゴニストについてのスクリーニングである、請求項５６から５８のいずれか一項に記載の使用。
  62. 前記スクリーニングが、前記ＧＰＣＲのアンタゴニストについてのスクリーニングである、請求項５６から５８のいずれか一項に記載の使用。
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