JP2008510168A - 骨関節炎のバイオマーカー - Google Patents

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Abstract

骨関節炎（ＯＡ）の評価方法、例えば、ＯＡの診断、ＯＡの診断の確証、ＯＡの進行の評価または予後の実施、ＯＡをもつ被験者の重症度の判定、将来ＯＡを発症する被験者のリスクの判定のための方法、また、本方法を行うために使用されるアレイおよびキットが提供される。ある特定の実施例において、本方法は、可溶性血管付着タンパク質１（ｓＶＡＰ−１）またはインターロイキン１５（ＩＬ−１５）などのＯＡリスク関連分子の活性量（存在するタンパク質の量または発現量など）を判定する段階を含む。また、ＯＡ関連分子の活性を変更する１つ以上の化合物を同定し、それによって、潜在的抗骨関節炎剤を同定する方法も提供される。

Description

分野
本開示は、骨関節炎の評価方法、骨関節炎関連分子の活性を変更する化合物の同定する方法、そして開示された方法を行うために使用されるアレイとキットに関する。
関連出願の相互参照
本出願は、２００４年８月１８に記入された、米国仮出願番号６０／６０２，３３４に対して優先権を主張し、参照によりその全体が本明細書に記載されているものとみなす。
背景
骨関節炎（ＯＡ）は、軟骨下骨の病的変化、骨関節炎性結節の増殖を含む骨の肥大、および痛みと硬直、そして最後には機能の喪失を伴う変化により、柔らかく、摩減され、薄くなる関節軟骨の分裂と腐食により特徴づけされる、変形性関節疾患である。骨関節炎は、主に、荷重関節に影響する。臨床的に明白なとき、骨関節炎は、関節痛、朝のこわばりおよび運動制限のため、特に高齢者にとって、罹患および障害の主な原因であり、通常、頚、腰、膝、臀部および指の関節を含む（Ｌａｗｒｅｎｃｅら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．、４１：７７８−９９、１９９８（非特許文献１）；Ｌｉｎｇら、Ｊ．Ａｍ．Ｇｅｒｉａｔｒ．Ｓｏｃ．４６：２１６−２５、１９９８（非特許文献２））。骨関節炎は、過去に損傷または外傷を受けた、または長期間頻繁に使用された関節で発症することもある。
従来のＸ線撮影は、臨床的症状を予測するための非感受性と、初期の疾病または経時的な微妙な変化を検知するための非感受性にもかかわらず、一般的に、ＯＡの診断および分類の判断基準とみなされる。(Lethbridge-Cejku et al.,Arthritis Care Res.8:182-83,1995（非特許文献３）;Altman et al.,Arthritis Rheum.30:1214-25,1987（非特許文献４）)。診断または疾病の臨床経過の予測に使用される滑液、血清、または尿で測定されるバイオマーカーの探求は、近年、強まっている。初期の研究は、軟骨前駆体、構成要素および分解生成物に焦点を置いていた（Ｂｒｕｙｅｒｅら、Ｊ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．３０：１０４３−５０、２００３（非特許文献５）；Ｄｒａｇｏｍｉｒら、Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｃａｒｔｉｌａｇｅ１０：６８７−９１、２００２（非特許文献６）；Ｌｏｈｍａｎｄｅｒら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ． Ｒｈｅｕｍ．４２：５３４−４４、１９９９（非特許文献７）；Ｐｏｏｌｅ、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ． Ｒｈｅｕｍ．４６：２５４９−５２、２００２（非特許文献８）；Ｐｏｏｌｅら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈ．２９４：１４５−５３、２００４（非特許文献９）；Ｃｌａｒｋら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ．Ｒｈｅｕｍ．４２：２３５６−６４、１９９９（非特許文献１０）；Ｖｉｌｉｍら、Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｃａｒｔｉｌａｇｅ１０：７０７−１３、２００２（非特許文献１１））。しかし、現在利用可能なマーカーは、すでに発生した軟骨と骨の損傷しか反映しないため、他のＯＡマーカーの同定が必要とされる。よって、初期発生、ＯＡの素因または継続する疾病過程を含む要因を反映するマーカーの同定が、例えば、ＯＡの早期介入から利益を得る患者を同定するために役立つ。さらに、ＯＡバイオマーカーの同定は、新規の治療標的の同定を可能にするかもしれない。
Ｌａｗｒｅｎｃｅら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．、４１：７７８−９９、１９９８ Ｌｉｎｇら、Ｊ．Ａｍ．Ｇｅｒｉａｔｒ．Ｓｏｃ．４６：２１６−２５、１９９８ Lethbridge-Cejku et al.,Arthritis Care Res.8:182-83,1995 Altman et al.,Arthritis Rheum.30:1214-25,1987 Ｂｒｕｙｅｒｅら、Ｊ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．３０：１０４３−５０、２００３ Ｄｒａｇｏｍｉｒら、Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｃａｒｔｉｌａｇｅ１０：６８７−９１、２００２ Ｌｏｈｍａｎｄｅｒら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ． Ｒｈｅｕｍ．４２：５３４−４４、１９９９ Ｐｏｏｌｅ、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ． Ｒｈｅｕｍ．４６：２５４９−５２、２００２ Ｐｏｏｌｅら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈ．２９４：１４５−５３、２００４ Ｃｌａｒｋら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ．Ｒｈｅｕｍ．４２：２３５６−６４、１９９９ Ｖｉｌｉｍら、Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｃａｒｔｉｌａｇｅ１０：７０７−１３、２００２
要旨
骨関節炎（ＯＡ）評価のための新規方法が開示される。発明者は、ＯＡを分析するために使用される、複数の骨関節炎マーカーを同定した。長期間縦軸的に追跡し、表現型がよく特徴づけされた被験者からの試料は、１６９の可溶性血清タンパク質を測定するために、多重抗体ベースのタンパク質マイクロアレイを使用して分析された。膝および手のＯＡ発症は、血清タンパク質の検知可能な変化により特徴づけされることが分った。確証されたＯＡに存在するマーカーと同様、ＯＡの発症に関連するマーカーが、同定された。よって、開示されたＯＡリスク関連マーカーは、被験者が将来ＯＡを発症するかを判定するため、診断またはＯＡの診断を確証するため、ＯＡの進行を判断またはＯＡの進行の予後を実行するため、ＯＡの重症度を判定するため、特定のＯＡ治療から利益を得る可能性のある被験者を同定するため、またはこれらの組み合わせにより使用される。
開示された方法は、多くのＯＡリスク関連分子（ＯＡリスク関連タンパク質または酢酸分子など）を、同時および順次に、スクリーニングすることを可能にする。ある実施例において、比較的少量の生体試料（生体液、例えば、血液、血清または尿など）のみが、必要とされる。タンパク質の量の変化は、使用されたアルゴリズムの感受性と特異性、および分析されたパラメータにより、少なくとも１０のタンパク質、少なくとも１３のタンパク質、少なくとも１６のタンパク質または少なくとも１７のタンパク質でみられた。
ある特定の実施例において、ＯＡの被験者は、インターロイキン１５（ＩＬ−１５）、可溶性血管付着タンパク質１（ｓＶＡＰ−１）、メタロプロテイナーゼ７（ＭＭＰ−７）、インターロイキン１α（ＩＬ−１α）、ＩＬ−２、マクロファージ抑制タンパク質（ＭＩＰ）−１α、Ｂリンパ球ケモカイン（ＢＬＣ）、６ケモカイン（Ｃｋｉｎｅ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）−７、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インスリン様成長因子結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）−２、ニューロトロフィン４（ＮＴ４）、ＩＣＡＭ−３、血管内皮（ＶＥ）カドヘリン、メタプロテイナーゼ１の組織阻害剤（ＴＩＭＰ−１）量の増加、およびプラスミノーゲン活性抑制物質１（ＰＡＩ−１）量の減少を示した。別のある特定の実施例において、ＯＡの被験者は、マクロファージ炎症性タンパク質１β（ＭＩＰ−１β）、ウロキナーゼ型活性プラスミノーゲン化因子受容体（ＵＰＡＲ）、血管細胞接着分子１（ＶＣＡＭ−１）、ＩＬ−２、ＩＧＦＢＰ−４、ＩＣＡＭ−３、インターフェロンγにより誘発されるモノカイン（ＭＩＧ）、ＭＭＰ−７、骨髄性前駆細胞抑制因子１（ＭＰＩＦ−１）、ＴＧＦβ受容体ＩＩＩ（ＴＧＦ−βＲＩＩＩ）（および、ある実施例において６−Ｃｋｉｎｅも）量の増加、およびマクロファージ炎症性タンパク質１δ（ＭＩＰ−１δ）、エオタキシン２（Ｅｏｔ２）および胸腺および活性調節性ケモカイン（ＴＡＲＣ）（ｔｈｙｍｕｓ ａｎｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ）量の減少を示した。
ある特定の実施例において、最初にＯＡではなかったが、後にＯＡを発症した被験者は、ＯＡを発症する前、例えば、ＯＡがＸ線により検知可能でなかった場合、ＩＬ−１５、ｓＶＡＰ−１、ＭＭＰ−７量の増加、およびＰＡＩ−１、Ｄダイマー５（ＤＤ５）、ＤＤ６、Ｅｏｔ２、細胞間接着分子１（ＩＣＡＭ−１）、ＭＭＰ−２、Ｐセレクチン量の減少を示した。別のある特定の実施例において、最初はＯＡではなかったが、後にＯＡを発症した被験者は、ＭＩＰ−１β、ＵＰＡＲ、ＶＣＡＭ−１、血液濾液ＣＣケモカイン１（ＨＣＣ１）、レプチン、ＭＭＰ−７、脳から派生した神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、６−Ｃｋｉｎｅ、ＴＧＦ−βＲＩＩＩおよびＩＣＡＭ−３量の増加、およびマクロファージ炎症性タンパク質１δ（ＭＩＰ−１δ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）およびプロラクチン量の減少を示した。
一実施例において、被験者のＯＡリスクの評価方法は、ＯＡリスク関連分子の活性の増加とＯＡリスク関連分子の活性の減少のパターンの検知、または双方を含む。このような活性のパターンは、核酸レベル（タンパク質発現に関連するｍＲＮＡｓの定量など）またはタンパク質レベル（タンパク質の定量的検知など）で検知が可能である。ある方法は、発現パターンの検知だけでなく、発現の規模（増加、減少、または双方）の検知も備え、そのようなパターンは、ＯＡである、またはＯＡ発症のリスクがある被験者と関連、または重傷度またはＯＡの進行など、予測された臨床的後遺症と関連する。
開示された方法は、例えば、Ｘ線写真の検査の前または後など、ＯＡの疑いのある被験者に実行することができる。他の実施例において、本方法は、例えば、ＯＡの進行をモニタリングするため、ＯＡの重傷度を判定するため、またはＯＡの放射線学的診断を確認するためなど、ＯＡと分っている被験者に実行される。他の実施例において、開示された方法は、例えば、ＯＡである、またはＯＡを発症するリスクがあると知らない被験者の疾病に対するスクリーニングの一部として、疾病に対する被験者のスクリーニングとして実行される。
一実施例において、ＯＡの評価方法は、被験者が、表８と１０〜１３に示す配列（ＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質の配列など）を含む、基本的に構成する、または構成する、１つ以上のＯＡリスク関連分子の活性の変化を示すかどうかを判定することを備え、１つ以上のＯＡリスク関連分子の差次的活性の存在は、被験者が、将来のＯＡの発症リスクの増加またはＯＡの診断など、ＯＡリスクの増加を示唆する。特定の実施例において、ＯＡの評価方法は、被験者が、表８および１０〜１３に示す配列を含む、基本的に構成する、または構成する、２つ以上のＯＡリスク関連分子（３つ以上、４つ以上、５つ以上、または６つ以上など）の活性の変化を示すかどうかを判定することを備え、少なくとも２つ以上、少なくとも３つ以上、少なくとも４つ以上、少なくとも５つ以上または少なくとも６つ以上のＯＡリスク関連分子の差次的活性の存在は、被験者が、将来、ＯＡの発症リスクの増加またはＯＡの診断など、ＯＡリスクの増加を示唆する。
一実施例において、１つ以上、２つ以上、３つ以上、または４つ以上のＯＡリスク関連分子は、インターロイキン１５（ＩＬ−１５）または可溶性血管付着タンパク質１（ｓＶＡＰ−１）を備え、本方法は、少なくともＩＬ−１５の上方制御がみられるかどうかの判定、または少なくともｓＶＡＰ−１の下方制御がみられるかどうかの判定を含む。他の実施例において、少なくとも、４つのＯＡリスク関連分子は、マトリックスメタロプロテイナーゼ７（ＭＭＰ−７）およびプラスミノーゲン活性抑制物質（ＰＡＭ−１）をさらに備え、本方法は、少なくともＭＭＰ−７およびＰＡＭ−１の上方制御がみられるかどうかの判定をさらに含む。さらに他の実施例において、少なくとも、４つのＯＡリスク関連分子は、マクロファージ炎症性タンパク質１β（ＭＩＰ−１β）、マクロファージ炎症性タンパク質１δ（ＭＩＰ−１δ）、ウロキナイーゼ型活性プラスミノーゲン化因子受容体（ＵＰＡＲ）および血管細胞接着分子１（ＶＣＡＭ−１）をさらに備え、本方法は、少なくともＭＩＰ−１β、ＵＰＡＲおよびＶＣＡＭ−１の上方制御、および少なくともＭＩＰ−１δの調節解除がみられるかどうかの判定を含む。さらに他の実施例において、少なくとも、４つのＯＡリスク関連分子は、ＭＩＰ−１β、ＭＩＰ−１δ、ＵＰＡＲ、ＶＣＡＭ−１、６−Ｃｋｉｎｅ、ＩＣＡＭ−３およびＴＧＦ−βＲＩＩＩをさらに備え、本方法は、少なくともＭＩＰ−１β、ＵＰＡＲ、ＶＣＡＭ−１、６−Ｃｋｉｎｅ、ＩＣＡＭ−３およびＴＧＦ−βＲＩＩＩの上方制御、および少なくともＭＩＰ−１δの調節解除がみられるかどうかの判定を含む。
一実施例において、ＯＡリスクの評価方法は、被験者の将来のＯＡの発症リスクの増加の判定を含む。一実施例において、そのような方法は、少なくともＩＬ−１５、ｓＶＡＰ−１とＭＭＰ−７の上方制御がみられるかどうかの判定、および少なくともＰＡＩ−１、Ｄダイマー５（ＤＤ５）、ＤＤ６、エオタキシン２（Ｅｏｔ２）、細胞間接着分子１（ＩＣＡＭ−１）、ＭＭＰ−２およびＰセレクチンの下方制御がみられるかどうかの判定を備え、ＰＡＩ−１、ＤＤ５、ＤＤ６、Ｅｏｔ２、ＩＣＡＭ−１、ＭＭＰ−２およびＰセレクチンの下方制御の存在と、ＩＬ−１５、ＭＭＰ−７とｓＶＡＰ−１の上方制御の存在は、被験者の将来のＯＡ発症のリスクの増加を示す。他の実施例において、そのような方法は、少なくともＭＩＰ−１β、ＵＰＡＲ、ＶＣＡＭ−１、６−Ｃｋｉｎｅ、ＩＣＡＭ−３、ＢＤＮＦ、ＨＣＣ１、レプチン、ＭＭＰ−７およびＴＧＦ−βＲＩＩＩの上方制御と、少なくともＭＩＰ−１δ、プロラクチンおよびＥＧＦの下方制御がみられるかどうかの判定を備え、ＭＩＰ−１β、ＵＰＡＲ、ＶＣＡＭ−１、６−Ｃｋｉｎｅ、ＩＣＡＭ−３、ＢＤＮＦ、ＨＣＣ１、レプチン、ＭＭＰ−７およびＴＧＦ−βＲＩＩＩの上方制御の存在と、ＭＩＰ−１δ、プロラクチンおよびＥＧＦの下方制御は、被験者がＯＡ発症の恐れがあることを示唆する。そのような実施例において、被験者は、ＯＡの放射能学的証拠がなくてよい、またはＯＡの臨床的症状がなくてよい。
一実施例において、ＯＡリスクの評価方法は、被験者がＯＡをもつかの判定を含む。一実施例において、そのような方法は、少なくともインターロイキン１α（ＩＬ−１α）、ＩＬ−２、マクロファージ抑制タンパク質（ＭＩＰ）−１α、Ｂリンパ球ケモカイン（ＢＬＣ）、６ケモカイン（Ｃｋｉｎｅ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）−７、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インスリン様成長因子結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）−２、ニューロトロフィン４（ＮＴ４）、ＩＣＡＭ−３、血管内皮（ＶＥ）カドヘリンおよびメタロプロテイナーゼ１の組織阻害剤（ＴＩＭＰ−１）の上方制御がみられるかどうかの判定をさらに備え、ＰＡＩ−１の下方制御の存在と、ＩＬ−１５、ＭＭＰ−７、ｓＶＡＰ−１、ＩＬ−１α、ＩＬ−２、ＭＩＰ−１α、ＢＬＣ、６−Ｃｋｉｎｅ、ＦＧＦ−７、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＧＦＢＰ−２、ＮＴ４、ＩＣＡＭ−３、ＶＥカドヘリンおよびＴＩＭＰ−１の上方制御の存在は、被験者のＯＡを示唆する。他の実施例において、そのような方法は、少なくともＭＩＰ−１β、ＵＰＡＲ、６−Ｃｋｉｎｅ、ＶＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−３、ＴＧＦ−βＲＩＩＩ、ＩＬ−２、ＩＧＦＢＰ−４、ＭＩＧ、ＭＭＰ−７、ＭＰＩＦ−１の上方制御と、少なくともＭＩＰ−１δ、Ｅｏｔ２およびＴＡＲＣの下方制御がみられるかどうかの判定をさらに備え、少なくともＭＩＰ−１β、ＵＰＡＲ、６−Ｃｋｉｎｅ、ＶＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−３、ＴＧＦ−βＲＩＩＩ、ＩＬ−２、ＩＧＦＢＰ−４、ＭＩＧ、ＭＭＰ−７、ＭＰＩＦ−１の上方制御の存在と、少なくともＭＩＰ−１δ、Ｅｏｔ２およびＴＡＲＣの下方制御は、被験者のＯＡを示唆する。
一実施例において、ＯＡリスクの評価方法は、被験者のＯＡの進行の判定を含む。本方法は、表８と１０〜１３に挙げる１つ以上の分子の上方制御、または表８および１０〜１３に挙げる１つ以上の分子の下方制御がみられるかどうかの判定を含む。例えば、２つの異なる時期に得た試料のＯＡリスク関連分子活性の量が比較される。後の時間点のＯＡリスク関連分子の活性が、差次的活性を示す、または大規模な差次的活性を示し続ける場合、ＯＡが進行していることを示唆する。反対に、後の時間点のＯＡリスク関連分子の活性が、もはや差次的活性を示さない、または小規模の差次的活性を示す場合、ＯＡが進行していない、またはＯＡの進行が遅いことを示唆する。他の実施例において、試料のＯＡリスク関連分子活性の量は、基準値または対照値と比較される。試験試料のＯＡリスク関連分子の活性が、ＯＡを表さない対照または規準値より大規模な差次的活性を示す場合、ＯＡが進行していることを示唆する。反対に、試験試料のＯＡリスク関連分子の活性が、ＯＡを表さないコントロールまたは規準値より統計上類似した量の差次的活性を示す場合、ＯＡが進行していない、またはＯＡの進行が遅いことを示唆する。
特定の実施例において、ＯＡリスク関連分子は、ＭＭＰ−７、ＰＡＩ−１、ＤＤ５、ＤＤ６、Ｅｏｔ２、ＩＣＡＭ−１、ＭＭＰ−２、Ｐセレクチン、ＩＬ−１α、ＩＬ−２、ＭＩＰ−１α、ＢＬＣ、６−Ｃｋｉｎｅ、ＦＧＦ−７、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＧＦＢＰ−２、ＮＴ４、ＩＣＡＭ−３、ＶＥカドヘリン、ＴＩＭＰ−１、ＭＩＰ−１β、ＭＩＰ−１δ、ＵＰＡＲ、ＶＣＡＭ−１、ＢＤＮＦ、ＥＧＦ、ＨＣＣ１、レプチン、プロラクチン、ＩＧＦＢＰ−４、ＭＩＧ、ＭＰＩＦ−１、ＴＡＲＣ、およびＴＧＦ−βＲＩＩＩの１つ以上と組み合わさるＩＬ−１５またはｓＶＡＰ−１、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３または３４と任意で組み合わさるＩＬ−１５またはｓＶＡＰ−１を含む、本質的に構成する、または構成する。例えば、ＯＡ関連分子は、表８および１０〜１３に挙げる２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、９つ以上、１０以上、１１以上、１２以上、１３以上、１４以上、１５以上、１６以上、１７以上、１８以上、１９以上、２０以上、２１以上、２２以上、２３以上、２４以上、２５以上、２６以上、２７以上、２８以上、２９以上、３０以上、３１以上、３２以上、３３以上、３４以上、３５以上、３６以上の分子を含む、本質的に構成する、または構成することが可能である。あらゆる同定された分子は、そのようなセットまたはサブセットの分子と組み合わせて使用することが可能である。
ある特定の実施例において、ＯＡの評価は、ＩＬ−１５またはｓＶＡＰ−１を含む、表８および１０〜１３に挙げる、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つのタンパク質（または対応する核酸）の任意の組み合わせなど、被験者の少なくとも１つのＯＡリスク関連分子の差次的活性の検知を備え、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つのＯＡリスク関連分子の差次的活性の存在は、被験者が、ＯＡである、または将来ＯＡを発症する恐れがあることを示唆する。特定の実施例において、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つのＯＡリスク関連分子は、ＭＭＰ−７、ＰＡＭ−１、ＤＤ５、ＤＤ６、Ｅｏｔ２、ＩＣＡＭ−１、ＭＭＰ−２、Ｐセレクチン、ＩＬ−１α、ＩＬ−２、ＭＩＰ−１α、ＢＬＣ、６−Ｃｋｉｎｅ、ＦＧＦ−７、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＧＦＢＰ−２、ＮＴ４、ＩＣＡＭ−３、ＶＥカドヘリン、ＴＩＭＰ−１、ＭＩＰ−１β、ＭＩＰ−１δ、ＵＰＡＲ、ＶＣＡＭ−１、ＢＤＮＦ、ＥＧＦ、ＨＣＣ１、レプチン、プロラクチン、ＩＧＦＢＰ−４、ＭＩＧ、ＭＰＩＦ−１、ＴＡＲＣまたはＴＧＦ−βＲＩＩＩの少なくとも１つとの組み合わさる、任意で、被験者が、表８と１０〜１３に挙げるＯＡリスク関連分子の少なくとも３つの他の分子（例えば、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも２６、少なくとも２７、少なくとも２８、少なくとも２９、少なくとも３０、少なくとも３１、少なくとも３２、少なくとも３３、または少なくとも３４でさえ）の任意の組み合わせなど、他のＯＡリスク関連分子の任意の他の組み合わせの活性を変更したかどうかの判定と組み合わさる、ＩＬ−１５またはｓＶＡＰ−１、を含む。
ある特定の実施例において、差次的活性は、被験者がＩＬ−１５、ｓＶＡＰ−１、ＭＭＰ−７、ＩＬ−１α、ＩＬ−２、ＭＩＰ−１α、ＢＬＣ、６−Ｃｋｉｎｅ、ＦＧＦ−７、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＧＦＢＰ−２、ＮＴ４、ＩＣＡＭ−３、ＶＥカドヘリン、ＴＩＭＰ−１、ＭＩＰ−１β、ＵＰＡＲ、ＶＣＡＭ−１、ＴＧＦ−βＲＩＩＩ、ＢＤＮＦ、ＨＣＣ、レプチン、ＩＧＦＢＰ−４、ＭＩＧおよびＭＰＩＦ−１の少なくとも１つの活性の増加を示すかどうかを判定することにより検知される。別の実施例において、差次的活性は、被験者がＰＡＩ−１、ＤＤ５、ＤＤ６、Ｅｏｔ２、ＩＣＡＭ−１、ＭＭＰ−２、Ｐセレクチン、ＭＩＰ−１δ、ＥｏＴ２およびＴＡＲＣの少なくとも１つの活性の減少を示すかどうかを判定することにより検知される。例えば、差次的発現は、被験者が、血清試料などの被験者から得た試料のＩＬ−１５、ｓＶＡＰ−１、ＭＭＰ−７、ＩＬ−１α、ＩＬ−２、ＭＩＰ−１α、ＢＬＣ、６−Ｃｋｉｎｅ、ＦＧＦ−７、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＧＦＢＰ−２、ＮＴ４、ＩＣＡＭ−３、ＶＥカドヘリン、ＴＩＭＰ−１、ＭＩＰ−１β、ＵＰＡＲ、ＶＣＡＭ−１、ＴＧＦ−βＲＩＩＩ、ＢＤＮＦ、ＨＣＣ、レプチン、ＩＧＦＢＰ−４、ＭＩＧおよびＭＰＩＦ−１量の増加を示すかどうかを判定すること、および被験者が、ＰＡＩ−１、ＤＤ５、ＤＤ６、Ｅｏｔ２、ＩＣＡＭ−１、ＭＭＰ−２、Ｐセレクチン、ＭＩＰ−１δ、ＥｏＴ２およびＴＡＲＣ量の減少を示すかどうかを判定することにより検知することができる。
ある実施例において、本方法は、被験者が、ＩＬ−１５、ｓＶＡＰ−１および表１０〜１１に挙げる分子の２つ以上の任意の組み合わせでの活性増加、例えば、表１０〜１１に挙げる分子の少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、または少なくとも１６における増加を示すかどうかを判定することを含む。表１０〜１１に挙げる分子の４つ以上の任意の組み合わせの活性の増加は、被験者のＯＡを示唆する。表１０〜１１のＯＡリスク関連分子の任意の１つは、ＯＡリスク関連分子（核酸またはタンパク質など）の組み合わせまたは下位の組み合わせを生成するために、表１０〜１１のＯＡリスク関連分子の任意の他の組み合わせと組み合わせることができる。
他の実施例において、本方法は、被験者が、表１２〜１３に挙げる少なくとも２つ以上の任意の分子と組み合わさるＰＡＩ−１の活性の減少、例えば、表１２〜１３に挙げる分子の少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つまたは少なくとも１０の減少、を示すかどうかを判定することを含む。表１２〜１３に挙げる分子の４つ以上の任意の組み合わせの活性の減少は、被験者の将来のＯＡの発症リスクの増加を示唆する。表１２〜１３のＯＡリスク関連分子の任意の１つは、ＯＡリスク関連分子（核酸またはタンパク質など）の組み合わせまたは下位の組み合わせを生成するために、表１２〜１３のＯＡリスク関連分子の任意の他の組み合わせと組み合わせることができる。
ある実施例において、被験者のＯＡリスク関連分子の活性量が、ＯＡでない、およびＯＡのリスクがないと予想される被験者のＯＡリスク関連分子の活性量など（タンパク質存在量または遺伝子発現量など）の基準値と比較され、表８および１０〜１３に挙げる１つ以上のＯＡリスク関連分子（表８および１０〜１３に挙げる、２つ以上、３つ以上、４つ以上のＯＡリスク関連分子など）の任意の組み合わせの活性の増加または減少は、被験者のＯＡ、または将来のＯＡ発現のリスクを示唆する。一実施例において、基準値は、同じ性別の被験者および試験被験者と同じ年齢範囲における、各標的ＯＡリスク関連分子の活性の範囲である。例えば、ｐ値≦０．０５または少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも１００％、または少なくとも４００％の変化規模など、試験被験者値と基準値間の統計上有意な差異は、試験被験者における分子の差次的活性を示唆する。
開示された方法は、差次的活性の存在が、被験者のＯＡ、またはＯＡ発症のリスクの増加を示唆する場合、損傷を回避または減少するために、被験者に治療を投与することをさらに含む。例えば、ＩＬ−１５またはｓＶＡＰ１を含む組み合わせなど、表８および１０〜１３に挙げる少なくとも２つ、少なくとも３つまたは少なくとも４つの他の分子と組み合わさる、少なくとも４つのＯＡリスク関連分子の活性の変化は、 被験者がＯＡ、またはＯＡを発症する恐れがあり、適切な治療の投与（顆粒球または抗炎症剤の投与など）を必要とするかもしれないことを示唆する。ある実施例において、被験者の差次的活性量が、ＯＡの恐れがない、またはＯＡでない被験者の活性の基準値（値の範囲など）と比較され、基準値と比較される表８および１０〜１３に挙げる、少なくとも４つのＯＡリスク関連分子の活性の有意な変化は、被験者が、ＯＡを治療または回避するための治療法から効果を得ることを示唆する。
ある特定の実施例において、差次的発現は、以下のＯＡを示唆する臨床的兆候および症状のオンセット後に検知される。このような兆候および症状の実施例は、これに制限されるものではないが、関節の痛み、関節の腫れ、関節の硬直、関節運動の制限、関節の変形、痛みを伴う関節のひび割れまたは「きしみ」（軋音）、および当該分野に精通した者により認識される関節の他の影響を含む。
一実施例において、分析される試験試料は、ＯＡリスク関連タンパク質を含む。特定の実施例において、差次的活性の検知は、試験被験者から得られた試料に存在する、少なくとも４つのＯＡリスク関連タンパク質量の定量化を含む。例えば、本方法は、試料の少なくとも４つのＯＡリスク関連タンパク質の量を測定することを含むことができ、ＯＡリスクのない被験者の、各少なくとも４つのＯＡリスク関連分子の基準値の量に対して、試料の少なくとも４つのＯＡリスク関連タンパク質量の差異は、少なくとも４つのＯＡリスク関連分子の差次的活性である。ある実施例において、被験者からの試料は、表８および１０〜１３に挙げるような、少なくとも４つの異なるＯＡリスク関連タンパク質を検知できる抗体を含むアレイなど、タンパク質を検知できるアレイに適用される。特定の実施例において、ローリングサークル増幅が、アレイ上で特異的に抗体に結合した試料からのタンパク質を検知および定量化するために使用される。
他の特定の実施例において、ＯＡリスク関連分子は、ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡ分子などの、単離されたＯＡリスク関連核酸分子を含む。単離された核酸分子は、例えば、核酸分子をアレイ、例えば、表８および１０〜１３に挙げる遺伝子など、少なくとも４つのＯＡリスク関連遺伝子に交雑可能なオリゴヌクレオチドプローブを含むアレイに接触することにより、検知および定量化されることができる。
また、本明細書で提供されるアレイは、ＯＡの評価ができる分子を含む。このようなアレイは、特定の実施例において、血清タンパク質を含む試料など、試料に存在するＯＡリスク関連核酸またはタンパク質の配列の定量化を可能にする。一実施例において、アレイは、表８および１０〜１３に挙げるタンパク質など、少なくとも４つのＯＡリスク関連タンパク質を認識する抗体を本質的に含む、または含む。特定の実施例において、アレイは、表８および１０〜１３のいずれかに挙げる、少なくとも４つのタンパク質、例えば、表８および１０〜１３のいずれかに挙げる５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４または３５のタンパク質の任意の組み合わせを認識する抗体を含む、または本質的に含む。ある実施例において、アレイは、１つ以上の対照抗体をさらに含む。このようなアレイを含むキットも開示される。
また、表８および１０〜１３に挙げる１つ以上の分子など、ＯＡリスク関連分子（例えば、遺伝子またはタンパク質）の活性（活性など）を変更する１つ以上の薬剤を同定する方法が、本開示で提供される。このような同定された分子は、抗骨関節炎薬剤の候補である。
所望するなら、複数の試験薬および複数のＯＡリスク関連分子を、同時にスクリーニングすることができる。一実施例において、本方法は、複数のＯＡリスク関連分子（表８、１０、１１、１２または１３に挙げる全てのＯＡリスク関連分子など）で、１つの試験薬の効果を同時にスクリーニングするのに使用される。他の実施例において、本方法は、表８および１０〜１３（例えば、ＩＬ−１５またはＰＡＩ−１）に挙げる分子の１つなど、１つのＯＡリスク関連分子で、複数の試験薬の効果をスクリーニングするのに使用される。特定の実施例において、同定された薬剤は、ＯＡの発症前またはＯＡの発症後に、上方制御または下方制御された、ＯＡリスク関連分子の活性を変更する。例えば、薬剤は、ＯＡ後に下方制御される（ＰＡＩ−１など）ＯＡリスク関連分子の活性を増加すること、またはＯＡ後に上方制御される（ＩＬ−２など）ＯＡリスク関連分子の活性を減少することなどにより、ＯＡ発症後に上方制御または下方制御されるＯＡリスク関連分子の活性を正常化できる。他の実施例において、薬剤は、ＯＡ発症前に下方制御される（Ｅｏｔ２など）ＯＡリスク関連分子の活性を増加すること、またはＯＡ発症前に上方制御される（ＩＬ−１５またはｓＶＡＰ−１など）ＯＡリスク関連分子の活性を減少することなどにより、ＯＡ発症前に上方制御または下方制御されるＯＡリスク関連分子の活性を正常化できる。開示された方法は、インビトロ（例えば、細胞培養で）またはインビボ（哺乳動物などで）で実施することができる。
一実施例において、試験薬は、ＯＡを治療するために、臨床試験前または臨床試験、または規制機関（食品医薬品局、ＦＤＡなど）により認可された薬剤である。例えば、本方法は、薬剤が、治療への反応を修正する１つ以上のＯＡリスク関連分子の活性を変更するかどうかを判定するために使用でき、最良の反応薬剤を予測できる。
他の実施例において、本方法は、炎症に対して効果的な薬剤など、薬剤の特定のクラスを同定するのに使用される。例えば、１つ以上の試験薬は、本明細書で開示された方法を使用してスクリーニングすることができ、ＩＬ−１５など、開示された炎症関連遺伝子（またはタンパク質）の差次的発現が測定される。１つ以上の開示された炎症関連分子の活性を変更する試験薬は、炎症の治療の候補である。
また、ＯＡである、または将来ＯＡを発症するリスクの増加を示す哺乳動物を治療する方法が、提供され、本方法は、哺乳動物への開示されたスクリーニング方法を使用して同定された薬剤の投与を含む。
上述および本開示の他の特徴は、以下のいくつかの実施形態の詳細な説明により、より明確になるだろう。
いくつかの態様の詳細な説明
略語および用語
以下の用語および方法に関する説明は、本発明をより良く説明し、本発明の実施に際して当業者を導くものである。単数形は、内容が明確に指示しない限り１つあるいは２つ以上を言及する。例えば、「ＯＡリスク関連分子を備える」という表現は、単数または複数のＯＡリスク関連分子を含み、「少なくとも１つのＯＡリスク関連分子を備える」という語句と同等にみなされる。「あるいは（または）」という用語は、内容が明確に示唆しない限り、述べられた代替要素の１つ、あるいは２つ以上の要素の組み合わせを言及する。本明細書で使用されるように、「備える」は「含む」を意味する。したがって、「ＡまたはＢを備える」は、追加要素を除外せずに「Ａ、ＢあるいはＡおよびＢを含む」という意味である。
説明されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明を所有する当業者が一般的に理解する意味を有する。本明細書で説明される方法および構成要素と類似あるいは同等の方法および構成要素が、本発明の実施あるいは試験に際して使用可能であるが、適切な方法および構成要素を以下に説明する。構成要素、方法および例は、実施例となるだけのものであり、制限するものではない。
ＯＡ：骨関節炎
ＲＣＡ：ローリングサークル型増幅
投与：任意の効果的な経路によって被験者に薬剤を与えること。投与の典型的経路として、経口、注射（関節内、皮下、筋内、皮内、腹腔内、静脈内など）、舌下、直腸、経皮（関節の真上あるいは全身のいずれか）、鼻内、膣内および吸入の経路があるが、これらに限定されない。
核酸分子を増幅する：例えば、ＯＡ関連遺伝子の領域などの、遺伝子あるいは遺伝子の断片などの核酸分子の転写数を増加する。得られた産物は増幅産物と称される。
インビトロでの増幅の一例として、試料中の核酸分子とのプライマーのハイブリダイゼーションを可能にする条件の下で、被験者から得られた生体試料が一対のオリゴヌクレオチドプライマーと接触するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）がある。プライマーは、適切な条件の下で延長され、鋳型から分離し、そして核酸分子の転写数を増幅するためにリアニール、延長、分離される。その他のインビトロ増幅法の例として、定量的リアルタイムＰＣＲ法、鎖置換増幅（ＵＳＰＮ５，７４４，３１１を参照）、転写なし等温増幅（ＵＳＰＮ６，０３３，８８１を参照）、修復連鎖反応増幅（ＷＯ９０／０１０６９を参照）、リガーゼ連鎖反応増幅（ＥＰ-Ａ-３２０ ３０８を参照）、ギャップ充填リガーゼ連鎖反応増幅（ＵＳＰＮ５，４２７，９３０を参照）、結合リガーゼ検知およびＰＣＲ（ＵＳＰＮ６，０２７，８８９を参照）、およびＮＡＳＢＡ（商標）ＲＮＡ転写なし増幅（ＵＳＰＮ６，０２５，１３４を参照）があげられる。
抗炎症剤：炎症を減らす、あるいは防ぐ薬剤。抗炎症剤は、１つ以上の鎮痛、解熱または抗炎症作用を有する。例えば、シクロオキシゲナーゼの非選択的抑制剤のように作用する非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）（アスピリン、イブプロフェン、ナプロキセン、エトドラク、フェノプロフェンカルシウムなど）、あるいはシクロオキシゲナーゼ-２（ＣＯＸ-２）またはＣＯＸ-３を選択的に阻害する非ステロイド性抗炎症薬があるが、これらに限定されない。抗炎症剤の投与は、ＯＡの治療の一つであり、例えば、患部関節の疼痛および膨れを軽減する。ＯＡの治療に使用される他の薬剤には、グルコサミンおよびコンドロイチン硫酸およびそれらの誘導体、カスパーゼ、テトラサイクリン誘導体、マトリックスメタロプロテイナーゼおよびＩＬ-１の抑制剤および調節剤（ＩＬ-１変換酵素阻害薬など）、誘導型一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）、Ｐ３８、ＭＥＫ-１／２、およびペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（ＰＰＡＲ）がある。
アレイ：生体高分子（タンパク質または核酸分子など）または生体試料（組織切片など）などの、基盤上あるいは基盤内のアドレス可能な記憶場所にある分子の配列。「マイクロアレイ」は、評価あるいは分析のために、顕微鏡検査を必要とする、または使用できるように小型化されたアレイである。
分子（「特徴」）のアレイによって、試料に対して一度に多数の分析が可能となる。特定のアレイの例において、１つ以上の分子（オリゴヌクレオチドプローブまたは抗体など）は、例えば、内部制御を提供するために、複数回（２回など）アレイ上で発生する。アレイ上のアドレス可能な記憶場所の数は変化し、例えば、少なくとも４から少なくとも１０、少なくとも１６、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも５０、少なくとも７５、少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも５００、少なくとも１，０００、少なくとも１０，０００、あるいはそれ以上となる。
アレイ内では、各配列された試料の位置がアレイの少なくとも二次元の中で確実かつ一様に判定可能であるという点で、各配列された試料はアドレス可能である。アレイの特徴適用位置は、異なる形が想定可能である。例えば、アレイは規則的（均一な行および列に配列されているなど）、あるいは不規則的である。したがって、秩序アレイにおいて、各試料の位置は、アレイに適用される際に試料に割り当てられ、適切な標的または特徴位置と各位置を相互に関連付けるために、鍵が与えられる場合がある。多くの場合、秩序アレイは、左右対称の格子図形で配列されるが、試料は他の図形で配列されることがある（放射状に分布された線、渦巻線、または秩序クラスターなど）。アドレス可能なアレイは、コンピュータがその位置にある試料に関する情報（例えば、信号強度などを含むハイブリダイゼーションまたは結合データ）とアレイ上の特定のアドレスを相互に関連付けるようプログラミングされるという点において、通常、コンピュータに読み込み可能である。コンピュータに読み込み可能な形式のいくつかの例では、アレイの個々の特徴は、例えば、デカルト格子図形で規則的に配列され、コンピュータによってアドレス情報と相互に関連付けられる。
タンパク質に基づくアレイには、タンパク質である、あるいはタンパク質を含むプローブ分子、または標的分子がタンパク質である、あるいはタンパク質を含む場所、およびタンパク質が結合した核酸などのアレイ、またはその逆のものがある。いくつかの例において、アレイには、例えば、表８および１０〜１３に挙げられるタンパク質の少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１４、少なくとも１６、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、または少なくとも３５のタンパク質など、例えば、表８および１０〜１３に挙げられる少なくとも４つの抗体の組み合わせなどの、特にＯＡリスク関連タンパク質と結合する抗体が含まれる。
アレイには、例えば、約１５〜４０ヌクレオチドの長さの、長さ少なくとも１５ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド配列などの核酸分子が含まれる。ある例では、アレイは、例えば、表８および１０〜１３に挙げられる少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１４、少なくとも１６、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、または少なくともの配列など、例えば、表８および１０〜１３に挙げられる少なくとも４つのオリゴヌクレオチドプローブあるいはプライマーの任意の組み合わせなどの、ＯＡリスク関連配列を検知するために使用可能なオリゴヌクレオチドプローブあるいはプライマーを含む。
結合または特異結合：核酸分子の他の核酸分子（またはそれ自体）へのハイブリダイゼーションなどの、２つの物質あるいは分子間での連関、抗体のペプチドとの連関、あるいはタンパク質の他のタンパク質または核酸分子との連関。
オリゴヌクレオチド分子は、十分な量のオリゴヌクレオチド分子が塩基対を形成、またはその標的核酸分子にハイブリダイズされる場合、標的核酸分子に結合、あるいは安定的に結合し（ＯＡリスク関連ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡなど）、その結合の検知を可能にする。結合は、例えば、標的（オリゴヌクレオチド複合体）の物理的または機能的特性によって、当業者に周知の任意の方法で検知可能である。例えば、結合は、結合が遺伝子の発現、ＤＮＡ複製、転写、翻訳などの生合成過程で観察可能な影響を有するかどうかを判定することによって、機能的に検知可能である。核酸分子の相補鎖の結合を検知する物理的方法には、ｓＤＮａｓｅIあるいは化学的フットプリント法、ゲルシフトおよび親和性切断アッセイ、ノーザンブロット法、ドットブロット法および光吸収検知法があるが、これらに限定されない。例えば、その方法には、検知可能なラベルなどの、一方あるいは両方の核酸分子に存在する信号の検知が含まれる。
抗体は、標的タンパク質のみと実質的に結合し、標的タンパク質を含む試料中の他のタンパク質と実質的に結合しない場合、標的タンパク質（ＯＡリスク関連タンパク質など）と特異的に結合する。そのような特異性は、ウエスタンブロット法、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、免疫拡散法、インサイチュー免疫学的検定（例えば、コロイド金、酵素またはラジオアイソトープラベルを使用して）、凝集反応、免疫電気泳動法、放射性アレルギー吸着試験（ＲＡＳＴ）、蛍光顕微鏡法、フローサイトメトリー、グリッド、ドット、組織ブロットおよびオイルゲージ法、あるいは抗体アレイなどの当技術分野において周知の方法を使用して判定可能である。
骨関節炎の臨床的適応：ＯＡの被験者に伴う１つ以上の徴候あるいは症状。特定例として、疼痛（一般的に手、腰、膝または足、時々、背骨）、関節の圧痛および偶発的膨れ、長い非活動時間（睡眠後の朝あるいは長時間座った後）後の凝り（例えば、１時間以内で続く）、関節の制限された動き、関節の変形（通常、骨関節炎の後期）、疼痛を伴う関節の亀裂または「きしみ」（捻髪音）、および当業者によって認識される関節に及ぶ影響があるが、これらに限定されない。
相補性および相補性の割合：相補的核酸を有する分子は、ワトソンクリック型、フーグスティーン型あるいは逆フーグスティーン型塩基対を形成することよって、鎖がお互いに結合する（ハイブリダイズ）際に、安定した二本鎖あるいは三本鎖を形成する。オリゴヌクレオチド分子が、検知可能な程度で、所要の条件の下で標的核酸配列と結合したままである場合、安定した結合が生じる。
相補性とは、１つの核酸の塩基が、第二の核酸の鎖の塩基（例えば、ＯＡリスク関連核酸分子にハイブリダイズすることが可能な、アレイ上の核酸分子など）を有する塩基対（被験者から得られた核酸分子など）を残す程度を表す。相補性は割合で表され、すなわち２つの鎖間または２つの鎖の特定領域や範囲内に塩基対を形成するヌクレオチドの比率を表す。例えば、１５-ヌクレオチドオリゴヌクレオチドの１０ヌクレオチドが、核酸分子の目標とされた領域を有する塩基対を形成する場合、そのオリゴヌクレオチドは、核酸の領域に対して６６．６７％の相補性が目標となると言われる。
本発明において、「十分な相補性」とは、検知可能な結合を達成するために、オリゴヌクレオチド分子および標的核酸配列（例えば、表８および１０〜１３に挙げられる任意の配列などの、ＯＡリスク関連配列など）の間には十分な数の塩基対が存在するということを意味する。形成された塩基対の割合で表示または測定される場合、この目標を達成する相補性の割合は、最低約５０％の相補性から完全な（１００％）相補性まで変動可能である。一般的に、十分な相補性は、例えば、少なくとも約７５％の相補性、少なくとも約９０％の相補性、少なくとも約９５％の相補性、少なくとも約９８％の相補性、あるいは少なくとも約１００％の相補性など、少なくとも約５０％である。
当業者が所望の条件での使用に適切なオリゴヌクレオチドを設計できるようにする結合条件の確立に関わる定性的および定量的考慮の徹底的な治療は、Ｂｅｌｔｚらによって提供される。Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１００：２６６-２８５、１９８３、およびＳａｍｂｒｏｏｋら（編集）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第二版、１〜３巻、コールドスプリングハーバー研究所プレス（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク州、１９８９。
ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）：ほとんどの生体の遺伝物質を含む長い鎖状重合体（リボ核酸、ＲＮＡを含む遺伝子を有するウイルスもある）。ＤＮＡ重合体の繰り返し単位は、４つの異なるヌクレオチドであり、それぞれ、リン酸基が付着するデオキシリボース糖と結合するアデニン、グアニン、シトシンおよびチミンの４つの塩基のうち１つを含む。コドンと称される、ＤＮＡ分子中のヌクレオチドのトリプレットは、ペプチドにあるアミノ酸をコードする。
特異的活性：増減などの、遺伝子（ＯＡリスク関連遺伝子など）のメッセンジャーＲＮＡへの発現、ｍＲＮＡのタンパク質への変換、タンパク質の生物活性、タンパク質の量における差異、またはその組み合わせ。いくつかの例において、差異は、現在ＯＡではない被験者またはＯＡを発症する危険性がない被験者において予期される遺伝子発現あるいはタンパク質提示の量、またはＯＡである、あるいは将来、ＯＡを発症する危険性がある被験者において予期される量などの、対照あるいは基準値と相対的である。特異的活性の検知には、遺伝子発現の変化の測定が含まれる。具体例では、特異的活性の検知には、タンパク質提示の相対量の判定が含まれる。
特異的活性判定のための、試料に対する比較用の対照あるいは基準は、場合により任意で設定されるかもしれないが、検査値のみならず、正常と思われる試料（例えば、ＯＡではない被験者あるいはＯＡを発症する危険性がない被験者からの試料など、所望の特徴を有するよう改変されていないという点で）も含まれるが、それらの値は実験室によって異なるということを留意しなければならない。実験室基準および基準値は、周知あるいは決められた母集団値に基づいて設定可能であり、測定され実験的に決定した値の比較を可能にするグラフまたは表の形式において提供可能である。
下方制御した、または不活性化：タンパク質の発現あるいは生物活性に関連して使用される場合、タンパク質の生物活性を低下させる任意の過程のみならず、タンパク質の産出を低下させる任意の過程（例えば、遺伝子の転写またはｍＲＮＡの翻訳の低下）も言及する。
転写を低下させる過程の例として、転写開始複合体の低下を促進する過程、転写開始率を低下させる過程、転写伸長速度を低下させる過程、転写過程を低下させる過程、および転写抑制を低下させる過程が挙げられる。遺伝子の下方制御には、既存のレベルを超える発現の低下が含まれる。翻訳を低下させる過程の例として、翻訳開始を低下させる過程、翻訳伸長を低下させる過程、およびｍＲＮＡ安定性を低下させる過程が挙げられる。タンパク質の活性を低下させる過程の例として、タンパク質を分解する過程、あるいは１つ以上の標的と相互に作用するために、タンパク質の能力を妨害する過程が挙げられる。
遺伝子の下方制御には、ＯＡリスク関連遺伝子産物などの遺伝子産物の産出における任意の検知可能な低下が含まれる。特定例において、遺伝子産物の産出は、対照（同種の正常細胞における遺伝子発現の量など）と比べて、例えば、少なくとも５倍、または少なくとも１０倍など、少なくとも４倍に低下する。一例では、対照は、現在ＯＡではない被験者あるいはＯＡの危険性が検知されない被験者の、血清などの生体試料における遺伝子発現またはタンパク質発現の相対量である。
タンパク質の下方制御あるいは不活性化は、ＯＡリスク関連タンパク質などの、タンパク質における任意の検知可能な低下を含む。一例では、検知可能なＯＡリスク関連タンパク質の量は、対照（同種の正常細胞における同一タンパク質の量など）と比べて、例えば、少なくとも５倍、または少なくとも１０倍など、少なくとも４倍に低下する。一例において、対照は、現在ＯＡではない被験者あるいはＯＡの危険性が検知されない被験者の、血清などの生体試料でのタンパク質提示の相対量である。
骨関節炎を評価する：例えば、被験者がＯＡを患っているかどうか（膝や手など）を判定し、被験者が将来、ＯＡを発症する危険性が高いかどうかの判定、ＯＡの診断の確認、被験者のＯＡの重症度の判定、ＯＡを有する被験者の起こり得る回復、ＯＡを有する被験者、あるいはＯＡを発症する危険性が高い被験者に対する適切な治療の判定、被験者のＯＡの進行度の把握などのため、あるいはその組み合わせのために、被験者のＯＡの状態を判定する。
発現：タンパク質合成など、遺伝子のコード化された情報が細胞の使用可能、使用不可能または構造上の部分に変換される過程。
遺伝子発現プロファイル（フィンガープリント）：差次的または変化した遺伝子発現は、遺伝子発現（ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡなど）の検知可能な量の変化、あるいはそれらの遺伝子によって発現したタンパク質の検知可能な量の変化によって検知可能である。例えば、ＥＳＴなどの、明確な一連の遺伝子や遺伝子を指標とする核酸の高発現および低発現のパターンなどの、遺伝子発現の識別可能あるいは特定可能なパターンであり、いくつかの例において、わずか１つあるいは２つの遺伝子はプロファイルを提供するが、それ以上の遺伝子がプロファイルにおいて使用される場合があり、例えば、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも８、少なくとも１０、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１８、少なくとも２０、少なくとも２５、あるいは少なくとも３０またはそれ以上の遺伝子である。遺伝子発現プロファイル（フィンガープリントとも称される）は、組織や細胞の種類（血清など）、正常な組織増殖または疾患の増悪（ＯＡなど）の特定の段階、あるいは予見可能な形で遺伝子発現に影響を与える任意の他の識別可能または特定可能な条件と関連可能である。遺伝子発現プロファイルには、特定の遺伝子の絶対的発現レベルのみならず、相対的なものが含まれ、基準または対照の試料プロファイル（ＯＡではない被験者の試料など）と比べると、試験試料の内容において見ることができる。一例において、被験者における遺伝子発現プロファイルは、アレイ（核酸またはタンパク質アレイなど）によって判定される。
ハイブリダイゼーション：ＤＮＡ、ＲＮＡの２つの鎖の相補的領域の間、またはＤＮＡとＲＮＡの間に塩基対を形成し、それによって、例えば、被験者から得られた核酸分子とＯＡリスク関連核酸分子の間に二本鎖分子を形成するなど、二本鎖分子を形成する。特有のストリンジェンシーをもたらすハイブリダイゼーション条件は、ハイブリダイゼーション方法の性質、ハイブリダイゼーションする核酸配列の構成および長さによって異なる。一般的に、ハイブリダイゼーション温度およびハイブリダイゼーション緩衝液のイオン強度（Ｎａ＋濃度など）が、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを判定する。特有のストリンジェンシーに到達するためのハイブリダイゼーション条件に関する計算は、Ｓａｍｂｒｏｏｋらの（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、第二版、コールドスプリングハーバー研究所プレス（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、プレーンヴュー、ニューヨーク州（第９章および１１章）で検討されている。以下は、一連のハイブリダイゼーション条件例であるが、これに限定するものではない。
非常に高いストリンジェンシー（９０％の同一性を占める配列を検知する）
ハイブリダイゼーション：５ｘＳＳＣ、６５度で１６時間
洗浄２回：２ｘＳＳＣ、それぞれ室温（ＲＴ）で１５分
洗浄２回：０.５ｘＳＳＣ、それぞれ６５度で２０分
高いストリンジェンシー（８０％以上の同一性を占める配列を検知する）
ハイブリダイゼーション：５ｘ〜６ｘＳＳＣ、６５度〜７０度で１６〜２０時間
洗浄２回：２ｘＳＳＣ、それぞれＲＴで５〜２０分
洗浄２回：１ｘＳＳＣ、それぞれ５５度〜７０度で３０分
低いストリンジェンシー（５０％を超える同一性を占める配列を検知する）
ハイブリダイゼーション：６ｘＳＳＣ、ＲＴ〜５５度で１６〜２０時間
少なくとも２回の洗浄：２ｘ〜３ｘＳＳＣ、ＲＴ〜５５度それぞれ２０〜３０分
インターロイキン（ＩＬ）-１５：生得の適応免疫システムに関与する多面性炎症性サイトカイン。ＩＬ-１５は、T細胞、好中球およびマクロファージの活性化を促進し、炎症性サイトカインＩＬ-１７、ＩＬ-６および腫瘍壊死因子の産出を誘導する。いくつかの例において、ＩＬ-１５は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の発達、ホメオスタシス、機能および生存にとって不可欠である。
ＩＬ-１５という用語は、任意のＩＬ-１５遺伝子、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、あるいは任意の生物からのタンパク質、すなわち、Ｔ細胞、好中球およびマクロファージを活性化するＩＬ-１５を含む。ＩＬ-１５配列は、公的に入手可能である。例えば、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏｓ：それぞれＹ０９９０８およびＣＡＡ７１０４４公開ヒトＩＬ-１５核酸およびタンパク質配列、およびＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏｓ：それぞれＵ１４３３２およびＡＡＡ７５３７７公開マウスＩＬ-１５核酸およびタンパク質配列がある。
一例において、ＩＬ-１５配列には、ＩＬ-１５対立遺伝子多型、変異型、断片、ホモログあるいはＴ細胞、好中球およびマクロファージを活性化する能力を保持する融合配列のみならず、完全長野生型（または自然型）配列も含まれる。ある例では、ＩＬ-１５は、自然型ＩＬ-１５に対して、例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、あるいは少なくとも９８％など、少なくとも８０％の配列同一性を有する。他の例では、ＩＬ-１５は、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｙ０９９０８またはＵ１４３３２に記述されている配列に、非常に高いストリンジェンシー条件（例えば、上記を参照）の下でハイブリダイズし、ＩＬ-１５活性を保持する配列を有する。さらに他の例では、ＩＬ-１５タンパク質は、ＩＬ-１５抗体と結合可能な配列を有する。
単離された：「単離された」生物学的要素（核酸分子、タンパク質あるいは細胞など）は、他の染色体および染色体外ＤＮＡおよびＲＮＡ、タンパク質および細胞などの、要素が自然に発生する生物の細胞あるいは生物自体にある他の生物学的要素から実質的に分離、あるいは精製されている。「単離された」核酸分子およびタンパク質は、標準的な精製法によって精製された核酸分子およびタンパク質を含む。この用語は、化学的に合成した核酸分子およびタンパク質のみならず、宿主細胞での組み換え発現によって精製された核酸分子およびタンパク質も含む。一例において、生物学的要素は、例えば、被験者から得られた血清検体などの、被験者から単離された血清である。
ラベル：例えば、ＥＬＩＳＡ、分光光度法、フローサイトメトリー、あるいは顕微鏡法などで検知可能な薬剤である。例えば、ラベルは核酸分子またはタンパク質に付着可能で（直接的または間接的に）、それによって核酸分子またはタンパク質の検知を可能にする。ラベルの例として、放射性同位体、酵素基盤、共同因子、リガンド、化学発光薬、蛍光プローブ、ハプテン、酵素、およびその組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。ラベリング法および様々な目的に適切なラベルの選択指導は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋらの研究（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク州、１９８９）およびＡｕｓｕｂｅｌらの研究（Ｉｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ〈Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ&Ｓｏｎｓ〉、ニューヨーク州、１９９８）において検討されている。
マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）-７：細胞外基質に作用可能な分泌性プロテアーゼ、および、それによって細胞移動および組織修復を調整する。また、当業者ではマトリリシンと称される。いくつかの例において、ＭＭＰ-７はタンパク質分解的にプロデフェンシンなどの抗菌性ペプチドを活性化する。
ＭＭＰ-７という用語は、任意のＭＭＰ-７遺伝子、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡあるいは任意の生物からのタンパク質および細胞移動および組織修復を調整するよう機能するＭＭＰ-７であるタンパク質を含む。ＭＭＰ-７配列は、公的に入手可能である。例えば、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏｓ：それぞれＡＹ７９５９７２およびＡＡＶ４０８３９公開ヒトＭＭＰ-７核酸およびタンパク質配列、およびＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏｓ：それぞれＮＭ＿０１０８１０およびＮＰ＿０３４９４０公開マウスＭＭＰ-７核酸およびタンパク質配列がある。
一例において、ＭＭＰ-７配列には、ＭＭＰ-７対立遺伝子多型、変異型、断片、ホモログあるいは細胞移動および組織修復を調整する能力を保持する融合配列のみならず、完全長野生型（または自然型）配列も含まれる。ある例では、ＭＭＰ-７は、自然型ＭＭＰ-７に対して、例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、あるいは少なくとも９８％などの、少なくとも８０％の配列同一性を有する。他の例では、ＭＭＰ-７は、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＹ７９５９７２またはＮＭ＿０１０８１０に記述されている配列に、非常に高いストリンジェンシー条件（例えば、上記を参照）の下でハイブリダイズし、ＭＭＰ-７活性を保持する配列を有する。さらに他の例では、ＭＭＰ-７タンパク質は、ＭＭＰ−7抗体と結合可能な配列を有する。
核酸アレイ：ｃＤＮＡアレイで見られるアレイあるいはオリゴヌクレオチドアレイなど、基質上に割り当てられた位置にある核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡなど）の配列。
核酸分子：ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ゲノムのＤＮＡおよび合成の（例えば、化学的に合成した）ＤＮＡを含むがこれに限定されない、デオキシリボヌクレオチドあるいはリボヌクレオチド重合体。核酸分子は、二本鎖あるいは一本鎖になり得る。一本鎖の場合、核酸分子は、センス鎖あるいはアンチセンス鎖になり得る。さらに、核酸分子は円形または直線になり得る。
本発明は、例えば、表８および１０〜１３に挙げられるタンパク質をコード化する分子などの、ＯＡリスク関連ヌクレオチド配列の特定された長さを含む単離された核酸分子を含む。そのような分子には、これらの配列の少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、あるいはそれ以上の連続したヌクレオチドが含まれ、ＯＡリスク関連核酸分子の任意の領域から取得可能である。
ヌクレオチド：ピリミジン、プリンまたはその合成類似化合物などの糖に結ばれた塩基、あるいはペプチド核酸（ＰＮＡ）に見られるようなアミノ酸に結ばれた塩基を含む単量体が含まれるが、これらに限定されない。ヌクレオチドは、ポリヌクレオチドにある１つの単量体である。ヌクレオチド配列は、ポリヌクレオチドにある塩基の配列を言及する。
オリゴヌクレオチド：長さ約６〜約３００ヌクレオチドの間の、自然型リン酸ジエステル結合によって結合した複数の結合ヌクレオチド。オリゴヌクレオチド類似体は、オリゴヌクレオチドと同様の機能をする構成部分を言及するが、非自然的に発生する部分を有する。例えば、オリゴヌクレオチド類似体には、ホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドなどの、変化した糖成分あるいは糖質間の連鎖など、非自然的に発生する部分が含まれる。
特定のオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド類似体には、少なくとも６ヌクレオチド、例えば、少なくとも８、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも１００、あるいは少なくとも２００ヌクレオチドの長ささえ、あるいは約６〜約５０ヌクレオチドなど、例えば１２、１５、または２０ヌクレオチドなどの約１０〜２５ヌクレオチドの、ＯＡリスク関連核酸配列（ＤＮＡあるいはＲＮＡなど）の、長さ約２００ヌクレオチドまでの直線配列が含まれる。
オリゴヌクレオチドプローブ：分子雑種形成によって相補配列の存在を検知するために使用される、長さ少なくとも８、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２５、あるいは少なくとも３０ヌクレオチドなどの、ヌクレオチドの短配列。特定例において、オリゴヌクレオチドプローブは、オリゴヌクレオチドプローブ：標的配列ハイブリダイゼーション複合体の検知を可能にするラベルを含む。例えば、オリゴヌクレオチドプローブは、ＯＡリスク関連核酸分子の存在を検知するために使用可能である。
骨関節炎：骨がお互いに擦れ合うまで、軟骨の進行性破壊を引き起こす関節軟骨の疾患。これは、組織および下層の骨に損傷を与え、骨関節炎の痛みを伴う関節症状を引き起こす。骨関節炎は、最も多く見られる形の関節炎であり、指、腰、膝、足あるいは背骨の関節に多く影響を与える。
骨関節炎リスク：膝または手のＯＡなど、被験者が現在ＯＡであるという可能性、あるいは将来、ＯＡを発症する可能性。
骨関節炎リスク関連（または連関）分子：ＯＡの影響を受ける活性（ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡの発現、あるいはタンパク質の量など）を有する分子。そのような分子は、例えば、核酸配列（ＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡなど）およびタンパク質を含む。具体例として、活性がＯＡの存在あるいはＯＡ発症の危険性に反応して変化した（上方制御した、または下方制御した、など）完全長遺伝子、ｃＤＮＡあるいはｍＲＮＡ（および、それによってコード化したタンパク質）の断片のみならず、表８および１０〜１３に挙げられる分子がある。
活性がＯＡに反応して上方制御されたＯＡリスク関連分子の例として、ＩＬ-１５、ｓＶＡＰ-１およびＭＭＰ-７がある。ＯＡの発症以前に、活性が下方制御したＯＡリスク関連分子の例として、ＰＡＩ-１、ＤＤ５、ＤＤ６、Ｅｏｔ２、ＩＣＡＭ-１、ＭＭＰ-２およびＰ-セレクチンがある。
ＯＡリスク関連分子は、原因となる（ＯＡリスク関連分子の変化が、ＯＡの発症あるいは進行となるという点において）あるいは結果となる（ＯＡの発症あるいは進行が、ＯＡリスク関連分子の変化となるという点において）など、多くの違った意味で、ＯＡに関与したり影響を受けたりすることがある。
プラスミノーゲンアクチベーター阻害剤（ＰＡＩ）-１：インビボのプラスミノーゲン活性化の主要な生理学的阻害剤であるセリンプロテイナーゼ阻害剤であるので、線溶系の主要な調節因子である。特定例において、ＰＡＩ-１は、創傷治癒、アテローム性動脈硬化、代謝障害（肥満およびインスリン抵抗性など）、腫瘍の血管新生、慢性ストレス、骨再形成、ぜんそく、関節リウマチ、線維症、糸球体腎炎および敗血症において機能的役割を果たす。
ＰＡＩ-１という用語は、任意のＰＡＩ-１遺伝子、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、あるいは任意の生物からのタンパク質、すなわち、プラスミノーゲンアクチベーターを低下または阻害するＰＡＩ-１を含む。ＭＭＰ-７配列は、公的に入手可能である。例えば、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏｓ：それぞれＸ０４７４４およびＣＡＡ２８４４４公開ヒトＰＡＩ-１核酸およびタンパク質配列、およびＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏｓ：それぞれＭ３３９６０およびＡＡＡ３９８８７公開マウスＰＡＩ-１核酸およびタンパク質配列がある。
一例において、ＰＡＩ-１配列は、ＰＡＩ-１対立遺伝子多型、変異型、断片、ホモログあるいは、プラスミノーゲンアクチベーターを低下あるいは阻害する能力を保持する融合配列のみならず、完全長野生型（または自然型）配列も含まれる。ある例では、ＰＡＩ-１は、自然型ＰＡＩ-１に対して、例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、あるいは少なくとも９８％など、少なくとも８０％の配列同一性を有する。他の例では、ＰＡＩ-１は、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｘ０４７４４またはＭ３３９６０に記述されている配列に、非常に高いストリンジェンシー条件の下でハイブリダイズし、ＰＡＩ-１活性を保持する配列を有する。さらに他の例では、ＰＡＩ-１タンパク質は、ＰＡＩ-１抗体と結合可能な配列を有する。
プライマー：例えば、１２、１５、２０、２５、３０または５０ヌクレオチド、あるいはそれ以上の長さの、長さ１０〜１００ヌクレオチドのＤＮＡオリゴヌクレオチドなどの短い核酸分子。プライマーは、プライマーと相補標的ＤＮＡ鎖（ＯＡリスク関連ＤＮＡなど）の間にハイブリッドを形成するために、核酸雑種形成によって相補的標的ＤＮＡ鎖にアニール可能である。プライマー対は、ＰＣＲまたは当技術分野で周知の他の核酸増幅法などによって、核酸配列の増幅に使用可能である。
核酸プライマーの調製法および使用法は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、ＣＳＨＬ、ニューヨーク州、１９８９）、Ａｕｓｕｂｅｌら（編集）（Ｉｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ〈Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ&Ｓｏｎｓ〉、ニューヨーク州、１９９８）、およびＩｎｎｉｓら（ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、アカデミックプレス社〈Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．〉、サンディエゴ、カリフォルニア州、１９９０）で記載される。ＰＣＲプライマー対は、例えば、Ｐｒｉｍｅｒ（Ｖｅｒｓｉｏｎ ０．５、（著作権）１９９１、ホワイトヘッド研究所〈Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ〉、ケンブリッジ、マサチューセッツ州）など、その用途に適したコンピュータプログラムなどを使用して、周知の配列から派生可能である。当業者は、特定のプライマーの特異性の長さに伴う増加を高く評価するであろう。したがって、例えば、ＯＡリスク関連核酸配列の３０の連続したヌクレオチドを含むプライマーは、１５ヌクレオチドのみの対応するプライマーより高い特異性を有する、指定されたＯＡリスク関連分子の他のホモログなどの標的配列にアニールする。そのため、より高い特異性を得るために、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、あるいはそれ以上連続したＯＡリスク関連ヌクレオチド配列を含むプライマーが、選択可能である。
タンパク質：少なくとも１０のアミノ酸を含む配列などの、アミノ酸の重合体。本発明は、例えば、表８および１０〜１３に挙げられるタンパク質など、ＯＡリスク関連タンパク質の完全長または断片を含むタンパク質を含む。
タンパク質（またはペプチド）アレイ：ＲＣＡタンパク質チップにおいて見られるアレイなど、基質上で割り当てられた位置にあるタンパク質（抗体など）の配列。そのようなアレイは、血清試料中のＯＡリスク関連タンパク質の量など、試料中にある１つ以上のタンパク質の量を同定および定量化するために使用可能である。
精製した：「精製した」という用語は、必ずしも完全な純度を意味するものではなく、むしろ、相対語としての目的を持つ。したがって、例えば、精製したタンパク質製剤は、言及されるタンパク質が、細胞内の自然な状態にあるタンパク質より高い純度のタンパク質であるタンパク質製剤のことである。例えば、タンパク質製剤は、タンパク質が製剤の総タンパク量の少なくとも５０％に相当するよう精製される。同様に、精製したオリゴヌクレオチド製剤は、オリゴヌクレオチドが、オリゴヌクレオチドの複合混合物を含む状態の製剤より高い純度である製剤のことである。さらに、精製した血清試料は、血清が、血清検体に存在する他の構成要素から実質的に分離している血清試料のことである。
ローリングサークル型増幅（ＲＣＡ）：配列が１つ以上の抗体を通してＯＡリスク関連分子に付着するなどの、核酸配列の複転写を発生させる過程（等温過程など）であり、産物の蓄積が時間とともに直線的に進行する。例となる方法は、本明細書で記載されており、さらに、ＫｉｎｇｓｍｏｒｅおよびＰａｔｅｌ（Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ、１４：７４-８１、２００３、およびＰｅｒｌｅｅら、Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｓｃｉ．、２：９、２００４）において公開されている。
試料：被験者から得られた、ゲノムのＤＮＡ、ＲＮＡ（ｍＲＮＡなど）、タンパク質あるいはその組み合わせを含む生物検体。例として、血清または血漿、尿、唾液、組織生検、外科標本、滑液、脳脊髄液および剖検材料など、末梢血あるいはその副構成要素があるが、これらに限定されない。ある具体例においては、試料は血清であり、あるいは血清を含む。
可溶性血管付着タンパク質（ＶＡＰ）-１（ｓＶＡＰ-１）：血液（または血清など、その画分）中に見られる血管付着タンパク質（ＶＡＰ）の型。ｓＶＡＰは、組織への血液循環からの運搬を促進するために、リンパ球および顆粒球を内皮細胞に付着する炎症誘導細胞の表面分子である。
ｓＶＡＰ-１という用語は、任意のｓＶＡＰ-１遺伝子、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、あるいは任意の生物からのタンパク質、すなわち、リンパ球および顆粒球を内皮細胞に付着可能なｓＶＡＰ-１を含む。ｓＶＡＰ-１は、タンパク質分解切断によるＶＡＰ-１の膜貫通型から派生したと考えられる（例えば、Ｋｕｒｋｉｊａｒｖｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６１：１５４９-５７、１９９８を参照）。ＶＡＰ-１の膜貫通および細胞質領域の欠失は、ＶＡＰ-１の分子量の約２ｋＤａのみの低下を引き起こす。ＶＡＰ-１配列は、公的に入手可能である。例えば、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏｓ：それぞれＮＭ＿００３７３４およびＮＰ＿００３７２５公開ヒトＶＡＰ-１核酸およびタンパク質配列、およびＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏｓ：それぞれＡＦ０７８７０５およびＡＡＣ３５８３９公開マウスＶＡＰ-１核酸およびタンパク質配列がある。
一例において、ｓＶＡＰ-１配列は、ｓＶＡＰ-１対立遺伝子多型、変異型、断片、ホモログあるいは、リンパ球および顆粒球を内皮細胞に付着する能力を保持する融合配列のみならず、完全長野生型（または自然型）配列も含む。ある例では、ｓＶＡＰ-１は、自然型ｓＶＡＰ-１に対して、例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％あるいは９８％など、少なくとも８０％の配列同一性を有する。他の例では、ｓＶＡＰ-１は、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．：ＮＭ＿００３７３４またはＡＦ０７８７０５に記述されている配列に、非常に高いストリンジェンシー条件の下でハイブリダイズし、ｓＶＡＰ-１活性を保持する配列を有する。さらに他の例では、ｓＶＡＰ-１タンパク質は、ｓＶＡＰ-１抗体と結合可能な配列を有する。
被験者：人間および人間以外の哺乳動物を含むカテゴリーである、生きている多細胞脊椎生物。
試験薬：タンパク質（抗体など）、核酸分子、有機化合物、無機化合物、あるいは関与する他の分子などの、任意の物質であるが、これらに限定されない。特定例において、試験薬は、細胞膜を通過可能である（単独または担体の存在の下）。
治療的有効量：単独または薬学的に容認可能な担体や１つ以上の追加治療薬とともに、所望の反応を誘導する医用調製物の量。抗炎症剤（非ステロイド性抗炎症薬、ＮＳＡＩＤなど）、カプサイシンあるいはグルコサミン治療薬などの抗炎症剤は、治療的有効量で投与される。
治療薬の有効量は、ＯＡの軽減あるいはＯＡの被験者の生理的状態の改善のための検査など、多くの異なる方法で判定可能である。有効量も、様々なインビトロ、インビボまたはインサイチューアッセイによって判定可能である。
治療薬は、例えば、治療の間、１日１回などの、単回投与または反復投与で投与可能である。しかしながら、有効量は、適用される起源、治療を受ける被験者、治療を受ける状態の重症度および種類、および投与方法によることがある。
一例において、被験者のＯＡの症状を部分的または完全に軽減するに十分な量である。治療は、ＯＡの進行を一時的に遅くするだけであるが、恒久的にＯＡの進行を停止あるいは後進することも可能である。例えば、医用調製物は１つ以上のＯＡの症状を軽減することができ、医用調製物の非使用と比較して、例えば、少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも９０％、少なくとも９８％、あるいは少なくとも１００％、症状を軽減することが可能である。
疾患を治療する：「治療」は、ＯＡの兆候あるいは症状などの、疾患の兆候あるいは症状または病態を改善する治療的介入を言及する。治療は、ＯＡなどの状態の寛解または回復の誘導も可能である。特定例において、治療は、例えば、疾患の完全な発症を抑制するなど、ＯＡの発症防止などの疾患の防止を含む。疾患の防止は、必ずしも疾患が完全に存在しなくなることを意味するわけではない。例えば、少なくとも５０％の低減でも十分である。
十分な条件の下で：所望の活性を可能にする任意の環境を記載するために使用される表現。
一例において、低酸素状態での細胞の培養などの、ＯＡを模倣または誘導するために十分な条件の下での培養細胞（軟骨細胞など）を含む。
他の例では、所望の活性を可能にするに十分な細胞培養あるいは被験者に試験薬を投与することを含む。特定例において、所望の活性は、ＯＡリスク関連分子の活性（発現など）を変える。
上方制御された、または活性化：タンパク質の発現あるいは生物活性に関連して使用される場合、タンパク質の生物活性を増加させる任意の過程のみならず、タンパク質の産出を増加させる任意の過程（例えば、遺伝子の転写またはｍＲＮＡの翻訳の増加）も言及する。
転写を増加させる過程の例として、転写開始複合体の形成を促進する過程、転写開始率を増加させる過程、転写伸長速度を増加させる過程、転写過程を増加させる過程、転写抑制を軽減する過程（例えば、転写抑制体の結合を阻害することによる）が挙げられる。遺伝子上方制御には、既存のレベルを超える発現を刺激することのみならず、抑制も阻止可能である。翻訳を増加させる過程の例として、翻訳開始を増加させる過程、翻訳伸長を増加させる過程、ｍＲＮＡ安定性を増加させる過程がある。タンパク質の活性を増加させる過程の例として、タンパク質の分解を低下させる過程、あるいは１つ以上の標的と相互に作用するタンパク質の能力を高める過程が挙げられる。
遺伝子の上方制御は、ＯＡリスク関連遺伝子産物などの遺伝子産物の産出における任意の検知可能な増加が含まれる。特定例において、遺伝子産物の産出は、対照（同種の正常細胞における遺伝子発現の量など）と比べて、例えば、少なくとも５倍、または少なくとも１０倍など、少なくとも４倍に増加する。一例では、対照は、現在ＯＡではない被験者あるいはＯＡの危険性が検知されない被験者の、血清などの生体試料における遺伝子発現またはタンパク質発現の相対量である。
タンパク質の上方制御あるいは活性化は、ＯＡリスク関連タンパク質などの、タンパク質における任意の検知可能な増加を含む。一例では、検知可能なＯＡリスク関連タンパク質の量は、対照（同種の正常細胞における同一タンパク質の量など）と比べて、例えば、少なくとも５倍、または少なくとも１０倍など、少なくとも４倍に増加する。一例において、対照は、現在ＯＡではない被験者あるいはＯＡの危険性が検知されない被験者の、血清などの生体試料でのタンパク質提示の相対量である。
骨関節炎リスクの評価
発明者らは、活性が（核酸またはタンパク質の発現など）ＯＡの後、あるいは発症前に変化した（上方制御したあるいは下方制御した、など）、少なくとも３６のＯＡリスク関連分子を同定した。同定した分子の数は、使用したアルゴリズムの特異性および感受性によって異なった。例えば、分散分析を使用すると、１９のＯＡリスク関連分子が同定され（表８および図４）、ＡＮＯＶＡおよびマイクロアレイ有意性解析（ＳＡＭ）法の混合モデルを使用すると、２２のＯＡリスク関連分子が同定された（表１０および１２、および図５）。ＩＬ-１５およびｓＶＡＰ-１などの、ＯＡとあらかじめ関連性のない複数のＯＡリスク関連分子が同定された。
これらのＯＡリスク関連分子の同定に基づき、ヒト以外の他の哺乳動物（例えば、動物の被験体）などの被験体におけるＯＡリスクを評価するための方法が開発された。ＯＡリスクを評価する特定例として、健康な被験者でなければ、ＯＡの疑いがある被験者あるいはＯＡの危険性がある被験者などの被験者が、ＯＡであるか、または将来、ＯＡを発症する危険性が高いかどうかの判定（例えば、他の臨床症状はないがＯＡの被験者）、ＯＡの被験者におけるＯＡの重症度の判断、ＯＡの被験者あるいはＯＡ発症の疑いが高くなっている被験者の進行度の把握、特定の抗ＯＡ治療に反応するＯＡの被験者の同定、またはその組み合わせを含む。いくつかの例において、被験者から得られた血清は、ＯＡリスクを評価するために使用される。しかしながら、当業者は、他の生体試料が使用可能になることを高く評価するであろう。
特定例において、公開された本方法は、ＯＡの以前の診断を確認するために使用される（例えば、レントゲン写真または他の画像検査法による診断）。例えば、被験者は、例えば、レントゲン写真または他の撮像法（ＭＲＩなど）を使用して、ＯＡと診断されていたかもしれない。そのような例では、診断方法は、ＯＡの診断を確認するため、診断の重症度を示すため、またはＯＡの進行を把握するために使用可能である。
特定例において、公開された本方法は、ＯＡに伴う徴候および症状の発症後に行われる。それらの症状の例として、疼痛、炎症、凝り、あるいは膝、手、足、腰または背骨など、患部関節の制限された動き、および当業者によって認識される関節に及ぶ他の影響があるが、これらに限定されない。
いくつかの例において、本方法は、レントゲン写真または他の画像検査法の使用より早くにＯＡの検知を可能にする。したがって、本明細書に記載される試験は、いくつかの例において、ＯＡの決定的な画像での証拠が周知される以前に、ＯＡを検知可能である。例えば、ＯＡの初期段階を検知するいくつかの画像診断法（レントゲン写真およびＭＲＩなど）では困難であるため、本明細書で公開される方法は、レントゲン写真または他の画像検査法では検知不可能なＯＡの検知を可能にするかもしれない。そのため、いくつかの例において、本方法は、任意の診断画像検査（ＯＡの解剖学的証拠を見つける検査など）を行う前に行われる。特定例において、本方法は、適当な量の感受性および特異性によって、被験者がＯＡである、または将来（少なくとも５年後、少なくとも１０年後、あるいは少なくとも２０年後など）、ＯＡを発症する危険性があるかどうか判定可能である。
特定例において、本方法は、さらに、ＯＡの被験者、あるいは将来、ＯＡを発症する危険性が高い被験者に適切な治療を与える。検査結果は、抗ＯＡ治療が被験者に使用されるべきかどうかを判定するために使用可能（単独で、または他の臨床上の証拠あるいは画像との併用で）である。例えば、公開された方法を用いてＯＡを有すると同定または評価された被験者には、抗炎症剤（例えば、ＮＳＡＩＤ）などのＯＡを有すると確認された被験者にとって適切な治療が提供される。他の特定例では、公開された方法で、将来、ＯＡを発症する危険性が高いと同定または評価された被験者は、グルコサミン、コンドロイチン硫酸およびそれらの誘導体の投与などの、適切な治療を与えられ、例えば、被験者のＯＡの発症を防止あるいは延期するために、体重がかかるＯＡに対する予防手段としての体重管理を始める、反復的損傷を少なくする動作の生体力学を改善する手段を開発する、ＯＡを発症する危険性がある若年成人のスポーツ関連損傷を減少させ、回復プログラムを開始するプログラムを始める。
被験者におけるＯＡリスクの評価に関するある特定例は、年齢に相関する、被験者における１つ以上のＯＡリスク関連分子の活性の判定を含む。見つかった、年齢に相関するＯＡリスク関連分子は、脳から派生した神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、６Ｃｋｉｎｅ、細胞間接着分子-３（ＩＣＡＭ-３）、ＴＧＦβ受容体ＩＩＩ（ＴＧＦ-β ＲＩＩＩ）、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化受容体（ＵＰＡＲ）、血管細胞接着分子-１（ＶＣＡＭ-１）、インターロイキン２（ＩＬ-２）、インターフェロンγにより誘発されるモノカイン（ＭＩＧ）、マトリックスメタロプロテイナーゼ７（ＭＭＰ７）および骨髄性前駆細胞抑制因子1（ＭＰＩＦ-１）（図４も参照）であった。例えば、ＩＣＡＭ-３は、統計的に、６０歳以上のＯＡ被験者で上昇し、ＢＮＤＦ基準は、５０歳までのＯＡでは低く、６０歳以上のＯＡでは高かった。ＢＮＤＦフォローアップは、６０歳までのＯＡでは低く、それ以降はのＯＡでは高くなり、ＥＧＦ基準は、５０歳までのＯＡ被験者では低く、６０歳以上のＯＡ被験者では確実に高くなった。ＩＬ-２の上昇は、５０歳を下回るＯＡ被験者では低く、６５歳を上回る被験者では高かった。ＭＩＧは、統計的に、７０歳以上のＯＡ被験者で上昇し、ＭＭＰ７は、ＯＡ被験者あるいは６０歳またはそれより年下の被験者で高かった（基準はすべての年齢においてＯＡでは高い）。ＭＰＩＦ１は、６０歳またはそれより年下のＯＡ被験者では高く（基準はすべての年齢においてＯＡでは高い）、プロラクチン基準は、５０歳またはそれより年下のＯＡ被験者では高かった。ＴＧＦ-βＲＩＩＩは、６０歳またはそれより年上のＯＡの被験者では高かった。
したがって、被験者が６０歳以上の場合、本方法には、ＩＣＡＭ-３、ＢＤＮＦ、ＩＬ-２、ＥＧＦあるいはＴＧＦ-βＲＩＩＩ（または、これらのうち１、２、３、４、５あるいは６つの組み合わせ）が被験者において活性を増加させたかどうかの判定が含まれ、このうち少なくとも１つの活性の増加の存在が、被験者のＯＡリスクが増加したことを示す（例えば、ＯＡを有する、またはＯＡを発症する危険性が高い）。被験者が７０歳以下の場合、本方法には、ＩＣＡＭ-３、ＢＤＮＦ、ＩＬ-２、ＴＧＦ-βＲＩＩＩ、ＥＧＦあるいはＭＩＧ（または、これらのうち１、２、３、４、５あるいは６つの組み合わせ）が、被験者において活性を増加させたかどうかの判定が含まれ、これらのＯＡリスク関連分子の少なくとも１つの活性の増加の存在が、被験者のＯＡリスクが増加したことを示す（例えば、ＯＡを有する、またはＯＡを発症する危険性が高い）。被験者が６０歳以下の場合、本方法には、ＭＭＰ-７あるいはＭＰＩＦ１（または、これらの２つの組み合わせ）が、被験者において活性を増加させたか、またはＢＤＮＦが被験者において活性を増加させたかどうかの判定が含まれ、これらのＯＡリスク関連分子の少なくとも１つの活性の増加の存在が、被験者のＯＡリスクが増加したことを示す（例えば、ＯＡを有する、またはＯＡを発症する危険性が高い）。被験者が５０以下の場合、本方法には、ＭＭＰ-７、ＭＰＩＦ１、ＥＧＦあるいはＢＤＮＦ（または、これらのうち２、３あるいは４つなどの組み合わせ）が、被験者において活性を増加させたか、またはプロラクチン活性の増加があるかどうかの判定が含まれ、これらのＯＡリスク関連分子の少なくとも１つの特異的活性の存在が、被験者のＯＡリスクが増加したことを示す（例えば、ＯＡを有する、またはＯＡを発症する危険性が高い）。
さらに、本発明は、老化または性別に伴う差次的発現を有するバイオマーカーを提供する。
ＯＡリスク関連分子の活性を検知する
特定例において、被験者におけるＯＡリスクの評価法は、被験者の少なくとも４つのＯＡリスク関連分子の活性を検知し、少なくとも４つのＯＡリスク関連分子における特異的活性の存在が、被験者のＯＡリスクが増加したことを示す。いくつかの例において、特異的活性の検知は、ＯＡリスク関連ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、タンパク質、あるいはその組み合わせの定量的または定性的な分析を含む。本明細書で使用されるように、「ＯＡリスク関連分子」という用語は、ＯＡリスク関連核酸分子（例えば、ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡなどの、ＤＮＡ、ＲＮＡ）およびＯＡリスク関連タンパク質を含む。用語は、表８および１０〜１３（および、表にあげられる分子に対応する分子）に挙げられるそれらの分子（および、表にあげられる分子に対応する分子）に限られないが、本明細書に挙げられるすべてのそのような分子を含むＯＡの影響を受ける他の核酸分子およびタンパク質が含まれる。特定のＯＡリスク関連分子の例は、ＩＬ-１５およびＶＣＡＭ-１など、表８および１０〜１３に挙げられる。
例えば、本方法には、インターロイキン１５（ＩＬ-１５）または可溶性血管付着タンパク質１（ｓＶＡＰ-１）の活性、および、被験者から得られた、または派生した試料中の、例えば、表８および１０〜１３に挙げられる分子などの、少なくとも２つの他のＯＡリスク関連分子の任意の組み合わせの判定が含まれる。特異的活性を検知する特定例において、少なくともＩＬ-１５の上方制御があるかどうかの判定、および少なくともｓＶＡＰ-１の下方制御があるかどうかの判定を含み、少なくとも４つのＯＡリスク関連分子における特異的活性の存在が、被験者のＯＡリスクが増加したことを示す。例えば、本方法には、例えば、表８および１０〜１３に挙げられる少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも２６、少なくとも２７、少なくとも２８、少なくとも２９、少なくとも３０、少なくとも３１、少なくとも３２、少なくとも３３、少なくとも３４、あるいは少なくとも３５の追加分子を含む任意の組み合わせなど、表８および１０〜１３に挙げられる少なくとも２つの追加分子を含む任意の組み合わせなどの、他のＯＡリスク関連分子とともに、試料におけるＩＬ-１５またはｓＶＡＰ-１活性（または両方）のスクリーニング、あるいは判定が含まれる。
一例において、本方法は、ＩＬ-１５、ｓＶＡＰ-１、およびメタロプロテイナーゼ-７（ＭＭＰ-７）およびプラスミノーゲン活性抑制物質-1（ＰＡＩ-１）などの、他のＯＡリスク関連分子の活性の判定を含み、本方法は、さらに、少なくともＭＭＰ-７の上方制御、および少なくともＰＡＩ-１の下方制御があるかどうかの判定を含む。いくつかの例において、ＩＬ-１５、ＭＭＰ-７およびｓＶＡＰ-１の上方制御、およびＰＡＩ-１の下方制御は、被験者のＯＡリスクが増加したことを示す。ある具体例では、本方法は、Ｄ-ダイマー５（ＤＤ５）、ＤＤ６、エオタキシン２（Ｅｏｔ２）、細胞間接着分子-１（ＩＣＡＭ-１）、ＭＭＰ-２およびＰ-セレクチンを含む少なくとも４つの他のＯＡリスク関連分子のみならず、ＩＬ-１５、ｓＶＡＰ-１、ＭＭＰ-１、ＰＡＩ-１の活性の判定を含む。そのような方法では、本方法には、少なくともＤＤ５、ＤＤ６、Ｅｏｔ２、ＩＣＡＭ-１、ＭＭＰ-２およびＰ-セレクチンの下方制御があるかどうかの判断が含まれ、ＰＡＩ-１、ＤＤ５、ＤＤ６、Ｅｏｔ２、ＩＣＡＭ-１、ＭＭＰ-２およびＰ-セレクチンの２つ以上の下方制御の存在（例えば、これらのうち、２、３、４、５、６あるいは７つの下方制御）、およびＩＬ-１５、ＭＭＰ-７およびｓＶＡＰ-１の上方制御の存在が、被験者が将来、ＯＡを発症する危険性が高いことを示す。
さらに他の例では、本方法は、ＩＬ-１５、ｓＶＡＰ-１およびマクロファージ炎症性タンパク質１β（ＭＩＰ-１β）、マクロファージ炎症性タンパク質１δ（ＭＩＰ-１δ）、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化受容体（ＵＰＡＲ）および血管細胞接着分子-１（ＶＣＡＭ-１）の２つ以上を含む他のＯＡリスク関連分子の活性の判定を含み、本方法は、少なくともＭＩＰ-１β、ＩＬ-１５、ｓＶＡＰ-１、ＵＰＡＲおよびＶＣＡＭ-１の上方制御、および少なくともＭＩＰ-１δの下方制御があるかどうかの判定も含む。いくつかの例において、ＩＬ-１５、ｓＶＡＰ-１、ＭＩＰ-１β、ＵＰＡＲおよびＶＣＡＭ-１の３つ以上の上方制御（例えば、これらのうち、３、４あるいは５つの上方制御）、およびＭＩＰ-１δの下方制御は、被験者にＯＡリスクがあることを示す。具体例では、本方法は、脳から派生した神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、濾液血液ＣＣケモカイン１（ＨＣＣ１）、レプチン、ＭＭＰ-７およびプロラクチンの少なくとも４つ（または、少なくとも５あるいは少なくとも６つ）を含む少なくとも４つの他のＯＡリスク関連分子のみならず、ＭＩＰ-１β、ＭＩＰ-１δ、ＵＰＡＲおよびＶＣＡＭ-１の活性の判定を含む。そのような方法では、本方法には、少なくともＭＩＰ-１β、ＨＣＣ、レプチン、ＭＭＰ-７、ＵＰＡＲ、ＶＣＡＭ-１およびＢＤＮＦの上方制御、およびＭＩＰ-１δ、ＥＧＦおよびプロラクチンの下方制御があるかどうかの判定が含まれ、ＭＩＰ-１δ、ＥＧＦおよびプロラクチンの２つ以上の下方制御の存在、およびＭＩＰ-１β、ＨＣＣ、レプチン、ＭＭＰ-７、ＵＰＡＲ、ＶＣＡＭ-１およびＢＤＮＦの２つ以上の上方制御の存在が、被験者が将来、ＯＡを発症する危険性が高いことを示す。
例えば、被験者が将来、ＯＡを発症する危険性が高いという表示は、少なくとも５年、少なくとも１０年、少なくとも１５年、あるいは少なくとも２０年後にＯＡを発症する可能性が高いことを示すことが可能である。一例では、被験者には、ＯＡの他の臨床的適応は見られない。例えば、被験者には、関節の疼痛または膨れがない場合がある。
他の例では、本方法は、ＩＬ-１５、ｓＶＡＰ-１および、ＭＭＰ-７、ＰＡＩ-１、インターロイキン１α（ＩＬ-１α）、ＩＬ-２、マクロファージ抑制タンパク質（ＭＩＰ）-１α、Ｂ-リンパ球ケモカイン（ＢＬＣ）、６-ケモカイン（Ｃｋｉｎｅ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）-７、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ-ＣＳＦ）、インスリン様成長因子結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）-２、ニューロトロフィン-４（ＮＴ４）、ＩＣＡＭ-３、血管内皮（ＶＥ）カドヘリンおよびメタロプロテイナーゼ１の組織阻害剤（ＴＩＭＰ-１）を含む他のＯＡリスク関連分子の活性の判定を含み、本方法は、少なくともＭＭＰ-７、ＰＡＩ-１、ＩＬ-１α、ＩＬ-２、マクロファージＭＩＰ-１α、ＢＬＣ、６-Ｃｋｉｎｅ、ＦＧＦ-７、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ-ＣＳＦ）、ＩＧＦＢＰ-２、ＮＴ４、ＩＣＡＭ-３、ＶＥ-カドヘリンおよびＴＩＭＰ-１に上方制御があるかどうかの判定も含む。いくつかの例において、ＰＡＩ-１の下方制御、およびＩＬ-１５、ＭＭＰ-７、ｓＶＡＰ-１、ＩＬ-１α、ＩＬ-２、ＭＩＰ-１α、ＢＬＣ、６-Ｃｋｉｎｅ、ＦＧＦ-７、ＧＭ-ＣＳＦ、ＩＧＦＢＰ-２、ＮＴ４、ＩＣＡＭ-３、ＶＥ-カドヘリンおよびＴＩＭＰ-１の３つ以上の上方制御の存在が（例えば、これらのうち、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、あるいは１３の上方制御）、被験者がＯＡであることを示す。
他の例では、本方法は、ＩＬ-１５、ｓＶＡＰ-１、およびＩＬ-２、Ｅｏｔ２、ＩＧＦＢＰ-４、ＩＣＡＭ-３、インターフェロンγにより誘発されるモノカイン（ＭＩＧ）、ＭＭＰ-７、骨髄性前駆細胞抑制因子１（ＭＰＩＦ-１）、胸腺および活性化調節ケモカイン（ＴＡＲＣ）およびＴＧＦβ受容体ＩＩＩ（ＴＧＦ-βＲＩＩＩ）の２つ以上（例えは、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、または少なくとも９）を含む他のＯＡリスク関連分子の活性の判定を含み、本方法は、少なくともＩＬ-２、ＩＧＦＢＰ-４、ＩＣＡＭ-３、ＭＩＧ、ＭＭＰ-７、ＭＰＩＦ-１およびＴＧＦ-βＲＩＩＩの上方制御、および少なくともＥｏｔ２およびＴＡＲＣの下方制御があるかどうかの判定も含む。いくつかの例において、Ｅｏｔ２およびＴＡＲＣの下方制御、およびＩＬ-２、ＩＧＦＢＰ-４、ＩＣＡＭ-３、ＭＩＧ、ＭＭＰ-７、ＭＰＩＦ-１およびＴＧＦ-βＲＩＩＩのうち２つ以上の上方制御の存在が（例えば、これらのうち、２、３、４、５、６、あるいは７の上方制御）、被験者がＯＡであることを示す。具体例では、本方法は、ＩＬ-２、Ｅｏｔ２、ＩＧＦＢＰ-４、ＩＣＡＭ-３、ＭＩＧ、ＭＭＰ-７、ＭＰＩＦ-１、ＴＡＲＣおよびＴＧＦ-βＲＩＩＩなどのうち、１、２、３、４、５、６、７、８、あるいは９つの、少なくとも１つの他のＯＡリスク関連分子のみならず、ＭＩＰ-１β、ＭＩＰ-１δ、ＵＰＡＲおよびＶＣＡＭ-１の活性の判定も含む。そのような方法では、本方法には、少なくともＭＩＰ-１β、ＩＬ-２、ＩＧＦＢＰ-４、ＩＣＡＭ-３、ＭＩＧ、ＭＭＰ-７、ＭＰＩＦ-１、ＵＰＡＲ、ＶＣＡＭ-１、６-ＣｋｉｎｅおよびＴＧＦ-βＲＩＩＩの上方制御、および少なくともＭＩＰ-１δ、Ｅｏｔ２およびＴＡＲＣの下方制御があるかどうかの判定が含まれ、ＭＩＰ-１δ、Ｅｏｔ２およびＴＡＲＣの２つ以上の下方制御の存在（例えば、これらのうち、２あるいは３つの下方制御）、およびＭＩＰ-１β、ＩＬ-２、ＩＧＦＢＰ-４、ＩＣＡＭ-３、ＭＩＧ、ＭＭＰ-７、ＭＰＩＦ-１、ＵＰＡＲ、ＶＣＡＭ-１、６-ＣｋｉｎｅおよびＴＧＦ-βＲＩＩＩの２つ以上の上方制御の存在（例えば、これらのうち、２、３、４、５、６、８、９、１０、あるいは１１の上方制御）が、被験者がＯＡであることを示す。
特定例において、スクリーニングされたＯＡリスク関連分子の数は、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも２６、少なくとも２７、少なくとも２８、少なくとも２９、少なくとも３０、あるいは少なくとも３５のＯＡリスク関連分子である。他の例では、本方法は、７０未満、６０未満、５０未満、４０未満、３５未満、３０未満、２９未満、２８未満、２７未満、２６未満、２５未満、２４未満、２３未満、２２未満、２１未満、２０未満、１９未満、１８未満、１７未満、１６未満、１５未満、１４未満、１３未満、１２未満、１１未満、１０未満、９未満、８未満-７未満、６未満、５未満、あるいは４未満のＯＡリスク関連分子のスクリーニングを使用する。特定のＯＡリスク関連分子の例は、表８および１０〜１３に示す。
特異的活性
特異的活性は、ＯＡリスク関連分の核酸あるいはタンパク質活性の増減によって表される。例えば、特異的活性は、核酸分子またはタンパク質の量の増減、核酸分子またはタンパク質の安定性、核酸分子またはタンパク質の局在性、あるいは核酸分子またはタンパク質の生物活性を含むが、これらに限定されない。特定例は、例えば、表８および１０〜１３で挙げられるＯＡリスク関連分子など、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも２６、少なくとも２７、少なくとも２８、少なくとも２９、少なくとも３０、少なくとも３１、少なくとも３２、少なくとも３３、少なくとも３４、少なくとも３５、あるいは少なくとも３６のＯＡリスク関連分子の任意の組み合わせにおける活性の変化など、少なくとも４つのＯＡリスク関連核酸分子またはタンパク質における活性の変化を検知する評価方法を含む（例えば、ＯＡであると思われていた、またはＯＡであると知られていた被験者から得られた核酸あるいはタンパク質）。いくつかの例において、特異的活性は、被験者の所望のＯＡリスク関連分子の活性が増加したかどうかの判定、および被験者の所望のＯＡリスク関連分子の活性が減少したかどうかの判定によって検知される。
特定例において、特異的活性は、上方制御されたＯＡリスク関連分子、および下方制御されたＯＡリスク関連分子の両方において検知される。例えば、少なくとも４つのＯＡリスク関連分子が被験者において特異的活性を有する、ＩＬ-１５、ＭＭＰ-７、ｓＶＡＰ-１、ＩＬ-１α、ＩＬ-２、ＭＩＰ-１α、ＢＬＣ、６-Ｃｋｉｎｅ、ＦＧＦ-７、ＧＭ-ＣＳＦ、ＩＧＦＢＰ-２、ＮＴ４、ＴＩＭＰ-１、ＶＥ-カドヘリン、ＭＩＰ-１β、ＵＰＡＲ、ＶＣＡＭ-１、ＩＧＦＢＰ-４、ＩＣＡＭ-３、ＭＩＧ、ＭＰＩＦ-１およびＴＧＦ-βＲＩＩＩの１つ以上の活性の増加、およびＰＡＩ-１、ＭＩＰ-１δ、Ｅｏｔ２およびＴＡＲＣの１つ以上の活性の減少は、被験者がＯＡである、重度のＯＡである、あるいはその組み合わせであることを示す。他の例では、少なくとも４つのＯＡリスク関連分子が被験者において特異的活性を有する、ＩＬ-１５、ＭＭＰ-７、ｓＶＡＰ-１、ＭＩＰ-１β、ＵＰＡＲ、ＶＣＡＭ-１、ＨＣＣ、レプチンおよびＢＤＮＦの１つ以上の活性の増加、およびＭＩＰ-１δ、ＰＡＩ-１、ＤＤ５、ＤＤ６、Ｅｏｔ２、ＩＣＡＭ-１、ＭＭＰ-２、Ｐ-セレクチン、ＥＧＦおよびプロラクチンの１つ以上の活性の減少は、被験者に将来、ＯＡが発症する危険性が高い、被験者が重度のＯＡである、あるいはその組み合わせであることを示す。
上方制御あるいは下方制御の検知には、例えば、ＩＬ-１５では少なくとも２５％、ＭＭＰ-７では少なくとも２５％、ｓＶＡＰ-１では少なくとも２５％、ＩＬ-１αでは少なくとも２５％、ＩＬ-２では少なくとも２５％、ＭＩＰ-１αでは少なくとも２５％、ＢＬＣでは少なくとも２５％、６-Ｃｋｉｎｅでは少なくとも２５％、ＦＧＦ-７では少なくとも２５％、ＧＭ-ＣＳＦでは少なくとも２５％、ＩＧＦＢＰ-２では少なくとも２５％、ＮＴ４では少なくとも２５％、ＩＣＡＭ-３では少なくとも２５％、ＴＩＭＰ-１では少なくとも２５％、ＶＥ-カドヘリンでは少なくとも２５％、ＭＩＰ-１βでは少なくとも２５％、ＵＰＡＲでは少なくとも２５％、ＶＣＡＭ-１では少なくとも２５％、ＩＧＦＢＰ-４では少なくとも２５％、ＩＣＡＭ-３では少なくとも２５％、ＭＩＧでは少なくとも２５％、ＭＰＩＦ-１では少なくとも２５％、ＴＧＦ-βＲＩＩＩでは少なくとも２５％、ＨＣＣでは少なくとも２５％、レプチンでは少なくとも２５％、６-Ｃｋｉｎｅでは少なくとも２５％、およびＢＤＮＦでは少なくとも２５％の増加の変化の大きさ、あるいはＰＡＩ-１では少なくとも２５％、ＭＩＰ-１δでは少なくとも２５％、Ｅｏｔ２では少なくとも２５％、ＴＡＲＣでは少なくとも２５％、ＥＧＦでは少なくとも２５％、プロラクチンでは少なくとも２５％、ＤＤ５では少なくとも２５％、ＤＤ６では少なくとも２５％、ＩＣＡＭ-１では少なくとも２５％、ＭＭＰ-２では少なくとも２５％、およびＰ-セレクチンでは少なくとも２５％の減少の変化の大きさなど、上方制御に対する少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、あるいは少なくとも１００％または少なくとも２００％の変化の大きさが含まれる。また、上方制御および下方制御は、例えば、少なくとも５倍、少なくとも６倍、あるいは少なくとも１０倍など、少なくとも４倍の変化（例えば、対照と相対的な）の大きさによる。
タンパク質活性を検知する
いくつかの例における検知されたＯＡリスク関連分子は、ＯＡリスク関連タンパク質である。例えば、特異的活性の検知方法には、ＯＡリスク関連タンパク質の量の定量化が含まれる。いくつかのＯＡリスク関連タンパク質は、隔離して考える場合、ＯＡリスクの情報を提供するかもしれないが、一般的に、複数のＯＡリスク関連タンパク質の活性は、診断あるいは予後診断を判定する際、検査され考慮される。例えば、少なくとも４つのＯＡリスク関連タンパク質の発現は、４、５、６、あるいは７つのタンパク質などにみなされる。いくつかの例において、より多くのＯＡリスク関連タンパク質が分析されるが、サブセットのみが診断あるいは予後診断の提供に十分であることがある。いくつかの例において、例えば、さらなる統計的検出力を得るために、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、あるいは３６のタンパク質など、さらに多くのＯＡリスク関連タンパク質が検査される。特定例において、活性が増加するＯＡリスク関連タンパク質および活性が減少するＯＡリスク関連タンパク質の両方が、同一の検査で検知される。
ＯＡリスク関連タンパク質は、当技術分野で周知の任意の手段によって試験試料中で検知可能である。例えば、抗体などのタンパク質特異的結合剤へのハイブリダイゼーションなどの、インビトロハイブリダイゼーション（数量的ハイブリダイゼーションが含まれる）、固相免疫測定法（例えば、ＲＣＡタンパク質チップなどの、抗体プローブアレイ）、定量的分光法（例えば、表面増強レーザー脱離／イオン化質量分析（ＳＥＬＤＩ）に基づく質量分析法などの）、あるいはその組み合わせなど、当技術分野で周知の任意の免疫学的検知方法が使用可能である。非核酸分析物の検知に核酸の信号増幅を適用する方法（ローリングサークル型増幅、ＲＣＡなど）は、試料中の特定のタンパク質分析物を検知、判定および定量化するために使用可能である（例えば、本明細書で文献として組み込まれている米国特許番号６，５３１，２８３を参照）。しかしながら、当業者は、当技術分野で周知の他の方法が使用可能であることを認識するであろう。
様々な固相基盤は、ＯＡリスク関連タンパク質などのタンパク質の濃度を定量化する、あるいは判定するために使用可能である。基盤は、型どおりの生活をする人によって選択が可能であり、利便性、コスト、技術、あるいは他の配慮に基づく。有用な基盤には、ビーズ、瓶、表面、基盤、繊維、針金、骨組構造物、管、フィラメント、プレート、シーツおよびウェルがあるが、これらに限定されない。例となる基盤には、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ガラス、プラスチック、金属、合金、セルロース、セルロース誘導体、ナイロン、被覆表面、アクリルアミドまたはその誘導体およびその重合体、アガロース、ラテックス、あるいはその組み合わせがある。本リストは、包括的なものではなく、説明用である。
タンパク質の検知および測定の他の方法は、免疫学的検定で定量化された、マイクロウェルプレートにあるビーズあるいはウェルと結合した抗体を使用する。この検定形式では、単一タンパク質は、各検定において検知可能である。検査は、本発明の方法で到達可能な同一の結果に本質的に達するため、複数のタンパク質に対する抗体で反復可能である。ビーズ検査は、それぞれ、ある方法で一意的にラベルを付けられた複数のビーズを使用することによって多重化が可能である。例えば、各種ビーズは、あらかじめ選択された蛍光プローブの量を包含することが可能である。ビーズの種類は、ビーズから放射される蛍光性（または波長）の量を判定することによって識別可能である。そのような蛍光標識されたビーズは、ルミネックス社（Ｌｕｍｉｎｅｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、オースティン、テキサス州）から市販されており、同時に１００までのタンパク質の測定を可能にする。
タンパク質分析物は、また、１つのマイクロウェルごとに単一タンパク質測定することを可能とし、１つのプレートごとに３８４まであるいはそれ以上の測定をすることが可能な、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）によって測定可能である。非免疫アッセイも使用可能である。酵素活性に基づいた検査は、高度な感受性を得ることができ、使用可能である。特異結合タンパク質測定は、タンパク質が高い結合親和力（低い解離定数）を有する特異結合対の一部である場合に使用可能である。特異結合対の他の部分は、タンパク質あるいは特異的にタンパク質と結合した核酸配列などの、非タンパク質であることがある。
一例において、ＯＡリスク関連タンパク質の特異的活性の検知方法は、被験者から得られた試料中の少なくとも４つのＯＡリスク関連タンパク質の数量測定を含み、少なくとも４つの各ＯＡリスク関連タンパク質の数量と相対的な、試料中の少なくとも４つのＯＡリスク関連タンパク質の数量の差異（例えば、ＯＡリスクを有さない被験者に対する量を表す値または値域など）が、それらの少なくとも４つの血管のリスク関連分子における特異的活性である。例えば、統計的差異は、当技術分野で周知の統計的方法（スチューデントのｔ-検定など）を使用して判定可能である。精度および感受性の判定は、当業者の技術では十分である。一例において、被験者から得られた試料の数量と基準（対照）値の間にある、ｐ値≦０．０５である統計的に有意な差異は、ＯＡリスク関連タンパク質に特異的活性があることを示す。他の例では、被験者から得られた試料の数量と基準値の間にある少なくとも４倍の差異は、ＯＡリスク関連タンパク質に特異的活性があることを示す。
一例において、試験試料中にあるタンパク質は、タンパク質が特異的に抗体と結合するに十分な条件の下で、ＯＡリスク関連タンパク質を認識する抗体の存在下で培養される。例えば、本方法には、タンパク質および抗体（アレイ基盤上の抗体など）の間で特異結合が可能となるに十分な期間、抗体を有するタンパク質含有試料を培養すること、それによって、タンパク質（抗体複合体）を形成し、その後、タンパク質の活性が変化したかどうかを判定するためにタンパク質（抗体複合体）を分析することが含まれる。一例において、タンパク質（抗体複合体）の分析は、試料中に存在するタンパク質（抗体複合体）の量を判定し、検査した各ＯＡリスク関連タンパク質の基準値（例えば、ＯＡリスクを有する被験者に対するタンパク質の量あるいは量の範囲）とその量を比較することを含む。例えば、タンパク質（抗体複合体）は、検知および定量化が可能である。少なくとも４つのＯＡリスク関連タンパク質の特異的活性の存在は、被験者がＯＡリスクを有することを示す。
多種タンパク質は、例えば、様々なタンパク質に特異的な一次抗体がアレイ上などに固定されているマイクロアレイ上でのサンドイッチ免疫測定法によって分析可能である。例えば、タンパク質を含有する試験試料は、ＯＡリスク関連タンパク質を認識する抗体を含むアレイとともに培養される。試料中に存在する場合、タンパク質分析物は、特定の抗原-抗体の相互作用に有利な条件の下で、マイクロアレイを有する試料の培養によって、アレイ上の同種の位置に捕らえられる。捕らえられたタンパク質は、例えば、タンパク質に存在するラベルを検知する、あるいは他のラベル付きの一般的な抗体と捕らえられたタンパク質を結合させてラベルを検知することによって検知可能である。いくつかの例において、ローリングサークル型増幅（ＲＣＡ）プライマーは、検知されたタンパク質に対して特異的で、ＲＣＡプライマーまたはハプテンに接合した二次抗体を使用して、様々なタンパク質分析物と関連付けられる。直接免疫学的検定において、二次抗体は、他のＲＣＡプライマーと直接、接合する。関節免疫学的検定では、二次抗体は、ビオチンなどのハプテンに接合し、検知抗体複合体またはＲＣＡプライマーに接合するストレプトアビジンとともに培養される。プライマーに感作されたローリングサークル型複製は、タンパク質が固定されたアレイの部位で大量のＤＮＡ産出を生じさせる。増幅したＤＮＡは、タンパク質に対する、容易に検知可能な信号として作用する。この信号は、検知および定量化可能であり、基準値または対照値と比較可能である。
アレイ中にある異なるタンパク質は、複数の方法で識別可能である。例えば、増幅したＤＮＡの位置は、異なるタンパク質がアレイの所定の位置に固定されている場合、関連のあるタンパク質を示す。また、各異なるタンパク質は、異なるＤＮＡサークル型のローリングサークル型複製を次々に感作する、異なるローリングサークル型複製プライマーと関連することができる。その結果、各異なるタンパク質に対する識別可能な増幅したＤＮＡができる。異なる増幅したＤＮＡは、任意の適切な配列に基づいた核酸検知方法によって識別可能である。２つ以上の異なる試料で見られたタンパク質分析物の比較は、当技術分野で周知の任意の手段を使用して行われる。例えば、第一の試料は、第一のアレイで分析可能であり、第二の試料は、第一アレイの複製である、第二のアレイで分析される。第一アレイの各タンパク質に対する位置の強度は、第二アレイの対応する位置の強度と比較可能である。第一および第二アレイの位置の強度の差異は、タンパク質の濃度が両試料において異なるかどうかを判定する。差異が見られる場合、それらは、タンパク質活性の増加、またはタンパク質活性の低下として記録される。また、異なる試料からの同じタンパク質は、異なる増幅したＤＮＡを産出するために異なるＤＮＡサークル型の複製を感作する異なるプライマーと関連することができる。このように、複数の試料の多くの各タンパク質提示は定量化可能である。
ＯＡリスク関連タンパク質は直接、分析可能であり、タンパク質の誘導体も分析可能である。誘導体は、試料処理の間、自然に、または計画的にのどちらかで、体内で発生するタンパク質の形、あるいは産出される形となり得る。誘導体の例として、タンパク質分解産物、リン酸化産物、アセチル化産物、ミリストイル化産物、アミノ基転移産物、タンパク質複合体産物および複合体解離産物がある。そのようなすべての誘導体は、「ＯＡリスク関連タンパク質」という用語に含まれる。
いくつかの例において、被験者におけるＯＡリスク関連タンパク質の結果として生じるパターンは、ＯＡリスクに対する被験者の発現プロファイルを提供する。そのようなプロファイルは、ＯＡではない被験者のプロファイルなどの、対照プロファイルと比較可能であり、いくつかの例においては、ほぼ同年齢または年齢幅、同性、あるいはその組み合わせのプロファイルである。
核酸活性を検知する
いくつかの例において、検知されたＯＡリスク関連分子は、ＯＡリスク関連核酸である。例えば、特異的活性の検知方法には、ＯＡリスク関連核酸分子の発現量の定量化が含まれる。例となる核酸分子には、ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡがある。いくつかのＯＡリスク関連核酸は、隔離して考える場合、ＯＡリスクの情報を提供するかもしれないが、一般的に、複数のＯＡリスク関連核酸の活性は、診断あるいは予後診断を判定する際、検査され考慮される。例えば、少なくとも４つのＯＡリスク関連核酸の発現は、４、５、６、あるいは７つの核酸などにみなされる。いくつかの例において、より多くのＯＡリスク関連核酸が分析されるが、サブセットのみが診断あるいは予後診断の提供に十分であるかもしれない。いくつかの例において、例えば、さらなる統計的検出力を得るために、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、あるいは３６の核酸など、さらに多くのＯＡリスク関連核酸が検査される。特定例において、活性が増加するＯＡリスク関連核酸および活性が減少するＯＡリスク関連核酸の両方が、同一の検査で検知される。
任意の核酸分子の検知方法が使用可能である。例えば、遺伝子活性のレベルは、例えば、ＲＮａｓｅ保護アッセイ、核酸または抗体プローブアレイ、インビトロ核酸増幅（ＲＴ-ＰＣＲまたはリアルタイムＰＣＲなど）、核酸雑種形成（数量的ハイブリダイゼーションを含む）、ドットブロット分析、インサイチューハイブリダイゼーション、あるいはその組み合わせなどの、当技術分野で周知の方法を使用して、定量化可能である。しかしながら、当業者は、他の方法が使用可能になることを高く評価するであろう。
一例において、核酸分子は、被験者から得られた試料から単離され、それによって、単離された核酸分子を生成する。結果として生じる単離された核酸分子は、例えば、ＯＡリスク関連分子を検知可能なオリゴヌクレオチドとハイブリダイズすることによって、検知可能である。一例において、オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションは、単離された核酸分子およびオリゴヌクレオチドの間でのハイブリダイゼーションが可能となるのに十分な期間、単離された核酸分子をオリゴヌクレオチドとインキュベートすることを含み、それによって、単離された核酸分子（オリゴヌクレオチド複合体）を形成する。結果として生じる複合体は、単離された核酸分子活性が変化したかどうかを判定するために分析可能であり、少なくとも４つのＯＡリスク関連核酸の特異的活性の存在が、被験者のＯＡリスクが増加したということを示す。例えば、核酸雑種形成の量は、例えば、複合体を検知および定量化することによって判定可能であり、検査された各ＯＡリスク関連核酸に対するハイブリダイゼーションの量の基準値と比較可能である（例えば、ＯＡリスクを有さない被験者で予期される値または値域など）。
特定例において、ＯＡリスク関連分子を検知可能なオリゴヌクレオチドは、アレイ基盤上に存在する。そのようなオリゴヌクレオチドは、表８および１０〜１３に挙げられる少なくとも４つの分子の任意の組み合わせに相補的である。例えば、被験者から得られる核酸分子は、ハイブリダイゼーション複合体を形成するための適切なハイブリダイゼーション条件の下で、ＯＡリスク検知アレイに適用可能である。特定例において、アレイ上のオリゴヌクレオチドはラベルを含む。他の例では、被験者から単離した核酸分子もラベルを含む。一例において、有機化合物の前処理済み溶液、有機化合物を含む溶液、あるいは温水は、ハイブリダイゼーションの前に適用可能である（本明細書で文献として組み込まれている米国特許番号５，９８５，５６７を参照）。
アレイおよびターゲット材の既定の組み合わせに対するハイブリダイゼーション条件は、予期された二本鎖のＴｍに近い実験に基づいた方法で、規定どおりに最適化が可能であり、それによって、本方法の識別力を最大限にする。結合が生じる細胞などの、アレイの位置の同定は、増幅した材料に存在するＯＡリスクと関連する配列の迅速かつ正確な同定を可能にする（下記参照）。
ハイブリダイゼーション条件は、一致したオリゴヌクレオチドおよび不一致のオリゴヌクレオチドの識別が可能になるよう選択される。ハイブリダイゼーション条件は、フィルターにハイブリダイズするための標準的な方法において適切となるそれらの周知の条件と対応するよう選択可能であり、本発明のアレイとの使用に対して最適化可能である。例えば、１種類の標的のハイブリダイゼーションに対して適切な条件は、アレイのほかの標的を使用できるよう調節される。特に、温度は、正確に相補的なＯＡリスク関連配列以外の配列間にある二本鎖の形成を実質的に取り除くためにコントロールされる。様々な周知のハイブリダイゼーション溶媒が使用可能であり、その選択は当業者に周知の配慮による（米国特許番号５，９８１，１８５を参照）。
被験者からのＯＡリスクと関連のある核酸分子がＯＡリスク検知アレイに存在するオリゴヌクレオチドをハイブリダイズされると、例えば、複合体を検知することによって、ハイブリダイゼーション複合体の存在が分析され、いくつかの例においては、複合体の定量化を含む。
オリゴヌクレオチドプローブのアレイにあるハイブリダイズされた複合体を検知することは、上記で記述された（本明細書で文献として組み込まれている米国特許番号５，９８５，５６７を参照）。一例において、検知は、オリゴヌクレオチド上に存在する１つ以上のラベル、被験者から得られる核酸分子上に存在する１つ以上のラベル、あるいはその両方の検知を含む。特定例において、開発は、緩衝液の適用を含む。一例において、緩衝液は、クエン酸ナトリウム生理食塩水、リン酸ナトリウム生理食塩水、塩化テトラメチルアンモニウム、エチレンジアミン四酢酸のクエン酸ナトリウム生理食塩水、ドデシル硫酸ナトリウムのクエン酸ナトリウム生理食塩水、エチレンジアミン四酢酸のリン酸ナトリウム生理食塩水、ドデシル硫酸ナトリウムのリン酸ナトリウム生理食塩水、エチレンジアミン四酢酸の塩化テトラメチルアンモニウム、ドデシル硫酸ナトリウムの塩化テトラメチルアンモニウム、あるいはその組み合わせである。しかしながら、他の適切な緩衝液も使用可能である。
さらに検知には、ハイブリダイズされた複合体の検知ラベルとの接合または結合をもたらすために、ハイブリダイズされた複合体を接合溶液で処理すること、および接合し、結合したハイブリダイズされた複合体を検知試薬で処理することが含まれる。一例において、接合溶液には、ストレプトアビジンアルカリホスファターゼ、アビジンアルカリホスファターゼ、あるいは西洋ワサビペルオキシダーゼがある。接合溶液の特定の限定されない例は、ストレプトアビジンアルカリホスファターゼ、アビジンアルカリホスファターゼ、あるいは西洋ワサビペルオキシダーゼを含む。接合し、ハイブリダイズされた複合体は、検知試薬で処理可能である。一例において、検知試薬は、酵素標識蛍光試薬または熱量測定試薬を含む。特定の限定されない例では、検知試薬は、モレキュラープローブ社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．、ユージーン、オレゴン州）の酵素標識蛍光試薬（ＥＬＦ）である。ハイブリダイズされた複合体は、紫外線（ＵＶ）トランスイルミネータ（ＵＶＰ社製、ＵＶＰ，Ｉｎｃ．、アップランド、カリフォルニア州）などの、検知装置に設置可能である。信号は開発され、信号強度の増強は、電荷結合素子（ＣＣD）カメラ（フォトメトリックス社製、Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ，Ｉｎｃ．、トゥーソン、アリゾナ州）などの、記録装置で記録可能である。特定例において、これらの工程は、蛍光プローブまたは放射標識が使用される場合は行われない。
ＯＡリスク関連分子のラベリング
核酸分子およびタンパク質が検知されるようにするためのラベリング法は知られている。そのようなラベルの例として、非放射標識および放射標識がある。非放射標識には、酵素、化学発光化合物、蛍光プローブ、金属複合体、ハプテン、比色薬、染料、あるいはその組み合わせがあるが、これらに限定されない。放射標識には、１２５Ｉおよび３５Ｓがあるが、これらに限定されない。当技術分野で周知の他の方法のみならず、放射性および蛍光性ラベリング法は、本発明で使用するのに適切である。一例において、核酸分子を増幅するために使用されるプライマーには、ラベルが付いている（例えば、ビオチン、放射標識、あるいは蛍光プローブの）。他の例では、増幅した核酸試料には、標識増幅した物質を形成するよう末端ラベルが付いている。例えば、増幅した核酸分子は、増幅反応において標識ヌクレオチドを含むことによって、ラベルが付けられる。他の例では、被験者から得られた核酸分子にはラベルが付けられ、オリゴヌクレオチドを含むアレイに適用される。特定例において、被験者から得られたタンパク質には、ラベルが付けられ、その後、例えば、アレイに適用されることによって分析される。
対照との比較
活性レベルの判定には、血清試料などの、被験者から派生した試料にあるＯＡリスク関連分子の量の測定が含まれる。
そのような量は、対照の試料に存在する量と比較可能であり（ＯＡではない被験者あるいはＯＡを発症する素因のない被験者から派生した試料、あるいはＯＡではない被験者あるいはＯＡを発症する素因のない１つ以上の被験者からの類似試料における標準的なＯＡリスク関連分子レベルなど）、対照の試料に相対的な被験者における、表８および１０〜１３に挙げられる少なくとも４つのＯＡリスク関連分子の任意の組み合わせなどの、表８および１０〜１３に挙げられる少なくとも４つのＯＡリスク関連分子の任意の組み合わせのレベルの差異（それぞれ上方制御または下方制御を反映する増減など）が、ＯＡの診断あるいは予後診断に用いられる。
他の例では、その量は、対照の試料に存在する量と比較可能であり（ＯＡではない被験者あるいはＯＡを発症する素因のない被験者から派生した試料、あるいはＯＡではない被験者あるいはＯＡを発症する素因のない１つ以上の被験者からの類似試料における標準的なＯＡリスク関連分子レベルなど）、対照の試料に相対的な被験者における、表８および１０〜１３に挙げられる少なくとも４つのＯＡリスク関連分子の任意の組み合わせなどの、表８および１０〜１３に挙げられる少なくとも４つのＯＡリスク関連分子の任意の組み合わせのレベルに存在する同様の量（４倍未満の差異など）が、ＯＡの診断あるいは予後診断に用いられる。
他の例では、ＯＡリスク関連分子の量は、ＯＡではない被験者、ＯＡを発症する素因のない被験者、ＯＡの被験者、あるいはＯＡを発症する素因のある被験者で予期されるＯＡリスク関連分子の量を表している、値域または標準曲線などの、基準値と比較される。
特定例において、対照、標準、あるいは基準値は、被験者と同じ性別の他の被験者、被験者と同じ年齢幅の他の被験者（例えば、１０年、１２年、あるいは１５年以内を含む、被験者の年齢から５年以内）、あるいはその組み合わせに対するものである。
臨床試料
ＯＡリスクを判定する際の本発明で使用する適切な試料は、例えば、血液または血液分画（血清または血漿など）などの、任意の従来の臨床試料を含む。他の試料の例として、滑液、脳脊髄液、尿、痰、涙液、唾液、排泄物、生検および頬粘膜塗抹標本が挙げられる。そのような試料の採取方法は、当技術分野において周知である（例えば、血清試料の採取は、Ｓｃｈｌｕｇｅｒら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７６：１３２７-３３、１９９２を参照）。血清あるいは他の血液分画は、従来の方法で用意可能である。例えば、約２００μＬの血清は、増幅反応で使用するためのＤＮＡの抽出に使用可能である。しかしながら、ＤＮＡが増幅していない場合、より大量の血液が、採取可能である。例えば、少なくとも５μｇのｍＲＮＡを目的とする場合、約２０〜３０ｍｌｓの血液が採取される。同様に、約２０μｌの血清がＲＣＡマイクロアレイ分析に使用可能である。
一度、試料が得られると、試料は直接使用可能であり、濃縮（例えば、遠心分離またはろ過によって）、精製、増幅、画分、あるいは、例えば、感受性の改善と背景の減少などの、その組み合わせが可能である。例えば、当技術分野で周知の任意の分別、濃度、あるいは精製法は、試験試料として使用される画分に所望の検体が残る限り、使用可能である。例えば、迅速なＤＮＡの調製は、市販されているキット（ＩｎｓｔａＧｅｎｅ Ｍａｔｒｉｘ、バイオ・ラッド社〈ＢｉｏＲａｄ〉、ハーキュリーズ、カリフォルニア州；ＮｕｃｌｉＳｅｎｓ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ、オルガノン・テクニカ社〈Ｏｒｇａｎｏｎ Ｔｅｋｎｉｋａ〉、オランダなど）を使用して調製可能である。一例において、ＤＮＡの調製方法は、核酸増幅を行いやすく、その影響を受けやすいヌクレオチド調製をもたらす。同様に、ＲＮＡも、市販されているキット（ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ、キアゲン社〈Ｑｉａｇｅｎ〉、バレンシア、カリフォルニア州）を使用して調製可能である。
対照の試料は、健康な被験者あるいは病気を患ってはいるがＯＡではない被験者から取得、または派生可能である。対照の試料は、個別で、あるいはまとめて検査可能である。個々の対象からのデータは、「正常」値の範囲を規定するために保存可能である。データは、初期段階で取得可能である。したがって、対照は、試験試料と比較するような形で実行されなくてよい。いくつかの目的に対しては、異なる時点で得られた個人からの試料は、お互いに比較される。そのような場合、評価の必要はないが、任意の対照あるいは正常な試料では必要であることがある。対照の試料は、人口あるいは天然の生体試料のどちらかにおける、特定の分析物の周知の数量を混合することによって、合成的にも産出可能である。
差次的活性検知のためのアレイ
特定の実施例において、表８および１０〜１３に挙げる、開示されたＯＡリスク関連分子の活性変化を検知するための方法は、本明細書で開示されたアレイを使用する。アレイは、例えば、特異なオリゴヌクレオチドプローブまたは抗体プローブを使用して、ＯＡを生じる、またはＯＡに反応して活性が上方制御または下方制御される、核酸またはタンパク質の存在を検知するために使用されることができる。本明細書で「ＯＡリスク検知アレイ」と称するアレイは、例えば、被験者がＯＡであるか野判定、将来ＯＡを発症するリスクの増加があるかの判定、ＯＡ被験者のＯＡの重傷度の判定、ＯＡ被験者またはＯＡ発症の感受性増加の被験者のＯＡの進行のモニタリング、特定の抗ＯＡ治療に反応するＯＡ被験者の同定、またはその組み合わせなど、ＯＡリスクの評価に使用される。
ＯＡリスク検知アレイも、本明細書により提供される。
核酸アレイ
一実施例において、アレイは、表８および１０〜１３に挙げるＯＡリスク関連核酸の２−３６、４−３６、４−３０、４−２５、４−２０、４−１６、４−１５または４−１０の任意の組み合わせなど、表８および１０〜１３に挙げるＯＡリスク関連核酸の少なくとも二つの任意の組み合わせと交雑できる核酸オリゴヌクレオチドを含む。他の特定の実施例において、ＯＡリスク検知アレイは、表８および１０〜１３に挙げるＯＡリスク関連核酸分子の少なくとも４つに、高緊縮の条件下で特異的に交雑できるオリゴヌクレオチドを含む。ある特定の実施例において、アレイは、表８および１０〜１３に挙げるＯＡリスク関連核酸分子の４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３１、３２、３３、３４、３５または３６の任意の組み合わせを認識するオリゴヌクレオチドから構成することができる。例えば、アレイは、表１０、１１、１２または１３の１つに挙げるＯＡリスク関連分子を認識するオリゴヌクレオチドから構成することができる。当該分野に精通した者は、このようなアレイは、内部対照として非ＯＡリスク関連核酸分子を認識するオリゴヌクレオチドも含むことができることを理解する。このようなアレイ（本明細書で説明する方法同様）のいくつかは、表８および１０〜１３に挙げられていないＯＡリスク関連分子を含むことができる。
一実施例において、一連のオリゴヌクレオチドプローブは、被験者から得た核酸分子の配列（ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡなど）など、ＯＡリスク関連の配列検知に使用される固体支持体の表面に付着される。さらに、内部対照の核酸の配列が、（ＯＡでない被験者から得た核酸の配列など）使用される場合、オリゴヌクレオチドプローブは、この対照核酸分子の存在を検知するために含まれる。
アレイに結合されたオリゴヌクレオチドプローブは、被験者から得た、または被験者から増幅された（高緊縮の条件下など）配列を特異的に結合することができる。よって、本方法で使用する配列は、表８および１０〜１３に挙げる遺伝子配列（または対応するタンパク質）など、ＯＡリスク関連配列を認識するオリゴヌクレオチドプローブである。このような配列は、異なる種属の配列の検査と、特定のＯＡリスク関連配列（表８および１０〜１３に挙げる配列など）に特異的に徐冷するが、他には徐冷しない、オリゴヌクレオチドの選択により、判定されることが可能である。当該分野に精通した者は、他のＯＡリスク関連核酸の配列の検知ために、個体支持体の表面に付着できる、他のＯＡリスク関連オリゴヌクレオチド分子を同定できる。
本開示による方法および装置は、適切な条件下で、オリゴヌクレオチドが、相補的ベース配列をもつ核酸分子とベースペア二重鎖を形成するという事実を利用する。二重鎖の安定性は、オリゴヌクレオチドの長さ、ベース成分および交雑が生じる溶液の成分を含む、多くの要因に依存する。二重鎖の安定性のベース成分の作用は、特定の溶液、例えば、第三または第四アミンの高濃度の存在で、交雑を実行することにより減少させることができる。
二重鎖の熱安定性は、配列間の配列の類似性の程度にも依存する。標的配列とアレイに結合されたオリゴヌクレオチド間で形成されると予想される二重鎖のタイプの予測されたＴｍ’ｓに近い温度で交雑を実行することにより、不一致の二重体形成程度が、大幅に減少されるかもしれない。
アレイで使用される各オリゴヌクレオチドの配列の長さは、標的のＯＡリスク関連核酸の配列結合を最適化するために選定されることができる。特異的なスクリーニング条件下で、特定のＯＡリスク関連核酸の配列と使用するための最適な長さが、経験に基づいて判定できる。よって、アレイの配列を含む、一連のオリゴヌクレオチドの配列の各個別の要素の長さが、スクリーニングのために最適化される。一実施例において、オリゴヌクレオチドプローブは、長さが約２０から約３５ヌクレオチド、または長さが約２５から約４０ヌクレオチドである。
アレイを形成するオリゴヌクレオチドプローブは、直接支持体に付着できる。代替的に、オリゴヌクレオチドプローブは、スペーサーまたは個体支持体へのリンカーとして働く、オリゴヌクレオチドまたは他の分子など、非ＯＡリスク関連の配列により支持体に付着される。
タンパク質アレイ
特定の実施例において、アレイは、表＿に挙げるＯＡリスク関連タンパク質の２−３６、４−３６、４−３０、４−２５、４−２０、４−１６、４−１５、または４−１０の任にの組み合わせなど、表８および１０〜１３に挙げる（特異的に結合する）ＯＡリスク関連タンパク質の少なくとも４つを認識するタンパク質の配列（またはこのようなタンパク質の断片またはこのようなタンパク質またはタンパク質の断片に特異的な抗体）を含む。ある特定の実施例において、アレイは、表８および１０〜１３に挙げるＯＡリスク関連タンパク質の４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５または３６の任意の組み合わせを認識するオリゴヌクレオチドから構成することができる。例えば、アレイは、表１０、１１、１２または１３の１つに挙げるＯＡリスク関連分子を認識する抗体から構成することができる。当該分野に精通した者は、このようなアレイは、内部対照として非ＯＡリスク関連タンパク質を認識する抗体も含むことができることを理解する。
アレイを形成するタンパク質または抗体は、支持体に直接連結することができる。代替的に、タンパク質または抗体は、個体支持体にスペーサーまたはリンカーにより、支持体に付着することができる。
ＯＡリスク関連タンパク質の発現の変化は、例えば、検知できる薬剤を用いて、場合により、標識されるＯＡリスクタンパク質特異結合薬剤を使用して検知できる。特定の実施例において、タンパク質の発現変化の検知は、（例えば、アレイ上に存在する）ＯＡリスクタンパク質特異結合薬剤により被験者から得たタンパク質試料を接触し、結合薬剤が、試料により結合されたかどうかを検知し、これにより、試料に存在するＯＡリスク関連タンパク質のレベルを測定することを含む。特定の実施例において、ＯＡでない被験者からの類似した試料で得たＯＡリスク関連タンパク質のレベルと比較した、試料のＯＡリスク関連タンパク質のレベルの差異は、被験者がＯＡであること示唆する。
アレイ基質
個体支持体は、有機ポリマーから形成することができる。個体支持体に適切な材料は、これに制限されるものではないが、ポリピロピレン、ポリエチレン、ポリブチレン、ポリイソブチレン、ポリブタジエン、ポリイソプレン、ポリビニルピロリジン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリビニリデンフルオライド、ポリフルオロエチレン−プロピレン、ポリエチレンビニルアルコール、ポリメチルペンテン、ポリクロロトリフルオロエチレン、ポリスルホン、ヒドロキシル化二軸配向ポリプロピレン、アミノ化二軸配向ポリプロピレン、チオール化二軸配向ポリプロピレン、エチレンアクリル酸、エチレンメタアクリル酸およびこれらのコポリマーの混合（米国特許番号５，９８５，５６７を参照資料として本明細書の一部とする）を含む。一実施例において、個体支持体の表面は、ポリプロピレンである。
一般的に、個体支持体の表面の形成に使用できる材料の適切な特徴は、活性時に支持体の表面が、オリゴヌクレオチドの表面付着など、生体分子を共有結合的に付着できるため、表面の活性に適切である、生体分子の原位置合成に適切である、オリゴヌクレオチドまたはタンパク質により占有されていない支持体上の部分は、非特異結合に適切でないため、化学的に不活性、または非特異結合が生じる場合、そのような材料は、オリゴヌクレオチドまたはタンパク質を除去せずに、容易に表面から除去できる、ことを含む。
他の実施例において、表面活性された有機ポリマーは、個体支持体の表面として使用される。表面活性された有機ポリマーの一実施例は、ラジオ周波数プラズマ放電を介してアミン化された、ポリプロピレンである。活性された有機ポリマー上のアミングループは、ヌクレオチド分子がポリマーに結合されるため、ヌクレオチド分子と反応性である。カルボキシル化、ヒドロキシル化、チオール化または活性エステルグループなど、他の反応性グループも使用できる。
アレイ形
多様なアレイ形が、本開示により使用されることが可能である。一実施例は、当該分野において、一般的にディップスティックいわれる、オリゴヌクレオチドまたはタンパク質のバンドの直線アレイを含む。他の適切な形は、個別細胞の二次元パターン（６４ｘ６４アレイで４０９６平方など）を含む。当該分野に精通した者に理解されるように、これに制限されるものではないが、スロット（長方形）および円形アレイを含む他のアレイ形は、使用に等しく適切である（米国特許番号５，９８１，１８５を参照）。一実施例において、アレイは、糸、膜またはフィルムである、ポリマー媒体で形成される。有機ポリマー媒体の一例は、フィルムの厚さは、重要ではなく、かなり幅広い範囲で変更できるが、約１ｍｉｌ（０．００１インチ）から約２０ｍｉｌの厚さのポリプロピレンシートである。特に、開示されたアレイの調製は、二軸配向ポリプロピレン（ＢＯＰＰ）フィルムである。
本開示のアレイ形には、多様な異なる形のタイプが含まれる。「形」は、マイクロタイタープレート、試験管、無機シート、ディップスティック、およびそれに似たものなど、個体支持体が付着できる任意の形である。例えば、個体支持体がポリプロピレン糸の場合、１つ以上のポリプロピレン糸は、プラスチックのディップスティックタイプのデバイスに付着することができ、ポリプロピレン膜は、ガラスのスライドに付着できる。特定の形自体は、重要でない。必要なことは、個体支持体が、個体支持体または個体支持体に吸収された任意のバイオポリマーの機能的作用を影響することなく付着でき、形（ディップスティックまたはスライドなど）が、デバイスが導入される任意の材料（臨床資料および交雑溶液など）において安定していることである。
本開示のアレイは、多様な方法で調製することができる。一実施例いおいて、オリゴヌクレオチドまたはタンパク質の配列が、個々に合成されてから、個体支持体に付着される（米国特許番号６，０１３，７８９を参照）。他の実施例において、配列は、所望のアレイを得るために、直接、支持体に合成される（米国特許番号５，５５４，５０１を参照）。共有結合的にオリゴヌクレオチドおよびタンパク質を個体支持体に結合し、オリゴヌクレオチドまたはタンパク質を支持体に直接合成するための適切な方法は、当該分野で働くものには周知である。適切な方法の要約は、Ｍａｔｓｏｎら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１７：３０６−１０，１９９４で確認できる。一実施例において、オリゴヌクレオチドは、個体支持体にオリゴヌクレオチドを調製するための従来の化学方法を使用して、支持体に合成される（ＰＣＴ出願ＷＯ８５／０１０５１およびＷＯ８９／１０９７７または米国特許番号５，５５４，５０１の参照など）。
オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの３’末端またはオリゴヌクレオチドの５’末端により、個体支持体に結合される。当該分野に精通した者が、オリゴヌクレオチドの３’末端または５’末端の使用が、個体支持体への結合に適切かどうかを判定することができる。一般的に、３’末端または５’末端の領域でのオリゴヌクレオチドプローブの内部相補は、支持体への結合を判定する。
特定の実施例において、アレイ上のオリゴヌクレオチドまたはタンパク質プローブは、プローブ：標的配列複合体の検知を可能にする、１つ以上の標識を含む。
キット
本開示は、例えば、被験者がＯＡであるかどうかの判定、将来ＯＡを発現するリスクの増加があるかどうかの判定、ＯＡである被験者のＯＡの重傷度の評価、ＯＡの被験者またはＯＡ発症の感受性増加の被験者のＯＡの進行のモニタリング、特定の抗ＯＡ治療に反応するＯＡの被験者の同定、またはその組み合わせなど、ＯＡリスクの評価のために使用されるキットを提供する。このようなキットは、技術者に、被験者が表８および１０〜１３に挙げる分子の４つ以上の任意の組み合わせなど、ＯＡリスク関連分子の差次的活性をもつかどうかの判定を可能にする。
開示されたキットは、キットの標的であるＯＡリスク関連分子と任意に交雑または結合する、オリゴヌクレオチドプローブまたはタンパク質プローブ（抗体プローブなど）、結合分子を含む。特定の実施例において、プローブは、本明細書で説明されたアレイなどに付着される。一実施例において、キットは、表８および１０〜１３に挙げる分子の少なくとも４つの任意の組み合わせを認識する。
キットは、１つ以上の緩衝液、重要な信号発現のための共役溶液、または重要な信号検知のための検知試薬をさらに含み、それぞれ、容器などに別々に梱包される。他の実施例において、キットは、陽性対照として働くため、ＯＡ検知アレイと結合するための複数のＯＡリスク関連標的分子を含む。標的分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡなどのオリゴヌクレオチド、ペプチド−核酸、ＰＣＲ断片またはタンパク質（抗体など）を含むことができる。
骨関節炎の治療
本開示は、本開示の方法を使用して、ＯＡと診断された被験者または将来のＯＡの発症リスクの増加の判定など、被験者のＯＡリスクの増加を判定するＯＡの治療方法を提供する。例えば、上述のアッセイを使用して、表８および１０〜１３に挙げる少なくとも４つのＯＡリスク関連分子活性の変更が、被験者において検知される、例えば、表８および１０〜１３に挙げるＯＡリスク関連分子の少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも１０、少なくとも１３、または少なくとも１６が、被験者において検知される場合、治療は、関節損傷の回避または減少、または関節損傷のオンセットの遅延のために選択される。そして、被験者は、この選択、例えば、１つ以上の抗炎症剤の投与、グルコサミンまたはコンドロイチン硫酸およびその派生物の投与、荷重関節ＯＡの予防戦略としての体重管理の開始、反復損傷軽減するための仕事に関連する生体工学改善の戦略の展開、スポーツ関連損傷減少のためのプログラムの開始、およびＯＡの発症リスクのある青少年の回復プログラムの開始、例えば、被験者のＯＡ発症の回避または遅延またはその組み合わせなど、により治療される。ある実施例において、選択された治療は、１つ以上のＯＡリスク関連分子の被験者のプロファイルの分析に基づき、特定で、被験者に合うように調整される。
試験薬のスクリーニング
分子の活性がＯＡに反応して、またはＯＡを生じるために変更される、複数のＯＡリスク関連分子（表８および１０〜１３に挙げる分子など）の同定に基づき、本開示は、これらの作用を向上、正常化または反転できる薬剤の同定方法を提供する。例えば、本方法は、ＯＡリスク関連分子の活性を正常化する薬剤の同定が可能である。ＯＡリスク関連分子の活性（活性など）の正常化は、活性がＯＡに反応して、またはＯＡを生じるために増加するＯＡリスク関連分子の活性の減少、または活性がＯＡに反応して、またはＯＡを生じるために減少するＯＡリスク関連分子の活性の増加を含む。他の実施例において、本方法は、活性が、ＯＡである、またはＯＡ発症のリスクの増加がある被験者に保護的作用を提供するＯＡリスク関連分子の活性を向上する薬剤の同定が可能である。例えば、本方法は、拮抗剤の同定が可能である。さらに他の実施例において、本方法は、ＯＡリスク関連分子の活性が１つ以上のＯＡのマイナス的症状を生じるなど、ＯＡリスク関連分子の活性を減少する薬剤の同定を可能にする。例えば、本方法は、拮抗剤の同定が可能である。
特定の実施例において、同定された薬剤は、ＯＡの被験者または将来ＯＡを発症するリスクの増加のある被験者の治療に使用できる。例えば、ＯＡの哺乳動物（ヒトまたは獣医学被験対象）または将来ＯＡを発症するリスクの増加のある哺乳動物は、哺乳動物治療のために開示されたスクリーニング方法を使用して同定された１つ以上の薬剤を投与される。
開示された方法は、例えば、培養された細胞に試験薬を添加することにより、インビトロで実行できる、または例えば、哺乳動物（ヒトまたは実験動物、例えばマウス、ラット、イヌまたはウサギなど）に試験薬を投与することにより、インビボで実行できる。特定の実施例において、本方法は、ＯＡを模擬または誘発するのに十分な条件に細胞または哺乳動物を暴露することを含む。このような方法は、当該分野において周知である。１つ以上の試験薬が、表８および１０〜１３に挙げる分子の少なくとも１つなど、１つ以上のＯＡ関連分子の活性を変更するのに十分な条件下で、細胞培養に添加または哺乳動物に投与される。その後、ＯＡリスク関連分子の活性が、例えば、１つ以上のＯＡリスク関連分子の発現の測定により、または１つ以上のＯＡ関連タンパク質の生体活性量の測定により、判定される。１つ以上のＯＡリスク関連分子の活性の変更は、試験薬が、表８および１０〜１３に挙げるＯＡリスク関連分子の活性を変更することを示唆する。特定の実施例において、活性の変更は、ＯＡでない、またはＯＡリスクのないときの活性量の存在、またはＯＡである、またはＯＡリスクのあるときの活性量の存在など、標準または基準値との比較、または対照（試験薬を投与されない細胞または被験者など）との比較により判定される。
本開示の方法を用いて同定した治療薬は、さらに大きな所望する活性の他の薬剤を同定するためのリード化合物として使用できる。さらに、同定された化学成分の類似体、または変種、断片またはペプチド試験薬の融合は、開示されたアッセイを使用してＯＡリスク関連分子の活性の変更能力を試験できる。候補薬剤は、動物で安全性を試験し、その後、動物またはヒトで臨床試験に使用することができる。
試験薬
任意の適切な化合物または成分は、芳香族、脂肪酸、および炭水化物を含む有機または無機化学物質、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体および他の特異結合薬剤を含むペプチド、ホスホペプチドまたは核酸分子など、試験薬として使用できる。ある特定の実施例において、試験薬は、無作為のペプチドライブラリー（例えば、Ｌａｍら， Ｎａｔｕｒｅ ３５４：８２−４， １９９１を参照）、無作為または部分的変性の方向づけされたホスホペプチドライブラリー（例えば、Ｓｏｎｇｙａｎｇら、Ｃｅｌｌ ７２：７６７−７８， １９９３を参照）を含む。試験薬は、複雑混合物または分子の「カクテル」も含む。
試験薬剤は、当該分野で既に周知の薬理剤、または任意の医薬活性をもつ以前未知であった化合物であってよい。化合物は、自然に発生、または実験室で設計されることができる。化合物は、微生物、動物または植物から単離され、組換えにより生成、または当該分野で周知の化学方法により合成できる。所望するなら、試験物質は、これに制限されるものではないが、生物学的ライブラリー、空間的位置決定可能な並列固相ライブラリーまたは溶相ライブラリー、分解分離を要する合成ライブラリー法、「１ビーズ１化合物」ライブラリー法、および親和性クロマトグラフ選択を使用した合成ライブラリー法を含む、当該分野において周知の任意の多数の組み合わせライブラリー法を使用して得ることができる。生物学的ライブラリー法は、ポリペプチドライブラリーに制限されるが、他の４つの方法は、ポリペプチド、非ペプチドオリゴマーまたは化合物の小分子ライブラリーに適用される（例えば、Ｌａｍ，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ．１２：１４５，１９９７を参照）。
分子ライブラリーの合成方法は、当該分野において周知である（例えば、ＤｅＷｉｔｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：６９０９， １９９３；Ｅｒｂら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９１：１１４２２，１９９４；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：２６７８，１９９４；Ｃｈｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１：１３０３，１９９３；Ｃａｒｅｌｌら、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０５９，１９９４；Ｃａｒｅｌｌら、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０６１；Ｇａｌｌｏｐら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：１２３３，１９９４を参照）。化合物のライブラリーは、溶液中（例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １３：４１２-２１，１９９２を参照）またはビーズ上（Ｌａｍ，Ｎａｔｕｒｅ ３５４，８２−４，１９９１）、チップ（Ｆｏｄｏｒ，Ｎａｔｕｒｅ ３６４：５５５−６， １９９３）、細菌または胞子（Ｌａｄｎｅｒ，米国特許５，２２３，４０９）、プラスミド（Ｃｕｌｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：１８６５-９，１９９２）またはファージ（Ｓｃｏｔｔ&Ｓｍｉｔｈ，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４９：３８６-９０，１９９０；Ｄｅｖｌｉｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：４０４-６，１９９０）；Ｃｗｉｒｌａら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９７：６３７８-８２，１９９０；Ｆｅｌｉｃｉ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：３０１-１０，１９９１；ａｎｄ Ｌａｄｎｅｒ，米国特許５，２２３，４０９）に存在する。
インビトロアッセイ
一実施例において、本方法は、インビトロアッセイである。例えば、インビボでＯＡに反応してなにが起こるのか、またはＯＡを生じる（軟骨細胞など）のになにが起こるのかのモデルを提供する細胞などの細胞は、酸化ストレスなど、ＯＡを模擬するのに十分な条件下で培養される。他の実施例において、ＯＡの被験者から得た細胞（例えば、軟骨細胞）が、使用される。１つ以上の試験薬は、例えば、ＯＡリスク関連分子の活性を変更（正常化など）するためなど、試験薬が細胞に所望の作用を与えるのに十分な条件下で細胞と培養される。細胞が、ＯＡを模擬または誘発するために処置される実施例において、試験薬は、このような治療前、治療中、または治療後に添加される。他の実施例において、細胞は、ＯＡの哺乳動物から得、試験薬と培養される。特定の実施例において、試験薬は、１つ以上のＯＡリスク関連分子に所望の作用を与える。
使用される細胞の例は、これに制限されるものではないが、軟骨細胞を含む。軟骨細胞は、哺乳動物などの被験者からも得られ、一般的な方法を使用して一次培養として増殖される。例えば、軟骨細胞は、軟骨から得られる（例えば、Ｙｕｄｏｈら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｅｓ Ｔｈｅｒ．７（２）：Ｒ３８０−９１，２００５を参照）。一実施例において、アメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）および他の市販供給源から入手可能なものなど、確立された軟骨培養細胞株が、使用される。例えば、適切な媒体で軟骨細胞に分化される軟骨細胞マウス間質細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１２４２４）は、使用される細胞株のある特定の実施例である。しかし、当該分野に精通した者は、他の細胞株が使用できることを理解する。
インビトロでＯＡを模擬または誘発するのに十分な条件を提供する方法は、当該分野において周知である。例えば、ＯＡは、Ｈ２Ｏ２の存在下、細胞培養により軟骨細胞で誘発できる。ＯＡの模擬には、ＯＡ被験者の関節軟骨から得た軟骨細胞など、ＯＡの哺乳動物からの細胞を培養することができる。
１つ以上の試験薬は、試験薬が細胞に所望の作用を与えるのに十分な条件下で細胞と培養される。細胞がＯＡを模擬または誘発するために処置される実施例において、試験薬は、ＯＡの模擬または誘発する前、後または実質的に同時に細胞に添加される。一実施例において、薬剤は、ＯＡの模擬または誘発の少なくとも１日後、少なくとも５日後、少なくとも７日後、少なくとも１４日後、少なくとも３０日後、少なくとも６０日後またはさらに少なくとも９０日後など、ＯＡの模擬または誘発の１２時間後に添加される。
試験薬は、少なくとも１０分間、少なくとも３０分間、少なくとも１時間、少なくとも６時間、少なくとも２４時間、少なくとも７２時間、少なくとも７日間、少なくとも１４日間または少なくとも３０日間など、試験薬が細胞に所望の作用を与えるのに十分な時間で細胞と培養される。
インビボアッセイ
他の実施例において、本方法は、インビボアッセイである。例えば、インビトロアッセイで候補として同定された薬剤は、ＯＡリスク関連分子（表８および１０〜１３に挙げる分子の１つ以上など）の活性変更（正常化など）の能力を、インビボで試験される。特定の実施例において、試験哺乳動物は、ＯＡを自然に発症、またはＯＡを誘発する条件に暴露される。同時またはその後、例えば、ＯＡリスク関連分子の活性またはＯＡリスク関連分子のパターンを変更（正常化など）するなど、試験薬が被験者に所望の作用を与えるのに十分な条件下で、１つ以上の試験薬が被験者に投与される。特定の実施例において、試験薬は、１つ以上のＯＡリスク関連分子に所望の作用を与える。
インビボでＯＡを誘発するのに十分な条件を提供する方法は、当該分野において周知である。例えば、ＯＡの動物モデルは、ラットＯＡモデル（例えば、Ｆｅｒｎｉｈｏｕｇｈら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． Ｌｅｔｔ． ２００５ Ｊｕｌ １９）、マウスＯＡモデル（再見にはＹｏｕｎｇ， Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｓｃｉ． ２６：３３３−５， ２００５ を参照 ）およびウサギＯＡモデル（例えば、Ｋｏｂａｙａｓｈｉら、 Ｉｎｆｌａｍｍ Ｒｅｓ． ５４：２４９−５５， ２００５）など、容易に利用可能である。例えば、部分的な内側半月板切除術、またはノードアセテートの滑膜腔への注入（例えば、Ｆｅｒｎｉｈｏｕｇｈら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． Ｌｅｔｔ． ２００５ Ｊｕｌ １９を参照）により、ＯＡを哺乳動物（ラット、マウス、ヒト以外の霊長類など）に誘発できる。さらに、ＳＴＲ／１Ｎマウス（例えば、Ａｖｅｒｂｅｃｋら、Ｊ． Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ． ３１：２０１３−２０， ２００４を参照）およびアカゲザル（例えば、Ｃｈａｔｅａｕｖｅｒｔら、Ｊ． Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ． １７：７３−８３， １９９０を参照）などの自然にＯＡを発症する動物モデルは、当該分野において周知である。
試験薬が被験者に所望の作用を与えるのに十分な条件下で、１つ以上の試験薬が被験者に投与される。静脈内、筋肉内、経皮または患部関節への直接注入など、任意の適切な投与方法が使用される。薬剤は、ＯＡの発症または誘発の後、またはＯＡの発症または誘発と実質的に同時に投与されることができる。一実施例において、薬剤は、ＯＡの発症または誘発の少なくとも１日後、少なくとも５日後、少なくとも７日後、少なくとも１４日後、少なくとも３０日後、少なくとも６０日後またはさらには少なくとも９０日後に添加される。
試験薬は、例えば、１つ以上の用量で、一、二または三投与など、または毎日、週毎、または月毎の投与など、試験薬が哺乳動物のＯＡに所望の作用を与えるのに十分な条件下で、１つ以上の用量で哺乳動物に投与することができる。
作用の判定
１つ以上ＯＡリスク関連分子の活性における１つ以上の試験薬の作用は、当該分野で周知の方法を使用して判定できる。例えば、１つ以上のＯＡリスク関連分子の活性に体する作用は、本明細書で開示したアレイおよび方法により判定することができる。
例えば、ＲＮＡは、試験薬に暴露された培養細胞から、または試験薬を投与した被験者から得た細胞から、単離することができる。単離されたＲＮＡは、標識され、表８および１０〜１３に挙げる遺伝子の少なくとも１つ、少なくとも２つ、または少なくとも３つなど、１つ以上の事前選択されたＯＡリスク関連遺伝子、またはＯＡリスクに関連するそのような遺伝子のパターンに、特異的に交雑することができる、１つ以上の核酸分子（プライマーまたはプローブなど）を含むアレイに暴露される。亜特定の実施例において、１つ以上の事前選択されたＯＡ関連遺伝子は、ＩＬ−１５、ｓＶＡＰ−１、ＵＰＡＲ、ｖＣＡＭ−１、ＭＩＰ−１β、ＭＩＰ１−β、６−Ｃｋｉｎｅ、ＩＣＡＭ−３、ＴＧＦ−βＲＩＩＩまたはＰＡＩ−１の１つ以上を含む。
他の実施例において、タンパク質は、試験薬に暴露された培養細胞から、または試験薬（血清試料など）を投与した被験者から得えられた。タンパク質を含む試料は、表８および１０〜１３に挙げるタンパク質の少なくとも１つ、少なくとも２つ、または少なくとも３つなど、１つ以上のＯＡリスク関連タンパク質の発現量または生物学的活性、または事前に同定された、または事前に選別されたタンパク質の上方制御または下方制御のパターンを判定するために分析される。ある特定の実施例において、１つ以上の事前に選択されたＯＡ関連タンパク質は、ＩＬ−１５、ｓＶＡＰ−１、ＵＰＡＲ、ｖＣＡＭ−１、ＭＩＰ−１β、ＭＩＰ１−δ、６−Ｃｋｉｎｅ、ＩＣＡＭ−３、ＴＧＦ−βＲＩＩＩまたはＰＡＩ−１の１つ以上含む。ある特定の実施例において、ＲＣＡタンパク質チップは、タンパク質を分析するために使用される。
特定の実施例において、ＯＡリスク関連分子の差次的活性は、標準、基準値または対照と比較される。一実施例は、ＯＡでない被験者に存在する、またはＯＡでない被験者に予測されるＯＡリスク関連分子の活性量を含み、対照と比較されたＯＡ関連分子（表８および１０〜１３に挙げる分子など）の試験試料の活性の増加または減少は、試験薬が少なくとも１つのＯＡリスク関連分子の活性を変更することを示唆する。他の実施例は、ＯＡの被験者に存在する、またはＯＡの被験者に予測されるＯＡリスク関連分子の活性量を含み、対照と比較されたＯＡリスク関連分子（表８および１０〜１３に挙げる分子など）の試験試料の活性の増加または減少は、試験薬が少なくとも１つのＯＡ関連分子の活性を変更することを示唆する。他の実施例において、対照は、試験薬の不在で存在する活性の量を含む。差次的活性の検知は、遺伝子発現での変化の測定、タンパク質量の測定、またはタンパク質が存在する生物学的活性量の判定を含む。
理想的には、試験薬は、ＯＡリスク関連分子（タンパク質など）の活性を正常化するため、試験薬の存在において、ＯＡリスク関連分子の活性は、ＯＡリスク不在のＯＡリスク関連分子の活性により近く類似する。つまり、ＯＡリスク関連分子の活性が、ＯＡリスク不在の分子の活性に対して、ＯＡ被験者で減少する場合、試験薬は、試験薬を受けた試料のＯＡリスク関連分子の活性を理想的に上昇する。同様に、ＯＡリスク関連分子の活性が、ＯＡリスク不在の分子の活性に対して、ＯＡ被験者で上昇する場合、試験薬は、試験薬を受けた試料のＯＡリスク関連分子の活性を理想的に減少する。特定の実施例において、差次的活性は、標準、基準値、または対照試験物質と比較した試験試料が、試験物質の不在のＯＡリスク関連分子の活性に対して、統計上有意な量（ｐ≦０．０５）で、ＯＡリスク関連分子の活性を減少または増加する時、存在する。他の実施例において、差次的活性は、標準、基準値または対照（ＯＡの被験者のＯＡリスク関連分子の活性量など）と比較した試験試料が、対照のＯＡリスク関連分子の活性に対して少なくとも５倍、または少なくとも１０倍など、少なくとも４倍のＯＡリスク関連分子の活性を減少または増加する。
特定の実施例において、ＯＡリスク関連分子の活性を正常化する試験薬は、例えば、さらなる臨床分析のために選択される。
ハイスループットスクリーニング
試験薬は、ハイスループットスクリーニングを使用して、１つ以上のＯＡリスク関連分子（タンパク質またはタンパク質をコード化するポリヌクレオチドなど）の活性（正常化など）に影響をおよぼす能力においてスクリーニングされる。ハイスループットスクリーニングを使用して、多くの個別の化合物が、並列して試験されるため、数多くの試験物質が速くスクリーニングできる。幅広く確立された方法は、９６ウェルマイクロタイタープレートを使用する。マイクロタイタープレイートのウェルは、基本的に５０から５００μｌの範囲のアッセイ容量を使用する。プレートに加え、多くの器具、材料、ピペッター、自動装置、プレートワッシャーおよびプレートリーダーが、９６ウェル形式に装着するのに市場で入手可能である。
代替的に、「自由形式アッセイ」または試料間で物理的障害のないアッセイが使用される。例えば、組み合わせペプチドライブラリーの簡単な均一アッセイで色素細胞（メラニン細胞）を使用したアッセイは、Ｊａｙａｗｉｃｋｒｅｍｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１９，１６１４-１８（１９９４）により説明される。細胞は、アガロース下でペトリ皿に置かれ、次に組み合わせ化合物を保有するビーズが、アガロースの表面上に置かれる。組み合わせ化合物は、部分的にビーズから遊離される。化合物がゲル基質に局所的に拡散すると、活性化合物は細胞の色を変化させるため、活性化合物は暗い色素領域として可視化される。
他のハイスループットスクリーニング方法は、Ｂｅｕｔｅｌら、米国特許５，９７６，８１３で説明される。この方法において、試験試料は、多孔性基質に置かれる。１つ以上のアッセイ成分は、次にゲル、プラスチックシート、フィルターまたは容易に処理される個体支持体の他の形など、基質の内、上または底に置かれる。試料が多孔性基質に投入されると、それらは、徐々に拡散するため、アッセイは、試験試料が共に処理されずに実行される。
本開示は、以下の制限のない実施例により、さらに図示される。
実施例１
評価される被験者
ケースコントロール研究は、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ Ｌｏｎｇｉｔｕｄｉｎａｌ Ｓｔｕｄｙ ｏｆ Ａｇｉｎｇ（ＢＬＳＡ）内で行われた。ＢＬＳＡは、４０年以上、総合的な隔年検査を通じて、大規模なボランティア集団による、規範的な老化現象の長期的な研究である(Shock. The physiological basis of aging. New York: Human Sciences; 1985)。
参加者は、ほとんどが白色人種（９６％）であり、上流中産階級の社会・経済的地位を持つ、研究参加には１９歳から９２歳の地域社会に暮らす健康ボランティアであった。さらなる詳細は、表１に提供される。
（表１）年齢層別の被験者数および初期および分類X線の特徴
Figure 2008510168
１９８４年から１９９１年の間、両手の単一の後方から前方への（ＰＡ）放射線写真、および体重を支える、十分に伸ばした両膝の前後（ＡＰ）の放射線写真が、１９８４年から１９９１年の間に半年ごとの一度以上の訪問で取得され、同様の手順を用いて取得した膝のX線の複写セットは、１９９５年から１９９８年の間で半年ごとの訪問の際に取得された。初期およびフォローアップのX線の平均間隔は、約１０年であった(Hochberg et al. Osteoarthritis Cartilage 12 Suppl A: S45-8, 2004)。
１９８４年から１９９１年の間に撮られたすべての放射線写真は、アトラスの標準放射線写真で説明されたようにＫｅｌｌｇｒｅｎ−Ｌａｗｒｅｎｃｅ（ＫＬ）を用いて、二人の訓練された助手により１９９２年から１９９３年にＯＡのために単独で評価された(Kellgren and Lawrence, Atlas of Standard Radiographs of Arthritis. The Epidemiology of Chronic Rheumatism. 1963;II)。膝のＯＡの定義は、どちらか一方でも膝のＫＬグレードが２より高いものとして定義された。手のＯＡは、どちらか一方でも手の遠位指節間（ＤＩＰ）、近位指節間（ＰＩＰ）、第一手根中手（ＣＭＣ１）関節にあたる１つ以上でＫＬのグレードが２より高いものとして定義された。対の放射線写真は、二人の訓練を受けた助手、意見の不一致を判定する第三の訓練を受けた助手により、参加者の身元確認、検査の時間および配列から盲目的に行われた。二人の検査人の間でのＫＬグレードでの同意のためのクラス内相関係数は、基準およびフォローアップフィルムで０．８３から０．８５であった(Scott et al. Invest. Radiol. 28:497-501, 1993)。
ＢＬＳＡの参加者が、基準Ｘ線セットでＯＡ、および対応する時間間隔で取得した血清試料のセットの証拠がないとして記録された手および膝のＸ線の２セットを持つ場合、適格者とされた。ここに報告されたデータは、初期Ｘ線で同時に取得した１つめの試料、および対照から症例を判別する第２Ｘ線の時期に取得した第２試料からのものである。初期Ｘ線に先立って、約５年参加者を管理することから取得した第３の試料も分析された。
第２Ｘ線において、片膝または両膝および片手または両手にＸ線写真でＯＡを有する参加者は、偶発的なＯＡ症例として分類された。両時点で「正常な」膝と手のＸ線を有する参加者は、対照となる。年齢、性別および肥満度指数により一致した３つの対照がそれぞれの偶発的なＯＡ症例として選択された。これらの詳細は、図１に説明されている。
実施例２
Ｒｏｌｌｉｎｇ Ｃｉｒｃｌｅ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＲＣＡ）タンパク質マイクロアレイ
スライドグラスには、３−シアノプロピルトリエトキシシランで洗浄され、誘導体化された。スライドは、スライドを直径０．６５ｃｍの１６のウェルに分割したテフロンマスクまたは、サブアレイと称する循環分析サイトを装備した（図２）。それぞれのマイクロアレイスポットに溶滴（〜３５０ｐＬ）を分注する、圧電性のチップを備えたＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ ＳｐｏｔＡｒｒａｙ Ｅｎｔｅｒｐｒｉｓｅの非接触アレイヤーを用いて印刷を仕上げた。抗体には、確定位置で０．５ｍｇ／ｍＬの濃度で適応した。各チップは、アレイ１、２、３、４、５、または６のいずれかのうち１タイプのアレイ１６枚のコピーで印刷した。下記の表２〜７に示されたように、各サブアレイで４通作成したスポットを用いて抗体のセットを印刷した。
印刷後、チップは、軽視顕微鏡を用いて検査した。観測された欠落スポットの割合が５％より大きい場合、失敗したバッチおよびスライドは、直ちに処分された。ここに説明されたすべての印刷では、抗体機能の１００％および９５％を超えるビオチン口径測定器を印刷した。
２つの方法で条件付きの試薬セットに呼応して、マイクロアレイチップを認証した。初めに１から３の異なるサイトカインの混合物を高強度信号に供給するために準備し、（抗体検出器の最大総補体までの異なる混合物を扱う、各ウェルを備えた）チップにある１４のウェルに使用した。空白の対照として２つのアレイを使用した。チップを発展、走査し、結果の信号を特定のアレイの位置地図と比較した。第２に、周知の試料マトリクスを用いて、特定アレイですべてのタンパク質検体の滴定品質管理が行われた。正常ヒューマン血清とヘパリン化血漿は、ストレートまたは、アレイ中にすべてのタンパク質検体を代表する精製された組み換えサイトカインを用いた溶液で測定した。混合溶液は、サイトカインの入っていない対照試料のための２つのサブアレイに加えて、サイトカイン濃度が９，０００ｐｇ／ｍＬから３７ｐｇ／ｍＬ含まれたスライドのサブアレイを滴定した。データは定量化され、アレイ中のすべてのタンパク質分析物に関して、濃度の関数として強度挙動機能を検定するために滴定曲線が生成された。これらをもとにして、アレイ機能および試薬セットの活性を確認するためにこのデータを使用した。
（表２）アレイ１のタンパク質分析物
Figure 2008510168
（表３）アレイ２のタンパク質分析物
Figure 2008510168
（表４）アレイ３のタンパク質分析物
Figure 2008510168
（表５）アレイ４のタンパク質分析物
Figure 2008510168
（表６）アレイ５のタンパク質分析物
Figure 2008510168
（表７）アレイ６のタンパク質分析物
Figure 2008510168
実施例３
Ｒｏｌｌｉｎｇ Ｃｉｒｃｌｅ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＲＣＡ）免疫学的検定
この実施例は、調査の参加者から少なくとも２つの異なる時点（分類時期および１０年前）で採取した血清中で、表２〜７に記載されている１６９のタンパク質の存在を分析するための使用方法を説明するものである。当業者は、類似の方法がほかのタンパク質および異なる試料（尿または滑液など）を分析するために使用されることを十分理解しうる。ＲＣＡ信号増幅を有する免疫測定を行うための基礎は、周知のことである（例えば、Ｓｃｈｗｅｉｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｏｌ．２０：３５９−６５、２００２、Ｋｉｎｇｓｍｏｒｅ ｅｔ ａｌ． Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １４：７４−８１、２００３、および Ｐｅｒｌｅｅ ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｓｃｉ． ２：９、２００４を参照）。
アッセイに先立って、室温で保存された密閉された容器から取り出され、湿度を管理された部屋で、スライドを開封した（４５〜５５％）。スライドは、Ｓｅａｂｌｏｃｋ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）を用いて閉鎖し、湿気のある部屋の中で３７℃で一時間のＰＢＳを備え、一対一の割合に薄められた。ブロッキング溶液を除去後、試料の使用に先立って、Ｂｒｉｊ３５の１ｘＰＢＳ／０．５％を用いて２回洗浄した。４通作成で各１６９のタンパク質（表２〜７）を試験した。４つの対照には、全滴定曲線上で４つのアンカー・ポイントに対応する熟知の濃度を持つ各試料スライドに含んだ。試験試料は、残り１２のサブアレイでアッセイした。
１９８４年から１９９１年の間に取得した初期の膝および手のＸ線にある、深刻なＯＡでない被験者は、１９９５年から１９９８年の間に行われたフォローアップのＸ線によりＯＡ症例（ｎ＝１９）またはＯＡでない対照（ｎ＝６６）で分類され、年齢、性別および肥満度指数により一致させた。分類時期および１０年前に取得した血清試料は、１６９のタンパク質を分析したマイクロアレイプラットフォームに適用した。すべての血清試料は、夜間絶食後、参加者より取得し、直ちに処理し、検査まで−８０°Ｃで保存した。分析に先立って、冷凍状態の血清試料（２１６の試料、ＯＡでない被験者から１７０、ＯＡ被験者より４６）を解かし、粒子状物質を除去するために遠心分離し、Ｈｅｔｅｒｏｂｌｏｃｋ（Ｏｍｅｇａ）の０．２５ｍｇ／ｍｌ、ＩＩＲ（Ｂｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎ）の０．２５ｍｇ／ｍｌおよびＴｗｅｅｎ−２０の０．１％を用いて混合した。その後、２０μＬの処理済の試料は、各サブアレイに適用し、成形複合体は、ＲＣＡ間接滴定測定を用いて検出した。
スライドは、ＬＳ２００スキャナー（ＴＥＣＡＮ）を用いて走査した。走査像は、特許ソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｔａｇｉｎｇ，Ｉｎｃ．）を用いて分析した。各品質管理および試料のためにマイクロアレイスポットの蛍光強度を分析し、その結果である平均強度を決定した。選択したタンパク質の用量反応曲線は、検出強度が背景をはるかに超え、被分析物濃度を増加させると共に強度を増加することを示した。対照空白よりも平均信号強度が４倍高いタンパク質は、Ｚ値により標準化し、多変量解析法（有意性ｐ<０．０５）を用いて、症例および対照間で比較した。
スライドからスライドへの精度は、回帰に基づいた標準化を用いて改善された。スライドからスライドの変動（ＣＶ）は、それぞれのアレイ１、２、３、４、５および６に対して、１７％、２０％、１７％、１９％、１８％、および１７％であった。最低基準を満たした合格率である８５％を超える、試料の８８％以上が品質管理を合格し、ＭＳＩのＳＯＰによるデータ生成の無事完成を示す。失敗した主要源は、試料不足であった。
実施例４
共分散分析を用いたＯＡバイオマーカーの検証
ここでは、実施例３で取得したデータを分析するのに使用した方法を説明する。実施例５では、データを分析するために使用したもう１つのアルゴリズムを説明する。
データは、２つの変化する変動を安定させ、データの標準化を向上するために対数ベースであった。検査された１６９のタンパク質のうち、６８は、非特異性機能を持つＢＬＡＮＫの総変動よりも高い総変動（分散）を示した。ＢＬＡＮＫよりも４倍高い平均強度の差異を有する６８のタンパク質検体は、統計分析に含まれた。ｂｌａｎｋの評価は、非特異性信号に反する安全装置に含まれた。ｂｌａｎｋの分析は、各アレイの分散分解を検証することにより達成される。実験誤差による分散は、ほとんどのタンパク質検体に比較でき、生物学的変動よりも一般的に低い。これは、測定の再現性が生物学的差異を検出するのに十分低かったことを示す。しかしながら、各ウェルに印刷されるＢＬＡＮＫ機能（獲得抗体を印刷するのに使用されるキャリアタンパク質を含む）は、実験誤差よりも大きい分散を示し、しばしば、調査タンパク質検体のいくつかで観測された分散に比較できる。
理想としては、ＢＬＡＮＫの分散は、観測された実験誤差と同等であるべきである。ＢＬＡＮＫの調整を行うために異なる方法はあるが、使用した方法は、特定のプラットフォーム経験に基づいている。その手順は、ＢＬＡＮＫの分散よりも高くするために、特定機能の総分散を必要とする、保守的なアプローチを示す。言い換えれば、ＢＬＡＮＫの分散は、実験誤差の測定として使用される。加えて、特定機能の平均強度は、ＢＬＡＮＫよりも４倍高くなることが必要である（均等目盛上）。
共分散分析は、年齢とＯＡに関連したタンパク質検体の変化を決定するのに使用された。ＳＡＳ（登録商標）混合の手順（ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｉｎｃ．、１９９２年、ＳＡＳ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｒｅｐｏｒｔ Ｐ−２２９、ＳＡＳ／ＳＴＡＴ Ｓｏｆｔｗａｒｅ：Ｃｈａｎｇｅｓ ａｎｄ Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔｓ、 Ｒｅｌｅａｓｅ ６．０７、Ｃａｒｙ、ＮＣ：ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｉｎｃ．）は、年齢とＯＡと共に発現したタンパク質検体の有意な変化を決定するために適用した。ＰＲＯＣの混合アルゴリズムは、欠落した価値への安定性、さらに高度なモデル化法のための微妙な真の共分散構造への能力、および一変量の分析を比べる強化された力に基づいて選択された。
それぞれの統計的なモデルは、年齢と分析を備えたタンパク質検体レベルの関連を分析するのに使用された。被験者モデル内で３つ（年齢非依存、共通の傾きおよび異なる傾き）が共分散として年齢を備えた、ベースライン（時点１）タンパク質検体レベルと変化を利用して適応された。
年齢非依存モデル：ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＡｔＴｉｍｅＰｏｉｎｔ２＝ベースライン＋ＯＡ＋性別
共通の傾きモデル：ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＡｔＴｉｍｅＰｏｉｎｔ２＝ベースライン＋ＯＡ＋ｄａｇｅ＋性別、（ｄａｇｅ＝ＡｇｅＡｔＴｉｍｅｐｏｉｎｔ２−ＡｇｅＡｔＢａｓｅｌｉｎｅ）
異なる傾きモデル：ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＡｔＴｉｍｅＰｏｉｎｔ２＝ベースライン＋ＯＡ＋ｄａｇｅ＊ＯＡ＋性別
これらのモデルは、長期的な分析に反映し、それは、ベースライン値での差異のような、被験者効果内で調整される。
同様に、３つの被験者モデル（年齢非依存、共通の傾きおよび異なる傾き）間では、ベースライン調整なしに時点１と時点２で調整した。
年齢非依存モデル：（ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＡｔＴｉｍｅＰｏｉｎｔ１またはＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＡｔＴｉｍｅＰｏｉｎｔ２）＝ＯＡ＋性別
共通の傾きモデル：（ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＡｔＴｉｍｅＰｏｉｎｔ１またはＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＡｔＴｉｍｅＰｏｉｎｔ２）＝ＯＡ＋年齢＋性別、年齢は、特定時点での個人の年齢である。
異なる傾きモデル：（時点１での発現または時点２での発現）＝ＯＡ＋年齢＊ＯＡ＋性別
これらのモデルは、断面解析に反映する。各タンパク質検体の適切なモデルを選択するためのアプローチは、以下のようになる。
1. 傾きは、モデルの発現＝［ベースライン］＋ＯＡ＋性別＋年齢＊ＯＡを用い、零点から異なることを確認する。
2. 効果年齢＊ＯＡが、有意である場合、モデルの発現＝［ベースライン］＋性別＋ＯＡ＋年齢＋年齢＊ＯＡを確認する。
3. 年齢＊ＯＡが、段階２で有意である場合、異なる傾きモデルを選択する。
4. 年齢＊ＯＡが、段階２で有意でない場合、共通の傾きモデルを選択する。
5. 年齢＊ＯＡが、段階１で有意でない場合、年齢非依存モデルを選択する。
フィッティングの結果が、直線回帰式である。モデル内の各期間の統計的有意性は、ＰＲＯＣ混合手順からのタイプIIIの二乗の合計を用いて決定された。効果は、Ｐ値が≦０．０５である場合、有意に考慮された。ＯＡ（ＯＡ、ＯＡ＊年齢、ＯＡ＊年齢２）に関連した効果に対する発現での統計的に有意な（Ｐ値<０．０５）差異を有するタンパク質検体は、表８に示される。表８での「モデル」欄は、上記で検討された３つの異なるモデルを示す。「調査タイプ」欄の「長期的」は、共分散としてのベースラインを備えたモデルに関連する。「調査タイプ」欄の「ベースライン」または「時点２」は、ベースラインまたは「時点２」のは発現レベルが、モデル内の左側として使用された。表８に示されたように、１９のタンパク質は、健康対照と比較したように、ＯＡに関連した発現で有意に（ｐ値≦０．０５）異なった。これら１９のタンパク質検体のうち、１１の発現は、１つ以上の効果のために有意に異なった。
（表８）時間と共にＯＡおよび健康対照間で有意な差異（ｐ値≦０．０５）を示すタンパク質
Figure 2008510168
上記の統計的なモデルへのデータの適応は、２つの直線回帰式をもたらす。１つめの方程式は、ＯＡの患者と時間の発現値間での直線フィットである。もう１つの直線回帰式は、健康な対照と時間の発現値間での直線フィットである。各直線回帰は、切片および傾きで説明される。傾きおよび切片の概算の誤差はまた、決定される。傾きがＯＡおよび健康対照の直線フィット間で異なる場合、仮定を分析することが可能である。ＯＡおよび健康対照の直線フィットが異なる場合もまた、比較可能である。図３Ａ−Ｄは、次に示されるように統計的なモデルである、異なる傾き、共通の傾き、および年齢非依存で、傾きおよび切片の異なる合成を示す。
効果ＯＡが有意である場合、タンパク質の発現の直線回帰フィットがＯＡおよび健康対照間で異なることを示す（図３Ａ、ＣおよびＤ参照）。
効果ｄａｇｅ＊ＯＡ（ｄａｇｅ＝ＡｇｅＡｔＴｉｍｅｐｏｉｎｔ２−ＡｇｅＡｔＢａｓｅｌｉｎｅ）は、長期調査タイプに関するものである。効果ｄａｇｅ＊ＯＡは、有意である場合、時間と共にタンパク質発現の直線回帰フィットの傾きが、ＯＡおよび健康対照間で異なることを示す（図３ＡおよびＢに類似）。
効果年齢＊ＯＡ（年齢は、ＡｇｅＡｔＴｉｍｅｐｏｉｎｔ２またはＡｇｅＡｔＢａｓｅｌｉｎｅの年齢である。）は、時点２およびベースラインに関するものである。効果年齢＊ＯＡが有意である場合、時間と共にタンパク質発現の直線回帰フィットの傾きが、ＯＡおよび健康対照間で異なることを示す（図３ＡおよびＢに類似）。
共通の傾きモデルは、図３Ｃに示されている。ＯＡおよび健康対照間のための直線フィットの直線は、互いに平行であり、それは同じ傾きであることを示す。共通の傾きモデルは、切片に有意な差異があるモデルに限定され、共通の傾きモデルのためのＯＡ効果が有意値（ｐ値≦０．０５）であることを意味する。
年齢非依存の傾向は、図３Ｄに示される。発現レベルは、時間と共に変化せず、傾きがゼロの指標となり、切片またはＯＡ効果の差異を示す。
結果の要旨は、図４に示される。左に記載されるタンパク質は、活性がＯＡ発症に先立って変化するものであるため、将来ＯＡ発症被験者のリスクを予期するために使用可能である。右に記載されるタンパク質は、活性がＯＡを構築する間に変化するものであるため、ＯＡの経過を診断し、モニタリングするために使用可能である。中央に記載されるタンパク質は、活性がＯＡ発症前後に変化するため、将来、ＯＡ発症被験者のリスクを予期し、ＯＡの経過を診断し、モニタリングし、ＯＡの重症度を決定し、またはその合成に使用可能である。
ＢＤＮＦ、ＥＧＦおよびプロラクチンは、ベースラインでＯＡおよび健康対照間で年齢と共に有意な差異の傾向を示した。ＢＤＮＦおよびＥＧＦは、ＯＡの患者で年齢と共に増加し、健康対照では、減少した。対照的に、プロラクチンのレベルは、健康対照で増加し、ＯＡ患者で安定を維持した。
ＯＡおよび健康対照間で、ＢＤＮＦ、ＥＧＦおよびＭＭＰ７の発現差異におけるＯＡ効果および年齢＊ＯＡは、ベースラインで有意である。切片および傾きが直線フィット間で差異があることを示す。ゆえに、ＢＤＮＦ、ＥＧＦ、ＭＭＰ７およびプロラクチンの発現の有意な差異は、将来ＯＡ発症リスクのような、ＯＡリスクを決定するのに使用可能である。
ＨＣＣ１およびレプチンのレベルはまた、ＯＡおよび健康対照間で、年齢のベースライン依存で有意な差異が認められるが、後の時点では見られなかった。これは、ＨＣＣ１およびレプチンが初期のＯＡに関連がある可能性があることを示す。
ＭＭＰ−７およびＭＰＩＦ−１のレベルが健康対照に対してＯＡ患者で年齢と共に減少している一方、ＢＤＮＦ、ＩＬ−２およびＭＩＧのレベルは、健康対照に対してＯＡ患者で年齢と共に増加した。
ＥＧＦおよびＥｏＴ２のレベルは、ＯＡ患者でより低く、年齢に依存していた。対照的に、ＩＣＡＭ３、ＩＧＦＢＰ−４およびＴＧＦｂ ＩＩＩのレベルは、ＯＡ患者でより高くなった。
ベースラインの差異のような、被験者効果内での調整は、長期的に計画された調査に、その結論を加えることにより達成可能である（表８の「長期的」を参照）。健康対照で観測されたタンパク質検体レベルに対して、６Ｃｋｉｎｅ、ＩＣＡＭ３、ｕＰＡＲおよびＶＣＡＭ−１のレベルは、診断するのに先立って時間と共にＯＡ患者で増加した。ゆえに、このようなタンパク質は、将来ＯＡ発症リスクを予期するために使用可能である。
長期的検体で有意が認められたモデルは、年齢（年数）で変化するごと、変化において調整した年ごとに示された。６ｃｋｉｎｅの傾きの直線の交差は７年で、ＩＣＡＭ３の傾きの直線の交差は６年で、ＭＩＰ−１ｂの傾きの直線の交差は１０年で、ＭＩＰ−１ｄの傾きの直線の交差は６年で、ＴＧＦｂ ＲＩＩＩの傾きの直線の交差は５年で、ＵＰＡＲの傾きの直線の交差は９年で、ＶＣＡＭ−１の傾きの直線の交差は９から１０年である。
実施例５
年齢によるバイオマーカーの同定
この分析は健康な対照からのタンパク質検体レベルで独占的に行われたものであることを除き、実施例4で使用されたものと同様の統計的なモデルが年齢と共にタンパク質検体レベルの関連を決定するために使用された。
被験者モデル内で３つ（年齢非依存、共通の傾きおよび異なる傾き）が共分散として年齢を備えた、ベースラインタンパク質検体レベルと変化を利用して適応された。
年齢非依存モデル：ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＡｔＴｉｍｅＰｏｉｎｔ２ｏｒ３＝ベースライン＋性別
共通の傾きモデル：ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＡｔＴｉｍｅＰｏｉｎｔ２ｏｒ３＝ベースライン＋性別＋ｄａｇｅ
（ｄａｇｅ＝ＡｇｅＡｔＴｉｍｅｐｏｉｎｔ２ｏｒ３−ＡｇｅＡｔＢａｓｅｌｉｎｅ）
異なる傾きモデル：ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＡｔＴｉｍｅＰｏｉｎｔ２ｏｒ３＝ベースライン＋性別＋年齢＊性別
これらのモデルは、長期的な分析に反映し、それはベースライン値での差異のような被験者効果内での調整を可能とする。
３つの被験者モデル（年齢非依存、共通の傾きおよび異なる傾き）間では、ベースライン調整なしに時点１で調整した。
年齢非依存モデル：ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＡｔＴｉｍｅＰｏｉｎｔ１＝性別
共通の傾きモデル：ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＡｔＴｉｍｅＰｏｉｎｔ１＝年齢＋性別、年齢は、時点１での個人の年齢である。
異なる傾きモデル：ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＡｔＴｉｍｅＰｏｉｎｔ１＝年齢＊性別＋性別
これらのモデルは、断面解析に反映する。各タンパク質検体の適切なモデルを選択するためのアプローチは、以下のようになる。
1. 傾きは、モデルの発現＝［ベースライン］＋性別＋年齢＊性別を用い、零点から異なることを確認する。
2. 効果年齢＊ＯＡが有意である場合、モデルの発現＝［ベースライン］＋性別＋年齢＋年齢＊性別を確認する。
3. 年齢＊性別が段階２で有意である場合、異なる傾きモデルを選択する。
4. 年齢＊性別が段階２で有意でない場合、共通の傾きモデルを選択する。
5. 年齢＊性別が段階１で有意でない場合、年齢非依存モデルを選択する。
フィッティングの結果は、直線回帰式である。モデルの各期間の統計的な有意は、ＰＲＯＣ混合の手順からタイプIIIの２乗の合計を用いて決定された。効果は、Ｐ値が０．０５以下である場合、有意に考慮された。
年齢（ｄａｇｅ、ｄａｇｅ＊性別、年齢、性別＊年齢）に関連した効果に対する発現での統計的に有意な（Ｐ値≦０．０５）差異を有するタンパク質分析物は、表９に示される。表９での「モデル」欄は、上記で検討された３つの異なるモデルを示す。「調査タイプ」欄の「長期的」は、共分散としてのベースラインを備えたモデルに関連する。「調査タイプ」欄の「ベースライン」は、ベースラインの発現レベルがモデル内の左側に使用された。表９に示されたように、３９のタンパク質は、健康対照からの試料で、年齢および性別に関連した発現において、有意に（ｐ≦０．０５）異なった。これら３９のタンパク質検体のうち、１５の発現は、１つ以上の効果のために有意に異なった。
（表９）時間と共に発現に有意な差異を示すタンパク質
Figure 2008510168
Figure 2008510168
Figure 2008510168
解釈は、性別がＯＡ用に置換されたものを除き、表８に提供されたものと同一である。
６Ｃｋｉｎｅ、ＣＴＡＣＫ、ＥＧＦ、ＥＮＡ−７８、ＥＯＴ２、ＩＧＦＢＰ−１、ＩＧＦ−ＩＩ、ＩＬ−１７、ＭＩＦ、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−７、ＭＭＰ−９、ＭＰＩＦ−１、ＯＰＮ、ＰＥＣＡＭ１、プロタクチン、ＴＧＦ−ｂ ＲＩＩＩ、ＴＩＭＰ１、ＵＰＡＲ、ＶＥＧＦおよびＶＥＧＦ Ｒ３の検体レベルは、年齢と共に変化する。
ＡＦＰ、ＢＤＮＦ、ＨＣＣ４、ＩＧＦＢＰ−６、ＩＬ−２は、ベースラインで年齢と共に性別依存の変化が見られるが、年齢関連の変化は、長期的調査で、時点１、２および３の間で、性別に敏感に反応する。
ＩＧＦＢＰ−２は、性別間で異なる年齢依存の変化を示す。
これらの結果に基づいて、これらの分子は、時効対照として使用可能である。
実施例６
ＡＮＯＶＡの混合モデルおよびマイクロアレイの有意な分析を用いたデータ分析
（ＳＡＭ）
この実施例は、例４で取得したデータを分析するために混合モデルＡＮＯＶＡおよびマイクロアレイの有意な分析（ＳＡＭ）を示す。
すべての分析は、Ｚスコアにより標準化された、背景よりも４倍高いすべてのタンパク質のために平均蛍光強度（ＭＦＩ）において行われた。混合モデルＡＮＯＶＡおよびマイクロアレイの有意な分析（ＳＡＭ）を用いたＯＡ症例および対照間で区別をつけて発現したタンパク質は、同定された。ＡＮＯＶＡ分析では、個人試料は、変量効果として、滞在時間は、反復測定として、および「ＯＡ」対「ＯＡ未発症」は、固定効果として処理された。ＳＡＭ分析では、区別をつけて発現したタンパク質は、反復測定の順列を介して、偽発見率（ＦＤＲ<０．２７）に基づいて決定した(for example see Tusher et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:5116-21, 2001)。
ＡＮＯＶＡおよびＳＡＭにより同定されたタンパク質（図５を参照）は、対照とは特異な症例における感受性および特異性は、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を用いて評価された。特に、すべての測定済みのタンパク質と同様に区別をつけて発現したタンパク質は、決定木の分類のための予測変数として使用され、その結果は、曲線に統合された。
ＡＮＯＶＡおよびＳＡＭで取得した結果をさらに交差確認するために、主成分分析（ＰＣＡ）は、差次的発現として同定されたタンパク質の相関行列に基づいて行われた。ＰＣＡでは、異なる年齢層の中で変数パターンを探すために、年齢群（２２〜５０、５１〜６９および７０〜９２歳）によるものと同様に、すべての年齢群からの統合データで行われた（ＰＣＡ分析における合成た年齢のみ、図５に示される）。加えて、核タンパク質において、発現値の平均Ｚスコアは各年齢群に対して、曲線で表された。
決定木は、ＯＡ未発症参加者から差次的発現したタンパク質がＯＡを識別した範囲を見極めるために構築された。予期結果の交差評価に関して、多数分類処理は、全タンパク質の発現データのたびに、無作為に構築された２つのデータセットで行われた。総データの７０％からなる、第１のデータセットは、訓練データセットとして使用され、残りの３０％のデータからなる、そのほかのデータセットは、予期および確認処理のデータとして使用された。業務用のソフトウェアＰａｒｔｅｋおよびＩｎｓｉｇｈｔｆｕｌ Ｍｉｎｅｒ ３．０および無料のソフトウェアＢｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ Ｒパッケージを用いて、すべての分析は、別々の訪問に先立って、Ｘ線および時点を分類する時間に取得した試料で行われた(Gentleman et al. Genome Biol. 5:R80, 2004)。
合計２１６の血清試料が分析された（偶発的な膝ＯＡとして分類された２１の患者から２回以上の訪問で採取した４６の試料および６６の対照から３回以上の訪問で採取した１７０の試料）。１つまたは両時点において、症例および対照間で大幅に差異が認められるタンパク質のみ、検討した（初期Ｘ線で１０、フォローアップのＸ線で１６）。
症例および対照間で差次的発現したタンパク質のＺスコアは、ＯＡを持たない（対照）残りの予測できるパターンと比較してＯＡ発症を予測できるパターンに温度を示す図のプロットで表された。ＯＡ症例および対照間での差異は、さらにより若い年齢群で目覚しかった。同様に、症例および対照を分類するために、第２Ｘ線でＯＡに関連したパターンのＺスコアを使用した。２つの時点でＯＡに関連した血清タンパク質発現パターンの比較は、一般的なＯＡに関連したタンパク質がＯＡ発症の予測できるものとは異なることを示す。
ＰＣＡ分析の結果は、上記で検討された差次的発現したタンパク質のＡＮＯＶＡおよびＳＡＭ検出を確認し、交差検証する。Ｘ線分類の時に同定されたＯＡおよび対照試料間で、１６の差次的発現したタンパク質を用いて、ＰＣＡ分析のための３つの主要素は、総変動の５６．５％（それぞれ第１、２、３の主要素として、２６．３％、１７．９％および１２．３％）を占めた。同様に、３つのＰＣは、初期のX線の時に同定された１０の差次的発現したタンパク質を用いたＰＣＡに関して、総変動の５７．４％（それぞれ第１、２、３の主要素として、３８．８％、９．７％および８．９％）を占めた。さらに、類似のＰＣＡがすべて１６９のタンパク質を用いて行われた場合、症例および対照間での区別は、有意に低く、第１時点では、総変動の３７．０％（それぞれ第１、２、３の主要素として、１８．８％、９．９％および８．３％）のみを占め、第２時点では、総変動の３４．１％（それぞれ上位３主要素として、１４．８％、１０．９％および８．４％）を占めた。受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線はまた、１６の一般的なＯＡ関連タンパク質および１０のＯＡ予測タンパク質のうち、再帰的決定木分類(Zhang et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:6730-5, 2001)を用いて生成され、すべての１６９のタンパク質で比較した、差次的発現したタンパク質を用いて、優れた曲線の識別力を確認した。図６Ａ−Ｇは、ＯＡおよび対照試料間で、４つの差次的発現したタンパク質（ＩＬ−１５、ＭＭＰ−７、ＰＡＩ−１およびｓＶＡＰ−１）のＺスコアを示す。
数少ない例外を備え、ＯＡ関連として同定された特定のタンパク質は、２つの時点で差異が認められた（図５）。初期のＸ線の時に、ＯＡの続発発展は、マトリクス・メタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）−２、Ｄ−ダイマーＤＤ５およびＤＤ６、エオタキシン２、細胞内接着分子（ＩＣＡＭ−１）、およびＰ−セレクチン、プラスミノーゲン活性抑制物質（ＰＡＩ）−１、およびＭＭＰ−７のより大きな発現、可溶性血管付着タンパク質（ＶＡＰ)−１、およびインターロイキン（ＩＬ）−１５のより低い発現に有意に関連した。ゆえに、血清タンパク質の変化は、膝および手の骨関節炎（ＯＡ）に付随して起こり、ＯＡがＸ線写真上で明らかになる前の数年で検出されうる。分類Ｘ線の時に、Ｂリンパ球ケモカイン（ＢＬＣ）、６ケモカイン（Ｃｋｉｎｅ）、マクロファージ抑制タンパク質（ＭＩＰ）−１α、ＩＬ−１α、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、線維芽細胞増殖分子（ＦＧＦ）−７、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、ＭＭＰ−７、ニューロトロフィン４（ＮＴ４）、ＩＣＡＭ−３、ＶＡＰ−１、および血管内皮（ＶＥ）−カドヘリン、およびインスリン様成長因子結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）−２の過剰発現に、予測ＯＡは関連した。これらの１６のタンパク質は、Ｘ線写真の膝または手のＯＡの証拠なしで年齢、性別、およびＢＭＩで一致した対照と比較して、Ｘ線写真の膝または手のＯＡの証拠を持つ患者で差次的発現であった。ＩＬ−１５、ＭＭＰ−７、ｓＶＡＰ−１およびＰＡＩ−１は、両時点で２つの群間で差次的発現であった（図５）。ＩＬ−１５、ＭＭＰ−７およびＶＡＰ−１は、両時点でＯＡ関連ではすべて高かった。対照的に、ＰＡＩ−Ｉ発現は、両時点でＯＡ関連では低かった。
結果の要旨は、図５に示される。左に記載されるタンパク質は、活性がＯＡ発症に先立って変化するものであるため、将来ＯＡ発症被験者のリスクを予期するために使用可能である。右に記載されるタンパク質は、活性がＯＡを構築する間に変化するものであるため、ＯＡの経過を診断し、モニタリングするために使用可能である。中央に記載されるタンパク質は、活性がＯＡ発症前後に変化するため、将来、ＯＡ発症被験者のリスクを予期し、ＯＡの経過を診断し、モニタリングし、ＯＡの重症度を決定し、またはその合成に使用可能である。
再帰的な分割(Zhang et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:6730-5, 2001)を用いて、差次的発現したタンパク質およびＺスコア閾値を用いて、症例を識別する能力間の関係を決定した。誤判別誤差率は、初期Ｘ線（図７Ａ）で１０の差次的発現したタンパク質では０．０６０９８で、分類Ｘ線訪問（図７Ｂ）で同定された１６の差次的発現したタンパク質では０．０７０５９であった。個々のタンパク質を段階的に入力した。双方図７Ａおよび７Ｂは、症例および対照として分類されている参加者任意のタンパク質値が、訪問により異なり（ＰＡＩ−１）、また、ほかの発現したタンパク質（ＩＣＡＭ−１）の発現およびレベルにより影響を受ける可能性がある。
ゆえに、１６のタンパク質は、対照と比較して、ＯＡ関連の差次タンパク質活性を有した。４つのタンパク質（ＭＭＰ−７、ＩＬ−１５、ＰＡＩ−１およびｓＶＡＰ−１）はまた、１０年前に取得した試料でも差次的発現した。ゆえに、これら１６のタンパク質は、ＯＡの診断または診断の確認、ＯＡの重症度の決定、またはＯＡの進行のモニタリング、またはその組み合わせのために使用可能である。６つの追加のタンパク質（ＭＭＰ−２、ＤダイマーＤＤ５およびＤＤ６、ＩＣＡＭ−１、Ｐ−セレクチンおよびＥｏＴ−２）は、続発ＯＡに関連したもののみで、従来のＯＡには関連しない。ゆえに、ＭＭＰ−７、ＩＬ−１５、ＰＡＩ−１およびｓＶＡＰ−１のうち１つ以上の単独または組み合わせである、これら１０のタンパク質は、被験者が将来ＯＡ発症増加リスクを有するかどうかの決定、ＯＡの進行のモニタリング、またはその組み合わせのために使用可能である。例えば、ＭＭＰ−７、ｓ−ＶＡＰ１およびＩＬ−１５の高い濃度、およびＰＡＩ−１のより低い濃度の検出は、例えば、Ｘ線写真の分類に先立って最長１０年までＯＡ発症増加リスクを示す可能性がある。例の中には、タンパク質結合が単一のタンパク質を用いて達成された症例および対照間で分類の正確さを向上できる。
要約すれば、マトリクス低下に伴う血清タンパク質の変化、細胞活性化および炎症は、初期ＯＡ発症に付随して起こり、数年前にＸ線写真検出することが可能である。
特定の理論でならなければならないということなしに、通常の初期Ｘ線の時に同定された差次的発現したタンパク質（ＤＤ５、ＤＤ６、ＥｏＴ２、ＩＣＡＭ−１、ＭＭＰ−２、Ｐ−セレクチン、ＩＬ−１５、ＭＭＰ−７、ｓＶＡＰおよびＰＡＩ−１）は、細胞外のマトリクス低下を起こすことにより、またはこの分解処理をさらに増幅するサイトカインおよびケモカインを生産する能力がある炎症細胞を化学誘引することにより、ＯＡを助長する可能性がある。ＯＡ症例でより高い濃度を検出したＭＭＰ（ＭＭＰ−２およびＭＭＰ−７）は、ＯＡの顕著な特徴であると考えられる軟骨低下を引き起こす、ＩＬ−１およびＴＮＦ−αの物質による、線維芽細胞、滑膜細胞および軟骨細胞により生産される可能性がある。ＭＭＰ−７とは異なり、ＭＭＰ−２は、通常および骨関節炎の関節の軟骨細胞により構造的に発現される(Duerr et al., Clin. Exp. Rheumatol. 22:603-8, 2004)。ゆえに、初期Ｘ線時に観測されたＭＭＰ−２の減少レベルは、軟骨のリモデリングおよび健康維持を必要とする不十分な代謝回転に反映する可能性がある。ＯＡを有するプラスミノーゲン活性抑制物質（ＰＡＩ−１）のより低い濃度は、骨および軟骨のプラスミン媒介マトリクス低下を脱抑制することにより、または関節の炎症を残留感覚させることにより、ＯＡ発症を助長する可能性がある。線維素溶解要因である、ＩＣＡＭ−１およびＶＣＡＭ−１は、破骨細胞の接着を伴い、それゆえに、マトリクスおよび骨吸収サイトカインの生産を刺激する可能性がある。驚くほどに、高いＩＣＡＭ−１およびＰ−セレクチンよりむしろ低い、しばしば炎症状態(Cush et al. Arthritis Rheum. 36:1098-102, 1993)で上昇することが分かった２つの分子は、ＯＡの発展の予測となることが分かった。
また、初期時点で差次的発現であった細胞外のマトリクス関連（ＭＭＰ−７およびＰＡＩ−１）および炎症のタンパク質（ｓＶＡＰ−１、ＩＬ−１５）に加えて、炎症メディエーター（ＩＬ−１α、ＩＬ−２、ＭＩＰ−１α、６Ｃｋｉｎｅ、ＢＬＣ）、接着分子（ＶＥ−カドヘリン、ＩＣＡＭ−３）、メタロプロテイナーゼの組織阻害剤（ＴＩＭＰ−１）および増殖因子（ＩＧＦＢＰ−２、ＦＧＦ−７、ＧＭ−ＣＳＦ）の広範囲のカテゴリーの下で、タンパク質は、特に予測ＯＡに関連した。細胞外のマトリクス低下（ＭＭＰ−７およびＰＡＩ−１）のメディエーターと共にＯＡを有する増殖因子の関連性は、修繕の試みのマーカーであることを示す。
これらの結果はまた、ＯＡが純変性でも軟骨に限定されるものでもないことを示す。ＭＭＰ−７、ＩＬ−１５およびｓ−ＶＡＰの高濃度および分類前および分類時点の双方で取得したＯＡ試料に観測されるＰＡＩ−１の低濃度は、持続処理と同様に間接初期疾病をとりなす可能性があることを示す。変化によって、被験者にＯＡへの発展が生じやすくなることを遺伝的に符号化された差異に反映する可能性がある。追加として、４つのタンパク質を除き、初期Ｘ線の時にＯＡに関連したタンパク質のセット（図５を参照）は、第２Ｘ線の時に差次的発現されなかった、その逆にこれらのタンパク質の外形は、時間と共に変化に対応し、初期事象のメディエーターは、疾病を維持するメディエーターと区別するものであるという考えを支持する。
実施例７
ＯＡの存在に関連した差次的活性
この実施例は、ＯＡの存在に関連したタンパク質のレベルにおける特有の変化を説明する。特有のＯＡリスク分子は、この実施例に記載されているが、当事者は、ほかの分子がこの開示で教えに基づいて使用可能であることの評価を得る。例えば、特有のＯＡリスク関連分子は、ほかのＯＡリスク関連分子と結合して使用可能であり、また、ＯＡリスク関連分子の副結合は、（下記の分子の少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７）単一またはほかのＯＡリスク関連分子との結合で使用可能である。
特定の実施例では、差次的活性の検出は、タンパク質レベルにおいて差異（増加、減少、または双方）を検出することを含む。あるいは、差次的活性の検出は、核酸レベルにおいて差異（増加、減少、または双方）を検出することを含む。その方法は、活性の差異の偏差を決定することを有し、変化の偏差は、ＯＡの存在に関連することを含む。
ＯＡリスク関連分子の特定の実施例は、ＯＡ関連の差次的発現であり、変化の方向性（上方制御、または下方制御）、および変化の偏差（ｆｏｌｄ Ｃｈａｎｇｅとして発現した）は、表１０、１１に供給されている。
（表１０）骨関節炎に関連した発現の例示的なパターン
Figure 2008510168
ゆえに、各ＩＬ−１５、ＭＭＰ−７、ｓＶＡＰ−１、ＩＬ−１α、ＩＬ−２、ＭＩＰ−１α、ＢＬＣ、６−Ｃｋｉｎｅ、ＦＧＦ−７、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＧＦＢＰ−２、ＮＴ４、ＩＣＡＭ−３、ＴＩＭＰ−１およびＶＥ−カドヘリンは、ｐ<０．０５で、対照よりもＯＡ試料で有意に高いＺ値を有するバックグラウンドよりも少なくとも４倍大きい信号強度を有する。平均値以上のＺ値は、上方制御と見なされ、平均値より低いＺ値は、下方制御と見なされた。すなわち、ＩＬ−１５、ＭＭＰ−７、ＶＡＰ−１、ＩＬ−１α、ＩＬ−２、ＭＩＰ−１α、ＢＬＣ、６−Ｃｋｉｎｅ、ＦＧＦ−７、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＧＦＢＰ−２、ＮＴ４、ＩＣＡＭ−３、ＴＩＭＰ−１およびＶＥ−カドヘリンは、ＯＡ関連量、例えば、バックグラウンドよりも少なくとも４倍大きく、Ｚ値がｐ<０．０５レベルでＯＡおよび対照試料間において、有意な差異が見られる量により、上方制御である。さらに、ＰＡＩ−１の信号強度は、バックグラウンドよりも少なくとも４倍大きかったが、Ｚ値がｐ<０．０５レベルで対照試料よりもＯＡ試料においては、有意に低下したため、下方制御であった。すなわち、ＰＡＩ−１は、ＯＡ関連量により下方制御である。
ＯＡに関連する可能性があるタンパク質発現パターンの一例は、ＩＬ−１５、ＭＭＰ−７、およびｓＶＡＰ−１の上方制御であり、それぞれがｐ<０．０５レベルで対照試料よりもＯＡ試料においては、有意に高いＺ値を有するバックグラウンドよりも少なくとも４倍大きい信号強度を有する。
ＯＡに関連する可能性があるタンパク質発現パターンの別例は、ＩＬ−１５、ＭＭＰ−７、およびｓＶＡＰ−１の上方制御で、ＰＡＩ−１の下方制御であり、例えば、それぞれがｐ<０．０５レベルで対照試料よりもＯＡ試料においては、有意に高いＺ値を有する（ＩＬ−１５、ＭＭＰ−７およびｓＶＡＰ−１）または有意に低いＺ値を有する（ＰＡＩ−１）バックグラウンドよりも少なくとも４倍大きい信号強度を有する。
さらに、ＯＡに関連する可能性があるタンパク質発現パターンの別例は、ＩＬ−１α、ＩＬ−２、ＭＩＰ−１α、ＢＬＣ、６−Ｃｋｉｎｅ、ＦＧＦ−７、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＧＦＢＰ−２、ＮＴ４、ＩＣＡＭ−３、ＴＩＭＰ−１およびＶＥ−カドヘリンの上方制御であり、それぞれがｐ<０．０５レベルで対照試料よりもＯＡ試料においては、有意に高いＺ値を有するバックグラウンドよりも少なくとも４倍大きい信号強度を有する。
さらに、ＯＡに関連する可能性があるタンパク質発現パターンの別の特有例は、ＩＬ−１５、ＩＬ−１α、ＩＬ−２、ＭＩＰ−１α、ＢＬＣ、６−Ｃｋｉｎｅ、ＦＧＦ−７、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＧＦＢＰ−２、ＮＴ４、ＩＣＡＭ−３、ＴＩＭＰ−１およびＶＥ−カドヘリンの上方制御であり、それぞれがｐ<０．０５レベルで対照試料よりもＯＡ試料においては、有意に高いＺ値を有するバックグラウンドよりも少なくとも４倍大きい信号強度を有する。
ＯＡに関連する可能性があるタンパク質発現パターンの別例は、ｓＶＡＰ−１、ＩＬ−１α、ＩＬ−２、ＭＩＰ−１α、ＢＬＣ、６−Ｃｋｉｎｅ、ＦＧＦ−７、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＧＦＢＰ−２、ＮＴ４、ＩＣＡＭ−３、ＴＩＭＰ−１およびＶＥ−カドヘリンの上方制御であり、例えば、それぞれがｐ<０．０５レベルで対照試料よりもＯＡ試料においては、有意に高いＺ値を有するバックグラウンドよりも少なくとも４倍大きい信号強度を有する。
ＯＡに関連する可能性があるタンパク質発現パターンの別例は、ＩＬ−１５、ＭＭＰ−７、ｓＶＡＰ−１、ＩＬ−１α、ＩＬ−２、ＭＩＰ−１α、ＢＬＣ、６−Ｃｋｉｎｅ、ＦＧＦ−７、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＧＦＢＰ−２、ＮＴ４、ＩＣＡＭ−３、ＴＩＭＰ−１およびＶＥ−カドヘリンの上方制御で、ＰＡＩ−１の下方制御であり、例えば、それぞれがｐ<０．０５レベルで対照試料よりもＯＡ試料においては、有意に高いＺ値を有する（ＩＬ−１５、ＭＭＰ−７、ｓＶＡＰ−１、ＩＬ−１α、ＩＬ−２、ＭＩＰ−１α、ＢＬＣ、６−Ｃｋｉｎｅ、ＦＧＦ−７、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＧＦＢＰ−２、ＮＴ４、ＩＣＡＭ−３、ＴＩＭＰ−１およびＶＥ−カドヘリン）または有意に低いＺ値を有する（ＰＡＩ−１）バックグラウンドよりも少なくとも４倍大きい信号強度を有する。
（表１１）骨関節炎に関連した発現の例示的なパターン
Figure 2008510168
ゆえに、各ＭＩＰ−１β、ＵＰＡＲ、ＶＣＡＭ−１、６−Ｃｋｉｎｅ、ＩＬ−２、ＩＧＦＢＰ−４、ＩＣＡＭ−３、ＭＩＧ、ＭＭＰ−７、ＭＰＩＦ−１、およびＴＧＦ−ｂ ＲＩＩＩのそれぞれは、ｐ<０．０５で、制御よりもＯＡ試料で有意に高いＺ値を有するバックグラウンドよりも少なくとも４倍大きい信号強度を有する。すなわち、ＭＩＰ−１β、ＵＰＡＲ、ＶＣＡＭ−１、６−Ｃｋｉｎｅ、ＩＬ−２、ＩＧＦＢＰ−４、ＩＣＡＭ−３、ＭＩＧ、ＭＭＰ−７、ＭＰＩＦ−１、およびＴＧＦ−β ＲＩＩＩは、ＯＡ関連量、例えば、バックグラウンドよりも少なくとも４倍大きく、Ｚ値がｐ<０．０５レベルでＯＡおよび制御試料間において、有意な差異が見られる量により、上方制御である。さらに、各ＭＩＰ−１δ、Ｅｏｔ２、およびＴＡＲＣの信号強度は、バックグラウンドよりも少なくとも４倍大きく、ｐ<０．０５レベルで制御試料よりもＯＡ試料においては、有意に低いＺ値を有した。すなわち、ＭＩＰ−１δ、Ｅｏｔ２、およびＴＡＲＣは、ＯＡ関連量、例えば、バックグラウンドよりも少なくとも４倍大きく、Ｚ値がｐ<０．０５レベルでＯＡおよび制御試料間において、有意な差異が見られる量により、下方制御である。
ＯＡに関連する可能性があるタンパク質発現パターンの一例は、ＭＩＰ−１β、ＵＰＡＲ、およびＶＣＡＭ−１の上方制御であり、それぞれがｐ<０．０５レベルで制御試料よりもＯＡ試料においては、有意に高いＺ値を有するバックグラウンドよりも少なくとも４倍大きい信号強度を有する。
ＯＡに関連する可能性があるタンパク質発現パターンの別例は、ＭＩＰ−１β、ＵＰＡＲ、ＶＣＡＭ−１、６−Ｃｋｉｎｅ、ＩＣＡＭ−３、およびＴＧＦ−β ＲＩＩＩの上方制御で、ＭＩＰ−１δの下方制御であり、例えば、それぞれがｐ<０．０５レベルで制御試料よりもＯＡ試料においては、有意に高いＺ値を有する（ＭＩＰ−１β、ＵＰＡＲ、ＶＣＡＭ−１、６−Ｃｋｉｎｅ、ＩＣＡＭ−３、およびＴＧＦ−βＲＩＩＩ）または有意に低いＺ値を有する（ＭＩＰ−１δ）バックグラウンドよりも少なくとも４倍大きい信号強度を有する。
さらに、ＯＡに関連する可能性があるタンパク質発現パターンの別例は、ＭＩＰ−１β、ＵＰＡＲ、ＶＣＡＭ−１、６−Ｃｋｉｎｅ、ＩＬ−２、ＩＧＦＢＰ−４、ＩＣＡＭ−３、ＭＩＧ、ＭＭＰ−７、ＭＰＩＦ−１、およびＴＧＦ−β ＲＩＩＩの上方制御であり、それぞれがｐ<０．０５レベルで制御試料よりもＯＡ試料においては、有意に高いＺ値を有するバックグラウンドよりも少なくとも４倍大きい信号強度を有する。
ＯＡに関連する可能性があるタンパク質発現パターンの別例は、ＭＩＰ−１β、ＵＰＡＲ、ＶＣＡＭ−１、６−Ｃｋｉｎｅ、ＩＬ−２、ＩＧＦＢＰ−４、ＩＣＡＭ−３、ＭＩＧ、ＭＭＰ−７、ＭＰＩＦ−１、およびＴＧＦ−β ＲＩＩＩの上方制御で、ＭＩＰ−１δ、Ｅｏｔ２、およびＴＡＲＣの下方制御であり、それぞれがｐ<０．０５レベルで制御試料よりもＯＡ試料においては、有意に高いＺ値を有する（ＭＩＰ−１β、ＵＰＡＲ、ＶＣＡＭ−１、６−Ｃｋｉｎｅ、ＩＬ−２、ＩＧＦＢＰ−４、ＩＣＡＭ−３、ＭＩＧ、ＭＭＰ−７、ＭＰＩＦ−１、およびＴＧＦ−β ＲＩＩＩ）または有意に低いＺ値を有する（ＭＩＰ−１δ、Ｅｏｔ２、およびＴＡＲＣ）バックグラウンドよりも少なくとも４倍大きい信号強度を有する。
実施例８
ＯＡ発症リスク関連差次的活性
この実施例は、ＯＡ発症の増加リスクに関連するタンパク質レベルの特有変化を説明する。特有のＯＡリスク分子は、この実施例に記載されているが、当事者は、ほかの分子がこの開示の教えに基づいて使用可能であることの評価を得る。例えば、特有のＯＡリスク関連分子は、ほかのＯＡリスク関連分子と結合して使用可能であり、また、ＯＡリスク関連分子の副結合は、（下記の分子のうち少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２など）単一またはほかのＯＡリスク関連分子との結合で使用可能である。
特定の実施例では、差次的活性の検出は、タンパク質レベルにおいて差異（増加、減少、または双方）を検出することを含む。あるいは、差次的活性の検出は、核酸レベルにおいて差異（増加、減少、または双方）を検出することを含む。その方法は、活性の差異の偏差を決定することを有し、変化の偏差は、ＯＡの存在に関連することを含む。）
ＯＡリスク関連分子の特定の実施例は、ＯＡ発症の高リスク関連の差次的発現（少なくとも５年以内に、少なくとも１０年以内に、少なくとも１５年以内に、少なくとも２０年以内に、または、少なくとも３０年以内に、ＯＡ発症など）であり、変化の検出（上方制御、または下方制御）、および変化の偏差（フォールド変化として発現した）は、表１２、１３に供給されている。
（表１２）ＯＡ発症の高リスクに関連した発現の例示的なパターン
Figure 2008510168
ゆえに、各ＩＬ−１５、ＭＭＰ−７、およびｓＶＡＰ−１は、ｐ<０．０５で、制御よりもＯＡ試料で有意に高いＺ値を有するバックグラウンドよりも少なくとも４倍大きい信号強度を有する。すなわち、ＩＬ−１５、ＭＭＰ−７、およびｓＶＡＰ−１は、将来ＯＡ発病増加リスク関連量、例えば、バックグラウンドよりも少なくとも４倍大きく、Ｚ値がｐ<０．０５レベルでＯＡおよび制御試料間において、有意な差異が見られる量により、上方制御である。さらに、各ＰＡＩ−１、ＤＤ５、ＤＤ６、ＥｏＴ２、ＩＣＡＭ−１、ＭＭＰ−２およびＰ−セレクチンの信号強度は、バックグラウンドよりも少なくとも４倍大きいが、ｐ<０．０５レベルで制御試料よりもＯＡ試料においては、有意に低いＺ値を有し、下方制御であることを示す。すなわち、ＰＡＩ−１、ＤＤ５、ＤＤ６、ＥｏＴ２、ＩＣＡＭ−１、ＭＭＰ−２およびＰ−セレクチンは、将来ＯＡ発病増加リスク関連量、例えば、バックグラウンドよりも少なくとも４倍大きく、Ｚ値がｐ<０．０５レベルでＯＡおよび制御試料間において、有意な差異が見られる量により、下方制御である。
将来ＯＡ発病増加リスクに関連する可能性があるタンパク質発現パターンの一例は、ＩＬ−１５、ＭＭＰ−７、およびｓＶＡＰ−１の上方制御であり、それぞれがｐ<０．０５レベルで制御試料よりもＯＡ試料においては、有意に高いＺ値を有するバックグラウンドよりも少なくとも４倍大きい信号強度を有する。
ＯＡ発病増加リスクに関連する可能性があるタンパク質発現パターンの別例は、ＩＬ−１５、ＭＭＰ−７、およびｓＶＡＰ−１の上方制御で、ＰＡＩ−１の下方制御であり、例えば、それぞれがｐ<０．０５レベルで制御試料よりもＯＡ試料においては、有意に高いＺ値を有する（ＩＬ−１５、ＭＭＰ−７およびｓＶＡＰ−１）または有意に低いＺ値を有する（ＰＡＩ−１）バックグラウンドよりも少なくとも４倍大きい信号強度を有する。
さらに、ＯＡ発病増加リスクに関連する可能性があるタンパク質発現パターンの別例は、ＤＤ５、ＤＤ６、ＥｏＴ２、ＩＣＡＭ−１、ＭＭＰ−２およびＰ−セレクチンの下方制御であり、それぞれがｐ<０．０５レベルで制御試料よりもＯＡ試料においては、有意に低いＺ値を有するバックグラウンドよりも少なくとも４倍大きい信号強度を有する。
さらに、ＯＡ発病増加リスクに関連する可能性があるタンパク質発現パターンの別の特有例は、ＩＬ−１５、ＩＬ−１α、ＩＬ−２、ＭＩＰ−１α、ＢＬＣ、６−Ｃｋｉｎｅ、ＦＧＦ−７、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＧＦＢＰ−２、ＮＴ４、ＩＣＡＭ−３、ＴＩＭＰ−１およびＶＥ−カドヘリンの上方制御であり、それぞれがｐ<０．０５レベルで制御試料よりもＯＡ試料においては、有意に高いＺ値を有するバックグラウンドよりも少なくとも４倍大きい信号強度を有する。
ＯＡに関連する可能性があるタンパク質発現パターンの別例は、ＩＬ−１５の上方制御で、ＤＤ５、ＤＤ６、ＥｏＴ２、ＩＣＡＭ−１、ＭＭＰ−２およびＰ−セレクチンの下方制御であり、例えば、それぞれがｐ<０．０５レベルで制御試料よりもＯＡ試料においては、有意に低いＺ値を有するバックグラウンドよりも少なくとも４倍大きい信号強度を有する。
ＯＡに関連する可能性があるタンパク質発現パターンの別例は、ｓＶＡＰの上方制御で、ＤＤ５、ＤＤ６、ＥｏＴ２、ＩＣＡＭ−１、ＭＭＰ−２およびＰ−セレクチンの下方制御であり、それぞれがｐ<０．０５レベルで制御試料よりもＯＡ試料においては、有意に高いＺ値を有する（ｓＶＡＰ）または有意に低いＺ値を有する（ＤＤ５、ＤＤ６、ＥｏＴ２、ＩＣＡＭ−１、ＭＭＰ−２およびＰ−セレクチン）バックグラウンドよりも少なくとも４倍大きい信号強度を有する。
ＯＡに関連する可能性があるタンパク質発現パターンの別例は、ＩＬ−１５の上方制御で、ＤＤ５、ＤＤ６、ＥｏＴ２、ＩＣＡＭ−１、ＭＭＰ−２、ＰＡＩ−１およびＰ−セレクチンの下方制御であり、例えば、それぞれがｐ<０．０５レベルで制御試料よりもＯＡ試料においては、有意に高いＺ値を有する（ＩＬ−１５）または有意に低いＺ値を有する（ＤＤ５、ＤＤ６、ＥｏＴ２、ＩＣＡＭ−１、ＭＭＰ−２、ＰＡＩ−１およびＰ−セレクチン）バックグラウンドよりも少なくとも４倍大きい信号強度を有する。
ＯＡに関連する可能性があるタンパク質発現パターンの別例は、ｓＶＡＰの上方制御で、ＤＤ５、ＤＤ６、ＥｏＴ２、ＩＣＡＭ−１、ＭＭＰ−２、ＰＡＩ−１およびＰ−セレクチンの下方制御であり、それぞれがｐ<０．０５レベルで制御試料よりもＯＡ試料においては、有意に高いＺ値を有する（ｓＶＡＰ）または有意に低いＺ値を有する（ＤＤ５、ＤＤ６、ＥｏＴ２、ＩＣＡＭ−１、ＭＭＰ−２、ＰＡＩ−１およびＰ−セレクチン）バックグラウンドよりも少なくとも４倍大きい信号強度を有する。
（表１３）ＯＡ発症の増加したリスクに関連した発現の例示的なパターン
Figure 2008510168
ゆえに、各ＭＩＰ−１β、ＵＰＡＲ、ＶＣＡＭ−１、６−Ｃｋｉｎｅ、ＩＣＡＭ−３、ＴＧＦ−β ＲＩＩＩ、ＩＬ−２、ＨＣＣ、レプチン、ＭＭＰ−７およびＢＤＮＦは、ｐ<０．０５で、制御よりもＯＡ試料で有意に高いＺ値を有するバックグラウンドよりも少なくとも４倍大きい信号強度を有する。すなわち、ＭＩＰ−１β、ＵＰＡＲ、ＶＣＡＭ−１、６−Ｃｋｉｎｅ、ＩＣＡＭ−３、ＴＧＦ−β ＲＩＩＩ、ＩＬ−２、ＨＣＣ、レプチン、ＭＭＰ−７およびＢＤＮＦは、ＯＡ発病増加リスク関連量、例えば、バックグラウンドよりも少なくとも４倍大きく、Ｚ値がｐ<０．０５レベルでＯＡおよび制御試料間において、有意な差異が見られる量により、上方制御である。さらに、各ＭＩＰ−１δ、プロラクチンおよびＥＧＦの信号強度は、バックグラウンドよりも少なくとも４倍大きいが、ｐ<０．０５レベルで制御試料よりもＯＡ試料においては、有意に低いＺ値を有する。すなわち、ＭＩＰ−１δ、プロラクチンおよびＥＧＦは、ＯＡ発病増加リスク関連量、例えば、バックグラウンドよりも少なくとも４倍大きく、Ｚ値がｐ<０．０５レベルでＯＡおよび制御試料間において、有意な差異が見られる量により、下方制御である。
ＯＡ発病増加リスクに関連する可能性があるタンパク質発現パターンの一例は、ＭＩＰ−１β、ＵＰＡＲ、およびＶＣＡＭ−１の上方制御であり、それぞれがｐ<０．０５レベルで制御試料よりもＯＡ試料においては、有意に高いＺ値を有するバックグラウンドよりも少なくとも４倍大きい信号強度を有する。
ＯＡ発病増加リスクに関連する可能性があるタンパク質発現パターンの別例は、ＭＩＰ−１β、ＵＰＡＲ、ＶＣＡＭ−１、６−Ｃｋｉｎｅ、ＩＣＡＭ−３、およびＴＧＦ−β ＲＩＩＩの上方制御で、ＭＩＰ−１δの下方制御であり、例えば、それぞれがｐ<０．０５レベルで制御試料よりもＯＡ試料においては、有意に高いＺ値を有する（ＭＩＰ−１β、ＵＰＡＲ、ＶＣＡＭ−１、６−Ｃｋｉｎｅ、ＩＣＡＭ−３、およびＴＧＦ−β ＲＩＩＩ）または有意に低いＺ値を有する（ＭＩＰ−１δ）バックグラウンドよりも少なくとも４倍大きい信号強度を有する。
さらに、ＯＡ発病増加リスクに関連する可能性があるタンパク質発現パターンの別例は、ＭＩＰ−１β、ＵＰＡＲ、ＶＣＡＭ−１、６−Ｃｋｉｎｅ、ＩＣＡＭ−３、ＴＧＦ−β ＲＩＩＩ、ＩＬ−２、ＨＣＣ、レプチン、ＭＭＰ−７およびＢＤＮＦの上方制御であり、それぞれがｐ<０．０５レベルで制御試料よりもＯＡ試料においては、有意に高いＺ値を有するバックグラウンドよりも少なくとも４倍大きい信号強度を有する。
ＯＡ発病増加リスクに関連する可能性があるタンパク質発現パターンの別例は、ＭＩＰ−１β、ＵＰＡＲ、ＶＣＡＭ−１、６−Ｃｋｉｎｅ、ＩＣＡＭ−３、ＴＧＦ−β ＲＩＩＩ、ＩＬ−２、ＨＣＣ、レプチン、ＭＭＰ−７およびＢＤＮＦの上方制御で、ＭＩＰ−１δ、プラクチン、およびＥＧＦの下方制御であり、それぞれがｐ<０．０５レベルで制御試料よりもＯＡ試料においては、有意に高いＺ値を有する（ＭＩＰ−１β、ＵＰＡＲ、ＶＣＡＭ−１、６−Ｃｋｉｎｅ、ＩＣＡＭ−３、ＴＧＦ−β ＲＩＩＩ、ＩＬ−２、ＨＣＣ、レプチン、ＭＭＰ−７およびＢＤＮＦ）または有意に低いＺ値を有する（ＭＩＰ−１δ、プラクチン、およびＥＧＦ）バックグラウンドよりも少なくとも４倍大きい信号強度を有する。
実施例９
ＯＡを診断する
この実施例は、被験者においてＯＡを診断、または、例えば、ヒトまたは動物の被験者において、ＯＡの事前の診断を確認するために使用可能である方法を説明する。ＯＡリスク関連分子の特有の結合は、このような分析を行うために開示されるが、当事者は、開示されたＯＡリスク関連分子のすべてを含む結合または副結合など、ほかの結合を使用可能であることは周知のことである。
被験者から取得した試料（血清試料など）は、開示された方法を用いて分析することができる。一例では、ほかの処理のための二次的ＯＡ（外傷）と比べて、被験者は、ＯＡ（例えば、手および膝のＯＡ）を一般化する。ある例では、被験者は、患部の関節の痛みおよび腫れなど、ＯＡ関連の１つ以上の症状を有する。
特定例では、ＯＡの解剖学的形跡を見つけるために日常的に行われる任意の画像検査を行うのに先立って、アッセイを行うことができる。例えば、ＯＡの初期ステージを検出するのは、画像診断法（Ｘ線およびＭＲＩなど）では、しばしば困難である。従って、特有の例においてここに説明された分析は、決定的なＯＡの画像証拠が分かる前にでさえ、ＯＡを検出することが可能である。
ある例では、抗ＯＡ治療法は、被験者がＯＡを有することをアッセイが示す場合、差次的活性アッセイの結果が知られた時点で、被験者に施される。
使用する検出方法のために必要である場合、ヒトまたは動物の被験など、検査被験から取得または生成した試料を操作する。この実施例は、タンパク質発現を分析するための血清試料の前処理を説明するが、当業者は、ほかの生物学試料（尿および滑液など）使用可能であり、発現を分析するその他の方法も使用可能であることは、十分理解することである。血清は、規定通りの方法を用いて血液試料から取得可能である。血清は、粒子状物質を除去するために遠心分離機にかけ、Ｈｅｔｅｒｏｂｌｏｃｋ（Ｏｍｅｇａ）の０．２５ｍｇ／ｍｌ、ＩＩＲ（Ｂｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎ）の０．２５ｍｇ／ｍｌおよびＴｗｅｅｎ−２０の０．１％を混合する。
アレイは、試料に適用するのに先立って、特定しない結合を減らすために遮断する。例えば、湿気のある部屋で３７℃で１時間ＰＢＳを用いて１対１に薄めた、Ｓｅａｂｌｏｃｋ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）を用いて、アレイを処理することができる。ブロッキング溶液の除去しながら、アレイは、試料の使用に先立って、Ｂｒｉｊ ３５の１ｘＰＢＳ／０．５％を用いて２度洗浄する。処理済の血清（例えば、１０〜５０μｌ、２０μｌなど）は、特有のタンパク質の形成を容認する状態である、抗体複合体（３７℃で３０から１２０分、または３７℃で３０分など）の下で、少なくとも４つのＯＡリスク関連タンパク質を認識する抗体を含むアレイに使用する。非結合タンパク質は、例えば、Ｂｒｊ−３５のＰＢＸ／０．５％を用いて、アレイを洗浄することにより、除去される。
アレイは、制御として供給する他のタンパク質と同様に、１つ以上のＯＡリスク関連タンパク質（２つ以上、３つ以上、または４つ以上ＯＡリスク関連タンパク質など）を見分ける抗体を含むことができる。具体例では、アレイは、少なくともインターロイキン１５（ＩＬ−１５）、可溶性血管付着タンパク質１（ｓＶＡＰ−１）、メタロプロテイナーゼ７（ＭＭＰ−７）、プラスミノーゲン活性抑制物質１（ＰＡＩ−１）、インターロイキン１α（ＩＬ−１α）、ＩＬ−２、マクロファージ阻止因子（ＭＩＰ）−１α、Ｂリンパ球ケモカイン（ＢＬＣ）、６ケモカイン（Ｃｋｉｎｅ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）−７、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インスリン様成長因子結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）−２、ニューロトロフィン４（ＮＴ４）、ＩＣＡＭ−３、血管内皮（ＶＥ）−カドヘリン、およびメタロプロテイナーゼ１の組織阻害剤（ＴＩＭＰ−１）を見分ける抗体を含む。別の具体例では、アレイは、少なくともマクロファージ炎症性タンパク質１β（ＭＩＰ−１β）、マクロファージ炎症性タンパク質１δ（ＭＩＰ−１δ）、ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーター受容体（ＵＰＡＲ）、および血管細胞接着分子１（ＶＣＡＭ−１）、ＩＬ−２、Ｅｏｔ２、ＩＧＦＢＰ−４、ＩＣＡＭ−３、インターフェロンγにより誘発されるモノカイン（ＭＩＧ）、ＭＭＰ−７、骨髄性前駆細胞抑制因子１（ＭＰＩＦ−１）、ＴＧＦβ受容体ＩＩＩ（ＴＧＦ−β ＲＩＩＩ）、および胸腺活性統制ケモカイン（ＴＡＲＣ）を見分ける抗体を含み、さらに６−Ｃｋｉｎｅを見分ける抗体を含むことができる。さらに別の具体例では、アレイは少なくともＩＬ−１５、ｓＶＡＰ−１、ＭＭＰ−７、ＰＡＩ−１、ＩＬ−１α、ＩＬ−２、ＭＩＰ−１α、ＢＬＣ、６−Ｃｋｉｎｅ、ＦＧＦ−７、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＧＦＢＰ−２、ＮＴ４、ＩＣＡＭ−３、ＶＥ−カドヘリン、ＴＩＭＰ−１、ＭＩＰ−１β、ＭＩＰ−１δ、ＵＰＡＲ、ＶＣＡＭ−１、Ｅｏｔ２、ＩＧＦＢＰ−４、ＭＩＧ、ＭＰＩＦ−１、ＴＧＦ−β ＲＩＩＩ、およびＴＡＲＣを見分ける抗体を含む。
例えば、ＲＣＡ間接免疫学的検定を用いて、アレイ上の血清および抗体のタンパク質間の形成複合体を検出する。二次的ビオチン化検出抗体を、抗体複合体（例えば、３７℃で３０から１２０分間、３７℃で３０分間など、Ｂｒｊ−３５のＰＢＳ／０．５％の中で０．１μｇ／ｍｌＡｂ）および取得タンパク質に結合したタンパク質を用いて培養する。上記に説明されたように洗浄することによって、非結合ビオチン化検出抗体を除去する。
アレイは、ユニバーサル抗ビオチン抗体を用いて培養され、それは厳密に言えばビオチン化検出抗体上で結合できる。万能抗ビオチン抗体は、相補的円形オリゴヌクレオチドにプレアニールしたプライマー・オリゴヌクレオチドに接合されている。上記に説明されたように洗浄することによって、非結合ビオチン化検出抗体接合を除去する。
円周のプライマーの３’末端拡張を認める状況下（３７℃で４５分など）で、抗体複合体である、タンパク質に付着しているｓｓ−ＲＣＡ製品をもたらしながら、ＲＣＡ反応は、ＤＮＡポリメラーゼおよび検出精査（Ｃｙ５ラベル付きの精査）存在下でのアレイ上に、そのとき行われる。特定の培養状態および濃度は、従来知られている（例えば、参照することによりここに組み込まれるＳｃｈｗｅｉｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０（４）：３５９−６５、２００２を参照）。
アレイを走査し、アレイ上の各タンパク質の平均蛍光強度を決定した。バックグラウンド蛍光強度は、必要に応じて、すべての実験蛍光強度から引くことができる。各タンパク質の強度は、制御または基準値と比較可能である。例えば、基準蛍光信号強度は、ＯＡが存在または未存在な場合、予期されるＯＡリスク関連タンパク質の価値または価値範囲である。制御値は、ＯＡを有する、またはＯＡを所持しない被験者から並列制御試料から取得した各ＯＡリスク関連タンパク質の平均蛍光強度である。ある例では、同年齢の範囲（例えば、±２年、±５年または±１０年）またはその合成で、制御値は、同姓の被験者の値を示す。
ＯＡリスク関連タンパク質の平均蛍光強度が、ＯＡがない基準または制御値に対して、有意な増加（ｐ≦０．０５）がある場合、またはＯＡリスク関連タンパク質の平均蛍光強度が、ＯＡの存在下で、基準または制御値に有意な類似値がある場合、ＯＡリスク関連タンパク質は、被験者には過剰発現または上方制御であったと見なされる。別例では、強度値からバックグラウンド信号強度を差し引いた後、ＯＡがない基準または制御値に対して、ＯＡリスク関連タンパク質の平均蛍光強度が、少なくとも５０％、少なくとも１００％、または少なくとも２００％増加する場合、ＯＡリスク関連タンパク質は、被験者には過剰発現または上方制御であったと見なされる。
ＯＡリスク関連タンパク質の平均蛍光強度が、ＯＡがない基準または制御値に対して、有意な減少（ｐ≦０．０５）がある場合、またはＯＡリスク関連タンパク質の平均蛍光強度が、ＯＡの存在下で、基準または制御値に有意な類似値がある場合、ＯＡリスク関連タンパク質は、被験者には過小発現または下方制御であったと見なされる。別例では、強度値からバックグラウンド信号強度を差し引いた後、ＯＡがない基準または制御値に対して、ＯＡリスク関連タンパク質の平均蛍光強度が、少なくとも３０％、少なくとも５０％、または少なくとも７５％減少する場合、ＯＡリスク関連タンパク質は、被験者には過小発現または下方制御であったと見なされる。
平均蛍光強度を考慮するために、理想としては、平均蛍光強度は、バックグラウンドよりも少なくとも４倍高いことである。
ＯＡリスク関連タンパク質のうち少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つの検出量（タンパク質のうち少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０など）における統計的有意な差異の存在は、被験者がＯＡを有することを示す。
実施例１０
将来ＯＡを発病するリスクを検出する
この実施例は、例えば、ヒトまたは動物の被験者において、被験者が将来ＯＡ発病の増加リスクを有する場合、決定可能である方法を説明する。ＯＡリスク関連分子の特有の結合は、このような分析を行うために開示されるが、当事者は、開示されたＯＡリスク関連分子のすべてを含む結合または副結合など、ほかの結合を使用可能であることは周知のことである。
被験者から取得した試料（血清試料など）は、開示された方法を用いて分析することができる。一例では、被験者は、患部の関節の痛みおよび腫れなど、ＯＡ関連の他の臨床症状を持たない。特定例では、ＯＡの解剖学的形跡を見つけるためにいくつかの画像検査を行うのに先立って、アッセイを行うことができる。ＯＡの初期ステージを検出するのは、画像診断法（Ｘ線およびＭＲＩなど）では、しばしば困難であるため、この実施例は、ＯＡ発病のより可能性が高い被験者を同定するための方法を供給し、ゆえに、より注意深いモニタリングまたは処置を必要とされる。
ある例では、抗ＯＡ治療法は、被験者が将来ＯＡ発病の増加したリスクを有することをアッセイが示す場合、差次的活性アッセイの結果が知られた時点で、被験者に施される。
使用する検出方法のために必要である場合、ヒトまたは動物の被験など、検査被験から取得または生成した試料を操作する。この実施例は、タンパク質発現を分析するための血清試料の前処理を説明するが、当業者は、ほかの生物学試料（尿および滑液など）使用可能であり、発現を分析するその他の方法も使用可能であることは、十分理解することである。血清は、実施例９に記載されているように、規定通りの方法を用いて血液試料から取得可能であり、準備される。
実施例９に記載されているように、アレイをブロックし、洗浄し、血清試料を培養する。アレイは、制御として供給する他のタンパク質と同様に、４つ以上のＯＡリスク関連タンパク質を見分ける抗体を含むことができる。具体例では、アレイは、少なくともインターロイキン１５（ＩＬ−１５）、可溶性血管付着タンパク質１（ｓＶＡＰ−１）、メタロプロテイナーゼ７（ＭＭＰ−７）、プラスミノーゲン活性抑制物質１（ＰＡＩ−１）、Ｄダイマー５（ＤＤ５）、ＤＤ６、エオタキシン２（Ｅｏｔ２）、細胞間接着分子１（ＩＣＡＭ−１）、ＭＭＰ−２、およびＰ−セレクチンを見分ける抗体を含む。別の具体例では、アレイは、少なくともマクロファージ炎症性タンパク質１β（ＭＩＰ−１β）、マクロファージ炎症性タンパク質１δ（ＭＩＰ−１δ）、ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーター受容体（ＵＰＡＲ）、血管細胞接着分子１（ＶＣＡＭ−１）、６−Ｃｋｉｎｅ、ＩＣＡＭ−３、ＴＧＦ−β ＲＩＩＩ、脳から派生した神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、血液濾液ＣＣケモカイン１（ＨＣＣ１）、レプチン、ＭＭＰ−７、およびプロラクチンを見分ける抗体を含むことができる。さらに別の具体例では、アレイは少なくともＩＬ−１５、ｓＶＡＰ−１、ＭＭＰ−７、ＰＡＩ−１、ＤＤ５、ＤＤ６、Ｅｏｔ２、ＩＣＡＭ−１、ＭＭＰ−２、Ｐ−セレクチン、ＭＩＰ−１β、ＭＩＰ−１δ、ＵＰＡＲ、ＶＣＡＭ−１、６−Ｃｋｉｎｅ、ＩＣＡＭ−３、ＴＧＦ−β ＲＩＩＩ、ＢＤＮＦ、ＥＧＦ、ＨＣＣ１、レプチン、およびプロラクチンを見分ける抗体を含むことができる。
例えば、実施例９に記載されたように、ＲＣＡ間接免疫学的検定を用いて、アレイ上の血清および抗体のタンパク質間の形成複合体を検出する。
アレイを走査し、アレイ上の各タンパク質の平均蛍光強度を決定した。バックグラウンド蛍光強度は、必要に応じて、すべての実験蛍光強度から引くことができる。各タンパク質の強度は、制御または基準値と比較可能である。例えば、基準蛍光信号強度は、将来ＯＡ発病の増加リスクが存在または未存在な場合、予期されるＯＡリスク関連タンパク質の価値または価値範囲である。制御値は、ＯＡリスクを有する、またはＯＡリスクを所持しない被験者から並列制御試料から取得した各ＯＡリスク関連タンパク質の平均蛍光強度である。ある例では、同年齢の範囲（例えば、±２年、±５年または±１０年）またはその合成で、制御値は、同姓の被験者の値を示す。
ＯＡリスク関連タンパク質の平均蛍光強度が、将来的なＯＡリスクがない基準または制御値に対して、有意な増加（ｐ<０．０５）がある場合、またはＯＡリスク関連タンパク質の平均蛍光強度が、将来的なＯＡリスクの存在下で、基準または制御値に有意な類似値（ｐ<０．０５）がある場合、ＯＡリスク関連タンパク質は、被験者において過剰発現または上方制御であったと見なされる。別例では、強度値からバックグラウンド信号強度を差し引いた後、将来ＯＡリスクがない基準または制御値に対して、ＯＡリスク関連タンパク質の平均蛍光強度が、少なくとも５０％、少なくとも１００％、または少なくとも２００％増加する場合、ＯＡリスク関連タンパク質は、被験者には過剰発現または上方制御であったと見なされる。
ＯＡリスク関連タンパク質の平均蛍光強度が、将来的なＯＡリスクがない基準または制御値に対して、有意な減少（ｐ<０．０５）がある場合、またはＯＡリスク関連タンパク質の平均蛍光強度が、将来的なＯＡリスクの存在下で、基準または制御値に有意な類似値（ｐ<０．０５）がある場合、ＯＡリスク関連タンパク質は、被験者において過小発現または下方制御であったと見なされる。別例では、強度値からバックグラウンド信号強度を差し引いた後、将来ＯＡリスクがない基準または制御値に対して、ＯＡリスク関連タンパク質の平均蛍光強度が、少なくとも３０％、少なくとも５０％、または少なくとも７５％減少する場合、ＯＡリスク関連タンパク質は、被験者には過小発現または下方制御であったと見なされる。
平均蛍光強度を考慮するために、理想としては、平均蛍光強度は、バックグラウンドよりも少なくとも４倍高いことである。
ＯＡリスク関連タンパク質のうち少なくとも２つの検出量（タンパク質のうち少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２など）における統計的有意な差異の存在は、被験者が将来ＯＡ増加リスクを有することを示す。
実施例１１
骨関節炎の重傷度の予測
本実施例は、被験者のＯＡの重傷度を判定するため、または被験者が発症した場合、どのくらい重傷のＯＡになるかを予測するために使用することができる方法を説明する。ある実施例において、ＯＡの重傷度は、一般的なＯＡ（例えば、手および膝のＯＡ）の被験者など、ＯＡの被験者において判定される。他の実施例において、被験者が発症した場合、ＯＡがどのくらい重度であるかの予測は、ＯＡの臨床的症状（患部関節の痛み、腫れおよび硬直など）はないが、将来ＯＡの発症リスクの増加を示す被験者において、判定される。アッセイは、ＯＡに関連する兆候および症状のオンセット前または後に実行することができる。
ＯＡの重傷度は、現在、放射線写真結果、症状および関節の機能、および軟骨および骨の代謝を使用して分類される。実施例３で得られたデータは、表１４に示すように、ＯＡの重傷度と関連するタンパク質と、ＯＡ疾病重傷度の予測であるタンパク質とを判定するために分析されることができる。表８、１０および１２に挙げる炎症サイトカインおよびケモカインは、疾病の重傷度と関連させることができ、表８、１０および１２に挙げる成長因子は、Ｘ線写真の重傷度と関連させることができる。
（表１４）ＯＡの重傷度の分類
Figure 2008510168
表８および１０〜１３に挙げるＯＡリスク関連分子を使用して、ＯＡの重傷度は、以下のように判定することができる。ヒトまたは獣医学被験対象などの試験被験者から得た、または派生した試料は、使用される検知方法に必要なように処理される。この実施例は、タンパク質の発現を分析するための血清試料の調製を説明するが、当該分野に精通した者は、他の生体試料（尿または滑液など）を使することが可能で、他の発現の分析方法を使用することが可能であることを理解する。血清は、実施例９で説明するように得られ、処理され、（閉鎖され、洗浄された）アレイに適用することができる。
アレイは、対照に使用できる他のタンパク質と同様に、４つ以上のＯＡリスク関連タンパク質を認識する抗体を含むことができる。特定の実施例において、アレイは、少なくともインターロイキン１５（ＩＬ−１５）、可溶性血管付着タンパク質１（ｓＶＡＰ−１）、メタロプロテイナーゼ７（ＭＭＰ−７）、プラスミノーゲン活性抑制物質−１（ＰＡＩ−１）、インターロイキン１α（ＩＬ−１α）、ＩＬ−２、マクロファージ抑制タンパク質（ＭＩＰ）−１α、Ｂリンパ球ケモカイン（ＢＬＣ）、６ケモカイン（Ｃｋｉｎｅ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）−７、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インスリン様成長因子結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）−２、ニューロトロフィン４（ＮＴ４）、ＩＣＡＭ−３、血管内皮（ＶＥ）カドヘリンおよびメタロプロテイナーゼ１の組織阻害剤（ＴＩＭＰ−１）を認識する抗体を含む。他の特定の実施例において、アレイは、少なくともマクロファージ炎症性タンパク質１β（ＭＩＰ−１β）、マクロファージ炎症性タンパク質１δ（ＭＩＰ−１δ）、ウロキナイーゼ型活性プラスミノーゲン化因子受容体（ＵＰＡＲ）および血管細胞接着分子１（ＶＣＡＭ−１）、ＩＬ−２、Ｅｏｔ２、ＩＧＦＢＰ−４、ＩＣＡＭ−３、インターフェロンγにより誘発されるモノカイン（ＭＩＧ）、ＭＭＰ−７、骨髄性前駆細胞抑制因子１（ＭＰＩＦ−１）、ＴＧＦβ受容体ＩＩＩ（ＴＧＦ−βＲＩＩＩ）および胸腺および活性調節性ケモカイン（ＴＡＲＣ）を認識する抗体を備え、６−Ｃｋｉｎｅを認識する抗体をさらに含むことができる。
特定の実施例において、アレイは、少なくともＩＬ−１５、ｓＶＡＰ−１、ＭＭＰ−７、ＰＡＩ−１、ＤＤ５、ＤＤ６、Ｅｏｔ２、ＩＣＡＭ−１、ＭＭＰ−２、Ｐセレクチン、ＩＬ−１α、ＩＬ−２、ＭＩＰ−１α、ＢＬＣ、６−Ｃｋｉｎｅ、ＦＧＦ−７、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＧＦＢＰ−２、ＮＴ４、ＩＣＡＭ−３、ＶＥカドヘリンおよびＴＩＭＰ−１を認識する抗体を含む。他の特定の実施例において、アレイは、少なくともＭＩＰ−１β、ＭＩＰ−１δ、ＵＰＡＲ、ＶＣＡＭ−１、ＩＬ−２、Ｅｏｔ２、ＩＧＦＢＰ−４、ＩＣＡＭ−３、ＭＭＰ−７、ＭＩＧ、ＭＰＩＦ−１、ＴＧＦ−βＲＩＩＩ、６−Ｃｋｉｎｅ、ＴＡＲＣ、ＢＤＮＦ、ＥＧＦ、ＨＣＣ１、レプチンおよびプロラクチンを認識する抗体を含む。
さらに他の特定の実施例において、アレイは、少なくともＩＬ−１５、ｓＶＡＰ−１、ＭＭＰ−７、ＰＡＩ−１、ＤＤ５、ＤＤ６、Ｅｏｔ２、ＩＣＡＭ−１、ＭＭＰ−２、Ｐセレクチン、ＭＩＰ−１β、ＭＩＰ−１δ、ＵＰＡＲ、ＶＣＡＭ−１、ＢＤＮＦ、ＥＧＦ、ＨＣＣ１、レプチン、プロラクチン、ＩＬ−１α、ＩＬ−２、ＭＩＰ−１α、ＢＬＣ、６−Ｃｋｉｎｅ、ＦＧＦ−７、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＧＦＢＰ−２、ＮＴ４、ＩＣＡＭ−３、ＶＥカドヘリン、ＴＩＭＰ−１、ＩＧＦＢＰ−４、ＭＩＧ、ＭＰＩＦ−１、ＴＧＦ−βＲＩＩＩおよびＴＡＲＣを認識する抗体を含む。
血清中のタンパク質とアレイ上の抗体の間で形成された複合体は、例えば、実施例９で説明される方法を使用して、ＲＣＡ社の間接免疫測定法を使用して検知される。
アレイを走査し、アレイ上の各タンパク質の平均蛍光強度を判定する。背景蛍光強度は、所望するなら、全ての実験蛍光強度から減算することができる。各タンパク質の強度は、対照または基準値と比較される。例えば、様々なＯＡ重傷度が存在またはＯＡが存在しないとき、基準蛍光信号強度値は、予測されるＯＡリスク関連タンパク質の値または値の範囲である。対照値は、ＯＡの重傷度が分っている、またはＯＡでない被験者からの並列対照試料から得た、ＯＡリスク関連タンパク質の平均蛍光強度である。ある実施例において、対照値は、同じ性別、同じ年齢範囲（例えば、±２年、±５年または±１０年）またはその組み合わせの被験者の値を表す。
ＯＡの重傷度、または被験者が重度のＯＡを発症する可能性を判定するために、標的のＯＡリスク関連分子の活性の変化の規模を、被験者において判定することができる。例えば、ＯＡリスク関連分子が、ＯＡに反応して、またはＯＡを引き起こす（例えば、上方制御と注釈された表１０〜１３のタンパク質）ために上方制御される分子ならば、重傷度は、対照（ＯＡ不在の活性など）に対して増加した活性の規模を判定することにより判定され、より大規模な活性の増加は、より重度なＯＡ（または被験者が重度のＯＡを発症する、より大きな可能性）を示唆する。例えば、一つ以上のＯＡリスク関連分子の活性が、対照に対して少なくとも２倍増加の被験者は、一つ以上のＯＡリスク関連分子の活性が、対照に対して少なくとも１０倍増加の被験者より重度の低いＯＡと言える。特定の実施例において、一つ以上のＯＡリスク関連分子の活性の少なくとも４倍、少なくとも５倍、または少なくとも１０倍の増加は、被験者が、重度のＯＡである、または重度のＯＡを発症する可能性があることを示唆する。例えば、上方制御と注釈された表１０および１２に挙げる、一つ以上（少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、または少なくとも５つなど）のＯＡリスク関連分子の活性の少なくとも４倍、少なくとも５倍、または少なくとも１０倍の増加は、被験者が重度のＯＡであることを示唆する。他の実施例において、上方制御と注釈された表１１および１３に挙げる、一つ以上（少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、または少なくとも５つなど）のＯＡリスク関連分子の活性の少なくとも４倍、少なくとも５倍、または少なくとも１０倍の増加は、被験者が重度のＯＡを発症する可能性があることを示唆する。
例えば、ＯＡリスク関連分子が、ＯＡに反応して（例えば、下方制御と注釈された表１０〜１３のタンパク質）下方制御される分子ならば、重傷度は、対照（ＯＡ不在の活性など）に対して減少した活性の規模を判定することにより判定され、より大規模な活性の減少は、より重度なＯＡ（または被験者が重度のＯＡを発症する、より大きな可能性）を示唆する。例えば、一つ以上のＯＡリスク関連分子の活性が、対照に対して少なくとも２倍減少の被験者は、一つ以上のＯＡリスク関連分子の活性が、対照に対して少なくとも１０倍減少の被験者より重度の低いＯＡと言える。特定の実施例において、一つ以上のＯＡリスク関連分子の活性の少なくとも４倍、少なくとも５倍、または少なくとも１０倍の減少は、被験者が、重度のＯＡである、または重度のＯＡを発症する可能性があることを示唆する。例えば、下方制御と注釈された表１０および１２に挙げる、一つ以上（少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、または少なくとも５つなど）のＯＡリスク関連分子の活性の少なくとも４倍、少なくとも５倍、または少なくとも１０倍の減少は、被験者が重度のＯＡであることを示唆する。他の実施例において、下方制御と注釈された表１１および１３に挙げる、一つ以上（少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、または少なくとも５つなど）のＯＡリスク関連分子の活性の少なくとも４倍、少なくとも５倍、または少なくとも１０倍の減少は、被験者が重度のＯＡを発症する可能性があることを示唆する。
よって、ある実施例において、ＯＡリスク関連タンパク質の少なくとも一つ（タンパク質の少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも２６、少なくとも２７、少なくとも２８、少なくとも２９、少なくとも３０、少なくとも３１、少なくとも３２、少なくとも３３、少なくとも３４、少なくとも３５、少なくとも３６など）の少なくとも４倍の変更規模における統計上有意な差異の存在は、被験者が、重度のＯＡまたは将来重度のＯＡを発症する恐れがあることを示唆する。
平均蛍光強度を考慮に入れるため、蛍光強度は、理論的には、背景より少なくとも４倍高い。
一実施例において、統計上有意な規模の変化は、ＯＡの不在または将来のＯＡリスクの不在における同じＯＡリスク関連分子の値と比較したとき、ｐ値≦０．０５である規模の変化を含む。
実施例１２
ＯＡの進行のモニタリング
本実施例は、ＯＡの被験者またはＯＡの臨床的症状（患部関節の痛み、腫れおよび硬直など）はないが、将来ＯＡの発症リスクの増加を示す被験者など、被験者のＯＡの進行をモニタリングするために使用することができる。一実施例において、被験者は、他の過程（外傷など）の二次的なＯＡと比較して、一般的なＯＡ（例えば、手および膝のＯＡ）である。アッセイは、ＯＡに関連する兆候および症状のオンセット前または後に実行することができる。
被験者から得た試料（血清試料など）は、開示された方法を使用して分析することができる。特定の実施例において、アッセイは、被験者がＯＡである、またはＯＡを発症しやすい、例えば、将来のＯＡの発症リスクの増加などを確認した後に実行することができる。特定の実施例において、複数の試料が、少なくとも１ヶ月間隔、少なくとも６ヶ月間隔または少なくとも１年間隔など、異なる時間点で、被験者から得る。
ヒトまたは獣医学被験対象などの試験被験者から得た、または派生した試料は、使用される検知方法に必要なように処理される。この実施例は、タンパク質の発現を分析するための血清試料の調製を説明するが、当該分野に精通した者は、他の生体試料（尿または滑液など）を使することが可能で、他の発現の分析方法を使用することが可能であることを理解する。血清は、実施例９で説明するように得られ、処理され、（閉鎖され、洗浄された）アレイに適用することができる。
アレイは、対照に使用できる他のタンパク質と同様に、４つ以上のＯＡリスク関連タンパク質を認識する抗体を含むことができる。特定の実施例において、アレイは、少なくともインターロイキン１５（ＩＬ−１５）、可溶性血管付着タンパク質１（ｓＶＡＰ−１）、メタロプロテイナーゼ７（ＭＭＰ−７）、プラスミノーゲン活性抑制物質１（ＰＡＩ−１）、インターロイキン１α（ＩＬ−１α）、ＩＬ−２、マクロファージ抑制タンパク質（ＭＩＰ）−１α、Ｂリンパ球ケモカイン（ＢＬＣ）、６ケモカイン（Ｃｋｉｎｅ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）−７、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インスリン様成長因子結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）２、ニューロトロフィン４（ＮＴ４）、ＩＣＡＭ−３、血管内皮（ＶＥ）カドヘリンおよびメタロプロテイナーゼ１の組織阻害剤（ＴＩＭＰ−１）を認識する抗体を含む。他の特定の実施例において、アレイは、少なくともマクロファージ炎症性タンパク質１β（ＭＩＰ−１β）、マクロファージ炎症性タンパク質１δ（ＭＩＰ−１δ）、ウロキナイーゼ型活性プラスミノーゲン化因子受容体（ＵＰＡＲ）および血管細胞接着分子１（ＶＣＡＭ−１）、ＩＬ−２、Ｅｏｔ２、ＩＧＦＢＰ−４、ＩＣＡＭ−３、インターフェロンγにより誘発されるモノカイン（ＭＩＧ）、ＭＭＰ−７、骨髄性前駆細胞抑制因子１（ＭＰＩＦ−１）、ＴＧＦβ受容体ＩＩＩ（ＴＧＦ−βＲＩＩＩ）および胸腺および活性調節性ケモカイン（ＴＡＲＣ）を認識する抗体を備え、６−Ｃｋｉｎｅを認識する抗体をさらに含むことができる。
特定の実施例において、アレイは、少なくともＩＬ−１５、ｓＶＡＰ−１、ＭＭＰ−７、ＰＡＩ−１、ＤＤ５、ＤＤ６、Ｅｏｔ２、ＩＣＡＭ−１、ＭＭＰ−２、Ｐセレクチン、ＩＬ−１α、ＩＬ−２、ＭＩＰ−１α、ＢＬＣ、６−Ｃｋｉｎｅ、ＦＧＦ−７、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＧＦＢＰ−２、ＮＴ４、ＩＣＡＭ−３、ＶＥカドヘリンおよびＴＩＭＰ−１を認識する抗体を含む。他の特定の実施例において、アレイは、少なくともＭＩＰ−１β、ＭＩＰ−１δ、ＵＰＡＲ、ＶＣＡＭ−１、ＩＬ−２、Ｅｏｔ２、ＩＧＦＢＰ−４、ＩＣＡＭ−３、ＭＭＰ−７、ＭＩＧ、ＭＰＩＦ−１、ＴＧＦ−βＲＩＩＩ、６−Ｃｋｉｎｅ、ＴＡＲＣ、ＢＤＮＦ、ＥＧＦ、ＨＣＣ１、レプチンおよびプロラクチンを認識する抗体を含む。
さらに他の特定の実施例において、アレイは、少なくともＩＬ−１５、ｓＶＡＰ−１、ＭＭＰ−７、ＰＡＩ−１、ＤＤ５、ＤＤ６、Ｅｏｔ２、ＩＣＡＭ−１、ＭＭＰ−２、Ｐセレクチン、ＭＩＰ−１β、ＭＩＰ−１δ、ＵＰＡＲ、ＶＣＡＭ−１、ＢＤＮＦ、ＥＧＦ、ＨＣＣ１、レプチン、プロラクチン、ＩＬ−１α、ＩＬ−２、ＭＩＰ−１α、ＢＬＣ、６−Ｃｋｉｎｅ、ＦＧＦ−７、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＧＦＢＰ−２、ＮＴ４、ＩＣＡＭ−３、ＶＥカドヘリン、ＴＩＭＰ−１、ＩＧＦＢＰ−４、ＭＩＧ、ＭＰＩＦ−１、ＴＧＦ−βＲＩＩＩおよびＴＡＲＣを認識する抗体を含む。
血清中のタンパク質とアレイ上の抗体の間で形成された複合体は、例えば、実施例９で説明される方法を使用して、ＲＣＡ社の間接免疫測定法を使用して検知される。
アレイを走査し、アレイ上の各タンパク質の平均蛍光強度を判定する。背景蛍光強度は、所望するなら、全ての実験蛍光強度から減算することができる。各タンパク質の強度は、対照または基準値と比較される。例えば、ＯＡが存在またはＯＡが存在しないとき、基準蛍光信号強度値は、予測されるＯＡリスク関連タンパク質の値または値の範囲である。一実施例において、対照値は、少なくとも１ヶ月前、少なくとも６ヶ月前、少なくとも１年前または少なくとも１０年前など、一つ以上前の時間点での被験者の特定のＯＡリスク関連タンパク質のタンパク質濃度である。ある実施例において、対照値は、同じ性別、同じ年齢範囲（例えば、±２年、±５年または±１０年）またはその組み合わせの被験者の値を表す。
ＯＡの進行をモニタリングするために、標的のＯＡリスク関連分子の活性を、同じ被験者で経時的にモニタリングすることができる。例えば、ＯＡリスク関連分子が、ＯＡに反応して、またはＯＡを引き起こす（例えば、上方制御と注釈された表１０〜１３のタンパク質）ために上方制御される分子ならば、標的のＯＡリスク関連分子の活性のさらなる統計上有意な増加は、ＯＡが速い速度で悪化または進行していることを示唆する。反対に、このような標的のＯＡリスク関連分子の活性の統計上有意な減少は、ＯＡが改善されている、または進行が減少したことを示唆する。
もし、ＯＡリスク関連分子が、ＯＡに反応して下方制御される分子（例えば、下方制御と注釈された表１０〜１３のタンパク質）ならば、標的のＯＡリスク関連分子の活性のさらなる統計上有意な減少は、ＯＡが速い速度で悪化または進行していることを示唆する。反対に、このような標的のＯＡリスク関連分子の活性の統計上有意な増加は、ＯＡが改善されている、または進行が減少したことを示唆する。
一実施例において、統計上有意な増加または減少は、被験者の一つ以上前の時間点で同じＯＡリスク関連分子の値と比較したとき、ｐ値≦０．０５であるそれらを含む。他の実施例において、統計上有意な増加または減少は、被験者の一つ以上前の時間点で同じＯＡリスク関連分子の値と比較したとき、活性の規模の増加または減少を伴うそれらを含む。規模の増加は、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも１００％または少なくとも２００％増加の可能性がある。規模の減少は、少なくとも２５％、少なくとも５０％または少なくとも７５％減少の可能性がある。
実施例１３
ＯＡリスクを評価するためのアレイ
本実施例は、例えば、ＯＡを診断するため、または被験者が将来ＯＡを発症するリスクの増加があるかどうかを判定する、ＯＡリスクを評価するために使用される特別なアレイを説明する。
一実施例において、アレイは、一つ以上のＩＬ−１５、ＭＭＰ−７、ｓＶＡＰ−１、ＩＬ−１α、ＩＬ−２、ＭＩＰ−１α、ＢＬＣ、６−Ｃｋｉｎｅ、ＦＧＦ−７、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＧＦＢＰ−２、ＮＴ４、ＩＣＡＭ−３、ＴＩＭＰ−１、ＶＥカドヘリン、ＭＩＰ−１β、ＵＰＡＲ、ＩＧＦＢＰ−４、ＭＩＧ、ＭＰＩＦ−１、ＴＧＦ−βＲＩＩＩ、ＢＤＮＦ、ＨＣＣおよびレプチン、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３または２４の分子のいずれかなど、ＯＡリスクに反応して上方制御される、少なくとも一つのＯＡリスク関連分子（核酸またはタンパク質など）を認識できるプローブ（オリゴヌクレオチドまたは抗体）を含む。例えば、アレイは、ＩＬ−１５を認識するプローブ（オリゴヌクレオチドまたは抗体）を含むことができる。さらに他の実施例において、アレイは、一つ以上のＰＡＩ−１、ＭＩＰ−１δ、Ｅｏｔ２、ＴＡＲＣ、ＤＤ５、ＤＤ６、ＩＣＡＭ−１、ＭＭＰ−２、Ｐセレクチン、ＭＩＰ−１δ、ＥＧＦ、およびプロラクチン、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２のいずれかなど、ＯＡリスクに反応して下方制御される、少なくとも一つのＯＡリスク関連分子（核酸またはタンパク質）を認識できるプローブ（オリゴヌクレオチドまたは抗体）を含む。
特定の実施例において、アレイは、ＯＡリスクに反応して上方制御（ＩＬ−１５、ＭＭＰ−７、ｓＶＡＰ−１、ＩＬ−１α、ＩＬ−２、ＭＩＰ−１α、ＢＬＣ、６−Ｃｋｉｎｅ、ＦＧＦ−７、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＧＦＢＰ−２、ＮＴ４、ＩＣＡＭ−３、ＴＩＭＰ−１、ＶＥカドヘリン、ＭＩＰ−１β、ＵＰＡＲ、ＩＧＦＢＰ−４、ＭＩＧ、ＭＰＩＦ−１、ＴＧＦ−βＲＩＩＩ、ＢＤＮＦ、ＨＣＣおよびレプチンの少なくとも一つ）される、少なくとも一つのＯＡリスク関連分子（核酸またはタンパク質）、およびＯＡリスクに反応して下方制御（ＰＡＩ−１、ＭＩＰ−１δ、Ｅｏｔ２、ＴＡＲＣ、ＤＤ５、ＤＤ６、ＩＣＡＭ−１、ＭＭＰ−２、Ｐセレクチン、ＭＩＰ−１δ、ＥＧＦ、およびプロラクチン）される、少なくとも一つの遺伝子（またはタンパク質）を認識できるプローブ（オリゴヌクレオチドまたは抗体）を含む。
ある特定の実施例において、アレイは、ＩＬ−１５、ＭＭＰ−７、ｓＶＡＰ−１、ＩＬ−１α、ＩＬ−２、ＭＩＰ−１α、ＢＬＣ、６−Ｃｋｉｎｅ、ＦＧＦ−７、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＧＦＢＰ−２、ＮＴ４、ＩＣＡＭ−３、ＴＩＭＰ−１、ＶＥカドヘリン、ＭＩＰ−１β、ＵＰＡＲ、ＩＧＦＢＰ−４、ＭＩＧ、ＭＰＩＦ−１、ＴＧＦ−βＲＩＩＩ、ＢＤＮＦ、ＨＣＣおよびレプチン、ＰＡＩ−１、ＭＩＰ−１δ、Ｅｏｔ２、ＴＡＲＣ、ＤＤ５、ＤＤ６、ＩＣＡＭ−１、ＭＭＰ−２、Ｐセレクチン、ＭＩＰ−１δ、ＥＧＦ、およびプロラクチンを認識できるプローブ（オリゴヌクレオチドまたは抗体など）を含む。しかし、アレイは、対照プローブをさらに含むことができる。
使用可能な他の代表的なプローブを表８および１０〜１３に挙げる。例えば、アレイは、表１０、１１、１２または１３に挙げるＯＡリスク関連分子を認識するプローブ（オリゴヌクレオチドまたは抗体など）を構成することができる。他の実施例において、アレイは、表１０〜１３の全てに挙げるＯＡリスク関連分子を認識するプローブ（オリゴヌクレオチドまたは抗体など）を構成することができる。
ＯＡリスク関連プローブは、プローブおよび標的の配列間の交雑または特異結合信号の検知を可能にする、一つ以上の検知可能な標識をさらに含むことができる。
交雑または特異結合信号の「減少」および「増加」のコンパイルは、表８および１０〜１３に挙げるＯＡリスク関連遺伝子に関する個々の状態を明らかにする。
実施例１４
定量分光法
本実施例は、例えば、ＲＣＡ社の間接免疫測定法使用の代替として、ＯＡリスク関連タンパク質（表８および１０〜１３に挙げるタンパク質など）の差次的タンパク質活性を検知するために使用されるＳＥＬＤＩなど、特別な定量的分光法を説明する。
一実施例において、レーザー脱離イオン化飛行時間型（ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析が、例えば、ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（商標）（Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）を使用して、ＯＡリスク関連タンパク質の差次的活性の変化を検知するために使用される。このような方法は、当該分野において、周知である（例えば、米国特許番号５，７１９，０６０、米国特許番号６，８９７，０７２および米国特許番号６，８８１，５８６を参照し、これら全てを参考資料として本明細書の一部とする）。ＳＥＬＤＩは、分析物が、分析物の取り込みまたは脱着を促進する表面のエネルギー流に向けられる、脱着のための固相法である。
つまり、ＳＥＬＤＩの変形の一つは、ＯＡリスク関連タンパク質など、興味のある分析物を選択的に取り込む、化学的性質を用いるクロマトグラフ表面を使用する。クロマトグラフ表面は、疎水性、親水性、イオン交換、固定化金属または他の化学的性質からなる。例えば、表面の化学的性質は、分析物の共有結合または非共有結合固定の酸素依存、炭素依存、硫黄依存または窒素依存の手段に基づく結合機能を含むことができる。活性表面は、タンパク質−タンパク質およびタンパク質−ＤＮＡ相互作用などの生体分子相互作用の研究にしばしば使用される、抗体、受容体またはオリゴヌクレオチドなどの特定の「ベート」分子を共有結合的に固定するために使用される。
表面の化学的性質は、結合した分析物を保持し、結合していない物質を洗い流す。続いて、表面に結合した分析物（ＯＡリスク関連タンパク質など）は、脱着され、例えば、質量分析を使用するなど、いくつかの手段のいずれかにより分析されることができる。分析物が、レーザー脱離イオン化質量分析などの、脱着の過程でイオン化されると、検知器は、イオン検知器である。質量分析器は、一般的に、脱着イオンの飛行時間を判定するための手段を含む。この情報は、質量に変換される。しかし、技術者は、イオンを分析および検知するために、脱着したイオンを判定する必要はない。イオン化された分析物が様々な時点で検出器に当るという事実は、イオンの検知および分析を提供する。代替的に、分析物は、検知可能なように、（例えば、フルオロフォアまたは放射性同位元素を用いて）表示される。これらの場合において、検知器は、フルオロフォアまたは放射性同位元素検知器である。複数の検知手段を、アレイの各位置で保持された分子に関連する分析物要素および機能を完全に識別するために、連続で実施することができる。
従って、特定の実施例において、クロマトグラフ表面は、ＩＬ−１５およびｓＶＡＰ−１などのＯＡリスク関連タンパク質を認識する抗体を含む。一実施例いおいて、抗体は、細菌Ｆｃ結合支持体を使用して、表面上に固定される。クロマトグラフ表面は、血清タンパク質を含む試料など、被験者からの試料を用いて培養される．試料に存在する抗原は、クロマトグラフ表面上の抗体を認識する。結合されないタンパク質および質量分析妨害化合物は、洗い流され、クロマトグラフ表面上に保持されるタンパク質は、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦにより分析され、検知される。試料からのＭＳプロファイルは、次に、特定の分子量でのタンパク質の相対的発現レベルは、様々な統計技術および生体情報科学ソフトウェアシステムにより比較される、差次的タンパク質発現の位置付けを使用して比較される。
実施例１５
核酸ベースの分析
本明細書で開示された（表８および１０〜１３で開示された分子など）ＯＡリスク関連核酸分子は、例えば、被験者がＯＡであるかどうかの判定、被験者が将来ＯＡを発症するリスクがあるかどうかの判定、ＯＡの重傷度の判定、被験者のＯＡの進行のモニタリング、およびＯＡの被験者の治療計画の判定など、ＯＡリスクの評価において使用することができる。このような手順において、被験者の生体試料は、表８および１０〜１３に挙げる分子など、ＯＡリスク関連核酸分子の活性（発現など）の増加または減少においてアッセイすることができる。適切な生体試料は、末梢血液、尿、唾液、組織生検、外科検体および滑液に存在するゲノムＤＮＡまたはＲＮＡなど、被験者の細胞から得たゲノムＤＮＡまたはＲＮＡ（ｍＲＮＡを含む）を含む試料を含む。
ＲＮＡは、以下のように細胞から分離することができる。完全ＲＮＡ（５〜１５μｇ）は、各製造会社のプロトコルに沿って、ＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ Ｃａｔ．＃７５１６２、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を使用して、全血から分離した細胞から抽出することができる。つまり、採取細胞は、ＰＢＳで稀釈され、４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離される。生じた上澄み液を破棄し、ペレットを均質化し、ＲＮＡを回収した。ＲＮＡは、当該分野で周知の方法を使用して標識することができる。一実施例において、ＲＮＡは、例えば、標識されたｃＲＮＡ標的を生成するために、エンゾバイオアレイ高収率ＲＮＡ転写標識キット３（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社、Ｐ／Ｎ９００１８２）を使用して、ヒトゲノムアレイのＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社のガイドラインに沿って、ビオチン標識、および洗浄された。最初に分離した完全ＲＮＡの質を確実にするために、ＤＮＡ分解酵素が、試料から汚染されたＤＮＡを除去するために使用される。
表８および１０〜１３に挙げる四つ以上の分子の任意の組み合わせ（ＩＬ−１５またはｓＶＡＰ−１を含む組み合わせなど）など、四つ以上のＯＡリスク関連核酸分子の生体試料の発現の増加または減少の検知は、当該分野において周知の方法で達成することができる。ある実施例において、発現は、少なくともＩＬ−１５、ＭＭＰ−７、ｓＶＡＰ−１、ＰＡＩ−１、または少なくともＭＩＰ−１β、ＭＩＰ−１δ、ＵＰＡＲ、ＶＣＡＭ−１、６−Ｃｋｉｎｅ、ＩＣＡＭ−３およびＴＧＦδ−ＲＩＩＩにおいて判定される。
ＯＡリスク関連分子の発現の増加または減少は、ＯＡリスク関連核酸分子特異ｍＲＮＡの細胞レベルを測定することにより、検知することもできる。ｍＲＮＡは、例えば、ノーザン分析、ＲＴ−ＰＣＲ、およびｍＲＮＡ切片上ハイブリッド形成法を含む、当該分野でよく知られた技術を使用して測定することができる。ｍＲＮＡ分析手順の詳細は、例えば、提供された実施例およびＳａｍｂｒｏｏｋら（ｅｄ．）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、２ｎｄ ｅｄ．、ｖｏｌ．１−３、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９８９において確認することができる。
ＯＡリスク関連配列に特異的なオリゴヌクレオチドは、市場で入手可能な装置を使用して化学的に合成することができる。これらのオリゴヌクレオチドは、次に、例えば、放射性同位元素（３２Ｐなど）またはビオチン（Ｗａｒｄ ａｎｄ Ｌａｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ７８：６６３３-５７、１９８１）またはフルオロフォアなどの非放射性標識を用いて標識され、ドットブロットまたは電気泳動後ゲルから移動することにより、膜または他の個体支持体に固定された個々のＤＮＡ試料と交雑することができる。これらの特異な配列は、例えば、オートラジオグラフィーまたは蛍光法（Ｌａｎｄｅｇｒｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４２：２２９−３７、１９８９）または比色反応（Ｇｅｂｅｙｅｈｕら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５：４５１３−３４、１９８７）などの方法により、視覚化される。
細胞から単離された核酸分子は、核酸増幅産物を形成するために、慣用的方法を使用して増幅することができる。これらの核酸増幅産物は、次に、ＯＡリスク関連核酸と厳密な条件下で交雑するオリゴヌクレオチドプローブと接触することができる。プローブと交雑する核酸増幅産物は、次に、定量化される。オリゴヌクレオチドプローブの配列は、表８および１０〜１３に挙げるＯＡリスク関連分子を符号化する核酸分子に特異的に結合することができる。
実施例１６
タンパク質ベースの分析
本実施例は、ＯＡリスク関連タンパク質の活性（発現または生物的活性など）の変化を検知するために使用することができる。ＯＡリスク関連タンパク質の配列は、例えば、被験者がＯＡであるかどうかの判定、ＯＡである被験者のＯＡの重傷度の判定、被験者のＯＡの進行のモニタリング、被験者が将来ＯＡを発症するリスクがあるかどうかの判定、およびＯＡまたはＯＡの発症リスクの増加にある被験者の治療計画の判定など、ＯＡリスクの評価方法に使用することができる。このような手順において、被験者の生体試料は、表８および１０〜１３に挙げる分子の少なくとも二つと組み合わさる、少なくともＩＬ−１５またはｓＶＡＰを含む任意の組み合わせなど、少なくとも四つのＯＡリスク関連タンパク質の任意の組み合わせ、または表８および１０〜１３に挙げる分子の少なくとも二つと組み合わさる、ＭＩＰ−１β、ＭＩＰ−１δ、ＵＰＡＲ、ＶＣＡＭ−１、６−Ｃｋｉｎｅ、ＩＣＡＭ−３およびＴＧＦβ−ＲＩＩＩの二つ以上を含む任意の組み合わせの活性の変化（増加または減少など）のためにアッセイされる。ある実施例において、ＯＡリスク関連の量は、少なくともＭＩＰ−１β、ＭＩＰ−１δ、ＵＰＡＲ、ＶＣＡＭ−１、６−Ｃｋｉｎｅ、ＩＣＡＭ−３およびＴＧＦβ−ＲＩＩＩにおいて判定される。ある実施例において、ＯＡリスク関連の量は、少なくともＩＬ−１５、ｓＶＡＰ、ＭＭＰ−７およびＰＡＩ−１において判定される。
適切な生体試料は、血清（または他の血液画分）または滑液に存在するタンパク質のようなタンパク質を含む、試料を含む。表８および１０〜１３に挙げる四つ以上のＯＡ関連タンパク質の増加または減少など、被験者の四つ以上のＯＡリスク関連タンパク質量の変化は、被験者がＯＡである、または将来ＯＡが発症する恐れがあることを示唆する。
正常な被験者（ＯＡでない、またはＯＡのリスクのない被験者など）のそのような発現と比較すると、ＯＡリスク関連タンパク質レベルの増加または減少の判定は、上に要約した方法による、ＯＡリスク関連核酸の配列の発現レベルの直接的判定に対する代替または相補的方法である。ＯＡリスク関連タンパク質に特異な抗体の利用は、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、ＣＳＨＬ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８８）において発表される方法のように、当該分野においてよく知られた数ある免疫検定方法の一つにより、ＯＡリスク関連タンパク質の検知および定量化を容易にする。このような抗体の形成方法は、当該分野において周知である。
任意の一般的な免疫検定フォーマット（ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロットまたはＲＩＡアッセイなど）が、ＯＡリスク関連タンパク質レベルを測定するために使用することができる。野生型（正常）のＯＡリスク関連タンパク質レベルと比較した、ＯＡリスク関連ペプチドレベルの増加または減少（表８および１０〜１３に挙げる少なくとも４つのタンパク質の任意の組み合わせの増加、または表８および１０〜１３に挙げる少なくとも４つのタンパク質の任意の組み合わせの減少など）は、ＯＡまたは将来ＯＡを発現するリスクを示唆する。免疫組織化学法も、ＯＡリスク関連タンパク質の検知および定量化に使用することができる。例えば、組織試料を、被験者から得、ある部分が、適切なＯＡリスク関連タンパク質特異的結合物質および任意の一般的な検知システム（西洋わさびペルオキシダーゼと結合した二次抗体を含むシステムなど）を使用して、ＯＡリスク関連タンパク質の存在に対して着色される。このような方法に関する一般的な指針は、ＢａｎｃｒｏｆｔおよびＳｔｅｖｅｎｓ（Ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ、１９８２）およびＡｕｓｕｂｅｌら（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ & Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９８）において確かめることができる。
ある特定の例において、ＲＣＡタンパク質アレイは、被験者から得られた試料に、四つ以上のＯＡリスク関連タンパク質の差次的発現があるかどうかを判定するために使用される。つまり、タンパク質を含む試料は、タンパク質が特異的に適切な抗体に結合するのに十分な条件下で、表８および１０〜１３に挙げる四つ以上のペプチドなど、四つ以上のＯＡリスク関連ペプチドを認識する抗体を含むアレイに適用される。ビオチン化抗体が、次に、取り込まれたタンパク質に結合するのに十分な条件下で添加され、これにより、高度な特異性免疫複合体を生成する。相補的な円形オリゴヌクレオチドに予備徐冷される、プライマーオリゴヌクレオチドに結合された凡用の抗ビオチン抗体が、次に、ビオチン化抗体に結合するのに十分な条件下で添加される。 凡用抗体は、円形の周りのプライマーの３’末端を拡張するＤＮＡポリメラーゼを使用するＲＣＡを使用して増幅され、結果として、複合体に結合されたままの長い単一鎖ＲＣＡ産物を生じる。ＲＣＡ産物は、標識付けされた（フルオロフォアなど、例えば、Ｃｙ−３、Ｃｙ−５またはＦＩＴＣ）相補的オリゴヌクレオチドとの交雑により検知することができる。
ＯＡリスク関連タンパク質を定量化する目的のため、細胞タンパク質を含む被験者の生体試料を使用することができる。ＯＡリスク関連タンパク質の定量化は、免疫検定およびＯＡでない、または将来ＯＡのリスクがある被験者からの細胞で発見されたタンパク質のレベルと比較した量により、達成することができる。正常なヒト細胞で発見された同じＯＡリスク関連タンパク質の量と比較して、被験者の細胞における四つ以上のＯＡリスク関連タンパク質の量の有意な増加は、通常、少なくとも４倍以上の差異がある。四つ以上のＯＡリスク関連タンパク質（表８および１０〜１３に挙げるタンパク質など）の実質的な過剰発現は、ＯＡのリスクを示唆する可能性がある。同様に、正常なヒト細胞で発見された同じＯＡリスク関連タンパク質の量と比較して、被験者の細胞における四つ以上のＯＡリスク関連タンパク質の量の有意な減少は、通常、少なくとも４倍以上の差異がある。四つ以上のＯＡリスク関連タンパク質（表８および１０〜１３に挙げるタンパク質など）の実質的な過下発現は、将来のＯＡ発症のリスクの増加を示唆する可能性がある。
ＯＡリスクを評価する代替方法は、被験者における、例えば、被験者の細胞における四つ以上のＯＡリスク関連タンパク質のレベルを定量化することである。この診断ツールは、例えば、特定の方法が、例えばタンパク質のサイズの変化を検知するために使用されるが、ＯＡリスク関連タンパク質のレベルの減少または増加を検知するのに役立つ。ＯＡリスク関連タンパク質の局所化または同調発現（時間的または空間的）も、周知の方法を使用して検査することができる。
実施例１７
発現のプロファイル（フィンガープリント）
多くのＯＡリスク関連分子（例えば、表８および１０〜１３に挙げる分子により示される）の開示により、ＯＡリスクを評価する情報を提供する発現のプロファイル、例えば、被験者がＯＡであるかどうかの判定、ＯＡの重症度の判定、ＯＡの進行のモニタリング、被験者が将来ＯＡを発現するリスクの増加があるかどうか、およびＯＡである、またはＯＡ発症のリスクがある被験者の治療計画の判定が、可能になる。
ＯＡリスク関連発現のプロファイルは、明確で識別可能な一連のＯＡリスク関連遺伝子またはタンパク質の発現パターン（またはレベル）、例えば、定義された一連の遺伝子またはタンパク質の発現の増加または減少のパターン、またはｍＲＮＡレベルまたはタンパク質レベルまたは活性など、このような分子に関連のある分子、を含む。特定のプロファイルにおける一連の分子は、表８および１０〜１３のいずれかに挙げる、少なくとも四つの分子の任意の組み合わせを含むことができる。一実施例において、プロファイルに含まれる分子は、例えば、ＤＤ５、ＤＤ６、Ｅｏｔ２、ＩＣＡＭ−１、ＭＭＰ−２およびＰセレクチンの少なくとも二つと組み合わさる、またはＩＬ−１α、ＩＬ−２、ＭＩＰ−１α、ＢＬＣ、６−Ｃｋｉｎｅ、ＦＧＦ−７、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＧＦＢＰ−２、Ｔ４、ＩＣＡＭ−３、ＶＥカドヘリンおよびＴＩＭＰ−１の少なくとも二つと組み合わさる、少なくともＩＬ−１５、ＭＭＰ−７、ｓＶＡＰ−１およびＰＡＩ−１を含む。他の実施例において、プロファイルに含まれる分子は、例えば、ＢＤＮＦ、ＥＧＦ、ＨＣＣ１、レプチン、ＭＭＰ−７およびプロクラチンの少なくとも二つと組み合わさる、またはＩＬ−２、ＩＧＦＢＰ−４、ＭＩＧ、ＭＭＰ−７、ＭＰＩＦ−１、Ｅｏｔ２およびＴＡＲＣの少なくとも二つと組み合わさる、少なくともＭＩＰ−１β、ＭＩＰ−１δ、ＵＰＡＲ、ＶＣＡＭ−１、６−Ｃｋｉｎｅ、ＩＣＡＭ−３およびＴＧＦβ−ＲＩＩＩを含む。
特定のプロファイルは、特定の段階または正常な組織の年齢（血清または滑液など）に対して特異的である。よって、発現プロファイルは、前ＯＡ試料（ＯＡを模擬または誘発する条件の対象でない正常な組織など）またはＯＡ組織から単離された細胞のために確立される。これらの各プロファイルは、発現がＯＡを生じるために変更、またはＯＡの結果として変更される、少なくとも四つ以上の遺伝子またはタンパク質の発現レベルでの情報を含む。このような情報は、特異的遺伝子またはタンパク質の絶対発現レベルと同様、相対発現レベルも含むことができる。同様に、測定された値は、「遺伝子発現レベル」と相関する、タンパク質活性の相対または絶対レベルである。 個々の被験者の発現プロファイルの結果は、基準または対照試料の識別特徴／プロファイルと比較して、試験試料の状況とみなされる。
発現プロファイルを構成する分子のレベルは、あらゆる様々な周知の方法により測定することができ、これらの方法は、測定される分子のタイプに対して特異的かもしれない。よって、核酸レベル（直接的遺伝子発現レベルなど、ｍＲＮＡ発現のレベルなど）は、特異的な核酸交雑反応を使用して測定することができる。タンパク質レベルは、一般的なタンパク質アッセイを使用して、免疫学ベースのアッセイ（ＥＬＩＳＡｓおよびタンパク質アッセイなど、ＲＣＡタンパク質アッセイなど）を使用して、または活性アッセイを使用して測定することができる。核酸およびタンパク質レベル測定の実施例は、本明細書において提供される。他の方法は、当該分野に精通した者には周知である。
ＯＡリスク発現プロファイルの実施例は、ヌクレオチドまたはタンパク質アレイまたはマイクロアレイなど、アレイフォーマットである。生体高分子採取の存在またはレベルを判定するためのアレイの使用は、周知である。アレイベースの測定方法において、アレイは、被験者の試料からのポリヌクレオチド（核酸ベースのアレイの場合）またはタンパク質（タンパク質ベースの場合）と接触させることができる。次に、被験者の核酸分子またはタンパク質の結合の量または位置を、例えば、その被験者の発現プロファイルを作成するために、判定することができる。そのような遺伝子発現プロファイルは、例えば、ＯＡであると分かっている、またはＯＡであると知らない被験者からの対照発現プロファイルなど、他の発現プロファイルと比較することができる。このような方法は、被験者がＯＡであるかどうかの判定、またはＯＡの重症度の判定のために使用することができる。さらに、被験者の発現プロファイルは、例えば、ＯＡレベルの対照（または一連の対照）発現プロファイルと相関させることができる、 一つ以上の適切な治療と相関させることができる。
実施例１８
迅速スクリーニングアッセイ
ＯＡリスク関連分子の活性（発現の量など）を変更する薬剤を同定するための任意のアッセイを実行する前に、薬剤がＯＡリスク関連タンパク質に結合するかどうかを判定するため、迅速スクリーニングアッセイが数多くの薬剤をスクリーニングするために使用される。
ＨＩＶタンパク質への結合を検知するための迅速スクリーニングアッセイが、例えば、米国特許番号５，２３０，９９８で開示されており、参考資料として本明細書の一部とする。つまり、ＯＡ関連タンパク質（例えば、ＩＬ−１５、ＭＭＰ−７、ｓＶＡＰ−１またはＶＣＡＭ−１など、表８および１０〜１３に挙げる一つ以上のタンパク質など）は、タンパク質に結合可能な一次抗体と培養され、一つ以上の試験薬と培養される。過剰な結合されない一次抗体は、洗浄、除去され、ＯＡリスク関連タンパク質に結合された抗体は、一次抗体を結合する二次標識された抗体を添加することにより検知される。過剰な結合されない二次抗体は、次に、除去され、検知可能な標識の量が定量化される。結合の効果は、次に、公式により百分率で判定される。（試験薬の不在における標識の量）−（試験薬の存在における標識の量／試験薬の不在における標識の量）ｘ１００。
ＯＡリスク関連タンパク質に対して高結合親和性である薬剤は、さらに薬剤の存在におけるＯＡリスク関連分子の活性（発現など）を判定するために特別に設計された、他のアッセイ（以下の実施例で説明される方法など）に使用される。
実施例１９
インビトロスクリーニングアッセイ
本実施例は、ＯＡ関連分子の活性を変更する試験薬の能力をスクリーニングするために使用される、独特なインビトロ方法を説明する。しかし、本開示は、これらの独特な方法に制限されるものではない。当該分野に精通した者は、他のインビトロアッセイが使用できることを理解する。
上の実施例で開示されたように、開示されたＯＡ関連分子（表８および１０〜１３に挙げる分子など）の活性は、ＯＡの結果として、またはＯＡを引き起こすために、増加または減少する。よって、スクリーニングアッセイは、そのような活性（ＯＡに反応して、またはＯＡを引き起こすために増加した核酸またはタンパク質の活性の減少、ＯＡに反応して、またはＯＡを引き起こすために減少した核酸またはタンパク質の活性の増加、またはその組み合わせなど）を正常化する、または活性の変化（ＯＡに反応して、またはＯＡを引き起こすために減少した核酸またはタンパク質の活性のさらなる減少、またはＯＡに反応して、またはＯＡを引き起こすために増加した核酸またはタンパク質の活性のさらなる増加など）を高める薬剤を同定および分析するために使用される。例えば、このような変化が、被験者に有益な効果を与えるなら、活性の変化をさらに高めることが所望されるかもしれないし、このような変化が、被験者に有害な作用（炎症など）を与えるなら、活性の変化を中和することが所望されるかもしれない。
開示されたアッセイにより同定された薬剤は、例えば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも５０％または、たとえ少なくとも９０％の減少など、ＯＡに関連する一つ以上の症状を減少するのに役立つ可能性がある。ひとたび同定されると、ＯＡリスク関連分子の活性を変更するために発見された試験薬は、薬学的に許容し得る形態で、治療薬（または予防薬として）に製剤化され、ＯＡである、または将来ＯＡを発症するリスクの増加がある被験者を治療するために使用される。
ＯＡの被験者のインビボで何が起こるかのモデルを提供する細胞（少なくとも１０，０００細胞、例えば、１×１０４−１×１０６細胞など）が、低酸素条件で培養される。例えば、軟骨細胞は、Ｙｕｄｏｈら（Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｅｓ Ｔｈｅｒ．７（２）：Ｒ３８０−９１、２００５）に説明される方法を使用して低酸素条件下で，３７℃で培養することができる。つまり、軟骨細胞は、市販または軟骨から得て、０．１μｍｏｌ／ｌなどの、０．１〜２００．０μｍｏｌ／ｌの濃度で、Ｈ２Ｏ２の存在下、５％のＣＯ２で培養される。軟骨細胞は、少なくとも４時間、または少なくとも２４時間など、少なくとも１時間、低酸素条件下で、培養される。試験薬は、Ｈ２Ｏ２で、細胞の培養前、培養中または培養後に添加される。一実施例において、薬剤は、低酸素条件で、細胞を培養後に、少なくとも１時間、少なくとも２時間、、少なくとも６時間または少なくとも２４時間、細胞と培養される。
他の実施例において、骨関節炎の被験者からの細胞が、当該分野で周知の方法（例えば、Ｙｕｄｏｈら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｅｓ Ｔｈｅｒ．７（２）：Ｒ３８０−９１、２００５）を使用して、単離、および培養される。つまり、軟骨細胞は、以下のように、軟骨の肉眼的に無損傷の地域から単離される。軟骨組織は、小片に切り、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、１．５ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼＢ（Ｓｉｇｍａ）を含むダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ：Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）で、３７℃で一夜、振盪台で、温浸する。細胞は、遠心分離され、ＰＢＳで洗浄され、新しいＤＭＥＭと培養される。得られた軟骨細胞は、１０％の熱失活した子ウシの胎児の血清、２ｍｍｏｌ／ｌの１−グルタミン、２５ｍｍｏｌ／ｌのＨＥＰＥＳ、および１００ユニット／ｍｌのペニシリンおよびストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭで、３７℃の加湿した５％ＣＯ２気圧で培養される。軟骨細胞表現型が、経過中維持されたことを確認するため、細胞形態およびプロテオグリカンを生成する可能性をモニタリングすることができる。所望する間中、試験薬を細胞に添加する。
例えば、ＯＡリスク関連分子の活性を変更（正常化するため）するために、試験薬が細胞に所望の効果を与えるのに十分な条件下で、一つ以上の試験薬を細胞と培養する。一実施例において、薬剤は、少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも６時間、少なくとも２４時間、または少なくとも１週間、細胞と培養される。
一つ以上のＯＡリスク関連分子の活性に対する試験薬の効果を判定するために、ＲＮＡが、当該分野で周知の方法を使用して、細胞から単離、および標識される。標識されたＲＮＡは、 例えば、一つ以上のＩＬ−１５、ＭＭＰ−７、ｓＶＡＰ−１、ＭＩＰ−１δ、ＭＩＰ−１β、ＵＰＡＲ、Ｖ−ＣＡＭ−１、６−Ｃｋｉｎｅ、ＩＣＡＭ−３、ＴＧＢ−βＲＩＩＩまたはＰＡＩ−１などの表８および１０〜１３に挙げる遺伝子の少なくとも１つ、少なくとも２つ、または少なくとも３つなど、一つ以上のＯＡリスク関連遺伝子に特異的に交雑できる、一つ以上の核酸分子（プライマーまたはプローブなど）を含むアレイに曝露される。交雑複合体を検知することにより、標的ＯＡリスク関連分子の核酸活性の変化が、試験薬により作用されたかどうかが、例えば、試験薬が不在の対照または基準値と比較することにより、判定される。
代替的に、一つ以上のＯＡリスク関連分子の活性に対する試験薬の効果を判定するために、細胞からのタンパク質を分析することができる。例えば、一つ以上のＩＬ−１５、ＭＭＰ−７、ｓＶＡＰ−１、ＭＩＰ−１δ、ＭＩＰ−１β、ＵＰＡＲ、Ｖ−ＣＡＭ−１、６−Ｃｋｉｎｅ、ＩＣＡＭ−３、ＴＧＢ−βＲＩＩＩまたはＰＡＩ−１などの表８および１０〜１３に挙げるタンパク質の少なくとも１つ、少なくとも２つまたは少なくとも３つなど、一つ以上のＯＡリスク関連タンパク質の差次的活性を検知するために、タンパク質（または単離されたタンパク質など）を分析することができる。一実施例において、実施例９で説明した方法が、使用される。タンパク質を検知することにより、標的ＯＡリスク関連分子のタンパク質活性の変化が、試験薬により作用されたかどうかが、例えば、試験薬が不在の対照または基準値と比較することにより、判定される。
実施例２０
インビボスクリーニングアッセイ
本実施例は、ＯＡ関連分子の活性を変更する試験薬の能力をスクリーニングするために使用される、独特なインビボ方法を説明する。しかし、本開示は、これらの独特な方法に制限されるものではない。当該分野に精通した者は、他のインビボアッセイ（例えば、他の哺乳動物または他の試験被験者におけるＯＡを誘導する他の方法）が使用できることを理解する。
ＯＡを自然に発症する哺乳動物（ＳＴＲ／１Ｎマウス）またはＯＡを誘発する状態に曝露された哺乳動物が使用される。ある特定の実施例において、ＯＡが、ウサギにおいて、麻酔（例えば、ケタミン（１５ｍｇ／ｋｇ体重）およびキシラジン（１．５〜２ｍｇ／ｋｇ体重）の筋肉内注射）下、部分的な内側半月板切除術により誘発される。ウサギに麻酔をし、皮膚を内側側枝靭帯より前で切開する。関節包を垂直に開いた後、内側半月の前挿入性靭帯を切除し、前角および半月の内側部を莢膜付着および内側側枝靭帯から取り除く。後挿入靭帯を後包切開の方法で解体した後、内側半月を除去する。通常の食塩水で関節洗浄の後、関節包および皮膚を単一縫合で閉口する。
ＯＡの誘発と同時、または誘発前または誘発後に、試験薬が被験者に所望する効果を与えるのに十分な条件で、一つ以上の試験薬を被験者に投与する。静脈内、筋肉内、経皮または患部関節への直接注入などのあらゆる適切な投与方法が、使用される。一実施例において、試験薬は、半月板切除術の少なくとも２４時間後、少なくとも２日後、少なくとも３日後、少なくとも７日後、少なくとも１０日後、少なくとも２週間後または少なくとも１ヶ月後など、部分的な内側半月板切除術の少なくとも１２時間後に投与される。
試験薬が被験者に所望する効果を与えるのに十分な条件下、例えば、ＯＡリスク関連分子の活性を変更（正常化など）する条件下で、一つ以上の試験薬を試験哺乳動物で培養する。一実施例において、一つ以上の試験薬の多重投与量が、例えば、毎日、毎週または毎月、例えば、少なくとも２週間、少なくとも１ヶ月またはすく膜とも３ヶ月、投与される。
一つ以上のＯＡリスク関連分子の活性における試験薬の効果は、本明細書で説明された方法を使用して判定することができる。例えば、血清を、試験薬に暴露した後、哺乳動物から単離し、一つ以上のＯＡリスク関連分子の差次的活性を、例えば、実施例９で説明した方法を使用して判定する。他の実施例において、哺乳動物の生体試料から単離したＲＮＡは、一つ以上のＯＡリスク関連分子の活性を、例えば、実施例１５で説明した方法を使用して、判定するために分析される。ＯＡリスク関連分子を検知することにより、標的ＯＡリスク関連分子の活性の変化が、試験薬によって生じたかどうかが、例えば、試験薬の不在の対照または基準値との比較により、判定される。
さらに他の実施例において、動物が、関節の痛みなどのＯＡの他の臨床的兆候に対して、例えば、Ｘ線で患部関節を検査することにより、検査された。試験薬の存在によるＯＡに関連した症状の発症の減少は、試験薬が、被験者のＯＡを軽減、またはさらにＯＡを阻害することにも使用可能な治療薬剤である証拠を提供する。
実施例２１
有効量および骨関節炎に対する効果判定のアッセイ
本実施例は、ＯＡリスク関連分子の活性を変更する、実施例１９および２０で説明した方法を使用して同定した分子など、試験薬をさらに評価するために使用することができる。例えば、試験薬の効果的な用量とＯＡを治療するための薬剤の能力が、インビトロまたはインビボで判定できる。
細胞ベースのアッセイ
細胞（２０，０００から５００，０００の軟骨細胞など）を、低酸素状態などのＯＡを模擬する状態に暴露し、少なくとも１２時間（少なくとも２４時間、または少なくとも４８時間など）培養を続ける。試験薬は、ＯＡの模擬前、模擬中または模擬後に適用できる。代替的に、ＯＡの被験者からの軟骨細胞が、単離（実施例１９で説明した方法を使用するなど）され、試験薬が培養細胞と培養された。
ある実施例において、潜在的な治療薬剤の複数の異なる用量が、最適な範囲を同定するために、細胞と培養された。例えば、ミリグラム、マイクログラム、およびナノグラム濃度が使用される。次に、一つ以上のＯＡリスク関連分子の活性を判定するためのアッセイ、例えば、ＯＡリスク関連タンパク質量またはＯＡリスク関連核酸発現量（例えば、上述の実施例を参照）を測定するためのアッセイなどが、実行される。
動物モデルアッセイ
上に提供した方法を使用して同定される薬剤などのＯＡの治療のための薬剤の能力は、動物モデルにおいて評価が可能である。哺乳動物でＯＡを誘発するいくつかの方法が知られているが、特定の実施例を本明細書で提供する。これに制限されるものではないが、マウス、ラット、ウサギ、犬、ギニアピッグ、ブタ、マイクロブタ、ヤギおよびアカゲザルなどのヒト以外の霊長類を含む、任意の種属の哺乳動物が、ＯＡの動物モデルを生成するために使用可能である。このような動物モデルは、ＯＡに関連した症状を改善するための薬剤の能力を試験するためにも、使用が可能である。さらに、このような動物モデルは、動物被験対象のＬＤ５０およびＥＤ５０を判定するために使用することができ、このようなデータは、候補薬のインビボの有効性を判定するために使用することができる。
ＯＡを自然に発症する動物を使用、または代替的に、ＯＡを哺乳動物で誘発（実施例２０を参照）し、上の実施例で同定された一つ以上の試験薬を投与する。投与される試験薬の量は、熟練した当業者により判定される。ある実施例において、最適な用量範囲を同定するために、複数の異なる候補治療薬剤の用量が、異なる試験被験者に投与される。治療薬剤は、ＯＡ誘発前、誘発中または誘発後に投与することができる。一つ以上の試験薬の投与後、動物は、ＯＡに関連する一つ以上の症状について観察される。試験薬の存在によるＯＡに関連した症状の発症の減少は、試験薬が、被験者のＯＡを軽減、またはさらにＯＡを阻害することにも使用可能な治療薬剤である証拠を提供する。
我々の開示の原則が適用されるであろう多様の可能な実施形態の見解において、図示の実施形態は実施例であって、本開示の範囲を制限するものではないことを理解するべきである。むしろ、本開示の範囲は、以下の特許請求の範囲で定義される。よって、我々は、これらの請求の範囲および精神に含まれる全てを我々の発明と主張する。
研究設計および試料選択を図示した概略図である。「発生例ひざＯＡ」または「対照」のように、参加者を分類するために使用されたＸ線と並行して空腹時の血清試料が、評価された。初期Ｘ線の約５年前に得た各「対照」から得た第三試料も評価された。対照群は、手ＯＡのＸ線写真の証拠もなかった。 １６のサブアレイ（Ａ−Ｌ）をもつ、試料タンパク質マイクロアレイスライドの図式的描写である。「サブアレイ」とは、スライド上の１６のウェルまたは円分析サイトを意味する。「アレイ」とは、 ウェルに印刷された抗体量を意味する。各マイクロアレイスライドは、一タイプのアレイのみを含む。 図３Ａ〜Ｄは、異なるモデルのシミュレーションと傾きおよび切片の効果を示す図式的描写である。（Ａ）ＯＡと正常間の異なる切片および傾き、（Ｂ）ＯＡと正常間の異なる傾き、しかし同じ切片、（Ｃ）ＯＡと正常間の異なる切片、しかし同じ傾き、（Ｄ）ＯＡと正常間の異なる切片、しかし傾きはゼロに等しい。 共分散分析を使用して同定されたタンパク質を示す、Ｖｅｎ概略図であり、発現がＯＡの発症前に変更されたものと、ＯＡが現れたときに発現が変更されたものである。 複合モデルＡＮＯＶＡおよび有意なマイクロアレイ分析（ＳＡＭ）を使用して同定されたタンパク質を示す、Ｖｅｎ概略図であり、発現がＯＡの発症前に変更されたものと、ＯＡが現れたときに発現が変更されたものである。 図６Ａ〜Ｇは、ＯＡおよび対照試料間の４つの差次的に発現したタンパク質のＺスコアを示すグラフである。発現が、来院時の初期Ｘ線および診断Ｘ線でＯＡおよび健康な試料間で著しく異なる、４つのタンパク質（インターロイキン−１５［ＩＬ−１５］、マトリックスメタロプロテイナーゼ［ＭＭＰ］−７、プラスミノーゲン活性抑制物質［ＰＡＩ］−１、可溶性血管付着タンパク質［ｓＶＡＰ］−１）の一連のプロット。Ｘ軸は３つの年齢グループで、Ｙ軸はＭＳＩマイクロアレイチップ上のタンパク質発現値およびＺスコア対応する値を示す。３つの年齢グループにおいて、異なる来院時のタンパク質の発現データの未加工値およびＺスコアが、個別、および合計平均により作図された。 図７Ａおよび７Ｂは、来院時の初期および分類Ｘ線の差次的発現タンパク質を使用した分類系図を示す、概略図である。初期のＸ線時またはそれ以前（Ａ）、および分類Ｘ線時（Ｂ）に観察されたタンパク質の発現に基づく、ＯＡおよび対照試料の反復的な回帰系図分類。各タンパク質の横に、試料を分類するために使用された限界値Ｚスコアを表示する。各タンパク質に関連する奇数値は、括弧内に表示する。２つの数字が各ノード（丸または四角で図示される）に表示される。そのタンパク質によりＯＡと分類された試料の数は、上に示され、対照と分類された参加者の数は、下に示される。誤分類エラー発生率は、（Ａ）において０．０６０９８、および（Ｂ）において０．０７０５９であった。

Claims (64)

  1. 被験者における骨関節炎（ＯＡ）リスクの評価方法であって、
    前記被験者の試料における、少なくとも４つのＯＡリスク関連分子の差次的活性を検知する段階を備え、前記少なくとも４つのＯＡリスク関連分子のうちの２つは、インターロイキン１５（ＩＬ−１５）と可溶性血管付着タンパク質１（ｓＶＡＰ−１）を備え、差次的活性を検知する段階は、少なくともＩＬ−１５の上方制御がみられるかどうかを判定する段階と、少なくともｓＶＡＰ−１の下方制御がみられるかどうかを判定する段階とを備え、前記少なくとも４つのＯＡリスク関連分子の差次的活性の存在が、前記被験者のＯＡリスクの増加を示す、方法。
  2. 前記少なくとも４つのＯＡリスク関連分子が、表８および１０〜１３のいずれかに挙げた、少なくとも４つの分子を備える、請求項１に記載の方法。
  3. 前記少なくとも４つのＯＡリスク関連分子が、表８および１０〜１３のいずれかに挙げた、少なくとも１０の分子を備える、請求項１に記載の方法。
  4. 前記少なくとも４つのＯＡリスク関連分子が、表８および１０〜１３のいずれかに挙げた、少なくとも１３の分子を備える、請求項１に記載の方法。
  5. 前記少なくとも４つのＯＡリスク関連分子が、表８および１０〜１３のいずれかに挙げた、少なくとも１６の分子を備える、請求項１に記載の方法。
  6. 前記少なくとも４つのＯＡリスク関連分子が、表８および１０〜１３のいずれかに挙げた、少なくとも２０の分子を備える、請求項１に記載の方法。
  7. 前記少なくとも４つのＯＡリスク関連分子は、マトリックスメタロプロテイナーゼ７（ＭＭＰ−７）およびプラスミノ−ゲン活性抑制物質１（ＰＡＭ−１）を備え、差次的活性を検知する段階は、少なくともＭＭＰ−７およびＰＡＭ−１の上方制御がみられるかどうかを判定する段階をさらに備える、請求項１に記載の方法。
  8. 前記少なくとも４つのＯＡリスク関連分子は、Ｄダイマー５（ＤＤ５）、ＤＤ６、エオタキシン２（Ｅｏｔ２）、細胞間接着分子１（ＩＣＡＭ−１）、ＭＭＰ−２およびＰセレクチンを備え、差次的活性を検知する段階は、少なくともＤＤ５、ＤＤ６、Ｅｏｔ２、ＩＣＡＭ−１、ＭＭＰ−２およびＰセレクチンの下方制御がみられるかどうかを判定する段階をさらに備え、ＰＡＩ−１、ＤＤ５、ＤＤ６、Ｅｏｔ２、ＩＣＡＭ−１、ＭＭＰ−２およびＰセレクチンの下方制御の存在と、ＩＬ−１５、ＭＭＰ−７およびｓＶＡＰ−１の上方制御の存在が、前記被験者の将来のＯＡ発症リスクの増加を示唆する、請求項７に記載の方法。
  9. 前記少なくとも４つのＯＡリスク関連分子が、インターロイキン１α（ＩＬ−１α）、ＩＬ−２、マクロファージ抑制タンパク質（ＭＩＰ）−１α、Ｂリンパ球ケモカイン（ＢＬＣ）、６ケモカイン（Ｃｋｉｎｅ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）−７、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ-ＣＳＦ）、インスリン様成長因子結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）-２、ニューロトロフィン４（ＮＴ４）、ＩＣＡＭ-３、血管内皮（ＶＥ）カドヘリンおよびメタロプロテイアーゼ１の組織阻害剤（ＴＩＭＰ−１）を備え、差次的活性を検知する段階は、少なくともＩＬ−１α、ＩＬ−２、マクロファ−ジＭＩＰ−１α、ＢＬＣ、６−Ｃｋｉｎｅ、ＦＧＦ−７、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、ＩＧＦＢＰ−２、ＮＴ４、ＩＣＡＭ−３、ＶＥカドヘリンおよびＴＩＭＰ−１の上方制御がみられるかどうかを判定する段階をさらに備え、ＰＡＩ−１の下方制御の存在とＩＬ−１５、ＭＭＰ−７、ｓＶＡＰ−１、ＩＬ−１α、ＩＬ−２、ＭＩＰ−１α、ＢＬＣ、６−Ｃｋｉｎｅ、ＦＧＦ−７、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＧＦＢＰ−２、ＮＴ４、ＩＣＡＭ−３、ＶＥカドヘリンおよびＴＩＭＰ−１の上方制御の存在が、前記被験者のＯＡを示唆する、請求項７に記載の方法。
  10. 前記少なくとも４つのＯＡリスク関連分子が、マクロファージ炎症性タンパク質１β（ＭＩＰ−１β）、マクロファージ炎症性タンパク質１δ（ＭＩＰ−１δ）、ウロキナーゼ型活性プラスミノーゲン化因子受容体（ＵＰＡＲ）および血管細胞接着分子１（ＶＣＡＭ−１）を備え、差次的活性を検知する段階は、少なくともＭＩＰ−１β、ＵＰＡＲとＶＣＡＭ−１の上方制御と、少なくともＭＩＰ−１δの調節解除がみられるかどうかを判定する段階をさらに備え、ＩＬ−１５、ｓＶＡＰ−１、ＵＰＡＲ、ＶＣＡＭ−１およびＭＩＰ−１βの上方制御と、ＭＩＰ−１δの下方制御の存在が、前記被験者のＯＡリスクの増加を示唆する、請求項１に記載の方法。
  11. 前記少なくとも４つのＯＡリスク関連分子が、脳から派生した神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、血液濾液ＣＣケモカイン１（ＨＣＣ１）、レプチン、ＭＭＰ−７およびプロラクチンを備え、差次的活性を検知する段階は、少なくともＨＣＣ１、レプチン、ＭＭＰ−７およびＢＤＮＦの上方制御と、少なくともＥＧＦおよびプロラクチンの下方制御がみられるかどうかを判定する段階をさらに備え、ＩＬ−１５、ｓＶＡＰ−１、ＭＩＰ−１β、ＨＣＣ１、レプチン、ＭＭＰ−７、ＵＰＡＲ、ＶＣＡＭ−１、ＨＣＣ１、レプチン、ＭＭＰ−７およびＢＤＮＦの上方制御の存在と、ＭＩＰ−１δ、ＥＧＦおよびプロラクチンの下方制御が、前記被験者が、将来、ＯＡを発症する恐れがあることを示唆する、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記少なくとも４つのＯＡリスク関連分子が、ＩＬ−２、Ｅｏｔ２、ＩＧＦＢＰ−４、ＩＣＡＭ−３、インターフェロンγにより誘発されるモノカイン（ＭＩＧ）、ＭＭＰ−７、骨髄性前駆細胞抑制因子１（ＭＰＩＦ−１）、胸腺および活性調節性ケモカイン（ＴＡＲＣ）（ｔｈｙｍｕｓ ａｎｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ）、６−ＣｋｉｎｅおよびＴＧＦβ受容体ＩＩＩ（ＴＧＦ−βＲＩＩＩ）を備え、差次的活性を検知する段階は、少なくともＩＬ−２、ＩＧＦＢＰ−４、ＩＣＡＭ−３、ＭＩＧ、ＭＭＰ−７、ＭＰＩＦ−１、６−ＣｋｉｎｅおよびＴＧＦ−βＲＩＩＩの上方制御と、少なくともＥｏｔ２およびＴＡＲＣの下方制御がみられるかどうかを判定する段階をさらに備え、ＩＬ−２、ＩＧＦＢＰ−４、ＩＣＡＭ−３、ＭＩＧ、ＭＭＰ−７、ＭＰＩＦ−１、ＵＰＡＲ、ＶＣＡＭ−１、６−ＣｋｉｎｅおよびＭＩＰ−１βの上方制御と、ＭＩＰ−１δ、Ｅｏｔ２およびＴＡＲＣの下方制御の存在は、前記被験者のＯＡを示唆する、請求項１０に記載の方法。
  13. 上方制御として表１０〜１１に挙げる、少なくとも１０のＯＡリスク関連分子の任意の組み合わせの上方制御の存在が、前記被験者のＯＡを示唆する、請求項１に記載の方法。
  14. 下方制御として表１２〜１３に挙げる、少なくとも６つのＯＡリスク関連分子の任意の組み合わせの下方制御の存在が、前記被験者の将来のＯＡ発症リスクの増加を示唆する、請求項１に記載の方法。
  15. 前記差次的活性が、前記被験者のＯＡリスクの増加を示唆する場合、ＯＡ疾病を回避または減少するために、前記被験者に治療を施すことをさらに含む、請求項１に記載の方法。
  16. 前記少なくとも４つのＯＡリスク関連分子の前記検知された差次的活性が、少なくとも４つのＯＡリスク関連分子のそれぞれの基準値と比較される、請求項１に記載の方法。
  17. 前記基準値が、ＯＡリスクのない、前記少なくとも４つのＯＡリスク関連分子のそれぞれの活性を備える、請求項１６に記載の方法。
  18. 前記被験者と同じ性別で同じ年齢範囲の被験者において、前記基準値は、前記少なくとも４つのＯＡリスク関連分子のそれぞれの活性の範囲である、請求項１７に記載の方法。
  19. 前記試料は、血液、血清、血漿、滑液または脳脊髄液を含む、請求項１に記載の方法。
  20. 前記方法は、ＯＡ進行の判定方法であり、少なくとも４つのＯＡリスク関連分子の差次的活性を検知する段階は、
    第一および第二時間点で判定された前記被験者の前記少なくとも４つのＯＡリスク関連分子の第一および第二活性を比較する段階であって、前記少なくとも４つのＯＡリスク関連分子の前記第一および第二活性間で、ｐ値≦０．０５である統計上有意な差異は、前記被験者のＯＡの進行を意味する段階を備える、請求項１に記載の方法。
  21. 骨関節炎（ＯＡ）の評価方法であって、前記方法は、被験者の年齢に関連したＯＡリスク関連分子の分類方法であり、
    前記被験者の試料において少なくとも４つのＯＡリスク関連分子の差次的活性を検知する段階であって、前記少なくとも４つのＯＡリスク関連分子が、脳から派生した神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、６Ｃｋｉｎｅ、細胞間接着分子３（ＩＣＡＭ−３）、ＴＧＦβ受容体ＩＩＩ（ＴＧＦ−βＲＩＩＩ）、ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーター受容体（ＵＰＡＲ）、血管細胞接着分子１（ＶＣＡＭ−１）、インターロイキン２（ＩＬ−２）、インターフェロンγにより誘発されるモノカイン（ＭＩＧ）、マトリックスメタロプロテイナーゼ７（ＭＭＰ７）および骨髄性前駆細胞抑制因子１（ＭＰＩＦ−１）を備え、差次的活性を検知する段階は、少なくともＢＤＮＦ、６Ｃｋｉｎｅ、ＩＣＡＭ−３、ＴＧＦ−βＲＩＩＩ、ＵＰＡＲ、ＶＣＡＭ−１、ＩＬ−２、ＭＩＧ、ＭＭＰ７およびＭＰＩＦ−１の上方制御がみられるかどうかを判定する段階と、少なくともＥＧＦの下方制御がみられるかどうかを判定する段階とを備え、前記少なくとも４つのＯＡリスク関連分子の差次的活性の前記存在が、前記被験者の年齢に相関するＯＡリスクの増加を示唆する段階、を備える、方法。
  22. 前記ＯＡリスク関連分子は、ＯＡリスク関連タンパク質を備える、請求項１に記載の方法。
  23. 差次的活性を検知する段階は、前記少なくとも４つのＯＡリスク関連タンパク質量を定量化する段階を備える、請求項２２に記載の方法。
  24. 少なくとも４つのＯＡリスク関連タンパク質の差次的活性がみられるかどうかを判定する段階は、
    前記被験者から得られた試料においける少なくとも４つのＯＡリスク関連タンパク質の量を測定する段階であって、ＯＡリスクがない被験者の前記少なくとも４つのＯＡリスク関連タンパク質のそれぞれの基準値の量に対する、前記試料の前記少なくとも４つのＯＡリスク関連タンパク質の量における差異が、少なくとも４つの血管リスク関連分子のそれらの差次的活性である、請求項２２に記載の方法。
  25. 前記被験者から得られた前記試料の量と前記基準値との間のｐ値≦０．０５である統計上有意な差異が、前記ＯＡリスク関連タンパク質において差次的活性がみられることを示唆する、請求項２４に記載の方法。
  26. 前記被験者から得られた前記試料の量と前記基準値との間の少なくとも４倍の差異は、前記ＯＡリスク関連タンパク質において差次的活性がみられることを示唆する、請求項２４に記載の方法。
  27. 前記タンパク質は前記被験者から得られ、前記タンパク質は、前記タンパク質が前記少なくとも４つのＯＡリスク関連タンパク質を検知する抗体に十分結合できる条件下で培養される、請求項２４に記載の方法。
  28. 記タンパク質が抗体に十分結合できる条件下での前記タンパク質を培養する段階は、
    前記タンパク質と抗体間で特定の結合を可能にするために十分な間、前記タンパク質を前記抗体で培養するステッであって、それによって、タンパク質・抗体複合体を形成する段階と、
    前記タンパク質の活性が、変更されたかどうかを判定するために前記タンパク質・抗体複合体を分析する段階であって、少なくとも４つのＯＡリスク関連タンパク質の差次的活性の存在は、前記被験者のＯＡリスクの増加を示唆する段階と、
    を備える、請求項２７に記載の方法。
  29. 前記タンパク質・抗体複合体を分析する段階は、タンパク質・抗体複合体の量を判定する段階と、前記量を、ＯＡリスクのない被験者の前記少なくとも４つのＯＡリスク関連タンパク質のそれぞれの基準値と比較する段階とを備える、請求項２８に記載の方法。
  30. 前記タンパク質・抗体複合体の分析は、前記複合体を検知する段階と定量化する段階とを備える、請求項２９に記載の方法。
  31. 前記抗体は、アレイ基盤に存在する、請求項２７に記載の方法。
  32. 前記抗体は、特に、表８および１０〜１３に挙げる、少なくとも４つの分子の任意の組み合わせに結合する、請求項２７に記載の方法。
  33. 前記ＯＡリスク関連分子は、前記ＯＡリスク関連核酸分子を備える、請求項１に記載の方法。
  34. 差次的活性を検知する段階は、少なくとも４つのＯＡリスク関連核酸分子の発現を定量化する段階を備える、請求項３３に記載の方法。
  35. 前記核酸分子は、ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡを備える、請求項３３に記載の方法。
  36. 前記核酸分子は、前記被験者から得た試料から単離され、それによって、単離された核酸分子を生成し、前記単離された核酸分子が、前記少なくとも４つのＯＡリスク関連分子を検知するオリゴヌクレオチドと交雑される、請求項３３に記載の方法。
  37. 前記オリゴヌクレオチドと交雑する段階は、
    前記単離された核酸分子とオリゴヌクレオチド間で交雑させるのに十分な時間、前記単離された核酸分子をオリゴヌクレオチドで培養する段階であって、それによって、単離された核酸分子・オリゴヌクレオチド複合体を形成する段階と、
    前記単離された核酸分子の活性が変更されたかどうかを判定するために前記単離された核酸分子・オリゴヌクレオチド複合体を分析する段階であり、少なくとも４つのＯＡリスク関連核酸の差次的活性の存在が、被験者のＯＡリスクの増加を示唆する段階と、
    を備える、請求項３６に記載の方法。
  38. 前記単離された核酸分子・オリゴヌクレオチド複合体を分析する段階は、核酸の交雑量を判定する段階と、前記交雑量を、ＯＡリスクのない被験者からの少なくとも４つのＯＡリスク関連核酸酸の交雑量の基準値と比較する段階を備える、請求項３７に記載の方法。
  39. 前記単離された核酸分子・オリゴヌクレオチド複合体を分析する段階は、前記複合体を検知する段階と、定量化する段階とを備える、請求項３７に記載の方法。
  40. 前記オリゴヌクレオチドは、アレイ基盤に存在する、請求項３６に記載の方法。
  41. 前記オリゴヌクレオチドは、表８および１０〜１３に挙げる、少なくとも４つの分子の任意の組み合わせに相補的である、請求項３６に記載の方法。
  42. 少なくとも４つのＯＡリスク関連分子の差次的活性を検知する段階は、
    前記被験者から得られた前記試料の少なくとも４つのＯＡリスク関連分子のレベルを測定する段階であって、ＯＡリスクのない被験者からの類似試料の前記少なくとも４つのＯＡリスク関連分子のレベルに対して、前記試料における前記少なくとも４つのＯＡリスク関連分子のレベルにおける差異は、少なくとも４つのＯＡリスク関連分子のそれらの差次的活性である段階と、
    を備える、請求項１に記載の方法。
  43. ＯＡリスクを評価する段階は、前記被験者のＯＡを判定する段階と、前記被験者のＯＡ疾病リスクの増加を判定する段階と、前記被験者のＯＡ進行を判定する段階と、または前記被験者のＯＡの重傷度のを判定する段階とを備える、請求項１に記載の方法。
  44. 前記被験者に前記選択された治療法を施す段階をさらに備える、請求項１５に記載の方法。
  45. 前記治療法は、抗炎症剤を備える、請求項４４に記載の方法。
  46. 少なくとも４つのＯＡリスク関連分子の任意の組み合わせの差次的活性を検知する段階は、前記被験者から得られた、核酸分子またはタンパク質を定量的または定性的に分析する段階を備える、請求項１に記載の方法。
  47. 被験者のＯＡリスクの評価方法であって、
    被験者から得られたタンパク質をアレイに適用する段階であって、前記アレイは、表１０〜１３に挙げる３６のＯＡリスク関連タンパク質の全てに相補である抗体を備える段階と、
    前記タンパク質と抗体間で特定の結合を可能にするために十分な時間、前記タンパク質をアレイでインキュベートする段階であって、それによって、タンパク質・抗体複合体を形成する段階と、
    前記試料に存在する前記タンパク質のそれぞれの量を判定するために、前記タンパク質・抗体複合体を分析する段階と、
    前記試料における前記タンパク質のそれぞれの量を基準値と比較する段階であって、前記基準値は、ＯＡリスクが存在しない場合の前記タンパク質のそれぞれの量であり、前記３６のタンパク質のうちの少なくとも４つに対する前記基準値と比較して、前記試料の前記タンパク質量の４倍の差異の存在は、前記被験者のＯＡリスクの増加を示唆する段階と、
    を備える、方法。
  48. 前記タンパク質・抗体複合体を分析する段階は、ローリングサークル増幅を使用して前記タンパク質・抗体複合体を検知する段階を備える、請求項４７に記載の方法。
  49. ＯＡリスクを判定するためのアレイであって、表８および１０〜１３に挙げる前記ＯＡリスク関連分子タンパク質の少なくとも４つを認識する抗体を備える、アレイ。
  50. 前記少なくとも４つのＯＡリスク関連タンパク質は、表８に挙げる前記ＯＡリスク関連タンパク質を備える、請求項４９に記載のアレイ。
  51. 前記少なくとも４つのＯＡリスク関連タンパク質は、表１０、１１、１２または１３に挙げる前記ＯＡリスク関連タンパク質を備える、請求項４９に記載のアレイ。
  52. 被験者のＯＡリスクを評価するためのキットであって、
    請求項４９に記載のアレイと、
    別のパッケージで緩衝液と、
    を備える、キット。
  53. 表８および１０〜１３に挙げるＯＡリスク関連分子の活性を変更する薬剤を同定する方法であって、
    ＯＡを模擬または誘発するのに十分な条件下で細胞を培養する段階と、
    一つ以上の試験薬がＯＡリスク関連分子の活性を変更するのに十分な条件下で、前記一つ以上の試験薬を前記細胞に接触させる段階と、
    前記ＯＡリスク関連分子の差次的活性を検知する段階であって、前記ＯＡリスク関連分子の差次的活性の存在は、前記試験薬が、表８および１０〜１３に挙げるＯＡリスク関連分子の活性を変更することを示唆する段階と、
    を備える、方法。
  54. 表８および１０〜１３に挙げる前記ＯＡリスク関連分子は、ＩＬ−１５またはｓＶＡＰ−１を備える、請求項５３に記載の方法。
  55. 表８および１０〜１３に挙げる前記ＯＡリスク関連分子は、６Ｃｋｉｎｅ、ＢＤＮＦ、ＥＧＦ、Ｅｏｔ２、ＨＣＣ１、ＩＣＡＭ−３、ＩＧＦＢＰ−４、ＩＬ−２、レプチン、ＭＩＧ、ＭＩＰ−１β、ＭＩＰ−１δ、ＭＭＰ７、ＭＰＩＦ−１、プロラクチン、ＴＡＲＣ、ＴＧＦ−β、ＴＧＦ−βＲＩＩＩ、ＵＰＡＲまたはＶＣＡＭ−１を備える、請求項５３に記載の方法。
  56. 表８および１０〜１３に挙げる前記ＯＡリスク関連分子は、核酸配列を備え、前記ＯＡリスク関連分子の差次的活性を検知する段階は、差次的ＲＮＡ発現を検知する段階を備える、請求項５３に記載の方法。
  57. 表８および１０〜１３に挙げる前記ＯＡリスク関連分子は、タンパク質の配列を備え、前記ＯＡリスク関連分子の差次的発現を検知する段階は、タンパク質の存在量を検知する段階を備える、請求項５３に記載の方法。
  58. ＯＡを模擬するのに十分な条件は、低酸素条件下で前記細胞を培養する段階を備える、請求項５３に記載の方法。
  59. 前記細胞は、哺乳動物に存在し、ＯＡを模擬するのに十分な条件下での前記細胞を培養する段階は、前記哺乳動物においてＯＡを誘発する段階、またはＯＡをもつ哺乳動物を提供する段階を備え、前記細胞を１つ以上の試験薬と接触させる段階は、前記１つ以上の試験薬を前記哺乳動物に投与する段階を備える、請求項５３に記載の方法。
  60. 前記方法は、前記細胞が、表８および１０〜１３に挙げる前記ＯＡリスク関連分子の少なくとも４つの任意の組み合わせの差次的活性を有するかどうかを判定する段階を備え、≦０．０５のｐ値である、少なくとも４つのＯＡリスク関連分子のいずれか一つの増加または減少の存在が、前記試験薬が前記ＯＡリスク関連分子の活性を変更することを示唆する、請求項５３に記載の方法。
  61. 前記方法は、前記細胞が、表８および１０〜１３に挙げる前記ＯＡリスク関連分子の全ての差次的発現を有するかどうかを判定する段階を備え、≦０．０５のｐ値である、前記ＯＡリスク関連分子のいずれか１つの増加または減少の存在が、前記試験薬が前記ＯＡリスク関連分子の活性を変更することを示唆する、請求項５３に記載の方法。
  62. ＯＡをもつ哺乳動物の治療方法であって、前記哺乳動物に請求項５３に記載の方法を使用して同定された前記薬剤を投与する段階を備える、治療方法。
  63. 将来、ＯＡの発症リスクが高い哺乳動物の治療方法であって、前記哺乳動物に請求項５３に記載の方法を使用して同定された前記薬剤を投与する段階を備える、治療方法。
  64. 前記ＯＡリスク関連分子の差次的活性を検知する段階は、前記ＯＡリスク関連分子の活性を、ＯＡリスクが存在しない場合の、前記ＯＡリスク関連分子の基準値と比較する段階を備える、請求項５３に記載の方法。
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