JP2008509204A

JP2008509204A - Ｃｄ８０抑制剤としての免疫調整性オキソピラゾロシンノリン類

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Publication number: JP2008509204A
Application number: JP2007525329A
Authority: JP
Inventors: マシューズ，イアン，リチャード
Original assignee: Medigene Ltd
Current assignee: Medigene Ltd
Priority date: 2004-08-09
Filing date: 2004-08-09
Publication date: 2008-03-27
Anticipated expiration: 2024-08-09
Also published as: MX2007001238A; ATE411318T1; DK1776366T3; WO2006016093A1; US7932253B2; US20090062289A1; DE602004017231D1; ES2315695T3; CA2576256A1; PL1776366T3; AU2004322237B2; AU2004322237A1; EP1776366A1; JP4763697B2; CN1997645A; CN1997645B; EP1776366B1; CA2576256C

Abstract

N-(1-アザ-ビシクロ[2.2.2]オクト-3-イル)-4-(6,9-ジフルオロ-3-オキソ-1,3-ジヒドロ-ピラゾロ[4,3-c]シンノリン-2-イル)-ベンズアミドは、CD80 拮抗剤であり、免疫抑制により恩恵を受ける疾患の治療に有用である。

Description

この発明は、免疫抑制CD80拮抗化合物、N-(1-アザビシクロ[2.2.2]オクト-3-イル)-4-(6,9-ジフルオロ-3-オキソ-1,3-ジヒドロピラゾロ[4,3-c]シンノリン-2-イル)-ベンズアミド、その製造法、それを含む組成物、および免疫調節により恩恵を受ける疾患、例えば自己免疫疾患、リュウマチ性関節炎、多発性硬化症、糖尿病、喘息、移植、全身性狼瘡紅班および乾癬の臨床的治療に関するものである。

免疫系は、免疫応答の間および後の種々の調節的作用機作により、リンパ球の活性化と非活性化との間の恒常性を制御する能力を有する。これらの中に、特に免疫応答を抑制および／または阻止する作用機作がある。

したがって、抗原がT-細胞受容体に対するMHC分子で提供されるとき、T-細胞は、さらなる副刺激シグナルの存在下でのみ、適宜活性化される。これらの補助的シグナルの非存在下では、リンパ球の活性化は起こらず、アネルギーもしくは寛容と呼ばれる機能的不活性の状態が誘導されるか、あるいは特異的にアポトーシスによりT-細胞を消滅する。

そのような副刺激シグナルの一つは、特異的な抗原-存在細胞上のCD80とT-細胞上のCD28との相互作用を含み、このシグナルがT-細胞の完全な活性化のために必須であることが示されている(Lenschowら (1996) Annu. Rev. Immunol., 14, 233-258)。それゆえに、このCD80/CD28相互作用を抑制する化合物の提供が望まれている。

われわれの出願中の国際特許出願PCT/GB2004/001008は、式(I)の化合物およびその医薬的または動物薬的に許容される塩、水和物または溶媒和物に関する。

（式中、
R₁ および R₃ は、独立して、H、F、Cl、Br、-NO₂、-CN、F もしくはClで任意に置換されていてもよいC₁-C₆ アルキル、またはFで任意に置換されていてもよいC₁-C₆ アルコキシを表し；
R₄ はカルボン酸基(-COOH)もしくはそのエステル、または -C(=O)NR₆R₇、-NR₇C(=O)R₆、-NR₇C(=O)OR₆、-NHC(=O)NR₇R₆ もしくは-NHC(=S)NR₇R₆ を表し、

ここで、
R₆ はHまたは式-(Alk)_m-Q の基であり、ここで、
m は0 または1であり、
Alk は、任意に置換されていてもよい2価の直鎖もしくは分枝鎖状のC₁-C₁₂アルキレンもしくはC₂-C₁₂アルケニレンまたはC₂-C₁₂アルキニレン基、または2価のC₃-C₁₂ 炭素環式基であり、これらの基は一つ以上の-O-、-S-もしくは-N(R₈)-鎖（ここで、R₈ はH またはC₁-C₄ アルキル、C₃-C₄ アルケニル、C₃-C₄アルキニルもしくはC₃-C₆ シクロアルキルである）を含んでいてもよい、そして
Q はH、-NR₉R₁₀（ここで、R₉およびR₁₀は独立してH、C₁-C₄ アルキル、C₃-C₄アルケニル、C₃-C₄ アルキニル、C₃-C₆ シクロアルキル、エステル基、任意に置換されていてもよい炭素環式もしくは複素環式基を表すか、あるいはR₉およびR₁₀ はそれらが結合している窒素と一緒になって環を形成し、その環は任意に置換されていてもよい）を表し；そして

R₇ は、HまたはC₁-C₆アルキルを表すか、あるいはR₆ およびR₇ はそれらが結合している一つもしくは複数の原子と一緒になって、任意に置換されていてもよい、5、6もしくは7員の単環式の複素環を形成する、

X は結合手または式-(Z)_n-(Alk)- もしくは-(Alk)-(Z)_n- （ここで、Z は-O-、-S-または-NH-であり、Alk はR₆に関連して定義されたとおりであり、n は0または1である）の2価の基を表す）。

本発明は、上記のPCT/GB2004/001008の一般式(I)の範囲に含まれる特定の化合物に関するものである。
本発明は、式(IA)：

の化合物、N-(1-アザビシクロ[2.2.2]オクト-3-イル)-4-(6,9-ジフルオロ-3-オキソ-1,3-ジヒドロ-ピラゾロ[4,3-c]シンノリン-2-イル)ベンズアミド、およびその塩、水和物および溶媒和物を提供する。

ベンズアミドの窒素に結合している1-アザ-ビシクロ[2.2.2]オクト-3-イル環システムの炭素原子は、不斉であり、したがって本発明の化合物は(R)- もしくは(S)-エナンチオマーまたは(RS)-エナンチマー混合物として存在する。構造(IA)および本明細書において、炭素とベンズアミド窒素との間の結合は、不確定な配向で示されている。

どちらのエナンチオマーも（および当然それらの混合物も）CD80 拮抗作用を有するが、(R)エナンチオマーが一般に好ましい。
したがって、本発明は(R)-エナンチオマーならびに(S)-エナンチオマーおよび(RS)-エナンチオマー混合物の形態にある化合物を含む。

化合物(IA)は、(IB) および (IC)：

のような互変異性体の形態でも存在し得る。

本発明は、具体的には式(IA)、(IB)および(IC)のものを含み、N-(1-アザ-ビシクロ[2.2.2]オクト-3-イル)-4-(6,9-ジフルオロ-3-オキソ-1,3-ジヒドロピラゾロ[4,3-c]シンノリン-2-イル)-ベンズアミドのすべての形態の互変異性体を含む。

本発明の化合物は、CD80拮抗剤である。それはCD80 とCD28との間の相互作用、したがってＴ細胞の活性化を阻害し、それにより免疫反応を調節する。

したがって、本発明は、
（i）免疫調節から恩恵を受ける疾患の治療に用いるための、特に免疫抑制のための、N-(1-アザビシクロ[2.2.2]オクト-3-イル)-4-(6,9-ジフルオロ-3-オキソ-1,3- ジヒドロピラゾロ[4,3-c]シンノリン-2-イル)-ベンズアミド、またはその医薬的もしくは動物薬的に許容される塩、水和物もしくは溶媒和物、

(ii) 免疫調節から恩恵を受ける疾患の治療に用いるための、特に免疫抑制のための医薬の製造における、N-(1-アザビシクロ[2.2.2]オクト-3-イル)-4-(6,9-ジフルオロ-3-オキソ-1,3-ジヒドロピラゾロ[4,3-c]シンノリン-2-イル)ベンズアミド、またはその医薬的もしくは動物薬的に許容される塩、水和物もしくは溶媒和物の使用、

(iii) そのような治療を必要とする哺乳動物に、有効量のN-(1-アザビシクロ [2.2.2]オクト-3-イル)-4-(6,9-ジフルオロ-3-オキソ-1,3-ジヒドロピラゾロ[4,3- c]シンノリン-2-イル)ベンズアミド、またはその医薬的もしくは動物薬的に許容される塩、水和物もしくは溶媒和物を投与することを含む、ヒトを含む哺乳動物における免疫調節、特に免疫抑制方法、

(iv) N-(1-アザビシクロ[2.2.2]オクト-3-イル)-4-(6,9-ジフルオロ-3-オキソ- 1,3-ジヒドロピラゾロ[4,3-c]シンノリン-2-イル)-ベンズアミド、またはその医薬的もしくは動物薬的に許容される塩、水和物もしくは溶媒和物を、医薬的もしくは動物薬的に許容される賦形剤もしくは担体とともに含む、医薬もしくは動物薬組成物、
をも含む。

免疫調節により恩恵を受ける疾患は次のものを含む；
急性播種性脳脊髄炎
副腎機能不全
アレルギー性血管炎および肉芽腫症
アミロイド症
強直性脊椎炎
喘息
自己免疫性アジソン病
自己免疫性脱毛症

自己免疫性慢性活動性肝炎
自己免疫性溶血性貧血
自己免疫ニュートロジーナ（Neutrogena）
自己免疫性血小板減少性紫斑病
ベーチェット病
小脳変性
慢性活動性肝炎
慢性炎症脱髄性多発神経根障害

単一クローン性高ガンマグロブリン血症を伴う慢性神経障害
古典的結節性多発動脈炎
先天性副腎過形成
寒冷症
疱疹状皮膚炎
糖尿病
イートン・ランバート筋無力症候群
脳脊髄炎

後天性表皮水泡症
結節性紅斑
グルテン感受性腸症
グッドパスチャー症候群
ギラン・バレー症候群
橋本病
甲状腺機能亢進症
特発性血色素症

特発性膜性糸球体腎炎
中枢神経系の孤立性脈管炎
川崎病
微少変化腎疾患
多種多様な脈管炎
混合結合組織病
伝導遮断を伴う多病巣性運動神経障害
多発性硬化症

重症性筋無力症
眼球クローヌス−筋クローヌス症候群
類天疱瘡
天疱瘡
悪性貧血
多発性筋炎／皮膚筋炎
感染後関節炎
原発性胆管硬化症

乾癬
反応性関節炎
ライター病
網膜症
リウマチ性関節炎
硬化性胆管炎
シェーグレン症候群
スティッフマン症候群

亜急性甲状腺炎
全身性エリテマトーデス
全身性壊死性脈管炎
全身性硬化症（強皮症）
高安動脈炎
側頭動脈炎
閉塞性血栓血管炎
I型およびII型自己免疫性多腺性症候群
潰瘍性大腸炎
ブドウ膜炎
ウェーグナー肉芽腫症。

N-(1-アザビシクロ[2.2.2]オクト-3-イル)-4-(6,9-ジフルオロ-3-オキソ-1,3-ジヒドロピラゾロ[4,3-c]シンノリン-2-イル)-ベンズアミドの塩は、生理学的に許容される酸付加塩および塩基の塩を含む。

好適な酸付加塩は、非毒性塩を形成する酸から形成される。その例は、アセテート、アスパルテート、ベンゾエート、ベシレート、重炭酸塩／炭酸塩、ビサルフェート／サルフェート、ボレート、カムシレート、クエン酸塩、エディシレート、エシレート、ホルメート、フマレート、グルセプテート、グルコネート、グルクロネート、ヘキサフルオロホスフェート、ハイベンゼート、塩酸塩／塩化物、臭化水素酸塩／臭化物、ヨウ化水素酸塩／ヨウ化物、イセチオネート、乳酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メシレート、メチルスルフェート、ナフチレート、2-ナプシレート、ニコチネート、硝酸塩、オロテート、オキサレート、パルミテート、パモエート、リン酸塩／リン酸水素塩／リン酸二水素塩、サッカレート、ステアレート、スクシネート、酒石酸塩、トシレートおよびトリフルオロアセテートを含む。

好適な塩基の塩は、非毒性の塩を形成する塩基から形成される。その例は、アルミニウム、アルギニン、ベンザチン、カルシウム、コリン、ジエチルアミン、ジオラミン、グリシン、リジン、マグネシウム、メグルミン、オラミン、カリウム、ナトリウム、トロメタミンおよび亜鉛の塩を含む。

上記のとおり、本発明は、本発明の化合物を医薬的もしくは動物薬的に許容される賦形剤または担体とともに含む医薬的または動物薬的組成物を含む。

そのような組成物において、個々の患者に対する特定の投与レベルが、用いられる特定の化合物の活性、年齢、体重、全般的な健康状態、性別、食物、投与時期、投与経路、排泄速度、医薬の組合せおよび治療される個々の疾患の原因および重篤度を含む種々のファクターに依存することは理解されるだろう。典型的な一回投与量は、10mg〜1000mgの範囲である。最適の投与レベルおよび投与回数は、臨床試験により決定されるだろう。

本化合物は、その薬物動態的性状に適合したルートにより、投与用に製剤化される。経口投与可能な組成物は、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、ロゼンジであり、あるいは経口、局所、もしくは非経口用の無菌の溶液もしくは懸濁液のような液剤もしくはゲル製剤でもあり得る。

経口用の錠剤およびカプセル剤は、単位投与量の形態であってよく、結合剤、例えばシロップ、アカシア、ゼラチン、ソルビトール、トラガントもしくはポリビニルピロリドン；賦形剤、例えば乳糖、蔗糖、トウモロコシでんぷん、リン酸カルシウム、ソルビトールもしくはグリシン；錠剤用滑沢剤、例えばステアリン酸マグネシウム、タルク、ポリエチレングリコールもしくはシリカ；崩壊剤、例えば馬鈴薯でんぷん、またはラウリル硫酸ナトリウムのような許容される湿潤剤のような通常の添加剤を含み得る。

錠剤は、通常の医薬分野で慣用の周知の方法に従ってコーティングされていてもよい。経口液剤は、例えば水性もしくは油性の懸濁液、溶液、エマルジョン、シロップもしくはエリキシルの形態にあってもよく、あるいは使用前に水またはその他の適当な溶媒で再調製される乾燥製剤として提供されてもよい。

そのような液体製剤は、懸濁化剤、例えばソルビトール、シロップ、メチルセルロース、グルコースシロップ、ゼラチン水素添加食用油脂；乳化剤、例えばレシチン、ソルビタンモノオレエートもしくはアカシア；非水性の媒体(食用油を含み得る)、例えばアーモンド油、分別ココナッツ油、グリセリン、プロピレングリコールもしくはエチルアルコールのような油性エステル；保存剤、例えばメチルもしくはプロピル p-ヒドロキシベンゾエート、もしくはソルビン酸；および所望により通常の着香料もしくは着色剤のような、通常の添加剤を含んでいてもよい。

皮膚への局所投与のために、医薬はクリーム、ローションもしくは軟膏に製剤化されてもよい。医薬用に用いられるクリームおよび軟膏製剤は、例えば英国薬局方のような標準的な医薬の教科書に記載されているように、当技術分野でよく知られた通常の製剤である。

眼への局所投与のために、医薬は好適な無菌の水性もしくは非水性の媒体中の溶液もしくは懸濁液に調製され得る。添加剤、例えばナトリウムメタビサルファイトもしくはジナトリウムエデエートのような緩衝剤；酢酸もしくは硝酸フェニル水銀、塩化ベンザルコニウムもしくはクロルヘキシジンのような抗菌剤および抗真菌剤を含む保存剤、およびハイプロメロースのような増粘剤も含み得る。

活性成分は、無菌媒体中で非経口的に投与することもできる。用いられる媒体および濃度によって、医薬は媒体中に懸濁もしくは溶解され得る。媒体中に局所麻酔剤のようなアジュバント、保存剤および緩衝剤を溶解できれば有利である。
医薬は、鼻腔用もしくは吸入スプレーとして、あるいは粉末として吸入用にも製剤化され得る。

以下の実施例は、一つの便宜的なルートによる、本発明の化合物の製造を記述する。標準的な化学文献によるその他のルート、あるいはPCT / GB2004 / 001008に記載されたルートにより、本発明の化合物を製造することもできる。

(R)-N-(1-アザ-ビシクロ[2.2.2]オクト-3-イル)-4-(6,9-ジフルオロ-3-オキソ-1,3-ジヒドロ-ピラゾロ[4,3-c]シンノリン-2-イル)-ベンズアミドの製造
還流濃縮器、磁石攪拌装置およびガスバブラーを備えた丸底フラスコに4-(6,9-ジフルオロ-3-オキソ-1,3-ジヒドロ-ピラゾロ[4,3-c]シンノリン-2-イル)-安息香酸(300 mg)を充填した。チオニルクロライド(5 ml)を加え、得られた赤色の懸濁液を窒素雰囲気下に加熱還流した。加熱によりガスの発生が観察された。2時間還流後、澄明な赤色溶液を室温まで冷却し、過剰のチオニルクロライドを真空下に除去した。混合物を蒸発乾固して、赤色の粉末を得た。

この粉末をジエチルエーテル(20 ml)に懸濁した。(R)-(+)-3-アミノキヌクリジン２塩酸塩(174 mg)をジエチルエーテル (10 ml)およびエチル-ジイソプロピル-アミン(0.566 g, 0.762 ml) と混合し、酸クロライドの懸濁液に加えた。[注：(S)型の3-アミノキヌクリジン二塩酸塩の使用は、所期の化合物の(S)-エナンチオマーの製造という結果をもたらす]。得られた混合物を室温で窒素雰囲気下に撹拌した。４日間撹拌後、物質のピーク[M+H]+ 451、およびカルボン酸出発物質が検出された。

反応混合物を水(50 ml)でクエンチし、固体を濾取し、水洗した。その固体を炭酸水素ナトリウム飽和溶液とともにトリチュレートし、濾過し、水洗した。この物質を次いでHPLC で精製し、アミドを得た。
MS: MH+ = 451.2
NMR
(d6 DMSO, 500 MHz) 1.74 (m, 1H); 1.92 (m, 2H); 2.14 (m, 1H); 2.22 (m, 1H); 2.54 (s, 1H); 3.24 (m, 4H); 3.70 (t, 1H); 4.32 (m, 1H); 7.42 (dt, 1H); 7.60 (m, 1H); 7.99 (d, 2H); 8.36 (d, 2H); 8.58 (d, 1H); 9.58 (brs, 1H).

この化合物を後記のビアコア（BIAcore）およびホモジニアス時間分解蛍光分析（homogeneous time resolved fluorescence Assay） (TR-Fret)で試験した。結果は次のとおりであった。
ビアコア: K_D = 0.35 nM
TR-Fret: EC₅₀ = 0.82 nM

BIAコア生体分子相互作用分析
ビオチン化されたヒトCD80(hCD80-BT)は、CD28と結合してT-細胞の活性化を引き起こす膜結合受容体分子(CD80)の組み換え可溶形態である。CD80とCD28の間の相互作用は、広範に研究されている(Collinsら、2002)。ビオチン化されたヒトHLA-A2-taxは、コントロール蛋白質として用いられている、膜結合受容体分子の組み換え可溶形態であり、本化合物と相互作用すると考えられていない。

ビアコアS51(商標)システムが、上記の実施例1〜4の化合物のスクリーニングに用いられた。シリーズSセンサーチップCM5がビアコアS51(商標)上にドッキングされた。ストレプトアビジン(Streptavidin)が、標準的なアミンカップリングを用いて、カルボキシメチル表面にカップリングされた。チップ表面は0.2M EDC/0.05M NHSで活性化され、次いでストレプトアビジン(10 mM 酢酸ナトリウムpH 5.0中0.25 mg/ml)の結合、および1M エチレンジアミンでの非占有サイトの飽和が行われた。

ビアコアS51センサーチップは、蛋白質の固定化のための二つの分離したセンサー箇所を有している。hCD80-BTは、凡そ3000 RUの応答が観測されるまで、一つのセンサー箇所のストレプトアビジンでコーティングされた表面に固定化された。化合物の非特異的結合をコントロールする蛋白質は、第二のセンサー箇所に固定された。これらの試験で使用されたコントロール蛋白質は、ビオチン化された可溶形態のヒトHLA蛋白質であった。

化合物の一連の希釈(1000nM〜0.05nM)がランニング緩衝液(10 mM、pH 7.4、150 mM NaCl、0.005% P20; 5% DMSO)中で調製された。
ビアコアS51(商標)を、ランニング緩衝液を用いて30 μl/分の流速で運転した。溶媒効果のデータ補正のために、化合物とDMSO標準溶液が注入された。データは自動的に記録され、ビアコアS51評価ソフトウエアを用いて分析された。

参考文献
Collins AVら、(2002) Immunity 17, 201-210 "The interaction properties of costimulatory molecules revisited"。

ホモジニアス時間分解蛍光分析
本化合物が、CD80-CD28相互作用の阻害剤としての活性を測定するために、無細胞ホモジニアス時間分解蛍光(HT-Fret)分析において試験された。
この分析において、ユーロピウムおよびアロフィコシアニン(APC)が、CD28 およびCD80と間接的に結合(抗体リンカーを介して)して複合体を形成し、ユーロピウムとAPCが接近してシグナルを発生する。この複合体は、次の６つの蛋白質：蛍光標識1、リンカー抗体1、CD28融合蛋白質、CD80融合蛋白質、リンカー抗体2および蛍光標識2を含む。以下の表にこれらの試薬をより詳細に記載する。

複合体の形成により、ユーロピウムとAPCが接近し、シグナルが発生する。
非特異的相互作用は、CD80マウスFabフラグメント融合蛋白質の代わりに、マウスFabフラグメント(C215)(1.9μg/ml)を用いて、測定された。
この分析は、最終容量30μlでのブラック384ウェルプレート中で行われた。分析緩衝液：50mM Tris-HCl、150mM NaCl pH7.8、使用直前に添加された0.1% BSA (w/v)を含む。

化合物を100μM〜1.7nMの範囲の一連の濃度で、上記の試薬に加えた。反応物を室温で4時間インキュベートした。Wallac Victor 1420 Multilabelカウンターを用いて、2重測定を行った。
第1測定：励起340nm、発光665nm、遅延50μs、ウインドー時間200μs。
第2測定：励起340nm、発光615nm、遅延50μs、ウインドー時間200μs。
計数は、蛍光クロスオーバー、クエンチングおよびバックグラウンドに対して、自動的に補正された。

Claims

N-(1-アザ-ビシクロ[2.2.2]オクト-3-イル)-4-(6,9-ジフルオロ-3-オキソ-1,3-ジヒドロ-ピラゾロ[4,3-c]シンノリン-2-イル)ベンズアミド、またはその塩、水和物もしくは溶媒和物。
(R)-エナンチオマーの形態にある請求項１に記載の化合物。
請求項１または２に記載の化合物を医薬的もしくは動物薬的に許容される賦形剤もしくは担体とともに含む、医薬もしくは動物薬組成物。
免疫調節により恩恵を受ける疾患の治療用の請求項１または２に記載の化合物。
免疫調節により恩恵を受ける疾患の治療用医薬の製造における、請求項１または２に記載の化合物の使用。
請求項１または２に記載の化合物の免疫調節有効量を、そのような治療を必要とする哺乳動物に投与することを含む、ヒトを含む哺乳動物における免疫調節方法。
免疫調節が免疫抑制である、請求項４に記載の使用、請求項５に記載の使用または請求項６に記載の方法のための化合物。
疾患が、自己免疫疾患、リュウマチ性関節炎、多発性硬化症、糖尿病、喘息、移植、全身性狼瘡紅班または乾癬である、請求項４に記載の使用、請求項５に記載の使用又は請求項６に記載の方法のための化合物。