CN1997645B

CN1997645B - 免疫调节作为cd80抑制剂的氧代吡唑并噌啉类

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Publication number: CN1997645B
Application number: CN2004800437569A
Authority: CN
Inventors: I·R·马修斯
Original assignee: Medigene AG
Current assignee: Medigene AG
Priority date: 2004-08-09
Filing date: 2004-08-09
Publication date: 2012-05-23
Anticipated expiration: 2024-08-09
Also published as: US7932253B2; MX2007001238A; JP2008509204A; DK1776366T3; DE602004017231D1; US20090062289A1; CN1997645A; WO2006016093A1; JP4763697B2; CA2576256A1; ATE411318T1; EP1776366B1; CA2576256C; PL1776366T3; EP1776366A1; ES2315695T3; AU2004322237A1; AU2004322237B2

Abstract

N-(1-氮杂-二环[2.2.2]辛-3-基)-4-(6，9-二氟-3-氧代-1，3-二氢-吡唑并[4，3-c]噌啉-2-基)-苯甲酰胺是CD80拮抗剂，可用于治疗能受益于免疫抑制的疾病。

Description

免疫调节作为CD80抑制剂的氧代吡唑并噌啉类

本发明涉及免疫抑制CD80拮抗剂化合物N-(1-氮杂-二环[2.2.2]辛-3-基)-4-(6，9-二氟-3-氧代-1，3-二氢-吡唑并[4，3-c]噌啉-2-基)-苯甲酰胺，涉及其制备方法，涉及含有其的组合物、并涉及其在受益于免疫调节的医疗症状的临床治疗中的应用，所述症状例如自身免疫性疾病、类风湿性关节炎、多发性硬化、糖尿病、哮喘、移植、全身性红斑狼疮(systemic lupus erythematosis)和银屑病。

发明背景

免疫系统拥有在免疫应答之中和之后通过各种调节机制控制在淋巴细胞的激活和失活之间的体内稳态的能力。特异地抑制和/或关闭免疫应答是其中的一种机制。那么，当MHC分子将抗原呈递到T-细胞受体时，只有存在辅助刺激信号下才能合适地激活T-细胞。不存在这些辅助信号时，淋巴细胞不会激活，同时既会诱导称为无反应性或耐受性的功能性失活状态，T-细胞也会由程序性细胞凋亡而特异性地消除。

一种这样的辅助刺激信号参与在特化的呈抗原细胞上的CD80与在T-细胞上的CD28之间的相互作用，该信号已证实对全T-细胞激活是必需的(Lenschow等，(1996)Annu.Rev.Immunol.，14，233-258)。因此，需要提供可抑制这种CD80/CD28相互作用的化合物。

我们的待批国际专利申请PCT/GB2004/001008涉及式(I)的化合物以及其药学或兽医学上可接受的盐、水合物或溶剂合物：

式中

R₁和R₃独立代表H、F、Cl、Br、-NO₂、-CN、任选被F或Cl取代的C₁-C₆烷基、或任选被F取代的C₁-C₆烷氧基；

R₄代表羧酸基团(-COOH)或其酯，或-C(＝O)NR₆R₇、-NR₇C(＝O)R₆、-NR₇C(＝O)OR₆、-NHC(＝O)NR₇R₆或-NHC(＝S)NR₇R₆，其中

R₆代表H，或结构式为-(Alk)_m-Q的基团，其中

m是0或1，

Alk是任选取代的二价直链或支链C₁-C₁₂亚烷基、或C₂-C₁₂亚烯基、或C₂-C₁₂亚炔基或二价C₃-C₁₂碳环基，任何这些基团可含有一个或多个-O-、-S-或-N(R₈)-键，其中R₈代表H或C₁-C₄烷基、C₃-C₄链烯基、C₃-C₄炔基或C₃-C₆环烷基；和

Q代表H；-NR₉R₁₀，其中R₉和R₁₀独立地代表H、C₁-C₄烷基、C₃-C₄链烯基、C₃-C₄炔基、C₃-C₆环烷基、酯基、任选取代的碳环或杂环基，或当R₉和R₁₀与其所连接的N相连时形成一个可任选取代的环；和

R₇代表H或C₁-C₆烷基；或当R₆和R₇与它们所连接的一个或几个原子组合起来时形成一可任选取代的有5、6或7个环原子的单环杂环；和

X代表键或结构式为-(Z)_n-(Alk)-或-(Alk)-(Z)_n-的二价基团，其中Z代表-O-、-S-或-NH-，Alk见与R₆有关的定义，n是0或1。

发明描述

本发明涉及具有上述PCT/GB2004/001008的通式(I)的具体化合物，本发明提供了式(IA)的化合物N-(1-氮杂-二环[2.2.2]辛-3-基)-4-(6，9-二氟-3-氧代-1，3-二氢-吡唑并[4，3-c]噌啉-2-基)-苯甲酰胺，及其盐、水合物和溶剂合物。

连接到苯甲酰氨基的氮上的1-氮杂-二环[2.2.2]辛-3-基环系统的碳原子是不对称的，因此本发明的化合物以(R)-对映体或(S)-对映体或以(RS)-对映体混合物存在。在结构(IA)和文中其它地方，碳和苯甲酰氨基的氮之间的键没有规定的方向。这两种对映体(当然还有混合物)都具有CD80拮抗剂活性，但(R)对映体目前是优选的。因此，本发明包括呈(R)-对映体以及(S)-对映体和(RS)-对映体混合物形式的化合物。

化合物(IA)可以互变体形式存在，如(IB)和(IC)：

本发明包括N-(1-氮杂-二环[2.2.2]辛-3-基)-4-(6，9-二氟-3-氧代-1，3-二氢-吡唑并[4，3-c]噌啉-2-基)-苯甲酰胺的所有互变体形式，尤其包括式(IA)、(IB)和(IC)的那些。

本发明的化合物是CD80拮抗剂。它们抑制CD80和CD28之间相互作用从而抑制了T细胞激活，因此调节了免疫应答。

因此本发明也包括：

(i)N-(1-氮杂-二环[2.2.2]辛-3-基)-4-(6，9-二氟-3-氧代-1，3-二氢-吡唑并[4，3-c]噌啉-2-基)-苯甲酰胺，或其药学或兽医学上可接受的盐、水合物或溶剂合物，用于治疗受益于免疫调节、尤其受益于免疫抑制的病症。

(ii)N-(1-氮杂-二环[2.2.2]辛-3-基)-4-(6，9-二氟-3-氧代-1，3--二氢-吡唑并[4，3-c]噌啉-2-基)-苯甲酰胺或其药学或兽医学上可接受的盐、水合物或溶剂合物在制造用于治疗受益于免疫调节、尤其受益于免疫抑制的病症的药物中的应用。

(iii)一种在包括人类在内的哺乳动物中进行免疫调节的方法，包括给予需要这种治疗的哺乳动物免疫调节有效剂量的N-(1-氮杂-二环[2.2.2]辛-3-基)-4-(6，9-二氟-3-氧代-1，3-二氢-吡唑并[4，3-c]噌啉-2-基)-苯甲酰胺或其药学或兽医学上可接受的盐、水合物或溶剂合物。

(iv)一种药学或兽医学组合物，所述组合物含有N-(1-氮杂-二环[2.2.2]辛-3-基)-4-(6，9-二氟-3-氧代-1，3-二氢-吡唑并[4，3-c]噌啉-2-基)-苯甲酰胺或其药学或兽医学上可接受的盐、水合物或溶剂合物以及药学或兽医学上可接受的赋形剂或载体。

受益于免疫调节的症状包括：

急性弥散性脑脊髓炎

肾上腺机能不全

变应性脉管炎和肉芽肿病

淀粉样变性病(Amylodosis)

强直性脊柱炎

哮喘

自身免疫阿狄森病

自身免疫脱发

自身免疫慢性活动型肝炎

自身免疫溶血性贫血

自身免疫露得清(Neutrogena)

自身免疫血小板减少紫癜(thrombocytopenic purpura)

贝切特氏病

小脑变性

慢性活动型肝炎

慢性炎性脱髓鞘多神经根神经病

慢性单克隆丙种蛋白神经病

典型结节性动脉周围炎

先天性肾上腺增生

寒冰病

杜林病

糖尿病

伊顿-兰伯特肌无力综合症

脑脊髓炎

获得性大疱性表皮松解

结节红斑

谷蛋白敏感性肠道病

古德帕斯彻氏综合症

传染性神经元炎

淋巴瘤样甲状腺炎

甲状腺机能亢进

原发性血色素沉着症

膜性肾小球肾炎

分离中枢神经系统脉管炎(Isolated vasculitis of the central nervous system)

川崎病

最小变化肾病(Minimal change renal disease)

混杂性脉管炎(Miscellaneous vasculitides)

混合结缔组织病

传导阻滞的多病灶运动神经病(Multifocal motor neuropathy with conduction block)

多发性硬化

重症肌无力

视性眼阵挛/肌阵挛综合症

类天疱疮

天疱疮

恶性贫血

多肌炎/皮肌炎

传染后关节炎(Post-infective arthritides)

原发性肝硬化

银屑病

反应性关节炎(Reactive arthritides)

莱特氏病

视网膜病

类风湿性关节炎

硬化性胆管炎

Sjogren综合症

全身强直综合症

亚急性甲状腺炎

全身性红斑狼疮

全身性坏死性脉管炎(Systemic necrotizing vasculitides)

系统性硬皮病(硬皮病)

大动脉炎

颞动脉炎

血栓闭塞性血管炎

I型和II型自身免疫多腺综合症

溃疡性结肠炎

眼色素层炎

韦格纳肉芽肿病

N-(1-氮杂-二环[2.2.2]辛-3-基)-4-(6，9-二氟-3-氧代-1，3-二氢-吡唑并[4，3-c]噌啉-2-基)-苯甲酰胺的盐包括生理学可接受的酸加成盐和碱盐(base salt)。合适的酸加成盐由可形成无毒盐的酸制得。例子包括乙酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、碳酸氢盐/碳酸盐、硫酸氢盐/硫酸盐、硼酸盐、右旋樟脑磺酸盐、柠檬酸盐、乙二苯磺酸盐、乙苯磺酸盐(esylate)、甲酸盐、延胡索酸盐、葡庚糖酸盐、葡糖酸盐、葡糖醛酸盐、六氟磷酸盐、羟苯酰苯酸盐、盐酸盐/氯化物、氢溴酸盐/溴化物、氢碘酸/碘化物、羟乙磺酸盐、乳酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、甲基硫酸盐、萘酸盐(naphthylate)、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、乳清酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、双羟萘酸盐、磷酸盐/磷酸氢盐/磷酸二氢盐、糖二酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、甲苯磺酸盐和三氟乙酸盐。合适的碱盐由可形成无毒性的盐的碱制得。其例子包括铝盐、精氨酸、双苄基乙撑二胺、钙盐、胆碱、二乙胺、二乙醇胺、甘氨酸、赖氨酸、镁盐、甲基葡胺、乙醇胺、钾盐、钠盐、缓血酸胺和锌盐。

如上所述，本发明包括含有本发明的化合物及药学或兽医学上可接受的赋形剂或载体的药学或兽医学的组合物。在这样的组合物中，要了解任何特定病人的具体剂量水平取决于一系列因素，包括：所用的具体化合物的活性，年龄，体重，总的健康状况，性别，饮食情况，给药时间，给药途径，排出率，药物的组合情况和要接受治疗的特定疾病的起因和严重性。典型的单剂量范围为10mg-1000mg。最优化的剂量水平和给药频率通过临床试验确定。

所述化合物可以任何与其药代动力学性质一致的途径制备给药。口服给药的组合物的形式可以是药片、胶囊、粉末、颗粒、锭剂、液体或凝胶制剂，例如口服的、局部的或无菌非肠道的溶液或悬浮液。用于口服的药片和胶囊可以是单剂形式，并且可以含有常规的赋形剂，例如粘合剂(例如糖浆、阿拉伯胶、明胶、山梨醇、黄蓍胶或聚乙烯吡咯烷酮)；填充剂(例如乳糖、糖、玉米淀粉、磷酸钙、山梨醇或甘油)；压片润滑剂(例如硬脂酸镁、滑石粉、聚乙二醇或二氧化硅)；崩解剂(例如马铃薯淀粉)或可接受的润湿剂(例如月桂基硫酸钠)。药片可以用常规药学实践中公知的方法包衣。口服的液体制剂的形式可以是，例如水或油的悬浮液、溶液、乳剂、糖浆或酏剂，或是制成干粉在使用前用水或其它的合适载体重新配制。这样的液体制剂可含有常规的添加剂，例如悬浮剂(例如山梨醇、糖浆、甲基纤维素、葡萄糖糖浆、明胶氢化的可食用油脂)；乳化剂(例如卵磷脂、失水山梨糖醇单油酸酯或阿拉伯胶)；非水载体(可以含有可食用的油)例如杏仁油、分馏的椰油、油酯(例如甘油、丙二醇或乙醇)；防腐剂(例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯或山梨酸)，并且如果需要可以加入常规的调味剂或染色剂。

为局部应用于皮肤，该药物可以制成霜剂、洗剂或软膏剂。用于药物的霜剂或软膏剂是本领域公知的常规制剂，例如描述于药学标准教科书(例如英国药典)中的。

为局部应用于眼睛，该药物可在合适的无菌水或非水载体中配制成溶液或悬浮液。其中也可以包括添加剂，例如缓冲液，例如偏亚硫酸氢钠或依地酸二钠(disodiumedeate)；防腐剂，包括杀菌剂和杀真菌剂(例如苯基乙酸汞或苯基硝酸汞、氯化苄烷铵或双氯苯双胍己烷)；以及增稠剂，例如羟丙甲纤维素(hypromellose)。

活性成份也可在无菌介质中以肠胃外给药。取决于载体和所使用的浓度，药物既可悬浮又可溶解在载体中。有利的是，佐剂如局部麻醉剂、防腐剂和缓冲剂也可溶解在载体中。

本发明的具体上述方式描述于以下非限制性实施例中：

药物也可被制成作为鼻或吸入喷雾给药，或作为粉末吸入。

以下实施例描述了通过一种常规途径制备本发明的化合物。采用标准文献方法以及通过PCT/GB2004/001008中描述的途径也可通过其它途径得到该化合物。

实施例

(R)-N-(1-氮杂-二环[2.2.2]辛-3-基)-4-(6，9-二氟-3-氧代-1，3-二氢-吡唑并[4，3-c]噌啉-2-基)-苯甲酰胺的制备

在装有回流冷凝器、磁力搅拌棒和鼓泡器的圆底烧瓶中加入4-(6，9-二氟-3-氧代-1，3-二氢-吡唑并[4，3-c]噌啉-2-基)-苯甲酸(300mg)。加入亚硫酰氯(5ml)并将所得红色悬浮液在氮气下加热回流。加热时观察到有气体生成。回流2小时后将澄清的红色溶液冷却至室温并在真空下除去过量亚硫酰氯。将混合物蒸发至干以得到红色粉末。

将该粉末悬浮液二乙醚(20ml)。将(R)-(+)-3-氨基奎宁环二盐酸化物(174mg)与二乙醚(10ml)和乙基-二异丙基-胺(0.566g，0.762ml)混合并加入酰氯悬浮液中。[注意：使用3-氨基奎宁环二盐酸化物的(S)形式导致制得所需化合物的(S)-对映体]。将所得混合物在氮气下室温搅拌。搅拌4天后可检测出产物峰[M+H]+451以及羧酸原料。

用水(50ml)淬灭反应混合物，固体通过过滤收集并用水洗涤。将该固体与饱和碳酸氢钠溶液一起研磨，过滤并用水洗涤。然后通过HPLC纯化产物得到酰胺。

MS：MH+＝451.2

NMR

(d6DMSO，500MHz)1.74(m，1H)；1.92(m，2H)；2.14(m，1H)；2.22(m，1H)；2.54(s，1H)；3.24(m，4H)；3.70(t，1H)；4.32(m，1H)；7.42(dt，1H)；7.60(m，1H)；7.99(d，2H)；8.36(d，2H)；8.58(d，1H)；9.58(brs，1H)。

通过下述BIAcore和均相时间分辨荧光(TR-Fret)试验测试该化合物。结果如下：

BIAcore：K_D＝0.35nM

TR-Fret：EC₅₀＝0.82nM

BIAcore生物分子相互作用试验

生物素化的人CD80(hCD80-BT)是膜结合受体分子的重组可溶性形式，它与CD28结合启动T细胞激活。人们广泛地研究了CD80与CD28之间的相互作用(Collins等著，2002)。生物素化的人HLA-A2-tax是膜结合受体分子的重组可溶性形式，用在本实施例中作为对照蛋白，并且不期望它与本发明化合物相互作用。

BIAcore S51^TM系统用于筛选上述实施例1-4的化合物。一系列S传感器芯片CM5接在BIAcore S51^TM上。使用标准的胺偶合方法将抗生物素蛋白链菌素偶合到羧甲基表面上。芯片表面用0.2M EDC/0.05M NHS激活，接着与抗生物素蛋白链菌素(0.25mg/ml，在10mM乙酸钠中，pH5.0)结合，未占据的位点用1M乙二胺饱和。

BIAcore S51传感器芯片有两个分开的、用于固定蛋白质的传感器位点。hCD80-BT固定在抗生物素蛋白链菌素覆盖的一个传感器位点的表面直至观察到的应答为约3000RU。与化合物非特异结合的对照蛋白固定在第二个传感器位点上。用于这些试验的对照蛋白是生物素化的、人类HLA蛋白的可溶性形式。

在运行缓冲液(10mM，pH7.4，150mM NaCl，0.005％P20；5％DMSO)中配制一系列化合物的稀释溶液(1000nM-0.05nM)。

BIAcore S51^TM使用运行缓冲液以流速30μl/分钟运行。注射入化合物和用于校正溶剂效应影响的数据的DMSO标准溶液。自动记录数据并使用BIAcore S51评估软件分析。

参考文献

Collins AV等，(2002)Immunity 17，201-210“再访问的辅刺激分子的相互作用特性”(The interaction property of costimulatory molecules revisited)

均相时间分辨荧光试验

上述的实施例进行无细胞的均相时间分辨荧光(HT-Fret)试验测试来确定其作为CD80-CD28相互作用的抑制剂的活性。

在试验中，铕和别藻蓝蛋白(APC)与CD28和CD80间接相连(通过抗体接头)形成复合物，该复合物使铕和APC靠近来产生信号。该复合物包括以下6种蛋白：荧光标记1，接头抗体1，CD28融合蛋白，CD80融合蛋白，接头抗体2和荧光标记2。

下表更详细地描述了这些试剂。

荧光标记1	用铕标记的抗兔IgG(1μg/ml)
		接头抗体1	特异针对小鼠Fc片段的兔IgG(3μg/ml)
CD28融合蛋白	CD28-小鼠的Fc片段融合蛋白(0.48μg/ml)
		CD80融合蛋白	CD80-小鼠的Fab片段(C215)融合蛋白(1.9μg/ml)
接头抗体2	GαMκ-生物素：特异针对小鼠κ链的生物素化的山羊IgG(2μg/ml)
		荧光标记2	SA-APC：抗生物素蛋白链菌素标记的别藻蓝蛋白(8μg/ml)

在复合物的形成中，铕和APC靠近并产生信号。

通过用小鼠Fab片段(C215)替代CD80-小鼠的Fab片段融合蛋白(1.9μg/ml)来测量非特异性相互作用。试验在黑色384孔板中进行，终体积为30μl。试验缓冲液为：50mM的Tris-HCl，150mM的NaCl，pH7.8，含有在使用前加入的0.1％的BSA(w/v)。

浓度为100μM-1.7nM的化合物加入上述试剂。反应于室温孵育4小时。使用Wallac Victor 1420多功能计数仪进行双重测量。第一次测量：激发340nm，发射665nm，滞后50μs，窗口时间200μs。第二次测量：激发340nm，发射615nm，滞后50μs，窗口时间200μs。计数值做荧光交叉、终止和背景的自动校正。

Claims

1.N-(1-氮杂-二环[2.2.2]辛-3-基)-4-(6，9-二氟-3-氧代-1，3-二氢-吡唑并[4，3-c]噌啉-2-基)-苯甲酰胺或其盐。

2.如权利要求1所述的化合物，其为(R)-对映体形式。

3.一种药学或兽医学组合物，所述组合物含有权利要求1或权利要求2所述的化合物以及药学或兽医学上可接受的赋形剂或载体。

4.权利要求1或权利要求2所述的化合物在制造用于治疗受益于免疫调节的病症的药物中的用途。

5.权利要求1或权利要求2所述的化合物在制备用于哺乳动物免疫调节的药物中的用途。

6.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述哺乳动物是人类。

7.如权利要求4所述的用途或如权利要求5或6所述的用途，其中，所述免疫调节是免疫抑制。

8.如权利要求4所述的用途或如权利要求5或6所述的用途，其中，所述病症是自身免疫性疾病、糖尿病、哮喘或移植。

9.如权利要求4所述的用途或如权利要求5或6所述的用途，其中，所述病症是类风湿性关节炎、多发性硬化、全身性红斑狼疮或银屑病。