JP2008508854A - エリスロポイエチンタンパク質変異体 - Google Patents

エリスロポイエチンタンパク質変異体 Download PDF

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Abstract

エリスロポイエチン（ＥＰＯ）変異体、特に安定性改善を有する変異体、それらの製造、ならびに例えば治療における使用。

Description

本発明は、エリスロポイエチン変異体、特に安定性改善を有する変異体に関する。本発明はさらに、変異体の製造、ならびに例えば治療における変異体の使用に関する。
エリスロポイエチン（ＥＰＯ）は、造血成長因子ファミリーの一成員であり、ホルモンとして振舞う。それは赤色血液細胞（赤血球）産生（赤血球生成）の調節に関与し、身体の赤血球量を最適レベルに保持する。ＥＰＯ産生は、酸素感受性である転写因子により媒介される腎動脈循環中の酸素含量低減により刺激される。ＥＰＯは、腎臓の尿細管周囲毛細管内皮の細胞により主に産生される。分泌ＥＰＯは、骨髄赤血球前駆細胞の表面でＥＰＯ受容体と結合して、それらの迅速複製および機能性赤血球への成熟を生じる。この刺激は、赤血球数の急速上昇およびその結果としてのヘマトクリット（血液中の赤血球％）の上昇を生じる（D’Andrea et al Cell 1989 57: 277-285；Lodish et al Cold Spring Harb Symp Quant Biol 1995 60: 93-104）。
ヒトＥＰＯは先ず、Lin等（Proc Natl Acad Sci USA 1985 82: 7582-4）およびJacobs等（Nature 313: 806-810 1985）によりクローン化され、アミノ酸配列が報告された。
ヒトＥＰＯは、約30400ダルトンの分子量を有する酸性糖タンパク質である。それは、4つのシステイン残基（位置７、２９、３３および１６１に）を含有する不変165アミノ酸単一ポリペプチド鎖からなり、これは内部ジスルフィド結合を形成する（Lai et al. J Biol Chem 1986 261: 3116-3121; Recny et al J Biol Chem 1987 262: 17156-17163）。システイン７および１６１間のジスルフィド架橋は、生物学的活性に不可欠であることが既知である。ＥＰＯの炭水化物部分は、Ａｓｎ２４、３８および８３の3つのＮ結合糖鎖、ならびにＳｅｒ１２６の1つのＯ結合糖から成る（Browne JK et al Cold Spring Harb Symp Quant Biol 1986 51: 693-702；Egrie JC et al Immunbiology 1986 172: 213-224）。
ヒトＥＰＯの構造が報告されている（Cheetham et al 1988 Nat Struct Biol 5: 861-866；Syed et al 1998 Nature 395: 511-516）。ヒトＥＰＯは、造血成長因子ファミリーの成員の典型である４本へリックスバンドルである。不変アミノ酸配列と対照して、炭水化物構造は可変性であり、ミクロ不均一性と呼ばれる特徴である。炭水化物部分における差異は、分枝パターン、複雑性サイズおよび電荷に関して、ＥＰＯの薬物動態および薬力学に及ぼす顕著な作用を有する。異なるグリコシル化パターンの作用は、十分に研究されている（Darling et al 2002 Biochemistry 41: 14524-14531; Storring et al 1998 Br J Haematol 100: 79-89; Halstenson et al 1991 Clin Pharmacol Ther 50: 702-712; Takeuchi et al 1990 J Biol Chem 265: 12127-12130）。
以下のＥＰＯは、組換えヒトＥＰＯ（ｒｈＥＰＯ）と同一のアミノ酸配列を有し、産生およびグリコシル化の方法における変異は、これらの生成物を区別する。エポエチンアルファ（ゲノムＤＮＡ）およびエポエチンベータ（ｃＤＮＡ）は、米国特許第4,703,008号および第5,955,422号に記載されている。これらはヒトＥＰＯと同一アミノ酸配列を有し、そしてチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞中で産生される。エポエチンアルファは、商標名プロクリット（Ortho Biotech）、エプレックス（Johnson & Johnson）、エポギン（Chugai）またはエポゲン（Amgen）下で入手可能である。エポエチンベータは、商標名ネオレコルモンまたはレコルモン（Hoffmann-La Roche）下で入手可能である。それは、腎疾患に関連した貧血の治療のために、Genetics Instituteにより開発された。米国特許第号に記載されたエポエチンオメガはヒトＥＰＯと同一アミノ酸配列を有し、そして幼仔ハムスター腎細胞（ＢＨＫ‐２１）中で産生される。エポエチンオメガは、商標名エポマックス（Elanex）下で入手可能である。
ダルベポエチンアルファ（新規の赤血球生成刺激タンパク質、ＮＥＳＰ）はAmgenにより開発されたものであり、そして商標名ARANESP（Macdougall IC, Kidney Int Suppl. 2002 May; (80): 55-61）下で入手可能である。それは、5つのＮ結合炭水化物鎖（ｒｈＥＰＯより2つ多い）を含有するよう設計された。Aranespのアミノ酸配列は、5つの置換（Ａｌａ３０Ａｓｎ、Ｈｉｓ３２Ｔｈｒ、Ｐｒｏ８７Ｖａｌ、Ｔｒｐ８８Ａｓｎ、Ｐｒｏ９０Ｔｈｒ）で、ｒｈＥＰＯのものとは異なり、したがって位置３０および８８のアスパラギン残基での付加的オリゴ糖結合を可能にする。その炭水化物含量増大のため、Aranespは、より高い分子量（37,100（30,400ダルトンと比較して））、シアル酸含量（22（14個のシアル酸残基と比較））および負電荷増大の結果として、ｒｈＥＰＯと異なる。Aranespの炭水化物含量増大は、その異なる生化学的および生物学的特性を、特に静脈内（ＩＶ）または皮下（ＳＣ）経路により投与される場合、他の現存するエリスロポイエチンより3倍長い循環半減期を説明する。しかしながら相対的ＥＰＯ受容体結合親和性は、炭水化物含量と逆相関し、Aranespは、ｒｈＥＰＯより4.3倍低いＥＰＯ受容体に関する相対的親和性を示した。ＳＣ投与後、Aranespの吸収は遅くそして速度限定性であり、血清レベルは平均54時間で最大に達する。最大濃度に達する時間は、おそらくはAranespの分子サイズ増大のため、ｒｈＥＰＯに関して報告された時間より長い。しかしながら一般に、循環半減期延長は、その低頻度投与のために、プロクリットより有意の臨床的利点をAranespに与える。しかしながら、その受容体に関するAranespの親和性に対して考え得る改善を探求するための、あるいはＳＣ投与後の吸収率を検討するための機会が存在し得る。
Transkaryotic Therapies（Aventis Pharmaと一緒に）は、エリスロポイエチン刺激薬ディネポ（エポエチンデルタ）を開発中である。ディネポは、腎不全を有する患者における貧血の治療のための、ヒト細胞培養中で産生される遺伝子活性化ヒトエリスロポイエチンである。
Rocheは、化学療法に関連した貧血の考え得る治療のための、第二世代エリスロポイエチンである連続エリスロポイエチン受容体活性剤（ＣＥＲＡ）であるＲ‐７４４を開発中である。ＣＥＲＡは、この作用物質の半減期を延長する約30 kDaの単一メトキシポリエチレングリコールポリマーを含有する。
ＥＰＯ構造活性関係（Elliot et al 1997 Blood 89: 493-502; Elliot et al 1996 Blood 87: 2702-2713; Syed et al 1998 Nature 395: 511-516）を、あるいはグリコシル化の作用（O’Narhi et al 2001 Protein Engineering 14: 135-140; Bill et al 1995 Biochimica et Biophysica Acta 1261: 35-43; Yamaguchi et al 1991 J Biol Chem 266: 20434-20439）を研究するために、多数のＥＰＯ個別点突然変異体が作製されてきた。公開突然変異と本出願で開示されるものとの間に、有意の重複は認められない。アミノ酸突然変異が重複する4つの突然変異（Ｌｙｓ２０Ａｒｇ、Ｔｈｒ２７Ａｌａ、Ｖａｌ６１ＡｌａおよびＴｈｒ１０７Ａｌａ）は、ＥＰＯフォールディングまたは生物活性に影響を及ぼさないことが以前に報告されており（Elliot et al 1997 Blood 89: 493-502）、そしてこれらの位置で観察されるアミノ酸変異は、今までのところ、本発明に開示された変異と有意に重複しない。
ＥＰＯは主要生物薬学的製品であり、世界的売上高は30億米ドルを超える。それは、慢性腎不全、癌化学療法、ＨＩＶ感染、小児科学的用法、未熟児に関連した貧血を治療するために、そして選択的非心臓性および非血管性手術を受けている貧血患者における輸血の必要性を低減するために、主に用いられる。
本発明は、安定性改善を示すＥＰＯ変異体を提供する。
安定性は一般に、そのフォールディング化および活性状態で残存する分子の傾向と定義され得る。天然分子は通常は、それらの代謝、そしてしばしばそれらの迅速代謝が身体中の作用のそれらの内在的メカニズムの重要な特質である場合、限定安定性を有する。
通常は、そのフォールディング化およびネイティブ構造中の安定タンパク質は、プロテアーゼまたはその他のメカニズムにより分解され得る。それは、タンパク質が通常は身体中で排除される安定状態からの2つのキーオフ経路のためである。これら2つは、アンフォールディングおよび凝集である。それらは通常は関連づけられる。アンフォールディングは、フォールディング化活性分子を低フォールディング化状態に戻す経路である。凝集は、分子が非可逆的に非活性状態に変えるようなミスフォールディングの結果である。アンフォールディングおよび凝集はともに、タンパク質分解性またはその他の消化に対するタンパク質の感受性を有意に増大する。本発明において、結果的に生じる存在物がより安定であるよう、ＥＰＯのフォールディングおよびアンフォールディングをわれわれは修飾した。タンパク質の熱力学的安定性増大の進展は以前に実証されている（Jermutus et al, 2001 Proc Natl Acad Sci 98: 75-80）が、しかしこれは、このプロセスからのin vitro進展およびその結果生じるアミノ酸変化は生物療法の実在する利益を生じ得る、という最初の記載である。
本発明の一態様によれば、野生型ヒトＥＰＯと比較して、安定性改善を示すＥＰＯ変異体が提供される。
本発明のさらなる態様および実施形態は本明細書中に開示されており、そして好ましい態様および実施形態は以下に包含される特許請求の範囲に支配される。
本発明の情況で用いられる安定性の測定値は、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）で確定した場合、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、例えば10 mMのＤＴＴの存在下でＥＰＯ受容体を結合するＥＰＯ変異体の能力と、同一ラジオイムノアッセイでＤＴＴの非存在下でＥＰＯ受容体を結合するＥＰＯ変異体の能力の比率として表わされ得る。その比率の値が大きいほど、ＥＰＯ変異体の安定性は、それゆえ還元環境中のフォールディング化状態でのその存在はより大きくなる。
野生型ＥＰＯと比較して、ＥＰＯ変異体は、少なくとも約5倍、さらに好ましくは少なくとも約10倍、15倍、20倍、25倍または30倍改善されるような比率を有し得る。
安定性改善を示す変異体は、下記の実験で同定される。例えば、野生型ＥＰＯ（0.02）および種々の変異体（0.13〜0.51の範囲）に関してＤＴＴの存在下および非存在下で結合するＥＰＯ受容体の測定比率を提示する表１を参照されたい。
本発明の情況で用いられる安定性のさらなる測定値は、抗ＥＰＯ ＨＲＰ融合抗体を用いてＥＬＩＳＡにより確定した場合に、ＤＴＴ、例えば10 mMのＤＴＴの存在下でＥＰＯ受容体を結合するＥＰＯ変異体の能力と、同一ＥＬＩＳＡでＤＴＴの非存在下でＥＰＯ受容体を結合するＥＰＯ変異体の能力の比率として表わされ得る。ＤＴＴの非存在下および存在下でのＥＰＯ変異体のＥＰＯ受容体との相対的結合の比較は、安定性の指標を提供する。結合がパーセンテージ値として測定される場合、パーセンテージ値が大きいほど、ＥＰＯ変異体の安定性は、それゆえ還元環境でフォールディング化状態でのその存在はより大きくなる。
野生型ＥＰＯと比較して、好ましいＥＰＯ変異体は、少なくとも約10％、20％、30％または40％、さらに好ましくは50％、60％または70％といったようなパーセンテージ値を有し得る。
安定性改善を示す変異体は、下記の実験で同定される。例えば、野生型ＥＰＯ（1％）および種々の変異体（1％〜75％の範囲）に関してＤＴＴの存在下および非存在下で結合するＥＰＯ受容体により確定されるパーセンテージ値を提示する表３を参照されたい。
本発明の情況で用いられ得る安定性の別の測定は、経時的なＥＰＯ変異体の凝集を野生型ＥＰＯの凝集とを比較することである。例えば野生型ＥＰＯおよび変異体ＥＰＯはともに、一連の温度（例えば5℃〜45℃）で保存され、次に当該技術分野で既知のルーチン方法を用いて分解生成物および凝集物質に関して分析され得る。安定タンパク質はより良好にフォールディング化状態で残存し、そして分解および凝集傾向が低い。
安定性改善を示すＥＰＯ変異体ポリペプチドは、野生型タンパク質が90％残留活性を保持するより2〜10℃高い温度で、例えば2、3、4、5、6、7、8、9または10℃高い温度で、90％残留活性を保持し得る。残留（即ちフォールディング化、活性）タンパク質のパーセンテージは、ＨＰＬＣ、ＳＤＳ ＰＡＧＥのようなルーチンの生化学的技法により、あるいは結合検定または細胞から応答を引き出すといったような活性検定により、測定され得る。
安定性改善を示す変異体は一般に下流プロセシングにおいてより高い発現およびより高い収率を提供し、これが商品コスト（ＣＯＧ）改善をもたらす。
さらに、安定性改善を示すＥＰＯ変異体は、保存寿命改善を示す。より長い保存寿命は、それが商品コストにも影響を及ぼすので、有益である。
安定性改善を示すＥＰＯ変異体は、より長い半減期に起因する身体における効率増大を有する。さらに、安定性改善を示すＥＰＯ変異体は、凝集低減のため、皮下投与のような投与経路により応じやすく、これは、効率を増大するだけでなく、引き出されている抗体を中和するかまたは結合する危険も低減する。
本発明による好ましいＥＰＯ変異体は、本明細書中で同定されるような一組の突然変異を含む。
本発明のさらに好ましいＥＰＯ変異体は、配列番号３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６および１７から成る群から選択されるアミノ酸配列を有する。
さらなる好ましいＥＰＯ変異体は、配列番号１８、１９、２０、２１および２２を有する。
本明細書中に開示された変異体の各々およびすべてのものは、コード核酸、このような核酸を含むベクター、このようなベクターを含む宿主細胞、変異体を含む組成物、ヒトまたは動物身体の治療方法に用いるための本発明の変異体、貧血の治療のための薬剤の製造における変異体の使用、変異体およびその他の組成物の製造方法、本明細書中に開示されるような方法および使用の場合と同様に、本発明の一態様を表わす。
本発明によるＥＰＯ変異体は、出発タンパク質と、あるいは野生型または天然タンパク質と比較して、1つまたは複数の付加的変化を含有し得る。ＥＰＯに対する多数の異なる修飾は機知であり（天然突然変異体および人工的作製変異体の両方）、野生型と比較して修飾された特性を有する。1つまたは複数のこれらの特性は、本発明によるＥＰＯ変異体中に保持されるかまたは提供され得る。
さらに、出発タンパク質と、あるいは野生型または天然タンパク質と比較して、1つまたは複数の付加的変化を含有する本発明のＥＰＯ変異体は、1つまたは複数の突然変異の相乗的組合せに起因する安定性増大を示し得る。
野生型ＥＰＯは、位置７、２９、３３および１６１に4つのシステイン残基を有し、これは、2つの分子内ジスルフィド架橋を形成する。好ましくは本発明のＥＰＯ変異体は、偶数のシステイン残基、好ましくは4以下のシステイン残基、さらに好ましくは2以下のシステイン残基を有する。好ましくは本発明によるＥＰＯ変異体は、4つのシステイン残基または2つのシステイン残基を有する。システイン残基は、位置７、２９、３３および１６１に、さらに好ましくは位置７および１６１に存在する。
奇数のシステイン残基の存在は、これが分子内ジスルフィド架橋による分子の交差結合のための凝集を生じ得るので、望ましくない。奇数のシステイン残基を含有する変異体では、非対合システインは、除去され、元々システインがない場合は本来の野生型残基と、または任意のアミノ酸残基、例えばアラニンと置き換えられるべきである。
位置２９または位置３３のシステイン残基が突然変異化される場合、位置２９または位置３３の突然変異をその元のシステイン残基に戻すことにより、非対合システイン残基が対合されるのが好ましい。
非対合システイン残基が位置２９にある場合、一選択肢は、この非対合システインを任意の他のアミノ酸と置き換えることである。さらなる選択肢は、位置２９の非対合システインをバリンと置き換えて、そしてさらに位置３３のアミノ酸残基をアラニンと置き換えることである。バリンおよびアラニンは、ジスルフィドか京都類似の立体要件を有することが既知であり、そこで、ジスルフィド架橋のための有用な代替物と考えられる（Worn and Pluckthun, 1998, FEBS Letter 427: 357-361）。
さらに、ＥＰＯ変異体の位置２９がシステイン以外のアミノ酸残基を有する場合、位置３３にチロシンまたはアルギニンを有するのが好ましい。
ＥＰＯ変異体の炭水化物含量増大は循環半減期を増大する、ということが当該技術分野では既知である（ARANESPでは、5つのＮ結合グリコシル化部位、2つより多い野生型ＥＰＯが存在する）。本発明のＥＰＯ変異体は、特に哺乳類発現系で発現される場合、5以上の、好ましくは4以上の、さらに好ましくは3以上のＮ結合グリコシル化部位を有するのが好ましい。好ましくは本発明の変異体は、5、4または3つのＮ結合グリコシル化部位を有する。Ｎ結合グリコシル化部位の数は、ＥＰＯ変異体が原核生物発現系で発現される場合、関連がない。本発明のＥＰＯ変異体の哺乳類発現に関しては、Ｎ結合グリコシル化部位の数は、好ましくは好ましい数に戻される。
本発明による好ましいＥＰＯ変異体は、配列番号３、６、７、９および１７から選択されるアミノ酸配列を有する。本発明のさらに好ましい変異体は、配列番号１７で示されるアミノ酸配列を有する。
さらなる好ましい変異体としては、1つまたは複数の突然変異が、本明細書中で同定される突然変異組のいずれかのほかに作製されるもの、そして1つまたは複数のシステイン残基あるいはＮ‐グリコシル化に関与する1つまたは複数の残基、即ち、モチーフＮＸＺでは、ＮまたはＺ（ここで、Ｎはアスパラギンであり、Ｚはセリンまたはトレオニンであって、この場合、Ｘはプロリン以外の任意のアミノ酸である）が生じるものが挙げられる。したがって、例えばシステインまたはアスパラギンあるいはＮ‐グリコシル化に関与するその他の残基に変化が存在する一組の突然変異が本明細書中に開示される変異体に関しては、システインへの復帰（本明細書中の別の箇所に示される原理に従って）および／またはＮ‐グリコシル化モチーフを提供するための復帰が存在するこのさらなる変異体が本発明により提供される。さらに、本明細書中に開示される一組の突然変異において、システインまたはアスパラギンあるいはＮ‐グリコシル化に関与するその他の残基に変化が認められない場合、システインでの1つまたは複数の突然変異（本明細書中の別の箇所に示される原理に従って）および／またはＮ‐グリコシル化のための1つまたは複数の付加的部位を提供するための1つまたは複数の突然変異が提供されるさらなる変異体が本発明により提供される。
本発明により提供されるさらなる変異体の実施形態としては、以下の位置：６、２９、３３、４５、４８、４９、６１、６４、７４、８８、９２、１０７、１０９、１３３、１３５、１５４、１５７および１５８のうちのいずれか1つまたは複数での付加的突然変異を有するものが挙げられる。これらの位置のいずれか1つまたは複数で提供される残基は、以下の表で同定されるものから選択され得る：
Figure 2008508854
本発明による好ましい変異体は、それらが基礎にする最初の組の突然変異の同定と一緒に、ここに示される：
最初の突然変異組（配列番号３に見出される）
Ｉ２５Ｆ Ｔ２７Ｓ Ｒ１３９Ｈ Ｇ１５８Ｅ；
さらなる突然変異体：
Ｔ２７Ｓ Ｒ１３９Ｈ Ｇ１５８Ｅ；
Ｉ２５Ｆ Ｒ１３９Ｈ Ｇ１５８Ｅ；
Ｒ１３９Ｈ Ｇ１５８Ｅ；
Ｉ２５Ｆ Ｔ２７Ｓ Ｇ１５８Ｅ；
Ｉ２５Ｆ Ｇ１５８Ｅ；
Ｔ２７Ｓ Ｇ１５８Ｅ；
Ｇ１５８Ｅ。
最初の突然変異組（配列番号４に見出される）
Ｔ２６Ａ Ｄ４３Ｇ Ｖ６１Ａ Ｌ７５Ｒ Ｖ８２Ａ Ｉ１３３Ｔ Ａ１３５Ｖ Ｔ１５７Ｉ；
さらなる変異体：
Ｄ４３Ｇ Ｖ６１Ａ Ｌ７５Ｒ Ｖ８２Ａ Ｉ１３３Ｔ Ａ１３５Ｖ Ｔ１５７Ｉ；
Ｔ２６Ａ Ｄ４３Ｇ Ｖ６１Ａ Ｖ８２Ａ Ｉ１３３Ｔ Ａ１３５Ｖ Ｔ１５７Ｉ；
Ｄ４３Ｇ Ｖ６１Ａ Ｖ８２Ａ Ｉ１３３Ｔ Ａ１３５Ｖ Ｔ１５７Ｉ；
Ｔ２６Ａ Ｄ４３Ｇ Ｖ６１Ａ Ｌ７５Ｒ Ｉ１３３Ｔ Ａ１３５Ｖ Ｔ１５７Ｉ；
Ｔ２６Ａ Ｄ４３Ｇ Ｖ６１Ａ Ｌ７５Ｒ Ｖ８２Ａ Ｉ１３３Ｔ Ａ１３５Ｖ Ｔ１５７Ｉ；
Ｄ４３Ｇ Ｖ６１Ａ Ｌ７５Ｒ Ｉ１３３Ｔ Ａ１３５Ｖ Ｔ１５７Ｉ；
Ｔ２６Ａ Ｄ４３Ｇ Ｖ６１Ａ Ｉ１３３Ｔ Ａ１３５Ｖ Ｔ１５７Ｉ；
Ｄ４３Ｇ Ｖ６１Ａ Ｉ１３３Ｔ Ａ１３５Ｖ Ｔ１５７Ｉ。
最初の突然変異組（配列番号５に見出される）
Ｎ２４Ｄ Ｔ２７Ａ Ｔ４０Ａ Ｋ４５Ｒ Ｋ５２Ｅ Ｗ６４Ｒ Ｌ１３０Ｐ Ａ１３５Ｖ Ｔ１５７Ｉ Ｇ１５８Ｅ；
さらなる変異体：
Ｔ２７Ａ Ｔ４０Ａ Ｋ４５Ｒ Ｋ５２Ｅ Ｗ６４Ｒ Ｌ１３０Ｐ Ａ１３５Ｖ Ｔ１５７Ｉ Ｇ１５８Ｅ；
Ｎ２４Ｄ Ｔ２７Ａ Ｋ４５Ｒ Ｋ５２Ｅ Ｗ６４Ｒ Ｌ１３０Ｐ Ａ１３５Ｖ Ｔ１５７Ｉ Ｇ１５８Ｅ；
Ｔ２７Ａ Ｋ４５Ｒ Ｋ５２Ｅ Ｗ６４Ｒ Ｌ１３０Ｐ Ａ１３５Ｖ Ｔ１５７Ｉ Ｇ１５８Ｅ；
Ｎ２４Ｄ Ｔ４０Ａ Ｋ４５Ｒ Ｋ５２Ｅ Ｗ６４Ｒ Ｌ１３０Ｐ Ａ１３５Ｖ Ｔ１５７Ｉ Ｇ１５８Ｅ；
Ｔ４０Ａ Ｋ４５Ｒ Ｋ５２Ｅ Ｗ６４Ｒ Ｌ１３０Ｐ Ａ１３５Ｖ Ｔ１５７Ｉ Ｇ１５８Ｅ；
Ｎ２４Ｄ Ｋ４５Ｒ Ｋ５２Ｅ Ｗ６４Ｒ Ｌ１３０Ｐ Ａ１３５Ｖ Ｔ１５７Ｉ Ｇ１５８Ｅ；
Ｋ４５Ｒ Ｋ５２Ｅ Ｗ６４Ｒ Ｌ１３０Ｐ Ａ１３５Ｖ Ｔ１５７Ｉ Ｇ１５８Ｅ。
最初の突然変異組（配列番号６に見出される）
Ｉ６Ｔ Ｄ８Ｇ Ｋ２０Ｒ Ｋ５２Ｒ Ｗ６４Ｒ Ｖ７４Ｆ Ｔ１０７Ａ Ｌ１０９Ｆ Ｉ１３３Ｎ Ｔ１５７Ｉ；
さらなる変異体：
Ｉ６Ｔ Ｄ８Ｇ Ｋ５２Ｒ Ｗ６４Ｒ Ｖ７４Ｆ Ｔ１０７Ａ Ｌ１０９Ｆ Ｉ１３３Ｎ Ｔ１５７Ｉ；
Ｉ６Ｔ Ｄ８Ｇ Ｋ２０Ｒ Ｗ６４Ｒ Ｖ７４Ｆ Ｔ１０７Ａ Ｌ１０９Ｆ Ｉ１３３Ｎ Ｔ１５７Ｉ；
Ｉ６Ｔ Ｄ８Ｇ Ｗ６４Ｒ Ｖ７４Ｆ Ｔ１０７Ａ Ｌ１０９Ｆ Ｉ１３３Ｎ Ｔ１５７Ｉ。
最初の突然変異組（配列番号７に見出される）
Ｉ２５Ｆ Ｃ２９Ｖ Ｃ３３Ａ Ｗ６４Ｒ Ｑ９２Ｒ Ｉ１３３Ｖ Ｇ１５８Ｅ；
さらなる突然変異体：
Ｃ２９Ｖ Ｃ３３Ａ Ｗ６４Ｒ Ｑ９２Ｒ Ｉ１３３Ｖ Ｇ１５８Ｅ；
Ｉ２５Ｆ Ｃ３３Ａ Ｗ６４Ｒ Ｑ９２Ｒ Ｉ１３３Ｖ Ｇ１５８Ｅ；
Ｉ２５Ｆ Ｃ２９Ｖ Ｗ６４Ｒ Ｑ９２Ｒ Ｉ１３３Ｖ Ｇ１５８Ｅ；
Ｃ３３Ａ Ｗ６４Ｒ Ｑ９２Ｒ Ｉ１３３Ｖ Ｇ１５８Ｅ；
Ｃ２９Ｖ Ｗ６４Ｒ Ｑ９２Ｒ Ｉ１３３Ｖ Ｇ１５８Ｅ；
Ｉ２５Ｆ Ｗ６４Ｒ Ｑ９２Ｒ Ｉ１３３Ｖ Ｇ１５８Ｅ；
Ｗ６４Ｒ Ｑ９２Ｒ Ｉ１３３Ｖ Ｇ１５８Ｅ。
最初の突然変異組（配列番号８に見出される）
Ｔ２６Ａ Ｔ２７Ａ Ｋ４５Ｒ Ｎ４７Ｄ Ｙ４９Ｎ Ｅ８９Ｇ Ｑ９２Ｒ Ｇ１５８Ｅ；
さらなる変異体：
Ｔ２７Ａ Ｋ４５Ｒ Ｎ４７Ｄ Ｙ４９Ｎ Ｅ８９Ｇ Ｑ９２Ｒ Ｇ１５８Ｅ；
Ｔ２６Ａ Ｋ４５Ｒ Ｎ４７Ｄ Ｙ４９Ｎ Ｅ８９Ｇ Ｑ９２Ｒ Ｇ１５８Ｅ；
Ｋ４５Ｒ Ｎ４７Ｄ Ｙ４９Ｎ Ｅ８９Ｇ Ｑ９２Ｒ Ｇ１５８Ｅ；
Ｔ２６Ａ Ｔ２７Ａ Ｋ４５Ｒ Ｎ４７Ｄ Ｅ８９Ｇ Ｑ９２Ｒ Ｇ１５８Ｅ；
Ｔ２６Ａ Ｋ４５Ｒ Ｎ４７Ｄ Ｅ８９Ｇ Ｑ９２Ｒ Ｇ１５８Ｅ；
Ｔ２７Ａ Ｋ４５Ｒ Ｎ４７Ｄ Ｅ８９Ｇ Ｑ９２Ｒ Ｇ１５８Ｅ；
Ｔ２６Ａ Ｔ２７Ａ Ｋ４５Ｒ Ｎ４７Ｄ Ｙ４９Ｎ Ｑ９２Ｒ Ｇ１５８Ｅ；
Ｔ２６Ａ Ｔ２７Ａ Ｋ４５Ｒ Ｎ４７Ｄ Ｑ９２Ｒ Ｇ１５８Ｅ；
Ｔ２６Ａ Ｋ４５Ｒ Ｎ４７Ｄ Ｑ９２Ｒ Ｇ１５８Ｅ；
Ｔ２７Ａ Ｋ４５Ｒ Ｎ４７Ｄ Ｑ９２Ｒ Ｇ１５８Ｅ；
Ｋ４５Ｒ Ｎ４７Ｄ Ｙ４９Ｎ Ｑ９２Ｒ Ｇ１５８Ｅ；
Ｋ４５Ｒ Ｎ４７Ｄ Ｑ９２Ｒ Ｇ１５８Ｅ；
Ｔ２７Ａ Ｋ４５Ｒ Ｎ４７Ｄ Ｙ４９Ｎ Ｑ９２Ｒ Ｇ１５８Ｅ；
Ｋ４５Ｒ Ｎ４７Ｄ Ｅ８９Ｇ Ｑ９２Ｒ Ｇ１５８Ｅ；
Ｔ２６Ａ Ｋ４５Ｒ Ｎ４７Ｄ Ｙ４９Ｎ Ｑ９２Ｒ Ｇ１５８Ｅ。
最初の突然変異組（配列番号９に見出される）
Ｉ２５Ｆ Ｖ８２Ａ Ｑ９２Ｒ Ｉ１３３Ｖ Ａ１３５Ｖ Ｋ１５４Ｍ；
さらなる変異体：
Ｖ８２Ａ Ｑ９２Ｒ Ｉ１３３Ｖ Ａ１３５Ｖ Ｋ１５４Ｍ；
Ｉ２５Ｆ Ｑ９２Ｒ Ｉ１３３Ｖ Ａ１３５Ｖ Ｋ１５４Ｍ；
Ｑ９２Ｒ Ｉ１３３Ｖ Ａ１３５Ｖ Ｋ１５４Ｍ。
最初の突然変異組（配列番号１０に見出される）
Ｖ７４Ｆ Ｑ８６Ｌ Ｗ８８Ｒ Ｇ１５８Ｅ；
さらなる変異体：
Ｖ７４Ｆ Ｗ８８Ｒ Ｇ１５８Ｅ。
最初の突然変異組（配列番号１１に見出される）
Ｔ２７Ａ Ｗ６４Ｒ Ｖ８２Ａ Ｎ８３Ｓ Ｒ１３９Ｈ Ｋ１５４Ｍ Ｔ１５７Ｉ；
さらなる変異体：
Ｔ２７Ａ Ｗ６４Ｒ Ｖ８２Ａ Ｒ１３９Ｈ Ｋ１５４Ｍ Ｔ１５７Ｉ；
Ｗ６４Ｒ Ｖ８２Ａ Ｎ８３Ｓ Ｒ１３９Ｈ Ｋ１５４Ｍ Ｔ１５７Ｉ；
Ｔ２７Ａ Ｗ６４Ｒ Ｎ８３Ｓ Ｒ１３９Ｈ Ｋ１５４Ｍ Ｔ１５７Ｉ；
Ｔ２７Ａ Ｗ６４Ｒ Ｖ８２Ａ Ｎ８３Ｓ Ｋ１５４Ｍ Ｔ１５７Ｉ；
Ｗ６４Ｒ Ｋ１５４Ｍ Ｔ１５７Ｉ；
Ｗ６４Ｒ Ｎ８３Ｓ Ｒ１３９Ｈ Ｋ１５４Ｍ Ｔ１５７Ｉ；
Ｗ６４Ｒ Ｖ８２Ａ Ｒ１３９Ｈ Ｋ１５４Ｍ Ｔ１５７Ｉ；
Ｗ６４Ｒ Ｖ８２Ａ Ｎ８３Ｓ Ｋ１５４Ｍ Ｔ１５７Ｉ；
Ｗ６４Ｒ Ｖ８２Ａ Ｋ１５４Ｍ Ｔ１５７Ｉ；
Ｗ６４Ｒ Ｒ１３９Ｈ Ｋ１５４Ｍ Ｔ１５７Ｉ；
Ｔ２７Ａ Ｗ６４Ｒ Ｒ１３９Ｈ Ｋ１５４Ｍ Ｔ１５７Ｉ；
Ｔ２７Ａ Ｗ６４Ｒ Ｖ８２Ａ Ｋ１５４Ｍ Ｔ１５７Ｉ；
Ｔ２７Ａ Ｗ６４Ｒ Ｎ８３Ｓ Ｋ１５４Ｍ Ｔ１５７Ｉ。
最初の突然変異組（配列番号１２に見出される）
Ｙ４９Ｈ Ｗ６４Ｒ Ａ６８Ｔ Ｅ７２Ｋ Ｑ９２Ｒ Ｅ１１６Ｇ Ａ１３５Ｖ Ｋ１５４Ｔ；
さらなる変異体：
Ｙ４９Ｈ Ｗ６４Ｒ Ｅ７２Ｋ Ｑ９２Ｒ Ｅ１１６Ｇ Ａ１３５Ｖ Ｋ１５４Ｔ；
Ｙ４９Ｈ Ｗ６４Ｒ Ａ６８Ｔ Ｑ９２Ｒ Ｅ１１６Ｇ Ａ１３５Ｖ Ｋ１５４Ｔ；
Ｙ４９Ｈ Ｗ６４Ｒ Ａ６８Ｔ Ｅ７２Ｋ Ｑ９２Ｒ Ａ１３５Ｖ Ｋ１５４Ｔ；
Ｙ４９Ｈ Ｗ６４Ｒ Ｅ７２Ｋ Ｑ９２Ｒ Ｅ１１６Ｇ Ａ１３５Ｖ Ｋ１５４Ｔ；
Ｙ４９Ｈ Ｗ６４Ｒ Ａ６８Ｔ Ｑ９２Ｒ Ａ１３５Ｖ Ｋ１５４Ｔ；
Ｙ４９Ｈ Ｗ６４Ｒ Ｑ９２Ｒ Ａ１３５Ｖ Ｋ１５４Ｔ；
Ｙ４９Ｈ Ｗ６４Ｒ Ｑ９２Ｒ Ｅ１１６Ｇ Ａ１３５Ｖ Ｋ１５４Ｔ。
最初の突然変異組（配列番号１３に見出される）
Ｔ２６Ａ Ｔ４０Ａ Ｗ６４Ｒ Ｖ７４Ｆ Ｑ８６Ｐ Ｔ１０７Ａ；
さらなる突然変異：
Ｔ４０Ａ Ｗ６４Ｒ Ｖ７４Ｆ Ｑ８６Ｐ Ｔ１０７Ａ；
Ｔ２６Ａ Ｗ６４Ｒ Ｖ７４Ｆ Ｑ８６Ｐ Ｔ１０７Ａ；
Ｔ２６Ａ Ｔ４０Ａ Ｗ６４Ｒ Ｖ７４Ｆ Ｔ１０７Ａ；
Ｔ４０Ａ Ｗ６４Ｒ Ｖ７４Ｆ Ｔ１０７Ａ；
Ｔ２６Ａ Ｗ６４Ｒ Ｖ７４Ｆ Ｔ１０７Ａ；
Ｗ６４Ｒ Ｖ７４Ｆ Ｔ１０７Ａ。
最初の突然変異組（配列番号１４に見出される）
Ｉ２５Ｆ Ｎ３８Ｙ Ｋ４５Ｒ Ｆ４８Ｌ Ｗ６４Ｒ Ｗ８８Ｒ Ａ１２８Ｔ Ｉ１３３Ｔ Ｋ１５４Ｍ；
さらなる変異体：
Ｎ３８Ｙ Ｋ４５Ｒ Ｆ４８Ｌ Ｗ６４Ｒ Ｗ８８Ｒ Ａ１２８Ｔ Ｉ１３３Ｔ Ｋ１５４Ｍ；
Ｉ２５Ｆ Ｋ４５Ｒ Ｆ４８Ｌ Ｗ６４Ｒ Ｗ８８Ｒ Ａ１２８Ｔ Ｉ１３３Ｔ Ｋ１５４Ｍ；
Ｉ２５Ｆ Ｎ３８Ｙ Ｋ４５Ｒ Ｆ４８Ｌ Ｗ６４Ｒ Ｗ８８Ｒ Ｉ１３３Ｔ Ｋ１５４Ｍ；
Ｋ４５Ｒ Ｆ４８Ｌ Ｗ６４Ｒ Ｗ８８Ｒ Ａ１２８Ｔ Ｉ１３３Ｔ Ｋ１５４Ｍ；
Ｎ３８Ｙ Ｋ４５Ｒ Ｆ４８Ｌ Ｗ６４Ｒ Ｗ８８Ｒ Ｉ１３３Ｔ Ｋ１５４Ｍ；
Ｉ２５Ｆ Ｋ４５Ｒ Ｆ４８Ｌ Ｗ６４Ｒ Ｗ８８Ｒ Ｉ１３３Ｔ Ｋ１５４Ｍ；
Ｋ４５Ｒ Ｆ４８Ｌ Ｗ６４Ｒ Ｗ８８Ｒ Ｉ１３３Ｔ Ｋ１５４Ｍ。
最初の突然変異組（配列番号１５に見出される）
Ｉ２５Ｆ Ｗ６４Ｒ Ｖ８２Ａ Ｔ１０７Ａ Ｉ１３３Ａ Ｋ１５４Ｍ；
さらなる変異体：
Ｗ６４Ｒ Ｖ８２Ａ Ｔ１０７Ａ Ｉ１３３Ａ Ｋ１５４Ｍ；
Ｉ２５Ｆ Ｗ６４Ｒ Ｔ１０７Ａ Ｉ１３３Ａ Ｋ１５４Ｍ；
Ｗ６４Ｒ Ｔ１０７Ａ Ｉ１３３Ａ Ｋ１５４Ｍ。
最初の突然変異組（配列番号１６に見出される）
Ｉ２５Ｆ Ｋ５２Ｒ Ｖ５６Ａ Ｎ８３Ｓ Ｅ８９Ｇ Ｑ９２Ｒ Ｇ１５８Ｅ；
さらなる変異体：
Ｋ５２Ｒ Ｖ５６Ａ Ｎ８３Ｓ Ｅ８９Ｇ Ｑ９２Ｒ Ｇ１５８Ｅ；
Ｉ２５Ｆ Ｋ５２Ｒ Ｖ５６Ａ Ｅ８９Ｇ Ｑ９２Ｒ Ｇ１５８Ｅ；
Ｋ５２Ｒ Ｖ５６Ａ Ｅ８９Ｇ Ｑ９２Ｒ Ｇ１５８Ｅ；
Ｉ２５Ｆ Ｖ５６Ａ Ｎ８３Ｓ Ｅ８９Ｇ Ｑ９２Ｒ Ｇ１５８Ｅ；
Ｖ５６Ａ Ｎ８３Ｓ Ｅ８９Ｇ Ｑ９２Ｒ Ｇ１５８Ｅ；
Ｉ２５Ｆ Ｖ５６Ａ Ｅ８９Ｇ Ｑ９２Ｒ Ｇ１５８Ｅ；
Ｉ２５Ｆ Ｋ５２Ｒ Ｎ８３Ｓ Ｅ８９Ｇ Ｑ９２Ｒ Ｇ１５８Ｅ；
Ｉ２５Ｆ Ｎ８３Ｓ Ｅ８９Ｇ Ｑ９２Ｒ Ｇ１５８Ｅ；
Ｉ２５Ｆ Ｋ５２Ｒ Ｖ５６Ａ Ｅ８９Ｇ Ｑ９２Ｒ Ｇ１５８Ｅ；
Ｖ５６Ａ Ｅ８９Ｇ Ｑ９２Ｒ Ｇ１５８Ｅ；
Ｉ２５Ｆ Ｋ５２Ｒ Ｅ８９Ｇ Ｑ９２Ｒ Ｇ１５８Ｅ；
Ｎ８３Ｓ Ｅ８９Ｇ Ｑ９２Ｒ Ｇ１５８Ｅ；
Ｉ２５Ｆ Ｖ５６Ａ Ｅ８９Ｇ Ｑ９２Ｒ Ｇ１５８Ｅ；
Ｋ５２Ｒ Ｎ８３Ｓ Ｅ８９Ｇ Ｑ９２Ｒ Ｇ１５８Ｅ；
Ｉ２５Ｆ Ｋ５２Ｒ Ｖ５６Ａ Ｎ８３Ｓ Ｑ９２Ｒ Ｇ１５８Ｅ；
Ｋ５２Ｒ Ｖ５６Ａ Ｎ８３Ｓ Ｑ９２Ｒ Ｇ１５８Ｅ；
Ｉ２５Ｆ Ｋ５２Ｒ Ｎ８３Ｓ Ｑ９２Ｒ Ｇ１５８Ｅ；
Ｋ５２Ｒ Ｎ８３Ｓ Ｑ９２Ｒ Ｇ１５８Ｅ；
Ｉ２５Ｆ Ｋ５２Ｒ Ｎ８３Ｓ Ｑ９２Ｒ Ｇ１５８Ｅ；
Ｋ５２Ｒ Ｑ９２Ｒ Ｇ１５８Ｅ；
Ｋ５２Ｒ Ｖ５６Ａ Ｅ８９Ｇ Ｑ９２Ｒ Ｇ１５８Ｅ；
Ｋ５２Ｒ Ｖ５６Ａ Ｑ９２Ｒ Ｇ１５８Ｅ；
Ｎ８３Ｓ Ｅ８９Ｇ Ｑ９２Ｒ Ｇ１５８Ｅ；
Ｎ８３Ｓ Ｑ９２Ｒ Ｇ１５８Ｅ；
Ｉ２５Ｆ Ｖ５６Ａ Ｎ８３Ｓ Ｑ９２Ｒ Ｇ１５８Ｅ；
Ｉ２５Ｆ Ｎ８３Ｓ Ｑ９２Ｒ Ｇ１５８Ｅ；
Ｖ５６Ａ Ｎ８３Ｓ Ｑ９２Ｒ Ｇ１５８Ｅ；
Ｑ９２Ｒ Ｇ１５８Ｅ；
Ｖ５６Ａ Ｎ８３Ｓ Ｑ９２Ｒ Ｇ１５８Ｅ；
Ｉ２５Ｆ Ｅ８９Ｇ Ｑ９２Ｒ Ｇ１５８Ｅ。
最初の突然変異組（配列番号１７に見出される）
Ｔ２７Ａ Ｋ４５Ｒ Ｋ５２Ｅ Ｗ６４Ｒ Ｌ１３０Ｐ Ａ１３５Ｖ Ｔ１５７Ｉ Ｇ１５８Ｅ；
さらなる変異体：
Ｋ４５Ｒ Ｋ５２Ｅ Ｗ６４Ｒ Ｌ１３０Ｐ Ａ１３５Ｖ Ｔ１５７Ｉ Ｇ１５８Ｅ；
Ｔ２７Ａ Ｋ４５Ｒ Ｗ６４Ｒ Ｌ１３０Ｐ Ａ１３５Ｖ Ｔ１５７Ｉ Ｇ１５８Ｅ；
Ｔ２７Ａ Ｋ４５Ｒ Ｋ５２Ｅ Ｗ６４Ｒ Ａ１３５Ｖ Ｔ１５７Ｉ Ｇ１５８Ｅ；
Ｔ２７Ａ Ｋ４５Ｒ Ｗ６４Ｒ Ａ１３５Ｖ Ｔ１５７Ｉ Ｇ１５８Ｅ；
Ｋ４５Ｒ Ｋ５２Ｅ Ｗ６４Ｒ Ａ１３５Ｖ Ｔ１５７Ｉ Ｇ１５８Ｅ；
Ｋ４５Ｒ Ｗ６４Ｒ Ａ１３５Ｖ Ｔ１５７Ｉ Ｇ１５８Ｅ；
Ｋ４５Ｒ Ｗ６４Ｒ Ｌ１３０Ｐ Ａ１３５Ｖ Ｔ１５７Ｉ Ｇ１５８Ｅ。
以下のような突然変異を有するさらなる変異体が、さらなる選択方法を用いて同定されている：
Ｌ１６Ｉ Ｉ２５Ｆ Ｔ２７Ｍ Ｖ６１Ａ Ｒ１３９Ｈ Ｔ１５７Ｖ；
Ｄ８Ｖ Ｔ２６Ａ Ｔ２７Ａ Ｓ１２６Ｐ Ｇ１５８Ｅ；
Ｄ８Ｖ Ｔ２７Ａ Ｙ４９Ｎ Ｗ６４Ｒ Ｖ８２Ａ Ｅ８９Ｇ Ｓ１２６Ｐ Ｇ１５８Ｅ；
Ｔ２６Ａ Ｗ６４Ｒ Ａ１３５Ｖ Ｇ１５８Ｅ；
Ｄ８Ｖ Ｖ７４Ｆ Ｔ１０７Ａ Ｎ１４７Ｄ。
本明細書中に開示される突然変異組は各々、同定突然変異組からなる一組の突然変異を有するＥＰＯ変異体内に含まれる。これらの突然変異組は各々、同定突然変異組、ならびに1つまたは複数の付加的突然変異、特に好ましい突然変異として本明細書中に開示される1つまたは複数の突然変異を含むＥＰＯ変異体内に含まれ得る。
本発明によるポリペプチドは、例えばコード核酸からの発現による産生後に、単離されるおよび／または精製され得る（例えば抗体を用いて）（これに関しては下記参照）。したがって夾雑物を含有しないかまたは実質的に含有しないポリペプチドが提供され得る。他のポリペプチドを含有しないかまたは実質的に含有しないポリペプチドが提供され得る。単離および／または精製ポリペプチドは、少なくとも1つの付加的構成成分を含み得る組成物、例えば製薬上許容可能な賦形剤、ビヒクルまたは担体を含む製剤組成物の処方に用いられ得る。本発明のポリペプチドを含む組成物は、以下で考察されるような予防的および／または治療的処置に用いられ得る。
本発明によるポリペプチドの産生の便利な方法は、発現系での核酸の使用により、それをコードする核酸を発現することである。したがって本発明は、ポリペプチドをコードする核酸（一般に本発明による核酸）からの発現を含めたポリペプチドの製造方法（開示されているような）、も包含する。これは、ポリペプチドの発現を引き起こすかまたは発現を可能にする適切な条件下で、このようなベクターを含有する培地中の宿主を増殖させることにより達成され得るのが便利である。ポリペプチドは、in vitro系、例えば網状赤血球溶解物中でも発現され得る。
種々の異なる宿主細胞中でのポリペプチドのクローニングおよび発現のための系が周知である。適切な宿主細胞としては、細菌、真核生物細胞、例えば哺乳類および酵母、ならびにバキュロウイルス系が挙げられる。異種ポリペプチドの発現のための当該技術分野で利用可能な哺乳類細胞株としては、チャイニーズハムスター卵巣細胞、HeLa細胞、幼仔ハムスター腎細胞、ＣＯＳ細胞等が挙げられる。一般的な好ましい細菌宿主は、大腸菌である。適切な調節配列、例えばプロモーター配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子およびその他の配列を適宜含有する適切なベクターが選択されるかまたは構築され得る。ベクターは、適宜、プラスミド、ウイルス、例えばファージ、またはファージミドであり得る。さらなる詳細に関しては、例えば、Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 3rd edition, Sambrook and Russell, 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Pressを参照されたい。例えば核酸構築物の調製、突然変異誘発、シーケンシング、細胞中へのＤＮＡの導入ならびに遺伝子発現における核酸の操作のための、そしてタンパク質の分析のための多数の既知の技法およびプロトコールは、Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons, 1992に詳細に記載されている。
本発明のポリペプチドをコード刷る核酸は、本発明のさらなる一態様として提供される。
一般に本発明の核酸は、単離および／または精製形態での、あるいは夾雑物を含有しないかまたは実質的に含有しない、単離物として提供される。核酸は、全部または一部合成性であり、そしてゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはＲＮＡを包含し得る。
核酸は、複製可能ベクターの一部として提供され、そして本発明のＥＰＯ変異体をコードする核酸を含むベクター、特にコード化ポリペプチドが適切な条件下で発現され得る任意の発現ベクターも本発明により提供され、そして宿主細胞は任意のこのようなベクターまたは核酸を含有する。この情況での発現ベクターは、in vitro発現系中での、例えば網状赤血球溶解物中での、あるいはin vivoでの例えば真核生物細胞、例えばＣＯＳまたはＣＨＯ細胞中での、あるいは原核生物細胞、例えば大腸菌中での、当該ポリペプチドをコードする核酸およびポリペプチドの発現のための適切な調節配列を含めた核酸分子である。
本発明のさらなる態様は、本明細書中に開示されるような核酸を含有する宿主細胞を提供する。本発明の核酸は、宿主細胞のゲノム（例えば染色体）中に組み込まれ得る。組込みは、標準技法に従って、ゲノムを用いた組換えを促す配列の含入により促進され得る。核酸は、細胞内の染色体外ベクター上に存在し得る。
さらなる態様は、宿主細胞中に核酸を導入することを包含する方法を提供する。一般的に「形質転換」または「トランスフェクション」として限定を伴わずに言及され得る導入（特にin vitro導入に関して）は、任意の利用可能な技法を用い得る。真核生物細胞に関しては、適切な技法としては、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ‐デキストラン、電気穿孔、リポソーム媒介性トランスフェクション、ならびにレトロウイルスまたはその他のウイルス、例えばワクシニアあるいは昆虫細胞に関してはバキュロウイルスを用いた形質導入が挙げられ得る。細菌細胞に関しては、適切な技法としては、塩化カルシウム形質転換、電気穿孔、ならびにバクテリオファージを用いたトランスフェクションが挙げられる。
マーカー遺伝子、例えば抗生物質耐性または感受性遺伝子は、当該技術分野で周知であるように、当該核酸を含有するクローンの同定に用いられ得る。
導入の後には、例えばコード化ポリペプチドが産生されるよう、遺伝子の発現のための条件下で、宿主細胞（実際に形質転換される細胞を含み得るが、しかしおそらくは細胞は形質転換細胞の子孫である）を培養することにより、核酸からの発現が引き起こされるかまたは可能になる。ポリペプチドが適切なシグナルリーダーペプチドに結合されて発現される場合、それは、細胞から培地中に分泌され得る。発現による産生後、ポリペプチドは、宿主細胞および／または培地から単離されおよび／または精製され、場合によって、そしてその後、所望により、例えば1つまたは複数の付加的構成成分を含み得る組成物、例えば1つまたは複数の製薬上許容可能な賦形剤、ビヒクルまたは担体を含む製剤組成物の処方に用いられ得る（例えば下記参照）。
発現によるＥＰＯ変異体の産生後、その活性、例えばＥＰＯ受容体を結合するその活性、または細胞増殖を引き出す活性がルーチンに試験され得る。
本発明のさらなる態様によれば、野生型ヒトＥＰＯを上回る安定性改善を示すＥＰＯ変異体の製造方法であって、以下の：
コード核酸からの発現によりＥＰＯ変異体ポリペプチドを産生し；
例えば安定性の測定値として、ラジオイムノアッセイにおいてＤＴＴの存在下でのＥＰＯ受容体との結合活性と、同一検定においてＤＴＴの非存在下でＥＰＯ受容体との結合活性の比率を用いて、野生型ヒトＥＰＯと比較した場合の安定性改善に関してＥＰＯ変異体を試験する
ことを包含する方法が提供される。
比率は、本明細書中の別の箇所に示されるように、少なくとも5倍またはそれ以上、改善され得る。
変異体は、本明細書中に開示されるような一組の突然変異を、例えばシステイン残基を復帰させるかまたは導入するかまたは除去するために、Ｎ‐グリコシル化部位を復帰させるかまたは導入するかまたは除去するために、あるいはＯ‐結合グリコシル化部位を復帰させるかまたは導入するために、1つまたは複数の付加的突然変異および／または1つまたは複数の野生型への復帰とともに含有する変異体であり得る。
保存的置換はまた、例えば本明細書中の他の箇所で同定される1つまたは複数の位置で、本発明の種々の実施形態において好ましい。
「保存的置換」とは、第二の異なるアミノ酸残基による第一のアミノ酸残基の置換を意味し、この場合、第一および第二のアミノ酸残基は、類似の生物物理学的特質を有する側鎖を有する。類似の生物物理学的特質としては、疎水性、電荷、極性、水素結合を提供するかまたは受容する能力が挙げられる。保存的置換の例としては、セリンをトレオニンまたはトリプトファンに、グルタミンをアスパラギンに、リシンをアルギニンに、アラニンをバリンに、アスパルテートをグルタメートに、バリンをイソロイシンに、アスパラギンをセリンに変えることが挙げられる。
このような方法は、その産生後に、そして試験の前に、ＥＰＯ変異体を単離するかおよび／または精製することを任意に包含し得る。
本方法を実施する者は、ＥＰＯ変異体のアミノ酸配列を変更することにより、例えば上記のような1つまたは複数のアミノ酸の置換および／または挿入により、ＥＰＯ変異体を提供するステップの前に、付加的に実施し得る。例えば本発明に従って所望される特性を有する1つまたは複数の変異体を一連の変異体から同定するために、種々の異なる変異体が提供され、所望の活性に関して試験され得る。普通は、ＥＰＯのアミノ酸配列の変更は、ＥＰＯをコードする核酸のコード配列を変えることによりなされる。1つまたは複数のヌクレオチドは、1つまたは複数のコドンを、したがってコード化アミノ酸（単数または複数）を変えるために変更され得る。本明細書中の他の箇所に記述されるように、そして当業者に明らかであるように、ＥＰＯ変異体に関するコード配列を、したがってコード化アミノ酸配列を変更するために、突然変異誘発、特に定方向または部位特異的突然変異誘発のための任意の適切な技法が用いられ得る。
本発明のさらなる態様は、野生型ヒトＥＰＯと比較して安定性改善を示すＥＰＯ変異体を同定しまたは獲得する方法であって、以下の：
ＥＰＯ変異体ポリペプチドをコードする核酸を突然変異化して、変更アミノ酸配列を有する1つまたは複数のＥＰＯポリペプチド（「ＥＰＯ変異体」）をコードする配列を有する1つまたは複数の核酸を提供し；
単数または複数の核酸を発現して、単数または複数のコード化ＥＰＯ変異体を生成し；
このように生成された単数または複数のＥＰＯ変異体を野生型ヒトＥＰＯと比較して改善された安定性に関して試験する
ことを包含する方法を提供する。
ＥＰＯ変異体のライブラリーまたは多様な集団が産生され、所望の能力に関して試験され得る。
突然変異は、本明細書中に開示されるような一組の突然変異内に同定される任意の残基、任意のシステインおよび／またはＮ‐グリコシル化が起こる任意の残基（例えば野生型配列では、Ｎ２４、Ｎ３８またはＮ８３）、あるいはＮ‐グリコシル化のためのアルギニンの認識に寄与する残基（例えば野生型配列では、残基２６または４０）に存在し得る。
突然変異を受けるＥＰＯポリペプチドは、本明細書中に開示される任意組の突然変異を含み、そして配列番号３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６および１７から選択されるアミノ酸配列を有し得る。
ライブラリーまたは多様な集団からの選択は、表示系、例えばファージ表示および／またはリボソーム表示を用い得る（再検討のためには、Lowe D and Jermutus L, 2004, Curr. Pharm, Biotech, 517-27; WO92/01047参照）。安定性改善を有する変異体に関する選択は、例えば本明細書中に開示されるように、ＤＴＴの存在下または非存在下で変異体が産生される場合、結合またはその他の活性の指標の比較を包含し得る。
所望の特性を有する1つまたは複数のＥＰＯ変異体が、同定されまたは選択され得る。
本発明のＥＰＯ変異体が同定されるかまたは獲得された後、それは単離および／または精製形態で提供され、それは望ましい場合に用いられ、そしてそれは少なくとも1つの付加的構成成分、例えば製薬上許容可能な賦形剤または担体を含む組成物に処方され得る。ＥＰＯ変異体をコードする核酸を用いて、その後の使用のために変異体を産生し得る。記載されたように、このような核酸は、例えば最初に提供されるライブラリーまたは多様集団から、そしてＥＰＯ変異体が産生および同定されたものから、単離され得る。
本発明によるＥＰＯ変異体は、目的のヒトまたは動物身体、好ましくはヒトの診断または治療の方法に用いられ得る。
したがって本発明のさらなる態様は、提示されたようなＥＰＯ変異体の投与を包含する治療方法、このようなＥＰＯ変異体を含む製剤組成物、ならびに投与のための薬剤の製造における、例えばＥＰＯ変異体を製薬上許容可能な賦形剤とともに処方することを包含する薬剤または製剤組成物の製造方法における、このようなＥＰＯ変異体の使用を提供する。
治療的利益を提供するためにＥＰＯ変異体が用いられ得る臨床的適応症としては、貧血、例えば慢性腎不全、癌化学療法またはＨＩＶ感染に関連した、あるいは未熟児における小児科学的使用に関連した貧血が挙げられる。あるいはＥＰＯ変異体は、選択的非心臓性および非血管性手術を受けている貧血患者における輸血の必要性を低減するために用いられ得る。
本発明に従って、ＥＰＯ変異体は、好ましくは「予防的有効量」または「治療的有効量」（場合によって。しかし予防は治療とみなされ得る）での投与により個体に投与され、これは、個体に対して利益を示すのに十分である。投与される実際量、ならびに投与の速度および時間‐経過は、治療されているものの性質および重症度によっている。治療の処方箋、例えば投薬量等に関する決定は、開業医およびその他の医者の責務内である。
組成物は、治療されるべき症状によって、単独で、または他の治療と組合せて、同時的にまたは逐次的に、投与され得る。
本発明による、そして本発明に従って用いるための製剤組成物は、活性成分のほかに、製薬上許容可能な賦形剤、担体、緩衝剤、安定剤または当業者に既知のその他の物質を含み得る。このような物質は非毒性であるべきであり、そして活性成分の効力を妨げるべきでない。担体またはその他の物質の厳密な性質は投与経路によっており、これは任意の適切な経路であり得るが、しかし十中八九注射（有針または無針）、特に皮下注射である。その他の好ましい投与経路としては、吸入による投与または鼻内投与が挙げられる。
静脈内、皮下または筋肉内注射に関しては、活性成分は、発熱性物質無含有であり、そして適切なｐＨ、等張性および安定性を有する非経口的許容可能な水溶液の形態である。当業者は、例えば等張性ビヒクル、例えば塩化ナトリウム注射液、リンガー注射液または乳酸加リンガー注射液を用いて、適切な溶液を良好に調製し得る。防腐剤、安定剤、緩衝剤、酸化防止剤および／またはその他の添加剤が、必要に応じて含まれ得る。
本発明のさらなる態様および実施形態は、以下の実験的例証を含めた本発明の開示に鑑みて、当業者に明らかである。
本明細書中のどこかに記述された文書はすべて、参照により援用される。
実験
実施例１
ＥＰＯ ｃＤＮＡをInvitrogenから入手し、変異体のライブラリーを作製して、数回の選択に付し、そしてさらに8.1ヌクレオチド突然変異／分子の誤差率を有するエラー・プローンＰＣＲにより突然変異化した。これは、4つの突然変異／分子ならびに約2.5×1010の変異体分子のライブラリーを導入した。
特定の変異体を単離し、下記のように特性化した。
安定性に関する選択
下記の事項を除いて、Jermutus et al 2001に記載されたように、ＤＴＴの存在下および非存在下で、in vitro翻訳および選択を実施した：
１． 30℃で10分間、翻訳を実行した。
２． 野生型を上回る改善を実証するために、ＥＰＯ野生型（ＷＴ）を包含した。
３． ＰＣＲサイクル数を、実時間ＰＣＲで確定した。実時間ＰＣＲ組入れは、特定生成物を増幅するためのＰＣＲサイクルの数を使用者に選択させる。これは、非特異的バックグラウンドを最小限にして、そして相対的定量値（ＲＱＶ）を算定することにより野生型を上回る産出量改善の比較を可能にする。
要するに、選択を実施し、それにより、ＥＰＯ受容体融合タンパク質を伴うライブラリーを用いてインキュベーション後、融合タンパク質を捕獲し、結合三元複合体（ｍＲＮＡ‐リボソーム‐ＥＰＯ変異体）を磁気分離により回収する一方、非結合複合体を洗い落とした。次にＲＴ‐ＰＣＲにより結合ＥＰＯ変異体をコードするｍＲＮＡを回収し、漸増濃度のＤＴＴ（4回に亘って0.5 mMを10 mMに増大）を用いて選択プロセスを反復した。
ラウンド１選択を0.5 mMＤＴＴで実施し、これからのＰＣＲ産物を10 mMＤＴＴでのラウンド２選択に進めた。ラウンド２選択からのＰＣＲ産物は、野生型対照と同一強度を有した（ＲＱＶ＝1）。ラウンド２後、2つの選択ストランドが後に続いた。
第一のストランド（３Ａ）では、ラウンド２からのＰＣＲ産物を、10 mMＤＤＴ中で2回より多い回数の選択を通して進行させた。ラウンド４ＡＰＣＲ産物は、ゲル上で、そしてＲＱＶにより示されるようなより安定な変異体に関する濃化を示した（ラウンド３Ａ ＲＱＶ＝6、ラウンド４Ａ ＲＱＶ＝11）。
第二のストランド（３Ｂ）に関しては、ライブラリーサイズをさらに増大するために、4突然変異／分子の誤差率を有するエラー・プローンＰＣＲを用いて、第２回ＰＣＲ産物をさらに突然変異化した。突然変異誘発後、5 mMＤＤＴでのラウンド３Ｂおよび10 mMＤＤＴでのラウンド４Ｂで、突然変異体のライブラリーを選択した。ゲル上およびＲＱＶで示されるように、ラウンド４Ｂは、野生型およびラウンド４Ａから単離される変異体を上回るより安定な変異体に関する濃化を示した（ラウンド４Ｂ ＲＱＶ＝23）。
選択前の本来のライブラリー、ならびにラウンド４Ａおよびラウンド４Ｂ産出物のＰＣＲ産物を、in vitro発現ベクターｐＩＶＥＸ２．３ｄ（Roche）中にクローン化した。要するに産出物をＰＣＲ増幅して、５’Ｎｃｏ１制限部位をそして３’末端に停止コドンを導入し、その直ぐ後ろにＮｏｔ１制限部位を導入した。停止コドンは、非標識変異体ＥＰＯの発現を可能にした。生成物をゲル精製し、Ｎｏｔ１およびＮｃｏ１（New England Biolabs）で二重消化して、ゲル精製した。消化産物をＮｏｔ１ Ｎｃｏ１消化ｐＩＶＥＸ２．３ｄに結紮し、大腸菌ＴＧ１細胞中で形質転換した。スクリーニングおよびシーケンシングのために、個々のコロニーを96ウエルプレート中に摘み入れた。
一次安定性ＲＩＡにおける単一ＥＰＯ変異体のスクリーニング
Jermutus et al 2001に記載されたように、一次安定性ＲＩＡ（ラジオイムノアッセイ）を用いて、安定性に関してＥＰＯ変異体をスクリーニングした。要するに、各変異体に関して、線状ＤＮＡ鋳型を増幅し、転写し、Ｇ２５セファデックスカラム上でｍＲＮＡ精製して、定量した。各変異体に関して、Ｓ‐35標識化メチオニンの存在下でのin vitro翻訳を、30℃で30分間、二重反復試験で、１つは非還元条件で、そして１つは10 mMＤＴＴ（ジチオトレイトール）中で設定した。0.05％トゥイーン２０を含有するＰＢＳを、翻訳と同一濃度のＤＴＴとともに用いて、翻訳を停止した。翻訳混合物を、ＥＰＯ受容体を被覆したプレート上で、室温で1時間インキュベートした。プレートを、0.05％トゥイーン２０を含有するＰＢＳ中で3回、ＰＢＳ中で3回洗浄した。残存する放射能を0.1 Mトリエチルアミンで溶離し、液体シンチレーション計数により定量した。10 mMＤＤＴ中のＲＩＡシグナルをＤＴＴの非存在下でのＲＩＡシグナルで割ることにより、変異体の安定性の測定値を算定した。変異体が安定であるほど、その比率は大きく、即ちＤＴＴ中で不活性である場合、その比率＝0であり、ＤＴＴ中で完全活性である場合、その比率＝1である。
1回の選択からの85のクローン化ＥＰＯ変異体を、上記と同様にスクリーニングした。これから、ＷＴより大きい比率を有する20のＥＰＯ変異体を同定した。これらの変異体を再試験して、これらから、ＷＴより安定である16のＥＰＯ変異体を同定した（表１）。これらのＥＰＯ変異体は、それらが成長ホルモン受容体またはＢＳＡと結合しなかったということを実証することにより、コグネイト受容体に特異的であることが示された。
ＥＰＯ変異体の配列分析
ＥＰＯ変異体をシーケンシングし、16より多い安定変異体の配列を、それらがＷＴ ＥＰＯ配列番号２とアミノ酸レベルがどれほど異なるか、以下に記載する。
配列番号３
Ｉ２５Ｆ Ｔ２７Ｓ Ｒ１３９Ｈ Ｇ１５８Ｅ；
配列番号４
Ｔ２６Ａ Ｄ４３Ｇ Ｖ６１Ａ Ｌ７５Ｒ Ｖ８２Ａ Ｉ１３３Ｔ Ａ１３５Ｖ Ｔ１５７Ｉ；
配列番号５
Ｎ２４Ｄ Ｔ２７Ａ Ｔ４０Ａ Ｋ４５Ｒ Ｋ５２Ｅ Ｗ６４Ｒ Ｌ１３０Ｐ Ａ１３５Ｖ Ｔ１５７Ｉ Ｇ１５８Ｅ；
配列番号６
Ｉ６Ｔ Ｄ８Ｇ Ｋ２０Ｒ Ｋ５２Ｒ Ｗ６４Ｒ Ｖ７４Ｆ Ｔ１０７Ａ Ｌ１０９Ｆ Ｉ１３３Ｎ Ｔ１５７Ｉ；
配列番号７
Ｉ２５Ｆ Ｃ２９Ｖ Ｃ３３Ａ Ｗ６４Ｒ Ｑ９２Ｒ Ｉ１３３Ｖ Ｇ１５８Ｅ；
配列番号８
Ｔ２６Ａ Ｔ２７Ａ Ｋ４５Ｒ Ｎ４７Ｄ Ｙ４９Ｎ Ｅ８９Ｇ Ｑ９２Ｒ Ｇ１５８Ｅ；
配列番号９
Ｉ２５Ｆ Ｖ８２Ａ Ｑ９２Ｒ Ｉ１３３Ｖ Ａ１３５Ｖ Ｋ１５４Ｍ；
配列番号１０
Ｖ７４Ｆ Ｑ８６Ｌ Ｗ８８Ｒ Ｇ１５８Ｅ；
配列番号１１
Ｔ２７Ａ Ｗ６４Ｒ Ｖ８２Ａ Ｎ８３Ｓ Ｒ１３９Ｈ Ｋ１５４Ｍ Ｔ１５７Ｉ；
配列番号１２
Ｙ４９Ｈ Ｗ６４Ｒ Ａ６８Ｔ Ｅ７２Ｋ Ｑ９２Ｒ Ｅ１１６Ｇ Ａ１３５Ｖ Ｋ１５４Ｔ；
配列番号１３
Ｔ２６Ａ Ｔ４０Ａ Ｗ６４Ｒ Ｖ７４Ｆ Ｑ８６Ｐ Ｔ１０７Ａ；
配列番号１４
Ｉ２５Ｆ Ｎ３８Ｙ Ｋ４５Ｒ Ｆ４８Ｌ Ｗ６４Ｒ Ｗ８８Ｒ Ａ１２８Ｔ Ｉ１３３Ｔ Ｋ１５４Ｍ；
配列番号１５
Ｉ２５Ｆ Ｗ６４Ｒ Ｖ８２Ａ Ｔ１０７Ａ Ｉ１３３Ａ Ｋ１５４Ｍ；
配列番号１６
Ｉ２５Ｆ Ｋ５２Ｒ Ｖ５６Ａ Ｎ８３Ｓ Ｅ８９Ｇ Ｑ９２Ｒ Ｇ１５８Ｅ；
配列番号１７
Ｔ２７Ａ Ｋ４５Ｒ Ｋ５２Ｅ Ｗ６４Ｒ Ｌ１３０Ｐ Ａ１３５Ｖ Ｔ１５７Ｉ Ｇ１５８Ｅ。
二次安定性検定
この検定では、哺乳類細胞株、例えばＣＨＯまたはＨＥＫ中で、タグを用いた場合と用いない場合とで、ＥＰＯ変異体を発現させて、精製し、生物学的活性に関して試験する。
ＥＰＯ変異体は、ＳＥＣ‐ＨＰＬＣにより査定した場合、発現および精製後に凝集物の比率の低減を示した（図１）。
これらの精製変異体の安定性を、それらが由来したＥＰＯ ＷＴならびに市販形態と比較して、二次安定性スクリーニングで査定する。
タンパク質凝集を経時的に測定する。
要するに、金属波形蓋を有する滅菌ガラスバイアル中に、5℃、37℃および45℃で2週間、タンパク質試料を保存する。設定時点（0週目、1週目および2週目）で、ＨＰＬＣ、ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ、還元および非還元、吸光度およびＩＥＦにより試料を分析し、選定変異体およびＷＴ間の凝集および分解産物における差を同定する。
関連細胞検定、例えばＴＦ‐１細胞増殖検定でも、ＷＴおよび変異体の活性を測定する（以下の実施例２参照）。
結果
ここで、ＥＰＯモノマーに関して、凝集物は高分子量種と呼ばれ、分解産物は低分子量種と呼ばれる。野生型ＥＰＯおよび本発明の代表的ＥＰＯ変異体は5℃で安定であり、モノマー、凝集物および分解産物の割合は、ＳＥＣ‐ＨＰＬＣおよびＳＤＳ‐ＰＡＧＥにより査定した場合、変化は認められなかった。
しかしながら野生型ＥＰＯは、ＳＥＣ‐ＨＰＬＣおよびＳＤＳ‐ＰＡＧＥ（還元および非還元）により検出した場合、37℃および45℃で不安定であった。ＳＥＣ‐ＨＰＬＣは、45℃で2週目の野生型ＥＰＯ試料に関して、モノマーの割合がゼロ時点で80％から20％に低減し、夾雑物は凝集物および分解産物中で上昇する、ということを明示した。
ＥＰＯ変異体（配列番号１７および配列番号９）は、この検定ではより安定であると思われる。ＳＤＳ‐ＰＡＧＥおよびＳＥＣ‐ＨＰＬＣにより査定した場合、37℃および45℃で2週間にわたるモノマー、凝集物および分解産物の割合の有意の変化は認められなかった。これは、図２Ｂにおける配列番号１７のＥＰＯ変異体に関するデータで例証される。
実施例２
ＴＦ‐１細胞増殖検定におけるＥＰＯ変異体の潜在能
ＴＦ‐１細胞増殖検定を用いて、野生型ＥＰＯおよび本発明のＥＰＯ変異体の潜在能を査定した。
ＴＦ‐１は、赤白血病を有する患者から確立されたヒト前骨髄球様細胞株である（Kitamura et al 1989, Blood: 73 p375-80）。ＴＦ‐１細胞株は、生存および増殖に関して因子依存性である。この点で、ＴＦ‐１細胞はＥＰＯに応答し、ヒトＧＭ‐ＣＳＦを含有する培地（4 nm/ml, R & D Systems）中に保持された。分裂中の細胞の新規合成ＤＮＡ中へのトリチウム化チミジンの組込みの低減を測定することにより、ＥＰＯ依存性増殖を確定した。
ＴＦ‐１検定プロトコール
ＴＦ‐１細胞をR & D Systemsから入手し、供給されたプロトコールに従って保持した。検定培地は、5％ウシ胎仔血清および1％ピルビン酸ナトリウムを含有するＧＬＵＴＡＭＡＸ Ｉを伴うＲＰＭＩ‐1640を含んだ。各検定前に、ＴＦ‐１細胞を300 × gで5分の遠心分離によりペレット化し、培地を吸引により除去して、細胞を検定蜂中に再懸濁した。このプロセスをさらに3回反復し、細胞を最終濃度105/mlで検定培地中に再懸濁した。ＥＰＯ変異体（三重反復実験）を検定培地中で所望の濃度に希釈した。次に100 μlの再懸濁細胞を各検定点に付加して、総検定容積を200 μl／ウエルとした。検定プレートを37℃で5％ＣＯ2下で72時間インキュベートした。次に20 μlのトリチウム化チミジン（5 μCi/ml, NEN）を各検定点に付加し、検定プレートをさらに4時間、インキュベーターに戻した。細胞採取機を用いて、ガラス繊維フィルタープレート（Perkin Elmer）上に細胞を採取した。Packard TopCountマイクロプレート液体シンチレーション計数器を用いて、チミジン組込みを確定した。Graphpad Prismソフトウエアを用いてデータを分析した。
結果
野生型ＥＰＯおよびＥＰＯ変異体をＴＦ‐１増殖検定で生物学的活性に関して試験し、ＣＨＯ細胞（Research Diagnostics）中で産生された組換えヒトＥＰＯ（ｒｈ ＥＰＯ）と比較した。野生型ＥＰＯは18 pMのＥＣ50を有したが、これはｒｈＥＰＯの27 pMのＥＣ50と類似した。配列番号９の代表的ＥＰＯ変異体は、4 pMのＥＣ50を有したが、これはＷＴ ＥＰＯの約4.5倍であった（図３）。
安定性スクリーンからのＥＰＯ ＷＴおよび変異体の生物学的活性を、ＴＦ１検定で査定した。5℃で2週間後、ＷＴ ＥＰＯおよびＥＰＯ変異体のＥＣ50は影響を受けなかった。しかしながら45℃で2週間インキュベーション後、野生型ＥＰＯのＥＣ50は5℃の場合より60倍高かった。比較した場合、ＥＰＯ変異体は、ＥＣ50の2倍増を示しただけである（図４）。これは、ＥＰＯ変異体が野生型ＥＰＯより安定であるだけでなく、45℃で2週間インキュベーション後により生物学的に活性であることも実証する。
哺乳類細胞株における野生型ＥＰＯおよびＥＰＯ変異体の発現
野生型ヒトＥＰＯのｃＤＮＡは、Invitrogenから入手した。野生型ＥＰＯまたは本発明のＥＰＯ変異体の完全コード領域をＰＣＲにより増幅し、ｐＥＥ１２．４発現ベクター中に挿入した。トランスフェクションとその後のＭＳＸ耐性に関する選択により、野生型または変異体ＥＰＯを発現するＣＨＯ‐Ｋ１ＳＶ細胞の安定細胞株を確立した。次に状態調節培地上で、組換えタンパク質の精製を実施した。最初に、30,000分子量限外濾過装置（Vevascience）を用いて、試料容積を低減した。濃縮試料を100％エタノールで1:1に希釈し、沈殿物質を遠心分離により除去し、残留溶液を50 mMＭＥＳ、ｐＨ4.75で1:1に希釈することにより状態調節した。次にＳＰセファロースを用いてイオン交換を実施して、組換えタンパク質をＮａＣｌで溶離した。ゲル濾過を実行して、セファデックス75を用いて単量体タンパク質を得た。
次に野生型ＥＰＯおよびＥＰＯ変異体を精製し、EPOGENの同一市販処方物中に処方した。本実施例に記載したように、安定性および生物学的活性に関して試料を試験した。
実施例３
ＥＰＯ変異体のライブラリーの構築ならびに安定性改善に関するＥＰＯ変異体の選択
ライブラリー構築
ＥＰＯ ｃＤＮＡは、Invitrogenから入手した。成熟配列をリボソーム表示線状鋳型に再編成して、これをその後、ライブラリー作製のために用いた。ＤＮＡレベルで、Ｔ７プロモーターをｍＲＮＡへの効率的転写のために５’末端に付加した。ｍＲＮＡレベルで、構築物は原核生物リボソーム結合部位（シャイン・ダルガーノ配列）を含有した。３’末端では、スペーサーとして作用するようｇＩＩＩの一部を付加した（Hanes et al., (2000) Meth Enzymol 328: 404）。メーカーのプロトコール（BD Bioscience）に従って、8.1ヌクレオチド突然変異／分子のエラー率で、エラープローンＰＣＲを用いて、変異体のライブラリーを作製した。これは、4突然変異／分子ならびに約2.5×1010変異体分子のライブラリーを導入した。
安定性に関する選択
少なくとも2つの同時安定性選択圧、例えば：ＤＴＴ、ＨＩＣを用いて、そして温度を上げて選択を実施し、その後、機能的活性に関して選択した。
還元剤ジチオトレイトール（ＤＴＴ）が、翻訳および選択中に存在した。ＤＴＴはジスルフィド架橋形成を妨げるが、これはＥＰＯ安定性の重要な一構成成分である。翻訳後、ＤＴＴとの翻訳混合物を、25℃で疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）マトリックスとともにインキュベートした。ＤＴＴ、ＨＩＣ、ならびに通常の4℃と比較して25℃という高い温度の組合せは、選択圧のためにアンフォールディングおよび／またはミスフォールディングした低安定性変異体を捕獲して、除去するはずである。ＨＩＣマトリックスを、例えば遠心分離または濾過により、混合物から除去する。機能的選択に進行する前には、緩衝液交換ステップも必要であり得る。
下記の事項を除いて、Jermutus et al 2001に記載されたように、ＤＴＴの存在下および非存在下で、in vitro翻訳および選択を実施した：
１． 30℃で10分間、翻訳を実行した。
２． ＨＩＣおよび温度増大を、付加選択圧として用いた。ＤＴＴを用いた場合と用いない場合の翻訳後、ＫＣｌ（1 Mを3 Mに増大）および翻訳と同一濃度のＤＴＴを含有する緩衝液中で翻訳を停止した。次に翻訳混合物を、1 mlの床容積のＨＩＣビーズ（ブチル‐、オクチル‐およびフェニル‐セファロース、Amersham）とともにインキュベートした。25℃で30分間振盪後、ＨＩＣビーズを室温での遠心分離により除去した。
３． 次に上清を4℃に冷却し、機能的選択を実施して、それにより、ＥＰＯ受容体融合タンパク質とともに安定性選択ライブラリーをインキュベート後、融合タンパク質を捕獲し、結合複合体を磁気分離により回収する一方で、非結合複合体を洗い落とした。次にＲＴ‐ＰＣＲにより結合ＥＰＯ変異体をコードするｍＲＮＡを回収し、漸選択プロセスを反復した。ＤＴＴ、ＨＩＣおよび温度増大のより不安定にする組合せを用いて4回の選択を実施した。
ラウンド４からのＰＣＲ産物を、in vitro発現ベクターｐＩＶＥＸ２．３ｄ（Roche）中にクローン化した。要するに産出物をＰＣＲ増幅して、５’Ｎｃｏ１制限部位を、そして３’末端に停止コドンを導入し、その直ぐ後ろにＮｏｔ１制限部位を導入した。停止コドンは、非標識変異体ＥＰＯの発現を可能にした。生成物をゲル精製し、Ｎｏｔ１およびＮｃｏ１（New England Biolabs）で二重消化して、ゲル精製した。消化産物をＮｏｔ１ Ｎｃｏ１消化ｐＩＶＥＸ２．３ｄに結紮し、大腸菌ＴＧ１細胞中で形質転換した。スクリーニングおよびシーケンシングのために、個々のコロニーを96ウエルプレート中に摘み入れた。
一次安定性ＲＩＡにおける単一ＥＰＯ変異体のスクリーニング
Jermutus et al 2001に記載されたように、一次安定性ＲＩＡ（ラジオイムノアッセイ）を用いて、安定性に関してＥＰＯ変異体をスクリーニングした。要するに、各変異体に関して、線状ＤＮＡ鋳型を増幅し、転写し、Ｇ２５セファデックスカラム上でｍＲＮＡ精製して、定量した。各変異体に関して、Ｓ‐35標識化メチオニンの存在下でのin vitro翻訳を、30℃で30分間、二重反復試験で、１つは非還元条件で、そして１つは10 mMＤＴＴ（ジチオトレイトール）中で設定した。0.05％トゥイーン２０を含有するＰＢＳを、翻訳と同一濃度のＤＴＴとともに用いて、翻訳を停止した。翻訳混合物を、ＥＰＯ受容体を被覆したプレート上で、室温で1時間インキュベートした。プレートを、0.05％トゥイーン２０を含有するＰＢＳ中で3回、ＰＢＳ中で3回洗浄した。残存する放射能を0.1 Mトリエチルアミンで溶離し、液体シンチレーション計数により定量した。10 mMＤＤＴ中のＲＩＡシグナルをＤＴＴの非存在下でのＲＩＡシグナルで割ることにより、変異体の安定性の測定値を算定した。変異体が安定であるほど、その比率は大きく、即ちＤＴＴ中で不活性である場合、その比率＝0であり、ＤＴＴ中で完全活性である場合、その比率＝1である。
ラウンド４からの48のクローン化ＥＰＯ変異体を、上記と同様にスクリーニングした。これから、ＷＴより安定である5つのＥＰＯ変異体を同定した。（表２）。
ＥＰＯ変異体の配列分析
ラウンド４からのＥＰＯ変異体をシーケンシングし、5より多い安定変異体の配列を、配列番号２として示されるアミノ酸配列を有するＷＴ ＥＰＯからのアミノ酸配列レベルでの差として、以下に記載する。
配列番号１８
Ｌ１６Ｉ Ｉ２５Ｆ Ｔ２７Ｍ Ｖ６１Ａ Ｒ１３９Ｈ Ｔ１５７Ｖ；
配列番号１９
Ｄ８Ｖ Ｔ２６Ａ Ｔ２７Ａ Ｓ１２６Ｐ Ｇ１５８Ｅ；
配列番号２０
Ｄ８Ｖ Ｔ２７Ａ Ｙ４９Ｎ Ｗ６４Ｒ Ｖ８２Ａ Ｅ８９Ｇ Ｓ１２６Ｐ Ｇ１５８Ｅ；
配列番号２１
Ｔ２６Ａ Ｗ６４Ｒ Ａ１３５Ｖ Ｇ１５８Ｅ；
配列番号２２
Ｄ８Ｖ Ｖ７４Ｆ Ｔ１０７Ａ Ｎ１４７Ｄ；
実施例４
安定性改善を付与する単一および組合せ突然変異の確定
ＥＰＯ変異体に安定性改善を付与する突然変異を確定するために、配列番号３（Ｉ２５Ｆ、Ｔ２７Ｓ、Ｒ１３９Ｈ、Ｇ１５８Ｅ）を参照しながら、単一、二重および三重突然変異の14の組合せを構築した。Ｉ２５Ｆ、Ｔ２７Ｓ、Ｒ１３９ＨおよびＧ１５８Ｅ殻選択される単一および組合せ突然変異は、表３に記述したものと同じである。
ＥＰＯ安定性ＥＬＩＳＡ
ＥＰＯ変異体を、ＤＴＴの存在下および非存在下で無細胞翻訳し、そのプレートを、安定性ＲＩＡに関する場合と同様に被覆した。プレートを1×ＰＢＳで3回洗浄し、50 μlの翻訳化ＥＰＯ試料を各ウエルに付加し、室温で1時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ／トゥイーン中で3回洗浄し、50 μlの抗ＥＰＯ ＨＲＰ接合体（part 890127 R & D Quantikine kit DEP00）を付加し、室温で2時間インキュベートした。プレートを1×ＰＢＳ／トゥイーン中で3回洗浄した。50 μlのＴＭＢを付加し、反応を0.5 MＨＳＯ中で停止させたが、そのとき発色した。吸光度を450 nmで読取り、安定性ＲＩＡに関する場合と同様に、相対安定性を算定した。
表３に示したように、突然変異の数の増大はＥＰＯ変異体の安定性を増大し、変異体配列番号３の安定性増大は、4つの突然変異すべての相乗的組合せによるものであった。
表１
非還元条件後の絶対ＲＩＡシグナルを有する16の変異体に関する安定性ＲＩＡの結果（ＤＴＴ−）、ならびに上記と同様に算定した安定性の測定値（ＤＴＴ＋／ＤＴＴ−）
Figure 2008508854
表２
非還元条件後の絶対ＲＩＡシグナルを有する5つの変異体に関する安定性ＲＩＡの結果（ＤＴＴ−）、ならびに上記と同様に算定した安定性の測定値（ＤＴＴ＋／ＤＴＴ−）
Figure 2008508854
表３
配列番号３を基礎にした突然変異の14の組合せに関する安定性ＥＬＩＳＡの結果（Ｉ２５Ｆ、Ｔ２７Ｓ、Ｒ１３９ＨおよびＧ１５８Ｅのいずれかの組合せ）、ならびに上記と同様に算定した安定性の測定値（ＤＴＴ＋／ＤＴＴ−）
Figure 2008508854
配列番号１
野生型ヒトＥＰＯをコードするヌクレオチド配列
配列番号２
野生型ヒトＥＰＯのアミノ酸配列
Figure 2008508854
図１Ａは、ＳＥＣ‐ＨＰＬＣにより査定した場合の、ＨＥＫ ＥＢＮＡ発現および親和性精製後の、ＥＰＯ ＷＴならびに配列番号１７および配列番号９のＥＰＯ変異体の相対数度パーセンテージ（％ＲＡ）を示す。 図１Ｂは、親和性精製ＷＴ ＥＰＯおよび配列番号１７のＥＰＯ変異体のＳＥＣ‐ＨＰＬＣ痕跡を示す。 図２Ａは、45℃で2週間に亘って保存され、ＳＥＣ‐ＨＰＬＣにより分析された野生型ＥＰＯの相対数度パーセンテージ（％ＲＡ）を示す。 図２Ｂは、45℃で2週間に亘って保存され、ＳＥＣ‐ＨＰＬＣにより分析された配列番号１７のＥＰＯ変異体の％ＲＡを示す。 図３は、ｒｈＥＰＯと比較した場合の精製後の野生型ＥＰＯおよび配列番号９のＥＰＯ変異体ＴＦ１増殖検定の結果を示す：
Figure 2008508854
 図４は、5℃および45℃で2週間後の野生型ＥＰＯおよびＥＰＯ変異体のＴＦ‐１増殖検定の結果を示す。図４Ａは、ＷＴ ＥＰＯに関する結果を示す。 図４Ｂは、配列番号９のＥＰＯ変異体に関する結果を示す。 図４Ｃは、配列番号１７のＥＰＯ変異体に関する結果を示す。 図４Ａ、図４Ｂおよび図４Ｃに略記した各試料のＥＣ50（pM）：
Figure 2008508854

Claims (28)

  1. 配列番号２のヒト野生型エリスロポイエチン（ＥＰＯ）と比較して安定性の測定値における少なくとも5倍の改善を示すエリスロポイエチン（ＥＰＯ）変異体ポリペプチドであって、安定性の測定値がラジオイムノアッセイにおけるＤＴＴの存在下でのＥＰＯ受容体との結合活性の、ならびに同一検定におけるＤＴＴの不存在下でのＥＰＯ受容体との結合活性の比率であるＥＰＯ変異体ポリペプチド。
  2. 以下の組の突然変異から成る群から選択される配列番号２のヒト野生型配列における一組の突然変異を含む、請求項１記載のＥＰＯ変異体ポリペプチド：
    （１）Ｔ２７Ａ Ｋ４５Ｒ Ｋ５２Ｅ Ｗ６４Ｒ Ｌ１３０Ｐ Ａ１３５Ｖ Ｔ１５７Ｉ Ｇ１５８Ｅ；
    （２）Ｉ２５Ｆ Ｔ２７Ｓ Ｒ１３９Ｈ Ｇ１５８Ｅ；
    （３）Ｔ２６Ａ Ｄ４３Ｇ Ｖ６１Ａ Ｌ７５Ｒ Ｖ８２Ａ Ｉ１３３Ｔ Ａ１３５Ｖ Ｔ１５７Ｉ；
    （４）Ｎ２４Ｄ Ｔ２７Ａ Ｔ４０Ａ Ｋ４５Ｒ Ｋ５２Ｅ Ｗ６４Ｒ Ｌ１３０Ｐ Ａ１３５Ｖ Ｔ１５７Ｉ Ｇ１５８Ｅ；
    （５）Ｉ６Ｔ Ｄ８Ｇ Ｋ２０Ｒ Ｋ５２Ｒ Ｗ６４Ｒ Ｖ７４Ｆ Ｔ１０７Ａ Ｌ１０９Ｆ Ｉ１３３Ｎ Ｔ１５７Ｉ；
    （６）Ｉ２５Ｆ Ｃ２９Ｖ Ｃ３３Ａ Ｗ６４Ｒ Ｑ９２Ｒ Ｉ１３３Ｖ Ｇ１５８Ｅ；
    （７）Ｔ２６Ａ Ｔ２７Ａ Ｋ４５Ｒ Ｎ４７Ｄ Ｙ４９Ｎ Ｅ８９Ｇ Ｑ９２Ｒ Ｇ１５８Ｅ；
    （８）Ｉ２５Ｆ Ｖ８２Ａ Ｑ９２Ｒ Ｉ１３３Ｖ Ａ１３５Ｖ Ｋ１５４Ｍ；
    （９）Ｖ７４Ｆ Ｑ８６Ｌ Ｗ８８Ｒ Ｇ１５８Ｅ；
    （１０）Ｔ２７Ａ Ｗ６４Ｒ Ｖ８２Ａ Ｎ８３Ｓ Ｒ１３９Ｈ Ｋ１５４Ｍ Ｔ１５７Ｉ；
    （１１）Ｙ４９Ｈ Ｗ６４Ｒ Ａ６８Ｔ Ｅ７２Ｋ Ｑ９２Ｒ Ｅ１１６Ｇ Ａ１３５Ｖ Ｋ１５４Ｔ；
    （１２）Ｔ２６Ａ Ｔ４０Ａ Ｗ６４Ｒ Ｖ７４Ｆ Ｑ８６Ｐ Ｔ１０７Ａ；
    （１３）Ｉ２５Ｆ Ｎ３８Ｙ Ｋ４５Ｒ Ｆ４８Ｌ Ｗ６４Ｒ Ｗ８８Ｒ Ａ１２８Ｔ Ｉ１３３Ｔ Ｋ１５４Ｍ；
    （１４）Ｉ２５Ｆ Ｗ６４Ｒ Ｖ８２Ａ Ｔ１０７Ａ Ｉ１３３Ａ Ｋ１５４Ｍ；
    （１５）Ｉ２５Ｆ Ｋ５２Ｒ Ｖ５６Ａ Ｎ８３Ｓ Ｅ８９Ｇ Ｑ９２Ｒ Ｇ１５８Ｅ。
  3. 配列番号１７、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５および１６から成る群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項２記載のＥＰＯ変異体ポリペプチド。
  4. 1つまたは複数の付加的突然変異を含む、請求項２記載のＥＰＯ変異体ポリペプチド。
  5. システイン以外である位置２９のアミノ酸を提供するための突然変異を含む、請求項４記載のＥＰＯ変異体ポリペプチド。
  6. 位置３３にチロシンまたはアルギニンを含む、請求項４または請求項５記載のＥＰＯ変異体ポリペプチド。
  7. 位置６、２９、３３、４５、４８、４９、６１、６４、７４、８８、９２、１０７、１０９、１３３、１３５、１５４、１５７および１５８から成る群から選択される1つまたは複数の位置に突然変異を含む、請求項４〜６のいずれか一項に記載のＥＰＯ変異体ポリペプチド。
  8. 前記1つまたは複数の位置の突然変異で提供される残基が以下の表：
    Figure 2008508854
     中で同定される残基から選択される、請求項７記載のＥＰＯ変異体ポリペプチド。
  9. 野生型ヒトＥＰＯと比較して安定性改善を有し、そして以下の組の突然変異：
    （１）Ｔ２７Ａ Ｋ４５Ｒ Ｋ５２Ｅ Ｗ６４Ｒ Ｌ１３０Ｐ Ａ１３５Ｖ Ｔ１５７Ｉ Ｇ１５８Ｅ；
    （２）Ｉ２５Ｆ Ｔ２７Ｓ Ｒ１３９Ｈ Ｇ１５８Ｅ；
    （３）Ｔ２６Ａ Ｄ４３Ｇ Ｖ６１Ａ Ｌ７５Ｒ Ｖ８２Ａ Ｉ１３３Ｔ Ａ１３５Ｖ Ｔ１５７Ｉ；
    （４）Ｎ２４Ｄ Ｔ２７Ａ Ｔ４０Ａ Ｋ４５Ｒ Ｋ５２Ｅ Ｗ６４Ｒ Ｌ１３０Ｐ Ａ１３５Ｖ Ｔ１５７Ｉ Ｇ１５８Ｅ；
    （５）Ｉ６Ｔ Ｄ８Ｇ Ｋ２０Ｒ Ｋ５２Ｒ Ｗ６４Ｒ Ｖ７４Ｆ Ｔ１０７Ａ Ｌ１０９Ｆ Ｉ１３３Ｎ Ｔ１５７Ｉ；
    （６）Ｉ２５Ｆ Ｃ２９Ｖ Ｃ３３Ａ Ｗ６４Ｒ Ｑ９２Ｒ Ｉ１３３Ｖ Ｇ１５８Ｅ；
    （７）Ｔ２６Ａ Ｔ２７Ａ Ｋ４５Ｒ Ｎ４７Ｄ Ｙ４９Ｎ Ｅ８９Ｇ Ｑ９２Ｒ Ｇ１５８Ｅ；
    （８）Ｉ２５Ｆ Ｖ８２Ａ Ｑ９２Ｒ Ｉ１３３Ｖ Ａ１３５Ｖ Ｋ１５４Ｍ；
    （９）Ｖ７４Ｆ Ｑ８６Ｌ Ｗ８８Ｒ Ｇ１５８Ｅ；
    （１０）Ｔ２７Ａ Ｗ６４Ｒ Ｖ８２Ａ Ｎ８３Ｓ Ｒ１３９Ｈ Ｋ１５４Ｍ Ｔ１５７Ｉ；
    （１１）Ｙ４９Ｈ Ｗ６４Ｒ Ａ６８Ｔ Ｅ７２Ｋ Ｑ９２Ｒ Ｅ１１６Ｇ Ａ１３５Ｖ Ｋ１５４Ｔ；
    （１２）Ｔ２６Ａ Ｔ４０Ａ Ｗ６４Ｒ Ｖ７４Ｆ Ｑ８６Ｐ Ｔ１０７Ａ；
    （１３）Ｉ２５Ｆ Ｎ３８Ｙ Ｋ４５Ｒ Ｆ４８Ｌ Ｗ６４Ｒ Ｗ８８Ｒ Ａ１２８Ｔ Ｉ１３３Ｔ Ｋ１５４Ｍ；
    （１４）Ｉ２５Ｆ Ｗ６４Ｒ Ｖ８２Ａ Ｔ１０７Ａ Ｉ１３３Ａ Ｋ１５４Ｍ；
    （１５）Ｉ２５Ｆ Ｋ５２Ｒ Ｖ５６Ａ Ｎ８３Ｓ Ｅ８９Ｇ Ｑ９２Ｒ Ｇ１５８Ｅ
    から成る群から選択される配列番号２のヒト野生型配列における一組の突然変異を含むＥＰＯ変異体ポリペプチドであり、突然変異組内の突然変異のある位置での残基が野生型ＥＰＯにおけるその位置の残基に復帰されるか、あるいは保存的アミノ酸置換を受けるＥＰＯ変異体ポリペプチドであって、当該位置が残基２０、２４、２５、２６、２７、２９、３３、３８、４０、４９、５２、５６、６８、７２、７５、８２、８３、８９、１１６、１２８、１３０および１３９のうちの1つまたは複数から成る群から選択されるＥＰＯ変異体ポリペプチド。
  10. 復帰されるかまたは保存的アミノ酸置換を受ける位置が位置２４、２６、２９、３３、３８、４０および８３のうちの1つまたは複数から成る群から選択される、請求項９記載のＥＰＯ変異体ポリペプチド。
  11. 請求項１〜１０のいずれか一項に記載のＥＰＯ変異体ポリペプチドをコードする核酸。
  12. 請求項１１記載の核酸を含むベクター。
  13. 請求項１２記載のベクターを含む宿主細胞。
  14. 請求項１〜１０のいずれか一項に記載のＥＰＯ変異体ポリペプチドを含む組成物。
  15. 製薬上許容可能な賦形剤を含む、請求項１４記載の組成物。
  16. ヒトまたは動物身体の治療方法に用いるための、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のＥＰＯ変異体ポリペプチド。
  17. 貧血の治療に用いるための薬剤の製造における、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のＥＰＯ変異体ポリペプチドの使用。
  18. 貧血が慢性腎不全、癌化学療法またはＨＩＶに関連する、請求項１７記載の使用。
  19. 野生型ヒトＥＰＯと比較して安定性改善を有するＥＰＯ変異体ポリペプチドの製造方法であって、以下の：
    コード核酸からの発現により請求項１〜１０のいずれか一項に記載のＥＰＯ変異体ポリペプチドを産生し；
    安定性改善に関して試験する
    ことを包含する方法。
  20. 試験前にＥＰＯ変異体を単離するステップを包含する、請求項１９記載の方法。
  21. それからの発現の前にＥＰＯ変異体をコードする核酸を提供するよう、野生型ヒトＥＰＯポリペプチドまたはＥＰＯ変異体ポリペプチドであるＥＰＯポリペプチドをコードする核酸を突然変異化することを包含する、請求項１９または請求項２０記載の方法。
  22. 野生型ヒトＥＰＯと比較して安定性改善を有するＥＰＯ変異体を同定するかまたは生成する方法であって、以下の：
    請求項１〜１０のいずれか一項に記載のＥＰＯ変異体ポリペプチドをコードする核酸を突然変異化して、変更アミノ酸配列を有する1つまたは複数のＥＰＯポリペプチド（「ＥＰＯ変異体」）をコードする配列を有する1つまたは複数の核酸を提供し；
    単数または複数の核酸を発現して、単数または複数のコード化ＥＰＯ変異体を生成し；
    このように生成された単数または複数のＥＰＯ変異体を野生型ヒトＥＰＯと比較して改善された安定性に関して試験する
    ことを包含する方法。
  23. ＥＰＯ変異体のライブラリーを産生し、そして安定性改善に関して前記ライブラリーの変異体を試験することを包含する、請求項２２記載の方法。
  24. 安定性改善を有する1つまたは複数のＥＰＯ変異体を同定することを包含する、請求項２３記載の方法。
  25. 前記1つまたは複数のＥＰＯ変異体を単離することを包含する、請求項２４記載の方法。
  26. 前記1つまたは複数のＥＰＯ変異体をコードする核酸配列を単離することを包含する、請求項２４または請求項２５記載の方法。
  27. 少なくとも1つの付加的構成成分を含む組成物中に前記1つまたは複数の単離ＥＰＯ変異体を処方することを包含する、請求項２６記載の方法。
  28. 請求項１〜１０のいずれか一項に記載のＥＰＯ変異体ポリペプチドをそれを必要とする個体に投与することを包含する治療方法。
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