JP2008503221A - Prrsvサブユニットワクチン - Google Patents
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Abstract
PRRSV ORF1の少なくとも一部領域を含む抗PRRSV有効性ワクチン。このようなワクチンをすれば、PRRSVに感染しやすい動物に免疫反応を誘発する。さらには、本発明に係る組成物は、PRRSVの重症度および/またはPRRSV罹患率の軽減だけでなく、PRRSVに対する防御免疫反応などの免疫反応の強化をもたらす。ORF1の選択された部分領域は、単独での使用、1または複数の他のPRRSV ORFとの組合わせ、および他のPRRSVワクチンとの組合わせでの使用することができる。
Description
本願は、2004年6月17日に出願された仮出願番号第60/581,350号による利益を主張し、そこでの教示および内容は本明細書に記載されているものとして取り込まれる。
配列表
本願に添付する配列表の印刷物は、同一内容のものがCD−ROMに記録されたコンピュータ読取可能なASCII形式ファイルとしても提出されている。
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発明の技術分野
本発明は、広くは豚繁殖・呼吸器障害症候群(PRRS)のためのワクチンに関する。より具体的には、本発明は、PRRSウイルス(PRRSV)のDNAサブユニットを含むワクチンの投与によるブタ(swine)のPRRS防止に関する。より詳細には、本発明は、ブタにPRRSVに対する感染防御免疫力をつけるDNAサブユニットワクチンにおけるオープンリーディングフレーム1(ORF1)の使用に関する。さらに詳細には、本発明は、ORF1の選択された部分領域の単独での使用、またはPRRSVゲノムの他の部分領域との組合わせまたはPRRSVに対する他のワクチンとの組合わせでの使用に関する。
本発明は、広くは豚繁殖・呼吸器障害症候群(PRRS)のためのワクチンに関する。より具体的には、本発明は、PRRSウイルス(PRRSV)のDNAサブユニットを含むワクチンの投与によるブタ(swine)のPRRS防止に関する。より詳細には、本発明は、ブタにPRRSVに対する感染防御免疫力をつけるDNAサブユニットワクチンにおけるオープンリーディングフレーム1(ORF1)の使用に関する。さらに詳細には、本発明は、ORF1の選択された部分領域の単独での使用、またはPRRSVゲノムの他の部分領域との組合わせまたはPRRSVに対する他のワクチンとの組合わせでの使用に関する。
従来技術の説明
PRRSは、世界中の養豚業における主な病気である。PRRSは、PRRSV感染により引き起こされる。現在、正しく使用すれば、ブタにPRRSV感染によって生じる病態に対する抵抗力をつけさせることができる市販の改良型生ワクチン(MLV)がある。PRRSV MLVワクチンは、有効な免疫反応の惹起を保証するために、ワクチンを予防接種した動物での複製が必要である(非特許文献1など参照)。しかしながら、このよな複製には、PRRSV MLVが、ワクチン接種後、数週間もの間、動物中で存続しうる点、また、PRRSV陰性のブタに放散される危険性もあるという点で問題がある。ワクチン接種動物からのPRRSV陰性集団へのPRRSV MLV放散を防御するための適切なバイオセキュリティ手段をもたないブタの群では、ワクチン接種動物からのPRRSV MLV放散は問題となるであろう。何百万ものPRRS MLVが保証もなく使われてきたが、より毒性の強い野生型PRRSV株に先祖返りするPRRS MLVの能力について、散発的な文献報告も見られる。PRRS MLV放散および毒性への先祖返りの問題の解決を図って、不活性化PRRSウィルス(すなわちPRRS KV)からなるワクチンの使用による試みもなされてきた。しかしながら、PRRS KVは、ワクチン接種したブタでの強い体液性反応を惹起するにも拘らず、PRRS関連疾患の予防には効能がないという研究結果が示されてきた。
PRRSは、世界中の養豚業における主な病気である。PRRSは、PRRSV感染により引き起こされる。現在、正しく使用すれば、ブタにPRRSV感染によって生じる病態に対する抵抗力をつけさせることができる市販の改良型生ワクチン(MLV)がある。PRRSV MLVワクチンは、有効な免疫反応の惹起を保証するために、ワクチンを予防接種した動物での複製が必要である(非特許文献1など参照)。しかしながら、このよな複製には、PRRSV MLVが、ワクチン接種後、数週間もの間、動物中で存続しうる点、また、PRRSV陰性のブタに放散される危険性もあるという点で問題がある。ワクチン接種動物からのPRRSV陰性集団へのPRRSV MLV放散を防御するための適切なバイオセキュリティ手段をもたないブタの群では、ワクチン接種動物からのPRRSV MLV放散は問題となるであろう。何百万ものPRRS MLVが保証もなく使われてきたが、より毒性の強い野生型PRRSV株に先祖返りするPRRS MLVの能力について、散発的な文献報告も見られる。PRRS MLV放散および毒性への先祖返りの問題の解決を図って、不活性化PRRSウィルス(すなわちPRRS KV)からなるワクチンの使用による試みもなされてきた。しかしながら、PRRS KVは、ワクチン接種したブタでの強い体液性反応を惹起するにも拘らず、PRRS関連疾患の予防には効能がないという研究結果が示されてきた。
メン(Meng), X.J., 豚繁殖・呼吸器障害症候群の多様性(Heterogeneity of Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus):現ワクチンの効果および将来のワクチン開発についての示唆(Implication for Current Vaccine Efficacy and Future Vaccine Development);74 Vet. Micro., 2000, 309-329
したがって、PRRS MLVに付随するような問題を生じることなく防御免疫反応を惹起しうるワクチン接種方法およびワクチンが当分野で求められている。好ましくは、ワクチンの投与は、ワクチン接種した動物において、活性的に複製せず、強い体液性および細胞性免疫反応を惹起することである。
本発明は、特有のかつ従来技術の問題を解決し、PRRSV DNAワクチンの供与により、当分野の現状を著しく改善させる。理論的には、PRRSV抗原を発現するDNAワクチンプラスミドは、PRRSV抗原(すなわちPRRS MLVの類)合成の鋳型として働くが、動物において、活性的に複製しない特徴も有する(すなわちPRRS KVの類)。PRRSVに対する防御的な宿主反応を惹起するために必要な防御免疫源は知られていない。PRRS MLVは、ワクチン接種したブタで防御反応を惹起しうることから、ワクチン接種した動物におけるPRRS MLV複製は、ワクチン接種した動物における強い体液性および細胞性免疫反応の両方を惹起するにちがいないと考えられる。
PRRSVのORF1は、PRRSVの複製および新世代発生のために必要な複製機構をコード化する。ORF1は、ORF1レプリカーゼ複合体を含む、ORF1aおよびORF1bで示される2つの領域をもつ(ディー(Dea)ら,豚繁殖・呼吸器障害症候群(Prrs)ウィルスの構造タンパク質についての最近の知識:北米分離株と欧州分離株との比較;145(4)Archives of Virology, 659-688 (2000))。レプリカーゼでコード化されたタンパク質は、他のウィルスファミリーにおけるキーとなる免疫源であろうと考えられる(ライトナー(Leitner)ら,DANおよびRNA系ワクチン:理論,進歩および展望;18 Vaccine 765-777 (2000))。
細胞がPRRSVに感染すると、ウィルスのレプリカーゼ活性は、細胞が感染している間レプリカーゼ関連抗原が発現される際の強力な補助効果をもたらす。レプリカーゼ関連抗原は、トランスフェクトされた細胞中に発生した“危険信号”として作用し、強い宿主反応(すなわちIFN,HSP,アポトーシス)を誘発する。そのため、レプリカーゼ関連“危険信号”は、非複製PRRS(すなわちPRRS KVにおける不活性化された抗原)が攻撃からの防御をもたらさないのに反して、なぜPRRS MLVが防御を誘発しうるかの主要因となり得る。
ORF1は、真核生物細胞でのトランスフェクションおよび適切な発現が困難な、ほぼ12,000のヌクレオチド長である。そのため、さまざまな病原体の防御免疫源の決定手段として発現ライブラリー免疫法(ELI)を用い、ORF1を連続的かつ随意に小区分に分割した。ELIは、特定の病原体のゲノムを小さな断片に切断する。該断片は、DNAワクチンベクター中にクローニングされ、その後どの断片が免疫反応を誘発する能力を有するかを決定するために宿主に投与される(ジョンストン(Johnston)およびバリー(Barry);ゲノムワクチン接種の遺伝学;15(8)Vaccine,808-809 (1997))。好ましくは、免疫反応が防御される。
本発明は、ORF1産生タンパク質に対する宿主の免疫反応はPRRSV攻撃からの防御に必須であるとの前提に基づいている。DNAワクチンベクターにおいて、PRRSV ORFs2−7をコード化する領域を配置することは、これらORFsが317−720ヌクレオチド長の範囲であることから、比較的容易である。上記したとおり、PRRSVのORF1領域のサイズは、ほぼ12,000のヌクレオチド長である。このサイズの領域をDNAワクチンベクターナ中に配置しても、真核生物細胞でのトランスフェクション、それに続く発現が容易にいくといえない。したがって、ORF1の全領域の適切な発現をより確実にするためには、ORF1領域を小区分に分断することは必須である。
発現ライブラリー免疫法(ELI)は、さまざまな病原体の防御免疫源の決定手段として用いられてきた。ELIは、特定の病原体のゲノムを小さな断片に切断する手法を用いる。これら小断片は、次いでDNAワクチンベクター中にクローニングされ、その後どの断片が免疫反応を誘発する能力を有するかを決定するために宿主に投与される。本発明では、配列的に、PRRSVゲノム領域をコード化するORF1からなるPRRSV DNAワクチンの開発用にELI法を改良した。この方法をSELI(配列発現ライブラリー免疫法)と表記する。これは、DNAワクチンとして完全なORF1領域を用いたバーフォード(Barfoed)ら(PRRSウィルスのオープンリーディングフレーム1−7をもつブタのDNAワクチン接種)と大きく異なる。
本発明に係るワクチンは、PRRSV ORF1の部分領域のみ、PRRSV ORF1の他の部分領域との組合わせ、およびPRRSV感染に対する免疫反応を発生させる効果のある他の組成物たとえば他のPRRSVワクチンなどとの併用からなる。本発明の目的に有用なORF1部分領域はワクチン接種される動物において免疫反応を引き出す能力のあるサイズである。当該部分領域の含有する塩基対は、約9,000以下が好ましい。より好ましくは、ORF-1部分領域は、約21−9,000の間の連続したヌクレオチド塩基対、一層好ましくは約21−6,000の間の連続したヌクレオチド塩基対、さらに好ましくは約21−3,000の間の連続したヌクレオチド塩基対、さらに好ましくは約21−2,000の間の連続したヌクレオチド塩基対、さらに好ましくは約21−1,000の間の連続したヌクレオチド塩基対、さらに好ましくは約21−500の間の連続したヌクレオチド塩基対、さらに好ましくは約21−300の間の連続したヌクレオチド塩基対、さらに好ましくは約21−150の間の連続したヌクレオチド塩基対、さらに好ましくは約21−75の間の連続したヌクレオチド塩基対、さらに好ましくは約21−50の間の連続したヌクレオチド塩基対、さらに好ましくは約21−25の間の連続したヌクレオチド塩基対、さらに好ましくは約21−23の間の連続したヌクレオチド塩基対、特に好ましくは少なくとも約21の連続したヌクレオチド塩基対を含有する。どのPRRSV株のどのORF1またはその一部のいずれも、本発明の目的のために用いることができるが、毒性の強い株を用いることが好ましい。
選択された部分領域(または各部分領域)は、適当な発現ベクター中にクローニングされる。適当なベクターとしては、アデノウィルスベクター、赤痢菌(Shigella)ベクター、pVC1650(バレンティス社(Valentis Inc.)(バーリンゲーム,カリフォルニア州)、WRG720(W.R.グレース(Grace),ニューヨーク,ンユーヨーク州)、およびpcDNA3(インヴィトロジェン(Invitrogen),カールズバッド,カリフォルニア州)などが例示される。いくつかの好ましいベクターは、前初期サイトメガロウィルスプロモーター、イントロンA、およびポリaアデニル化部分領域(すなわち、ウシ成長ホルモン(BGH)またはヒト成長ホルモン(HGH))を含む。さらに、精製PRRSVタンパク質は、たとえば、バキュロウィルス発現系を用いて、昆虫細胞培養物中で発現することができる。その後、このようなタンパク質は、助剤と組み合わされ、投与される。勿論、本発明分野の当業者は、真核生物細胞中でさまざまなPRRSV ORFsの発現を誘導することができる適当な発現系およびベクターを選択することができる。好ましくは、各ORF1部分領域を適当な発現ベクター中にクローニングした後、クローンの配置を確認する。
本発明の一実施態様例では、本発明を実施する際に使用するものとして、PRRSVウィルスVR-2332が選択された。ORF1の13重複クローンを発生するため、ジーンバンク(Genbank)U87392を用いた。このORF1は、12,071ヌクレオチド塩基対を含む。各部分領域のサイズは、773ないし975bpの範囲であった。各クローンは、アルファベットA−Mで表し、クローンA(配列番号2)は939bp、クローンB(配列番号3)は957bp、クローンC(配列番号4)は976bp、クローンD(配列番号5)は954bp、クローンE(配列番号6)は939bp、クローンF(配列番号7)は957bp、クローンG(配列番号8)は957bp、クローンH(配列番号9)は852bp、クローンI(配列番号10)は917bp、クローンJ(配列番号11)は972bp、クローンK(配列番号12)は966bp、クローンL(配列番号13)は783bp、クローンM(配列番号14)は774bpである。クローンA−Hは、ORF1の領域1aに由来し、クローンI−Mは、ORF1の領域1bに由来する。
クローンAは、真性のORF1 ATG開始コドンを用いた。残余のORF1クローンは、それらの5’端に付加したインフレームATG開始コドンを用いた。これら各クローンは、それぞれDNA発現ベクターpVC1650中にクローニングされた。このベクターは、前初期サイトメガロウィルスプロモーター、およびイントロンAを含み、真核生物細胞中での種々のPRRSV ORFsの発現を誘導する。表1は、各クローンおよび各クローンがヌクレオチド配列のどの領域由来かについての情報を示す。
表1 BIV PRRSV ORF1a/1b配列発現ライブラリー免疫法(SELI)クローン
*注:オリジナルのHおよびIクローンは、ORF1a/1bマイナス1フレームシフト領域の側面に位置し、新プライマーは若干小さいRT−PCR産生物をもたらすように設計された。
その後、各部分領域は、単独でだけなく種々組合わせて、他のPRRSV ORFsを含むワクチンの各調製に用いられた。
他の実施態様例では、クローンA−MおよびORFs2−6のクローンは、pVC1650発現ベクター中にクローニングし、ORF7のクローンは、WRG720発現ベクター中にクローニングした。勿論、本発明分野の当業者は、適当な発現系およびベクターを選択することができる。また、本発明の核酸配列は、標準的技術、特に制限されないが、たとえば一般的な分子クローニング法、突然変異生成法および化学的核酸合成法などにより製造することができる。
本発明の目的に沿うものとして、少なくとも75%の配列同一性をもつDNA配列、好ましくはクローンA−Mのいずれかとの配列同一性が、少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、さらに好ましくは少なくとも85%、さらに好ましくは少なくとも90%、さらに好ましくは少なくとも95%、さらに好ましくは少なくとも98%、さらに好ましくは少なくとも99%、特に好ましくは100%であるDNA配列は、本発明の範疇といえる。
本発明の一態様において、クローンA−Mは、各々ワクチン成分として、単独で使用される。動物へのワクチン予防接種は、どのような慣用手段による投与でもよい。投与方法としては、たとえば経口、経皮、静脈注射、皮下、筋肉内、眼球内、腹腔内、直腸内、膣内、鼻腔内、胃内、気管内、肺内またはそれらいずれかの組合わせなどが挙げられる。好ましい投与の形態は、筋肉内、皮下および鼻腔内である。所望または必要に応じて、追加の免疫接種を、1回または数回、種々の間隔で、行なうことができる。このようなワクチン投与すれば、有毒性PRRSVの攻撃後、動物中の免疫反応が誘発され、PRRSV感染の臨床的徴候が、罹患率および/または重症度の点で軽減される。
本発明の他の態様において、クローンA−Mの組合わせで、上記のように動物に投与される。この組合わせは、2以上の上記クローンを含む。いくつかのこれらクローン(A,B,C,D,E,HおよびJ)は、豚抗PRRSV回復期血清を用いてトランスフェクションの後、IFA反応を誘発するため、これらクローンの組合わせは本発明の目的にとって好ましい。
本発明の他の態様において、クローンA−Mは、上記のように、それぞれ単独でも、組合わせでも、PRRSVの他のORF(またはs:複数)と組合わせてワクチン調製に用いられる。好ましいORFsとしては、ORFs2−7が挙げられる。
本発明の他の態様において、PRRSV ORF DNAは、他のPRRSVワクチンと組合わされる。好ましくは、該ワクチンは、PRRSV ORF1 DNAの追加に先立って、免疫反応の惹起に効果的である。
本発明のさらなる他の態様として、ベクターが供される。本発明に係るベクターは、PRRSV ORF1 DNAの少なくとも一部を含む外来DNA(ベクター由来ではない)が挿入されている。好ましい形態として、該ベクターはプラスミドである。PRRSV ORF1 DNAの該部分領域は、好ましくは、PRRSV ORF1 DNA由来の少なくとも21の連続したヌクレオチドを有する。いくつかの好ましい形態において、該部分領域は、配列番号1−14のいずれか1つと少なくとも85%の配列同一性をもつ配列およびそれらの組合わせからなる群より選ばれる配列由来の少なくとも150の連続したヌクレオチドを有するであろう。
上記組成自体と同様に、配列同一性をもつパーセントおよび配列の長さは、上記のようにさまざまであってよい。他の好ましい形態では、上記ベクターは、PRRSV DNAの第二の部分領域をさらに含む。この第二の部分領域は、ORF1以外のPRRSV ORF由来の最少21の連続したヌクレオチド、ORF1由来の少なくとも21の連続したヌクレオチド、およびそれらの組合わせからなる群より選ばれる。ORF1由来の追加の21連続したヌクレオチドを有する実施態様において、これら21ヌクレオチドは、PRRSV ORF1 DNAの第1の部分領域に含まれる少なくとも21のヌクレオチドとは別異である。ベクター構築に用いられるPRRSV DNAがPRRSVの毒性株から誘導されることも好ましい。
本発明の他の態様は、本発明のプラスミドを含む宿主細胞を包含する。たとえば、上記のような各種ORF1断片の誘導によって作出されるプラスミドを含むことができる。このような細胞は、好ましくは、PRRSV ORF1 DNA由来の少なくとも21の連続したヌクレオチドを含むプラスミドを含有する。他の好ましい形態において、上記細胞は、配列番号1−14のいずれか1つと少なくとも85%の配列同一性をもつ配列およびそれらの組合わせからなる群より選ばれる配列由来の少なくとも150の連続したヌクレオチドを含むプラスミドを含有する。さらに別の好ましい態様において、上記細胞中のプラスミドは、ORF1以外のPRRSV ORF由来の最少21の連続したヌクレオチド、ORF1由来の少なくとも21の連続したヌクレオチド、およびそれらの組合わせからなる群より選ばれるPRRSV DNAの第二の部分領域をさらに含む。上記細胞中に含有されるプラスミドを発生させるために用いられるPRRSV DNAがPRRSVの毒性株から誘導されることも好ましい。
本発明の他の態様において、本発明の組成物は、PRRSV感染によって引き起こされる重篤な症状および徴候を完全予防または軽減する方法だけでなく、動物における免疫反応の惹起方法に有用である。
本発明の組成物は、医薬品上、許容しうる助剤、担体、および/または賦形剤を含有することができる。
本明細書では、以下の定義を用いる。“配列同一性”とは、公知のとおり、2以上のポリペプチド配列間または2以上のポリヌクレオチド配列間の関係、すなわち、参照配列と、該参照配列との対比のための所定配列との間の関係をいう。配列同一性は、配列がもっとも高度に配列類似性を生じるように最適化調整した後、所定配列と参照配列とを対比することによって決定され、それら配列の鎖同士の合致により決定される。そのような調整の際には、配列同一性は、位置ごとの塩基で確認され、すなわち、その配列は、もし特定の位置において、ヌクレオチドまたはアミノ酸残基が同一であれば、その位置で“同一”である。そのような位置同一数の合計を、参照配列のヌクレオチドまたは残基数の合計で除すれば、配列同一性(%)が得られる。
配列同一性は、特に限定されないが、以下の文献に記載された公知の方法により容易に算出することができる。Computational Molecular Biology,レスク(Lesk),A.N.,Oxford University Press発行,New York(1988)、Biocomputing:Informatics and Genome Projects,スミス(Smith),D.W.,Academic Press発行,New York(1993)、Computer Analysis of Sequence Data,パートI,グリフィン(Griffin),A.M.およびH.G.,Humana Press発行,New Jersey(1994)、Sequence Analysis in Moleculer Biology,フォン ハインゲ(von Heinge),G.,Academic Press(1987)、Sequence Analysys Primer,グリブスコフ(Gribskov),M.およびヅブリュー(Devereux),J.M.Stockton Press,New York(1991)、およびカリロ(Carillo),H.およびリップマン(Lipman),D.,SIAM J.Applied Math.,48:1073(1988)。これらの教示は引用することにより本明細書に記載されているものとする。
配列同一性を決定するための好ましい方法は、試験された配列同士の一致が最大となるように設計されることである。配列同一性の決定法は、所定配列間の配列同一性を決定するため公に入手可能なコンピュータプログラムに体系化されている。そのようなプログラムとしては、特に限定されないが、GCGプログラムパッケージ(ヅブリュー(Deveruex),J.ら,Nucleic Acids Research,12(1):387(1984))、BLASTP,BLASTNおよびFASTA(アルツシュール(Altschul),S.F.ら,J.Molec.Biol.,215:403-410(1990))などが例示される。BLASTXプログラムは、NCBIおよび他のソース(BLASTマニュアル,アルツシュール(Altschul),S.ら,NCBI NLM NIH ベセスダ,MD 20894,アルツシュール(Altschul),S.F.ら,J.Molec.Biol.,215:403-410(1990)、これらの教示は引用することにより本明細書に記載されているものとする)。これらプログラムは、所定配列と参照配列との間での配列同一性を最大レベルにするために、デフォルトギャップウェイトを用いて、配列を最適化調整する。
例として、参照ヌクレオチド配列に対して少なくともたとえば95%の“配列同一性”のヌクレオチド配列をもつポリヌクレオチドとは、所定ポリヌクレオチドの配列が、参照ヌクレオチド配列の各100個のヌクレオチドあたり、突然変異を5個まで含んでよいことを除き、所定ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が、参照配列と同一であることを意味する。換言すれば、参照ヌクレオチド配列に対して少なくとも95%同一性のヌクレオチド配列をもつポリヌクレオチドでは、参照配列の5%のヌクレオチドまでは欠失されるか他のヌクレオチドで置換されていてもよく、または参照配列の全ヌクレオチドの5%までのヌクレオチド数が参照配列中に挿入されていてもよい。このような参照配列の突然変異は、参照ヌクレオチド配列の5’または3’末端で起きてもよく、またはこれら末端間のいずれかの位置で、参照配列中または参照配列内の1もしくは複数の連続基中のヌクレオチド間で個別に点在して起きてもよい。
同様に、参照アミノ酸配列に対して少なくともたとえば95%の配列同一性をもつ所定アミノ酸配列をもつポリペプチドとは、所定ポリペプチド配列が、参照アミノ酸配列の各100個のアミノ酸あたり5個のアミノ酸の変更を含んでよいことを除き、所定ポリペプチドのアミノ酸配列が、参照配列と同一であることを意味する。換言すれば、参照アミノ酸配列と少なくとも95%配列同一性をもつ所定ポリペプチド配列を得るためには、参照配列におけるアミノ酸残基の5%までは欠失されるか他のアミノ酸で置換されていてもよく、または参照配列中のアミノ酸残基の総数に対し5%までのアミノ酸数が参照配列中に挿入されていてもよい。このような参照配列の変更は、参照アミノ酸配列のアミノまたはカルボキシ末端で起きてもよく、またはこれら末端間のいずれかの位置で、参照配列中または参照配列内の1または複数の連続基内の残基間で個別に点在して起きてもよい。好ましくは、同一ではない残基の位置は、保存アミノ酸の置換数だけ異なる。しかしながら、同類置換は、配列同一性の決定時には、一致とみなされない。
同様に、本明細書で使用される“配列相同性”とは、2つの配列の類似性の決定方法に関する。配列相同性の決定には、2以上の配列を、上記のように最適化調整し、必要に応じてギャップを導入する。しかしながら、“配列同一性”とは対照的に、配列相同性の決定では、保存アミノ酸の置換は、一致として数えられる。換言すれば、参照配列と95%配列相同性を有するポリペプチドまたはポリヌクレオチドを得るには、参照配列中のアミノ酸残基またはヌクレオチドの95%が一致または他のアミノ酸もしくはヌクレオチドと同類置換を含む必要があり、または参照配列中の全アミノ酸残基もしくはヌクレオチド数の5%までの数のアミノ酸もしくはヌクレオチドが、ただし同類置換は含まないが、参照配列中に挿入されていてもよい。
“同類置換”とは、アミノ酸残基もしくはヌクレオチドを、全体的な機能を顕著に変化させない、たとえばサイズ、疎水性などの同様な特徴または特性をもつ他のアミノ酸残基もしくはヌクレオチドで置換することをいう。
“単離された”とは、その自然状態から“人間の手により”変化させられることを意味し、すなわち、もしそれが自然に生じるならば、そのオリジナルの環境から変更が加えられたか、または取出されたか、またはその両方を意味する。たとえば、生体内に自然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、“単離され”ていないが、その自然状態での共存物から分離されたそれと同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、本明細書で用いられる用語としての“単離された”にあたる。
“核酸”とは、デオキシリボ核酸(DNA)などのポリヌクレオチドをいい、リボ核酸(RNA)にも適用する。また、この用語は、ヌクレオチド類似体からなるRNAまたはDNAの類似体も同等のものとして含み、さらに、単鎖(センスまたはアンチセンス)および二重鎖のポリヌクレオチドが記載されている態様にも適用されると解すべきである。
“プロモータ”とは、プロモータに動作可能に結合された選択されたDNA配列の発現を調整し、細胞中で該選択されたDNA配列の発現を生じさせるDNA配列をいう。該用語は、“組織特異性”プロモータ、すなわち選択されたDNA配列の発現を特異的細胞(たとえば特異的組織の細胞)においてのみ生じさせるプロモータを包含する。また、該用語は、最初、1つの細胞において選択されたDNAの発現を調整するが、同様に他の細胞でも発現を生起する、“リーキー”と称されるプロモータをも包含する。該用語は、さらに、組織非特異性プロモータおよび構造的に発現するまたは誘導性である(すなわち発現レベルが調整可能)プロモータも包含する。
“トランスフェクション”は、たとえば発現ベクターを介して、核酸媒介遺伝子導入により受容細胞中への核酸の導入を意味する。本明細書において、“形質転換”は、細胞が外来DNAおよびRNAを取り込んだ結果、細胞の遺伝子型が変化し、たとえば、形質転換した細胞がポリペプチドの組み換え体を発現するか、または導入された遺伝子由来のアンチセンス発現の場合には、自然発生形態のタンパク質の発現を妨害するプロセスをいう。トランスフェクションは化学試薬(すなわち脂質)を用いてもよい。
“ベクター”の語は、そこに結合している他の核酸を移送する能力を有する核酸分子をいう。好ましいベクターの一類型は、エピソーム、すなわち過剰染色体複製能力のある核酸である。好ましいベクターは、それが結合している核酸が自己複製および/または発現能力をもつものである。それが動作可能に結合された遺伝子の発現を誘導しうるベクターは、本明細書において、“発現ベクター”という。一般に、組み換えDNA技術で有用性ある発現ベクターは、しばしば、“プラスミド”の形態であり、プラスミドは、通常、環状二重鎖DNAループをいい、それのベクターの形態では染色体に結合していないものである。本明細書において、プラスミドがベクターのもっとも一般的な使用形態であることから、“プラスミド”および“ベクター”は、相互置き換えられる語として使用される。ベクターは、他のDNA断片を挿入して該挿入断片の複製をもたらすことができる他のレプリコン、たとえばファージまたはコスミドなどをも含む。本発明は、同等の機能を発揮し、本発明後に公知技術となるような他の形態の発現ベクターも含むことも意図する。
核酸またはポリヌクレオチドの“増幅”は、核酸またはポリヌクレオチド分子の1以上の複製生成(指数増幅)または核酸またはポリヌクレオチド分子の相補体のみの1以上の複製生成(リニア増幅)を達成する方法であればどの方法でもよい。増幅方法としては、変性、オリゴヌクレオチドプライマーアニーリングおよび好熱性鋳型依存ポリヌクレオチドポリメラーゼによるプライマー伸長のサイクル繰り返しに基づき、プライマーに側面配置されたポリヌクレオチド検体の所望配列のコピーを指数増加的にもたらすポリメラーゼ連鎖反応(PCR)が挙げられる。DNAの逆鎖に対合する2種のPCRプライマーは、一方のプライマーのポリメラーゼで触媒された伸長産生物が他方の鋳型鎖として働くように配置されると、その長さがオリゴヌクレオチドプライマー5’端間の距離で定められる別個の二重鎖断片が累積することになる。
このような増幅を誘導する試薬としては、オリゴヌクレオチドプライマー、ヌクレオチドポリメラーゼおよびヌクレオシド三リン酸たとえばデオキシアデノシン三リン酸(dATP)、デオキシグアノシン三リン酸(dGTP)、デオキシシチジン三リン酸(dCTP)およびデオキシチミジン三リン酸(dTTP)などが挙げられる。
他の増幅方法としては、単鎖オリゴヌクレオチドプライマーを用いる単鎖ポリヌクレオチドの増幅、リガーゼ鎖反応(LCR)、核酸増幅法(NASBA)、Q-β-レプリカーゼ法および3SRなどが挙げられる。
本明細書に記載されたすべての参考文献の教示および内容は、引用により記載されているものとして取り込まれる。
本明細書に記載されたすべての参考文献の教示および内容は、引用により記載されているものとして取り込まれる。
本発明の好ましい実施態様
以下に示す実施例は、本発明の好ましい実施態様を示す。しかしながら、これら実施例は本発明の説明として提示されるものであり、これにより何ら本発明の総体的な範囲を限定するものでないと理解されるべきである。
以下に示す実施例は、本発明の好ましい実施態様を示す。しかしながら、これら実施例は本発明の説明として提示されるものであり、これにより何ら本発明の総体的な範囲を限定するものでないと理解されるべきである。
(実施例1)
この実施例は、PRRSVゲノムのさまざまな領域を含むDNAワクチンの効果に関するデータを示す。本実施例は、Spring Prairie Colony(ハーレー、ミネソタ州56549)よりン入手したPRRSV陰性の性別混合豚40頭で開始した。研究の開始時、豚は3−4週齢であった。研究の間、豚には、動物の大きさ、年齢、状態にみあって充分に給餌した。水は無制限に与えた。
この実施例は、PRRSVゲノムのさまざまな領域を含むDNAワクチンの効果に関するデータを示す。本実施例は、Spring Prairie Colony(ハーレー、ミネソタ州56549)よりン入手したPRRSV陰性の性別混合豚40頭で開始した。研究の開始時、豚は3−4週齢であった。研究の間、豚には、動物の大きさ、年齢、状態にみあって充分に給餌した。水は無制限に与えた。
PRRSV DNAワクチン作出のために、PRRSウィルスから19のcDNAクローンを作出した。pRRSゲノムのオープンリーディングフレーム(ORF)1a/1b領域を配列描写する13のcDNAクローンを作出した。クローンAは、真性のORF1aATG開始コドンを用いる。残余のORF1a/1bクローンBないしMは、それぞれのの5’端に付加したATG開始コドンを有していた。上記のすべてのクローンは、それぞれDNA発現ベクターpVC1650中にクローニングされた。このpVC1650ベクターは、前初期サイトメガロウィルスプロモーターおよびイントロンAを含み、真核生物細胞中での種々のPRRSV ORFsの発現を誘導する。
6つの追加のcDNAクローンは、PRRSV構造タンパク質ORF2,3,4,5,6および7を描写する。ORF2,3,4,5および6クローンも、上記と同様に、pVC1650発現ベクター中にクローニングされた。ORF7遺伝子は、WRG720と称される類似発現ベクター中にクローニングされた。このWRG720ベクターも、真核生物細胞中での種々のPRRSV ORFsの発現を誘導する前初期サイトメガロウィルスプロモーターおよびイントロンAを含む。
“A1-19”および“T1-19”と称される2対のワクチンを作出した。A1-19ワクチンについて、上述のクローンをバレンティス社(Valentis, Inc.)pVC1650発現プラスミド中にクローニングした。各プラスミド構築は、リン酸アルミニウム(Adju-PhosTM)(ウルマー(Ulmer)ら、Enhancement of DNA Vaccine Potency Using Conventional Aluminum Adjuvants;18 Vaccine,18-28(1999)を用いて別々に調製し、1mlの投与量中アルミニウム理論量1000μgを含む各ORFクローン250μgを得た。最終ワクチンは、別々の1mlのIM投与量の各調製ORFクローンからなる。
T1-19ワクチンについて、上述のクローンをバレンティス社pVC1650発現プラスミド中にクローニングした。各プラスミド構築は、TGV200PINCポリマーを用いて別々に調製し、1mlの投与量中各ORFクローン250μgを得た。最終ワクチンは、別々の1mlのIM投与量の各調製ORFクローンからなる。
T1-19ワクチンについて、上述のクローンをバレンティス社pVC1650発現プラスミド中にクローニングした。各プラスミド構築は、TGV200PINCポリマーを用いて別々に調製し、1mlの投与量中各ORFクローン250μgを得た。最終ワクチンは、別々の1mlのIM投与量の各調製ORFクローンからなる。
対照の作出として、ORF PCV2およびSIVのHA遺伝子のcDNAクローンからなるワクチンを生成させた。ORFはどれも、別々にバレンティス社pVC1650発現プラスミド中にクローニングした。PCV2 ORF2およびSIVのHA遺伝子プラスミド構築はどちらも、リン酸アルミニウム(Adju-PhosTM)を用いて別々に調製し、1mlの投与量中アルミニウム理論量1000μgを含む各ORFクローン250μgを得た(A20およびA21と称する)。さらに、PCV2 ORF2およびSIVのHA遺伝子プラスミド構築はどちらも、TGV200PINCポリマーを用いて別々に調製し、1mlの投与量中各クローン250μgを得た(T20およびT21と称する)。最終ワクチンは、4つ別々の1mlのIM投与量の各調製クローンからなる。表2は、対照ワクチンも含み、作出したすべてのワクチンを示す。
40頭の豚を4つの群に分けた。群1は、0、21および42日目に、A1−A19のAdju-Phosの各1ml投与量×19を投与した。群2は、0、21および42日目に、T1−T19のTGV200の各1ml投与量×19を投与した。群3は、0、21および42日目に、A20,A21,T20およびT21の各1ml投与量×4を投与した。群4は、陰性対照であり、なにも処理投与しなかった。
研究56日目に、群1,2および3のすべての豚に、PRRSVの毒性SDSU#73株を投与した。PRRSVの毒性SDSU#73株は、豚に投与するに先立って、4%ウシ胎児血清を含むEMEM中に1:10希釈した。希釈した攻撃ウィルスの全量2mlを経鼻的に送達し、豚に各鼻孔あたり1mlの希釈ウィルスを配分した投与した。PRRSV攻撃ウィルスの攻撃前および攻撃後の滴は、それぞれ104.59TCID50/mlおよび104.65TCID50/mlであった。
豚は、試験の0,21,42および56日目に採血し、ワクチンの血清変換を観察した。また、豚は、試験の57,59,61,63,66および70日目にも採血し、血清変換およびウィルス血の観察も行なった。54−70日目の間、臨床的所見を記録した。70日目に、豚を剖検し、全肺病巣についてPRRSVによる肺病変のパーセントで記録した。豚は研究開始の前および56日目および70日目に体重測定した。この実施例のプロトコールの結果を表3に示す。
実施例の結果を評価するために、試験処理の効果を決定するものとして用いた主な基準は、PRRSVの肺病巣特徴の拡大である。基準のサポートとして、血清学的反応、攻撃後ADGおよび直腸温を測定した。実施例の結果を表4に示す。
A1−A19 Adju-PhosまたはT1−T19 TGV200 DNAワクチンプロトタイプそれぞれ3投与を受けた豚はいずれも、IDEXX PRRS ELISAで分析した結果、PRRSVへの血清変換はなかった。毒性PRRSV攻撃の後、具体的に群2におけるELISA S/P比は、群1よりも急速な上記のような上昇がみられた。群3(ワクチン非接種/攻撃対照)の豚は、毒性PRRSV攻撃に暴露されるまでは負のS/P比であった。群4の完全陰性対照豚は、研究の間一貫して負のS/P比であった。血清学的結果を表5に示す。
攻撃の2日前から攻撃後14日までの間、豚の体温を観察した。攻撃の間を通じて平均体温の基準群であるワクチン非接種/非攻撃対照の群4は、103.4°Fであった。
PRRSV攻撃を受けたすべての群の群平均体温は、攻撃後にいくらか上昇したが、攻撃後の群平均体温の最高時である何日間での温度差はなかった。PRRSV攻撃を受けたすべての群の群平均最高体温は、105.9〜106.1°Fの範囲であり、一方、陰性対照群の平均最高体温は、103.9°Fであった。群3は、攻撃後体温が徐々に上昇し、攻撃後9日目の最高106.1°Fになった。群1および2は、攻撃後体温の急激な上昇をみせ、攻撃後2日目にそれぞれ最高105.9°Fおよび105.6°Fになった。注目すべきは、群1および2中のDNAワクチンを接種した豚での攻撃後体温の急激な上昇の仕方は、PRRS KVワクチンを接種した動物の攻撃後反応の仕方と同じであることである。実験的なPRRS KVプロトタイプをワクチン接種した豚は、通常、“体液性感作”される(すなわち、ワクチン接種の後、PRRSVに血清反応陽性)。また、これら実験的なPRRS KVプロトタイプをワクチン接種した動物は、本研究でのDNAワクチン接種した群1および2の豚にみられるように、攻撃後、ただちに体温に上昇がみられる。PRRSV攻撃に続きただちに体温上昇するとことにおけるこの類似性は、DNAワクチン接種した豚の免疫系が、実際PRRSV抗原に感作されたことを追加的に示唆する。
群3の豚は、有効的なPRRSV攻撃に特徴的に見られる肺病巣を示した。群4の豚は、剖検で肺病巣はみられなかった。群1および2は、それぞれ19.84および28.42の群平均肺病巣であった。各豚の肺スコアを表6に示す。
これら結果から、PRRSVゲノムのさまざまな領域を含むDNAワクチンは、呼吸器官モデルにおける毒性攻撃からの防御を惹起することができることが明らかである。
Claims (24)
- PRRSV ORF1 DNA由来の少なくとも21の連続したヌクレオチドを有する、PRRSV ORF1 DNAの第一の部分領域と、
適切な医薬的担体と
を含む、PRRSVに対する免疫反応を惹起しうるワクチン。 - 前記部分領域が、配列番号1−14のいずれか1つと少なくとも85%の配列配列同一性をもつ配列およびそれらの組合わせからなる群より選ばれる配列由来の少なくとも150の連続したヌクレオチドを有する請求項1に記載のワクチン。
- 前記部分領域が、配列番号1−6、9、10のいずれか1つと少なくとも85%の配列同一性をもつ配列およびそれらの組合わせからなる群より選ばれる請求項2に記載のワクチン。
- ORF1以外のPRRSV ORF由来の最少21の連続したヌクレオチド、PRRSV ORF1由来の少なくとも21の連続したヌクレオチド、およびそれらの組合わせからなる群より選ばれるPRRSV由来のDNAの部分領域をさらに含む、請求項1に記載のワクチン。
- PRRSV感染に対する免疫反応惹起に有効な他の組成物をさらに含む、請求項1に記載のワクチン。
- 前記PRRSV ORF1がPRRSVの毒性株から誘導される、請求項1に記載のワクチン。
- 助剤、賦形剤およびそれらの組合わせからなる群より選ばれる成分をさらに含む、請求項1に記載のワクチン。
- PRRSV ORF1 DNAの部分領域由来の少なくとも21の連続したヌクレオチドを含む組成物を動物に投与する工程、および
その免疫反応誘発を生起させる工程
を含む方法である、PRRSV感染症に感染しやすい動物に抗PRRSV免疫反応を惹起する方法。 - 前記組成物の2回目の投与を供する工程をさらに含む請求項8に記載の方法。
- 前記部分領域が、配列番号1−14のいずれか1つと少なくとも85%の配列同一性をもつ配列およびそれらの組合わせからなる群より選ばれる配列由来の少なくとも150の連続したヌクレオチドを含む請求項8に記載の方法。
- 前記部分領域が、配列番号1−6、9、10のいずれか1つと少なくとも85%の配列同一性をもつ配列およびそれらの組合わせからなる群より選ばれる請求項10に記載の方法。
- 前記組成物が、ORF1以外のPRRSV ORF由来の最少21の連続したヌクレオチド、PRRSV ORF1由来の少なくとも21の連続したヌクレオチド、およびそれらの組合わせからなる群より選ばれる第二のDNA部分領域をさらに含む、請求項9に記載の方法。
- PRRSV感染に対する免疫反応惹起に有効な第二の組成物をさらに含む、請求項9に記載の方法。
- 前記組成物が、助剤、賦形剤およびそれらの組合わせからなる群より選ばれる成分をさらに含む、請求項9に記載の方法。
- 少なくともPRRSV ORF1 DNAの部分領域を含むベクター。
- 前記ベクターがプラスミドである請求項15に記載のベクター。
- 前記PRRSV ORF1 DNAの部分領域が、PRRSV ORF1 DNA由来の少なくとも21の連続したヌクレオチドを含む請求項15に記載のベクター。
- 前記PRRSV ORF1 DNAの部分領域が、配列番号1−14のいずれか1つと少なくとも85%の配列同一性をもつ配列およびそれらの組合わせからなる群より選ばれる配列由来の少なくとも150の連続したヌクレオチドを有する請求項17に記載のベクター。
- 前記ベクターが、ORF1以外のPRRSV ORF由来の最少21の連続したヌクレオチド、PRRSV ORF1由来の少なくとも21の連続したヌクレオチド、およびそれらの組合わせからなる群より選ばれるPRRSV DNAの第二の部分領域をさらに含む、請求項1に記載のベクター。
- 前記PRRSV DNAがPRRSVの毒性株から誘導される、請求項15に記載のベクター。
- PRRSV ORF1 DNA由来の少なくとも21の連続したヌクレオチドを含むプラスミドを含有する細胞。
- 前記プラスミドが、配列番号1−14のいずれか1つと少なくとも85%の配列同一性をもつ配列およびそれらの組合わせからなる群より選ばれる配列由来の少なくとも150の連続したヌクレオチドをさらに含む請求項21に記載の細胞。
- 前記プラスミドが、ORF1以外のPRRSV ORF由来の最少21の連続したヌクレオチド、PRRSV ORF1由来の少なくとも21の連続したヌクレオチド、およびそれらの組合わせからなる群より選ばれるPRRSV DNAの第二の部分領域をさらに含む請求項21に記載の細胞。
- 前記PRRSV DNAがPRRSVの毒性株から誘導される、請求項21に記載の細胞。
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