MXPA06014821A - Arial de subunidades del virus del sindrome reproductivo y respiratorio porcino. - Google Patents

Abstract

Se describen vacunas efectivas contra virus del sindrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRSV) que incluyen al menos una porcion del ORF1 del PRRSV. Estas vacunas, luego de su administracion, provocan una respuesta inmune en animales susceptibles a PRRSV. Ademas, las composiciones de acuerdo con la presente invencion proporcionan una respuesta inmune hasta e incluyendo inmunidad protectora contra PRRSV asi como reducen la severidad de PRRSV y/o incidencia de PRRSV. Porciones seleccionadas del ORF1 pueden ser usadas singularmente, en combinacion unas con otras, en combinacion con otros ORFs del PRRSV, y en combinaciones con otras vacunas contra PRRSV.

Description

VACUNAS DE SUBÜNIDADES DEL VIRUS DEL SÍNDROME REPRODUCTIVO Y RESPIRATORIO PORCINO Campo de la invención La presente invención está relacionada ampliamente con vacunas para el síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRS) . Más particularmente, la invención está relacionada con la prevención de PRRS en cerdos mediante la administración de una vacuna que comprende subunidades de ADN del virus del PRRS (PRRSV) . Todavía más particularmente, la invención se refiere al uso del marco de lectura abierto 1 (ORF1) en una vacuna de subunidades de ADN que proporciona inmunidad protectora contra PRRSV a cerdos. De manera todavía más particular, la invención se refiere al uso de porciones seleccionadas de ORF1 tanto solas como en combinación con otras porciones del genoma del PRRSV o en combinación con otras vacunas contra PRRSV.

Antecedentes de la invención El PRRS es una gran enfermedad en la industria del cerdo a nivel mundial. PRRS es causado por infección por PRRSV. Actualmente, existen vacunas vivas modificadas (MLV) disponibles las cuales, cuando se usan adecuadamente, REF.: 178408 proporcionan protección a los cerdos contra la enfermedad clínica que resulta de la infección por PRRSV. Las vacunas MLV de PRRS requieren de la replicación en el animal vacunado para poder asegurar que se induzca una respuesta inmune eficaz (por ejemplo, véase Meng, X.J., Heterogeneity of Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus: Implications for Current Vaccine Efficacy and Future Vaccine Development; 74 Vet . Micro., 309-329 (2000)). Sin embargo, esta replicación presenta problemas toda vez que la MLV de PRRS puede persistir en el animal durante varias semanas luego de la vacunación y también puede dispersarse a otro cerdo negativo para PRRSV. El derramamiento o dispersión de MLV de PRRS a partir de animales vacunados puede ser un problema en algunas piaras de cerdos que no tengan adecuadas medidas de bioseguridad en lugar de prevenir el derramamiento de MLV de PRRS de animales vacunados a una población naive a PRRSV. Aunque millones de dosis de MLV de PRRS se han usado sin problemas, también hay reportes esporádicos en la literatura en cuanto a la capacidad de la MLV de PRRS para revertirse a una cepa tipo silvestre y más virulenta de PRRSV. Intentos por resolver los problemas del derramamiento de MLV de PRRS y la posible reversión a virulencia también han sido llevados a cabo mediante la utilización de una vacuna que comprende virus del PRRS inactivado (es decir, PRRS KV) . Sin embargo, las investigaciones han demostrado que a pesar del hecho de que PRRS KV puede inducir una fuerte respuesta humoral en cerdos vacunados, no es efectiva para prevenir la enfermedad asociada con PRRS. En consecuencia, se requiere en la técnica un método de vacunación y una vacuna que puedan inducir la respuesta inmune protectora, sin los problemas asociados con la MLV de PRRS. De preferencia, la administración de la vacuna no se replicaría activamente en el animal vacunado e induciría una fuerte respuesta inmune humoral y mediada por células Breve descripción de la invención La presente invención resuelve los problemas inherentes en la técnica 'anterior y proporciona un avance distinto en el estado de la técnica al proporcionar vacunas de ADN de PRRSV. Teóricamente, el plásmido de vacuna de ADN que expresa el antígeno de PRRS sirve como una plantilla para sintetizar antígenos de PRRSV (es decir, tal como una MLV de PRRS) , pero también tiene la característica de no replicarse activamente en el animal (es decir, como una PRRS KV) . No se conocen los inmunógenos protectores que se requieren para inducir una respuesta protectora en huésped a PRRSV. Ya que la MLV de PRRS puede inducir una respuesta protectora en cerdos vacunados, se cree que la replicación de la MLV de PRRS en el animal vacunado debe inducir tanto una fuerte respuesta inmune humoral como mediada por células en el animal vacunado. El 0RF1 de PRRSV codifica para la maquinaria de replicación necesaria para la replicación de PRRSV y la generación de progenie nueva. El 0RF1 tiene dos regiones, designadas como ORFla y ORFlb, que comprenden el complejo de 0RF1 replicasa (Dea et al . , Current Knowledge on the Structural Proteins of Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome (Prrs) Virus: Comparison of the North American and European Isolates; 145 (4) Archives of Virology, 659-688 (2000) ) . Se cree que las proteínas codificadas por replicasa son inmunógenos clave en otras familias de virus (Leitner et al . , DNA and RNA-Based Vaccines : Principies, Progress and Prospects; 18 Vaccine 765-777 (2000) ) . Cuando una célula es infectada con PRRSV, la actividad de la replicasa viral puede proporcionar un potente efecto adyuvante toda vez que los antígenos asociados a replicasa son expresados durante la infección de la célula. Los antígenos asociados a replicasa pueden servir como "señales de peligro" generadas en células transfectadas e inducir fuertes respuestas inmunes en el huésped (es decir, IFN, HSP, apoptosis) . De esta manera, las "señales de peligro" asociadas a replicasa podrían ser un factor clave acerca de por qué la MLV de PRRS puede inducir protección mientras que un PRRS no replicante (es decir, antígeno inactivado en PRRS KV) no confiere protección contra el ataque. El 0RF1 tiene casi 12,000 nucleótidos de longitud lo cual hace difícil la transfección y expresión adecuada en una célula eucariótica. De esta manera, el 0RF1 fue dividido secuencial y arbitrariamente en secciones más pequeñas usando Inmunización por Biblioteca de Expresión (ELI) como una herramienta para determinar los inmunógenos protectores de varios patógenos. ELI corta el genoma de un patógeno particular en fragmentos pequeños que son clonados en un vector de .vacuna de ADN y posteriormente administrados a un huésped para determinar si algún fragmento es capaz de inducir una respuesta inmune (Johnston and Barry; Genetic to Genomic Vaccination; 15(8) Vaccine, 808-809 (1997)). De preferencia, la respuesta inmune es protectora. La invención es predicada bajo la hipótesis de que respuestas inmunes de huésped a proteínas generadas por ORF1 son esenciales para la protección contra el ataque por PRRSV. Es relativamente fácil colocar las regiones que codifican para los ORFs 2-7 de PRRSV en un vector de vacuna de ADN toda vez que estos ORFs varían en longitud de 317-720 nucleótidos. Como se indicó arriba, el tamaño de la región ORF1 de PRRSV mide casi 12,000 nucleótidos de largo. Poner una región de este tamaño en un vector de vacuna de ADN podría no ser viable para su transfección y subsecuente expresión en una célula eucariótica. En consecuencia, era esencial romper la región ORFl en secciones más pequeñas para asegurar mejor una expresión adecuada de todas las áreas del ORFl. La Inmunización por Biblioteca de Expresión (ELI) ha sido empleada como una herramienta para determinar los inmunógenos protectores de varios patógenos. ELI emplea ese corte del genoma de un patógeno particular en fragmentos pequeños. Estos fragmentos pequeños son después clonados en un vector de vacuna de ADN y luego administrados al huésped para determinar si algún fragmento es capaz de inducir una respuesta inmune protectora. En la presente, la técnica ELI ha sido modificada para el desarrollo de una vacuna de ADN de PRRSV que está comprendida secuencialmente de la región de codificación ORFl del genoma del PRRSV. Este método ha sido designado como SELI (inmunización por biblioteca de expresión secuencial). Esto contrasta con Barfoed et al . , (DNA Vaccination of Pigs with Open Reading Frame 1-7 de PRRS Virus; 22 Vaccine, 3628-3641 (2004)) quienes usaron la región ORFl completa como una vacuna de ADN. Las vacunas de la presente invención comprenden porciones de ORFl de PRRSV solo, en combinación con otras porciones de ORFl de PRRSV, y junto con otras composiciones efectivas para generar una respuesta inmune a una infección por PRRSV incluyendo otras vacunas contra PRRSV. Las porciones ORFl útiles para los propósitos de la presente invención tienen un tamaño suficiente como para invocar una respuesta inmune en un animal que reciba la vacuna. De preferencia, la porción incluirá hasta aproximadamente 9,000 pares de bases. Más preferiblemente la porción ORFl incluirá entre alrededor de 21-9,000 pares de bases de nucleótidos contiguos, aún más preferiblemente entre alrededor de 21-6,000 pares de bases de nucleótidos contiguos, todavía más preferiblemente entre alrededor de 21-3,000 pares de bases de nucleótidos contiguos, aún más preferiblemente entre alrededor de 21-2,000 pares de bases de nucleótidos contiguos, todavía más preferiblemente entre alrededor de 21-1,000 pares de bases de nucleótidos contiguos, aún más preferiblemente entre alrededor de 21-500 pares de bases de nucleótidos contiguos, todavía más preferiblemente entre alrededor de 21-300 pares de bases de nucleótidos contiguos, aún más preferiblemente entre alrededor de 21-150 pares de bases de nucleótidos contiguos, todavía más preferiblemente entre alrededor de 21-75 pares de bases de nucleótidos contiguos, aún más preferiblemente entre alrededor de 21-50 pares de bases de nucleótidos contiguos, todavía más preferiblemente entre alrededor de 21-25 pares de bases de nucleótidos contiguos, aún más preferiblemente entre alrededor de 21-23, y más preferiblemente por lo menos alrededor de 21 pares de bases de nucleótidos contiguos. La proteína que resulta de cualquiera de estas porciones preferidas también es una parte de la presente invención.

Cualquier ORFl o porción del mismo proveniente de cualquier cepa de PRRSV podría usarse para los propósitos de la presente invención, sin embargo, se prefiere usar una cepa que sea virulenta. Las porciones seleccionadas pueden ser clonadas en un vector de expresión adecuado. Ejemplos de vectores adecuados incluyen vectores de adenovirus, vectores de Shigella , pVC1650 (Valentis, Inc., Burlingame, California), RG720 (W.R. Grace, Nueva York, Nueva York) y pcDNA3 (Invitrogen, Carlsbad, California). Algunos vectores que se prefieren contienen el promotor de citomegalovirus temprano inmediato, intrón A y una porción de adeniliación poli-a (por ejemplo, hormona de crecimiento bovina (BGH) u hormona de crecimiento humana (HGH) . Además, las proteínas de PRRSV purificadas pueden ser expresadas en cultivo de células de insecto usando, por ejemplo, el sistema de expresión de baculovirus. Estas proteínas podrían ser después combinadas con un adyuvante y ser administradas. Por supuesto, aquellos con capacidad en la técnica serán capaces de seleccionar sistemas y vectores de expresión adecuados que puedan dirigir la expresión de varios ORFs de PRRSV en células eucarióticas . De preferencia, luego de clonar las porciones respectivas de ORFl en un vector de expresión adecuado, se verifica la orientación del clon. En un ejemplo de la presente invención, el virus PRRSV VR-2332 se seleccionó para usarse de acuerdo con la presente invención. Genbank U87392 se usó para generar 13 clones sobrepuestos de ORFl. Este ORFl incluye 12,071 pares de bases de nucleótidos. Las porciones variaban en tamaño de 773 pb a 975 pb. Los clones fueron designados con las letras A-M con el clon A (SEQ ID NO: 2) teniendo 939 pb, el clon B (SEQ ID NO: 3) teniendo 957 pb, el clon C (SEQ ID NO: 4) teniendo 976, el clon D (SEQ ID NO: 5) teniendo 954 pb, clon E (SEQ ID NO: 6) teniendo 939 pb, clon F (SEQ ID NO: 7) teniendo 957 pb, clon G (SEQ ID NO: 8) teniendo 957 pb, clon H (SEQ ID NO: 9) teniendo 852 pb, clon I (SEQ ID NO: 10) teniendo 917 pb, clon J (SEQ ID NO: 11) teniendo 972 pb, clon K (SEQ ID NO: 12) teniendo 966 pb, clon L (SEQ ID NO: 13) teniendo 783 pb y clon M (SEQ ID NO: 14) teniendo 774 pb. Los clones A-H provienen de la región la y los clones I-M provienen de la región Ib del ORFl. El clon A utiliza el codón de inicio ATG de ORF1A autentico. Los clones de ORFl restantes tuvieron un codón de inicio ATG en cuadro añadido a sus cinco extremos cinco prima. Cada uno de estos clones fueron clonados respectivamente en el vector de expresión de ADN pVC1650. Este vector contiene el promotor de citomegalovirus temprano inmediato e intrón A, y dirige la expresión de los diferentes ORFs de PRRSV en células eucarióticas. La tabla 1 proporciona información que se refiere a cada clon y de qué región de la secuencia de nucleótidos se deriva cada clon.

Tabla 1 Clones de Inmunización por Biblioteca de Expresión Secuencial (SELI) de ORFla/lb de BIV PRRSV * Nota: Los clones H e I originales flanquean el ORFla/lb menos una región de desplazamiento de cuadro, y nuevos cebadores fueron designados para dar productos de RT-PCR ligeramente más pequeños.

Cada porción se utilizó después en varias combinaciones así como sola en preparaciones de vacuna que comprendían otros ORFs de PRRSV. En otro ejemplo, los clones A-M y los clones de ORFs 2-6 fueron clonados en el vector de expresión pVC1650 y un clon para 0RF7 se clonó en el vector de expresión WRG720. Por supuesto, aquellos expertos en la técnica serán capaces de seleccionar vectores adecuados. Además, las secuencias de ácido nucleico de la presente invención se pueden producir mediante técnicas estándares, incluyendo, sin limitación, técnicas comunes de clonación molecular, mutagénesis y síntesis de ácido nucleico química. Para los propósitos de la presente invención, las secuencias de ADN que tienen al menos 75% de identidad de secuencia, muy preferiblemente al menos 75%, todavía más preferiblemente al menos 80%, aún más preferiblemente por lo menos 85%, todavía más preferiblemente al menos 90%, aún más preferiblemente al menos 95%, todavía más preferiblemente por lo menos 98%, muy preferiblemente al menos 99% y más preferiblemente 100% de identidad de secuencia con cualquiera de los clones A-M podrían ser cubiertas por la presente invención. En un aspecto de la presente invención, cada uno de los clones A-M se usan individualmente como un componente de vacuna. Los animales son inmunizados con la vacuna mediante administración por medio de cualquier medio convencional.

Ejemplos de métodos de administración incluyen administración oral, transdérmica, intravenosa, subcutánea, intramuscular, intraocular, intraperitoneal, intrarectal, intravaginal, intranasal, intragástrica, intratraqueal, intrapulmonar o cualquier combinación de los mismos. Los modos de administración que se prefieren son intramuscular, subcutáneo e intranasal. Si se desea o es necesario, se pueden dar inmunizaciones de refuerzo una o varias veces en varios intervalos. Luego de la administración de esta vacuna, una respuesta inmune se desarrolla en el animal y las señales clínicas de infección por PRRSV son reducidas en incidencia y/o severidad después del ataque con una forma virulenta de PRRSV. En otro aspecto de la presente invención, combinaciones de clones A-M se administran a animales como se describió arriba. Estas combinaciones incluyen dos o más de los clones indicados arriba. Ya que algunos de estos clones (A, B, C, D, E, H y J) desarrollaron una reacción IFA luego de la transfección usando sueros convalecientes anti-PRRSV de porcino, las combinaciones de estos clones se prefieren para los propósitos de la presente invención. En otro aspecto de la presente invención, los clones A-M, ya sea individualmente o en combinaciones como se describió arriba, se usan en combinaciones con otros ORFs de PRRSV en preparaciones de vacuna. Los ORFs adecuados incluyen los ORFs 2-7. En otro aspecto de la presente invención, ADN de ORF de PRRSV se combina con otra vacuna contra PRRSV. De preferencia, la vacuna es efectiva para inducir una respuesta inmune antes de la adición del ADN del ORFl de PRRSV. En otro aspecto de la presente invención, se proporciona un vector. Los vectores de acuerdo con la presente invención tienen insertado en ellos ADN extraño (no derivado del vector) que comprende al menos una porción de ADN del ORFl de PRRSV. En formas preferidas, el vector es un plásmido. De preferencia, la porción de ADN del ORFl de PRRSV tendrá al menos 21 nucleótidos contiguos a partir del ADN del ORFl de PRRSV. En algunas formas preferidas, la porción tendrá al menos 150 nucleótidos contiguos de una secuencia seleccionada del grupo que consiste en secuencias que tienen al menos 85% de identidad de secuencia con cualquiera de SEQ ID Nos: 1-14, y combinaciones de las mismas. Al igual que con la propia composición, el porcentaje de identidad de secuencia y longitud de la secuencia pueden variar como se describió arriba. En otras formas preferidas, el vector comprende además una segunda porción de ADN de PRRSV. Esta segunda porción se selecciona del grupo que consiste en por lo menos 21 nucleótidos contiguos de un ORF de PRRSV que no es el ORFl, al menos 21 nucleótidos contiguos del ORFl y combinaciones de los mismos.

En modalidades que tienen 21 nucleótidos contiguos del ORFl adicionales, estos 21 nucleótidos son distintos de los por lo menos 21 nucleótidos contenidos en la primera porción del ADN del ORFl de PRRSV. También se prefiere que el ADN de PRRSV usado para construir el vector se derive de una cepa virulenta de PRRSV. Otro aspecto de la presente invención abarca células huésped que contienen los plásmidos de la invención. Esto podría incluir los plásmidos creados mediante la introducción de los diferentes fragmentos de ORFl indicados arriba. De preferencia, esta célula podría contener un plásmido que comprendiera al menos 21 nucleótidos contiguos de ADN del ORFl de PRRSV. En otras formas preferidas, la célula incluirá un plásmido que comprenda al menos 150 nucleótidos contiguos de una secuencia seleccionada del grupo que consiste en secuencias que tienen al menos 85% de identidad de secuencia con cualquiera de SEQ ID Nos: 1-14 y combinaciones de las mismas. En aún otras formas preferidas, el plásmido en la célula comprenderán una segunda porción de ADN de PRRSV seleccionada del grupo que consiste en al menos 21 nucleótidos contiguos de un ORF de PRRSV que no sea el ORFl, por lo menos 21 nucleótidos contiguos del ORFl, y combinaciones de los mismos. De preferencia, el ADN de PRRSV usado para generar el plásmido contenido en la célula se deriva de una cepa virulenta de PRRSV.

En otro aspecto de la presente invención, las composiciones de la presente invención son útiles en métodos para la inducción de respuestas inmunes en animales así como para la prevención completa o una reducción en la severidad de condiciones y síntomas causados por infección por PRRSV. Las composiciones de la presente invención pueden incluir adyuvantes, vehículos y/o excipientes farmacéuticamente aceptables . Según se usa en la presente, las siguientes definiciones aplicarán: "Identidad de secuencia" como se conoce en la técnica se refiere a una relación entre dos o más secuencias de polipéptidos o dos o más secuencias de polinucleótidos, en particular una secuencia de referencia y una secuencia dada que será comparada con la secuencia de referencia. La identidad de secuencia se determina al comparar la secuencia dada con la secuencia de referencia después de que las secuencias han sido alineadas óptimamente para producir el grado más alto de similitud de secuencia, según se determina por la coincidencia entre cadenas de estas secuencias. Después de esta alineación, la identidad de secuencia se determina sobre una base de posición por posición, por ejemplo, las secuencias son "idénticas" en una posición particular si en esa posición los nucleótidos o residuos de aminoácido son idénticos. El número total de estas identidades de posición se divide después entre el número total de nucleótidos o residuos en la secuencia de referencia para dar el porcentaje de identidad de secuencia. La identidad de secuencia se puede calcular fácilmente mediante métodos conocidos, incluyendo pero no limitados a, aquellos descritos en Computational Molecular Biology, Lesk, A.N., ed. Oxford University Press, Nueva York (1988), Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. ., ed., Academic Press, Nueva York (1993); Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A. M. , y Griffin, H. G., eds., Humana Press, Nueva Jersey (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinge, G., Academic Press (1987); Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. y Devereux, J. , eds., M. Stockton Press, Nueva York (1991); y Carillo, H. y Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988), cuyas enseñanzas se incorporan en la presente a manera de referencia. Los métodos preferidos para determinar la identidad de secuencia están diseñados para dar la mayor coincidencia entre las secuencias probadas. Los métodos para determinar la identidad de secuencia están codificados en programas de computadora disponibles públicamente los cuales determinan la identidad de secuencia entre secuencias dadas. Ejemplos de estos programas incluyen, pero no están limitados a, el paquete de programa GCG (Devereux, J. , et al . , Nucleic Acids Research, 12(1): 387 (1984)), BLASTP, BLASTIN y FASTA (Altschul, S. F. et al . , J . Molec. Biol., 215:403-410 (1990).

El programa BLASTX está disponible públicamente de NCBI y otras fuentes (BLAST Manual, Altschul, S. et al . , NCVI NLM NIH Bethesda, MD 20894, Altschul, S. F. et al . , J. Molec. Biol., 215: 403-410 (1990), las enseñanzas de los cuales se incorporan en la presente a manera de referencia) . Estos programas alinean óptimamente secuencias usando ponderaciones de espacio por omisión para producir así el nivel más alto de identidad de secuencia entre las secuencias dadas y de referencia. Como una ilustración, por un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos que tiene por lo menos, por ejemplo, 95% de "identidad de secuencia" con una secuencia de nucleótidos de referencia, se intenta decir que la secuencia de nucleótidos del polinucleótido dado es idéntica a la secuencia de referencia excepto que la secuencia de polinucleótidos dada puede incluir hasta cinco mutaciones por punto por cada 100 nucleótidos de la secuencia de nucleótidos de referencia. En otras palabras, en un polinucleótido que tenga una secuencia de nucleótidos que tenga por lo menos 95% de identidad en relación a la secuencia de nucleótidos de referencia, hasta 5% de los nucleótidos en la secuencia de referencia pueden ser eliminados o sustituidos con otros nucleótidos, o un número de nucleótidos de hasta 5% de los nucleótidos totales en la secuencia de referencia pueden ser insertados en la secuencia de referencia. Estas mutaciones de la secuencia de referencia pueden ocurrir en las posiciones terminales 5' o 3' de la secuencia de nucleótidos de referencia o en cualquier lugar entre esas posiciones terminales, intercaladas ya sea individualmente entre nucleótidos en la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia. En forma análoga, por un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos dada que tiene al menos, por ejemplo, 95% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos de referencia, se intenta decir que la secuencia de aminoácidos dada del polipéptido es idéntica a la secuencia de referencia excepto que la secuencia de polipéptidos dada puede incluir hasta 5 alteraciones de aminoácido por cada 100 aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de referencia. En otras palabras, para obtener una secuencia de polipéptidos dada que tenga al menos 95% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos de referencia, hasta 5% de los residuos de aminoácido en la secuencia de referencia pueden ser eliminados o sustituidos con otro aminoácido, o un número de aminoácidos hasta 5% del número total de residuos de aminoácido en la secuencia de referencia puede insertarse' en la secuencia de referencia. Estas alteraciones de la secuencia de referencia pueden ocurrir en las posiciones terminales amino o carboxi de la secuencia de aminoácidos de referencia o en cualquier lugar entre esas posiciones terminales, intercaladas ya sea individualmente entre residuos en la secuencia de referencia o en el uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia. De preferencia, las posiciones de residuo que no sean idénticas difieren por sustituciones de aminoácido conservadoras. Sin embargo, las sustituciones conservadoras no están incluidas como una coincidencia cuando se determina la identidad de secuencia . En forma similar, "homología de secuencia" según se usa en la presente, se refiere también a un método para determinar el parentesco de dos secuencias. Para determinar la homología de secuencia, dos o más secuencias se alinean óptimamente como se describió arriba, y se introducen espacios si es necesario. Sin embargo, en contraste con la "identidad de secuencia", las sustituciones de aminoácido conservadoras se cuentan como una coincidencia cuando se determina la homología de la secuencia. En otras palabras, para obtener un polipéptido o polinucleótido que tenga 95% de homología de secuencia con una secuencia de referencia, 95% de los residuos de aminoácido o nucleótidos en la secuencia de referencia deben coincidir o comprender una sustitución conservadora con otro aminoácido o nucleótido, o un número de aminoácidos o nucleótidos de hasta 5% de los residuos de aminoácido o nucleótidos totales, no incluyendo las sustituciones conservadoras, en la secuencia de referencia pueden ser insertados en la secuencia de referencia. Una "sustitución conservadora" se refiere a la sustitución de un residuo de aminoácido o nucleótido con otro residuo de aminoácido o nucleótido que tenga características o propiedades similares incluyendo tamaño, hidrofobicidad, etc., de tal manera que la funcionalidad general no cambie significativamente . "Aislado" significa alterado "por la mano del hombre" a partir de su estado natural, es decir, si ocurre en la naturaleza, ha sido cambiado o removido de su ambiente original, o ambos. Por ejemplo, un polinucleótido o polipéptido naturalmente presente en un organismo vivo no está "aislado", sino que el mismo polinucleótido o polipéptido separado de los materiales coexistentes de su estado natural es "aislado", según se emplea en la presente el término. "Ácido nucleico" se refiere a polinucleótidos tales como ácido desoxirribonucleico (ADN) y, cuando se adecuado, ácido ribonucleico (ARN) . El término también debe entenderse que incluye, como equivalentes, análogos ya sea de ARN o ADN hechos a partir de análogos de nucleótido y, según sea aplicable a la modalidad que se esté describiendo, polinucleótidos de una sola (sentido o antisentido) y doble hebra . "Promotor" significa una secuencia de ADN que regula la expresión de una secuencia de ADN seleccionada enlazada operablemente al promotor, y la cual lleva a cabo la expresión de la secuencia de ADN seleccionada en las células. El término abarca promotores "específicos de tejido", es decir, promotores los cuales llevan a cabo la expresión de la secuencia de ADN seleccionada sólo en células específicas (por ejemplo, células de un tejido específico). El término cubre también los llamados promotores "permeables", los cuales regulan la expresión de un ADN seleccionado principalmente en un tejido, pero causan la expresión en otros tejidos también. El término abarca también promotores no específicos de tejido y promotores que expresan constitutivamente o que son inducibles (es decir, los niveles de expresión pueden ser controlados) . "Transfección" significa la introducción de un ácido nucleico, por ejemplo, mediante un vector de expresión, en una célula receptora mediante transferencia génica mediada por ácido nucleico. "Transformación", según se usa en la presente, se refiere a un proceso en el cual el genotipo de una célula es cambiado como resultado de la absorción celular de ADN o ARN exógeno, y, por ejemplo, la célula transformada expresa una forma recombinante de un polipéptido o, en el caso de la expresión anti-sentido a partir del gen transferido, la expresión de una forma que ocurre naturalmente de la proteína es interrumpida. La transfección también puede usar un reactivo químico (es decir, un lípido) . El término "vector" se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al cual se haya enlazado. Un tipo de vector que se prefiere es un episoma, es decir, un ácido nucleico capaz de la replicación extra-cromosómica. Los vectores que se prefieren son aquellos capaces de la replicación autónoma y/o de la expresión de ácidos nucleicos a los cuales sean enlazados. Los vectores capaces de dirigir la expresión de genes a los cuales son enlazados operativamente son referidos en la presentes como "vectores de expresión". En general, los vectores de expresión de utilidad en las técnicas de ADN recombinante están comúnmente en forma de "plásmidos" los cuales se refieren generalmente a asas circulares de ADN de doble hebra las cuales, en su forma de vector no están unidas al cromosoma. En la presente descripción, "plásmido" y "vector" se usan indistintamente ya que el plásmido es la forma más comúnmente usada de vector. Los vectores también incluyen otros replicones tales como fagos o cósmidos, dentro de los cuales otro segmento de ADN puede insertarse para ocasionar así la replicación del segmento insertado. La invención está destinada a incluir aquellas otras formas de vectores de expresión que tengan funciones equivalentes y las cuales se vuelvan conocidas en la técnica posteriormente a la presente.

La "amplificación" de ácidos nucleicos o polinucleótidos es cualquier método que resulte en la formación de una o más copias de una molécula de ácido nucleico o polinucleótido (amplificación exponencial) o en la formación de una o más copias sólo del complemento de una molécula de ácido nucleico o polinucleótido (amplificación lineal) . Los métodos de amplificación incluyen la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) que se basa en ciclos repetidos de desnaturalización, fijación a cebadores de oligonucleótidos y extensión de cebadores mediante la polinucleótido polimerasa dependiente de plantilla termofílica, dando como resultado el incremento exponencial en copias de la secuencia deseada del analito de polinucleótido flanqueado por los cebadores. Los dos diferentes cebadores de PCR, los cuales se fijan a hebras opuestas del ADN, se colocan de tal manera que el producto de extensión catalizado por polimerasa de un cebador pueda servir como una hebra de plantilla para el otro, llevando a la acumulación de un fragmento de doble hebra individual cuya longitud se define por la distancia entre los extremos 5' de los cebadores de oligonucleótidos. Los reactivos para llevar a cabo esta amplificación incluyen cebadores de oligonucleótidos, una nucleótido polimerasa y trifosfatos de nucleósido tales como, por ejemplo, trifosfato de desoxiadenosina (dATP) , trifosfato de desoxiguanosina (dGTP) , trifosfato de desoxicitidina (dCTP) y trifosfato de desoxitimidina (dTTP) . Otros métodos para la amplificación incluyen la amplificación de un polinucleótido de una sola hebra usando un solo cebador de oligonucleótidos, la reacción en cadena de la ligasa (LCR) , la amplificación a base de secuencia de ácido nucleico (NASBA) , el método de Q-beta-replicasa y 3SR. Las enseñanzas y el contenido de todas las referencias citadas en la presente se incorporan expresamente a manera de referencia.

Descripción detallada de la invención El siguiente ejemplo ilustra una modalidad preferida de la presente invención. Sin embargo, se debe entender que este ejemplo se proporciona a manera de ilustración y nada en el mismo debe tomarse como una limitante sobre el alcance total de la invención.

Ejemplo 1 Este ejemplo proporciona datos en cuanto a la eficacia de vacunas de ADN que comprenden varias regiones del genoma de PRRSV. El ejemplo empezó con 40 cerdos de ambos sexos negativos a PRRSV provenientes de Spring Prairie Colony, Hawley, MN 56549. Los puercos tenían 3-4 semanas de edad al inicio del estudio. A lo largo del estudio, a los puercos se les proporcionó suficiente alimento para el tamaño, edad y condición de los animales. Se proporcionó agua ad libi tum . Para generar vacunas de ADN de PRRSV, diecinueve clones de ADNc se generaron a partir del virus PRRS. Se generaron 13 clones de ADNc que representaban secuencialmente la región la/Ib del marco de lectura abierto (ORF) del genoma del PRRSV. El clon A utiliza el codón de inicio ATG de ORFla auténtico. Los restantes clones B a M de ORFla/lb tuvieron un codón de inicio ATG añadido a sus extremos 5' respectivos. Todos los clones anteriores fueron clonados respectivamente en el vector de expresión de ADN pVC1650. El vector pVC1650 contiene el promotor de citomegalovirus temprano inmediato e intrón A para dirigir la expresión de los diferentes ORFs de PRRSV en células eucarióticas. Los seis clones de ADNc adicionales representaron los ORFs 2, 3, 4, 5, 6 y 7 de la proteína estructural de PRRSV. Los clones del ORF 2, 3, 4, 5 y 6 fueron también clonados respectivamente en el vector de expresión de ADN pVC1650 descrito arriba. El gen del ORF7 se clonó en un vector de expresión similar designado WRG7020. El vector RG7020 contiene también al promotor de citomegalovirus temprano inmediato e intrón A para dirigir la expresión del ORF7 de PRRSV en células eucarióticas. Se crearon dos juegos de vacunas, designados "Al-19" y "Tl-19". Para las vacunas Al-19, los clones mencionados anteriormente fueron clonados en el plásmido de expresión pVC1650 de Valentis, Inc. Cada construcción de plásmido se formuló separadamente con fosfato de aluminio (Adju-PHos®) (Ulmer et al . , Enhancement of DNA Vaccine Potency Using Conventional Aluminium Adjuvants; 18 Vaccine, 18-28 (1999) para producir 250 µg del clon de ORF respectivo con 1000 µg de aluminio calculado en una dosis de 1 ml . La vacuna final consistía en una dosis IM de 1 ml separada de cada clon de ORF formulado. Para las vacunas Tl-19, los clones mencionados arriba se clonaron en el plásmido de expresión pVC1650 de Valentis, Inc. Cada construcción de plásmido se formuló por separado con polímero TGV200 PINC para producir 250 µg del clon ORF respectivo en una dosis de 1 ml . La vacuna final consistía en una dosis IM de 1 ml separada de cada clon de ORF formulado. Para generar un control, vacunas de ADN que consistían en clones de ADNc de PVC2 del ORF y el gen HA de SIV fueron creadas. Ambos ORFs se clonaron por separado en el plásmido de expresión pVC1650 de Valentis, Inc. Tanto el ORF2 de PCV2 como las construcciones de plásmido del gen HA de SIV se formularon por separado con fosfato de aluminio (Adju-PHos®) para producir 250 µg del clon de ORF respectivo con 1000 µg de aluminio calculado en una dosis de 1 ml (llamada A20 y A21) . Además, tanto las construcciones de plásmidos del ORF2 de PCV2 como del gen HA de SIV se formularon por separado con polímero TGV200PINC para producir 250 µg de cada clon respectivo en una dosis de 1 ml (llamada T20 y T21) . La vacuna final consistía en cuatro dosis IM de 1 ml separadas de cada clon formulado. La tabla 2 muestra todas las vacunas creadas, incluyendo las vacunas de control. Tabla 2 ismido Región del clon Envergadura nucleotídica del clon (usando Genbank U87392 como referencia) 1 ORF la 190-1128 2 ORF 1 a 1126-2082 3 ORF la 2082-3057 4 ORF la 3037-3990 5 ORF la 3985-4923 6 ORF la 4924-5880 7 ORF la 5863-6819 8 ORF la 6808-7659 9 OPT Ib 7735-8651 10 ORF Ib 8634-9605 11 ORF Ib 9588-10553 12 ORF Ib 10536-11318 13 ORF Ib 11298-12071 14 ORF2 ND 15 ORF3 ND 16 ORF4 ND 17 ORF5 ND 18 ORF6 ND 19 ORF7 ND 20 ORF2 ND 21 SIV HA ND Los cuarenta cerdos se dividieron en cuatro grupos: al Grupo 1 se le administraron dosis 19 x 1 ml de A1-A19 Adju-Phos los días 0, 21 y 42. Al Grupo 2 se le administraron dosis 19 x 1 ml de T1-T19 TGV200 los días 0, 21 y 42. Al Grupo 3 se le administraron dosis 4 x 1 ml respectivas de A20, A21, T20 y T22 los días 0, 21 y 42. Al Grupo 4, el control negativo, no se le administró tratamiento alguno en absoluto. El día 56 del estudio, a todos los cerdos de los grupos 1, 2 y 3 se les administró la cepa SDSU#73 virulenta de PRRSV. La cepa SDSU#73 virulenta de PRRSV se diluyó 1:10 en EMEM con 4% de suero bovino fetal antes de su administración a los cerdos. Un total de 2 ml del virus de ataque diluido se suministraron intranasalmente a los cerdos adecuados con 1 ml del virus diluido administrado a cada fosa nasal. Los títulos preataque y postataque del virus de ataque PRRSV fueron 104"59 TCID50/ml y 104'65 TCID50/ml, respectivamente . Los cerdos fueron sangrados los días 0, 21, 42 y 56 de la prueba para monitorear la seroconversión a vacunación. Los cerdos también fueron sangrados los días 57, 59, 61, 63, 66 y 70 de la prueba para monitorear la seroconversión y el postataque de viremia. Las observaciones clínicas se registraron diariamente a partir del día 54-70. En el día 70 se practicó la necropsia a los cerdos y se registraron las grandes lesiones pulmonares como porcentaje de implicación pulmonar debido a PRRSV. Los cerdos fueron pesados antes del inicio del estudio y los días 56 y 70. Un resumen del protocolo de este ejemplo puede observarse en la tabla 3.

Tabla 3 Grupo Cerdos/grupo Primera Segunda Tercera Ataque Toma de muestra vacunación vacunación vacunación (Dia = 56) y terminación de (Dia = 0) (Dia = 21) (Dia =42) estudio (Día = 70) 2 ml de Evaluar salud clínica, SDSU#73 de temperatura rectal. Evaluar animales para A1-A19 A1-A19 PRRSV A1-A19 10 virulento lesiones pulmonares en Adju-Phos Adju-Phos Adj u-Phos administradonecropsia y tomar intranasal muestra de tejido mente . pulmonar designado . T1-T19 T1-T19 T1-T19 Igual que 10 Igual que arriba ? TGV200 TGV200 TGV200 arriba o A20-A21 A20-A21 A20-A21 Igual que 10 Igual que arriba T20-T21 T20-T21 T20-T21 arriba 10 10 Ninguna Ninguna Ninguna Ninguna Igual que arriba 15 Para evaluar los resultados del ejemplo, los principales criterios usados para determinar la eficacia de los tratamientos de prueba fue el desarrollo de lesiones pulmonares características de PRRSV. La respuesta serológica, ADG postataque y temperaturas rectales fueron evaluadas como criterios de soporte. Los resultados del ejemplo se resumen en la tabla 4.

Tabla 4 Porcentaje de cerdos en cada grupo con Temp. prom. Porcentaje ADG Grupo Puntuación Puntuaciones de por grupo más más alto de postataque es consolidación pulmonar de a'ta Post- viremia pico promedio por pulmonares >20% ataque (°C) postataque grupo promedio por grupo 1 (A l - 19.84 37.5 40.9 100% 0.16 A19 Adju- Phos) 2 (T1-T19 28.42 70.0 41.1 100% 0.43 TGV200) 3 (Cont. 37.68 70.0 41.2 100% 0.68 Ataq.) (Control 0.0A 0.0 39.9 0% 1.48 Neg.) No hubo seroconversión a PRRSV determinada por el estudio IDEXX PRRS ELISA en ninguno de los cerdos que recibieron tres dosis de los prototipos de vacuna de ADN Al-A19 Adju-Phos o T1-T19TGV200 respectivos. Después del ataque con PRRSV virulento, pareció haber un incremento más rápido en las relaciones S/P del ELISA en los cerdos del Grupo 2 que en los del Grupo 1. Los cerdos del Grupo 3 (controles no vacunados/atacados) tuvieron relaciones S/P negativas hasta que fueron expuestos al ataque con PRRSV virulento. Los cerdos de control negativo estricto en el Grupo 4 tuvieron relaciones S/P negativas a lo largo del estudio. Los resultados de serología se reportan en la tabla 5.

Tabla 5 Día 0 Día 21 Día Día (0 Día (3 Día (5 Día (7 Día (10 Día (14 56 dpc) 59 dpc) 61 dpc) dpc) dpc) dpc) up ) Cerdo ELISA ELISA ELIS ELIS VI ELISA VI ELISA VI ELIS VI ELIS VI ELIS VI 1 802 0.14 -0.09 o."o? 0.^22 N 0.21 POS 0.97 POS 2.^2 POS 2A6 N 2A9 N 1 808 0.00 1-0.01 0.02 N 0.02 POS 0.08 POS 0.66 POS 1.01 N 1.22 N 1 812 -0.02 -0.01 - 0.00 N 0.02 N 0.10 POS 0.60 POS 0.92 N 1.21 N 1 814 -0.03 0.01 - 0.02 N 0.02 N 0.13 POS 0.54 POS 1.15 N 1.80 N 1 818 0.01 -0.01 0.36 0.23 N 0.18 POS 0.83 POS 2.74 POS 2.97 N 3.24 N 1 826 0.00 0.00 - 0.01 N 0.01 N 0.10 POS 0.37 POS 0.45 POS ND ND 1 830 -0.01 0.00 0.04 0.02 N -0.01 POS 0.06 POS 0.39 POS 0.97 POS 1.68 N 1 832 -0.02 0.00 - 0.03 N 0.04 N 0.18 POS 0.93 POS 1.39 POS 1.71 N 1 839 0.01 -0.05 0.01 0.08 N 0.06 POS 0.13 POS 0.36 POS 0.72 N 1.13 POS 1 842 0.02 -0.01 - 0.17 N 0.19 N 0.92 POS 2.30 POS 2.48 N ND ND Media 0.01 -0.02 0.03 0.08 0.07 0.35 1.12 1.47 1.84 10 806 0 . 01 0 . 05 0 . 11 0 . 31 N 0 . 26 POS 0 . 58 POS 2 . 51 POS 3 . 22 N 3 . 34 2 813 -0.02 0.00 - 0.05 N 0.07 POS 0.22 POS 0.83 POS 1.47 POS 1.73 N 2 821 0.00 0.05 0. .04 0.07 N 0.10 POS 0.15 POS 1.12 POS 2.28 N 2.52 N 2 822 -0.01 0.00 - 0.03 N 0.05 POS 0.41 POS 1.78 POS 2.37 N 2.01 POS 2 836 -0.02 0.05 0. .12 0.22 N 0.23 POS 0.79 POS 2.93 POS 3.52 POS 3.62 N 2 844 0.00 -0.02 0. .00 0.05 N 0.03 POS 0.31 POS 1.72 POS 2.33 POS 2.17 N 2 845 0.04 0.01 0. .06 0.32 N 0.19 POS 1.00 POS 2.80 POS 3.44 N 3.26 N 2 846 -0.01 -0.02 - 0.09 N 0.09 N. 0.75 -POS 2.57 POS 3.17 POS 3.06 N 2 847 -0.01 0.01 0, .02 0.04 N 0.02 POS 0.43 POS 2.05 POS 2.94 POS 2.96 N 15 2 849 0.03 -0.02 - 0.11 N 0.08 POS 0.45 POS 1.97 POS 2.48 N 2.56 N co cn 2 2 2 0 2 0 2 2: 2: 2 2 2 2 2 2 2 2 cu cu r r iH LO O -n o o n r m O i-H ?H CN H -) O r- r- ? rH > r- ri rH -n co o <3< o o <H O O O 0 0 0 T-H rH O CNI rH O rH rH 0 I 0 ° ° I 0 ° 0 I 0 I 0 I 0 I 0 ° 0 ° ° n BI n 10 n 01 M O 0 0 0 2 0 0 0 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 og '3' M G- O CO O O G ^ 'Í CI 00 CN - r- 00 r- •^r m co t-H ^< ^< m m oo r- o O S . °0 S^ " r 0 0 0 0 rH O O rH O O rH O 1 co (i n tn n n n m m O cn O O O O O O O O 2 2 2 2 2 2 2 2 u o c cu c cu cu cu cu cu cu 00 10 r- Ln ^ ao in i-H i-H i-H o ^ o o N o o o o o o o o o o o I I I n co co cn n co cn co cn O 0 0 2 0 0 0 0 0 0 2 2 2 2 2 2 2 CU cu cu cu cu cu cu cu cu LO r- 00 -^ r- 00 ao -a* O CTl N O U) rH O LO r- LO m o O O O O O i-H rH r-l O o rH O O O O O O O o O O O O O O O O O O 0 0 0 0 0 0 0 0 0 co co cn cn n n n co co O 0 0 0 0 0 0 0 2 0 2 2 2 2 2 2 2 2 2 C cu cu cu cu cu cu cu cu rH 00 CNl rH rH rH CNl 3 CN O 00 O O O O O O rH O O O O o b . ° o° o u l-J ° o 8 o o o O O O O O O O O O O o c? o <? c? o o o o o 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 00 o I > rH CNl rH rH LO) <£> CNl LT> 00 •5T (M O CO ?j o o n cO ? ^1 rH o O O O O O O O O O O O rH O O , O O O O O O o O O O O O O O O O O o o o o '-j' o o o o o o 00 D -T r, r « CNl ^ ^ ^ -^ O rH O OO O o o O O O O O rH ^ *-* O O O O ° o o , , , 0 0 0 0 0 0 O O O O O O ^ ^ O O o o ^ ^ ^ o o o o o o CNl CN CNl rH CNl CNJ CNl _^ OO rH MD CNl OO CNl OO rH rH CNl o o O O O O O O O O O O o O O O O O O O O O O ' O O O O O O O O O O I I I I I I I I I I " 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 o g o g o o g o g o 00 o -¡ rH OO rH OO ^ ^ O O 'í' rH o . 0 , 0 0 , 0 . 0 0 0 . 0 0 0 0 , , 0 0 0 o I •^ o o o o ^ '-y' o o o o rd •H LD Cn oO rH OO O rH OO OO TH 00 «f in o ^ oo ^ i^ ß o ? O O O rH rH CNJ OO OO OO LD O c? co co ? co co ? co ro co a> 0O CD OO 8 OO OO OO OO OO CO Q) S 00 00 00 00 00 00 00 00 00 ^* ^* ^* ^1 ^J1 ^J1 ^J* ^* ^* m m Las temperaturas de los cerdos se monitorearon a partir de dos días preataque a lo largo de catorce días postataque. La temperatura promedio del grupo de línea de base a lo largo del periodo de ataque para los controles no vacunados/no atacados del Grupo 4 fue de 39.67 °C. Las temperaturas promedio de grupo entre todos los grupos atacados con PRRSV se evaluaron en el algún punto luego del ataque, sin embargo hubo una diferencia temporal en los días después del ataque en los cuales la temperatura promedio del grupo tuvo un pico. Las temperaturas pico promedio del grupo en todos los grupos atacados con PRRSV variaron de 41.06°C a 41.17°C, mientras que la temperatura pico promedio de los grupos de control negativo fue de 39.94°C. El Grupo 3 mostró un incremento gradual en la temperatura postataque con un pico de 41.17°C nueve días después del ataque. Los Grupos 1 y 2 presentaron un agudo incremento en las temperaturas dos días después del ataque con temperaturas pico de 41.06°C y 40.89°C, respectivamente. Cabe mencionar que la manera en la cual las temperaturas después del ataque de los cerdos vacunados con ADN en el Grupo 1 y 2 se incrementó rápidamente, es similar a la manera en la cual los animales vacunados con PRRS KV responden después del ataque. Se ha observado que los cerdos vacunados con prototipos PRRS KV experimentales normalmente son "cebados humoralmente" (es decir, seropositivos a PRRSV luego de la vacunación) . Los animales vacunados con estos prototipos PRRS KV experimentales también presentan un rápido incremento en la temperatura justo después del ataque, como se observó en este estudio con los cerdos vacunados con ADN de los Grupos 1 y 2. Esta similitud en una rápida elevación de la temperatura luego del ataque con PRRSV es una indicación adicional de que los sistemas inmunológicos de los cerdos vacunados con ADN fueron de hecho cebados al antígeno de PRRSV. Los cerdos del Grupo 3 presentaron lesiones pulmonares que se encuentran característicamente en un ataque con PRRSV exitoso. Los cerdos del Grupo 4 no tuvieron lesiones pulmonares en la necropsia. Los cerdos del Grupo 1 y 2 tuvieron lesiones pulmonares promedio de grupo de 19.84 y 28.42, respectivamente. Las puntuaciones pulmonares para los cerdos individuales se reportan en la tabla 6.

Tabla 6 Grupo Animal Puntuaciones pulmonares 1 802 2.00 1 808 0.90 1 812 55.00 1 814 0.20 1 818 1.00 00 VO r- ro CN CN CN CN CN CN CN CN CN CN ro ro ro ro ro oo oo oo oo ro -O IO o CN CM 4 803 0.00 4 804 0.00 4 805 0.00 4 810 0.00 4 817 0.00 828 0.00 4 834 0.00 4 837 0.00 4 838 0.00 4 850 0.00 media 0.00 A partir de estos resultados, es claro que las vacunas de ADN que comprenden varias regiones del genoma de PRRSV pueden inducir protección contra el ataque virulento en el modelo respiratorio. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (24)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. Una vacuna capaz de inducir una respuesta inmune contra el virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRSV), caracterizada porque comprende: una primera porción de ADN del ORFl del PRRSV, la porción tiene al menos 21 nucleótidos contiguos provenientes del ADN del ORFl del PRRSV y un vehículo farmacológico adecuado.

2. La vacuna de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la porción que tiene al menos 150 nucleótidos contiguos es de una secuencia seleccionada del grupo que consiste en secuencias que tienen al menos 85% de identidad de secuencia con cualquiera de SEQ ID Nos. 1-14, y combinaciones de las mismas.

3. La vacuna de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque la porción se selecciona del grupo que consiste en secuencias que tienen al menos 85% de identidad de secuencia con cualquiera de SEQ ID Nos. 1-6, 9, 10, y combinaciones de las mismas.

4. La vacuna de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque comprende además una porción de ADN de PRRSV seleccionada del grupo que consiste en al menos 12 nucleótidos contiguos de un ORF del PRRSV que no es el ORFl, al menos 21 nucleótidos contiguos del ORFl de PRRSV, y combinaciones de los mismos.

5. La vacuna de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque comprende además otra composición efectiva para inducir una respuesta inmune contra infección por PRRSV.

6. La vacuna de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el ORFl del PRRSV se deriva de una cepa virulenta de PRRSV.

7. La vacuna de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque comprende además un ingrediente seleccionado del grupo que consiste en adyuvantes, excipientes y combinaciones de los mismos.

8. Un método para inducir una respuesta inmune contra PRRSV en un animal susceptible a infección por PRRSV, caracterizado porque comprende los pasos de: administrar una composición al animal, la composición comprende al menos 21 nucleótidos contiguos de una porción de ADN del ORFl de PRRSV y causar la inducción de la respuesta inmune.

9. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque comprende además el paso de proporcionar una segunda administración de la composición.

10. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque la porción comprende al menos 150 nucleótidos contiguos de una secuencia seleccionada del grupo que consiste en secuencias que tienen al menos 85% de identidad de secuencia con cualquiera de SEQ ID Nos. 1-14, y combinaciones de las mismas.

11. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque la porción se selecciona del grupo que consiste en secuencias que tienen al menos 85% de identidad de secuencia con cualquiera de SEQ ID Nos. 1-6, 9, 10, y combinaciones de las mismas.

12. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque la composición comprende además una segunda porción de ADN seleccionada del grupo que consiste en al menos 12 nucleótidos contiguos de un ORF del PRRSV que no es el ORFl, al menos 21 nucleótidos contiguos del ORFl, y combinaciones de los mismos.

13. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque la composición comprende además una segunda composición efectiva para inducir una respuesta inmune contra infección por PRRSV.

14. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque la composición comprende además un ingrediente seleccionado del grupo que consiste en adyuvantes, excipientes y combinaciones de los mismos.

15. Un vector caracterizado porque comprende al menos una porción de ADN del ORFl del PRRSV.

16. El vector de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque es un plásmido.

17. El vector de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque la porción de ADN del ORFl del PRRSV comprende al menos 21 nucleótidos contiguos del ADN del ORFl del PRRSV.

18. El vector de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque la porción de ADN del ORFl del PRRSV tiene al menos 150 nucleótidos contiguos de una secuencia seleccionada del grupo que consiste en secuencias que tienen al menos 85% de identidad de secuencia con cualquiera de SEQ ID Nos. 1-14, y combinaciones de las mismas.

19. El vector de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque comprende además una segunda porción de ADN del PRRSV seleccionada del grupo que consiste en al menos 21 nucleótidos contiguos de un ORF del PRRSV que no es el ORFl, al menos 21 nucleótidos contiguos del ORFl, y combinaciones de los mismos.

20. El vector de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el ORFl del PRRSV se deriva de una cepa virulenta de PRRSV.

21. Una célula caracterizada porque contiene un plásmido que comprende al menos 21 nucleótidos contiguos de ADN del ORFl del PRRSV.

22. La célula de conformidad con la reivindicación 21, caracterizada porque el plásmido comprende además por lo menos 150 nucleótidos contiguos de una secuencia seleccionada del grupo que consiste en secuencias que tienen al menos 85% de identidad de secuencia con cualquiera de SEQ ID Nos. 1-14, y combinaciones de las mismas.

23. La célula de conformidad con la reivindicación 21, caracterizada porque el plásmido comprende además una segunda porción de ADN del PRRSV seleccionada del grupo que consiste en al menos 12 nucleótidos contiguos de un ORF del PRRSV que no es el ORFl, al menos 21 nucleótidos contiguos del ORFl, y combinaciones de los mismos.

24. La célula de conformidad con la reivindicación 21, caracterizada porque el ADN del PRRSV se deriva de una cepa virulenta de PRRSV.