JP2008503210A - Celiiエンドヌクレアーゼをコードする核酸配列 - Google Patents
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Abstract
本発明は、CEL IIエンドヌクレアーゼをコードする単離された核酸配列並びに、これによりコードされたタンパク質を産生するためのベクターおよび宿主細胞に関する。
Description
序論
本出願は、2004年6月17日出願の米国特許仮出願第60/580,450号の利益を請求し、これを、この全体にわたり、参照により本明細書中に導入する。
本出願は、2004年6月17日出願の米国特許仮出願第60/580,450号の利益を請求し、これを、この全体にわたり、参照により本明細書中に導入する。
本発明の背景
植物からのDNAミスマッチ特異性エンドヌクレアーゼの新規な族は、最近発見された(Oleykowskiら(1998)、Nucl. Acid Res. 26:4597-4602; Yangら(2000)、Biochem. 39:3533-3541)。この群のエンドヌクレアーゼの最も高い外見上の濃度を有する植物供給源は、セロリであり(Oleykowskiら(1998)、上記)、従って酵素が、セロリから精製され、CEL Iと命名された(Oleykowskiら(1998)、上記;Yangら(2000)、上記)。CEL Iは、DNAを、塩基置換ミスマッチおよびDNA歪みの部位の3’側において切断する(Oleykowskiら(1998)、上記;Yangら(2000)、上記)。
植物からのDNAミスマッチ特異性エンドヌクレアーゼの新規な族は、最近発見された(Oleykowskiら(1998)、Nucl. Acid Res. 26:4597-4602; Yangら(2000)、Biochem. 39:3533-3541)。この群のエンドヌクレアーゼの最も高い外見上の濃度を有する植物供給源は、セロリであり(Oleykowskiら(1998)、上記)、従って酵素が、セロリから精製され、CEL Iと命名された(Oleykowskiら(1998)、上記;Yangら(2000)、上記)。CEL Iは、DNAを、塩基置換ミスマッチおよびDNA歪みの部位の3’側において切断する(Oleykowskiら(1998)、上記;Yangら(2000)、上記)。
CEL Iは、挿入/欠失および塩基置換ミスマッチにおいて二本鎖DNAに切れ目を挿入するかまたは切断することに依存するミスマッチ検出アッセイにおいて、有用であると示されている(Oleykowskiら(1998)、上記;Yangら(2000)、上記;Kulinskiら(2000)、BioTechniques 29:44-48; Colbertら(2001)、Plant Physiol. 126:480-484; Sokurenkoら(2001)、Nucl. Acids Res. 29:e111;米国特許第5,869,245号)。
CEL Iとして同定されたCELヌクレアーゼの精製された調合液は、2種の異なるタンパク質種、即ちCEL IおよびCEL IIを含む(Yangら(2000)、上記;米国特許第5,869,245号)。CEL Iと呼ばれる1つの種は、SDS−PAGEにより決定されたように、43kDaの外見上の分子量を有する。N結合オリゴ糖類をEndo Hfで除去することにより、分子量は29kDaに減少する。CEL Iは、部分的に配列決定されており、CEL Iをコードする遺伝子は、セロリcDNAライブラリーから単離され、配列決定され、大腸菌中にクローン化された(Yangら(2000)、上記;米国特許第5,869,245号)。CEL IIは、SDS−PAGEにより決定されたように、39kDaの外見上の分子量を有し、N結合オリゴ糖類の除去により、分子量は37kDaに減少する。CEL IおよびCEL IIのクロマトグラフィー分離が記載されており、CEL IおよびCEL IIが、関連すると見られている一方、これらは、異なる酵素活性を有する;CEL IIは、CEL Iよりも高いpHで最適であり、CEL IIは、ミスマッチにおいてDNAを切断するにあたり、CEL Iよりも効率が高い。
従って、当該分野において必要とされているものは、二本鎖DNAにおけるミスマッチの存在の検出において用いるための、CEL Iの汚染がない単離されたCEL IIの容易に入手可能な供給源である。本発明は、CEL IIをコードする核酸配列をこの組換え産生のために提供するこの長年の必要性を満たす。
発明の概要
本発明は、CEL IIポリペプチドをコードする単離された核酸に関する。前述の単離された核酸は:
(a)配列番号:1または配列番号:3のヌクレオチド配列;
(b)配列番号:1のヌクレオチド配列またはこの相補的なヌクレオチド配列に、 ストリンジェントな条件の下でハイブリダイズし、機能的なCEL IIポリペプチドをコードする、ヌクレオチド配列;あるいは
(c)(a)または(b)のヌクレオチド配列によりコードされたアミノ酸配列をコードするが、遺伝子コードの縮重または翻訳されていないヌクレオチド配列の存在により、(a)または(b)のヌクレオチド配列とは異なるヌクレオチド配列を有する、ヌクレオチド配列
である。
本発明は、CEL IIポリペプチドをコードする単離された核酸に関する。前述の単離された核酸は:
(a)配列番号:1または配列番号:3のヌクレオチド配列;
(b)配列番号:1のヌクレオチド配列またはこの相補的なヌクレオチド配列に、 ストリンジェントな条件の下でハイブリダイズし、機能的なCEL IIポリペプチドをコードする、ヌクレオチド配列;あるいは
(c)(a)または(b)のヌクレオチド配列によりコードされたアミノ酸配列をコードするが、遺伝子コードの縮重または翻訳されていないヌクレオチド配列の存在により、(a)または(b)のヌクレオチド配列とは異なるヌクレオチド配列を有する、ヌクレオチド配列
である。
本発明はさらに、CEL IIポリペプチドをコードする単離された核酸を含むベクターに関する。
本発明はさらに、配列番号:2もしくは配列番号:4のアミノ酸配列、またはこの機能的断片に対して、少なくとも約70%のアミノ酸配列相同性を有するアミノ酸配列を有する、単離されたCEL IIポリペプチドに関する。
本発明はさらに、CEL IIポリペプチドまたはこれによりコードされたポリペプチドをコードする、単離された核酸またはベクターを含む宿主細胞に関する。
本発明はさらに、配列番号:2もしくは配列番号:4のアミノ酸配列、またはこの機能的断片に対して、少なくとも約70%のアミノ酸配列相同性を有するアミノ酸配列を有する、単離されたCEL IIポリペプチドに関する。
本発明はさらに、CEL IIポリペプチドまたはこれによりコードされたポリペプチドをコードする、単離された核酸またはベクターを含む宿主細胞に関する。
発明の詳細な説明
一般的にCEL Iと呼ばれる、CELヌクレアーゼの精製された調合液は、2種のCELヌクレアーゼ、即ちCEL IおよびCEL IIを含む(Yangら(2000)、上記)。2種の酵素を分離した、セロリからの改変された精製方法が、開発された。この手順は、本明細書中に、および表3中に要約されている。この方法に従って精製されたCEL IIは、CEL Iによる外見上の汚染を含まないが、45および57kDaにおいて広帯域として移動した2種のタンパク質またはタンパク質の族で汚染されていた。この汚染を考慮した後に、当該精製方法により精製されたCEL IIの比活性は、それぞれpH8.5および5.5において、2.3×108および0.21×108単位/mgであった。
一般的にCEL Iと呼ばれる、CELヌクレアーゼの精製された調合液は、2種のCELヌクレアーゼ、即ちCEL IおよびCEL IIを含む(Yangら(2000)、上記)。2種の酵素を分離した、セロリからの改変された精製方法が、開発された。この手順は、本明細書中に、および表3中に要約されている。この方法に従って精製されたCEL IIは、CEL Iによる外見上の汚染を含まないが、45および57kDaにおいて広帯域として移動した2種のタンパク質またはタンパク質の族で汚染されていた。この汚染を考慮した後に、当該精製方法により精製されたCEL IIの比活性は、それぞれpH8.5および5.5において、2.3×108および0.21×108単位/mgであった。
SEPHACRYL(登録商標)S−100 HRによるゲル濾過により、これらの汚染物がほとんど除去された。CEL IIが、SEPHACRYL(登録商標)S−100 HRから、35.5kDaの分子量と一致する位置において溶離した。CEL IIを、SDS−PAGEを施す前にジスルフィド架橋を切断するための還元剤(例えばβ−メルカプトエタノール)で処理した場合には、タンパク質は、2種のバンドとして、〜16および〜28kDaにおいて移動した。CEL IIが、還元剤に曝露されなかった場合には、これは、SDS−PAGEの間に、〜35kDaにおいて予測されたように移動していたであろう。これは、CEL IIの精製の間にタンパク質分解的切断により導入されたCEL IIポリペプチド主鎖における切断に帰していた。改変された精製方法により精製されたほとんどのCEL IIを、この位置においてタンパク質分解的に切断した。時々、切断されていないある種のCEL IIが得られた。主鎖におけるこの切断は、酵素の機能的なミスマッチ切断活性に影響しなかった。
この方法により精製されたCEL Iは、CEL IIによる外見上の汚染を含まなかったが、比較的低い程度にであるが、CEL II中に存在する同一の2種のタンパク質で汚染されていた。この汚染を考慮した後に、精製されたCEL Iの比活性は、それぞれpH5.5および8.5において、1.2×108および0.8×108単位/mgであった。CEL Iヌクレアーゼの既知の調合液は、CEL IとCEL IIとを共に含み、3.1×107単位/mgの比活性を有する(Yangら(2000)、上記)。CEL Iは、〜39kDaの分子量に整合するSDS−PAGEにおける位置において移動した。CEL Iは、精製の間にはタンパク質分解的に切断されなかった。
その後、精製されたCEL IIの酵素的特性を、分析した。いくつかの場合において、本明細書中に開示した方法で精製したCEL Iの特性に対して、比較を行った。CEL IおよびCEL IIのDNA分解酵素可溶化アッセイにおけるpH最適を、表1に示す。CEL Iは、pH6.0〜7.0を優先し、CEL IIは、pH9.0より上で最適な活性を有していた。本明細書中に開示された方法により精製されたCEL Iの酵素的特性は、既知の方法に従って精製されたCEL Iの酵素的特性と同様であった(Yangら(2002)、上記)。
ミスマッチしたオリゴヌクレオチドアッセイを用いて、精製したCEL IおよびCEL IIの単一塩基のミスマッチ切断優先傾向は、同一であると見出された:C/T〜A/C〜C/C>T/T>A/A〜G/G≫A/G〜G/T。CEL IIが、PCRで増幅したDNA断片における種々の歪みを切断する能力もまた、試験した。突然変異体および基準のPCR産物を、等量でハイブリダイズさせた場合には、2種の交互のヘテロ二本鎖ミスマッチが形成し、これは、混合物中のDNAの〜50%を表す。CEL IIは、G/GおよびC/C、G/AおよびT/C、G/TおよびA/C並びにA/AおよびT/Tを含む、632bp基質において試験したすべてのミスマッチした対において、二本鎖切断を生じた。ミスマッチが、A/GおよびC/TまたはT/GおよびC/Aであるように、最上部および底部のらせんにおいて、ミスマッチした塩基を切り換えることにより、同様の切断効率が得られた。さらに、CEL IIは、1bp、2bp、3bp、6bp、9bpまたは12bpの挿入を含む632bp基質中の部位において、有効に切断し、各々の場合において予測された切断産物を産生した。
CEL IIにより発生した産物の量の比較により、酵素が、挿入/欠失を、単一の塩基のミスマッチよりも効率的に切断することが、明確に例証された。G/GおよびC/Cヘテロ二本鎖を用いて、ヘテロ二本鎖をCEL IおよびCEL IIにより切断する効率を、比較した。消化産物を、分別し、HPLCにより定量した。CEL IIは、ミスマッチの切断においてCEL Iよりも効率的であった。約40単位(pH5.5)のCEL I(14fmol)および10単位(pH8.5)のCEL II(2.5fmol)が、400ngのヘテロ二本鎖を同一の程度に切断するのに、必要であった。
CEL IIの〜16および〜28kDaの断片を、単離し、各断片のアミノ末端アミノ酸配列を、決定し、本明細書中ではそれぞれ配列番号:6および配列番号:7として示す(図1)。CEL I遺伝子とのアミノ酸配列の相同性に基づいて、16kDaの断片は、CEL IIタンパク質のアミノ末端から由来しており、28kDaの断片は、タンパク質のカルボキシ末端から由来していた。縮重したオリゴヌクレオチドプライマーを、これらの配列から設計し、CEL II遺伝子の一部をコードする核酸配列を、クローン化した。その後、セロリcDNAライブラリーを、構成し、全長CEL II遺伝子を、該ライブラリーから、CEL II部分的DNA配列から設計した重複するオリゴヌクレオチドプライマーを用いて単離した。CEL IIをコードする核酸配列を、配列番号:1として示し、ペプチドリーダーを含むアミノ酸配列を、配列番号:2として示す。5’未翻訳領域およびペプチドリーダーをコードする核酸配列を欠いているCEL IIをコードする核酸配列を、配列番号:3として示し、ペプチドリーダーを欠いているアミノ酸配列を、配列番号:4として示す。
ペプチドリーダーを含み、CEL IIおよびCEL Iは、アミノ酸レベルで45%同一である(図1)。成熟したタンパク質のアミノ末端における保存されたtrpで開始して、CEL IIおよびCEL Iは、それぞれ291個および274個のアミノ酸を含んでいた。翻訳後改変を含まないCEL IIの計算された分子量は、32,629ダルトンであり、一方CEL Iは、31,440ダルトンの計算された分子量を有していた。CEL II〜16kDaおよび〜28kDa断片の計算された分子量は、それぞれ12.3kDaおよび20.3kDaであり、これは、両方の断片が、グリコシル化されていることを示していた。CEL Iにおけるように(Yangら(2000)、上記)、P1ヌクレアーゼにおいて3個の触媒的に必須のZn原子に結合するためのリガンドであると知られている、9個の保存されたアミノ酸残基が、CEL II中に存在していた(図1)。CEL IIおよびCEL Iは共に、cys−cys架橋の形成に関与するP1ヌクレアーゼ中に存在する4個の保存されたcys残基を含んでいた。さらに、CEL IIおよびCEL Iは、保存された位置において4個の他のcys残基を含んでおり、CEL IIは、CEL Iにより共有されていない余分なcys残基を含んでいた。
タンパク質分解的に切断されたCEL IIポリペプチド主鎖における領域(Leu−Leu−Gly−Val−His−Asp−Leu−Asn−Ser−Lys−Met↓Asn−Asn−Asn−Leu;配列番号:8)は、13個のアミノ酸のうち3個のみが保存されている、CEL Iの対応するアミノ酸配列(Gly−His−Phe−Arg−His−Gly−Thr−Ser−Asp−Arg−Arg−Tyr−Asn−Met;配列番号:9)に対する最小に保存された領域の1つである。この多岐にわたる領域に直接隣接している領域は、はるかに一層高度に保存されていた(13個のアミノ酸のうち9個が、上流で保存されており、13個のうち11個が、下流において保存されていた)(図1)。P1ヌクレアーゼの3−D構造に対する比較に基づいて、アミノ酸のこの多岐にわたる伸張は、酵素の表面上に、露出したループ中に位置する。露出したループ構造の、CEL IIに対して独特の適切なアミノ酸認識配列との組み合わせにより、この部位が、CEL IにおいてではなくCEL IIにおいて、タンパク質分解的な切断を受けやすくなる。
CEL IIの明確な酵素活性および、二本鎖DNAにおけるミスマッチの存在を検出するためのアッセイにおけるこの有用性に基づいて、CEL IIの高度に純粋な調合液を、大規模で生産するのが、所望される。従って、本発明は、CEL IIポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸を提供する。本明細書中で用いる、単離された分子(例えば単離された核酸、例えばゲノムDNA、RNAもしくはcDNAまたは単離されたポリペプチド)は、天然に存在する生物の他の成分の少なくとも数種、例えば細胞構造成分または、分子に関連して共通して見出される他のポリペプチドもしくは核酸から分離されているか、またはこれを実質的に含まない分子を意味する。単離された分子が、ポリペプチドである場合には、前述のポリペプチドは、少なくとも約25%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%またはこれ以上の純度である(w/w)。
1つの態様において、CEL IIポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号:1または配列番号:3のヌクレオチド配列である。他の態様において、CEL IIポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号:1のヌクレオチド配列またはこの相補的なヌクレオチド配列に、ストリンジェントな条件の下でハイブリダイズするヌクレオチド配列であり、ここで、前述のヌクレオチド配列は、機能的なCEL IIポリペプチドをコードする。他の態様において、CEL IIポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、機能的なCEL IIポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であるが、これは、遺伝子コードの縮重または翻訳されないヌクレオチド配列の存在のために、配列番号:1または配列番号:3のヌクレオチド配列とは異なるヌクレオチド配列を有する。
本明細書中で用いる、機能的なポリペプチドは、通常当該ポリペプチドと関連する少なくとも1種の生物学的活性を維持するものである。あるいはまた、機能的なポリペプチドは、修飾されていないポリペプチドにより保有された活性をすべて維持する。生物学的活性を維持するにより、ポリペプチドが、野生型の(native)ポリペプチドの少なくとも約10%、20%、30%、40%、50%、60%、75%、85%、90%、95%、97%、98%、99%またはこれ以上の生物学的活性を維持する(かつさらに、野生型のポリペプチドよりも高いレベルの活性を有し得る)ことを、意味する。機能的でないポリペプチドは、通常はポリペプチドと関連する検出可能な生物学的活性を本質的に示さない(例えば、多くとも、例えば約10%またはさらに5%より低い、有意ではない量に過ぎない)ものである。
本明細書中で用いる、ポリペプチドの用語は、他に示さない限り、ペプチドおよびタンパク質の両方を包含する。
本明細書中で用いる、CEL IIポリペプチドまたはCEL IIタンパク質は、広範囲に解釈されるべきものであることを意図し、塩基対ミスマッチにおいて二本鎖DNAを切断することができる酵素を包含する。用語CEL IIはまた、生物学的機能性を維持する(即ち、野生型のCEL IIタンパク質の少なくとも1種の生物学的活性を有する、例えば二本鎖DNAを塩基対ミスマッチにおいて切断するかまたは二本鎖DNAを塩基対ミスマッチにおいて結合する)、改変された(例えば突然変異した)CEL II、切断された分子を含む機能的なCEL II断片および機能的なCEL II融合ポリペプチド(例えば、CEL II−GSTタンパク質融合物またはCEL II−Hisタグ付加タンパク質)を含む。
すべてのCEL IIポリペプチドまたはCEL IIコード核酸を、本発明のCEL IIであると考慮する。CEL IIポリペプチドまたはCEL IIコード核酸は、菌類、哺乳類またはArabidopsis、Zinnia、アルファルファ、アスパラガス、トマト、カリフラワー、ブロッコリー、キャベツ、ウイキョウ、ケール、水クレソン(water cress)、パセリ、レタス、マングビーンの芽、Hemerocallis、Oryza、HordeumまたはZeaを含む他の植物種から由来し得る。CEL IIエンドヌクレアーゼは、同様の活性、pH最適および大きさを有する、セロリ以外の他の非組換えの、または天然の供給源から単離されたエンドヌクレアーゼ酵素を含むことを意図する。
セロリCEL IIの代表的なcDNA配列を、それぞれ配列番号:1および配列番号:3として示し、代表的なアミノ酸配列を、配列番号:2および配列番号:4として示す。本発明により包含される他のCEL II配列には、GENBANK受託番号AAD00695、BAB03377、AAC34856、CAC33831およびNP_680734が含まれるが、これらには限定されない。
例示するために、このような配列のハイブリダイゼーションを、低下したストリンジェンシー、中程度のストリンジェンシーまたはさらにストリンジェントな条件(例えば、それぞれ37℃における、5×デンハート液、0.5%のSDSおよび1×SSPEを含む35〜40%のホルムアミドの洗浄ストリンジェンシーにより表される条件;42℃における、5×デンハート液、0.5%のSDSおよび1×SSPEを含む40〜45%のホルムアミドの洗浄ストリンジェンシーにより表される条件;および/または42℃における、5×デンハート液、0.5%のSDSおよび1×SSPEを含む50%のホルムアミドの洗浄ストリンジェンシーにより表される条件)の下で、本明細書中に具体的に開示した配列に対して行うことができる。例えば、Sambrookら、Molecular Cloning, A Laboratory Manual(第2版、1989)(Cold Spring Harbor Laboratory)を参照。
代替的に述べて、本発明のCEL IIをコードする単離された核酸は、少なくとも約60%、70%、80%、90%、95%、97%、98%またはこれより高い、本明細書中に具体的に開示した単離された核酸配列(または上記で定義したこの断片)との配列の相同性を有し、本明細書中に定義した機能的なCEL IIをコードする。
当業者には、本発明のCEL IIをコードする核酸には、遺伝子コードの縮重により可変性があり得ることが、理解される。異なる核酸配列が同一のポリペプチドをコードすることを可能にする遺伝子コードの縮重は、文献において十分知られている(表2を参照)。
核酸配列における他の変化は、翻訳されない配列、例えばイントロン配列並びに5’および3’非翻訳配列の存在(または不存在)により、導入され得る。
さらに、本発明の単離された核酸は、少なくとも約60%、70%、80%、90%、95%、97%、98%またはこれより高い、本明細書中に具体的に開示したポリペプチド配列(またはこの断片)とのアミノ酸配列の同一性を有し、さらに本明細書中に定義した機能的なCEL IIをコードするCEL IIポリペプチドをコードする当該核酸を包含する。
当該分野において知られているように、多くの種々のプログラムを用いて、核酸またはポリペプチドが、既知の配列に対する配列の同一性または相同性を有するか否かを確認することができる。配列の同一性および/または相同性を、当該分野において知られている標準的な手法を用いて決定することができ、これには、SmithおよびWaterman (1981)、Adv. Appl. Math. 2:482の局所的な配列同一性アルゴリズム、NeedlemanおよびWunsch (1970)、J. Mol. Biol. 48:443の配列同一性整列アルゴリズムによるもの、PearsonおよびLipman (1988)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444の同一性方法のための検索によるもの、初期設定を用いるかまたは調査による、これらのアルゴリズム(GAP、BESTFIT、FASTAおよびWisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, WIにおけるTFASTA)、Devereuxら(1984)、Nucl. Acid Res. 12:387-395により記載されたBest Fit配列プログラムのコンピュータ化された履行によるものが含まれるが、これらには限定されない。
有用なアルゴリズムの例は、PILEUPである。PILEUPは、関連する配列の群からの複数の配列の整列を、連続的な対での整列を用いて作成する。これはまた、整列を作成するために用いられるクラスタリング関係を示す系図をプロットすることができる。PILEUPは、FengおよびDoolittle (1987)、J. Mol. Evol. 35:351-360の連続的な整列方法の単純化を用いる;この方法は、HigginsおよびSharp (1989)、CABIOS 5:151-153により記載されたものと類似する。
有用なアルゴリズムの他の例は、Altschulら(1990)、J. Mol. Biol. 215:403-410およびKarlinら(1993)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787中に記載されているBLASTアルゴリズムである。特に有用なBLASTプログラムは、Altschulら(1996)、Methods in Enzymology, 266:460-480; http://blast.wustl/edu/blast/README.htmlから得られたWU-BLAST-2プログラムである。WU-BLAST-2は、いくつかの検索パラメーターを用い、これを、初期値に設定することができる。パラメーターは、動的な値であり、特定の配列の構成および関連する配列を検索する特定のデータベースの構成に依存して、プログラム自体により確立される;しかし、当該値を、感受性が増大するように調整することができる。
追加的な有用なアルゴリズムは、Altschulら(1997)、Nucleic Acids Res. 25:3389-3402により報告された、ギャップを作成した(gapped)BLASTである。
百分率のアミノ酸配列の同一性の値を、整合する同一の残基の数を、整列した領域における長い方の配列の残基の合計の数で除することにより、決定することができる。長い方の配列は、整列した領域における最も実際的な残基を有する配列である(WU-Blast-2により導入して、整列スコアを最大化したギャップを、無視する)。
当該整列は、ギャップの導入を、整列させるべき配列中に含むことができる。さらに、本明細書中に具体的に開示したポリペプチドよりも多数の、または少数のアミノ酸を含む配列について、1つの態様において、配列の同一性の百分率は、同一のアミノ酸の数に基づいて、アミノ酸の合計の数に関連して決定されることが、理解される。従って、例えば、本明細書中に具体的に開示した配列よりも短い配列の配列同一性は、1つの態様においては、短い方の配列中のアミノ酸の数を用いて、決定される。百分率同一性の計算においては、相対的重量は、配列の変化、例えば挿入、欠失、置換などの種々の明示には帰されない。
1つの態様において、同一性のみが、正に評定され(+1)、ギャップを含む配列の変化のすべての形態に、「0」の値を割り当て、これにより、配列同一性の計算について以下に記載する加重規模またはパラメーターについての必要性を解消する。配列同一性の百分率を、例えば、整合する同一の残基の数を、整列した領域における短い方の配列の残基の合計の数で除し、100を乗じることにより、計算することができる。長い方の配列は、整列した領域における最も実際的な残基を有する配列である。
本明細書中に具体的に開示したか、または他の方法で当該分野において知られているCEL IIアミノ酸配列を改変するために、アミノ酸置換は、アミノ酸側鎖置換の相対的な相同性または差異を含む、当該分野において知られているすべての特性、例えばこれらの疎水性、親水性、電荷、大きさなどに基づくことができる。特定の態様において、保存的置換(即ち、同様の特性を有するアミノ酸残基での置換)を、CEL IIをコードするアミノ酸配列において行う。このような改変を行って、CEL IIのpH最適、温度最適または安定性を変化させることができる。
アミノ酸置換を行うにあたり、アミノ酸の疎水性親水性指標の指数を、考慮することができる。相互作用的な生物学的機能をタンパク質に付与するにあたっての、疎水性親水性指標のアミノ酸の指数の重要性は、当該分野において一般的に理解されている(KyteおよびDoolittle (1982)、J. Mol. Biol. 157:105を参照)。アミノ酸の相対的な疎水性親水性指標の特徴は、得られたタンパク質の二次構造に寄与し、次にこれにより、他の分子を有するタンパク質、例えば酵素、基質、レセプター、DNA、抗体、抗原などの相互作用が定められることが、認められている。
各々のアミノ酸には、この疎水性および電荷特性に基づく疎水性親水性指標の指数が割り当てられており(KyteおよびDoolittle (1982)、上記)、これらは、以下の通りである:イソロイシン(+4.5);バリン(+4.2);ロイシン(+3.8);フェニルアラニン(+2.8);システイン/シスチン(+2.5);メチオニン(+1.9);アラニン(+1.8);グリシン(−0.4);トレオニン(−0.7);セリン(−0.8);トリプトファン(−0.9);チロシン(−1.3);プロリン(−1.6);ヒスチジン(−3.2);グルタミン酸(−3.5);グルタミン(−3.5);アスパラギン酸(−3.5);アスパラギン(−3.5);リシン(−3.9);およびアルギニン(−4.5)。
また、当該分野において、アミノ酸の置換を、親水性に基づいて行うことができることが、理解されている。米国特許第4,554,101号には、隣接するアミノ酸の親水性により左右される、タンパク質の最大の局所的な平均の親水性は、タンパク質の生物学的特性と相関することが、述べられている。
米国特許第4,554,101号に詳述されているように、以下の親水性値が、アミノ酸残基に割り当てられている:アルギニン(+3.0);リシン(±3.0);アスパラギン酸(+3.0±1);グルタミン酸(+3.0±1);セリン(+0.3);アスパラギン(+0.2);グルタミン(+0.2);グリシン(0);トレオニン(−0.4);プロリン(−0.5±1);アラニン(−0.5);ヒスチジン(−0.5);システイン(−1.0);メチオニン(−1.3);バリン(−1.5);ロイシン(−1.8);イソロイシン(−1.8);チロシン(−2.3);フェニルアラニン(−2.5);トリプトファン(−3.4)。
本発明の単離された核酸には、RNA、DNA(cDNAを含む)およびこれらのキメラが含まれる。単離された核酸は、さらに、改変されたヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体を含むことができる。
CEL IIをコードする単離された核酸は、適切な発現制御配列、例えば転写/翻訳制御シグナルおよびポリアデニル化シグナルと関連し得る。
種々のプロモーター/エンハンサー要素を、所望のレベルおよび細胞または組織特異性発現に依存して用いることができることが、理解される。プロモーターは、所望の発現のパターンに依存して、構成的であるか、または誘発性であってもよい(例えば、メタロチオネインプロモーターまたはホルモン誘発性プロモーター)。プロモーターは、野生型であるかまたは外来性であってもよく、天然の、または合成の配列であってもよい。外来性のにより、転写開始領域が、該転写開始領域を導入する野性型の宿主中に見出されないことを意図する。プロモーターを、これが、関連する標的細胞(1または2以上)中で機能するように、選択する。特定の態様において、プロモーターは、大規模のタンパク質生産の目的のためにCEL IIをコードする核酸を発現するために用いることができる細胞中で機能する。同様に、プロモーターは、これらの細胞および組織に特異的であってもよい(即ち、特定の細胞または組織のタイプにおいて顕著な活性を示すのみである)。
例示するために、CEL IIをコードする配列を、サイトメガロウイルス(CMV)主要最初期プロモーター、アルブミンプロモーター、伸張因子1−α(EF1−α)プロモーター、PγKプロモーター、MFGプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーターまたはグリセルアルデヒド−3−リン酸プロモーターと、動作可能に関連させることができる。
さらに、特定の開始シグナルが、一般的に、挿入されたタンパク質コード配列の効率的な翻訳のために、必要である。ATG開始コドンおよび隣接する配列を含むことができるこれらの翻訳制御配列は、天然および合成の両方の、種々の起源のものであってもよい。例えば、当業者は、内因性シグナルペプチドを欠いているCEL IIの発現には、成熟したCEL IIタンパク質の組換え発現のために、コード配列の5’末端において、開始コドンの付加が必要であることを、理解することができる。
CEL IIは、直接のみならず、異種性のポリペプチド、即ち分泌のためのシグナル配列および/またはCEL IIの精製を補助する他のポリペプチドを有する融合タンパク質としても、発現することができる。1つの態様において、異種性のポリペプチドは、当該異種性のポリペプチドをCEL IIから除去するための特異的な切断部位を有する。
一般的に、シグナル配列は、配列番号:1によりコードされる内因性シグナル配列であってもよいか、またはベクターの成分であってもよく、宿主細胞により認識され、加工される(即ち、シグナルペプチダーゼにより切断される)ものでなければならない。原核生物中での産生のために、例えばアルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、lppまたは熱安定性エンテロトキシンIIリーダーからの原核生物シグナル配列を、用いることができる。酵母分泌のために、例えば、酵母インベルターゼ、アルファ因子または酸ホスファターゼリーダー、Candida albicansグルコアミラーゼリーダー(EP 362,179)などを、用いることができる(例えば、WO 90/13646を参照)。哺乳類細胞発現において、同一の、または関連する種の分泌されたポリペプチドからのシグナル配列、並びにウイルス分泌リーダー、例えば単純ヘルペス糖タンパク質Dシグナルを、用いることができる。このようなシグナル配列を、有利には、成熟したCEL IIタンパク質をコードする核酸配列(例えば配列番号:3)に融合させることができる。
CEL IIに融合させることができる他の有用な異種性のポリペプチドには、融合タンパク質の発現もしくは溶解性を増大させるか、またはアフィニティー精製においてリガンドとして作用することにより、融合タンパク質の精製を補助するものが含まれる。典型的な融合発現ベクターには、pGEX(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ)、pMAL(New England Biolabs, Beverly, Mass.)およびpRIT5(Pharmacia, Piscataway, NJ)が含まれ、これらは、それぞれGST、マルトースE結合タンパク質またはプロテインAを、標的の組換えタンパク質に融合する。
CEL IIをコードする単離された核酸を、例えばクローン化または他の実験室的な操作、組換えタンパク質産生または遺伝子送達の目的のために、ベクター中に導入することができる。特定の態様において、ベクターは、発現ベクターである。例示的なベクターには、細菌性の人工的な染色体、コスミド、酵母の人工的な染色体、ファージ、プラスミド、脂質ベクターおよびウイルスベクターが含まれる。核酸コード配列、特にCEL IIコード配列の発現(express)、発現(expresses)または発現(expression)の用語により、当該配列が、転写され、随意に翻訳されることを、意味する。典型的に、本発明において、コード配列の転写および翻訳の結果、CEL IIポリペプチドの産生がもたらされる。
本発明の方法は、インビトロで(例えば、大規模の組換えタンパク質生産のために)、またはインビボで(例えば、組換え大規模タンパク質生産もしくは治療的目的のために)分裂している、および分裂していない細胞を共に含む、広範囲の宿主細胞中にCEL IIをコードする核酸を送達し、随意に発現させるための手段を提供する。本発明の態様において、核酸を、標的細胞中で一過性に発現させることができるか、または核酸を、標的細胞中に、例えば細胞のゲノム中への組み込みもしくは安定に維持されたエピソーム(例えばエプスタインバーウイルスから由来する)からの持続性の発現により、安定に導入することができる。
CEL IIをコードする単離された核酸を、細胞または対象により発現させて、CEL IIが、即ち組換えCEL IIタンパク質の供給源として、これから産生され、精製されるようにすることができる。この態様において、CEL IIは、全身的な循環中に、または他の体液(例えば乳汁、リンパ液、髄液、尿)中に分泌され、これは、容易に採集され、これから、CEL IIをさらに精製することができる。他の代案として、CEL IIタンパク質を、鳥類種において産生し、卵タンパク質中に蓄積し、かつこれから好都合に単離することができる。
同様に、CEL IIをコードする核酸を、スクリーニングアッセイの目的のために、または大規模の組換えタンパク質生産のために、細胞培養系において、一過性に、または安定に発現させることができる。細胞は、細菌、原生動物、植物、酵母、菌類または動物細胞であってもよい。
特定の態様において、CEL IIをコードする単離された核酸を、培養した細胞、例えば初代または不死化細胞系の細胞中に、組換えタンパク質産生のために導入することができる。組換え細胞を用いて、CEL IIポリペプチドを産生することができ、これを、細胞または細胞培養培地から採集する。同様に、組換えタンパク質を、本質的にバイオリアクターとして用いられる生物(例えば微生物、動物または植物)中で産生し、随意に生物から精製することができる。
一般的に、単離された核酸を、発現ベクター(ウイルス性または非ウイルス性)中に導入する。当業者には、すべての好適なベクターを用いて、本発明の単離された核酸を関連する標的細胞(1もしくは2以上)または対象に送達することができることは、明らかである。送達ベクターの選択を、当該分野において知られている多数の要因に基づいて、行うことができ、これには、標的宿主の年齢および種、インビトロ対インビボ送達、所望される発現のレベルおよび持続性、意図される目的(例えば、大規模生産のため)、標的細胞または器官、送達の経路、単離された核酸の大きさ、安全性の懸念などが含まれる。
好適なベクターには、ウイルスベクター(例えばレトロウイルス、アルファウイルス;ワクシニアウイルス;アデノウイルス、アデノ関連ウイルスまたは単純ヘルペスウイルス)、脂質ベクター、ポリリシンベクター、核酸分子と共に用いられる合成ポリアミノポリマーベクター、例えばプラスミドなどが含まれる。
本明細書中で用いる、ウイルスベクターまたはウイルス送達ベクターの用語は、核酸送達ビヒクルとして機能し、ウイルス粒子内に包装されたベクターゲノムを含むウイルス粒子を意味することができる。あるいはまた、ウイルス粒子の不存在において核酸送達ビヒクルとして用いる場合には、これらの用語を用いて、ベクターゲノムを意味することができる。
組換えウイルスベクターを産生するための、およびウイルスベクターを、核酸送達のために用いるためのプロトコルは、Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F. M.ら(編)、Greene Publishing Associates, (1989)および他の標準的な実験室マニュアル(例えばVectors for Gene Therapy. Current Protocols in Human Genetics中、John Wiley and Sons, Inc.: 1997)中に見出すことができる。
種々の宿主細胞と適合性の発現ベクターは、当該分野において十分知られており、核酸の転写および翻訳に適する要素を含む。典型的には、発現ベクターは、発現カセットを含み、これは、5’から3’への方向において、プロモーター、プロモーターと動作可能に関連するCEL IIをコードするコード配列並びに随意に、RNAポリメラーゼのための停止シグナルおよびポリアデニラーゼのためのポリアデニル化シグナルを含む末端配列を含む。
発現ベクターを、原核細胞または真核細胞中でのポリペプチドの発現のために、設計することができる。例えば、ポリペプチドを、細菌細胞、例えば大腸菌、昆虫細胞(例えばバキュロウイルス発現系において)、酵母細胞または哺乳類細胞中で発現させることができる。いくつかの好適な宿主細胞は、さらにGoeddel (1990)、Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA中に討議されている。酵母S. cerevisiae中での発現のためのベクターの例には、pYepSecl(Baldariら(1987)、EMBO J. 6:229-234)、pMFa(KurjanおよびHerskowitz (1982)、Cell 30:933-943)、pJRY88(Schultzら(1987)、Gene 54:113-123)、およびpYES2(INVITROGEN Corporation, San Diego, CA)が含まれる。培養した昆虫細胞(例えばSf9細胞)中でタンパク質を産生するための核酸の発現のために有用なバキュロウイルスベクターには、pAc系列(Smithら(1983)、Mol. Cell. Biol. 3:2156-2165)およびpVL系列(LucklowおよびSummers (1989)、Virology 170:31-39)が含まれる。
哺乳類発現ベクターの例には、pCDM8(Seed (1987)、Nature 329:840)およびpMT2PC(Kaufmanら(1987)、EMBO J. 6:187-195)が含まれる。哺乳類細胞において用いる場合には、発現ベクターの制御機能は、しばしばウイルス調節要素により付与される。例えば、一般的に用いられているプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス2、サイトメガロウイルスおよびサルウイルス40から由来する。
本明細書中で討議した調節制御配列に加えて、組換え発現ベクターは、追加のヌクレオチド配列を含むことができる。例えば、組換え発現ベクターは、ベクターを包含している宿主細胞を識別するための、選択可能なマーカー遺伝子をコードすることができる。
ベクターを、原核細胞または真核細胞中に、慣用の形質転換またはトランスフェクション手法により導入することができる。本明細書中で用いる、形質転換およびトランスフェクションの用語は、外来の核酸(例えばDNA)を宿主細胞中に導入するための、種々の当該分野で認識されている手法を意味し、当該手法には、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈、DEAE−デキストランにより媒介されたトランスフェクション、リポフェクション、エレクトロポレーション、微量注入、DNA負荷リポソーム、リポフェクタミン−DNA複合体、細胞超音波処理、Agrobacteriumにより媒介された形質転換、高速微粒子銃を用いた遺伝子衝撃、およびウイルスにより媒介されたトランスフェクションが含まれる。宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトするのに適する方法は、Sambrookら(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版、Cold Spring Harbor Laboratory press (1989))および他の実験室マニュアル中に見出すことができる。
しばしば、細胞(特に哺乳類細胞)の小さい画分のみにより、外来のDNAがこれらのゲノム中に組み込まれる。これらの組み込み体を同定し、選択するために、選択可能なマーカー(例えば抗生物質に対して耐性である)をコードする核酸を、関連する核酸と共に、宿主細胞中に導入することができる。特定の態様において、選択可能なマーカーには、薬剤、例えばG418、ハイグロマイシンおよびメトトレキセートに対する耐性を付与するものが含まれる。選択可能なマーカーをコードする核酸を、関連する核酸を含むものと同一のベクター上の宿主細胞中に導入することができるかまたは、別個のベクター上に導入することができる。導入された核酸で安定にトランスフェクトされた細胞を、薬剤選択により同定することができる(例えば、選択可能なマーカー遺伝子を導入された細胞は、生存し、一方他の細胞は、死滅する)。
組換えタンパク質をまた、トランスジェニック植物中で産生することができ、ここで、タンパク質をコードする単離された核酸を、核または色素体ゲノム中に挿入する。植物および植物細胞を形質転換するためのベクター、植物、細胞培養物および方法は、当該分野として知られている。一般的に、Methods in Enzymology Vol. 153 (Recombinant DNA Part D) 1987, WuおよびGrossman編、Academic Pressおよび欧州特許出願第EP 693554号を参照。
植物細胞において、発現系は、しばしば、組換えTiおよびRiプラスミドベクター系から由来する。シャトルベクターの共組換え体群において、関連する遺伝子を、遺伝子組換えにより、植物形質転換に必要なシス作用性およびトランス作用性要素を共に含む、非発癌性のTiプラスミド中に挿入する。例示的なベクターには、pMLJ1シャトルベクター(DeBlockら(1984)、EMBO J. 3:1681-1689)および非発癌性のTiプラスミドpGV2850(Zambryskiら(1983)、EMBO J. 2:2143-2150)が含まれる。二元系において、関連する遺伝子を、植物形質転換に必要なシス作用性要素を含むシャトルベクター中に挿入する。他の必要な機能は、トランスにおいて、非発癌性Tiプラスミドにより提供されている。例示的なベクターには、pBIN19シャトルベクター(Bevan (1984)、Nucl. Acids Res. 12:8711-8721)および非発癌性TiプラスミドpAL4404(Hoekemaら(1983)、Nature 303:179-180)が含まれる。あるいはまた、CEL II核酸配列を、適切な調節配列と共に、植物細胞中に、遺伝子銃形質転換により、導入することができる。
植物発現系において用いられるプロモーターは、典型的には、植物細胞のゲノムから(例えば、熱ショックプロモーター;RUBISCOの小さいサブユニットについてのプロモーター;クロロフィルa/b結合タンパク質についてのプロモーター)、または植物ウイルスから(例えば、CaMVの35S RNAプロモーター;TMVのコートタンパク質プロモーター)由来する。植物におけるCEL II配列の発現は、構成的であるか、または一時的に、もしくは空間的に調節されていてもよい。CEL IIを発現するための例示的な植物には、タバコ(例えば葉における発現)、トウモロコシ(例えば種子における発現)またはジャガイモ(例えば塊茎における発現)が含まれるが、これらには限定されない。植物細胞系における発現が、さらに意図される。
本発明はさらに、本発明のスクリーニング方法および大規模なタンパク質生産方法において用いるための、CEL IIをコードする単離された核酸を含む培養した、または組換え細胞を提供する(例えば、CEL IIを、細胞から産生および採集し、随意に精製する)。
CEL IIをまた、動物においてインビボで産生することができる。従って、尚他の観点として、本発明は、当該分野において十分知られている方法により産生することができる、CEL IIをコードする単離された核酸を含むトランスジェニックの非ヒト動物を提供する。トランスジェニックの非ヒト動物は、鳥類および非ヒト哺乳類を含むすべての種であってもよい。本発明のこの観点において、好適な非ヒト哺乳類には、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ヤギ、ヒツジ、ブタおよびウシが含まれる。
CEL IIをコードする核酸は、トランスジェニック動物内の細胞中に安定に導入される(典型的には、ゲノム中への安定な組み込みにより、または安定に維持されたエピソーム作成物により)。十分な数の細胞が、CEL II導入遺伝子を含み、発現する限りは、すべての細胞が、導入遺伝子を含む必要はなく、動物は、改変された、および改変されていない細胞のキメラであってもよい。
トランスジェニック動物を作成する方法は、当該分野において知られている。DNA作成物を、鳥類または哺乳類の生殖系列中に導入して、トランスジェニック動物を作成することができる。例えば、作成物の1個または数個のコピーを、胚のゲノム中に、標準的なトランスジェニック手法により導入することができる。
例示的な態様において、トランスジェニック非ヒト動物を、非ヒト動物の生殖系列中に導入遺伝子を導入することにより、作成する。導入遺伝子を、胚標的細胞中に、種々の発生段階において導入することができる。胚標的細胞の発生の段階に依存して、種々の方法を用いる。用いるすべての動物の特定の系列(1または2以上)を、可能な場合には、一般的な良好な健康、良好な胚産生量、胚における良好な前核の視感度および良好な生殖適応度について、選択しなければならない。
導入遺伝子の胚中への導入を、当該分野において知られている種々の方法のいずれか、例えば微量注入、エレクトロポレーション、リポフェクションまたはウイルスベクターにより、達成することができる。例えば、導入遺伝子を、哺乳類中に、作成物を哺乳類受精卵(1または2以上)の前核中に微量注入して、発生している哺乳類(1または2以上)の細胞中に維持されるべき作成物の1個または2個以上のコピーを生じることにより、導入することができる。トランスジェニック作成物の受精卵中への導入に続いて、当該受精卵を、インビトロで、種々の量の時間にわたりインキュベートするか、または代理の宿主中に再び移植するか、またはこれらの両方とすることができる。1つの一般的な方法は、胚をインビトロで、種に依存して約1〜7日間インキュベートし、次にこれらを、代理の宿主中に再び移植することである。
トランスジェニック的に操作した胚の後代を、組織のセグメントの作成物の存在について試験することができる(例えばサザンブロット分析により)。ゲノム中に安定に組み込まれた、外因性のクローン化された作成物の1個または2個以上のコピーを有する胚を用いて、トランスジェニック的に加えられた作成物を有する永久的なトランスジェニック動物系を達成することができる。
トランスジェニック的に変化した動物を、生後に、子孫のゲノム中への作成物の導入について、アッセイすることができる。これを、後代からの染色体物質上に、ポリペプチドまたはこのセグメントをコードするDNA配列に相当するプローブをハイブリダイズすることにより、行うことができる。作成物の少なくとも1つのコピーをこれらのゲノム中に含むと見出されたこれらの後代を、成熟度に成長させる。
トランスジェニック鳥類を作成する方法はまた、当該分野において知られている。例えば、米国特許第5,162,215を参照。
大規模の生産のために、CEL IIポリペプチドを、培養した細胞またはトランスジェニック動物から精製することができる。典型的には、ポリペプチドを、体液(例えばミルクまたは卵)の培養培地から、分泌されたポリペプチドとして回収するが、分泌シグナルを伴わずに直接発現する場合には、これをまた、宿主細胞溶菌液から回収することができる。CEL IIを、セロリ起源のもの以外の組換え細胞中で発現させる場合には、CEL IIは、セロリ起源のタンパク質またはポリペプチドを完全に含まない。しかし、組換え細胞タンパク質またはポリペプチドからCEL IIを精製して、CEL IIに関して実質的に均質な調合液を得ることが、必要である。
最初の段階として、培養培地または溶菌液を、遠心分離して、粒子状の細胞残骸を除去する。次に、膜および可溶性タンパク質画分を、分離する。次に、CEL IIを、可溶性タンパク質画分から精製することができる。次に、CEL IIを、本明細書中に開示したように、または例えば以下の好適な精製手順を用いて、汚染可溶性タンパク質およびポリペプチドから精製することができる:免疫親和性における分別またはイオン交換カラム;エタノール沈殿;逆相HPLC;シリカ上の、または陽イオン交換樹脂、例えばDEAE上のクロマトグラフィー;等電点電気泳動;SDS−PAGE;硫酸アンモニウム沈殿;例えばSEPHADEX(登録商標)G−75を用いたゲル濾過;およびリガンドアフィニティークロマトグラフィー。
CEL IIの好適に純粋な調合液を、CELエンドヌクレアーゼ活性について、DNA切れ目挿入アッセイ、DNA分解酵素可溶化アッセイまたはミスマッチエンドヌクレアーゼアッセイが含まれるが、これらには限定されない、1種または2種以上の十分知られているアッセイを用いて、分析することができる。精製された生成物をまた、電気泳動分離、例えばポリアクリルアミドゲル電気泳動により、分析することができる。
精製されたCEL II調合液を、二本鎖DNAにおけるミスマッチの存在を検出するかまたは、二本鎖DNA中の二本鎖DNAミスマッチにおける突然変異の部位を決定するための方法において、用いることができる。このような方法の例は、米国特許第5,869,245号および6,027,898号中に見出される。本明細書中に開示されている核酸配列、ベクターおよび宿主細胞から産生されたCEL IIを、二本鎖DNAの試料を分析するための方法において用いて、この中の突然変異の存在を決定することができることが、意図される。このような方法は、二本鎖DNAを含む試料(例えば、生物学的試料、細胞、組織など)を、単離されたCEL IIエンドヌクレアーゼと接触させ、CEL IIエンドヌクレアーゼ消化の産物を分離し、前述の産物を検出することを含む。
断片(即ち、アガロースゲル上で決定される、1つのバンドの2つもしくは3つ以上のバンドへのCEL II消化)の数の増大または、CEL IIエンドヌクレアーゼの存在下でのDNAの大きさの低下は、前述のDNAにおけるミスマッチの指標となる。CEL IIエンドヌクレアーゼ消化の産物を分離する段階を、ゲル電気泳動、毛細管電気泳動またはクロマトグラフィー分離、例えば整合イオンポリヌクレオチドクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーまたは逆相クロマトグラフィーを用いて行うことができる。DNA分子を検出するための標準的な方法は、当該分野において十分知られている(例えば、臭化エチジウム染色またはUV光吸収;放射性同位体またはフルオロフォアでの標識)。
本発明を、以下の非限定的な例により、一層詳細に記載する。
例1:材料およびアッセイ
材料。子ウシ胸腺DNA(SIGMA, St Louis, MO)を、プロテイナーゼK処理およびフェノール抽出の繰り返されたサイクルにより精製し、超音波処理により粘度を低下させ、沸騰水浴中で10分間加熱することにより変性させ、続いて湿潤氷上で迅速に冷却した。Q SEPHAROSE(登録商標)高速流、ヘパリンSEPHAROSE(登録商標)高速流、G-25 SEPHADEX(登録商標)、SEPHACRYL(登録商標)S−100 HR、およびConA-SEPHAROSE(登録商標)マトリックス並びにHIPREP(登録商標)16/10ヘパリンSEPHAROSE(登録商標)高速流、 MONO S(登録商標)HR 5/5、HITRAP(登録商標)ヘパリンHP、およびMONO Q(登録商標)HR 5/5カラムは、AMERSHAM(登録商標)PHARMACIA(登録商標)Biotech(Piscataway, NJ)からのものであった。合成オリゴヌクレオチドは、INVITROGEN(登録商標)(Carlsbad, CA)からのものであった。
例1:材料およびアッセイ
材料。子ウシ胸腺DNA(SIGMA, St Louis, MO)を、プロテイナーゼK処理およびフェノール抽出の繰り返されたサイクルにより精製し、超音波処理により粘度を低下させ、沸騰水浴中で10分間加熱することにより変性させ、続いて湿潤氷上で迅速に冷却した。Q SEPHAROSE(登録商標)高速流、ヘパリンSEPHAROSE(登録商標)高速流、G-25 SEPHADEX(登録商標)、SEPHACRYL(登録商標)S−100 HR、およびConA-SEPHAROSE(登録商標)マトリックス並びにHIPREP(登録商標)16/10ヘパリンSEPHAROSE(登録商標)高速流、 MONO S(登録商標)HR 5/5、HITRAP(登録商標)ヘパリンHP、およびMONO Q(登録商標)HR 5/5カラムは、AMERSHAM(登録商標)PHARMACIA(登録商標)Biotech(Piscataway, NJ)からのものであった。合成オリゴヌクレオチドは、INVITROGEN(登録商標)(Carlsbad, CA)からのものであった。
DNA配列決定。個別の大腸菌コロニーを、液体培養において、37℃で一晩成長させた。プラスミドDNAを、プラスミドミニプレップキット(QIAGEN(登録商標)、Valencia, CA)を用いて単離し、適切な遺伝子を、ABI 3100遺伝子分析装置(ABI, Foster City, CA)を用いて配列決定した。
PCR断片でのミスマッチ切断アッセイ。プラスミドpQIS155は、pET22b(NOVAGEN(登録商標)、Madison, WI)のNdeI部位とXhoI部位との間にクローン化された、CEL I(Yangら(2000))についての遺伝子の誘導体を含む。GENETAILOR(登録商標)部位特異的変異誘発システム(INVITROGEN(登録商標)、Carlsbad, CA)を用いて、pQIS155のCEL I遺伝子中の標的部位と呼ばれる、位置605におけるCを、A、GおよびTに変更するか、または1個、2個、3個、6個、9個および12個の塩基の挿入を、当該部位において行った。プラスミドDNAを、大腸菌DH5α(INVITROGEN(登録商標)、Carlsbad, CA)中に形質転換し、細胞を、LB培地+100μg/mLのアンピシリン中で成長させた。プラスミドDNAを、プラスミドミニキット(QIAGEN(登録商標)、Valencia, CA)を用いて単離した。プラスミドを、標的部位におけるこれらの配列に基づいて命名した。例えば、pQIS155Gは、標的部位においてGを有する。
632bp断片を、pQIS155プラスミドDNAから増幅し、この誘導体は、以下のプライマー(INVITROGEN(登録商標)、Carlsbad, CA)を用いた:pCELR:5’−CGC CAA AGA ATG ATC TGC GGA GCT T−3’(配列番号:10)およびpCEL190F:5’−ACA CCT GAT CAA GCC TGT TCA TTT GAT TAC−3’(配列番号:11)。PCRを、OPTIMASE(登録商標)ポリメラーゼ(Transgenomic, Omaha, NE)で、推薦された反応条件を用いて行った。PCR反応において産生された増幅されたDNAの量および品質を、DNA産物の、アガロースゲル電気泳動により分別されたDNA質量ラダー(NEB, Beverly, MA)に対する視覚的比較により、決定した。
ヘテロ二本鎖を、等量のpQIS155から調製した増幅されたDNAおよびこの誘導体の1種をアニールすることにより、形成した。DNAハイブリダイゼーションを、以下のプログラムを用いた熱サイクラー(thermocycler)において、行った:95℃で10分間;−2℃/秒において95℃から85℃;および−0.1℃/秒において85℃から25℃。2種の異なる対立遺伝子を、1:1の混合物においてアニールした場合には、ミスマッチヘテロ二本鎖が、当初の約50%で形成する。各々の塩基の変化について、2種のミスマッチが、形成する。改善されたホモ二本鎖(homoduplex)は、集団の他の50%を構成する。
アニールしたDNA(200ng)を、20mMのTris−HCl、pH7.4、25mMのKCl、10mMのMgCl2を含む5単位(pH8.5)のCEL IIを20μLの容積で、および100単位のT4DNAリガーゼを用いて消化した。アニールしたDNA(200ng)をまた、5単位のCEL IIヌクレアーゼを1×PCR緩衝液中のDNAに直接加えることにより、消化することができる。消化反応を、42℃で20分間インキュベートし、2μLの0.5MのEDTAを加えることにより、停止した。切断産物を、2%アガロースゲルキャスト上で分別し、1×TAE緩衝液(40mMのTris−酢酸、pH8.3、1mMのEDTA)中を移動させた。ゲルを、臭化エチジウムで染色し、UV透視により撮影した。
HPLCにより分析するべきアニールしたDNA(400ng)を、20mMのTris−HCl、pH7.4、25mMのKClおよび10mMのMgCl2を含む所望の量のCEL IまたはCEL IIを40μLの容積で用いて消化した。アニールしたDNA(400ng)をまた、所望の量のCEL IまたはCEL IIで、酵素を1×PCR緩衝液中のDNAに直接加えることにより、消化することができる。消化反応を、42℃で20分間インキュベートし、4μLの0.5MのEDTAを加えることにより、停止した。発生した切断産物(40μL)を、260nmにおけるUV検出を用いたWAVEシステム(Transgenomic, Omaha, NE)上で、分離した。DNASEP(登録商標)カートリッジを、50℃で、非変性条件下で移動させて、DNA断片を大きさに基づいて分離した。
DNA分解酵素可溶化アッセイ。2種の可溶化アッセイを、pH5.5および8.5において行った。pH5.5における反応混合物(50μL)は、20mMの酢酸ナトリウム(pH5.5)、10mMのKCl、0.5mg/mLの変性子ウシ胸腺DNAおよび種々の量のCELヌクレアーゼを含んでいた。pH8.5における反応混合物は、緩衝液が、20mMのTris−HCl(pH8.5)、10mMのKClおよび3mMのMgCl2であった以外は、同一の成分を含んでいた。反応を、37℃で10分間インキュベートし、0.2NのHCl中の低温の20mMのLaCl3を50μL加えることにより、終了した。氷上で10分およびEPPENDORF(登録商標)微量遠心管中で13,000rpmにおいて10分間遠心分離した後に、上清の260nmにおける吸光度を、分光光度計において測定して、可溶化されたDNAの量を決定した。1単位の可溶化活性(CELヌクレアーゼ単位)は、1ngの酸可溶性物質を1分間で37℃において産生するのに必要な酵素の量である。
オリゴヌクレオチドを用いたミスマッチ切断アッセイ。ミスマッチエンドヌクレアーゼアッセイを、Oleylowskiら((1998)、上記)により、当該文献の図1B中に記載されているように、整合した、およびミスマッチのDNA64量体二本鎖を用いた標準的な方法(Oleykowskiら(1998)、上記)を用いて、行った。用いた二本鎖は、平滑な末端を有していた。所望されるDNAオリゴヌクレオチドを、5’末端において、[γ−32P]ATPおよびT4ポリヌクレオチドキナーゼで標識した場合(Sambrookら、(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版、Cold Spring Harbor Laboratory press (1989))。ミスマッチエンドヌクレアーゼアッセイのための反応混合物(20μL)は、20mMのTris−HCl(pH7.4)、25mMのKCl、10mMのMgCl2、500ngの標識していないDNA64量体二本鎖または5ngの5’末端を標識した二本鎖、およびCELヌクレアーゼを含んでいた。
標識した二本鎖を用いた場合には、Taq DNAポリメラーゼ(2.5単位;PROMEGA(登録商標)、Madison WI)を加え、インキュベーションを、42℃で5分間とした。標識していない二本鎖を用いた場合には、インキュベーションを、42℃で30分間とした。プロテイナーゼK(2μg)を、30分の終了時に加え、インキュベーションを、42℃で5分間継続した。インキュベーションを、1.5μLの70%(w/v)スクロース、50mMのEDTA、5mMの1,10−フェナントロリン、0.1%(w/v)のキシレンシアノールおよび0.4%(w/v)のブロモフェノールブルーを加えることにより、終了した。DNAを、12%のPAGEゲル上で分別した。標識していないDNAを、尿素を含まないゲル上で移動させ、ゲルを、臭化エチジウムで染色し、ゲルを、254nmにおいてUVトランスイルミネータにより照射して、KODAK(登録商標)EDAS 290システムを用いて撮影した。標識したDNAを、7Mの尿素を含まない、および含むゲルの両方上を移動させた。ゲルを乾燥し、放射活性を、PHOSPHORIMAGER(登録商標)(MOLECULAR DYNAMICS(登録商標)、Sunnyvale CA)上で分析した。
SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)。SDS−PAGE(Sambrookら(1989)、上記)を、14%または10〜20%のプレキャストポリアクリルアミドゲル(INVITROGEN(登録商標)、Carlsbad, CA)において行った。タンパク質を、TCA沈殿、続いてSDS試料緩衝液中で加熱する前のアセトン洗浄により、濃縮した。タンパク質バンドを、銀染色(BIO-RAD(登録商標)、Hercules, CA)により検出した。MARK 12(登録商標)(INVITROGEN(登録商標)、Carlsbad, CA)タンパク質標準を、試行して、分子量を確立した。
タンパク質濃度の決定。タンパク質の濃度を、ビシンコニン酸タンパク質アッセイ(Pierce, Rockford, IL)を用いて、ウシ血清アルブミンを標準として決定した。
例2:CELヌクレアーゼの精製
すべての段階を、4℃で行った。カラムクロマトグラフィーの間、ヌクレアーゼ活性を、DNA分解酵素可溶化アッセイをpH5.5および8.5において行ってモニタリングした。
すべての段階を、4℃で行った。カラムクロマトグラフィーの間、ヌクレアーゼ活性を、DNA分解酵素可溶化アッセイをpH5.5および8.5において行ってモニタリングした。
粗製の抽出物の調製。冷却したセロリの茎(15〜20房)を、フードプロセッサ中で細分化し、WARING(登録商標)ブレンダー中でホモジナイズした。絞り汁を、果肉から、4層のチーズクロスを通して果肉を乾燥するまで搾り取ることにより、採集した。絞り汁を、5,000×gにおいて20分間遠心分離して、緑色の顆粒状物質を除去した。透明にした琥珀色の絞り汁を、ConA緩衝液(100mMのTris−HCl、pH7.7、100μMのフッ化フェニルメチルスルホニル(PMSF))の組成に、1MのTris−HCl(pH7.7)および0.1MのPMSFを加えることにより、調整した。固体の(NH4)2SO4を、絞り汁に、飽和の80%に(51.6g/100mL)加え、懸濁液を、2時間攪拌した。懸濁液を、10,000×gで30分間遠心分離して、堅固なタンパク質ペレットを回収した。ペレットを、700〜800mLのConA緩衝液に溶解した。(NH4)2SO4を、飽和の15%(8.4g/100mL)に溶解し、懸濁液を、30分間攪拌した。懸濁液を、10,000×gで30分間遠心分離し、ペレットを廃棄した。
コンカナバリンA−SEPHAROSE(登録商標)アフィニティークロマトグラフィー。ConA−SEPHAROSE(登録商標)(100mL)(ジメチルスベルイミデート(dimethyl suberimidate)で架橋した)を、直径2.5cmのカラム中に詰め込み、ConA洗浄緩衝液(ConA緩衝液+0.5MのKCl)で平衡にした。(NH4)2SO4上清を、カラム上に、0.75mL/分の流速で一晩負荷させた。次に、カラムを分解し、樹脂を、ブフナー漏斗中で、6〜8リットルのConA洗浄緩衝液で洗浄した。次に、洗浄した樹脂を、2.5cmのカラム中に、ConA洗浄緩衝液を用いて再び詰め込んだ。CELヌクレアーゼを、100mLのConA洗浄緩衝液+0.5Mのα−メチルマンノシドで溶離させた。溶離を、さらに4回繰り返した。溶出液を併せ、TRITON(登録商標)X−100中0.01%とした。
G−25SEPHADEX(登録商標)クロマトグラフィー。ConA−SEPHAROSE(登録商標)プールを、緩衝液A(50mMのTris−HCl、pH8.0、5mMのα−メチルマンノシド、0.01%のTRITON(登録商標)X−100)で平衡にした2L(10×26cm)のG−25SEPHADEX(登録商標)カラム上で脱塩した。カラムを、緩衝液A+100μMのPMSF中で、25〜30mL/分において展開した。タンパク質が、700mlと1,400mlとの間の溶離容積で溶離し、これをプールした。このプールを、1Mのα−メチルマンノシドを加えることにより、α−メチルマンノシド中50mMとした。
Q SEPHAROSE(登録商標)クロマトグラフィー。脱塩したConAプールを、緩衝液A+45mMのα−メチルマンノシドで平衡にした、50mlのQ SEPHAROSE(登録商標)高速流カラム(2.5×10cm)上に、〜0.5mL/分で一晩負荷させた。カラムを、250mLの緩衝液A+45mMのα−メチルマンノシドで洗浄した。CELヌクレアーゼを、緩衝液A+45mMのα−メチルマンノシド中0〜0.5MのKClの500mL直線状勾配で、溶離させた。DNAエクソヌクレアーゼ活性(これは、pH5.5における可溶化アッセイにおいて活性であったが、pH8.5においては活性ではなかった)の大きいピークが、時々観察され、これは、0.05Mと0.12Mとの間のKClで、Q SEPHAROSE(登録商標)から溶離した。
CELヌクレアーゼは、pH5.5の可溶化アッセイに基づいて0.12Mと0.18Mとの間のKClで、およびpH8.5の可溶化アッセイに基づいて0.12Mと0.35Mとの間のKClで溶離した。フラクションを、0.12Mと0.35Mとの間のKClでプールし、低い濃度のKClにおけるエクソヌクレアーゼおよび高い濃度のKClにおける主要なタンパク質汚染物を回避した。汚染タンパク質の大部分が、KCl濃度が増大するに伴って溶離したため、0.35Mより高いKClのプールを、回避した。CEL II活性(pH8.5において活性である)をすべてプールすることと、比較的高い濃度のKClで溶離した汚染タンパク質を排除することとの間で、妥協があった。CEL IおよびCEL IIを、一緒にプールした。
CELヌクレアーゼピークフラクションを、プールし、緩衝液B(25mMのKPO4、pH7.0、5mMのα−メチルマンノシド、0.01%のTRITON(登録商標)X−100)+100μMのPMSFに対して透析した。
ヘパリンSEPHAROSE(登録商標)クロマトグラフィー。Q SEPHAROSE(登録商標)からの透析したCELヌクレアーゼプールを、α−メチルマンノシド中50mMとし、緩衝液B+45mMのα−メチルマンノシド中で平衡にした、20mLのHIPREP(登録商標)16/10ヘパリンFFカラム(0.6×18cm)上に、1mL/分で負荷させた。カラムを、100mLの緩衝液B+45mMのα−メチルマンノシドで、2mL/分で洗浄した。CELヌクレアーゼを、緩衝液B+45mMのα−メチルマンノシド+100μMのPMSF中で、2mL/分において、4mL/フラクションで、0〜0.3MのKClの200mLの直線状勾配で溶離させた。
フラクションを、pH5.5および8.5においてアッセイした。CEL IおよびCEL IIを、ヘパリンSEPHAROSE(登録商標)クロマトグラフィーにより部分的に分離した。タンパク質汚染物の主要なピークは、0.02〜0.12MのKClにおいて溶離した。CEL II(pH8.5において一層高い活性)は、0.06〜0.18MのKClにおいて溶離した。CEL I(pH5.5において一層高い活性)は、0.12〜0.22MのKClにおいて溶離した。CEL IIを、低濃度のKCl側において、狭い範囲でプールして、タンパク質汚染を回避し、高濃度のKCl側においてプールして、CEL Iを回避した(0.09〜0.15MのKClでのプール)。CEL Iを、0.15〜0.21MのKClにおいてプールした。CEL IIの精製を、その後行った。
CEL Iプールを、2リットルの緩衝液A+100μMのPMSFに対して一晩透析し、最終的に精製するまで4℃で貯蔵した。
CEL IIプールを、MONO S(登録商標)クロマトグラフィーについての調製において、2リットルの緩衝液C(10mMのPIPES−NaOH、pH7.2、5mMのα−メチルマンノシド、0.01%のTRITON(登録商標)X−100)+100μMのPMSFに対して一晩透析した。
CEL IIプールを、MONO S(登録商標)クロマトグラフィーについての調製において、2リットルの緩衝液C(10mMのPIPES−NaOH、pH7.2、5mMのα−メチルマンノシド、0.01%のTRITON(登録商標)X−100)+100μMのPMSFに対して一晩透析した。
CEL IIのMONO S(登録商標)HR 5/5クロマトグラフィー。緩衝液C中の、ヘパリンSEPHAROSE(登録商標)カラムからの透析したCEL IIプールを、1Mのα−メチルマンノシドを加えることにより、α−メチルマンノシド中50mMとし、pHを、1MのPIPES(pH6.0)(〜2mL)を加えることにより、6.2に調整した。試料を、緩衝液D(50mMのPIPES−NaOH、pH6.2、5mMのα−メチルマンノシド、0.01%のTRITON(登録商標)X−100)+45mMのα−メチルマンノシド+100μMのPMSF中で平衡にした1mLのMONO S(登録商標)HR 5/5カラム上に、0.5mL/分において負荷させた。カラムを、5mLの緩衝液D+45mMのα−メチルマンノシド+100μMのPMSFで、1mL/分において洗浄した。
CELヌクレアーゼを、緩衝液D+45mMのα−メチルマンノシド+100μMのPMSF中で、1mL/分において、0.5mL/フラクションで、0〜0.3MのKClの25mLの直線状勾配で溶離させた。可溶化アッセイを、pH5.5および8.5において行った。タンパク質汚染物の主要なピークは、0.05〜0.21MのKClにおいて溶離した。CEL Iは、0.15〜0.22MのKClにおいて溶離した。CEL IIは、0.18〜0.28MのKClにおいて溶離した。CEL IIを、0.21〜0.26MのKClの狭い範囲でプールして、タンパク質汚染を可能な限り回避し、CEL Iを、低濃度のKCl側においてプールした。プールした後に、1MのTris−HCl(pH8.0)を、直ちに加えて、pHを、8.0とした(〜0.5mLのTrisを、3〜3.5mLのプールした酵素に加えた)。
CEL IIプールを、1リットルの緩衝液A+100μMのPMSFに対して、一晩透析した。
CEL IIのMONO Q(登録商標)HR 5/5クロマトグラフィー。MONO S(登録商標)カラムからの透析したCEL IIプールを、α−メチルマンノシド中50mMとし、緩衝液A+45mMのα−メチルマンノシド中で平衡にしたMONO Q(登録商標)HR 5/5カラム上に、0.5mL/分において負荷させた。カラムを、5mLの緩衝液A+45mMのα−メチルマンノシドで、1mL/分において洗浄した。CEL IIを、緩衝液A+45mMのα−メチルマンノシド中で、1mL/分において、0.5mL/フラクションで、0〜0.3MのKClの25mLの直線状勾配で溶離させた。可溶化アッセイを、pH8.5において行った。CEL IIは、0.1〜0.25MのKClにおいて溶離した。CEL IIを、0.1〜0.18MのKClの狭い範囲でプールして、一層高い、および一層低い濃度のKClにおいて溶離したタンパク質汚染物を回避した。
CEL IIプールを、1リットルの貯蔵緩衝液(50mMのTris−HCl、pH7.5、100mMのKCl、10μMのZnCl2、0.01%のTRITON(登録商標)X−100、50%のグリセロール)に対して一晩透析し、−20℃で貯蔵した。
緩衝液Cに対してのCEL Iの透析。緩衝液A中に4℃で貯蔵したCEL IヘパリンSEPHAROSE(登録商標)プールを、HITRAP(登録商標)ヘパリンHPクロマトグラフィーの前に、2リットルの緩衝液C+100μMのPMSFに対して一晩透析した。
CEL IのHITRAP(登録商標)ヘパリンHPクロマトグラフィー。透析したヘパリンSEPHAROSE(登録商標)CEL Iプールを、α−メチルマンノシド中50mMとし、pHを、1MのPIPES(pH6.0)(〜2mL)を加えることにより、6.2に調整した。プールを、緩衝液D+45mMのα−メチルマンノシド中で平衡にした1mLのHITRAP(登録商標)ヘパリンHPカラム上に、0.5mL/分において負荷させた。カラムを、5mLの緩衝液D+45mMのα−メチルマンノシドで、1mL/分において洗浄した。CEL Iを、緩衝液D+45mMのα−メチルマンノシド中で、1mL/分において、0.5mL/フラクションで、0〜0.5MのKClの20mLの直線状勾配で溶離させた。アッセイを、pH5.5において行った。主要なタンパク質汚染ピークは、0.1〜0.38MのKClにおいて溶離した。CEL Iは、0.32〜0.47MのKClにおいて溶離した。CEL Iを、狭い範囲でプールして、一層低い濃度のKCl、即ち0.35〜0.45MのKClにおいて溶離したタンパク質汚染物を回避した。プールした後に、1MのTris−HCl(pH8.0)を、直ちに加えて、pHを、8.0とした(〜0.5mLのTrisを、3〜3.5mLのプールした酵素に加えた)。
CEL Iプールを、1リットルの緩衝液A+100μMのPMSFに対して、一晩透析した。
CEL IのMONO Q(登録商標)HR 5/5クロマトグラフィー。HITRAP(登録商標)ヘパリンHPからの透析したCEL Iプールを、α−メチルマンノシド中50mMとし、緩衝液A+45mMのα−メチルマンノシド中で平衡にしたMONO Q(登録商標)HR 5/5カラム上に、0.5mL/分において負荷させた。カラムを、5mLの緩衝液A+45mMのα−メチルマンノシドで、1mL/分において洗浄した。CEL Iを、緩衝液A+45mMのα−メチルマンノシド中で、1mL/分において、0.5mL/フラクションで、0〜0.3MのKClの25mLの直線状勾配で溶離させた。フラクションを、pH5.5においてアッセイした。CEL Iは、0.09〜0.15MのKClにおいて溶離した。CEL I活性のピークフラクションを、0.11〜0.13MのKClでプールした。
CEL Iプールを、貯蔵緩衝液に対して一晩透析し、−20℃で貯蔵した。
精製モニタリング。精製を、実施単位および各々の精製段階からのプールに対するタンパク質決定により、モニタリングした。このようなモニタリングの結果を、表3に示し、これは、各々の段階における精製からの典型的な収率および精製倍数結果を示す。さらに、各々のクロマトグラフィー段階について、グラフをプロットして、合理的なプール決定を行った。これらのグラフは、タンパク質濃度、pH5.5および8.5における単位活性、並びに塩濃度についてのプロフィールを含んでいた。
SEPHACRYL(登録商標)S−100 HRゲル濾過。CEL IIMONO Q(登録商標)濃縮物(表3;500μL)を、緩衝液A+0.15MのNaClに対して透析し、緩衝液A+0.15MのNaCl中で、0.25mL/分において展開したSEPHACRYL(登録商標)S−100 HRカラム(1.5×28cm;50mL)上で分別した。カラム空洞容積は、18.3mLであった。卵白アルブミン(43kDa)が、23.2mLにおいて溶離し、CEL IIが、24.5mL(35.5kDa)において鋭いピークとして溶離した。
b CEL Iは、SDS−PAGEゲルの視覚的調査により決定して、80%均一であった。
c CEL IIは、SDS−PAGEゲルの視覚的調査により決定して、25%均一であった。
例3:CEL IIのアミノ酸配列決定
SDS−PAGE、PVDF膜上へのエレクトロブロッティング(electroblotting)およびアミノ酸分析。CEL IIヌクレアーゼ(MONO Q(登録商標)で濃縮したプール;表3)を、希釈緩衝液(25mMのTris−HCl、pH7.5、100mMのKCl、10μMのZnCl2)中に緩衝液交換し、MICROCON(登録商標)YM−10濃縮器(AMICON(登録商標)、Billerica, MA)を用いることにより、濃縮した。試料を、濃縮器中で12,000rpmにおいて、EPPENDORF(登録商標)5415D微量遠心管中で、4℃で遠心分離した。濃縮したタンパク質を、等しい容量の低温の30%TCAを加え、当該管を氷上に30分間配置することにより、沈殿させた。試料を、12,000rpmにおいて4℃で10分間遠心分離し、上清を廃棄し、ペレットを、低温のアセトンで洗浄した。遠心分離後に得られたペレットを、自然乾燥し、β−メルカプトエタノールを含むSDS−PAGE試料緩衝液に溶解した。
SDS−PAGE、PVDF膜上へのエレクトロブロッティング(electroblotting)およびアミノ酸分析。CEL IIヌクレアーゼ(MONO Q(登録商標)で濃縮したプール;表3)を、希釈緩衝液(25mMのTris−HCl、pH7.5、100mMのKCl、10μMのZnCl2)中に緩衝液交換し、MICROCON(登録商標)YM−10濃縮器(AMICON(登録商標)、Billerica, MA)を用いることにより、濃縮した。試料を、濃縮器中で12,000rpmにおいて、EPPENDORF(登録商標)5415D微量遠心管中で、4℃で遠心分離した。濃縮したタンパク質を、等しい容量の低温の30%TCAを加え、当該管を氷上に30分間配置することにより、沈殿させた。試料を、12,000rpmにおいて4℃で10分間遠心分離し、上清を廃棄し、ペレットを、低温のアセトンで洗浄した。遠心分離後に得られたペレットを、自然乾燥し、β−メルカプトエタノールを含むSDS−PAGE試料緩衝液に溶解した。
試料を、14%のTris−グリシンゲル(INVITROGEN(登録商標)、Carlsbad, CA)上で分離した。次に、タンパク質を、25ボルト(一定の電圧)で1時間、1×エレクトロブロット緩衝液(10mMのCAPS、pH11.0、10%メタノール)を用いて、PVDF膜上に電気移送した(electro-transferred)。膜を、0.1%のPonceau S(SIGMA)中で、5分間染色し、次に、1%酢酸中で脱染した。CEL IIは、還元剤の存在下で、〜16kDaおよび〜28kDaにおいて2つの断片として分離した。このバンドの各々を含むPVDF膜の切片を、切り出し、アミノ末端において配列決定した。CEL IIの断片のアミノ末端アミノ酸配列は、以下の通りであった:
16KDa断片:Xaa−Xaa−Lys−Gln−(Gly)−(His)−Phe−Ala−Ile−Xaa−Lys−Ile−Xaa−Gln−Xaa−(Phe);配列番号:6、および
28KDa断片:Xaa−(Asn)−Asn−Xaa−Thr−Glu−Ala−Leu−Met;配列番号:7
ここで、Xaaは、未決定のアミノ酸の存在を示し、丸括弧は、ある不確定度を示す。
16KDa断片:Xaa−Xaa−Lys−Gln−(Gly)−(His)−Phe−Ala−Ile−Xaa−Lys−Ile−Xaa−Gln−Xaa−(Phe);配列番号:6、および
28KDa断片:Xaa−(Asn)−Asn−Xaa−Thr−Glu−Ala−Leu−Met;配列番号:7
ここで、Xaaは、未決定のアミノ酸の存在を示し、丸括弧は、ある不確定度を示す。
CEL I遺伝子とのアミノ酸配列の相同性に基づいて、16kDaの断片は、CEL IIタンパク質のアミノ末端から由来しており、28kDaの断片は、当該タンパク質のカルボキシ末端から由来していた。縮重したオリゴヌクレオチドプライマーを、これらの配列から設計して、CEL II遺伝子を、セロリcDNAからクローン化した。これらは、以下の通りである:
(順方向プライマー)5’−AAR CAR GGH CAY TTY GCH AT−3’(配列番号:12)および
(逆方向プライマー)5’−AAC ATY ARD GCY TCY GT−3’(配列番号:13)、
ここで、R=AまたはG;H=A、CまたはT;Y=CまたはT;およびD=A、GまたはT。
(順方向プライマー)5’−AAR CAR GGH CAY TTY GCH AT−3’(配列番号:12)および
(逆方向プライマー)5’−AAC ATY ARD GCY TCY GT−3’(配列番号:13)、
ここで、R=AまたはG;H=A、CまたはT;Y=CまたはT;およびD=A、GまたはT。
例4:CEL II核酸配列の単離
セロリからの全RNAの単離。全RNAを、凍結したセロリの茎から、CONCERT(登録商標)植物RNA試薬(INVITROGEN(登録商標)、Carlsbad, CA)を用いて、小規模RNA単離プロトコルに従って単離した。凍結したセロリの茎を、乳鉢および乳棒で、粉末に粉砕した。低温の植物RNA試薬(粉砕した組織0.1gあたり0.5mL)を、粉砕した組織に加え、試験管を、室温で5分間インキュベートした。懸濁液を、室温で遠心分離により透明にした(12,000×g、2分間)。NaCl(5M;0.1mL)を、透明にした抽出物に加え、内容物を、温和に反転させることにより混合した。
セロリからの全RNAの単離。全RNAを、凍結したセロリの茎から、CONCERT(登録商標)植物RNA試薬(INVITROGEN(登録商標)、Carlsbad, CA)を用いて、小規模RNA単離プロトコルに従って単離した。凍結したセロリの茎を、乳鉢および乳棒で、粉末に粉砕した。低温の植物RNA試薬(粉砕した組織0.1gあたり0.5mL)を、粉砕した組織に加え、試験管を、室温で5分間インキュベートした。懸濁液を、室温で遠心分離により透明にした(12,000×g、2分間)。NaCl(5M;0.1mL)を、透明にした抽出物に加え、内容物を、温和に反転させることにより混合した。
等しい容積のクロロホルムを、試験管に加え、内容物を、反転により混合し、試料を、4℃で遠心分離(12,000×g、10分間)して、相を分離した。最上部の水性相を、新たな試験管に移送し、等しい容量のイソプロパノールを、試験管に加えた。試料を混合し、室温で10分間放置し、4℃で遠心分離した(12,000×g、10分間)。上清を、デカンテーションし、ペレットを、75%エタノールで洗浄した。短時間の遠心分離(12,000×g、2分間)の後に、液体を、注意深く除去し、ペレットを、RNA分解酵素を含まない水に溶解した。260nmにおける吸光度を測定し、RNAの濃度を計算した。
第一鎖cDNA合成およびPCR。第一鎖cDNAを、CREATOR(登録商標)SMART(登録商標)cDNAライブラリー構成キット(CLONTECH(登録商標)Laboratories Inc., Palo Alto, CA)を用いて合成した。全RNA(〜1μg)を、キットプライマーSMART(登録商標)IVおよびCDS III/3’PCRプライマーで、65℃で5分間インキュベートすることにより、アニールした。1×第一鎖緩衝液、2mMのDTT、1mMの各々のdNTPおよびPOWERSCRIPT(登録商標)逆転写酵素を含むcDNA合成反応(10μL)を、42℃で60分間インキュベートした。CEL IIペプチドのアミノ末端配列に基づいて設計された縮重オリゴヌクレオチドおよび第一鎖cDNAを鋳型として用いて、PCRを、ADVANTAGE(登録商標)2ポリメラーゼ混合物(CLONTECH(登録商標)Laboratories Inc.)を用いて行った。CEL II遺伝子断片のアミノ末端の推定された位置に基づいて、CEL II遺伝子の〜300ないし400bpの5’部分を、予測した。
増幅された産物のゲル分析により、〜100bpないし〜1,500bpの長さの一般的な塗抹が、いくつかの特定的なバンドと共に示された。200〜400bpの領域におけるDNA塗抹を、ゲルから切り取り、DNAを、QIAQUICK(登録商標)ゲル抽出キット(QIAGEN(登録商標)、Valencia, CA)を用いて抽出した。これを、1×ADVANTAGE(登録商標)2 PCR緩衝液、0.2mMの各々のdNTP、0.2μMの各々のプライマー、増幅されたDNA、および1×ADVANTAGE(登録商標)2ポリメラーゼ混合物を含む反応混合物中での縮重したプライマーでの増幅のための鋳型として、再び用いた。PCRサイクリング条件は、94℃で15秒間、55℃で15秒間、および68℃で1分間の10サイクル、続いて94℃で15秒間、50℃で15秒間、および68℃で1分間の10サイクル、続いて94℃で15秒間、45℃で15秒間、および68℃で1分間の10サイクルであった。
大きさが〜350bpの特定のPCRバンドが、ゲル分析により観察され、これを切り取り、抽出した。PCR断片を、pCR 2.1-TOPO(登録商標)ベクター(INVITROGEN(登録商標))中に、TOPO TA CLONING(登録商標)キットを用いてクローン化した。DNAを、16個のコロニーから単離し、各々の挿入物のDNA配列を、ベクターに相補的なプライマーを用いて決定した。16個のうちの1つのみのDNA配列は、翻訳された場合には、CEL IIペプチド断片のアミノ酸配列に整合する末端において、アミノ酸配列を有していた。DNA配列(5’から3’)およびこのクローンについて得られた対応するアミノ酸配列を、本明細書中で、それぞれ配列番号:14および配列番号:15として示す。
cDNAライブラリー構成。第一鎖cDNAを、CREATOR(登録商標)SMART(登録商標)cDNAライブラリー構成キット(CLONTECH(登録商標)Laboratories Inc.)で長距離PCR(LD−PCR)を行うことにより二本鎖cDNAを作成するための鋳型として用いた。改変したオリゴ(dT)プライマー(CDS III/3’PCRプライマー)を、SMART(登録商標)IVオリゴヌクレオチドプライマーと共に用いて、mRNAの完全な5’末端を含む全長cDNAを得た。増幅反応混合物は、1×ADVANTAGE(登録商標)2 PCR緩衝液、0.2mMの各々のdNTP、0.2μMのCDC III/3’PCRプライマーおよび5’PCRプライマー、第一鎖cDNA、並びに1×ADVANTAGE(登録商標)2ポリメラーゼ混合物を含んでおり、95℃で5秒間および68℃で6分間を26サイクル循環させた。
二本鎖cDNA産物は、アガロースゲル電気泳動により分析した場合に、塗抹として出現した。二本鎖cDNAを、プロテイナーゼKでの処理、フェノール抽出およびエタノール沈殿により精製した。精製したDNAを、SfiIで消化した。DNAは、1%アガロースゲル上で分離し、〜0.5kbないし3kbのDNA塗抹を、ゲルから、QIAQUICK(登録商標)ゲル抽出キットで抽出した。SfiIで消化した、ゲル精製した二本鎖cDNAを、T4DNAリガーゼで、キット中に供給した(16℃、一晩)、SfiIで消化した、脱リン酸化したpDNR−LIBベクターに連結した。1マイクロリットルの連結混合物を、50μLのONE SHOT(登録商標)Top10大腸菌電子競合的(electrocompetent)細胞中に、BIO-RAD(登録商標)GENE PULSER(登録商標)を用いたエレクトロポレーションにより、形質転換した。
5マイクロリットルの形質転換混合物を、30μg/mLのクロラムフェニコールを含むLB寒天プレート上に播種し、プレートを、37℃で一晩インキュベートした。形質転換混合物の残りを、4℃で貯蔵した。挿入物の存在についての18個の独立したクローンの分析を用いて、組換えクローンの百分率を決定した。形質転換混合物を、30℃で、LB+クロラムフェニコール(30μg/mL)中で、数時間成長させ、次に一層大きい培養物中に接種し、これを一晩30℃で成長させた。培養物を、遠心分離し、ライブラリーDNAを、細胞ペレットから、QIAGEN(登録商標)からのPlasmid Midi Prepキットを用いて、単離した。
cDNAライブラリーからのCEL II遺伝子の単離。CEL II遺伝子の5’末端から得られた部分的なDNA配列に基づいて、2つの重複するオリゴヌクレオチドを、設計して、CEL II遺伝子をcDNAライブラリーから増幅した:
順方向プライマー 5’−TT CAT GAC TTG AAT TCA AAA ATG AAT A−3’(配列番号:16)、および
逆方向プライマー 5’−TGA ATT CAA GTC ATG AAC ACC CAA TAG−3’(配列番号:17)。
順方向プライマー 5’−TT CAT GAC TTG AAT TCA AAA ATG AAT A−3’(配列番号:16)、および
逆方向プライマー 5’−TGA ATT CAA GTC ATG AAC ACC CAA TAG−3’(配列番号:17)。
cDNAライブラリーDNAを、CpGメチラーゼM.SssI(New England Biolabs, Beverly, MA)を用いてメチル化した。鋳型としてのメチル化したDNAおよびCEL II特異性プライマーを用いて、cDNAを、1×ADVANTAGE(登録商標)2 PCR緩衝液、0.2mMの各々のdNTP、0.2μMの各々のプライマー、cDNAおよび1×ADVANTAGE(登録商標)2ポリメラーゼ混合物を含む反応混合物中で、PCRにより増幅した。95℃での2分間にわたる最初の変性の後に、95℃で30秒間、55℃で30秒間および68℃で6分間のサイクルを30回行った。重複するプライマーにより、産物がインビボでの環を形成することを可能にする相補性末端を含むPCR産物が生じた。PCR産物を、大腸菌DH5α細胞中に形質転換し、クロラムフェニコール(30μg/mL)を含むLB寒天プレート上に播種した。
DH5α細胞は、メチル化されたcDNA鋳型を含む細胞中のDNAを分解し、これらの成長を妨害し、PCRで増幅されたDNAを含む細胞が成長するのを可能にするmcrBC遺伝子の野生型のコピーを含む。コロニーを、ミニプレップDNAをEcoRIで消化することにより、CEL II遺伝子の存在についてスクリーニングした。CEL II遺伝子のDNA配列から、加工したタンパク質(シグナルペプチドの除去の後)をコードする遺伝子の5’末端からの〜310bpのEcoRI部位を、予測した。次に、予測されたEcoRI消化パターンを生じるクローンからのDNAに、DNA配列決定を施した。DNAを配列決定した17個のクローンのうち、7個が、加工したタンパク質に相当するCEL II遺伝子の配列を有しており、1個が、シグナルペプチドを含むタンパク質に相当する全長の配列を有していた。
Claims (10)
- CEL IIポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸。
- 前記単離された核酸が:
(a)配列番号:1または配列番号:3を含むヌクレオチド配列;
(b)配列番号:1もしくは配列番号:3を含むヌクレオチド配列またはこの相補的なヌクレオチド配列に、ストリンジェントな条件の下でハイブリダイズし、機能的なCEL IIポリペプチドをコードする、ヌクレオチド配列;あるいは
(c)(a)または(b)のヌクレオチド配列によりコードされたアミノ酸配列をコードするが、遺伝子コードの縮重または翻訳されていないヌクレオチド配列の存在により、(a)または(b)のヌクレオチド配列とは異なるヌクレオチド配列を有する、ヌクレオチド配列
を含む、請求項1に記載の核酸。 - 請求項1に記載の単離された核酸を含む、ベクター。
- 請求項2に記載の単離された核酸を含む、ベクター。
- 単離されたCEL IIポリペプチドであって、前記ポリペプチドが、配列番号:2もしくは配列番号:4を含むアミノ酸配列、またはこの機能的断片に対して、少なくとも約70%のアミノ酸配列相同性を有するアミノ酸配列を含む、前記単離されたCEL IIポリペプチド。
- 請求項1に記載の単離された核酸を含む、宿主細胞。
- 請求項2に記載の単離された核酸を含む、宿主細胞。
- 請求項3に記載のベクターを含む、宿主細胞。
- 請求項4に記載のベクターを含む、宿主細胞。
- 請求項5に記載の単離されたCEL IIポリペプチドを含む、宿主細胞。
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