JP2008502321A5

JP2008502321A5 -

Info

Publication number: JP2008502321A5
Application number: JP2007508715A
Authority: JP
Filing date: 2005-03-10
Publication date: 2008-08-28

Description

ＰＭ−２抗体の抗原とその使用法

この発明はポリペプチドに関するものである。このポリペプチドは膜結合蛋白として細胞表面に発現されているものであって、一つ乃至複数のポイントにおいてグリコシル化されており（膜糖蛋白）、そのアミノ酸配列は部分的に、又は完全に、インテグリン結合蛋白ｐ８０（受入れ番号ＡＪ１３１７２０）又はＲＥＶ１（受入れ番号ＡＦ２０６０１９）に対応している。

この発明はまた腫瘍治療、腫瘍診断及び腫瘍研究に関する発明によるポリペプチドの使用に関するものである。

化学療法の進歩発達にもかかわらず、ガンの有効な治療法は医学における最大の挑戦の的となっている。これを目標として、ガンの旱期診断ということが特に重要な役割を演ずるわけである。不安をいだいている尨大な数のガンの患者が、その最初の診断の際に、すでに頗る病状の進んだ状態になっている。それだけではなく、組織の中に腫瘍細胞が存在することが早期に判っていても、ガンと戦う新規な手段、たとえば細胞の増殖を押えることや、そのアポトーシスを図る手段が阻害されている。神経成長因子／腫瘍壊死因子（ＮＧＦ／ＴＮＦ）などのような細胞表面のアポトーシスレセプターはリンパ球に広く発現されているが、また数多くの他の細胞類にも見出されるので、ガンの治療にとって適切ではない。特に、in vivoでのテストにおいて、これらの受容体についてのリガンドと抗体とは肝障害を招く。アポトーシス作用を行う腫瘍特異受容体（抗原）は、腫瘍細胞の表面に発現されるものであり、それ故に、ガンの治療にとって特に重要である。そのことは、特に、アポトーシス作用を演ずるヒトの単クローン抗体が次々と同定、単離されていることを背景にしている。ハイブリドーマ技術を利用して、ガン患者の組織と健康なドナーから一連の腫瘍特異IgM抗体を分離するのに成功している。特に、２種類のヒト単クローン腫瘍特異抗体とその抗原とを識別することは可能になっている。したがって、ヒト単クローン抗体ＳＣ−１はＣＤ−５５受容体に特異的に結合する（Cancer Reserch, 1999年10月15日, 59(20), 5299-5306, Hensel et al.）。一方、ＰＡＭ−１抗体は、特異的にＣＦＲ−１受容体に結合する（Oncol.Rep. 2004年4月, 11(4), 777-784 Braendlein et al.）。また、この種のヒト・単クローン抗体はガンの治療と診断とに大きな役割を果すものである。これがガンの治療に重要であるということは、腫瘍細胞の表面の対応する抗原に特異的に結合した後に、細胞のアポトーシス及び／又は細胞増殖抑制を誘発することにある。

ヒト単クローン抗体ＰＭ−２（ＤＥ１０２３０５１５６Ａ１）（ＤＳＭ受入れ番号：ＤＳＭＡＣＣ２６００）を用いることで、抗原（受容体）としてＰＭ−２抗体を特異的に見出すところの本発明に係る膜糖蛋白を同定することができる。この発明に係る抗原の質量分光分析で配列を比較（図６を参照）したところ、この発明に係る抗原とｐ８０蛋白又はＲＥＶ１（受入れ番号ＡＦ２０６０１９）として周知の蛋白（ＮＣＢＩ受入れ番号ＡＪ１３１７２０）との間に、少なくとも調査した範囲内において相同性が存在することが明らかになった。

［定義］
アポトーシスとはプログラムされた細胞死、すなわちＤＮＡの断片化、細胞の収縮及び小胞体の膨張、それに続く細胞の断片化及び膜小胞、いわゆるアポトーシス小体、の形成による細胞の自殺のことを言う。最も多くの場合には真核細胞の死を招き、胚形成、変態、そして組織萎縮を発生する。アポトーシスは、細胞死の生理学的な形式として、壊死の場合のような炎症作用あるいは細胞の損傷などを初期に生ずることなく、必要としない細胞を極めて迅速に、きれいに除くものである。病理学的なコンディションの場合には、アポトーシスは、また、ガン前駆細胞などの悪性の細胞を除去する働きをする。アポトーシスは、細胞毒性Ｔ−リンパ球又は腫瘍壊死因子のようなサイトカイン、グリココルチコルド及び抗体のような刺激によって広く呼び起こされる。

「グリコシレーション（糖鎖形成）」
膜糖蛋白は、その細胞外の側に糖残基（グリコカリックス）を有し、これはアスパラギン側鎖のアミド窒素原子に結合されているか（Ｎ−結合）、あるいはセリン又はスレオニン側鎖の酸素原子に結合されているか（Ｏ−結合）のいずれかである。側鎖に直接結合している糖は通常、Ｎ−アセチルグルコサミンか、あるいはＮ−アセチルガラクトサミンである。炭水化物は極めて多様な構造を形成することができる。まず第一に、数多くの単糖類は１個もしくはそれ以上のＯＨ基を介して互いに結合することができる。第二として、Ｃ−１原子への結合はα又はβ配位をとることができる。これらの数多の結合を利用して、膜糖蛋白がオリゴ糖類から成る側鎖を伸長させることができる。

細胞の表面の炭水化物の構造（グリコシレーションパターン、グリコカリックス）が細胞間の認識についての情報特性を具備することは知られている。したがって、例えば、免疫系が標的細胞に対する同定及び吸着のために、そのプロセスの機序についての構造の基本は、いまだによく判っていないながらも、グリコシレーションパターンを必要とする。

インテグリンは蛋白質であり、これは細胞の表面に連結されていて、その疎水性の部分は細胞壁を突きぬけており（膜貫通蛋白）、その細胞外の成分はグリコシル化されている（膜糖蛋白）である。接着として知られている過程によって、インテグリンは、細胞の、細胞外基質及び他の細胞への結合を促進する。インテグリンのアミノ酸配列と三次元蛋白構造とに加えて、インテグリンに結合する糖の構造は結合の選択性に関して影響がある。インテグリンはα及びβサブユニットから成るヘテロダイマーであり、およそ１０の異なるαサブユニットと、少なくともその２倍の異なるβサブユニットがある。インテグリンの受容体タイプについてかかる事実から生ずる可変性だけをとってみても、細胞接着の基礎となる一般機序が完全には理解されていないということを示すものである。インテグリン結合の特異性は細胞外Ｃａ²⁺濃度によって、より一段と変調される。インテグリンが細胞外基質のＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ配列（Ruoslahti, Pierschbacher, Science, 1987, 238, 491）に選択的に結合することは公知である。

接着の受容体のうち、インテグリンが特に情報の伝達、すなわち、細胞外の信号の細胞の内部への情報の伝達、及び細胞の内部から外部への伝達に作用する。接着とそれに続く細胞内部への信号伝達は細胞内の反応を誘発させ、細胞骨格の再構成に導き、信号カスケードを誘導する。インテグリン結合蛋白は接着においてインテグリンが結合する相手である。

細胞接着プロセスは発現パターンに対する調節効果と、それによって受容体それ自体の特異性に対する調節効果がある。細胞接着メカニズムは、それ故、細胞の成長、細胞の移動そして細胞分化に重要である。特に、それには、細胞がその特殊な形状を喪失して転移性ガン細胞になる場合を含んでいる。

［腫瘍性の細胞］
新生物又は腫瘍は異常な組織塊であってその成長は自律的（増殖因子に非依存性）、非同調性、無目的的かつ、進行性である。腫瘍は２種類の成分から成っている。すなわち、腫瘍性の細胞として知られる実質細胞と、非腫瘍性の支質、すなわち、結合組織と血管である。この発明に係る抗原の文脈でいうと、腫瘍性の細胞とは、制御されない細胞分裂に陥っている細胞、あるいはアポトーシス機構を備えていない細胞のことを指す。この発明において、腫瘍性の細胞とは、これら両方の障害を具備し、またその細胞周期は正常な細胞周期とは掛け離れていることを特徴とするものである。

先行文献（Wixler et al, FEBS Letters 1999, 445, 351-355）から既知の配列（受入れ番号ＡＪ１３１７２０）はアルファ−インテグリン結合蛋白ｐ８０をコードし、これはアルファ−インテグリンの近位領域と相互作用する。これらの結合特性はｐ８０が膜結合蛋白に違いないことを示している。ｐ８０蛋白のグリコシレーションに関する詳細は不明である。

ヒトＲＥＶ−１蛋白（受入れ番号ＡＦ２０６０１９）も既知であって、また、少なくとも断片的に、この発明に係る抗原に相同する配列を備えている。デオキシチジルトランスフェラーゼ活性はＲＥＶ１の機能として与えられる。デオキシチジルトランスフェラーゼは、恐らく、細胞核内でのＤＮＡの複製時に娘ＤＮＡ線維にデオキシチジレートの結合を触媒する。インテグリン結合タンパクであるｐ８０に対して、ＲＥＶ１は膜結合タンパクではなく、核に局在する。

同一のアミノ酸配列のポリペプチドが、膜結合蛋白として、また細胞核中の蛋白としての双方であることができるということは、グリコレーションのような翻訳後の修飾がポリペプチドの局在と機能とに関する主要な役割を演ずるということを示すとともに、配列が相同であるにもかかわらずこれらの蛋白が同一とは推測できない。

この発明の目的は、腫瘍特異的ヒト単クローン抗体ＰＭ−２（ＤＳＭ受入れ番号：ＤＳＭＡＣＣ２６００）が結合する抗原を同定し特徴づけること、そしてその抗原を腫瘍の治療及び腫瘍の診断に利用することにある。

ＰＭ−２抗体（ドイツ特許ＤＥ１０２３０５１６Ａ１号）はＨ鎖とＬ鎖の分子を具備するヒト単クローン抗体であって、Ｈ鎖の場合も、Ｌ鎖の場合も、抗体間で構造が一定な領域と、抗体間で構造が変化している領域、すなわち、抗体の機能的フラグメントである、Ｌ鎖の可変領域の配列プロトコルのＳＥＱＮＯ．４、及び／又はＨ鎖のＳＥＱＩＤＮＯ．３の少なくとも一方とを有している。ＰＭ−２抗体はハイブリドーマ技法で生成され、ハイブリドーマ細胞（ＤＳＭＡＣＣ２６００）はヘテロ−ミエローマ細胞ＨＡＢ１及びそのサブクローンとＰ−リンパ球との融合によって得られた。Ｐ−リンパ球はリンパ器官、望ましくはガン患者の脾臓又はリンパ節から採取した。ヒト単クローン抗体ＰＭ−２は、腫瘍性の細胞の表面の対応するＰＭ−２抗原に特異的に結合した後で、この細胞のアポトーシスを開始させ、及び／又は細胞の増殖を阻害する。ＰＭ−２抗体のアポトーシス効果は細胞死ＥＬＩＳＡ検査法で詳細に検出されており、前掲ドイツ特許ＤＥ１０２３０５１６Ａ１号に詳述されている。

この目的を達成するために、本発明は、腫瘍性細胞で発現するが非腫瘍性細胞では発現せず、抗原としてヒト単クローン抗体ＰＭ−２（ＤＳＭ受入れ番号：ＤＳＭＡＣＣ２６００）に特異的に結合し、Ｎ−グリコシル化及びＯ−グリコシル化されることを特徴とする抗原性を有する膜糖蛋白を教示する。

本発明に係る抗原は腫瘍特異的、すなわち、腫瘍性細胞にのみ発現されるものである。ヒト単クローン抗体ＰＭ−２（ＤＳＭ受入れ番号：ＤＳＭＡＣＣ２６００）が本発明に係る抗原に特異的に結合するためには、Ｎ−グリコシル化及びＯ−グリコシル化が重要である。

本発明に係る抗原と、少なくとも断片的に配列が同一なｐ８０タンパクとは両者とも膜結合蛋白である。ｐ８０タンパクがインテグリンに結合するということは、本発明に係る抗原が腫瘍の発生において果たす役割を示すものである。細胞接着分子として、インテグリンは血管新生に重要である。したがってαＶβ３インテグリンは腫瘍へ供給する血管内皮細胞で発現する。血管上皮細胞中に検出された本発明に係る抗原もまたインテグリンと相互作用を行ってこれを阻害することで血管新生阻止と同等の作用があると考えられる。インテグリンは、血管を介して輸送される腫瘍細胞を、それまで腫瘍のなかった組織へ接着させることができるという点で、腫瘍細胞の転移に重要な役割を演ずるということも判っている。

抗体ＰＭ−２の特異的な結合に関して、本発明に係る抗原は、Ｎ−グリコシド結合糖構造が恐らく特別の役目を果すものと思われる。グリコシレーション部位をより正確に分析すると、これは当業者にとって周知となっているソフトウェア（「英国 MRC ヒト・ゲノム・マッピング・プロジェクト」http://www.hgmp.mrc.ac.uk/Genome Web/prot-anal.htmlのデータベースソフトウェア）によって実行されている。

ｐ８０の部分的に入手可能な配列（７７４アミノ酸）のみから出発して、この分析で、Ｎ−グリコシレーションは特に３３３，３５３，４５０及び５６８番目のアミノ酸に生ずることがわかった。完全に入手可能なＲＥＶ１蛋白の配列を用いた同様の分析によって、ＲＥＶ１の場合、Ｎ−グリコシレーションは８１０，８３０，９２７及び１０４５番目のアミノ酸に生じた。

同じ方法で決定したＯ−グリコシレーション部位の数は有意に多かった。

そのヒト単クローン抗体によって同定される抗原は、単量体又は複数の同一のサブユニットから形成されていても本発明の範囲内に属する。その抗原が２つの同一のサブユニット（二量体）からなるホモマーであるか、あるいは異なる蛋白が結合したものであるかの可能性は、免疫ブロット法（ウエスタン・プロット）で検出される分子量が現在に至るまで、広いバンド幅の中で変化しているということをも説明できるであろう。

その蛋白を発現する細胞は、ＰＭ−２抗体の特徴に関連して既に記載されている。したがって、ここで、ＤＥ１０２３０５１５６Ａ１文献を参照する。ＰＭ−２抗体を産生するハイブリドーマ細胞株は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブタペスト条約に従って、「ドイツ国の微生物及び細胞の寄託所（ＤＳＭＺ）」に一般に入手することができるようにＤＳＭ２６００として２００３年７月２日に寄託した。本発明に係る抗原の特性については、特に細胞株ＢＸＰＣ３（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１６８７）の膵臓ガン細胞を用いた。それは該抗原がこのガン細胞の表面に特によく発現するからである。

本発明に係る抗原の免疫生物学的意義の説明としては、抗原が上皮細胞腫瘍組織の表面に発現されることが重要と思われる。

ＰＭ−２抗体が抗原に結合した後の腫瘍性細胞にアポトーシスを招くことが、本発明に係る抗原の治療能力にとって決定的に重要である。一方、ＰＭ−２抗体の腫瘍性細胞の表面への特異的結合により、その細胞の増殖が抑制されることも認められる。これらの両作用は腫瘍の治療について興味深いことである。

本発明の範囲内において、本発明に係る抗原を分離する方法が開発された。当業者に周知の界面活性剤中で均質化と溶解化とを行った後に、抗原をクロマトグラフィーにて精製する。特に、サイズ排除クロマトグラフィーが、このために使用される。分離方法の改良においては、サイズ排除クロマトグラフィーのあとにさらに陰イオン交換クロマトグラフィーの形による段階を利用してもよい。この第２の精製段階によって、分離された膜糖蛋白の純度が改善される。

以上のようにして分離された抗原は、通常の薬用賦形剤と担体物質とを用いて薬剤の調製に使用することができる。最も単純な場合においては、生理食塩水中に精製抗原を溶解してin vivo投与した。

精製した膜糖蛋白を、特異的結合リガンド又は接着ペプチドを同定するための抗原として使用することもやはりまた本発明の範囲に属する。原則として、このようにして同定されたポリペプチドはヒト単クローン抗体の配列に断片的に対応するだけではあるものの、腫瘍性細胞のアポトーシス及び／又はこれらの細胞の増殖を抑制する。この効果を促進するために、接着ペプチド又はリガンドを放射性ヌクレオチド、サイトキン、サイトカイン、又は成長抑制因子に結合させることができる。

ハイスループットスクリーニングの一部として生理活性物質の同定に、本発明に係る膜糖蛋白を抗原として用いることが考えられる。そのような方法及びその改良法は医薬品研究分野の当業者には周知のものである。

本発明の範囲内において、本発明に係る抗原を腫瘍マーカーとして使用することもできる。こうした場合に、腫瘍性の細胞の表面における、本発明に係る膜糖蛋白の検出はＰＭ−２抗体によって行うことができる。配列プロトコル１及び２で与えられるベクターインサートを用いて、本発明に係る膜糖蛋白が、ヒト単クローン抗体ＰＭ−２が特異的に結合する抗原であることが、アンチセンス検査によって明らかにされている。

例１原料と方法
細胞培養：
ガン細胞株ＢＸＰＣ−３（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１６８７）を受容体を得るために用いた。比較試験として、たとえば、ウエスタンブロット分析に、既知の胃腺腫細胞株２３１３２／８７（ＤＳＭＺ受入れ番号ＤＳＭ２０１）（Hensel et al. 1999, Int. J. Cancer 81: 229-235）を用いた。この細胞を１０％ＦＣＳ及びペニシリン／ストレプトマイシン（両者とも１％）を添加したＲＰＭＩ−１６４０（ＰＡＡ，ウィーン，オーストリア）中で８０％コンフルエンスになるまで培養した。上記試験では、細胞をトリプシン／ＥＤＴＡで剥離し、リン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２度洗浄した。

膜抽出物の調製：
腫瘍細胞からの膜蛋白の分離はHensel et al.（Hensel et al., 1999, Int. J. Cancer 81:229-235）に記載されている方法で細胞株ＢＸＰＣ−３を使用して行った。これを簡単に述べると、凝集した腫瘍細胞をＰＢＳを用いて２度洗浄し、セルスクレーパーで剥離し、遠心して、低張性緩衝液（２０ｍＭＨＥＰＥＳ，３ｍＭＫＣｌ，３ｍＭＭｇＣｌ２）に懸濁した。氷上で１５分間インキュベーションした後に超音波処理を５分間行い、細胞核を１０分間１０，０００ｇにおいて遠心してペレット状にした。上澄みをスイングロータにて、１００，０００ｇで３０分間遠心し、それによって膜をペレット状にした。ペレットを低張性緩衝液（５０ｍＭＨＥＰＥＳｐＨ７．４，０．１ｍＭＥＤＴＡ，１０％グリセロールと１％トリトンＸ−１００）に再び懸濁させた。蛋白分解酵素阻害剤（べーリンガー，マンハイム，ドイツ）をすべての溶液に添加した。

抗原の精製：
抗原の精製にはＰｈａｒｍａｚｉａ（フライブルク，ドイツ）ＦＰＬＣユニットを使用するカラムクロマトグラフィーで行なわれた。サイズ排除クロマトグラフィーについては、ＰｈａｒｍａｚｉａＳｕｐｅｒｄｅｘ２００（ＸＫ１６／６０）カラムに膜調製物５ｍｇを充填して、バッファーＡ（１００ｍＭｔｒｉｓ／Ｃｌ，ｐＨ７．５，２ｍＭＥＤＴＡ，４０ｍＭＮａＣｌ，１％トリトンＸ−１００）を流した。次いで、溶出液をウエスタンブロット分析によって抗体ＰＭ−２を用いた反応で分画させて調べた。陽性の分画をバッファーＡを用いてモノＱ（５／５列）に充填した。結合した蛋白をバッファーＢ（１００ｍＭｔｒｉｓ／Ｃｌ，ｐＨ７．５，１ＭＮａＣｌ，２ｍＭＥＤＴＡ，１ＭＮａＣｌ，１％トリトンＸ−１００）を用いてリニアグラディエント法で洗い出し、クーマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥとウエスタンブロット分析で分画して調べた。

ウエスタンブロッティング：
１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルとウエスタンブロッティングによる蛋白の分離は、他（Hensel et al., 1999, Int. J. Cancer 81: 229-235）で記載のとおりの標準的な条件下で行った。簡単に述べると、ブロットしたニトロセルロース膜を、２％脱脂粉乳を含有するＰＢＳでブロックし、次いで１０ｐｇ／ｍｌ精製抗体１０３／５１を用いて１時間培養した。ＰＢＳ＋０．０５％トゥイーン２０で３回洗液した後に、第二の抗体（ペルオキシダーゼ結合ウサギ抗ヒトＩｇＭ抗体（ディアノーバ，ハンブルク，ドイツ）で培養した。その反応はピアース（ＫＭＦ，セント，オースチン，ドイツ）のスーパーシグナル化学発光キットを用いて行った。

対応するＳＤＳゲル上でのウェスタンブロットによって同定された陽性バンドをゲルから分離して、ＭＡＬＤＩ分析のために使用した。

ＭＡＬＤＩペプチド分析：
ＳＤＳゲルから分離された蛋白バンドはおよそ１ｍｍ×１ｍｍの小片に細切された。そのゲル片はＤＴＴで洗浄、還元され、ヨードアセトアミド及びトリプシン（非修飾、シーケンスグレード、べーリンガー）処理によって、他（Shevchenko et al.,1996b Anal. Chem. 68: 850-858）に記載の方法でＳ−アルキル化された。３７℃で３時間消化した後に、その溶液の０．３μｌを下流抽出手段を備えているブラッカーリフレックスＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（ブラッカー，フランツェン，ブレーメン，ドイツ）を用いて質量分光分析（ＭＡＬＩＤＩ）を行った。薄層法をサンプル調製に利用した（Jensen et al., 1996 Rapid Commun. Mass Spectrom 10: 1371-1378）。トリプシン処理ペプチド群を自ら開発したペプチド探索プログラムを用いて非重複蛋白配列データを探索するのに使用した。

ｐ８０アンチセンスのクローニングとトランスフェクション
ＲＮＡの分離、ｃＤＮＡの合成とＰＣＲは、他（Hensel et at.,1999 Int.J.Cancer 81:229−235）に記載のとおりに行なわれた。簡略に述べると、ｐ８０（受入れ番号ＡＪ１３１７２０号）のヌクレオチド配列の１８１番から６８１番に至る領域のＰＣＲによって、断片の増幅のために、次のプライマーを用いた。すなわち、
Ｐ８０−Ｒｅｖ３’５’ ＣＴＧＴＴＣＣＡＴＡＣＧＡＴＴＴＴＣＡＴＧＣ３’
Ｐ８０−Ｒｅｖ５’５’ ＴＣＧＡＡＣＴＧＧＴＣＴＡＴＣＡＴＣＣＡＡ３’

増幅を次に示すサイクルプロフィルで行った。すなわち、９５℃で２分間の後、９４℃で３０秒；６０℃で３０秒；７２℃で６０秒を３５サイクル、そして、その後に７２℃で４分間。ｐＣＲ−ＳｃｒｉｐｔＡｍｐＳＫ（＋）ベクターのクローニングとＤＮＡの塩基配列決定法は、既に述べた（Hensel et al., 1999 Int.J.Cancer 81:229-235）通りに遂行した。

インサートをｐＣＲ−ＳｃｒｉｐｔＡｍｐＳＫ（＋）ベクターから適当な制限酵素で切り出し、そして、ｐＨｏｏｋ−２ベクター（インヴィトロゲン，リーク，オランダ）にサブクローンした。いろいろなクローンを結果の良かったクローニングの配列決定によって調べた。あるクローンが選択されたのだが、そのコード配列はプロモーターの方へアンチセンス方向にクローン化されたものであった。このクローンは増幅されて、ベクターはアンチセンス・トランスフェクション用に分離された。

ｐＨｏｏｋ−ａｎｔｉ：ＰＭ−２−Ｒによる細胞株ＢＸＰＣ−３への導入を、プライムファクター試薬（ＰＱＬａｂ，エルランゲン，ドイツ）を用いて供給者のマニュアルに従い完遂された。このために、プラスミドＤＮＡは１０μｇ／ｍｌに希釈され、そしてそのプライムファクター試薬は１：１０の割合で無血清増殖培地に添加された。希釈されたプラスミドＤＮＡ（４５０μｌ）と、添加物としての希釈プライムファクター試薬（９０μｌ）と無血清培地（４６０μｌ）が室温において混合され培養された。６０ｍｌ細胞培養皿（７０％コンフルエント）を無血清増殖培地（４６０μｌ）をもって２度洗浄し、次いでプライムファクター／ＤＮＡ混合物を一滴ずつ加えた。それらの細胞を１８時間３７℃で７％ＣＯ₂によって培養し、それから無血清増殖培地を１０％ＦＣＳの増殖培地に置き換えて、受容体蛋白の発現を調べる前に、さらに２４時間培養を続けた。
ａ）細胞株ＢＸＰＣ−３の一部に対照ベクター（ｐ−ＨＯＯＫ−２）を導入し、その他の部分にはｐ８０アンチセンス・ベクターを導入した。
ｂ）導入４８時間後、細胞のサイトスピン標本を調製した。
ｃ）サイトスピン標本をＰＭ−２抗体と対照抗体（二次抗体のみ）とによって染色した。
ｄ）ｐ８０アンチセンスベクターを導入されている細胞はＰＭ−２抗体の結合によって、明確な縮退を示す。

サイトスピンのＮ−グリコシダーゼ消化
使用した細胞はトリプシン／ＥＤＴＡによりその培養びんの底から剥離し、次いでＲＰＭＩ−１６４０培地＋１０％ＦＣＳ中で４℃において１時間かけて培養し膜蛋白を再生させた。次いで、サイトスピン標本をその細胞で作成した。サイトスピンは室温にて一晩乾燥した。乾燥後に、細胞は１００％アセトンで１０分間固定し、ＰＢＳで３回洗浄した。それから、固定された細胞は５ｍＵ／ｍｌＮ−グリコシダーゼ（１００μｌリン酸塩緩衝液、ｐＨ７．０）にて恒温器内で３７℃で３時間消化した。次いで、サイトスピン標本はＰＢＳで３回洗浄し、免疫組織化学染色を異なる抗体について行った。陰性対照として、単にリン酸緩衝液で培養されただけのサイトスピンを陰性対照として用い、また、グリコシダーゼ処理をすることなく通常の免疫組織化学的染色を行った。染色が完了した後、顕微鏡で判定され、その結果は写真システム及びオリンパス顕微鏡とを利用して記録した。

サイトスピンのＯ−グリコシダーゼ消化
ここでもまた同様に、細胞をトリプシンで剥離し、氷上で培養液中で１時間再生させた。サイトスピンの調製とそれに続く固定の後に、細胞を３時間３７℃で、２０μｌ／ｍｌＯ−グリコシダーゼ（１００μｌリン酸塩緩衝液、ｐＨ６．８）を用いて培養した。対照として、サイトスピンをリン酸緩衝液だけで培養し、または培養せずに普通に染色した。免疫組織化学的染色については、次に述べるように行った。

生存細胞及びアセトン固定細胞の免疫組織化学的染色
生存細胞を染色するために、細胞を剥離し、洗浄し、細胞１×１０⁶ 個／ｍｌに希釈した。１ｍｌの細胞溶液を５分間１５００ｇで遠心分離した。完全ＲＰＭＩで４０μｇ／ｍｌに希釈した抗体を最終量１ｍｌとして、９０分間氷中で培養した。次いで、細胞を５分間１５００ｇでペレットにし、５００μｌＰＲＭＩで再度剥離した。サイトスピン標本を細胞溶液２００μｌで調製して、３０分間乾燥した。細胞は３０分間アセトンで固定し、Ｔｒｉｓ／ＮａＣｌで３回洗浄した。ＨＲＰ連結ウサギ抗ヒトＩｇＭ（ＤＡＫＯ）をＰＢＳ／ＢＳＡ（０．１％）で１：５０に希釈し、室温で３０分間培養した。３回洗浄の後に、前に述べたように染色を行った。

アセトン固定細胞を染色するために、サイトスピンを調製し、室温で乾燥し、前に述べたように、アセトンで固定した。それから、サイトスピンをＰＢＳ／ＢＳＡ（０．１％）で１５分間ブロックし、３０分間１０μｇ／ｍｌの一次抗体で培養し、次いで３度洗浄をした。二次抗体での培養と染色とは、前に述べた通りにして行った。

例２グリコシダーゼの結果：消化
図１は膵臓ガン細胞ＢＸＰＣ−３の細胞表面へのＰＭ−２抗体の結合に関するグリコシダーゼ消化の影響を示す。消化した後に、サイトスピンが陽性対照ＣＡＭケラチン（Ａ，Ｃ，Ｅ）とＰＭ−２（Ｂ，Ｄ，Ｆ）とによって免疫組織化学的に染色された。

図１の図Ａ及びＢは酵素なしのグリコシダーゼ緩衝液中で細胞を培養した後のコントロールを示すものである。図Ｃ及びＤは膵臓ガン細胞への抗体ＰＭ−２の結合におけるＮ−グリコシダーゼの効果を示す。Ｎ−グリコシダーゼで消化した後には、もはや抗体ＰＭ−２で染色されない。このことは、抗体が受容体とは結合しないということで、それは特異的に結合するために必要な糖結合構造がＮ−グリコシダーゼの消化作用中に乖離してしまうからである。

図１Ｅ及びＦは抗体ＰＭ−２の結合に関するＯ−グリコシダーゼの効果を示す。陽性対照である図ＥのＣＡＭケラチンは色の変化を示さないのに対し、Ｏ−グリコシダーゼ酵素での消化後では、細胞はもはや抗体ＰＭ−２によって染色することができなくなっていることが判る。すなわち、Ｎ−結合糖のほかに、少なくとも抗原のＯ−グリコシド結合抗原決定基もまたＰＭ−２抗体の特異的結合に寄与するものである。

例３アンチセンス・トランスフェクションの結果
図２はＰＭ−２抗体染色及び生存細胞染色におけるアンチセンス・トランスフェクションの効果を示す（倍率２００倍）。

図２の右側の縦列はＰＭ−２で染色されたＢＸＰＣ−３細胞株の細胞を示す。上段は非導入細胞を示す。中段は空ベクターを導入した細胞を示す。いずれの場合も、細胞は別個のＰＭ−２抗体染色を示している。この染色は、細胞をアンチセンス・ベクターでトランスフェクションした後には有意に減少する。このことは右列下段の画像で示される。この実験はＰＭ−２抗体が、ｐ８０蛋白のアミノ酸配列と少なくとも部分的に相同なアミノ酸配列の膜蛋白に結合することを示すものである。

グリコシダーゼ消化作用の結果を考え合わせると、このことは、そのアミノ酸配列がｐ８０蛋白に少なくとも部分的に該当する膜糖蛋白はＰＭ−２抗体が特異的に結合する抗原であることを示す。

例３ウエスタンブロットの結果
図３はＢＸＰＣ−３細胞及び２３１３２／８７細胞に発現する抗原をＰＭ−２抗体を用いて免疫特異的に証明したものである。

例４Ｎ−グリコシル化部位の決定
図４ａ及び４ｂ並びに５ａ及び５ｂに示すグリコシレーション部位は「英国ＭＲＣヒト・ゲノム・マッピング・プロジェクト」（http://www.hgmp.mrc.ac.uk/Genome Web/protanal.html）のデータベースソフトウェアによって決定された。

例５：ＰＭ−２抗原のＭＡＬＤＩ分析
図６はＰＭ−２抗体によってＳＤＳゲルから選別された蛋白バンドの質量分光分析の結果を示す。質量スペクトロメータを利用したペプチド分画Ｎｏ．２，Ｎｏ．３，Ｎｏ．４及びＮｏ．６の配列比較でｐ８０蛋白又はＲＥＶ１蛋白と配列の相同性があることを示している。

膵臓ガン細胞ＢＸＰＣ−３の細胞表面へのＰＭ−２抗体の結合に関するグリコシダーゼ消化の影響を示す図。同図の左側（ＡＣＥ）はＣＡＭケラチンを、右側（ＢＣＤ）はＰＭ−２を示す。抗体ＰＭ−２と生存細胞染色の効果を示す。同図の右列は染色されたＢＸＰＣ−３細胞核の細胞を、上段Ａは非導入細胞、中段は空ベクターを導入されたＢＸＰＣ−３細胞を、下段はアンチセンス・ベクターを導入したＢＸＰＣ−３細胞を示す。ＢＸＰＣ−３細胞及び２３１３２／８７細胞に発現する抗原をＰＭ−２抗体を用いて免疫特異的に証明したものである。ヒト・アルファ−インテグリン結合蛋白ｐ８０の部分的配列のグリコシレーションの可能性のある部位の決定を示す。図４ａの補充シート。ヒト・ＲＥＶ１蛋白のＮ−グリコシレーションの可能性のある部位の決定を示す。ヒト・ＲＥＶ１蛋白のＮ−グリコシレーションの可能性のある部位の決定を示す。ＰＭ−２抗原のＭＡＬＤＩ分析を示す。

Claims

膜結合蛋白として細胞の表面に発現され、一以上のポイントでＮ−グリコシル化及びＯ−グリコシル化され（膜糖蛋白）、そのアミノ酸配列がインテグリン結合蛋白ｐ８０（受入れ番号ＡＪ１３１７２０）又はＲＥＶ１（受入れ番号ＡＦ２０６０１９）のアミノ酸配列に部分的に又は完全に対応し、さらに、前記膜糖蛋白が、ＤＳＭ受け入れ番号：ＤＳＭＡＣＣ２６００により産生されるヒト単クローン抗体ＰＭ−２と特異的に結合することを特徴とするポリペプチド。
ＤＳＭ受入れ番号：ＤＳＭＡＣＣ２６００により産生される前記ヒト単クローン抗体ＰＭ−２の前記膜糖蛋白への特異的結合が少なくとも一つのＮ−グリコシル化炭水化物残基により媒介されることを特徴とする請求項１記載のポリペプチド。
Ｎ−グリコシレーションをＰ−８０抗原の部分配列（受入れ番号ＡＪ１３１７２０）のアミノ酸位置３３３，３５３，４５０及び５６８のうちの少なくとも一つの部位に存在するものとしたことを特徴とする請求項１又は２記載のポリペプチド。
Ｎ−グリコシレーションをＲＥＶ１抗原の部分配列（受入れ番号ＡＦ２０６０１９）のアミノ酸位置８１０，８３０，９２７及び１０４５のうちの少なくとも一つの部位に存在するものとしたことを特徴とする請求項１又は２記載のポリペプチド。
前記膜糖蛋白が単量体であることを特徴とする前記各請求項のいずれかの一項に記載のポリペプチド。
前記膜糖蛋白がさらにもう一つの同一のサブユニットを有するか、又は他の蛋白と連結していることを特徴とする前記各請求項のいずれかの一項に記載のポリペプチド。
前記膜糖蛋白の分子量をおよそ８０乃至１６０ｋＤａとすることを特徴とする前記各請求項のいずれかの一項に記載のポリペプチド。
前記膜糖蛋白は腫瘍細胞により発現されることを特徴とする前記各請求項のいずれかの一項に記載のポリペプチド。
前記膜糖蛋白は大腸、膵臓、前立腺、子宮、卵管、副腎、肺の腫瘍細胞、食道又は肺の扁平上皮ガン、胃ガン又は乳房の腺管ガンで発現されることを特徴とする前記各請求項のいずれかの一項に記載のポリペプチド。
ＤＳＭ受入れ番号：ＤＳＭＡＣＣ２６００により産生される前記ＰＭ−２抗体が腫瘍細胞上の膜糖蛋白へ結合した後に、該腫瘍細胞にアポトーシスを誘発させることを特徴とする前記各請求項のいずれかの一項に記載のポリペプチド。
前記膜糖蛋白は膵臓ガン細胞株ＢＸＰＣ−３（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１６８７）の表面に発現することを特徴とする前記各請求項のいずれかの一項に記載のポリペプチド。
前記膜糖蛋白は腫瘍性の上皮細胞の表面に発現することを特徴とする前記請求項のいずれかの一項に記載のポリペプチド。
ＤＳＭ受入れ番号：ＤＳＭＡＣＣ２６００により産生される前記ＰＭ−２抗体が腫瘍細胞へ結合した後に、該細胞の細胞増殖が抑制されることを特徴とする前記各請求項のいずれかの一項に記載のポリペプチド。
抗腫瘍薬剤の製造に用いられる前記請求項１乃至１３のいずれかの一項に記載のポリペプチドの使用法。
腫瘍細胞に特異的に結合するリガンド又は接着ペプチドのスクリーニングに用いられる前記請求項１乃至１３のいずれかの一項に記載のポリペプチドの使用法。
放射性ヌクレオチド、蛍光標識、細胞毒、サイトカイン又は成長抑制物質に結合するリガンド又は接着ペプチドのスクリーニングに用いられ前記請求項１乃至１３のいずれかの一項に記載のポリペプチドの使用法。
前記スクリーニングがハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）である請求項１５又は１６記載のポリペプチドの使用法。
腫瘍マーカーとしての前記請求項１乃至１３のいずれかの一項に記載のポリペプチドの使用法。
腫瘍診断のための前記請求項１乃至１３のいずれかの一項に記載のポリペプチドの使用法。
腫瘍診断が前記ＰＭ−２抗体（ＤＳＭ受入れ番号：ＤＳＭＡＣＣ２６００）の膜糖タンパクへの結合を介して行われる膜糖タンパク分布又は量の決定によるものである請求項１９記載のポリペプチドの使用法。
エンコードするアミノ酸配列の一部が図４ａに示す配列であることを特徴とするアンチセンスベクター。
ヌクレオチド配列の一部が図５ａに示す配列をエンコードすることを特徴とするアンチセンスベクター。
前記膜糖蛋白を膵臓ガン細胞株ＢＸＰＣ−３の膜抽出物から、溶解化と、それに続くサイズ排除クロマトグラフィーとを利用して分離することを特徴とする前記請求項１乃至１３のうちのいずれかの一項に記載のポリペプチドを得る方法。
サイズ排除クロマトグラフィーの後に陰イオン交換クロマトグラフィーを行うことを特徴とする請求項２３記載の方法。