JP2008500813A - 抗肥満用免疫原性ハイブリッドポリペプチド及びこれを含む抗肥満ワクチン組成物 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、アポリポ蛋白質B−100のB細胞エピトープのミメティックペプチドとヘルパーT細胞エピトープを含み、前記ミメティックペプチドのC末端がヘルパーT細胞エピトープ部分のN末端と融合した免疫原性ハイブリッドポリペプチド、及びこれを含む肥満予防または治療用ワクチン組成物に関する。
最近、韓国では、西欧的食生活の影響で動脈硬化症及び冠状動脈疾患(coronary atherosclerotic disease:CAD)が益々増加しつつあり、これによる死亡率も高くなってきている。この種の疾患の原因となる血清脂質としては、コレステロール(cholesterol)、トリグリセリド(triglyceride:TG)、遊離脂肪酸(free fatty acid)、リン脂質(phospholipid)などがあり、アポリポ蛋白質(apolipoprotein)と共にリポ蛋白質を形成して血液循環によって運搬されている。中でも、LDL(low density lipoprotein)は主にTGやコレステロールの運搬を担当しており、LDL−コレステロール数値の変化は前述したような疾病の予後を示す尺度となる。
一つの様態として、本発明は、アポリポ蛋白質B−100のB細胞エピトープのミメティックペプチドのアミノ酸配列を含み、前記ミメティックペプチドのC末端がヘルパーT細胞エピトープのN末端と融合した免疫原性ハイブリッドポリペプチドを提供する。
本発明の前記および他の目的、特徴および利点は、添付図面を参照する以降の詳細な説明からより明らかになるであろう。
一つの様態として、本発明は、アポリポ蛋白質B−100のB細胞エピトープのミメティックペプチのアミノ酸配列を含み、前記ミメティックペプチドのC末端とヘルパーT細胞のエピトープのN末端とが融合した免疫原性ハイブリッドポリペプチドを提供する。
<実験材料>
DNAミニプレップキット(miniprep kit)とゲルからDNAを抽出するために使用されたキットはNucelogen製を、細胞培養に必要なバクト−トリプトン(bacto-trypton)、バクト−酵素抽出物(bacto-yeast extract)、アガ(agar)などは、Difco社(Detroti、MI)製を、制限酵素はTakara製を、T4DNAリガーゼはNEB製をそれぞれ使用した。ベクターはpB1uescriptIISK(Stratagene社)、PCR2.1(Invitrogen、Carlsbad、CA)、pQE30(Qiagen社)を使用し、菌株は大腸菌JM109及びM15(Qiagen社)を使用した。
pB1uescritIISKベクターに入っているB14断片を得るために、BamHIとXhoI制限酵素を用いて切断し、PCR2.1ベクターに入っているT断片を得るために、SalIとHindIII制限酵素を用いて切断した。2つのベクターから得られた切片、B14とTに対して、B14のXhoI粘着末端とTのSalI粘着末端が相補的なので、T4 DNAリガーゼを用いて16℃で12時間結合させた。その結果、連結部位はSalIまたはXhoIによって切られなくなり、B14T断片を得るためにもう1回SalIとHindIIIで切った。蛋白質を発現するために選択されたベクターシステムとしてpQE30プラスミドを使用した。このベクターは、発現させようとする蛋白質が6Xヒスチジンと融合蛋白質の形で発現して精製が容易となるように考案された。B14T遺伝子断片をpQE30ベクターのSalI及びHindIII部位と結合した。こして作られたクローンをpB14Tと命名した(図1)。大腸菌JM109を形質転換させた後、プラスミドを分離してSalIとHindIIIで切って、450bp断片が挿入されたことを確認した(図2)。
pB1uescriptIISKベクターに入っているB14断片をSalIとXhoIで切って得た。pBX4ベクター(B14断片が挿入されているpQX30ベクター、韓国特許公開第2002−0018971号)をSalIで切って前記B14断片とT4DNAリガーゼを用いて16℃で一晩中結合させた。
クローニングされたpB14Tの塩基配列を確認するために、プラスミド濃度を300〜500ng/μLとして韓国の(株)コアバイオシステムにDNA塩基配列分析を依頼し、正しいクローンであることを確認した(図3)。
PB14T及びPB18は、pQE30ベクターで発現するので、ベクター自体内の開始コドンから蛋白質の発現が始まり、精製を便利にするために6個のヒスチジンも共に発現し、エンテロキナーゼ部位も含んでいる。ペプチドの発現に使用した宿主細胞は、大腸菌M15であって、アンピシリンとカナマイシンが含有されたLBプレートに塗抹してコロニーを得た後、Amp(100μg/mL)とKan(25μg/mL)が含有されたLB培地10mLで一晩中培養した。時間の変化に伴う蛋白質の誘導を調べるために、一晩中培養した培養液中の1mLを新鮮なLB培地50mLに接種した。本培養液を600nmで吸光度が0.4〜0.5となるまで37℃で1時間30分振とう培養した後、IPTGを最終1mM濃度となるように加え、5時間培養を行い続けて1時間ごとに1mLずつ分取した。IPTGを加える前に1mLを予め取って非誘導対照グループとして使用した。それぞれの培養液は、14,000rpmで1分間遠心分離してペレットを得た後、2×SDSサンプル緩衝液30μLに溶かしてSDS−PAGEの際にサンプルとして使用した。こうして計算された蛋白質の大きさは、それぞれPB14Tは16.2kDa、PB18は16.5kDaであった。時間帯別にサンプルを得てSDS−PAGEによって発現を確認した結果を、図4及び図5に示す。
SDS−PAGEにおいて大きさの分析によってPB14Tを確認したが、正確な蛋白質が発現するかを確認するために、PB14Tを認識することが可能な2つの抗体を用いてウェスタンブロットを行った。PB14Tウェスタンブロットの対照グループには、M15にB14TがサブクローニングされていないpQE30ベクターのみを形質転換させて使用した。サンプルは、IPTGで誘導する前のものと、IPTG誘導3時間後のものにした。1次抗体は、ウサギ抗−PB14ポリクローナル抗体、マウス抗−preS2モノクローナル抗体をPBSに1:10000で希釈して使用した。1次抗体を認識することが可能な2次抗体は、ペルオキシダーゼが結合している山羊抗−ウサギIgG、山羊抗−マウスIgGをPBSに1:10000で希釈して使用した。発色反応は、ECL+Plusウェスタンブロットキットを使用し、膜をカセットに入れて富士メディカルのX線フィルムを入れた後、10秒間露出させて現像した。ウサギ抗−PB14ポリクローナル抗体はPB14TのPB14断片を認識する抗体であり、マウス抗−preS2モノクローナル抗体は、PB14TのT断片を認識する抗体なので、正確に蛋白質が発現すると、2つの抗体を使用したブロックの全てでバンドが現われるべきである。図8に示すように、それぞれの抗体がPB14TのPB14とTを認識したので、PB14Tが正確に発現したことを確認できた。
PB14T及びPB18の細胞位置確認は、IPTGで誘導してから3時間が経過したサンプルを遠心分離し、それを超音波緩衝液で再懸濁させた後、超音波により得られたペレットと上澄み液それぞれSDS−PAGEで確認した。具体的に、IPTGで発現が誘導された細胞を4℃、9000rpmで30分間遠心分離した後、得られたペレットをしばらく−20℃で凍らせてから氷上で溶かし、その後超音波分解緩衝液をペレット1gに対して5mLの割合で入れて再懸濁した。細胞を溶解させるために、30秒ずつ15サイクル(サイクルの間に1分間休止)で超音波粉砕した。4℃、9000rpmで30分間遠心分離して上澄み液を分離し、これを可溶性蛋白質の入っている非加工抽出物A(粗抽出物A)として使用し、残っているペレットは、不溶性蛋白質の入っている非加工抽出物B(粗抽出物B)として使用した。それぞれのサンプルに2×SDSサンプル緩衝液を混ぜて95℃で5分間沸かした後、SDS−PAGEを行った。上澄み液よりはペレットに所望の蛋白質が多量現われることから、不溶性が強いことを確認した(図6及び図7)。
ペプチドを精製するためにヒスチジンタグ蛋白質用Ni−NTAレジンを使用した。レジンに結合しているNi+と末端にヒスチジンヘキサマー融合蛋白質が相互作用する性質を利用することにより親和力を利用したアフィニティクロマトグラフィーの一つの方法である。遺伝子組み換えされた大腸菌を接種したLB培地10mLを一晩中前培養した後、500mLのLB培地に全量接種して600nmで吸光度0.4〜0.5となるまで37℃で培養した。IPTGを1mMで加え、4時間培養した後、9000rpmで30分間遠心分離して細胞ペレット得て−20℃に置いた。氷上で溶かしたペレットに超音波粉砕緩衝液を湿潤細胞と5mL/gの割合で入れて再懸濁させて超音波粉砕を行った。超音波粉砕をして細胞を溶解させ、4℃、9000rpmで30分間遠心分離してペレットを得た。結合緩衝液を、残っている上澄み液の体積と同一の体積となるようにペレットに入れた後、再懸濁させ、細胞残骸を除去するために超音波粉砕を3サイクル行った。これを再び4℃、9000rpmで30分間遠心分離して得た上澄み液を精製用サンプルとして使用した。
PB14T、PB14、PB18は、PBSで透析を行うと、尿素が除去されるので、蛋白質の凝集による沈殿が発生し、この状態では蛋白質の定量を正確に行うことができなかった。精製された蛋白質の凝集状態を除去するために、50mM CHAPSを使用した。定量は、BCA蛋白質定量法、ブラッドフォード法を用いて行った。2mg/mLのBSAを1000、500、250、125、62.5μg/mLと逐次希釈して標準として用いた。BCA分析は、Pierce社製のプロトコールによって行い、37℃で30分間反応させ、562nmで吸光度を測定し、ブラッドフォード試薬はサンプルと室温で10分間反応させた後、595nmで吸光度を測定し、BSAの逐次希釈液のBCA或いはブラッドフォード蛋白質定量発色反応の吸光度を標準定量線として用いてサンプルの蛋白質の濃度を定量した。
M15大腸菌株に形質転換されている発現用ベクターpQE30においてTカセット(preS2)をKpnI(Takara)、SalI(Takara)制限酵素で二重切断によって分離し、pB1uescriptも同一の酵素で処理した。分離したTカセットとpB1uescriptをそれぞれゲル上で確認して分離溶出させ、溶出させたベクターとTカセットはT4 DNAリガーゼで連結させた。pB1uescript4μL、Tカセット4μL、リガーゼ1μL(MBI Fermentas、1Weissμ/mL)、10×緩衝液(MBI Fermentas)1μLを1.5mLのチューブに入れて16℃で一晩中培養させた。組み換えされたベクターをJM109細胞と混ぜて42℃で90秒間熱衝撃を与えた後、LB培地を入れて37℃で1時間培養した。これをLB(Amp)培地に接種し、37℃で培養してコロニーを確認した。確認されたコロニー中の幾つかを任意選択して培養過程、プラスミド分離精製、制限酵素切断を経てアガロースゲル上でDNA断片のサイズによって確認した。Tカセット内にはXhoI部位が存在するが、これを無くさなければ、連結されたTB4カセットを得ることができなかった。すなわち、Tとは、Tカセット(HBVウィルスのpreS2遺伝子、183bp)の3’末端近く(Tカセットの5’を基準として約150bp)にXhoI部位が存在してクローニングに使用することができないので、内部のXhoI部位を点突然変異させたXhoIで切られない新しい配列のTカセットの形態である。pB1uescript−preS2は、Tカセット内部のXhoI部位により短いDNA断片(30bp)が切り出された。この部分に合成オリゴマーを挿入した。セルフライゲーション(Self-ligation)を防ぐために、ベクターは37℃、30分間アルカリ性ホスファターゼ(Boehringer Mannheim、GembH、Germany)で処理し、95℃で5分間脱リン酸させてゲル上で溶出させた。オリゴマーは、37℃で30分、65℃で20分間処理して5’−リン酸化させた。95℃で5分間静置反応させた後、熱遮断(heat block)をして徐々に冷やしながらアニーリングさせた。オリゴマーとpB1uescrpt−Tリガーゼを用いて16℃で一晩中培養した。組み換えされたpB1uescrtip−TをJM109細胞に形質転換導入してLB(Amp)培地でコロニーを確認し、コロニー選別過程を経て、所望のプラスミドを持った細胞を確保した。オリゴマーはpresS2の当該部分の28個のヌクレオチドからなっており、但し、XhoI部位を無くすために、センス−オリゴマー5’の5番目のヌクレオチドをGからAに変え、これによりアミノ酸配列がアルギニンからリジンに変わった。センスとアンチセンスでそれぞれ28merを製作してアニーリングさせ、これを、XhoIで処理したpB1uescript−preS2内に挿入した。pB1uescript−TをSalI、XhoIで二重切断し、pQE30−B4をSalIで処理してそれぞれをゲル上で分離溶出させた。5’側が切り出されたpQE30−B4に、分離されたTを挿入し、pQE30−pTB4を作成した。組み換えされたTB4をSalIとHindIIIで切ってバンドの大きさを確認した。こうして作成されたベクターをpTB14と命名した(図13)。
発現ベクターpTB14をM15に導入してLB(Amp、Kan)培地2Lに培養した。これを7000rpmで10分間遠心分離して湿潤細胞9gを回収した。遺伝子組み換えで発現されたハイブリッドポリペプチドPTB4は、His−Tagが存在するので、Ni−NTA His−結合レジンを用いたアフィニティクロマトグラフィーを行った。カラムは、レジン体積4mLで直径1.8cm、高さ8cmのものを使用した。Econo systemの吸光度範囲は0.5、記録計の用紙速度は2cm/hour、サンプルローディング速度は2mL/minに合わせて使用した。まず、湿潤細胞に超音波粉砕緩衝液(sonication buffer)を入れて超音波破砕によって細胞を壊し、4℃、10000rpmで30分間遠心分離した。ペレットのみを結合緩衝液に溶かした後、アフィニティクロマトグラフィーで精製した。まず、結合溶液をカラムに流しながらレジンを沈殿させた。検出器を見ながら、ベースラインを定め、一定の値を指すと、超音波粉砕したサンプルを入れた。サンプルがカラム内に入って再び一定の値を指すまで待ってから洗浄溶液を流し、その後さらに一定の値を指すと、溶出溶液も流してPTB14を分離した。発現及び精製されたハイブリッドポリペプチドは、SDS−PAGE後、ウェスタンブロットで確認した。SDS−PAGEしたPTB14を半乾燥トランスファ(semi-dry transfer)を用いて膜に移した。ブロッキング溶液(0.5% casein−phosphate buffered saline-tween、0.02%NaN3)を用いて37℃で2時間恒温処理した後、Tris-buffered saline-tween(TBS−T、pH7.6)で2分ずつ2回洗浄した。その後、1次抗体を37℃で1時間処理し、TBS−Tで5分ずつ4回洗浄した。2時抗体も1時間処理した後、同一の方法で洗浄した。Tカセットの確認には抗−preS2モノクローナル抗体(1:10000)、山羊抗−マウスIgG−HRP結合抗体(1:10000)を使用し、Bカセットの確認にはウサギ抗−PB14抗血清(1:10000)、山羊抗−ウサギIgG−HRP結合抗体(1:10000)を使用した。ECLキット溶液を乾燥膜上に散布して5分間反応させ、これをECLキットとしてバンドを確認した。その結果、Bカセットは、ウサギ抗−PB14抗血清と山羊抗−ウサギIgG−HRP結合抗体を用いてPB14TとPTB14でのみ約16KDaのバンドが現われたことを見ることができ、Tカセットは、抗−preS2モノクローナル抗体と山羊抗−マウスIgG−HRP結合抗体を用いて、PB14では約8kDaのバンドが観察され、PB14TとPTB14では16kDaのバンドが見えてそれぞれのハイブリッドポリペプチドが正確に発現、精製されたことを確認した(図14)。
PB14をキャリア蛋白質としてのオブアルブミンと連結した。キャリア蛋白質とPB14のモル比が約1:10となるようにした。約1時間4℃で反応バイアルで攪拌し、2%グルタルアルデヒド溶液を入れた後、3時間攪拌し、PBS緩衝液でMWCO3000透析膜を用いて一晩中透析して残余のグルタルアルデヒドを除去した。
7週齢のSD系白ネズミを6グループに分けてワクチン処理を行った(表1)。実施例7及び実施例10で精製及び定量したペプチド100μgを、表1に示すように、それぞれの補助剤と混合して100μLとなるようにして腹腔に注射した。注射は2週間隔で7、9及び11週齢に3回にわたって行った。補助剤はフロイントアジュバントと水酸化アルミニウムを使用した。フロイントアジュバントはペプチドと同量で混ぜ、水酸化アルミニウムは5.8mg/mLを最終濃度が0.2mg/mLとなるように調整した後、ペプチドと室温で攪拌しながら恒温処理した。最初ブースト5日目、最終ブースト5日目、2週目及び4週目に尻から採血した。
血清サンプルを用いて間接的ELISA法によって抗体力価を測定した。微細力価平板(microtiter plate)にPB14を各ウェルに100ngの濃度で100μLずつ仕込んだ。4℃で一晩中処理した後、ブロッキング溶液(PBS、0.5%カゼイン、0.02%NaN3)を添加し、37℃で1時間恒温処理した。PBSTで3回洗い出し、SD系白ネズミワクチン処理によって得た血清をPBSに1/500〜1/8000倍で希釈して100μLずつ使用し、37℃で1時間恒温処理した。各ウェルをPBSTで3回洗い出し、2次抗体としての山羊抗−白ネズミIgGの1/1000倍希釈液で培養した。OPD発色反応を行い、吸光度を450nmで測定した。
TGと総コレステロールの測定は、発色試薬200μLに血清4μLを入れて37℃で5分間高温処理した後、それぞれ505nm、500nmで吸光度を測定した。HDLの測定は、血清と沈澱試薬を1:1で混ぜた後、室温で10分間放置し、その後3000rpm以上で10分間遠心分離して得た上澄液を発色試薬200μLに4μL入れて37℃で5分間恒温処理した後、555mmで吸光度を測定した。LDLコレステロールの測定はEZ LDLコレステロールキット(Sigma社製)を使用し、LDLカリブレータはRandox社製を使用し、製造社から提供されたプロトコールによってキット内の試薬1150μLに血清4μLを入れて37℃で5分間反応させた後、試薬250μLを添加してさらに37℃で5分間反応し、その後600nmで吸光度を測定した。各測定シートから得た吸光度と標準試液を比較して濃度を計算した。
SD系白ネズミへの3次注射後5週目の血清で分析した結果が表3に示されている。
PB14Tをアジュバントとしてのアルミナと混合した混合物(2mg/mL)0.5mLを10匹の愛玩犬(韓国アンサン動物病院で肥満管理を受けている愛玩犬)に筋肉注射又は皮下注射の形で2週間隔で2回接種した後、1.5〜3ヶ月間体重の変化を観察した。その結果、抗体が徐々に減少する形に維持され(半減期:3ヶ月)、間食を始めとした高脂肪食を無制限提供しても、体重は全く増加していない。具体的に、接種した10匹の愛玩犬の全てが、間食及び高カロリー食餌を摂取する場合でも体重の増加が抑制されることを確認した。特に、ヨークシャーテリア(Yorkshire terrier)種の場合、性別及び年齢による体重増加が予想される状況でも、PB14Tの接種により体重が増加しないことを確認することができた。
本発明の抗肥満効果を示すアポリポ蛋白質B−100のB細胞エピトープのミメティックペプチドのC末端にヘルパーT細胞のエピトープのN末端を融合させたハイブリッドポリペプチドは、B細胞エピトープの有利な活性または効果を中和させる免疫反応を誘導するか有害な副作用を起すことなく、優れた免疫増強効果を示して肥満の予防または治療に効果的に使用できる。
特許手続き上微生物寄託の国際的承認に関するブダペスト条約
国際様式
このページの下端に確認された国際寄託当局から規則7.1に基づいて発行された原寄託申請の受託証
To:Hyo Joon Kim.
韓国(〒425−791)京畿道安山市常緑樹区四1洞漢陽大学校HBI604
┌──────────────────────────────────────┐
I.微生物表示 │
├─────────────────┬────────────────────┤
寄託者によって与えられた識別番号: 国際寄託当局によって与えられた受託番号 │
M15/pB14T : │
│ KCCM−10562 │
├─────────────────┴────────────────────┤
II. 科学的性質および/または提示された分類学的表示 │
├──────────────────────────────────────┤
前記Iで識別された微生物は、下記のとおりである。 │
[ ]科学的性質 │
[ ]提示された分類学的表示 │
(該当欄にX表示) │
├──────────────────────────────────────┤
III.受付および受託 │
├──────────────────────────────────────┤
本国際寄託当局は、前記Iに表示された微生物が2004年3月4日付で受付され │
たことを確認する。(原寄託日)1 │
├──────────────────────────────────────┤
IV.国際寄託当局 │
├───────────────────┬──────────────────┤
名称:韓国微生物保存センター(KCCM 本国際寄託当局を代表する委任状を有 │
) する者又は権限保有職員の署名 │
住所:韓国(〒120−091)ソウル市 │ │
西大門区弘済1洞361−221 日付:2004年3月12日 │
ユリムビル │ │
└───────────────────┴──────────────────┘
1 規則6.4(d)適用、この日付は国際寄託当局の資格を得た日付であるが、国際寄託当局の資格の獲得後、ブダペスト条約の外でなされた寄託がブダペスト条約下の寄託に転換される場合、この日付は国際寄託当局が微生物を受付けた日付である。
書式BP/4 単一ページ
Claims (15)
- 配列番号1、2及び3の中から選択されたアミノ酸配列を含むペプチドのC末端とヘルパーT細胞エピトープのN末端とが融合する、免疫原性ハイブリッドポリペプチド。
- ペプチドは、配列番号1、2及び3の中から選択されたアミノ酸配列が2〜8個連結されてなることを特徴とする、請求項1に記載のポリペプチド。
- ペプチドは、配列番号1、2及び3の中から選択されたアミノ酸配列が4個連結されてなることを特徴とする、請求項2に記載のポリペプチド。
- ペプチドは、配列番号1のアミノ酸配列が4個連結されてなることを特徴とする、請求項3に記載のポリペプチド。
- ペプチドは、配列番号5のアミノ酸配列を持つことを特徴とする、請求項4に記載のポリペプチド。
- ヘルパーT細胞エピトープは、B型肝炎ウィルス表面抗原ヘルパーT細胞エピトープ、クラミジア・トラコマティス(Chlamydia trachomatis)主要外膜蛋白質ヘルパーT細胞エピトープ、プラスモジウム・ファルシパルム・サーカムスポロゾイト(Plasmodium falciparum circumsporozoite)ヘルパーT細胞エピトープ、大腸菌TraTヘルパーT細胞エピトープ、破傷風トキソイド(Tetanus toxoid)ヘルパーT細胞エピトープ、ジフテリアトキソイド(diphtheria toxoid)ヘルパーT細胞エピトープ、マンソン住血吸虫(Schistosoma mansoni)トリオースリン酸イソメラーゼヘルパーT細胞エピトープ、麻疹(measles)ウィルスF蛋白質ヘルパーT細胞エピトープ及び狂犬病ウィルスヘルパーT細胞エピトープよりなるグループの中から選択されることを特徴とする、請求項1に記載のポリペプチド。
- T細胞エピトープがB型肝炎ウィルス表面抗原のヘルパーT細胞エピトープであることを特徴とする、請求項6に記載のポリペプチド。
- T細胞エピトープがB型肝炎ウィルス表面抗原のpreS2ヘルパーT細胞エピトープであることを特徴とする、請求項7に記載のポリペプチド。
- T細胞エピトープが配列番号7のアミノ酸配列を持つことを特徴とする、請求項8に記載のポリペプチド。
- 配列番号9のアミノ酸配列を持つことを特徴とする、請求項1に記載のポリペプチド。
- 請求項1〜10のいずれか1項に記載のポリペプチドを含む肥満予防または治療用ワクチン。
- 請求項1〜10のいずれか1項に記載のポリペプチドをコードする遺伝子を含む組み換えベクター。
- pB14T(KCCM−10562)であることを特徴とする、請求項12に記載の組み換えベクター。
- 請求項12に記載の組み換えベクターで形質転換された宿主細胞。
- 請求項12に記載の組み換えベクターで形質転換された宿主細胞を培養して請求項1に記載のポリペプチドを製造する方法。
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