JP2008500003A - 新規eimeria遺伝子および対応タンパク質の使用 - Google Patents
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Abstract
Description
メンドリでのコクシジウム症の種を、正確に、迅速にかつ安価に同定する能力は、感染の予防および処置のために可能性のある最も重要事である。現在、LongとReid(1982)の方法は、接合子形態(顕微鏡)、宿主特異性、腸における損傷の病状および前顕性時間に従って、メンドリにおいて7種のEimeriaを同定するために慣例的に使用されている。これに加えて、イソ酵素パターンの方法によって生物学的特徴分析を有効とする試みがある。この方法では、糖代謝酵素は、大部分の酵素図を構築するための遺伝的マーカーとして使用されている (JohnstonおよびFemando 1997)。経験は、従来的、形態学的な、描写方法または生物化学的方法のいずれかを用いる場合には、種の正確な判別は、不十分または部分的に達成され得るだけであることを示している。従って、組換えDNAレベルで種を特徴づけ得ることが望ましい。非常に少ない相反する調査結果が、この分野では得られてきた(Comes et al. 1996)。Eimeria種の生物学的差違は、DNA多形性の形態における遺伝的差違が様々な種において存在することによると示唆されている。多形性は、塩基変化(欠失、挿入)の結果として、または染色体再配列の結果として生じ得る。元々血縁分析のために開発されたDNAフィンガー・プリント法において、変異性DNAは、制限エンドヌクレアーゼによって切断され、放射性DNAプローブとハイブリダイズされ、ゲル電気泳動およびサザンブロット後に、オートラジオグラフィーで可視化される。この方法で作成されてきた遺伝子のフィンガー・プリント法は、生物の種および株を明白に区別するために使用され得る。RAPD−PCR法「ランダムに増幅した多形性DNAポリメラーゼ連鎖反応(random amplified polymorphic DNA polymerase chain reaction)」は、この方法の簡略化を提供する。この方法は、ランダムヌクレオチド配列を有する1つのプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応(PCR)において、ゲノムDNAを増幅することを基にしている。アガロースゲル上で分離され、エチジウムブロマイドで染色された後、増幅されたDNAセグメント(RAPD−PCRマーカー)から、特異的なバンドのパターンを得る。しかし、この方法は、互いに純粋株を区別するためだけに使用され得る。野外の単離物(様々なEimeria種の混合物)で種を同定するには、これらの技術は使用できない。技術の簡略化に加えて、より経済的な方法は、特異的な遺伝子配列を基にした特異的なプローブを見出すことであろう。すなわち、内部翻訳スペーサーITS1(Schnitzler et al. 1998)およびITS2(Gasser et al.2001)領域、さらにEimeria acervulina種虫抗原(EASZ 240/160)(Molloy et al. 1998)由来のリボゾームDNAの既知配列(EllisおよびBumstead 1990)は、この目的のために使用される。
年額少なくとも300ミリオンUSドルにのぼる抗コクシジウム剤が、現在この疾患の治療に使用されている。l970年以来、化学療法処置は、特にポリエステルイオノフォア、モネンシン、ナラシン、サリノマイシンおよびラサドヒドを用いて、実施されている。さらに、寄生体段階のDNA合成またはタンパク質合成を阻害する数多くの活性な化合物は、市場に存在している(Greif 2001)。しかし、本治療は、重大な問題および/または不利益をこうむる。メンドリにおいて深刻な薬物担持(食用組織中に残留する問題)および生態毒性/生態汚染(環境の)とは別に、薬剤耐性の進化が、抗コクシジウム症の処置に関する大きな問題と考えられている。シャトルまたはローテーションプログラムと言われるものを用い、そして新規の作用機構(Coombs 2002)に対する高額の探索によって進化する耐性に打ち勝つ試みがなされている。そのため、Eimeria感染を処置するための改善された活性な化合物およびこれらの活性な化合物を見出す方法を緊急に必要としている。
免疫予防(ワクチン接種)は、コクシジウム症の化学療法を処置するための非常に良好な代替法である。Eimeria種と接触する1つの病原体は、二次相同感染に対して実質的に完全な免疫性を導く(RoseおよびWakelin1990)。1日齢のヒナドリは、16-25日期間にわたる寄生体段階の連続投与により、Eimeria tenella、EimeriaacervulinaおよびEimeria maximaに対する天然の免疫性を誘導させる(StiffおよびBafundo 1993)。保護的配偶子母細胞抗原を用いて産卵メンドリを免疫化すると、ふ化したヒナドリでの免疫状態が改善される。このストラテジーは、「母系免疫化」(Wallach 1992)としてWallachによって開発された。
本発明は、Eimeria tenella種の寄生体由来の新規接合子スポロキスト(胞子嚢子)タンパク質(EtOS22)に関する。
a)配列番号:1または3に記載の配列を有するポリヌクレオチドと比べて、50%、60%、70%または80%、好ましくは85%または90%以上、特に好ましくは95%、97%以上の同一性を示すポリヌクレオチド;
b)配列番号:1または3に記載の配列を有するポリヌクレオチドと比べて、ストリジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド;
c)配列番号:2に記載の配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと比べて、50%、60%、70%以上または80%、好ましくは85%以上または90%、特に好ましくは95%または97%以上の同一性を示すポリヌクレオチド;
d)ストリジェントな条件下で、配列番号:2に記載の配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと、ハイブリダイズするポリヌクレオチド;
e)遺伝子コードの縮重により、配列番号:1に記載のポリヌクレオチドとは異なるポリヌクレオチド;および
f)a)からe)に記載のポリヌクレオチドのフラグメントであって、少なくとも6個のヌクレオチドまたは8個のヌクレオチド長、好ましくは10または20個以上のヌクレオチド長、特に好ましくは50個または100個のヌクレオチド長、特に好ましくは200個または500個以上のヌクレオチド長であるポリヌクレオチド、
に関する。
a)ノーザンまたはサザンブロッド・アッセイにおけるプローブ、
b)ミクロアレイまたはマクロアレイに結合されるポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド、
c)上記寄生体を診断するために使用されるPCRまたは類似方法のためのプライマー、このプライマーおよびPCR技術を用いて、問題の寄生体のDNAが特異的に同定され、増幅される、
の使用に関する。
さらに、本発明は、Eimeria感染、好ましくはEimeria tenella感染を診断するための、EtOS22ポリヌクレオチドまたはEtOS22ポリペプチドに対する上記抗体の使用に関する。
本発明は、飼鳥類、好ましくはニワトリを免疫化するための免疫原組成物の調製方法にも関し、この組成物は、本発明の少なくとも1つの上記EtOS22ポリペプチドまたは少なくとも1つの上記抗体を含む。
1.
a)i.寄生体段階から単離される、または
ii.イン・ビトロで合成的に調製される、または
iii.組換えDNA技術を用いて調製される、
少なくとも1つの上記EtOS22ポリペプチド、
または
b)上記EtOS22ポリペプチドの1つを含む、上記のような融合タンパク質、
を含む不活性化ワクチンに関し;
そのポリペプチドまたは融合タンパク質が、アミド化、カルボキシル化またはリン酸化の方法によってイン・ビボまたはイン・ビトロで修飾されることが可能である、
2.
a)好ましくは、EtOS22ポリペプチドの長期合成および抗原提示を生じさせ、結果として免疫系が刺激される、上記EtOS22ポリヌクレオチドの1つを含有する、自己複製ベクター(例えば、細菌、真菌またはウイルス)、または
b)EtOS22ポリヌクレオチドを含むプラスミド、または
c)純粋なEtOS22ポリヌクレオチド(ネイキッドDNA)、
を含むベクターワクチンに関し;
3.
a)EtOS22ポリペプチドの免疫原エピトープに対する抗体、または
b)抗イディオタイプ抗体、即ち、EtOS22ポリペプチドに結合する抗体のイディオタイプに対する抗体、
を含む受動ワクチンに関する。
本発明は、配列番号:2に記載のEtOS22ポリペプチドの機能を調節し、それによってEimeriaスポロキスト由来のスポロゾイトの脱嚢を調節する活性な化合物(例えば小器官分子、ペプチドまたは抗体)を同定するための方法に関する。調節の程度は、少なくとも10%、好ましくは少なくとも20%、特に好ましくは少なくとも30%および特に好ましくは少なくとも50%である。
a)試験物質がEtOS22ポリペプチドに特異的に結合し得る選択された条件で、試験されるべき活性な化合物を、請求項2記載のEtOS22ポリペプチドと接触させる;および
b)行われたポリペプチドへの特異的結合を検出する;
工程を含み、
該ポリペプチドに結合する活性を有する化合物が、コクシジウム症を処置するための可能性のある活性な化合物として同定される、
方法に関する。
a)試験物質がEtOS22ポリペプチドと特異的に結合できる選択された条件で、試験されるべき活性な化合物を、請求項2に記載のEtOS22ポリペプチドと接触させる;および
b)請求項2に記載のポリペプチド、またはEtOS22タンパク質の活性調節を検出する;
工程を含み、
該活性を調節する活性を有する化合物が、コクシジウム症を処置するための可能性のある活性な化合物として同定される、
方法に関する。
活性な化合物は、予防的および治療的の両方に使用され得る。
活性な化合物は、直接または適当な剤形のいずれかで経腸的に、非経口的に、経皮的にまたは経鼻的に使用され得る。
本発明は、ポリヌクレオチドおよびポリペプチドが、EtOS22核酸およびEtOS22ポリペプチドと各々相同性であって、当業者に利用され得る方法を用いて容易に単離されうる関連(同族)生物由来のポリヌクレオチドおよびポリペプチドに関する。
理解を深めるために、発明の詳細な説明、実施例および特許請求の範囲で使用される特定の単語および用語の意味は、下記で詳細に説明される。
細菌株およびベクター
細菌株
E.coli TOP10、化学的成分(Invitrogen, Groningen, NL)
F−mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC)Φ80 lacZΔM15 ΔlacX74 recAl deoR araD139Δ (ara-leu)7697 galU galK rpsL (StrR) endAl nupG.
E.coli TG1, エレクトロコンピータント (Stratagene, Heidelberg)]
supE thi-1Δ(lac-proAB) Δ(mcrB-hsdSM)5 (rk -mk -) [F' traD36 proABlaclqZΔM15]
ベクター
pG8SAET (Jacobsson and Frykberg, 1998; Zhang et al., 1999)
pCR2.1-TOPO (Invitrogen, Groningen, NL)
pcDNA3.1/V5-His-TOPO (Invitrogen, Groningen, NL)
Eimeria tenellaからのゲノムDNA単離
DNAを、Blin and Stafford (1976)の方法を修飾した方法を用いて単離した。1x108の胞子形成した接合子を、3000rpm、10分(Heraeus MULTIFUGE 3L-R)で沈降させ、沈殿物の容量と同じガラスビーズ(0.45-0.5 mm)の容量を添加した。接合子およびスポロキスト殻を、最高速でボルテックスによる2分間の攪拌によって破砕し、該殻を顕微鏡下で確認した。次いでプロテイナーゼKの100μg/mlの濃度に調整した抽出緩衝液(5ml)(10 mM Tris-HCl pH 8.0; 0.1 M EDTA pH 8.0;0.5% SDS;20μgのRNaseA/ml)を添加し、該混合物を一晩56℃でインキュベートした。DNAを、Roti-Phenol(Roth, Karlsruhe)/クロロホルムで2回抽出し、クロロホルムで1回、その後、2容量の絶対エタノールおよび0.1容量の3M 酢酸ナトリウムを用いて沈殿させ、13000rpm Beckman JS13.1ローターの遠心分離に供して沈降させた。該沈降物を、70%エタノールで2回洗浄し、空気中で乾燥させた;次いで、蒸留H20(dH2O)に再懸濁させた後、このDNAの濃度を、1%TBEアガロースゲルにおいて、1μgのEcoRI/HindIII-消化した#DNA(MBI Fermentas, St.Leon-Rot)との比較によって判断した。
Eirneria renellaおよびヒナドリの盲腸(chick cecum)由来の全RNAの単離
全RNAを、"Invisorb RNA kit II" (Invitek, Berlin-Buch)を用いて、3x107接合子またはヒナドリの盲腸(0.3g)から単離した。全ての手順工程を、RNase-不含物質およびDEPC(ジエチルピロカルボネート)処置溶液を用いて実施した。接合子をボルテックスによる攪拌により、溶菌緩衝液(500μl)中でガラスビースを用いて破砕し、一方で腸組織を、溶菌溶液(2ml)中でUltraturraxにより細く粉砕した。各ケースで該上清をRNAの単離に使用し、全て次の処理ステップは製造業者の指示書に従った。次いで、DEPC H20に溶解した全RNAを光化学的に決定した。
プラスミドDNAの調製
プラスミドDNAを、E.coli TG1またはE.coli TOP10の培養物(50ml)の一定量3mlから調製した。シングルコロニーを用いて、適切な抗生物質が添加されたLB培地に接種し、培養液を280rpm、一晩37℃で振とうしながらインキュベートした。The Nucleo Spin plasmid kit (Macherey-Ngel, Dueren)またはthe Plasmid Midi kit (Qiagen, Hilden)を、プラスミドを単離するために用いた。プラスミドDNAを、各製造者指示書に従って精製した。
核酸濃度の決定
核酸の濃度を、DU 640 分光光度計(Beckmann, Munich)で光度測定により決定した。その濃度および純度を、Sambrook ら(1989)によって説明されたとおりに計算した。サザンおよびノーザンブロッティングのためのプローブとして使用されるべき制限フラグメントを、EcoRI/Hind III-消化したλDNA(1μg)(MBI Fermentas, St.Leon-Rot)とそれらを比較することにより、1%TBEアガロースゲルにおいて評価した。
制限的および電気泳動的DNA分離
DNAを、製造業者の指示書に従って、また関連酵素に対して推奨される緩衝液において、制限エンドヌクレアーゼを用いて限定した。原則として、インキュベーションは3時間37℃であった。
アガロースゲル由来の単離DNAフラグメント
DNAフラグメントを、アガラーゼ(Roche Molecular Biochemicals, Mannheim)を用いるか、または1kit中のNucleospin Extract2 (Macherey-Nagel, Dueren)を用いて、同じ%のTAEアガロースゲル中、ウィンドウ・ゲルとして注ぎ入れた低融点アガロース(Biozym, Hess.Oldendorf)を消化することによりアガロースゲルから単離した。両ケースにおいて、所望のフラグメントを、長波UV光の下で切出し、製造業者の指示書に従って単離した。DNA濃度を決定するために、次いでサンプル量の1/10をコントロールゲルで分離し、DNA長標準物と比較して評価した。
E.coliの化学的形質転換
製造業者の指示書に従って、ケミカリー・コンピタントE. coli TOP10 (Invitrogen, Groningen, NL)を、組換えプラスミドを用いて形質転換した。形質転換細胞を選択寒天上に播種した後、一晩37℃でインキュベートし、形質転換体を単離し、制限消化により分析した。
Eimeria tenellaゲノム発現ライブラリーの構築
a)ゲノムDNAのフラグメント化(断片化)、およびブラント・エンド反応
Eimeria tenella ゲノムDNA(25μg)を、4mlの容量中、10x30秒40%器具作業負荷でSonotrode MS73を用い、氷冷水浴中で冷却しながら、フラグメント化した。100から800bpのサイズであったこれらのフラグメントを沈殿させ、dH20(60μl)に再懸濁し、同じ%の低融点アガロース・ウィンドウを有する1.2%アガロースゲル、エチジウムブロマイド不含1.2%アガロースゲルにおいて分離した。アガラーゼ消化によって単離したフラグメントを、製造業者の指示書に従って、S-400 HR Microspin columns (Amersham Pharamacia Biotech, Freiburg)を通して精製した。
pG8SAET(20μg)を、40UのSnaBI(Promega, Heidelberg)を用いて、37℃で3時間インキュベートした。その後、4Uのエビ・アルカリ性ホスフェート(USB, Bad Homburg)を制限混合物に加え、全体を37℃で一晩インキュベートした。65℃で10分間の熱不活性化後、直線化され、脱リン酸化されたベクターを、アガラーゼを用いる消化により0.8%低融点アガロース・ウィンドウゲルから単離した。
300UのT4DNAリガーゼHC(MBI Fermentas, St. Leon-Rot)を用いて、100μlの全量で、ゲノムDNAフラグメント(8μg)と直線化および脱リン酸化したpG8SAET(5g)を16℃48時間で連結させた。その後、このリガーゼを、65℃で10分間、熱不活性化し、組換えベクター分子をグリコーゲン(20μg)を添加して沈殿させた。該沈殿物をdH20(100μl)に再懸濁し、この懸濁液の1.5μlを各電気的形質転換に用いた。
E.coli TG1の50μl容量を、各々の場合で、0.1cmのエレクトロポーレーションキュベット(BIORAD, Munich)中、製造業者の指示書に従って、フィールド強度(17kV/cm)、200Ωおよび25μFで、Gene Pulser (BIorAD, Munich)において、ライゲーション混合物(1.5μl)を用いて電気的に形質転換させた。形質転換体の数を決定し、組換え細胞を、グリセロールストックの形態にて−80℃で貯蔵した。
ファージ・ディスプレイおよびフェーズパニング
a)組換えファージミドの調製および精製
各グリセロールストック(200μl)を、アンプリコン含有LB培地(50μg/ml)(20ml)に接種し、この培養物を、37℃280rpmで一晩インキュベートした。次いで、この培養物(1 ml)を使用してアンピシリン含有LB培地(100ml)に接種し、この培養物をOD600=0.5までインキュベートし、R408ヘルパーファージ(Promega, Heidelberg)(500μl)(1x1011 pfu)で感染させた。37℃280rpmでもう一晩インキュベーションした後、該細胞を、10分5000rpmで沈降させ、上清を滅菌濾過した;次いで、ファージミドを、Vivaspin 20 concentrators (Sartorius AG, Goettingen)を用いて製造業者の指示書に従って濃縮した。
限外濾過(100kDa MWCO)によって50倍濃縮したモノクローナル抗体(Mab)E2E5(Mouafo et al., 2002)のハイブリドーマ培養上清を、Corting Pan Mouse IgG DYNABEADS (Deutsche Dynal GmbH, Hamburg)をコーティングするために使用した。約5%E2E5 MAb含量を有する濃縮した全タンパク質(20μg)をDYNABEADSのmgあたりに使用し、該混合物を回転させて4℃で一晩インキュベートした。未結合タンパク質および免疫グロブリンを、PBS(NaCl(8g);KCl(0.2g);Na2HP04(1g)x2H20; NaH2PO4xH20(0.15g);KH2PO4(0.2g)pH7.4を、H20を用いて1lに調製した)/0.1%BSAで3回洗浄することによって除去して、DYNABEADSを結合反応に使用した。
結合反応において、表面上にMabE2E5を有するか、または有さないDYNABEADS[50μl(2x107)]を、PBS/0.1% BSA(400μl)中ファージミド濃縮物(200μl)を用いて、4℃で一晩回転させながらインキュベートした。DYNABEADSを10回洗浄した後に、溶出緩衝液(50mM クエン酸ナトリウム;150mM NaCl、pH4.5)(400μl)で、15分間回転しながらインキュベーションした後に、弱い結合ファージミドを除去し、溶出緩衝液(pH1.8)に溶出したファージを、中和化緩衝液(2M Tris-HCl、pH8.6)(40μl)で処理し、力価および再感染の決定に使用した。
d)力価決定および再感染
各溶出物を、対数増殖期にあるE.coli TGl(10ml)の再感染に使用した。37℃、40rpm、0.5時間でインキュベートした後、該細胞を沈降させ、次いでアンピシリン含有LB培地(400μl)に再懸濁した;次いで、それらを力価決定および/または増幅のためにアンピシリン含有LB寒天プレートに播種した。フェーズパニングの次のラウンドのために、これらのプレートを、18時間後にアンピシリン含有LB培地ですすぎ、微生物を、培養液(50ml)中でR408ヘルパーファージ(100μl)によって感染させた。37℃、280rpm、一晩インキュベーションした後に、ファージミドを、記載したとおりに濃縮し、あらたに結合反応に使用した。
E-タグ 発現クローンを単離する目的のために、約100コロニー形成単位(cfu)をアンピシリン含有寒天プレートに播種し、続いて数回のフェーズパニングの後、ニトロセルロース膜(Schleicher and Schuell, Dassel)に移した。膜に付着している細胞を、一晩、溶菌緩衝液[100mM Tris-HCl、pH7.8;150mM NaCl;5mM MgCl2;1.5% BSA;DNaseI(1μg)/ml;リゾチーム(40μg)/ml](6ml)中で溶解し、その後細胞残留物を、PBS/0.05% Tween-20で3回洗浄して除去し、膜上の非特異的結合部位を、1時間、1xRotiBlock溶液(Roth,Karlsruhe)を用いたブロッキングにより飽和させた。次いで、該膜を、1:500に1xRotiBlockで希釈したマウス抗Eタグ一次抗体(Amersham Pharmacia, Freiburg)と共に、室温で(22℃)2時間インキュベートした。非結合抗体を、0.5時間、3回洗浄することで除去した。アルカリホスファターゼ(AP)結合ヤギ抗マウスIgGを、二次抗体として1:2000希釈で使用した。さらに3回の洗浄工程後、該膜を、2分間、検出用緩衝液(100 mM Tris-HCl、pH9.5;100 mM NaCl)で平衡化し、結合二次抗体を、1:100に検出用緩衝液で希釈したCDPスター(Roche Molecular Biochemicals,Mannheim)を用いて、化学ルミネセンスの発光により検出した。2-10分間、22℃で、ECLHyperfilm(Amersham Pharmacia, Freiburg)上で感光させた。
モノクローナル抗体(MAb)E2E5を、Pan Mouse IgG DYNABEADSの表面に結合させ、ファージパニングに使用した。いずれの別の抗体も含まないPan Mouse IgG DYNABEADSをネガティブコントロールとして用いた。3回のファージパニングの後、ネガティブコントロールと比較して結合クローンが362倍多く含まれていた。Eタグを発現するこれらのクローンを、E2E5MAbを用いて、ウエスタン・ブロットにて分析した。単離した62のE−タグ発現クローンの内、6つ(A14、A17、A45-A47およびA62)を、ウエスタン・ブロットにおいてE2E5MAbによって認識した。検出された全ての融合タンパク質は、SDS−PAGEにおいて同じ移動挙動を示し、約14kDaの分子量を有した。これらの融合タンパク質は125AAからなり、その48AAはクローン化「A17」挿入体に起因し得る。
ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)
全てのPCRを、MJ Research(Biozym, Hess. Oldendorf)のPTC−200勾配サイクラーまたはPTC−150MiniCyclerにおいて実施した。
合成オリゴヌクレオチド(プライマー)
全てのPCRプライマーを、MWG Biotech (Ebersbach)により合成した。
RT−PCRは、全RNA逆転写に続いて、配列特異的プライマーを用いて、DNA配列を増幅する目的のためのPCRを含む。RTのための反応混合物の組成物は、全容量50μlで、次のとおりである;全RNA(3.5μg)、80UのRNasin リボヌクレアーゼ阻害剤(Promega, Heidelberg)、0.4mM dNTPmix、50UAMV逆転写酵素、1×AMV緩衝液(全てRoche Molecular Biochemicals, Mannheimから)、5mMDTTおよび2.5μM cDNA合成を開始するための分子としてランダムヘキサマープライマー。22℃10分でのインキュベーションに続き、42℃および55℃で各々30分間、cDNAの合成に供した。酵素を、95℃で5分間熱不活性化した。各逆転写について、2つの別の反応、すなわち各々逆転写酵素のない反応、RNAテンプレートのない反応を、ネガティブコントロールとして実施した。
胞子形成したEimeria tenella接合子からの全RNAを、5'−および3'-RACE−PCRのための開始物質として用い、"5'/3'RACE kit"(Roche Molecular Biochemicals, Mannheim)を用いて実施した。cDNA合成、テーリング反応(5'-RACEの場合にのみ)および配列特異的プライマーを用いるcDNAの増幅を、製造業者の指示書に従って行った。次いで、これを、5'-RACEの場合において1つ、3'-RACE、さらにネスティッドPCRの場合において2つ、5'および3'末端の増幅を増加させるために供した。A17-max-631-lo(cDNA合成)、A17-max-533-lo(dA-末端cDNAの増幅)およびA17-112-lo(ネスティッドPCR)を、5'-RACEにおいて配列特異的プライマーとして使用し、一方3'-RACEにおいては、A17-max-90-up(cDNA増幅)、A17-max-150-up(F’ネスティッドPCR)およびA17-22-up(2回目のネスティッドPCR)を配列特異的プライマーとして使用した。2%アガロースゲルで分離したRACE−PCR産物を、Chomczynski(1992)の方法を用いて、中性Hybond-N ナイロン膜(Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg)に転写し、放射性標識プローブとハイブリダイズさせ、次いでKodak Biomax MS X線フィルムで感光させて使用した。この方法で同定した特異的なRACE−PCR産物を、クローンとして発生させ、単離し、配列決定した。
PCR産物のクローニング
TOPO TA クローニングキットおよびpcDNA3.1/V5-His TOPO TA 発現キット(Invitrogen, Groningen, NL)を、PCR産物のクローニングに使用した。PCR産物を、1kit (Macherey-Nagel,Duren)中のthe NucleoSpin Extract2を用いて、アガロースゲルから単離し、5UのTaq DNAポリメラーゼ(Promega, Heidelberg)、1xTaq DNAポリメラーゼ緩衝液および0.4mM dNTP mixと共に72℃で0.5時間インキュベートした。TaqDNAポリメラーゼの末端トランスフェラーゼ活性により、3’末端でアデニル化したPCR産物を1kit中のNucleoSpin Extract2を用いて2回目に精製し、その後製造業者の指示書に従って、TOPO TA クローニングに使用した。
DNA配列分析
クローン化DNAを、Sangerら(1977)の鎖停止方法に従い、MWG Biotech (Ebersbach)を備えた自動化LI-COR 4000 DNAシークエンサーを用いて非放射性的に配列決定した。配列決定を、pG8SAET ベクター(MWG Biotech, Ebersberg)用の5'-IRD-800-結合プライマーおよび5'-IRD-800-結合標準プライマー(LI-COR Bioscience, Bad Homburg)を用いて行った。
サーモ・シーケナーゼ・プライマー・サイクル配列決定キット(Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg)および赤外蛍光染料IRD-800(MWG Biotech, Ebersbach)に結合させたプライマーを、配列決定反応に使用した。各反応について、プラスミドDNA(1.5μg)および5'-IRD-800-結合プライマー(1pmol/μl)(2-4μl)を、全容量(13μl)に混合し、この混合物(3μl)を、各ケースにおいて、A、C、GまたはTヌクレオドミックス各々3μlに添加し、次いでこれらの混合物に各ケースで、鉱油(10μl)で重層し。次いで、配列決定反応を、PTC 100サーモサイクラー(MJ Research, Biozym, Hess. Oldendorf)で行う。この反応において、2分間94℃での変性、変性(94℃、30秒)、アニーリング(55℃、30秒)および鎖合成 (72℃、1.5分)の30サイクルに供した。反応を、ホルムアミド負荷緩衝液(6μl)を添加することによって停止させた。配列決定ゲル上で配列決定反応を行う直前に、該反応サンプルを72℃で3分変性させ、その直後に、光から保護しながら氷上で貯蔵した。蛍光標識した鎖停止フラグメントを、1xTBE緩衝液、1500Vおよび50℃、8M 尿素を含有する修飾されたポリアクリルアミド(Ultra Pure Sequagel XR, National Diagnostics ; Atlanta, USA)からなる40cm長、0.25mm厚の6%ゲルにおいて分離し、リアルタイムでレーザー光電子増倍管ユニットを用いて、検出した。配列を、LI-COR ImagIR 4.0 software base (MWG Biotech, Ebersbach)を用いて分析した。
配列分析によって得たデータを、the Molecular BioComputing Suite (Muller etal., 2001)および配列3.0プログラムを用いて最初に処理し、導き出したタンパク質配列を決定した。BLAST(Altschul et al., 1990)およびomniBLASTプログラムをデータベース探索のために使用した、すなわち、EMBLとSwiss Prot databaseにおいて既知配列と、Eimeria tenella genome project data(www.sanger. ac.uk/Proiects/E tenell/)との比較である。2以上のDNAまたはタンパク質配列を、BLAST2配列(www. ncbi.nlm.nih.gov) (Tatusova and Madden, 1999)、CLUSTALW(www. ebi. ac. uk) (Thompson et al., 1994)およびDIALIGN(Morgenstern et al., 1998; 1999)プログラムを用いて並べた。さらに、このSignalP(www. cbs. dtu.dk/services/signalP/)(Nielsen etal., 1997)およびClone Manager5programを、シグナルペプチドを同定するために、各々クローニングおよび限定の計画をたてるために、そしてオープン・リーディング・フレームを探索するために、使用した。
E. coli由来のタンパク質抽出物の調製
E.coli TG1(2ml)を、定常状態一晩培養物から沈降させ、dH20で1回洗浄し、dH2O(300μl)に再懸濁した。4xRotiLoad 緩衝液(Roth, Karlsruhe)(100μl)を添加し、サンプルを5分間沸騰水中で変性させた。混合物中のゲノムDNAを、短時間の超音波処置によってフラグメント化し、各ケースでこのサンプル(10μl)を、SDSポリアクリルアミドゲル上で流した。
ポリアクリルアミドゲル中でタンパク質を分離する電気泳動およびウェスタンブロッティング
a)SDS−PAGE
Laemmli(1970)の方法を用いて、不連続なポリアクリルアミドゲルにおいて変性条件下でタンパク質抽出物を分離した。Mini-PROTEAN II電気泳動細胞装置(BIorAD, Munich)を、この目的のために使用した。この系において、ゲルサイズは8x10cmであった。15%ポリアクリルアミドを含有する分離ゲルを使用した。スタッキング・ゲルの濃度は、均一な4.5%ポリアクリルアミドであった。分離は、40mA、約2-2.5時間で生じた。予め染色したSDS分子量マーカーミックス(Sigma, Deisenhofen)(5μl)を分子量標準として使用した。
SDS−PAGEで分離したタンパク質を、セミドライ法(Kyhse-Anderson, 1984)を用いて、Protran BA85 ニトロセルロース膜(Schleicher and Schuell, Dassel)上にブロッティングした。この方法は、連続緩衝液系(Lihme andSchafer-Nielsen,1986)を使用し、ここで2つのグラファイトプレート(Biometra Fast Blot, Goettingen)の間にあるブロッティング緩衝液に浸したWhatman paper(Whatman Ltd., Maidstone, England)の層は緩衝液貯蔵所として機能する。このタンパク質が、60mAの電流、2時間でSDSポリアクリルアミドゲルからニトロセルロース膜に転写された均質な電気的なフィールドは、これらのグラファイトプレートの間で生じる。転写を確認するために、ニトロセルロース膜を、ブロッティングの後にポンソーS(3%トリクロロ酢酸中0.2%ポンソーS)で可逆的に染色し、次いでdH20を用いて再度脱染色した。
ニトロセルロース膜を、遠心分離チューブ(Falcon, Becton Dickinson, Sunnyvale, CA, USA)(50ml)の内側に巻き付け、非特異的結合部位を飽和させるために、1xRotiBlock 溶液(Roth, Karlsruhe)(10ml)を用いて回転させながら1時間インキュベートした。その後、このブロッキング溶液を、1xRotiBlock 溶液(10ml)中、モノクローナル抗体E2E5(一次抗体)の50倍濃縮ハイブリドーマ培養上清(50μl)により置換した。22℃で2時間インキュベートした後、該膜を、未結合の過剰な一次抗体を除くために、PBS/0.05% Tween-20で0.5時間、全て3回洗浄した。二次抗体、すなわち、セイヨウワサビ・ペルオキシダーゼ(HRP)(Jackson Immune Research Laboratories, West Grove, USA)と結合させ、1xRotiBlock溶液(10ml)で1:4000希釈したヤギ抗マウスIgGを、1時間の間添加した。次いで、膜を、PBS/0.05%Tween-20を用いて全て0.5時間、3回再度洗浄した。ここで、結合抗体を、化学ルミネセンスを発生させた後にRoswellおよびWhite(1978)の方法で、ECLウェスタンブロッティング検出系(Amersham Pharmacia, Freiburg)を用いて検出した。これに対して、検出試薬1および2の等量を混合し、膜に加えた(0.125ml/cm2)。1分後、液体を除去し、膜を1回、PBS/0.05% Tween-20で軽くすすいた;次いで2つの上部の透明なフィルムの間にそれを置いて、空気泡を取り除いた。ECL Hyper film (Amersham Pharmacia, Freiburg)上で、2−5分、22℃で感光させた。
放射性標識DNA
DNAの放射標識は、用いたプローブのサイズに依存する。DNAフラグメント>800bpを、FeinbergおよびVogelstein(1984)の方法に従って[α32P]dCTPを用いてランダムプライミングによって標識した。Megaprime DNA 標識キット(Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg)を、製造業者の指示書に従って、この標識化反応のために使用した。DNA(40ng)および50μCiの[α32P]dCTP(10μCi/l、比活性>3000Ci/mmol)をアッセイあたりに使用した。
サザン・ブロッティング:膜へのDNAの転写およびハイブリダイズ
この技術を用いて、中性Hybond-Nナイロン膜上に(Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg)PCR産物およびゲノムDNAの両方を転写する。ゲノムDNAを、予め様々な制限エンドヌクレアーゼを用いて消化し(制限アッセイあたり10μg)、20mVで0.6%、14cm長のアガロースゲルで一晩分離した。ブロッティングを、Chomczynski (1992)の方法に従って実施し、下方キャピラリィーによって、2時間または終夜アルカリ性トランスファー緩衝液(3M NaCl、8mM NaOH、pH11.40-11.45)中で転写した。転写前に、ゲル中のDNAを、1.5M NaCl、0.5M NaOH中で1時間変性させ、次いでトランスファー緩衝液中で10分間インキュベートした。転写がおこった後、該膜を、0.2M リン酸ナトリウム緩衝液(pH6.8)で15分中和し、次いで80℃で20分間乾燥させた。膜上のDNAを、ここで、放射性標識プローブと共にハイブリダイズに使用した。しかし、まずハイブリダイゼーション前に溶液中60℃で3時間、膜をインキュベートした。次いで、この溶液を、ハイブリダイゼーション溶液に置き換えた。放射性標識プローブを加えた後に、ハイブリダイゼーションを一晩60℃で行った。20xSSCストック溶液(3M NaCl;0.3M クエン酸ナトリウム、H20中、pH7.0)を、洗浄緩衝液に用いた。該膜を、2xSSC、0.1%SDS、30分、そして1xSSC、0.1%SDS、30分から2時間、連続的に洗浄した。該膜を、補力スクリーンを用いて−80℃でKodak Biomax MS X線フィルム上で感光させた。
RNAの電気泳動およびノーザンブロッティング
RNAを電気泳動するための方法の全工程を、0.1% DEPCで処理し、次いでオートクレブにかけた緩衝液を用いるRNAseを含まない条件下で実施した。RNAを、グリオキサールおよびDMSOを用いて変性させ、次いでSambrook et al.(1989)に記載のとおりに電気泳動により分離した。脱イオン化した6Mグリオキサール(5.4μl)、DMSO(16.0μl)および0.1M リン酸ナトリウム緩衝液(3μl)(pH7.0)を、5.4μlであるRNA(20pg)に添加し、全体を50℃で1時間インキュベートした。その後、グリオキサール・ゲル・ローディング緩衝液(10mM リン酸ナトリム、pH7.0;50% グリセロール;0.25%ブロモフェノール・ブルー)(6μl)を氷上で添加した。該分離を、3-4V/cmで、10mM リン酸ナトリウム緩衝液(pH7.0)中で、1.2%アガロースゲルで行った。RNAを、下方キャピラリーブロッティング技術およびアルカリ性トランスファー緩衝液(3M NaCl、8mM NaOH、pH11.40-11.45) (Chomczynski, 1992)を用いて、中性Hybond-N ナイロン膜(Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg)上にブロッティングした。該膜を、0.2Mリン酸ナトリウム緩衝液(pH6.8)中で15分中和し、最後に80℃で20分間乾燥させた。サイズを評価するために、EcoRI/HindIII消化したDNA(MBI Fermentas, St. Leon-Rot)(10μg)を、グリオキシル化し、RNAと共に平行して分離した。電気泳動の後、λDNAを含有するレーンを、ゲルの残余物から分離し、グリオキサールを除去するために、50mM NaOH20分洗浄し、50mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.0)で15分中和し、最後に同じ緩衝液中でエチジウムブロマイド/ml(0.5μg)により染色した。ハイブリダイゼーションを、すなわち65℃で、2回目の洗浄緩衝液として0.1xSSC、0.1% SDSを用いるさらなるストリジェントな条件以外はサザン・ブロッティングに記載のとおりに実施した。
EtOS22cDNAの配列決定
融合タンパク質がウェスタンブロッティングにおいてE2E5MAbによって認識したファージクローンを、DNA配列決定を用いて分析した。この既知の配列(暗灰色の下線)を基にして、5'-および3'-RACE-PCRを用い、この遺伝子の3'末端および主要な5'末端を増幅し、この5'-RACEは224bpまで5'末端を伸張させるために使用される。リーディングフレームが依然連続して残っている間に、オープン・リーディング・フレーム(ORF)を開始する開始コドン(ATG)が消失した。RT−PCRを使用してこの遺伝子の完全なORFを増幅させるために、2つの新しいプライマーを、Eimeria tenella genome projectのデータを基にして構築した:配列中に下線を引いたA17-f-長さ-64-upおよびA17-f-長さ-1176-loが、1106bpのPCR産物を提供した。この方法で、完全なオープン・リーディング・フレームを増幅させた。該プライマーは、各々cDNAの5'-UTRおよび3'-UTRにおいてハイブリダイズした。5'プライマーとATG開始コドンの間に、上流ストップコドンが存在しており、これはPCR産物が完全なオープン・リーディング・フレームを含有することを確実にするものである。EtOS22cDNAは、594bpまたは198AAのORFを所有し、TAAストップコドンによって位置677で終結する。3'-UTRは506bpを含む。図1は、EtOS22に対してcDNAの完全配列を提供する;しかし5'-UTRの長さは依然決定されていない。
EtOS22の特徴分析
シグナルP VI.1プログラム(Nielsen et al.,1997)により、タンパク質のN末端で18AAのシグナル ペプチドを同定した(配列中の淡灰色で線を引いた)。シグナルペプチドおよび成熟タンパク質の間の開裂部位は、おそらく、位置18および19(AVA−AD)の間にある。結果的に、成熟タンパク質のサイズは180AAである。これは、シグナルペプチドを持たない理論分子量21039.7Daか、またはシグナルペプチドを持つ22830.9 Daを示した。顕著な特徴は、前駆体タンパク質(または、成熟タンパク質で)中の特定のAAの頻度である:ヒスチジン(H)23.2% (25.6%)、プロリン(P)17.2% (18.9%)、アラニン(A)8.6%、(6.7%)およびグルタアミン(Q)7.6%(8.3%)。ヒスチジンおよびプロリンあわせて、タンパク質中全アミノ酸の40%以上となる。
Eimeria tenellaにおけるEtOS22の発現
Eimeria tenella中のEtOS22の発現パターンを分析することを目的として、配列特異的プライマーおよび放射性標識プローブを各々用いて、RT−PCRおよびノーザン・ブロッドを、対応する翻訳物を検出するために行った。4つの異なる寄生体段階(胞子形成した接合子、およびニワトリの感染後72h、137hおよび148hの細胞内段階)から単離したcDNAをRT−PCRに用い、これらの段階ごとの全RNAは感染したニワトリの盲腸から単離した。RT−PCR産物は、137および148時間の感染後(ガモゴニー)、そして感染後72時間(シゾゴニー)ではない接合子段階で、上手く増幅した。従って、この遺伝子は、72時間感染後には依然として転写されず、転写は感染後137時間までに起こり、更に継続し、胞子形成した接合子(図2)でおこっている。
Eimeria tenellaにおける接合子胞子嚢子タンパク質(EtOS22)の位置決定
a)免疫蛍光
3x107胞子形成した接合子を、14000rpm2分で沈降させ、1回PBSで洗浄した;次いで、それらを沈殿物の容量と同じガラスビーズ(0.45-0.5mm)と共に、ボルテックスを用いて、サンプルに存在する接合子およびスポロキストの一部が破砕するまで、2分間激しく振とうした(顕微鏡下で確認した)。これらの細胞および細胞破砕物を沈降させ、次いで冷メタノール(−20℃)に再懸濁し、その後それらを22℃で10分間 インキュベートした。別の洗浄ステップの後、それらを22℃10分間でPBS/0.1% Triton X100に再懸濁した。次いで、それらを、PBSを用いて完全に反復洗浄し、細胞物質中の非特異的結合部位を、22℃1時間、ブロッキング緩衝液(PBS/1% BSA)中で、回転させながらインキュベーションして、飽和させた。その後、E2E5モノクローナル抗体(一次抗体)の50倍濃縮したハイブリドーマ培養上清(25μl)を、ブロッキング緩衝液(1ml)に添加し、該混合物を、回転させながら2時間インキュベートした。一次抗体の過剰量を、全0.5時間3回PBSで洗浄して除去し、細胞物質を、光から保護しながら1時間回転させながら、Alexa Fluor 488 ヤギ抗マウスIgG(H+L)(MoBiTec GmbH,Gppingen)二次抗体と共にインキュベートした。PBSで2回洗浄した後、細胞ペレットを、Mowiol(Polyscience Inc., Niles, IL, USA)に再懸濁した;次いで、この懸濁液(15μl)を、顕微鏡スライド上に置き、気泡を排除するためにカバースリップで覆い、4℃暗所で貯蔵した。
Leica CLSM TCS NT 連結装置(Leica Lasertechnik, Heidelberg), Version 1.5.451にあったZeiss IM 35 顕微鏡(Zeiss, Oberkochen)を、共焦点レーザー走査顕微鏡のために使用した。488nm波長でアルゴンレーザーを用いて、蛍光を発するようにAlexa 488 染料を刺激した。接合子およびスポロキストからの光学セクションのZシリーズを、1.024x1.024ピクセルの解像によってスキャンした。ウィンドウ版Adobe Photoshop 6.0およびCorel Draw 10.0を、結果を分析するために使用した。
スポロゾイト脱嚢
新しい接合子を得るために、2−3週齢のヒナを、プロバングを用いて、約5000胞子形成したEimeria tenella接合子により感染させた。感染後7日目に動物を屠殺し、盲嚢含有物を2%重クロム酸カリウム溶液中に回収した。約28℃で攪拌している間に、この接合子は、48時間以内に胞子形成した。スポロキストを得るために、接合子を、ポッター(Potter)を用いて粉砕した。これを行うために、約1.5mlの濃縮接合子懸濁液を、ポッター容器中でピペッティングし、全ての接合子が破砕されるまで(顕微鏡で確認した)1300rpmで均質化した。
スポロゾイト脱嚢の阻害
脱嚢中のEtOS22の重要性を調査するために、平行脱嚢アッセイを、E2E5MAbの追加的存在下および非存在下で行った。次いで、孵化スポロゾイトおよび未孵化スポロゾイト含有スポロキストの数を、両方のアッセイ(各々2ml)で決定し、これらのデータを互いに比較した。孵化スポロゾイトの数は、各々コントロールおよびMAbの存在では、96x106および4.8x106であった。一方、未孵化スポロゾイト含有スポロキストの数は、2.0x105から2.2x106(図6)に増加した。未孵化スポロゾイト含有スポロキストが約10倍増加したと同時に、遊離スポロゾイトが約半分まで低下したという事実は、EtOS22の活性調節により、Eimeria tenella脱嚢を阻害に導くことを示し、結果的に、EtOS22の活性を調節することはEimeria感染を処理するのに適切であり得る。
細胞培養においてEimeria tenellaに対するアフィニティー単離物質の試験
イン・ビトロ試験は、一次腎臓細胞培養に対して有効であった。このため、12日目の産卵型(laying-type)のチキン由来の腎臓組織を無菌解剖し、そこから単離した腎臓細胞を、96ウェルプレートの単層組織培養において培養した。使用した栄養培地は、DMEM+5%胎児子ウシ血清+2%グルタミン+2%非必須アミノ酸+1%HEPES+1%ピルビン酸ナトリウムである。2日間42℃および5%CO2でインキュベートした後、組織培養物を、脱嚢したEimeria tenellaスポロゾイトにより感染させた。DMSO中ストック溶液濃度(20mg/ml)から開始して、アフィニティー単離物質を、栄養培地で終濃度10ppmまで希釈し、感染細胞培養に添加した。感染5日後に、培養物を顕微鏡で評価し、宿主細胞の状態、インタクトなシゾントおよび遊離メロゾイト(感染120時間後)の数を決定した。活性を次のように評価した:
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Claims (19)
- a)配列番号:1または3に記載の配列;または
b)配列番号:1または3に記載の配列を有するポリヌクレオチドと、50%以上の同一性を示すポリヌクレオチド;または
c)ストリジェントな条件下で、配列番号:1または3に記載の配列を有するポリヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチド;または
d)配列番号:2に記載の配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;または
e)配列番号:2に記載の配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと50%以上の同一性を示すポリヌクレオチド;または
f)ストリジェントな条件下で、配列番号:2に記載の配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチド;または
g)遺伝子コードの縮重のために、配列番号:1に記載の配列を有するポリヌクレオチドとは異なるポリヌクレオチド;
h)a)からg)に記載のポリヌクレオチドのフラグメントであって、少なくとも6ヌクレオチド長である、ポリヌクレオチド;
を含むポリヌクレオチド。 - 請求項1に記載のポリヌクレオチドによってコードされ、少なくとも8アミノ酸長である、ポリペプチド。
- 請求項1に記載の少なくとも1つのポリヌクレオチドを含む、ベクターまたは発現系。
- 請求項3に記載のベクターまたは発現系を担持する、宿主細胞。
- 請求項4に記載の宿主細胞を用いる請求項2に記載のポリペプチドの調製方法。
- 請求項2に記載のポリペプチドに特異的に結合することを特徴とする、抗体。
- 殺寄生虫薬として請求項6に記載の抗体の使用。
- 請求項1に記載のポリヌクレオチドを検出するための方法であって、請求項1に記載のポリヌクレオチドが、生物学的サンプル由来の核酸物質とハイブリダイズされ、該ハイブリダイゼーションが検出される、方法。
- ハイブリダイゼーションがポリメラーゼ連鎖反応を用いて検出される、請求項8に記載の方法。
- ポリペプチドが、請求項6に記載の抗体の結合によって検出される、請求項2に記載のポリペプチドを検出するための方法。
- 請求項1に記載のポリヌクレオチドまたは請求項2に記載のポリペプチドを検出するための組成物であって、請求項1に記載のポリヌクレオチドまたは請求項6記載の抗体を含む、組成物。
- ワクチンを産生するための、
a)請求項1に記載のポリヌクレオチド;または
b)請求項2に記載のポリペプチド;または
c)請求項3に記載のベクターまたは発現系;または
d)請求項6記載の抗体、の使用。 - a)請求項2記載のポリペプチド;または
b)請求項3に記載のベクター;または
c)請求項6記載の抗体、を含むワクチン。 - スポロキスト由来のスポロゾイトの脱嚢中にEtOS22タンパク質の活性を調節する活性な化合物を見出す方法であって、
a)試験物質がEtOS22ポリペプチドに特異的に結合し得る選択された条件で、試験されるべき活性な化合物を、請求項2に記載のEtOS22ポリペプチドと接触させる;および
b)行われた該ポリペプチドへの特異的な結合を検出する;
工程を含み、
ポリペプチドに結合する活性を有する化合物がコクシジウム症を処置するための可能性のある活性な化合物として同定される方法。 - スポロキスト由来のスポロゾイトの脱嚢中にEtOS22タンパク質の活性を調節する活性な化合物を見出すための方法であって、
a)試験物質がEtOS22ポリペプチドに特異的に結合し得る選択された条件で、試験されるべき活性な化合物を、請求項2に記載のEtOS22ポリペプチドと接触させる;および
b)請求項2に記載のポリペプチド、またはEtOS22タンパク質の活性調節を検出する;
工程を含み、
活性を調節する活性を有する化合物が、コクシジウム症を処置するための可能性のある活性な化合物として同定される方法。 - 請求項14または15に記載の方法のうちの一つを用いて見出され得る、活性な化合物。
- スポロキスト由来のスポロゾイトの脱嚢中にEtOS22タンパク質の活性を調節する、活性な化合物。
- 請求項16または17に記載の活性な化合物および医薬的に許容し得る添加剤を含む、医薬組成物。
- コクシジウム症を処置するための医薬品製造のための、スポロキスト由来のスポロゾイトの脱嚢中にEtOS22タンパク質の活性を調節する、活性な化合物の使用。
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