MXPA06000198A

MXPA06000198A - Usos de un nuevo gen de eimeria y proteina correspondiente.

Info

Publication number: MXPA06000198A
Application number: MXPA06000198A
Authority: MX
Inventors: Frank Wunderlich
Original assignee: Bayer Healthcare Ag
Priority date: 2003-07-04
Filing date: 2004-06-30
Publication date: 2006-03-21
Also published as: AR045000A1; BRPI0412323A; JP4594304B2; JP2008500003A; WO2005005472A1; AU2004255594A1; EP1644407A1; EP2311859A1; DE10330235A1; NZ544451A; NO20060568L; US20070184054A1; US7691987B2; AU2004255594B2; ZA200510465B; CA2531161A1

Abstract

La invencion se refiere a una nueva proteina (EtOs22) de oocito esporocito que pertenece al parasito de la especie Eimeria tenella y al polinucleotido que codifica esta proteina, a los vectores que contienen este polinucleotido, a celulas que se transforman con estos vectores, a los anticuerpos que se dirigen contra la proteina, a las vacunas que comprenden el polinucleotido, a la proteina, a sus fermentos, a los vectores previamente mencionados o anticuerpos dirigidos contra la proteina y al uso del polinucleotido o de polipeptido para encontrar compuestos activos para tratar una infeccion con Eimeria y compuestos activos que son adecuados para la terapia de una infeccion con Eimeria.

Description

USOS DE UN NUEVO GEN DE EIMERIA Y PROTEINA CORRESPONDIENTE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCION La invención se refiere a una nueva proteína de oocito esporocítico (EtOS22) que pertenece al parásito de la especie Eimeria tenella y al polinucleótido que codifica esta proteína, a vectores que contienen este polinucleótido, a células que se transforman con estos vectores, a anticuerpos que están dirigidos contra la proteína, a vacuna que comprenden el polinucleótido, la proteína o fragmentos de la misma, a los vectores o anticuerpos anteriormente citados dirigidos contra la proteína y al uso del polinucleótido o del polipéptido para encontrar compuestos activos para tratar una infección por Eimeria y a compuestos activos que son adecuados para la terapia de una infección por Eimeria . Los parásitos del género Eimeria son protozoos obligatoriamente intracelulares que tienen un ciclo vital complicado que da lugar secuencialmente a fases de desarrollo sexuales y asexuales. Eimeria tenella vive en el ciego de la gallina doméstica {Gallus domesticus) y está estrechamente relacionado con los patógenos humanos Toxoplasma gondii, Plasmodium falciparum y Cryptosporidium parvum, y con los géneros Sarcocystitis, Neospora, Bribesia y Theileria, que son patógenos animales importantes. Según la clasificación REF.:168953 sistemática de los protozoos de Levine (1980) , los representantes de estos géneros pertenecen al filum Apicomplexa . Eimeria tenella es el agente causante de coccidiosis de aves de corral, una enfermedad que se ha convertido en un problema económicamente importante junto con la gestión intensiva de suelo de pollos y gallinas. La patología de una enfermedad coccídica incluye diarreas sangrientas, que pueden causar daños económicos serios como resultado de que las gallinas reducen su toma de alimento y pierden peso. Aparte de Eimeria tenella, otras seis especies de Eimeria son responsables de enfermedad coccídica en la gallina doméstica: Eimeria acervulina, Eimeria máxima, Eimeria brunetti, Eimeria necatrix y Eimeria praecox. Las formas infecciosas de los parásitos Apicomplex (esporozoítos y merozoítos) se caracterizan por propiedades morfológicas especiales que las distinguen de forma inequívoca de otros esporozoos. La característica más importante se considera que es un "complejo apical" en el polo celular anterior, estando compuesto dicho complejo por tres org nulos secretores (roptrías, micronemas y gránulos densos) y también los conoides formadores de estructura que poseen anillos polares y microtubulos subpeliculares . Eimeria tenella pasa a través de un desarrollo monoxeno en la gallina doméstica {Gallus gallus) . El parásito es estrictamente específico de huésped y obligatoriamente intracelular. La propagación tiene lugar en células epiteliales y en la submucosa del ciego. La gallina doméstica se infecta con Eimeria tenella cuando busca comida. Después de ingerir los oocitos esporulados y procesarse mecánicamente en la molleja, se liberan esporozoítos maduros en reposo a partir de los esporocitos, en lo que se denomina el cuerpo de Stieda, en el intestino delgado bajo la influencia de tripsina y sales biliares. Los esporozoítos se vuelven móviles y colonizan células huésped en el ciego formando una vacuola parasitófora . La vacuola parasitófora protege al parásito intracelular de la digestión lisosómica. Dentro de esta protección, se forman esquizontes multinucleares. La esquizogonia (merogonia) constituye una reproducción asexual del parásito. Los merozoítos móviles salen por pinzamiento del esquizonte en forma de una roseta. Después de liberarse, los merozoítos establecen hasta 3 generaciones posteriores de esquizontes en las células adyacentes de ciego. Durante una infección aguda, los ciclos de esquizogonia dan lugar a lesiones intestinales extensas que pueden conducir a hemorragias intestinales, pérdida de peso y, en el caso de una infección grave, a la muerte del huésped. Después de finalizar los ciclos de esquizogonia, comienza la gamogonia, con la formación de mxcrogamontes masculinos multinucleares y macrogamontes femeninos mononucleares , que maduran en gametos. Los macrogamentos contienen cuerpos "totipotentes" que, después de fertilización, se fusionan y forman la pared oocitica. Después de finalizar el tiempo de prepatencia de 6 días, se secretan nuevos oocitos. Con la secreción de los oocitos, la infección finaliza y el huésped tiene inmunidad especifica de especie adquirida. Diagnóstico La capacidad de identificar exacta, rápida y económicamente la especie coccídica en gallinas es de la mayor importancia posible para la profilaxis y el tratamiento de una infección. El procedimiento de Long y Reíd, 1982, se utiliza actualmente de forma rutinaria para identificar las siete especies Eimeria en la gallina según la morfología oocitica (microscópica) , la especificidad de huésped, la patología de las lesiones en el intestino y el tiempo de prepatencia. Además de esto, existe también el intento de efectuar una caracterización bioquímica mediante patrones de isoenzimas. En este procedimiento, se utilizan en su mayor parte enzimas del metabolismo del azúcar como marcadores genéticos para construir un zimograma (Johnston y Fernando, 1997) . La experiencia ha mostrado que puede conseguirse una diferenciación de especies exacta sólo inadecuada o parcialmente cuando se utiliza el procedimiento morfológicamente descriptivo convencional o los procedimientos bioquímicos. Por lo tanto, es deseable ser capaz de caracterizar especies al nivel de ADN recombinante . Hasta ahora, se han obtenido sólo muy pocos resultados de investigación conflictivos en este campo (Comes et al., 1996) . La diversidad biológica de las especies Eimeria sugiere que existen diferencias genéticas en forma de polimorfismos de ADN en las diferentes especies. Los polimorfismos pueden surgir como resultado de cambios de bases (deleción, inserción) o como resultado de transposiciones cromosómicas. En el procedimiento de huella del ADN, que se desarrolló originalmente para análisis de parentesco, se corta el ADM variable con endonucleasas de restricción, híbrida con sondas de ADN radiactivo y, después de electroforesis en gel y transferencia Southern, se visualiza en autorradiografía . La huella genética que se ha producido de esta manera puede utilizarse para diferenciar inequívocamente la especie y cepa de organismos. El procedimiento PCR-RAPD (reacción en cadena con polimerasa con ADN polimórfico amplificado aleatoriamente) ofrece una simplificación de este enfoque. El procedimiento está basado en amplificar ADN genómico en una reacción en cadena con polimerasa (PCR) utilizando cebadores individuales que tienen una secuencia nucleotidica aleatoria. Después de separar en un gel de agarosa y teñir con bromuro de etidio, los segmentos de ADN amplificados (marcadores de PCR-RAPD) dan lugar a un patrón de bandas específico. Sin embargo, este procedimiento puede utilizarse sólo para distinguir cepas puras entre sí . No es posible utilizar estas técnicas para identificar una especie en un aislamiento de campo (mezcla de diferentes especies Eimeria) . Un procedimiento técnicamente más sencillo, y por lo tanto más económico, sería encontrar una sonda especxfica que esté basada en una secuencia génica específica. Hasta ahora, sólo se han utilizado con este fin secuencias conocidas de ADN ribosómico (Ellis y Bumstead, 1990) de las regiones del espaciador transcriptor interno ITS1 (Schnitzler et al., 1998) e ITS2 (Gasser et al., 2001), asi como un antígeno de esporozoíto de Eimeria acervulina (EASZ 240/160) (Molloy et al., 1998). Terapia Se utilizan actualmente anticoccídiales por un valor anual de al menos 300 millones de dólares estadounidenses para la terapia de esta enfermedad. Desde 1970, el tratamiento quimioterapéutico se ha llevado a cabo, en particular, utilizando los ionóforos de poliéter monensina, narasina, salinomicina y lasalocida. Además, están también en el mercado un gran número de compuestos activos que inhiben la sxntesis de ADN o la síntesis de proteína de las fases del parásito (Greif , 2001) . Sin embargo, las presentes terapias padecen graves problemas y/o desventajas. Aparte de la fuerte carga de fármaco de la gallina (problemas de residuos en tejidos comestibles) y de la contaminación ecotoxicológica/ecobiológica (del entorno), el desarrollo de resistencia a fármacos se considera que es el mayor problema implicado en el tratamiento con anticoccidiales . Se hacen intentos de combatir las resistencias que se desarrollan utilizando lo que se denominan programas lanzadera o de rotación, y mediante una búsqueda costosa de nuevos mecanismos de acción (Coombs, 2002) . Existe por lo tanto una necesidad urgente de compuestos activos mejorados para tratar infecciones por Eimeria y de procedimientos para encontrar estos compuestos activos. Vacunación La inmunoprofilaxis (vacunación) sería una alternativa mucho mejor a tratar la coccidiosis quimioterapéuticamente . Un contacto patogénico con especies Eimeria. conduce virtualmente a inmunidad completa frente a una segunda infección homologa (Rose y Wakelin, 1990) . En pollos de un día, la administración continua de fases de parásito durante un periodo de 16-25 días induce una inmunidad natural frente a Eimeria tenella, Eimeria acervulina y Eimeria máxima (Stiff y Bafundo, 1993). Inmunizar gallinas ponedoras con antígenos gametocíticos protectores mejora la situación de inmunidad en pollos eclosionados . Esta estrategia se desarrolló por Wallach como "inmunización materna" (Wallach, 1992) . Se están llevando a cabo actualmente programas de vacunación que emplean cepas de Eimeria totalmente virulentas (vacunas vivas de oocitos) utilizando los productos comerciales Immucox® (Vetech Laboratories, Canadá) y Coccivac® (Sterwin Laboratories, EE.UU.). Los productos Paracox® (Schering Plough, Inglaterra) y Livacox® (Williams, 2002) están basados en lo que se denominan cepas virulentas atenuadas . Se han puesto recientemente en el mercado también vacunas vivas virulentas resistentes a poliéter (Vermeulen, 2001) . En total, están actualmente registradas 13 vacunas vivas que contienen oocitos para inmunizar frente a coccidiosis en gallinas (Chapman et al., 2002, Williams, 2002) . Sin embargo, todas estas vacunas que están en el mercado padecen la desventaja económica de altos costes de producción y de la gestión del ganado que es necesaria para la pasada de los oocitos. Es un problema adicional que las vacunas vivas que están en el mercado podrían mutar de vuelta al tipo patogénico original . Por lo tanto, existe la necesidad urgente de poner a disposición vacunas mejoradas que sean preferiblemente vacunas no vivas . El desarrollo, mediante manipulación genética, de una vacuna recombinante (una vacuna de subunidades) que está basada en los que se denominan antígenos protectores, se considera que es el "objetivo ideal" de todos los procedimientos de inmunización. Los antígenos protectores son compuestos estructurales en el parásito que, durante la interacción parásito/célula huésped, tienen una función importante en el reconocimiento celular, la adhesión celular y la Invasión celular y, posiblemente también, en otras proteínas cuya función no es conocida de momento. La búsqueda previa de antigenos protectores de Ei eria tenella ha abarcado antígenos de superficie y antígenos de orgánulos internos, y también antígenos de orgánulos aislados por gradiente, a partir de oocitos, esporozoitos y merozoítos (Vermeulen, 1998) . Aparte de la búsqueda deliberada de secuencias génicas de proteínas que sean ya conocidas, se utiliza también la búsqueda aleatoria en bases de datos de EST (mareajes de secuencia expresada) (Wang et al., 1999) o bibliotecas expuestas en fagos (Silva, A. et al., 2002) para encontrar nuevos genes y dianas . Danforth et al. (1985) fueron los primeros en preparar un antígeno de Eimeria tenella, de 60-70 kDa, in vitro, basándose en técnicas de ADN recombinante . Desde este experimento, se han preparado recombinantemente unos pocos antígenos de oocitos de Eimeria tenella selectivos (Clark, 1986, Crane et al., 1991, Bhogal et al., 1992, Eschenbacher et al., 1996), antígenos de esporozoitos de Eimeria tenella (Files et al., 1987, Miller et al., 1989) y antígenos de merozoíto de Eimeria tenella (Ko et al., Binger et al., 1993) . Crane et al. (1991) utilizaron un antígeno de Eimeria tenslla recombinante para inducir protección reactiva cruzada contra cuatro especies Eimeria en la gallina. Sin embargo, a pesar de muchos intentos de inmunización utilizando antígenos recombinantes , no se han conseguido resultados satisfactorios hasta ahora, lo que significa que existe una gran necesidad de identificar nuevos antígenos previamente desconocidos y sus secuencias génicas correspondienes (Jenkins, 1998, Vermeulen, 2001) . Descripción de las Figuras La Fig. 1 muestra la secuencia de ADN, y la secuencia aminoacídica deducida, en el caso de ADNc de EtOS22. Los cebadores A17-length-f-64-up y A17-length-f-1176-low están subrayados. El péptido señal está sombreado en gris pálido. La secuencia original del clon que se enriqueció en la inmunoabsorción en fase sólida, y que se utilizó para llevar a cabo la PCR-RACE 5' y 3', está sombreada en gris oscuro. La Fig. 2 muestra el uso de TI-PCR para determinar el patrón de expresión de StOS22. En cada caso, se utilizó 1 de marcadores pUC-Míx (MBI Fermentas, St . Leon-Rot) como patrón de longitud de ADN (M) . Se utilizó ADNc de ciegos de pollo no infectados (ui) , así como de ciegos de pollo infectados 72, 137 y 148 h después de la infección (72 hpi, 137 hpi y 148 hpi) y de oocitos esporulados, como moldes para las reacciones de PCR. Los productos de PCR que se amplificaron utilizando los cebadores A17-22-up y A17-112-low son de 91 pb de tamaño (A) , mientras que los productos de PCR que se amplificaron utilizando los cebadores -EtACTIN-up y EtACTIN-low son de 350 pb de tamaño (B) . Se cargaron en cada caso las mezclas de reacción que contienen transcriptasa inversa (TI) y que contienen molde de AR en los carriles marcados (1) , mientras que las mezclas de reacción sin TI pero que contienen molde de ARN se cargaron en cada caso en los carriles marcados (2) , y las mezclas de reacción que contienen TI pero no contienen molde de ARN se cargaron en cada caso en los carriles marcados (3) . La Fig. 3 muestra el análisis de transferencia Northern de £tOS22. Se separaron ARN total de oocitos esporulados (1) , ARN total de ciego de pollo infectado 137 h (2) y 148 h (3) después de la infección, y también ARN total de ciego de pollo no infectado como control negativo (4) mediante electroforesis en gel y se transfirieron.. Se hibridó la transferencia con el producto de PCR-RACE 3 ' marcado radiactivamente (816 pb) , que empieza en la posición 385. La Fig. 4 muestra una transferencia Southern genómica de EtOS22. Se separaron por electroforesis en gel 10 pg de ADN genómico de E. tenella y se transfirieron en cada carril. Este ADN se habla digerido anteriormente con las siguientes endonucleasas de restricción: Bgll (1) , Gal (2) , Kpnl (3) , Accl (4), Bglll (5), £>ral (6) y val (7). Se hibridó la transferencia con el producto de PCR marcado de la posición 1 a la posición 1.106 (1.106 pb) .

Las Figuras 5a-5c muestran la inmunofluorescencia contra EtOS22 en E. tenella. Se utilizó el mAb E2E5 (IgG2a de ratón) como anticuerpo primario, mientras que se utilizó un conjugado de IgG de cabra anti-ratón, Alexa 488, como anticuerpo secundario. Las figuras muestran una cubierta de oocito vacía (5a) , un esporocito roto (5b) y un esporocito intacto (5c) . La región del cuerpo de Stieda está marcada con una flecha. La Fig. 6 muestra que EtOS22 es una diana para inhibir la exquistación de E. tenella. Después de experimentos de exquistación paralelos, se determinaron el número de esporozoítos libres y el número de esporocitos que contienen esporozoítos no eclosionados en una muestra experimental que no contenía mAb E2E5 añadido (control) y en una mezcla experimental que contenía mAb E2E5 añadido. Descripción de la invención La invención se refiere a una nueva proteína de oocito esporocítico (I?tOS22) del parásito de la especie Eimerla tenella . La invención se refiere también al polinucleótido que codifica esta proteína. La SEC N° ID 1 muestra el A m completo que contiene la secuencia de ADN que codifica la nueva proteína de oocito esporocítico de Eimeria tenella. El marco de lectura abierto (ORF) que codifica la proteína (SEC N° ID 2) se muestra en la SEC N° ID 3.

Además, la invención está basada en el descubrimiento de que la nueva proteína EtOS22 del parásito de la especie Eimeria tenella está implicada en la exquistación de los esporozoítos a partir de los esporocitos, y en consecuencia es esencial para el ciclo vital del parásito. La exquistación puede inhibirse mediante anticuerpos dirigidos contra EtOS22.

BtOS22 es un gen sin intrones que consiste en un solo exón de codificación. El ORF del gen EtOS22, que es de 594 pb de tamaño, está presente en dos copias en el clon genómico 2257242c.007101021. Contigl (71.864 pb, estado: 03-03-2003). Sin embargo, probablemente EtOS22 aparece sustancialmente en más de 2 copias en el genoma de Eimeria tenella. La invención se refiere también a: a) un polinucleótido que exhibe una identidad de más de 50%, 60%, 70% u 80%, preferiblemente más de 85% ó 90%, y de forma particularmente preferida más de 95% o 97%, con el polinucleótido que tiene la secuencia descrita en la SEC N° ID 1 ó 3; b) un polinucleótido que hibrida, en condiciones rigurosas, con el polinucleótido que tiene la secuencia descrita en la SEC N° ID 1 ó 3; c) un polinucleótido que exhibe una identidad de más de 50%, 60%, 70% u 80%, preferiblemente más de 85% ó 90%, y de forma particularmente preferible más de 95% ó 97%, con un polinucleótido que codifica el polipéptido que tiene la secuencia descrita en la SEC N° ID 2; d) un polinucleótido que híbrida, en condiciones rigurosas, con un polinucleótido que codifica el polipéptido que tiene la secuencia descrita en la SEC N° ID 2; e) un polinucleótido que difiere del polinucleótido descrito en la SEC N° ID 1 debido a la degeneración del código genético; y f) un polinucleótido que es un fragmento de un polinucleótido como se describe en a) a e) y que es de al menos 6 nucleotidos u 8 nucleotidos de longitud, preferiblemente de más de 10 ó 20 nucleotidos de longitud, de forma particularmente preferida de más de 50 ó 100 nucleotidos de longitud, y de forma muy particularmente preferida de más de 200 o más de 500 nucleotidos de longitud. Un polinucleótido que tiene la secuencia SEC N° ID 1 ó 3, y también los polinucleotidos anteriormente citados a) a f) , se denominan polinucleotidos EtOS22 en adelante. La invención se refiere además a un polipéptido que está codificado por un ácido nucleico como se describe en a) a f) y es de al menos 8 aminoácidos de longitud. Este polipéptido, y el polipéptido descrito en la SEC N° ID 2, se denominan polipéptidos BtOS22 en adelante.

La invención se refiere también a un sistema de expresión o vector que contiene al menos uno de los polinucleótidos como se describen en a) a f) y una secuencia control de la expresión. El sistema de expresión permite expresar el polipéptido EtOS22 de conformidad con la invención. A este respecto, la expresión de EtOS22 está preferiblemente bajo el control del promotor de citomegalovirus (CMV) . Una señal de poliadenilación de BGH (hormona de crecimiento bovina) termina a su vez la transcripción, y es responsable de la poliadenilación del AR m. Son ejemplos de secuencias control de la expresión particularmente preferidas el promotor temprano o tardío de SV40 o promotor de adenovirus, el sistema lac, el sistema trp, el sistema TAC, el sistema TRC, el operador principal y las regiones promotoras del fago ?, las regiones de control de la proteina de cubierta fd, el promotor de 3-fosfoglicerato quinasa, el promotor de fosfatasa ácida y el promotor del factor de acoplamiento OÍ de levadura. La invención se refiere también a una célula huésped que alberga el vector o sistema de expresión descrito anteriormente . Son ejemplos preferidos de célula huésped: E. coli, Pseudomonas, Bacíllus, Streptomyces, células de levadura, células CHO, células Rl.l, células B-W, células L-M, células COS 1, células COS 7, células BSC1, células BSC40 y células BMT10, células de planta, células de insecto y células de mamífero en cultivo celular. La expresión en un sistema eucariótico se efectúa de forma particularmente preferible en el sistema baculovirus, particularmente en un sistema que permita la introducción de modificaciones postraduccionales. La invención se refiere también a proteínas de fusión que comprenden un polipeptido EWS22 como se describe anteriormente. A este respecto, la proteína de fusión puede contener otro resto polipeptídico que sea relevante para una actividad adicional de la proteína de fusión [por ejemplo, ß-galactosidasa, ß-glucuronidasa, proteína fluorescente verde (GFP) , proteínas autofluorescentes tales como proteína fluorescente azul (BFP) , glutation-S-transferasa (GST) , luciferasa, peroxidasa de rábano picante (HRP) y cloranfenicol acetíltransferasa (CA.T) ] . Además, o como alternativa, los mareajes epitópicos pueden formar parte de la proteína de fusión [por ejemplo, mareajes His, mareajes FLAG, mareajes de emaglutinina de la gripe (HA), mareajes Myc, mareajes VSV-G o mareajes de tioredoxina (Trx)]. Las proteínas de fusión pueden contener también proteína de unión a maltosa (MBP) , marea es S, dominios de unión a ADN Lex, dominios de unión a ADN GAL4 o proteína BP16 de herpesvirus simplex (HSV) . La invención se refiere también a un procedimiento para preparar un polipeptido EtOS22 o una proteína de fusión, como se describe anteriormente, en sistemas de expresión procarióticos o eucarióticos apropiados. A este respecto, la expresión puede efectuarse permanente o transitoriamente en una línea celular que sea apropiada en cada caso, o en células huésped apropiadas, como se describe anteriormente. Los sistemas huésped/vector conocidos tales como bacterias (por ejemplo, Streptayces spp., Bacillus súbtilis, Salmonella typhiurivm, Serratia marcescens y, en particular, Escherichia coli) son sistemas de expresión procariótica adecuados. Esta invención se refiere también al uso de polinucleótidos £¾OS22 para detectar polinucleótidos de parásitos del género Eimeria, preferiblemente Eimeria acervulina, Eimeria mxima, Eimeria brunetti, Eimeria necatrix, Eimeria praecox y, de forma particularmente preferida, Eimeria tenella. A este respecto, la invención se refiere a polinucleótidos que son capaces de hibridar con polinucleótidos de los parásitos anteriormente citados. La invención se refiere, en particular, al uso de estos polinucleótidos como: a) sondas en ensayos de transferencia Northern o Southern, b) polinucleótidos u oligonucleó idos que están unidos a micromatrices o macromatrices , c) cebadores de PCR o procedimientos análogos que se utilizan para el diagnóstico de los parásitos anteriormente citados, estando específicamente identificado y amplificado el i¾DN de los parásitos en cuestión utilizando los cebadores y la técnica de PC . Esta invención se refiere también a anticuerpos que reaccionan específicamente con un epítopo de un polipéptido £¾0S22. Esta invención se refiere también, en particular, a anticuerpos monoclonales que reaccionan específicamente con un epítopo de un polipéptido StOS22. Esta invención se refiere también al uso de los anticuerpos anteriormente citados como parasiticidas. Los anticuerpos se utilizan preferiblemente para tratar infecciones por Eiiaeria, y de forma particularmente preferible para tratar infecciones por Eiiaeria tenella. Los anticuerpos anteriormente citados se utilizan preferiblemente para tratar infecciones de aves de corral y, se utilizan de forma particularmente preferida para tratar infecciones de pollos. Diagnóstico Esta invención se refiere además al uso de polinucleótidos EtOS22, o de los anticuerpos anteriormente citados dirigidos contra polipéptidos EtOS22, para el diagnóstico de infecciones por Eimeria y, preferiblemente, infecciones por Eimeria tenella. La invención se refiere también a un kit que comprende polinucleótidos EtOS22, o anticuerpos dirigidos contra polipéptidos BtOS22, e instrucciones para implementar el procedimiento de diagnóstico.

Vacunas La invención se refiere también a un procedimiento para preparar una composición inmunogénica para inmunizar aves de corral, y preferiblemente pollos, comprendiendo dicha composición al menos uno de los polipéptidos EtOS22 anteriormente citados de conformidad con la invención o al menos uno de los anticuerpos anteriormente citados. La invención se refiere también al uso de los vectores de expresión anteriormente descritos que contienen uno de los polinucleótidos EtOS22 anteriormente citados para preparar una composición inmunogénica que ha de administrarse a un huésped con el fin de activar una respuesta inmune en este huésped, estando dirigida dicha respuesta inmune hacia una proteína homologa de EtOS22 de Eimeria o hacia la proteina BtOS22 de Eimeria tenella. Esta invención se refiere también al uso de los polipéptidos fítOS22 anteriormente citados para preparar vacunas contra la coccidiosis. La invención se refiere también a : 1. Una vacuna inactivada que comprende : a) al menos uno de los polipéptidos BtOS22 anteriormente citados que i. se aisla de las fases de parásito, o ii. se prepara sintéticamente in vitro, o iii . se prepara utilizando tecnología de ADN recombinante; o b) una proteína de fusión, como se cita anteriormente, que comprende uno de los polipéptidos EtOS22 anteriormente citados, siendo posible que el polipéptido o la proteína de fusión se hayan modificado in vivo o in vitro mediante amidación, carboxilación o fosforilación. 2. Un vector de vacuna que comprende : a) un vector autorreplicante (por ejemplo, bacterias, hongos o virus) que contiene uno de los polinucleótidos EtOS22 anteriormente descritos, que da lugar preferiblemente a la síntesis a largo plazo de un polipéptido EÜ0S22 y a la presentación de antígeno, dando como resultado que se estimula el sistema inmune; o b) un plásmido que contiene un polinucleótido EtOS22; o c) un polinucleótido EÜ0S22 puro (ADN desnudo) . 3. Una vacuna pasiva que comprende: a) anticuerpos que están dirigidos contra epítopos inmunogénicos del polipéptido EtOS22; o b) anticuerpos antiidiotípicos, concretamente anticuerpos que están dirigidos contra el idiotipo de los anticuerpos que se unen a un polipéptido j?tOS22. Procedimientos de examen Esta invención se refiere también a un procedimiento para identificar compuestos activos, tales como moléculas orgánicas pequeñas, péptidos o anticuerpos, que modulan la función del polipeptido £?tOS22 como se describe en la SEC N° ID 2 , y modulan asi la exquistación de los esporozoítos a partir de esporocitos de Eimexia. El grado de modulación es al menos 10%, preferiblemente al menos 20%, de forma particularmente preferida al menos 30%, y de forma muy particularmente preferida al menos 50%. La invención se refiere también a un procedimiento para encontrar compuestos activos que modulan la actividad de la proteina BtOS22 con respecto a la exquistación de esporozoítos a partir de esporocitos, en dicho procedimiento: a) se pone en contacto el compuesto activo que se va a ensayar con un polipéptido BtOS22 de conformidad con la reivindicación 2, permitiendo las condiciones seleccionadas que la sustancia de ensayo se una específicamente al polipéptido EtOS22; y b) se detecta que ha tenido lugar una unión específica al polipéptido; identificándose un compuesto activo que se une al polipéptido como un compuesto activo potencial para tratar la coccidiosis .

La invención se refiere también a un procedimiento para encontrar compuestos activos que modulan la actividad de la proteína EtOS22 con respecto a la exquistación de esporozoítos a partir de esporocitos, en dicho procedimiento: a) se pone en contacto el compuesto activo que se va a ensayar con un polipéptido £?tOS22 de conformidad con la reivindicación 2, permitiendo las condiciones seleccionadas que la sustancia de ensayo se una específicamente al polipéptido BtOS22; y b) se detecta una modulación de la actividad del polipéptido de conformidad con la reivindicación 2, o de la proteína _5tOS22; identificándose un compuesto activo que modula la actividad como un compuesto activo potencial para tratar la coccidiosis . La invención se refiere también a un procedimiento para encontrar compuestos activos para tratar la coccidiosis, en dicho procedimiento se utiliza la proteína £?tOS22 en su forma recombinante para examinar bibliotecas de compuestos químicos basándose en selección por afinidad y espectrometría de masas . Con el fin de encontrar inhibidores para la proteína diana, que tiene una función que es desconocida pero que es esencial para la supervivencia del esporozoíto, es posible utilizar procedimientos de examen que ensayan bibliotecas de sustancias con respecto a la afinidad por la proteína. Es una posibilidad de examen la selección por afinidad de mezclas de sustancias, detectándose los ligandos posteriormente en el espectrómetro de masas. Por esto, es necesario utilizar mezclas de sustancias definidas de las que puedan identificarse sustancias individuales con la ayuda de detección de masas. Por esta razón, las mezclas de sustancias que se han preparado a partir de síntesis combinatorias son particularmente adecuadas para este procedimiento de examen.

Las sustancias que se manifiestan en la selección por afinidad se someten a ensayos adicionales tales como el ensayo in vi tro de Eimeria. tenella. La invención se refiere también a nuevos compuestos activos que se identifican utilizando los procedimientos descritos anteriormente y que son adecuados para modular la exquistación de los esporozoitos a partir de esporocitos de Eimeria. Los nuevos compuestos activos modulan la exquistación en al menos 10%, preferiblemente en al menos 20%, de forma particularmente preferida en al menos 30%, y de forma muy particularmente preferida en al menos 50%. La invención se refiere también a nuevos compuestos activos que modulan la exquistación de esporozoitos a partir de esporocitos de Eimeria. Los nuevos compuestos activos modulan la exquistación en al menos 10%, preferiblemente en al menos 20%, de forma particnolarmente preferida en al menos 30%, y de forma muy particularmente preferida en al menos 50%.

La invención se refiere también al uso de nuevos compuestos activos, que se han identificado utilizando uno de los procedimientos anteriormente descritos, para producir un fármaco para el tratamiento profiláctico o terapéutico de aves de corral y, preferiblemente, de pollos que pueden estar infectados o se han infectado por Exmeri . Los fármacos de conformidad con la invención comprenden al menos uno de los compuestos activos identificados utilizando uno de los procedimientos descritos anteriormente, y pueden administrarse por vía nasal, dérmica, parenteral o entérica.

La invención se refiere también al uso de nuevos compuestos activos que modulan la exquistación de esporozoítos a partir de esporocitos de Eimeria en al menos 10%, preferiblemente en al menos 20%, de forma particularmente preferida en al menos 30%, y de forma muy particularmente preferible en al menos 50%, para producir un fármaco para el tratamiento profiláctico o terapéutico de la coccidiosis. Se da preferencia a utilizar los compuestos activos para producir un fármaco para tratar aves de corral y, de forma particularmente preferida, pollos, que pueden estar infectados o se han infectado por Eimeria. Los fármacos de conformidad con la invención comprenden al menos uno de los compuestos activos que se han identificado utilizando los procedimientos descritos anteriormente y pueden administrarse por vía nasal, dérmica, parenteral o entérica.

Composiciones farmacéuticas Los compuestos activos pueden utilizarse tanto profiláctica como terapéuticamente. Los compuestos activos se utilizan por vía entérica, parenteral, dérmica o nasal directamente o en forma de preparaciones adecuadas . Los compuestos activos se utilizan por vía entérica, por ejemplo, por vía oral, en forma de polvos, supositorios, comprimidos, cápsulas, pastas, bebidas, gránulos, brebaje, bolos, alimento medicado o agua de bebida. Se utilizan por vía dérmica, por ejemplo, en forma de inmersión, pulverización, baño, lavado, vertido dorsal y vertido en la cruz y espolvoreo. Se utilizan por vía parenteral, por ejemplo, en forma de inyección (intramuscular, subcutánea, intravenosa o intraperitoneal) o mediante implantes. Son preparaciones adecuadas: soluciones como soluciones de inyección, soluciones orales, concentrados para administración oral después de dilución, soluciones para uso sobre la piel o en cavidades corporales, formulaciones de vertido dorsal, geles; emulsiones y suspensiones para uso oral o dérmico y también para inyección; preparaciones semisólidas; formulaciones en las que el compuesto activo se procesa en una base de ungüento o en una base de emulsión de aceite en agua o agua en aceite; preparaciones sólidas tales como polvos, premezclas o concentrados, gránulos, aglomerados, comprimidos, bolos y cápsulas; aerosoles e inhalados y cuerpos moldeados que contienen compuesto activo.

Las soluciones de inyección se administran por vía intravenosa, intramuscular y subcutánea. Las soluciones de inyección se producen disolviendo el compuesto activo en un disolvente adecuado y, cuando sea apropiado, añadiendo aditivos tales como solubilizantes , ácidos, bases, sales tampón, antioxidantes y conservantes. Las soluciones se esterilizan mediante filtración y se embotellan. Son disolventes que pueden citarse: disolventes tolerados fisiológicamente tales como agua, alcoholes tales como etanol, butanol, alcohol bencílico y glicerol, hidrocarburos, propilenglicol , polietilenglicoles y N-metilpirrolidona, y también mezclas de los mismos. Los compuestos activos pueden disolverse también, cuando sea apropiado, en aceites vegetales o sintéticos fisiológicamente tolerados que son adecuados para inyección. Los solubilizantes que pueden citarse son: disolventes que promueven la disolución del compuesto activo en el disolvente principal o que evitan que precipite. Son ejemplos polivinilpirrolidona, aceite de ricino polietoxilado y ésteres de sorbitán polietoxilados . Son conservantes: alcohol bencílico, triclorobutanol , ésteres p-hidroxibenzoicos y n-butanol . Las soluciones orales se utilizan directamente. Los concentrados se utilizan por vía oral después de diluirse previamente a la concentración de uso. Las soluciones y concentrados orales se preparan como se describe anteriormente en el caso de soluciones de inyección, siendo posible dispensarlas con operaciones estériles. Las soluciones para uso sobre la piel se gotean, se extienden, se frotan, se rocían o se pulverizan o se aplican mediante inmersión, baño o lavado. Estas soluciones se preparan como se describe anteriormente en el caso de soluciones de inyección. Puede ser ventajoso añadir espesantes durante la preparación. Los espesantes son: espesantes inorgánicos tales como bentonitas, ácido silícico coloidal y monoestearato de aluminio, y espesantes orgánicos tales como derivados de celulosa, alcoholes polivinílicos y sus copolímeros, acrilatos y metacrilatos . Los geles se aplican, o se extienden, sobre la piel o se introducen en cavidades corporales. Los geles se preparan añadiendo suficiente espesante a soluciones que se han preparado como se describe anteriormente en el caso de soluciones de inyección, produciendo una masa transparente que tiene una consistencia de tipo ungüento. Los espesantes anteriormente citados se utilizan como espesantes. Las formulaciones de vertido dorsal se vierten, o se rocían, sobre regiones definidas de la piel, penetrando el compuesto activo por la piel y actuando sistémicamente o distribuyéndose sobre la superficie corporal. Las formulaciones de vertido dorsal se preparan disolviendo, suspendiendo o emulsionando el compuesto activo en disolventes o mezclas de disolventes dermotolerados adecuados. Se añaden otras sustancias auxiliares, tales como tintes, sustancias promotoras de la absorción, antioxidantes, agentes fotoestabilízantes y adhesivos, cuando sea apropiado.

Son disolventes que pueden citarse: agua, alcandés, glicoles, polietilenglicoles , poliproplenglicoles , glicerol, alcoholes aromáticos tales como alcohol bencílico, feniletanol y fenoxietanol , esteres tales como acetato de etilo, acetato de butilo y benzoato de bencilo, éteres tales como alquilenglicolalquiléteres, tales como dipropilenglicolmonometiléter y dietilenglicolmonobutiléter, cetonas tales como acetona y metiletilcetona, hidrocarburos aromáticos y/o alifáticos, aceites vegetales o sintéticos, DMF, dimetilacetamida, N-metilpirrolidona y 2-metil-4-oxometilen-1 , 3-dioxolano . Los tintes son cualquier tinte que esté autorizado para uso en animales y que pueda disolverse o suspenderse. Son ejemplos de sustancias promotoras de la absorción DMSO, aceites dispersables tales como miristato de isopropilo, pelargonato de dipropilenglicol, aceites de silicona, ésteres de ácidos grasos, triglicéridos y alcoholes grasos.

Son antioxidantes sulfitos o metabisulfitos tales como metabisulfito de potasio, ácido ascórbico, butilhidroxitolueno, butilhidroxianisol y tocoferol. Son ejemplos de agentes fotoestabilizantes sustancias de la clase de benzofenona o ácido novantisólico . Son ejemplos de adhesivos derivados de celulosa, derivados de almidón, poliacrilatos y polímeros naturales tales como alginatos y gelatina. Las emulsiones pueden utilizarse por vía oral, dérmica o como inyecciones. Las emulsiones son del tipo agua en aceite o de tipo aceite en agua. Se preparan disolviendo el compuesto activo en la fase hidrófoba o en la fase hidrófila y homogeneizando esta fase con el disolvente de la otra fase con ayuda de emulsionantes adecuados y, cuando sea apropiado, otras sustancias auxiliares tales como tintes, sustancias promotoras de la absorción, conservantes, antioxidantes, agentes fotoestabilizantes y sustancias aumentadoras de la viscosidad. Las fases hidrófobas (aceites) que pueden citarse son aceites de parafina, aceites de silicona, aceites vegetales naturales tales como aceite de sésamo, aceite de almendra y aceite de ricino, triglicéridos sintéticos tales como biglicérido caprílico/cáprico, mezcla de triglicéridos que contiene ácidos grasos de planta de longitud de cadena C8-12 u otros ácidos grasos naturales especialmente seleccionados, mezclas de glicéridos parciales de ácidos grasos saturados o insaturados, posiblemente que contienen también grupos hidroxilo, y monoglicéridos y diglicéridos de ácidos grasos C8/C10; esteres de ácidos grasos tales como estearato de etilo, adipato de di-n-butirilo, laurato de hexilo y pelargonato de dipropilenglicol , esteres de un ácido graso ramificado de longitud media de cadena con alcoholes grasos saturados de longitud de cadena C16-C18, miristato de isopropilo, palmitato de isopropilo, esteres de ácido caprilico/cáprico de alcoholes grasos saturados de longitud de cadena C12-C18, estearato de isopropilo, oleato de oleílo, oleato de decilo, oleato de etilo, lactato de etilo, esteres de ácidos grasos cerosos tales como ftalato de dibutilo y adipato de diisopropilo y mezclas de ésteres relacionadas con estos últimos, y también alcoholes grasos tales como alcohol isotridecílico, 2-octildodecanol , alcohol cetilestearílico y alcohol oleílico; ácidos grasos tales como ácido oleico y sus mezclas . Son fases hidrófilas que pueden citarse: agua y alcoholes tales como propilenglicol , glicerol y sorbitol y sus mezclas . Son emulsionantes que pueden citarse: tensioactivos no iónicos, por ejemplo, aceite de ricino polietoxilado, monooleato de sorbitán polietoxilado, monoestearato de sorbitán, monoestearato de glicerol, estearato de polioxietilo y alquilfenilpoliglicoléteres ,- tensioactivos anfolíticos tales como N-lauril- -iminodipropionato disódico o lecitina; tensioactivos aniónicos tales como la rilsulfato de sodio, étersulfatos de alcohol graso y sal de monoetanolamina de esteres de ácido mono/dialquilpoliglicoleterortofosfórico; tensioactivos catiónicos tales como cloruro de cetiltrimetilamonio . Otras sustancias auxiliares que pueden citarse son: sustancias que aumentan la viscosidad y estabilizan la emulsión tales como carboximetilcelulosa, metilcelulosa y otros derivados de celulosa y almidón, poliacrilatos, alginatos, gelatina, goma arábiga, polivinilpirrolidona, alcohol polivinílico , copolímeros compuestos por metilviniléter y anhídrido maleico, polietilenglicoles , ceras y ácido silícico coloidal, o mezclas de las sustancias enumeradas . Las suspensiones pueden utilizarse por vía oral o dérmica o en forma de una inyección. Se preparan suspendiendo el compuesto activo en un vehículo líquido, cuando sea apropiado con la presencia añadida de sustancias auxiliares adicionales tales como agentes humectantes, tintes, sustancias promotoras de la absorción, conservantes, antioxidantes y agentes fotoestabilizantes . Son líquidos vehiculantes que pueden citarse todos los disolventes y mezclas de disolventes homogéneos.

Son agentes humectantes (agentes dispersantes) que pueden citarse los tensioactivos anteriormente especificados.

Son otras sustancias auxiliares que pueden citarse las especificadas anteriormente. Las preparaciones semisólidas pueden administrarse por vía oral o dérmica. Difieren sólo de las suspensiones y emulsiones anteriormente descritas en su alta viscosidad. Para preparar preparaciones sólidas, se mezcla el compuesto activo con sustancias vehiculantes adecuadas, cuando sea apropiado con la presencia añadida de sustancias auxiliares, y se lleva a la forma deseada. Son sustancias vehiculantes que pueden citarse todas las sustancias inertes sólidas fisiológicamente toleradas. Estas sustancias inertes pueden ser sustancias inorgánicas o sustancias orgánicas. Son ejemplos de sustancias inorgánicas cloruro de sodio, carbonatos tales como carbonato de calcio e hidrogenocarbonatos, óxidos de aluminio, ácidos silícicos, tierras arcillosas, dióxido de silicio precipitado o coloidal y fosfatos. Son ejemplos de sustancias orgánicas azúcares, celulosa, alimentos y piensos tales como leche en polvo, harinas animales, harinas de cereales y harinas de maíz, de grano grueso, y almidones. Son sustancias auxiliares conservantes, antioxidantes y tintes que se han enumerado ya anteriormente . Son otras sustancias auxiliares adecuadas lubricantes y deslizantes tales como estearato de magnesio, ácido esteárico, talco, bentonitas, sustancias promotoras de la disgregación tales como almidón o polivinilpirrolidona reticulada, aglutinantes tales como almidón, gelatina o polivinilpirrolidona lineal, y también aglutinantes secos tales como celulosa microcristalina. Secuencias homologas La invención se refiere también a polinucleótidos y polipéptidos de organismos relacionados, siendo dichos polincucleótidos y polipéptidos homólogos con un ácido nucleico StOS22 y un polipéptido StOS22, respectivamente, y pudiendo aislarse fácilmente utilizando procedimientos que están disponibles en la técnica anterior. Estos procedimientos incluyen: PCR utilizando cebadores degenerados, examen de bibliotecas génicas con £?tOS22 como sonda a bajo rigor, y examen de bibliotecas de expresión con el anticuerpo monoclonal E2E5 (Sambrook y Russell, 2001) . La invención se refiere también a los agentes de diagnóstico descritos anteriormente, a procedimientos de diagnóstico, a vacunas, a procedimientos de examen y a agentes terapéuticos que están basados, de manera análoga y evidente para el experto, en polinucleótidos o polipéptidos homólogos . Definiciones Para mejorar la comprensión, se explicará con más detalle a continuación el significado de palabras y términos particulares que se utilizan en la descripción, los ejemplos y las reivindicaciones adjuntas. "Polinucleótido" o "polinucleótidos" ha de entenderse que significa ADW bicatenario y monocatenario y ARN bicatenario y monocatenario y ADNc que puede estar presente como la cadena de codificación o la cadena complementaria, oligonucleótidos, ??? interférente pequeño (ARNsi) , análogos de ácido nucleico tales como ácidos nucleicos peptídicos (PNA) , ácidos nucleicos bloqueados (LNA) , oligonucleótidos sin sentido que pueden sintetizarse, por ejemplo, mediante enlace covalente del extremo 5' de un nucleótido con el extremo 3' de otro nucleótido mediante enlaces no fosfodiéster, tales como alquilfosfonatos , fosforotioatos , fosforoditioatos, alquilfosfonotioatos , alquilfosfonatos, fosforamidatos , esteres fosfato, carbamatos, acetamidatos, esteres carboximetilo, carbonatos y triésteres fosfato. Los términos "homología", "identidad" y "similitud" se refieren a similitudes de secuencia entre dos péptidos o entre dos moléculas de ácido nucleico o polinucleótidos. La homología puede determinarse comparando una posición en una de las secuencias con la posición equivalente en la otra secuencia. Si una posición en la secuencia bajo comparación está ocupada por la misma base o aminoácido, las dos moléculas son homologas en esta posición. La extensión de la homología entre secuencias es una función del número de posiciones congruentes u homologas que las secuencias comparten entre sí. Una secuencia "no homologa" tiene una identidad de menos de 40%, preferiblemente sin embargo, de menos de 25% de identidad. Puede establecerse una homología o identidad, entre otros, utilizando programas informáticos tales como el programa GCG [Devereux et al. (1983), Nucleic Acids Res., 12, 387-395]. Existe también "homología" cuando un segmento polinucleotídico es capaz de hibridar con otro polinucleótido. Los términos "hibridar" o "hibridación" describen el proceso mediante el cual un polinucleótido monocatenario entra en apareamiento de bases con una cadena de ??? complementaria, dependiendo la capacidad de un polinucleótido monocatenario del rigor de las condiciones de hibridación. El término "rigor" se refiere a las condiciones de hibridación. Existe "alto rigor" cuando un apareamiento de bases se hace más difícil. Existe "bajo rigor" cuando se facilita un apareamiento de bases . Las condiciones de hibridación rigurosas son bien conocidas por el experto y se describen, por ejemplo, en Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2a ed., 1989, p g. 9.50-9.51. Para obtener condiciones de hibridación rigurosas, la combinación de temperatura y concentración salina debería elegirse típicamente de tal modo que sea aproximadamente 12-20°C por debajo de la temperatura de fusión calculada, Tm, del híbrido. El experto está familia izado con el hecho de que la Tm de un ADN bicatenario se reduce en 1-1, 5°C por cada 1% de reducción de la identidad [Bonner et al., J. Mol. Biol . 81, 123 (1973)] . La Tm de un híbrido compuesto por un polinucleótido que tiene la secuencia descrita en la SEC N° ID 1 ó 3 y un polinucleótido que es al menos 50%, preferiblemente 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% ó 97% idéntico a un polinucleótido que tiene la secuencia descrita en la SEC N° ID 1 ó 3 puede calcularse, por ejemplo, utilizando la ecuación de Bolton y McCarthy [Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 48, 1390 (1962)] : Tm= 81,5°C - 16,6 (log10 [Na+] ) + 0,41 (%G+C) - 0,63 (% formamida) - 600/1) en la que 1 = longitud del híbrido en pares de bases. Son condiciones de lavado rigurosas durante la hibridación, por ejemplo, 4 x SSC a 65°C o 50% de formamida, 4 x SSC a 42°C o 0,5 x SSC, 0,1% de SDS a 65 °C. Son condiciones de lavado altamente rigurosas, por ejemplo, 0,2 x SSC a 65°C. El término "plásmido" se refiere a un elemento genético extracromosómico . Los plásmidos originales que se utilizan en la presente invención pueden obtenerse comercialmente o están disponibles libremente, o pueden derivarse de dichos plásmidos utilizando procedimientos conocidos. El término "vector" describe un polinucleótido que se utiliza para introducir polinucleótidos exógenos en células huésped. Un vector contiene una secuencia nucleotídica que codifica uno o más polipéptidos . Los vectores que son capaces de controlar la expresión de los genes que contienen se denominan "vectores de expresión" . El término "modular" se refiere tanto a la estimulación como a la supresión o inhibición de un proceso bioquímico. En el contexto de la presente invención, "modular" o "modulación" significa inhibir, o una inhibición o supresión, de la actividad del polipéptido BtOS22, siendo dicha actividad importante para la exquistacion de los esporozoítos a partir de los esporocitos . Ejemplos Cepas bacterianas y vectores Cepas bacterianas TOP10 de E. coli, químicamente competente (Invitrogen, Groningen, Holanda) . F" mcrA ? (mrr-hsdRMS-mcrBC) 801acZAM15 AlacX74 recAl deoR a_raDl39 ? {ara-leu) 7697 galU ^ralK rpsL (StrR) endAl nupG.

TG1 de E. coli, electrocompetente (Stratagene, Heidelberg) . supE thi-1 t\{lac-proAB) ? [mcrB-hsdSM) 5 (rk"mk~) , [F' traD36 proAB laclqZAM15] . Vectores pG8SAET (Jacobsson y Frykberg, 1998; Zhang et al., 1999) . pCR2.1-T0P0 (Invitrogen, Groningen, Holanda) . pcDNA3.l/V5-His-T0P0 (Invitrogen, Groningen, Holanda).

Ejemplo 1 Aislamiento de ADN genómico de Eimeria tenella Se aisló el ADN utilizando un procedimiento modificado a partir del de Blin y Stafford (1976) . Se sedimentaron 1 x 108 oocitos esporulados a 3.000 rpm durante 10 min (Heraeus MULTIFUGE 3L_R) y se añadió un volumen de perlas de vidrio (ø 0,45-0,5 mm) correspondiente al del sedimento. Se abrieron por ruptura los oocitos y cubiertas de esporocitos agitando con un vórtex a velocidad máxima durante 2 min, y se comprobaron las cubiertas bajo el microscopio. Se añadieron después 5 mi de tampón de extracción (Tris-HCl 10 mM, pH 8,0, EDTA 0,1 M, pH 8,0, 0,5% de SDS, 20 ]xq de ARNasa A/ml) , se ajustó a una concentración de proteinasa K de 100 yg/ml, y se incubó la mezcla durante una noche a 56°C. Se extrajo el ADN dos veces con Roti-fenol (Roth, Karlsruhe) /cloroformo y una vez con cloroformo, después de lo cual precipitó con 2 vol . de etanol absoluto y 0,1 vol. de acetato de sodio 3 M, y se sedimentó mediante centrifugación a 13.000 rpm en un rotor Beckam JS13.1. Se lavó el sedimento dos veces con etanol al 70% y se secó al aire; se resuspendió después en H20 destilada (¾0d) , después de lo cual se estimó la concentración de ADN en un gel de agarosa con 1% de TBE comparando con 1 µg de ADN de ? digerido con EcoRI/HindIII (MBI Fermentas, St. Leon-Rot) .

Ejemplo 2 Aislamiento de ARN total a partir de Eimeria tenella y ciego de pollo Se aisló el ARN total a partir de 3 x 107 oocitos o 0,3 g de ciego de pollo utilizando el "Invisorb RNA kit II" (Invitek, Berlin-Buch) . Se llevaron a cabo todas las etapas de procedimiento utilizando material exento de ARNasa y soluciones tratadas con DPEC (pirocarbonato de dietilo) . Se desestabilizaron los oocitos con perlas de vidrio en 500 µ? de solución de lisis agitando con un vórtex, mientras el tejido intestinal se trituraba con un Ultraturrax en 2 mi de solución de lisis. Se utilizó el sobrenadante en cada caso para aislar el ARN, y todos las etapas de procedimientos adicionales estuvieron de acuerdo con las instrucciones del fabricante . Se determinó después fotométricamente el ARN total, disuelto en H20 con DEPC . Ejemplo 3 Preparación de ADN de plásmido Se preparó ADN de plásmido a partir de 3 mi estacionarios de cultivos de 50 mi de TG1 de E. coli o TOP10 de E. coli. Se utilizó una sola colonia para inocular medio LB en la presencia añadida de un antibiótico apropiado, y se incubó el cultivo con agitación a 280 rpm durante una noche a 37 °C. Se utilizó el kit de plásmido NucleoSpin (Macherey-Nagel, Duren) o el kit Plasmid Midi (Qiagen, Hilden) para aislar el plásmido. Se purificó el ADN de plásmido según las instrucciones del f bricante respectivo . Ejemplo 4 Determinación de la concentración de ácido nucleico Se determinó fotométricamente la concentración del ácido nucleico en un espectrofotómetro DU 640 (Beckmann, Múnich) . Se calcularon su concentración y pureza como se describe por Sambrook et al. (1989) . Se evaluaron los fragmentos de restricción que iban a utilizarse como sondas para transferencia Southern y Northern en gel de agarosa con 1% de TBE comparándolos con 1 pg de ADN de ? digerido con EcoRl/HindIII (MBI Fermentas, St . Leon-Rot) . Ejemplo 5 Restricción y separación electroforética de ADN Se restringió ADN con endonucleasas de restricción según las instrucciones del fabricante y en el tampón recomendado para la enzima referida. Como norma, la incubación fue durante 3 h a 37 °C. Se separaron electroforáticamente fragmentos de ADN mediante el procedimiento de Sambrook et al. (1989) en un cámara de lecho plano horizontal. Para hacer esto, se hizo uso de geles de agarosa al 0,6-2% que se vertieron utilizando tampón TBE o tampón TAE y en la presencia añadida de 0,5 pg de bromuro de etidio/ml. Se compararon después las moléculas de ADN, que se tiñeron con bromuro de etidio, en un transiluminador, con patrones de longitud de ADN que se hablan separado en paralelo. Se utilizó 1 de marcadores pUC-Mix para fragmentos <1 kb, mientras que se utilizó 1 µg de ADN de ? digerido con EcóRl/HindlII para fragmentos mayores (ambos de MBI Fermentas, St . Leon-Rot) . Ejemplo 6 Aislamiento de fragmentos de ADN a partir de geles de agrarosa Se aislaron fragmentos de ADN a partir de geles de agarosa utilizando agarasa (Roche Molecular Biochemicals , Mannheim) mediante digestión de agarosa de bajo punto de fusión (Biozym. Hess. Oldendorf) que se había vertido, como gel de ventana, en un gel de agarosa TAE del mismo porcentaje, o utilizando el kit Nucleospin Extract 2 in 1 (Macherey-Nagel , Duren) . En ambos casos, el fragmento deseado se escindió con luz UV de onda larga y se aisló según las instrucciones del fab icante. Para determinar la concentración de ADN, se separó después 1/10 del volumen de muestra en un gel control y se estimó mediante comparación con el patrón de longitud de ADN. Ejemplo 7 Transformación química de E. coli Se transformaron TOP10 de E. coli químicamente competentes (Invitrogen, Groningen, Holanda) con plásmidos recombinantes según las instrucciones del fabricante . Después de sembrar las células transformadas en agar de selección, e incubar durante una noche a 37 °C, pudieron aislarse transformantes y analizarse mediante digestión de restricción. Ejemplo 8 Construcción de una biblioteca de expresión genómica de Eimeria tenella. a) Fragmentación de ADN genómico y reacción de extremo romo Se fragmentaron 25 pg de ADN genómico de Eimeria tenella en un volumen de 4 mi utilizando un Sonotrode MS73 a 40% de carga de trabajo del instrumento durante 10 x 30 s, y enfriando en baño de agua enfriado con hielo. Se precipitaron después estos fragmentos, que eran de entre 100 y 800 pb de tamaño, se resuspendieron en 60 µ? de ¾Od y se separaron en un gel de agarosa al 1,2% que poseía una ventana de agarosa de bajo punto de fusión del mismo porcentaje, y que no contenía bromuro de etidio. Se purificaron los fragmentos, que se aislaron mediante digestión con agarasa, mediante columnas S-400 HR icrospin (Amersham Pharmacia Biotech, Friburgo) según las instrucciones del fabricante. Se preparó la siguiente mezcla de reacción para la reacción de extremo romo: 75 µ? de fragmentos de ADN purificado, mezcla de d TP 1 mM, 10 U de ADN polimerasa AccuTherm (GeneCraft, Münster) y 1 x tampón AccuTherm, completado hasta 100 µ? con H2Od. Se incubó esta mezcla de reacción a 72 °C durante 30 min, después de lo cual se extrajo con fenol/cloroformo y se resuspendieron los fragmentos en 100 µ? de H20d. Se separaron 2 µ? de esta suspensión en un gel de ensayo con el fin de evaluar la concentración. b) Desfosforilación de pG8SAET Se incubaron 20 de pG8SAET con 40 U de SnáBI (Promega, Heidelberg) a 37 °C durante 3 h. Después de eso, se añadieron 4 U de fosfatase alcalina de camarón (USB, Bad Homburg) a la mezcla de restricción y se incubó todo a 37 °C durante una noche. Después de 10 min de inactivación térmica a 65° C, se aisló el vector linealizado y desfosforilado a partir de un gel de ventana de agarosa de bajo punto de fusión al 0,8% mediante digestión con agarasa. c) Ligamiento de ADN Se utilizaron 300 U de ADN ligasa T4 HC (MBI Fermentas, St . Leon-Rot) para ligar 8 de fragmentos de ADN genómico y 5 g de pG8SAET linealizado y desfosforilado a 16°C durante 48 h en un volumen total de 100 µ? . Después de eso, se inactivo térmicamente la ligasa a 65 °C durante 10 min y se precipitaron las moléculas de vector recombinante añadiendo 20 de glicógeno. Se resuspendió el sedimento en 100 µ? de H2Od, y se utilizaron 1,5 µ? de dicha suspensión para cada electrotransformación . d) Electrotransformación de E. coli Se electrotransformaron en cada caso volúmenes de 50 µ? de TG1 de E. coli con 1,5 µ? de mezcla de ligamiento en cubetas de electroporación de 0,1 cm (BIO-RAD, Munich) y a un intensidad de campo de 17 kV/cm a 200 O y 25 \iF en un Gene Pulser (BIO-RAD, Munich) según las instrucciones del fabricante . Se determinó el número de transformantes y se almacenaron las células recombinantes a -80 °C en forma de soluciones madre de glicerol . Se construyó una biblioteca de ADN genómico representativa del parásito en el vector fagémido pG8SAET. Esta biblioteca comprende 4,7 x 10s clones independientes (95% recombinantes) que tienen un tamaño de inserto medio de 450 pb, proporcionando esto una representación de 7,3 veces del genoma de Eímeria tenella. Ej emplo 9 Exposición en fago y inmunoabsorcion en fase sólida a) Preparación y purificación de fagemidos recombinantes Se inocularon 200 µ? de las soluciones madre de glicerol en 20 mi de medio LB que contiene ampicilina (50 g/ml) y se incubó el cultivo durante una noche a 37°C y 280 rpm. Se utilizó después 1 mi de este cultivo para inocular 100 mi de medio LB que contiene ampicilina, estando incubado este cultivo hasta D06oo= 0/5 e infectado después con 500 µ? (1 x lO11 ufp) de fagos auxiliares R408 (Promega, Heidelberg) . Después de incubación renovada a 37°C y 280 rpm durante una noche, se sedimentaron las células a 5.000 rpm durante 10 min y se esterilizó el sobrenadante mediante filtración; se concentraron después los fagémidos utilizando concentradores Vivaspin 20 (Sartorius AG, Gotinga) según las instrucciones del fabricante. b) Recubrimiento de DYNABEADS Se utilizó un sobrenadante de cultivo de hibridoma del anticuerpo monoclonal (mAb) E2E5 (Mouafo efc al., 2002) , que se había concentrado 50 veces mediante ultrafiltración (corte de PM 100 kDa) para recubrir DYNABEADS Pan Mouse IgG (Deutsche Dynal GmbH, Hamburgo) . Se utilizaron 20 pg de proteina total concentrada, que tenía un contenido de aproximadamente 5% de mAb E2E5, por mg de DYNABEADS y se incubó la mezcla con rotación durante una noche a 4°C. Se retiraron las proteínas e inmunoglobulinas no unidas lavando 3 veces con PBS (8 g de NaCl; 0,2 g de KCl; 1 g de Na2HP04 x 2 H20; 0,15 g de Na¾P04 x ¾0; 0,2 g de KH2P04, pH 7,4, completado a 1 1 con H2O)/0,l% de BSA, y se utilizaron las DYNABEADS después en la reacción de unión. c) Reacción de unión, etapas de lavado y elución En la reacción de unión, se incubaron 50 µ? (2 x 107) de DYNABEADS, con o sin mAb E2E5 sobre la superficie durante una noche a 4°C y con rotación, con 200 µ? de concentrado de fagémido en un volumen de 400 µ? en PBS/0,1% de BSA. Después de lavar las DYNABEADS 10 veces, se desecharon los fagémidos de unión débil después de una incubación rotatoria de 15 min en 400 µ? de tampón de elución (citrato de sodio 50 mM, NaCl 150 m , H 4,5), se trataron los fagos que eluyeron en tampón de elución a pH 1,8 con 40 µ? de tampón de neutralización (Tris-HCl 2 M, pH 8,6) y se utilizaron para determinar la valoración y reinfección. d) Determinación de la valoración y reinfección Se utilizó cada eluido para reinfectar 10 mi de TG1 de E. coli, que estaban en la fase de crecimiento logarítmico. Después de incubar a 37°C y 40 rpm durante 0,5 h, se sedimentaron las células y después se resuspendieron en 400 µ? de medio LB que contiene ampicilina; se sembraron después en placas de agar LB que contiene ampicilina para la determinación de la valoración y/o para amplificación. Para una ronda adicional de inmunoabsorción en fase sólida, se aclararon estas placas después de 18 h con medio LB que contiene ampicilina y se infectaron las bacterias, en un cultivo de 50 mi, con 100 µ? de fagos auxiliares R408. Después de incubación a 37°C y 280 rpm durante una noche, se concentraron los fagémidos como ha descrito y se utilizaron para nuevas reacciones de unión. e) Detección de clones que expresan mareajes E Con el fin de aislar clones que expresan el mareaje E, se sembraron aproximadamente 100 unidades formadoras de colonia (ufe) , después de varias rondas de inmunoabsorción en fase sólida, sobre placas de agar que contienen ampicilina, y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa (Schleicher y Schuell, Dassel) . Se lisan las células adheridas a la membrana durante una noche en 6 mi de tampón de lisis (Tris-HCl 100 mM , pH 7,8, NaCl 150 mM, MgCl2 5 mM, 1,5% de BSA, 1 de ADNasa I/ml, 40 µ? de lisozima/ml) , después de lo cual se retiran los residuos celulares lavando 3 veces con PBS/0,05% de Tween-20 y se saturan los sitios de unión no especifica en la membrana bloqueando durante 1 h con 1 x solución RotiBlock (Roth, Karlsruhe) . Se incubó después la membrana a temperatura ambiente (22 °C) durante 2 h con el anticuerpo primario de ratón antimarcaje E (Amersham Pharmacia, Friburgo) , que se diluyó 1:500 en 1 x RotiBlock. Los anticuerpos no unidos se retiraron mediante lavado 3 veces durante 0,5 h. Se utilizó una IgG de cabra anti-ratón acoplada a fosfatasa alcalina (FA) , en dilución 1:2000, como anticuerpo secundario. Después de 3 etapas de lavado adicionales, se equilibró la membrana durante 2 min en tampón de detección (Tris-HCl 100 mM, pH 9,5, NaCl 100 mM) y se detectaron los anticuerpos secundarios unidos generando quimiolumini scencia con ayuda de CDP Star (Roche Molecular Biochemical s , Mannheim) , que se diluyó 1:100 en tampón de detección. La exposición fue durante 2-10 min a 22 °C, en ECL Hyperfilm (Amersham Pharmacia, Friburgo) . f) Inmunoabsorción en fase sólida comparada con enriquecimiento de mAb E2E5 de clones de unión específica Se unió el anticuerpo monoclonal (mAb) E2E5 a la superficie de DYNABEADS Pan Mouse IgG y se utilizó en la inmunoabsorción en fase sólida. Se utilizaron DYNABEADS Pan Mouse IgG sin anticuerpo adicional como control negativo. Después de 3 rondas de phage panning, se enriquecieron los clones de unión 362 veces en comparación con el control negativo. Se analizaron aquellos clones que expresan el mareaje E con el mAb E2E5 en transferencias Western. De los 62 clones que expresan mareaje E que se aislaron, 6 (A14, A17, A45-A47 y A62) se reconocieron por el mAb E2E5 en transferencias Western. Todas las proteínas de fusión que se detectaron exhibieron el mismo comportamiento de migración en SDS-PAGE, con un peso molecular de aproximadamente 14 kDa. Estas proteínas de fusión estaban compuestas por 125 aa, 48 aa de los cuales podían atribuirse al inserto "Al7" clonado dentro . Ejemplo 10 Reacción en cadena con polimerasa (PCR) Se llevaron a cabo todas las PCR en un PTC-200 Gradient Cycler o PTC-150 MiniCycler de MJ Research (Biozym, Hess.

Oldendorf) . Oligonucleótidos sintéticos (cebadores) Se sintetizaron todos los cebadores de PCR mediante MWG Biotec (Ebersbach) .

A) TI-PCR La TI-PCR comprende la transcripción inversa del ARN total seguido de PCR con el fin de amplificar secuencias de ADN utilizando cebadores específicos de secuencia. La composición de la mezcla de reacción para la TI fue la siguiente, en un volumen total de 50 µ?: 3,5 µg de ARN total, 80 U de inhibidor de la ribonucleasa ARNasina (Promega, Heidelberg) , mezcla de d TP 0,4 mM, 50 U de transcriptasa inversa AMV, 1 x tampón AMV (todos de Roche Molecular Biochemicals, Mannheim) , DTT 5 mM y 2,5 µ? de cebadores hexaméricos aleatorios como moléculas para iniciar la síntesis de ADNc. Una incubación a 22 °C durante 10 min fue seguida por la síntesis del ADNc a 42 °C y 55 °C durante, en cada caso, 30 min. Se inactivo térmicamente la enzima a 95 °C durante 5 min. Para la transcripción inversa, se llevaron a cabo dos reacciones adicionales, concretamente sin transcriptasa inversa y sin molde de ARN respectivamente, como controles negativos. Se utilizó 1/10 del volumen de las reacciones de transcriptasa inversa, en un volumen total de 50 µ?, como molde para la PCR siguiente. Se utilizaron los siguientes sistemas PCR, utilizando en cada caso 0,4 µ? de los dos cebadores específicos de secuencia, según las instrucciones del fabricante: "Triple Master PCR system" (Eppendorf) , "Platinum Pfx DNA Polymerase" (Invitrogen, Groningen, Holanda) y ("High Fidelity PCR system" (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim) . La desnaturalización inicial a 94 °C durante 2 min fue seguida por 35 ciclos compuestos por 15 s de desnaturalización a 94°C, 30 s de asociación a 63 °C y 2 min de extensión de cadena a 72 °C. Una elongación terminal a 72 °C durante 10 min completó la reacción. Se fraccionó 1/5 del volumen de esta reacción, con fines de control, en un gel de agarosa TBE del porcentaje apropiado, b) PCR-RACE 5' y 3/ Se empleó ARN total de oocitos de Eimeria tenella esporulados como material de partida para la PCR-RACE 5' y 3', que se llevó a cabo utilizando el "5'/3' RACE kit" (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim) . La síntesis de ADNc, la reacción de cola (sólo en el caso de RACE 5') y la amplificación del ADNc utilizando cebadores específicos de secuencia, se llevaron a cabo según las instrucciones del fabricante. Esto fue seguido por una, en el caso de RACE 5', y dos, en el caso de RACE 3', PCR anidadas adicionales para aumentar la amplificación de los extremos 5' y 3'. Se utilizaron A17-max-631-lo (síntesis de ADNc) , A17-max-533-lo (amplificación del ADNc con cola dA) y A17-112-lo (PCR anidada) como cebadores específicos de secuencia en la RACE 5', mientras que se utilizaron A17-max-90-up (amplificación de ADNc), Al7-max-150-up (Ia PCR anidada) y A17-22-up (2a PCR anidada) como dichos cebadores en la RACE 3 ' . Los productos de PCR-RACE, que se separaron en un gel de agarosa al 2%, se transfirieron, utilizando el procedimiento de - Chomczynski (1992) a una membrana de nailon Hybond-N neutra (Amersham Pharmacia, Biotech, Friburgo) , hibridaron con una sonda marcada radiactivamente y se utilizaron después para exponer a películas de rayos X Kodak Biomax MS . Los productos específicos de PCR-RACE que se identificaron de este modo se clonaron, aislaron y secuenciaron. Ejemplo 11 Clonación de productos de PCR Se utilizaron el kit de clonación TOPO TA y el kit de expresión TOPO TA pcDNA3. l/V5-His (Invitrogen, Groningen, Holanda) para clonar productos de PCR. Se aislaron los productos de PCR de geles de agarosa utilizando el kit NucleoSpin Extract 2 in 1 (Macherey-Nagel , Düren) y se incubaron después, a 72 °C durante 0,5 h, con 5 U de ADN polimerasa Taq (Promega, Heidelberg) , 1 x tampón ADN polimerasa Taq y mezcla de dNTP 0,4 mM. Se purificaron los productos de PCR, que se adenilaron en el extremo 3' mediante la actividad transferasa terminal de ADN polimerasa Taq, una segunda vez utilizando el kit NucleoSPin Extract 2 in 1 y se utilizaron después en la clonación TOPO TA según las instrucciones del fabricante. Ejemplo 12 Análisis de secuencia de ADN Se secuenció no radiactivamente ADN clonado según el procedimiento de terminación de cadena de Sanger et al. (1977) y utilizando un secuencíador automatizado de ADN LICOR 4000 suministrado por MWG Bíotech (Ebersbach) . Se llevó a cabo la secuenciación utilizando cebadores acoplados a 5'-IRD-800 para el vector pG8SAET (MWG Biotech, Ebersberg) y utilizando cebadores patrón acoplados a 5' -IRD-800 (LI-COR Bioscience, Bad Homburg) . Cebadores acoplados a 5' -IRD-800 a) Secuenciación utilizando Thermo sequenase Se utilizaron el kit de secuenciación cíclica de cebadores Thermo sequenase (Amersham Pharmacia Biotech, Friburgo) , y cebador acoplado al tinte fluorescente infrarrojo I D-800 (MWG Biotech, Ebersbach) para la reacción de secuenciación. Se mezclaron para cada reacción 1,5 µg de ADN de plásmido y 2-4 µ? de cebador acoplado a 5' -IRD-800 (1 pmol/µ?) en un volumen total de 13 µ?, y se añadieron en cada caso 3 µ? de esta mezcla a 3 µ? en cada caso de la respectiva mezcla de nucleótidos A, C, G o T, recubriéndose estas mezclas en cada caso con 10 µ? de aceite mineral. La reacción i de secuenciación tuvo lugar después en un ciclador térmico PTC 100 (MJ Research, Biozym, Hess. Oldendorf) . En la reacción, una desnaturalización de 2 min a 94 °C fue seguida por 30 ciclos de desnaturalización (9 °C durante 30 s) , asociación (55°C durante 30 s) y síntesis de cadena (72°C durante 1,5 min) . Se detuvieron las reacciones añadiendo 6 µ? de tampón de carga de formamida . Inmediatamente antes de cargar la reacción de secuenciación en el gel de secuenciación, se desnaturalizaron las muestras de reacción a 72 °C durante 3 min e, inmediatamente después de eso, se almacenaron en hielo protegiéndose de la luz . Se separaron los fragmentos de terminación de cadena marcado fluorescentemente en tampón 1 x TBE y a 1500 V y 50°C en geles de 40 cm de longitud, 0,25 mm de grosor al 6% compuestos por poliacrilamida modificada (Ultra Puré Seguagel XR, National Diagnostics, Atlanta, EE.UU.) que contenía urea 8 M y se detectaron, en tiempo real, utilizando una unidad fotomultiplicadora láser. Se analizaron las secuencias utilizando la base de software LI-CO ImagIR 4.0 (MWG Biotech, Ebersbach) . b) Análisis informático de los datos de secuencia Se procesaron en primer lugar los datos obtenidos mediante el análisis de secuencia utilizando los programas Molecular BioComputing Suite (Muller et al., 2001) y Sequences 3.0, y se determinaron las secuencias proteicas deducidas. Se utilizaron los programas BLAST (Altschul et al., 1990) y omniBLAST para las búsquedas de base de datos, es decir, la comparación con secuencias ya conocidas en las bases de datos EMBL y SwisProt o en los datos del proyecto de genoma de Eimeria tenella (www . sanger . ac . uk/Proj ects/E tenella/) . Se alinearon dos o más secuencias de ADN o de proteina utilizando las secuencias de los programas BLAST 2 (www. ncbi . nlm. ih. gov) (Tatusova y Madden, 1999), CLUSTALW (www.ebi.ac.uk) (Thompson et al., 1994) y DIALIGN (Morgenstern et al., 1998, 1999) . Además, se utilizaron los programas SignalP (www . cbs . dtu . dk/services/SignalP/) (Nielsen et al., 1997) y Clone Manager 5 par identificar péptidos señal y, respectivamente, planear clonaciones y restricciones y para buscar marcos de lectura abiertos. Ejemplo 13 Preparación de extractos proteicos a partir de E. coli Se sedimentaron 2 mi de TG1 de E. coli a partir de un cultivo estacionario de una noche, se lavaron 1 x con ¾0d y se resuspendieron en 300 µ? de ¾0d. Se añadieron 100 µ? de 4 x tampón RotiLoad (Roth, Karlsruhe) y se desnaturalizó la muestra durante 5 min en agua a ebullición. Se fragmentó después el ADN genómico en la mezcla mediante un corto tratamiento ultrasónico, y se cargaron en cada caso 10 µ? de esta muestra en un gel de poliacrilamida SDS. Ej emplo 14 Separación electroforática de proteínas en geles de poliacrilamida y transferencia Western a) SDS-PAGE Se utilizó el procedimiento de Lámmli (1970) para separar extractos proteicos en condiciones desnaturalizantes en geles de poliacrilamida discontinuos. Se utilizó el aparato de celda de electroforesis Mini -PROTEAN II (BIO-RAD, Munich) con este fin. En este sistema, el tamaño de gel es de 8 x 10 cm. Se utilizaron geles separadores que contenían 15% de poliacrilamida. La concentración de los geles de apilamiento era uniformemente 4,5% de poliacrilamida. La separación tuvo lugar a 40 mA durante aprox. 2-2,5 h. Se utilizaron 5 µ? de la mezcla marcadora de peso molecular con SDS preteñida (Sigma, Deisenhofen) como patrón de peso molecular. b) Transferencia de proteína a membrana de nitrocelulosa transfirieron las proteínas que se separaron en SDS PAGE a membranas de nitrocelulosa Protran BA 85 (Schleicher y Schuell, Dassel) utilizando el procedimiento semiseco (Khyse-Anderson, 1984) . Este procedimiento utiliza un sistema tampón continuo (Lihme y Schafer-Nielsen, 1986) en el que sólo las capas de papel Whatman (Whatman Ltd., Maidstone, Inglaterra), que se empaparon en tampón de transferencia entre dos placas de grafito (Biometra Fast Blot, Gotinga) , sirvieron como depósito de tampón. Se generó un campo eléctrico homogéneo entre estas placas de grafito, en el que se transfirieron las proteínas, a una intensidad de corriente de 60 mA y durante 2 h, desde el gel de SDS-poliacrilamida a la membrana de nitrocelulosa. Para comprobar la transferencia, se tiñó reversiblemente la membrana de nitrocelulosa, después de la transferencia, con Ponceau S (0,2% de Ponceau S en 3% de ácido tricloroacético) y después se destiñó una vez de nuevo utilizando H20d. c) Inmunodetección Se enrolló la membrana de nitrocelulosa dentro de un tubo de centrífuga de 50 mi (Falcon, Becton Dickinson, Sunnyvale, CA, EE.UU.) y se incubó durante 1 h y con rotación con 10 mi de 1 x solución RotiBlock (Roth, Karlsruhe) para saturar los sitios de unión no específica. Después de esto, se reemplazó esta solución de bloqueo por 50 µ? de sobrenadante de cultivo de hibridoma concentrado 50 veces del anticuerpo monoclonal E2E5 (anticuerpo primario) en 10 mi de 1 x solución de RotiBlock. Después de incubar a 22 °C durante 2 horas, se lavó la membrana 3 x durante un total de 0,5 h con PBS/0,05% de Tween-20 para retirar el exceso no unido de anticuerpo primario . Se añadió el anticuerpo secundario después durante 1 h, concretamente IgG de cabra anti-ratón que estaba acoplado con peroxidasa de rábano picante (HRP) (Jackson Immuno Research Laboratories, West Grove, EE.UU.) y que estaba diluido 1:4000 en 10 mi de 1 x solución RotiBlock. Se lavó después la membrana otra vez 3 x durante un total de 0,5 h con PBS/0,05% de Tween-20. Se detectaron ahora los anticuerpos unidos utilizando el sistema de detección de transferencia ECL Western (Amersham Pharmacia, Friburgo) para generar quimioluminiscencia siguiendo el procedimiento de Roswell y White (1978) . Para esto, se mezclaron volúmenes iguales de los reactivos de detección 1 y 2 y se añadieron a la membrana (0,125 ml/cm2) . Después de 1 min, se retiró el líquido y se aclaró la membrana 1 x brevemente con PBS/0,05% de Tween-20; se depositó después, libre de burbujas de aire, entre dos películas de transparencia vertical. Se efectuó la exposición durante 2-5 min a 22 °C en ECL Hyperfilm (Amersham Pharmacia. Friburgo) . Ejemplo 15 Mareaje radiactivo de ADN El mareaje radiactivo de ADN dependía del tamaño de las sondas que se emplearan. Se marcaron los fragmentos de ADN >800 pb mediante cebado aleatorio con [a P]dCTP, siguiendo el procedimiento de Feinberg y Vogelstein (1984) . Se utilizó el kit de mareaje Megaprime DNA (Amersham Pharmacia Biotech, Friburgo) según las instrucciones del fabricante para esta reacción de mareaje. Se utilizaron 40 ng de ADN y 50 µ?? de [a32P]dCTP (10 µ??/µ?, actividad esp. > 3.000 Ci/mmol) para ensayo . Se marcaron radiactivamente fragmentos muy pequeños de ADN, tales como oligonucleótidos , con [?32?]???. En esta reacción, la polinucleótido quinasa T4 (MBI Fermentas, St. Leon-Rot) cataliza la transferencia del [?32?]??? al grupo 5 'OH del ADN. Se utilizaron 20 ng de oligonucleótidos y 100 µ?? de [?32?]??? (10 µ??/µ?, actividad esp. >4.500 Ci/mmol). Al final de la reacción de mareaje, se separaron los nucleótidos no incorporados utilizando el kit NucleoSpin 2 in 1 (Macherey-Nagel , Duren) . El ADN que se había marcado y purificado de esta manera se desnaturalizó durante 10 min antes de utilizarse para la hibridación. Ejemplo 16 Transferencia Southern: transferencia de ADN a membranas e hibridación Se utilizó esta técnica para transferir tanto productos de PCR como ADN genómico a una membrana de nailon Hybond-N (Amersham Pharmacia Biotech, Friburgo) . El ADN genómico se había digerido anteriormente con una variedad de endonucleasas de restricción (10 por ensayo de restricción) y se separó durante una noche a 20 mV en un gel de agarosa al 0,6% de 14 cm de longitud. Se llevó a cabo la transferencia, según el procedimiento de Chomczynski (1992) , mediante transferencia capilar dirigida hacia abajo en tampón de transferencia alcalino (NaCl 3 M, NaOH 8 mM, pH 11,40-11,45) durante 2 h o durante una noche. Antes de la transferencia, se desnaturalizó el ADN en el gel en NaCl 1,5 M, NaOH 0,5 M durante 1 h, y después se incubó en tampón de transferencia durante 10 min. Después de tener lugar la transferencia, se neutralizó la membrana con tampón fosfato de sodio 0,2 M (pH 6,8) durante 15 min y después se calentó a 80 °C durante 20 imn. Se utilizó entonces el ADN de la membrana para hibridación con sondas marcadas radiactivamente. Sin embargo, la membrana se incubó en primer lugar a 60 °C durante 3 h en solución de prehibridación. Se reemplazó esta solución por la solución de hibridación. Después de añadir la sonda marcada radiactivamente, tuvo lugar entonces la hibridación durante una noche a 60 °C. Se utilizó una solución madre de 20 x SSC (NaCl 3 M, citrato de sodio 0,3 M, pH 7,0 en H20) para el tampón de lavado. Se lavó la membrana consecutivamente en 2 x SSC, 0,1% de SDS durante 30 min y 1 x SSC, 0,1% de SDS durante 30 min a 2 h. Se expuso la membrana a películas de rayos X Kodak Biomax MS a -80 °C utilizando una pantalla intensificadora .

Ejemplo 17 Electroforesis de ADN y transferencia Northern Se llevaron a cabo todas las etapas de procedimiento para someter a electroforesis a AR en condiciones exentas de ARNasa utilizando tampones que se habían tratado con DEPC al 0,1% y después se habían sometido a autoclave. Se desnaturalizó el ARN con glioxal y DMSO, y después se separó por electroforesis, como se describe en Sambrook et al. (1989). Se añadieron 5,4 µ? de glioxal 6 M desionizado, 16,0 µ? de DMSO y 3 µ? de tampón fosfato de sodio 0 , 1 M (pH 7,0) a 20 ]iq de ARN, que estaba en un volumen de 5,4 µ?, y se incubó todo a 50 °C durante 1 h. Después de eso, se añadieron 6 µ? de tampón de carga de gel de glioxal (fosfato de sodio 10 mM, pH 7,0; 50% de glicerol, 0,25% de azul de bromofenol) sobre hielo. Se efectuó la separación a 3-4 V/cm en un gel de agarosa al 1,2% en tampón fosfato de sodio 10 mM (pH 7,0) . Se transfirió el ARN a una membrana de nailon Hybond-N neutra (Amersham Pharmacia Biotech, Friburgo) utilizando una técnica de transferencia capilar dirigida hacia abajo y empleando un tampón de transferencia alcalino (NaCl 3 M, NaOH 8 M, pH 11,40-11,45) . (Chomczynski , 1992) . Se neutralizó la membrana con tampón fosfato de sodio 0,2 M (pH 6,8) durante 15 min y finalmente se calentó a 80 °C durante 20 min. Con el fin de evaluar el tamaño, se glioxilaron 10 ]ig de ADN de ? digerido con EcoRl/HindIII (MBI Fermentas, St. Leon-Rot) y se separaron en paralelo con el ARN. Después de la electroforesis , se separaron los carriles que contenían ADN de ? del resto del gel, se lavaron con NaOH 50 mM durante 20 min para retirar el glioxal, se neutralizaron con tampón fosfato de sodio 50 mM (pH 7,0) durante 15 min y finalmente se tiñeron con 0,5 µg de bromuro de etidio/ml en el mismo tampón. Se llevó a cabo la hibridación como se describe para la transferencia Southern, pero en condiciones más rigurosas, concretamente a 65°C y utilizando 0,1 x SSC, 0,1% de SDS como segundo tampón de lavado . Ejemplo 18 Secuencxación de ADNc de EtOS22 Se analizaron los clones de fago cuyas proteínas de fusión se reconocieron por el mAb E2E5 en la transferencia Western mediante secuenciación de ADN. Basándose en esta secuencia conocida (sombreada en gris oscuro) , se utilizaron RACE-PC 5' y 3' para amplificar el extremo 3' de este gen y la mayoría del extremo 5' , utilizándose la RACE 5' para extender el extremo 5' en 224 pb. Aunque el marco de lectura permaneció continuo, faltaba el codón de inicio (ATG) con el que empieza el marco de lectura abierto (ORF) . Para utilizar TI-PCR para amplificar el ORF completo de este gen, se construyeron dos nuevos cebadores basándose en los datos del proyecto genómico de Eimeria tenella: A17-f-length-64-up y A17-f-length-1176-lo, que se subrayan en la secuencia, dando lugar a un producto PCR de 1106 pb. De este modo, se amplificó el marco de lectura abierto completo. Los cebadores hibridaron en 5'-UTR y 3'-UTR, respectivamente, del ADNc. Existe un codón de paro cadena arriba entre el cebador 5' y el codón de inicio ATG, asegurando éste que el producto PCR contiene el marco de lectura abierto completo. El ADNc de EtOS22 posee un ORF de 594 pb, o 198 aa, y termina en la posición 677 con un codón de paro TAA. El 3'-UTR abarca 506 pb. La Fig. proporciona la secuencia completa del ADNc de StOS22; sin embargo, la longitud de 5'~UTR no se ha determinado todavía . E emplo 19 Caracterización de EtOS22 El programa SignalP VI .1 (Nielsen et al., 1997) identifica un péptido señal de 18 aa (sombreado en gris pálido en la secuencia) en el extremo N-terminal de la proteína. El sitio de escisión entre el péptido señal y la proteína madura se encuentra probablemente entre las posiciones 18 y 19 (AVA-AD) . En consecuencia, el tamaño de la proteína madura es de 180 aa. Esto proporciona un peso molecular teórico de 21.039,7 Da sin el péptido señal o de 22.830,9 Da con el péptido señal. Es una característica notable la frecuencia de los aa particulares en la proteína precursora (o en la proteína madura) : histidina (H) 23,2% (25,6%), prolina (P) 17,2% (18,9%), alanina (A) 8,6% (6,7%) y glutamina (Q) 7,6% (8,3%). La histidina y prolina juntas constituyen más de un 40% de todos los aminoácidos en la protein . Ejemplo 20 Expresión de EtOS22 en Eimeria tenella Se llevaron a cabo TI-PCR y transferencias Northern utilizando cebadores específicos de secuencia y sondas marcadas radiactivamente, respectivamente, con el fin de analizar el patrón de expresión de EtOS22 en Eimeria tenella mediante la detección del correspondiente transcripto. Se utilizó ADNc de cuatro fases de parásito diferentes para la TI-PCR: de oocitos esporulados y de fases intracelulares a 72 h, 137 h y 148 h después de la infección del pollo, estando aislado el ARN total de estas fases a partir de ciegos de pollo infectado. Los productos de PCR-TI se amplificaron exitosamente 137 y 148 h después de la infección (gamogonia) y en la fase de oocito, pero no 72 h después de la infección (esquizogonia) . En consecuencia, el gen sigue sin transcribirse 72 h después de la infección; por otro lado, la transcripción tiene lugar no después de 137 h después de la infección y en adelante, y sigue teniendo lugar en los oocitos esporulados (Fig. 2) . La transferencia Northern mostró que había un pico muy marcado de expresión a 137 h después de la infección. Cuando se utilizó este procedimiento, apenas fue posible o ya no fue posible detectar el transcripto de ARNm de StOS22 después de 148 h y en los oocitos (Fig. 3) . Además de esto, la transferencia Northern indicó que el tamaño del transcripto de ARNm completo era de aproximadamente 1,1 kb. Esto se ajusta muy bien al tamaño del ADNc clonado . Ejemplo 21 Localización de la proteína de oocito esporocítico (EtOS22) en Eimeria tenella a) Inmunofluorescencia Se sedimentaron 3 x 107 oocitos esporulados a 14.000 rpm durante 2 min y se lavaron 1 x con PBS; se agitaron después vigorosamente durante 2 min utilizando un vórtex con un volumen de perlas de vidrio (ø 0,45-0,5 mra) correspondiente al del sedimento, hasta que se rompió una porción de los oocitos y esporocitos presentes en la muestra (comprobado microscópicamente) . Se sedimentaron estas células y desechos celulares y después se resuspendieron en metanol frío (a -20°C), después de lo cual se incubaron a 22°C durante 10 min. Después de una etapa de lavado adicional, se resuspendieron a 22 °C durante 10 min en PBS/0,1% de Tritón X-100. Se lavaron después repetidamente de forma concienzuda con PBS, antes de saturar los sitios de unión no específicos en el material celular a 22 °C durante 1 h mediante incubación con rotación en tampón de bloqueo (PBS/l% de BSA) . Después de eso, se añadieron 25 µ? del sobrenadante de cultivo de hibridoma concentrado 50 veces del anticuerpo monoclonal E2E5 (anticuerpo primario) en 1 mi de tampón de bloqueo, y se incubó la mezcla con rotación durante 2 h. Se retiró el exceso de anticuerpo primario lavando 3 veces con PBS durante un total de 0,5 h, antes de incubar el material celular durante 1 h con rotación y protegiéndose de la luz, con el anticuerpo secundario Alexa Fluor 488 IgG de cabra anti-ratón (H+L) ( oBiTec GmbH, Góppingen) . Después de lavar dos veces con PBS, se resuspendió el sedimento celular en Mowiol (Polyscience Inc., Niles, IL, EE.UU.); se dispusieron después 15 µ? de esta suspensión en un portaobjetos de microscopio, se cubrieron con un cubreobjetos para excluir las burbujas de aire y se almacenaron a 4°C en la oscuridad, b) Microscopía de barrido láser confocal Se utilizó un microscopio Zeiss IM 35 (Zeiss, Oberkochen) con un accesorio Leica CLSM TCS NT (Leica Lasertechnik, Heidelberg) , versión 1.5.451 para microscopía de barrido láser confocal. Se utilizó un láser de argón a una longitud de onda de 488 nm para estimular la fluorescencia del tinte Alexa 488. Se barrieron series Z de secciones ópticas de oocitos y esporocitos con una resolución de 1.204 x 1.024 píxeles. Se utilizaron Adobe Photoshop 6.0 y Corel Draw 10.0 para Windows para analizar los resultados. La inmunofluorescencia registrada frente a StOS22 en oocitos de Eimeria tenella (Fig. 5a) y esporocitos (Fig. 5b y 5c) confirmó en primer lugar los estudios de Moaufo et al. (2002) . El hecho de que la pared del oocito estuviera teñida en oocitos rotos pero no en oocitos intactos sugiere que la I?tOS22 está localizada en la pared interior. Además de esto, aparecieron distintas señales de fluorescencia en 'la región del cuerpo de Stieda del esporocito. Esta estructura está estrechamente relacionada con la exquistación, concretamente la eclosión de los dos esporozoítos a partir de los esporocitos . El hecho de que son sólo los esporocitos que están ya rotos los que exhiben estas señales fluorescentes, indica que £tOS22 es un componente de estructuras que están localizadas en el interior de los esporocitos y no es un componente de la cubierta externa del esporocito. Ejemplo 22 Exquistación de esporozoítos Para obtener oocitos frescos, se infectaron pollos de 2-3 semanas con aproximadamente 5.000 oocitos de Eimeria tenella esporulados utilizando una sonda esofágica. El 7a día después la infección, los animales se sacrificaron y se recogió el contenido de los ciegos en una solución de dicromato de potasio al 2%. Agitando aproximadamente a 28 °C, los oocitos esporularon a las 48 h. Para obtener esporocitos, se desestabilizaron los oocitos utilizando un Potter. Para hacer esto, se pipetearon aproximadamente 1,5 mi de suspensión concentrada de oocitos al recipiente Potter y se homogeneizó a 1.300 rpm hasta que todos los oocitos se fraccionaron (comprobado microscópicamente) . Los esporocitos que se habían liberado se recogieron en un tubo de centrífuga de 50 mi (Falcon, Becton Dickinson, Sunnyvale, CA, EE.UU.) y se centrifugaron a 2.000 rpm durante 10 min. Se resuspendió el sedimento en 25 mi de PBS y se almacenó a 4°C durante una noche con la presencia añadida de 10 g de Baytril/ml (BAYER, Leverkusen) . A la mañana siguiente, se sedimentó la suspensión y se resuspendieron los esporocitos en una mezcla constituida por 1 mi de bilis y 20 mi de PBS-tripsina, que se había esterilizado mediante filtración. En cada caso, se utilizaron alícuotas de 2 mi de esta mezcla, con o sin la adición de 100 µ? de sobrenadante de cultivo de hibridoma concentrado 50 veces del anticuerpo monoclonal E2E5j para experimentos de exquistacion paralela. Se incubaron estas mezclas durante 5 h en un incubador cuya temperatura se fijó a 41,5°C. Posteriormente, se utilizó una cámara Bürker para determinar, en el caso de ambas mezclas, el número de esporozoitos libres y de esporozoitos no eclosionados en los esporocitos. Ejemplo 23 Inhibición de la exquistacion de esporozoitos Para investigar la importancia de EtOS22 durante la exquistacion, se realizaron ensayos paralelos de exquistacion con y sin la presencia añadida del mAb E2E5. Se determinó después el número de esporozoitos eclosionados y de esporocitos que contienen esporozoitos no eclosionados en ambos ensayos (en cada caso 2 mi) , y se compararon estos datos entre sí. El número de esporozoitos eclosionados fue de 9,6 x 106 y 4,8 x 106 en el control y en presencia de Ab, respectivamente. Por otro lado, el número de esporocitos que contienen esporozoitos no eclosionados aumentó de 2,0 x 105 a 2,2 x 10s (Fig. 6) . El hecho de que los esporozoitos libres se redujeran aproximadamente a la mitad mientras que al mismo tiempos los esporocitos que contienen esporozoitos no eclosionados aumentaban aproximadamente 10 veces, muestra que la modulación de la actividad de EtOS22 conduce a la inhibición de la exquistación de Eimeria tenella y, en consecuencia, la modulación de la actividad de StOS22 puede ser adecuada para tratar infecciones por Eimeria. Ejemplo 24 Ensayo de sustancias aisladas por afinidad frente a Eimeria tenella en cultivo celular Se efectúa el ensayo in vitro en cultivos de células renales primarias. Para esto, se separa por disección asépticamente tej ido renal de pollos de tipo ponedor de 12 días, y se hacen crecer las células renales que se aislan a partir de los mismos en cultivos de tejido monocapa en placas de 96 pocilios. El medio nutriente utilizado es DMEM + 5% de suero fetal bovino + 2% de glutamina + 2% de aminoácidos no esenciales + 1% de HEPES + 1% de piruvato de sodio. Después de incubar durante dos dias a 42 °C y 5% de C02, se infectan los cultivos de tejido con esporozoitos de Eimeria tenella exquistados. Procedentes de una concentración de solución madre de 20 mg/ml en DMSO, se diluyen las sustancias aisladas por afinidad con medio nutriente hasta una concentración final de 10 ppm, y se añaden a los cultivos celulares infectados. El 5o día después de la infección, se evalúan microscópicamente los cultivos y el estado de las células huésped, y se determina también el número de esquizontes intactos y merozoitos libres (120 horas después de la infección) . Se evalúa la actividad del modo siguiente: índice Evaluación Percepción óptica 2 Totalmente Sin parásitos intactos/pocilio activo 1 Débilmente 1-6 parásitos intactos/pocilio activo 0 Inactivo Número de parásitos como en el control infectado T Citotóxico Las células huésped han muerto (se han redondeado) Referencias : Altsch.ul, S.F., Gish, .( Miller, ., Myers, E.W., Lipman, D.l (1990): Basic local alignment search lool. J. Mol. Biol. 215: 403-410. 5 Blin, N., Stafford, D.W. (1976): A general meíhod for isola'íion of liigh molecular weig t DNA firon. eukaryotes. Nucleic Acids Res. 3: 2303-230S.

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Se hace constar que con relación a esta fecha el mej or método conocido por la solicitante para llevar a la practica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención .

Claims

REIVINDICACIONES Habiendo descrito la invención como antecede se declara como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :

1. Un polinucleótido caracterizado porque comprende: a) la secuencia descrita en la SEC N° ID 1 ó 3 , o b) un polinucleótido que exhibe una identidad de más de 50% con el polinucleótido que tiene la secuencia descrita en la SEC N° ID 1 ó 3; o c) un polinucleótido que híbrida en condiciones rigurosas con el polinucleótido que tiene la secuencia descrita en la SEC N° ID 1 ó 3 ; o d) un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene la secuencia descrita en la SEC N° ID 2; o e) un polinucleótido que exhibe una identidad de más de 50% con un polinucleótido que codifica el polipéptido que tiene la secuencia descrita en la SEC N° ID 2; o f) un polinucleótido que híbrida en condiciones rigurosas con un polinucleótido que codifica el polipéptido que tiene la secuencia descrita en la SEC M° ID 2; o g) un polinucleótido que difiere de un polinucleótido que tiene la secuencia descrita en la SEC N° ID 1 debido a la degeneración del código genético; h) un polinucleótido que es un fragmento de un polinucleótido como se describe en a) a g) y que es de al menos 6 nucleótidos de longitud.

2. Un polipéptido caracterizado porque está codificado por un polinucleótido de conformidad con la reivindicación 1 y que es de al menos 8 aminoácidos de longitud.

3. Un vector o sistema de expresión caracterizado porque contiene al menos uno de los polinucleótidos de conformidad con la reivindicación 1.

4. Una célula huésped caracterizado porque alberga el vector o el sistema de expresión de conformidad con la reivindicación 3.

5. Un procedimiento caracterizado porque es para preparar un polipéptido de conformidad con la reivindicación 2, utilizando una célula huésped de conformidad con la reivindicación 4.

6. Un anticuerpo caracterizado porque se une específicamente al polipéptido de conformidad con la reivindicación 2.

7. El uso de anticuerpos de conformidad con la reivindicación 6 como parasiticidas.

8. Un procedimiento para detectar un polinucleótido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque un polinucleótido de conformidad con la reivindicación 1 hibrida con el material ácido nucleico de una muestra biológica y se detecta la hibridación.

9. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque la hibridación se detecta utilizando la reacción en cadena con polimerasa.

10. Un procedimiento para detectar un polipéptido de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el polipéptido se detecta mediante la unión del anticuerpo de conformidad con la reivindicación 6.

11. Una composición para detectar un polinucleótido de conformidad con la reivindicación 1 o un polipéptido de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque comprende un polinucleótido de conformidad con la reivindicación 1 o un anticuerpo de conformidad con la reivindicación 6.

12. El uso de un a) polinucleótido de conformidad con la reivindicación 1; o b) polipéptido de conformidad con la reivindicación 2; o c) vector o sistema de expresión de conformidad con la reivindicación 3; o d) anticuerpo de conformidad con la reivindicación 6 para producir una vacuna.

13. Una vacuna caracterizada porque comprende: a) un polipéptido de conformidad con la reivindicación 2 ; o b) un vector de conformidad con la reivindicación 3 ; o c) un anticuerpo de conformidad con la reivindicación 6.

14. Un procedimiento para encontrar compuestos activos que modulan la actividad de la proteína EtOS22 durante la exquistación de esporozoítos a partir de esporocitos, caracterizado porque a) el compuesto activo que se va a ensayar se pone en contacto con un polipéptido EtOS22 de conformidad con la reivindicación 2, permitiendo las condiciones seleccionadas que la sustancia de ensayo se una específicamente al polipéptido BtOS22; y b) se detecta la unión específica al polipéptido que ha tenido lugar; identificándose el compuesto activo que se une al polipéptido como un compuesto activo potencial para tratar la coccidiosis .

15. Un procedimiento para encontrar compuestos activos que modulan la actividad de la proteína EtOS22 durante la exquistación de esporozoítos a partir de esporocitos, caracterizado porque: a) el compuesto activo que se va a ensayar se pone en contacto con un polipéptido £tOS22 de conformidad con la reivindicación 2, permitiendo las condiciones seleccionadas que la sustancia de ensayo se una específicamente al polipéptido EtOS22; y b) se detecta la modulación de la actividad del polipéptido de conformidad con la reivindicación 2 , o de la proteina £?tOS22; identificándose el compuesto activo que modula la actividad como un compuesto activo potencial para tratar la coccidiosis.

16. Un compuesto activo caracterizado porque puede encontrarse utilizando uno de los procedimientos de conformidad con la reivindicación 14 ó 15.

17. Un compuesto activo caracterizado porque modula la actividad de la proteína BtOS22 durante la exquistación de esporozoitos a partir de esporocitos.

18. Una composición farmacéutica caracterizado porque comprende el compuesto activo de conformidad con la reivindicación 16 ó 17 y un excipiente farmacéuticamente admisible .

19. El uso de un compuesto activo caracterizado porque modula la actividad de la proteína EtOS22 durante la exquistación de esporozoitos a partir de esporocitos para producir un fármaco para tratar la coccidiosis.