JP2008206514A - 真菌の細胞壁合成遺伝子 - Google Patents

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Mamiko Tsuchiya
満美子 土谷
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直彰 渡邉
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教博 上田
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Abstract

【課題】新しい原理に基づく抗真菌剤の開発方法及び抗真菌剤の提供。
【解決手段】GPIアンカー蛋白質の細胞壁への輸送過程を反映したレポータ系を作製し、その過程を阻害する化合物を見出した。更に該化合物に対し耐性を付与する遺伝子を同定し、該遺伝子がコードする蛋白質の活性を阻害する化合物のスクリーニング法を開発した。ＧPIアンカー蛋白質の細胞壁への輸送過程を阻害するという、新規メカニズムの抗真菌剤が可能であることを、新規化合物をもって示した。
【選択図】なし

Description

本発明は、真菌の細胞壁合成に関与する蛋白質をコードするDNA、該DNAがコードする蛋白質、ある化合物がGPIアンカー蛋白質の細胞壁への輸送過程に影響を及ぼすか否かを検定する方法、GPIアンカー蛋白質の細胞壁への輸送過程に影響を及ぼす抗真菌剤に関する。
発明の背景
近年、高度な化学療法等により免疫機能の低下した患者や高齢者の増加により、日和見感染に対する対策は益々重要性を増してきている。カンジダ、アスペルギルス、クリプトコッカス等による内臓真菌感染症はこうした日和見感染症の一部を占め、その割合は年々増加している。異なる弱毒菌による日和見感染が次々と起こっている事実は、患者の抵抗力が低下するような基礎疾患がある限り感染症の問題は後を絶たないことを示している。近い将来確実に訪れる高齢化社会においては、耐性菌の問題を含めた新たな感染症対策が重要な課題の一つとなるにもかかわらず、現状では有効な治療薬がきわめて少ない。
これまでの真菌感染症治療剤は既知の骨格に化学修飾し新規化合物を開発するストラテジーが中心であったが、耐性菌の問題もあり新規メカニズムに基づく新薬の開発が切望されている。
このような現状を踏まえ、発明者らは、未だ充分な治療薬が揃っていない抗真菌剤領域において「病原体が病原性を発揮できないようにすることにより、感染症の発症・進展・持続に対して効果を示す」という新たなアプローチを試みた。感染を成立・進展させないためには、感染成立の第一段階である宿主への付着、およびその後のコロニゼーションの進展を抑えることが最も効果的であると考えた。そして、「付着因子自体の発現を阻害する」というこれまで行われていない新たなアプローチを実施することにした。
付着因子の発現を阻害するために、発明者らは、「付着因子等の細胞壁表層糖蛋白質は、一度細胞膜にGPI（Glycosylphosphatidylinositol）アンカリングした後、細胞壁表層に輸送される（図１）。」という仮説に着目した。現在までに付着リガンドを含む30種類以上の細胞壁表層糖蛋白質が、GPIアンカリングを介して輸送される（GPIアンカー蛋白質と称す）ことが明らかになっており、この輸送の段階を阻害すれば、付着因子および主要細胞壁構成蛋白の細胞壁表層での発現が阻害される可能性が高いと考えられた（Hamada K et al, Mol. Gen. Genet., 258: 53-59, 1998（非特許文献１））。また、病原性真菌であるカンジダにおいてもGPIアンカー蛋白質の存在が報告されていた（Kapteyn JC et al, Eur. J. Cell Biol., 65:402-407, 1994（非特許文献２））。
発明者らは、真菌において細胞膜に存在するGPIアンカー蛋白質が、細胞壁に輸送される過程を阻害することにより、細胞壁合成の阻害による新規抗真菌剤が創出できると考えて、研究に着手した。
Hamada K et al, Mol. Gen. Genet., 258:53-59, 1998 Kapteyn JC et al, Eur. J. Cell Biol., 65:402-407, 1994
本発明の課題は、細胞壁表層糖蛋白質の発現を阻害し、細胞壁assemblyを阻害するとともに細胞への付着を阻害して、病原体が病原性を発揮できないようにすることにより、感染症の発症・進展・持続に対して効果を示す、抗真菌剤を開発することにある。
GPIアンカー蛋白質の細胞壁への輸送過程を阻害する化合物をスクリーニングするため、本発明者らは、GPIアンカー蛋白質の一つCWP2（Van Der Vaat JM et al, J. Bacteriol., 177:3104-3110,1995）のＣ末端にある輸送シグナルとレポータ酵素の融合蛋白質によるレポータ系の作製を試みた。
分泌シグナル遺伝子＋レポータ酵素遺伝子＋CWP2のＣ末端遺伝子（有りor無し）から成るDNAを構築し、融合蛋白質をSaccharomyces cerevisiae（以下S. cerevisiae）に発現させたところ、レポータ酵素の活性が、CWP2のＣ末端が有る場合は細胞壁に、無い場合は培養上清中に見出されることが明らかとなった。この結果より、もし被検試料によってGPIアンカー蛋白質の細胞壁への輸送過程が阻害されれば、細胞壁のレポータ酵素の活性が減少する、あるいはレポータ酵素の活性が培養上清中に見出されることが予想され、本レポータ系によるGPIアンカー蛋白質の細胞壁への輸送過程を阻害する化合物のスクリーニングを開始した。
本レポータ系によるスクリーニングより、幾つかのGPIアンカー蛋白質の細胞壁への輸送過程を阻害する化合物が見出された。その代表的な例が、式（Ｉａ）で表される化合物である。
前記式（Ｉａ）で表される化合物は、S. cerevieiae及びCandida albicans（以下C. albicans）の増殖を抑制し、前記式（Ｉａ）で表される化合物存在下で培養したC. albicansは、細胞への付着能が弱く、前記式（Ｉａ）で表される化合物は、GPIアンカー蛋白質の細胞壁への輸送過程を阻害することにより、付着因子の発現を抑制して真菌の付着を阻害するという、当初目的としていた化合物であることが確認された。更に透過型電子顕微鏡による観察により、前記式（Ｉａ）で表される化合物存在下で培養したC. albicansは、細胞壁の合成に異常があることも確認された。
前記式（Ｉａ）に記載の化合物により、本発明者らは「GPIアンカー蛋白質の細胞壁への輸送過程を阻害する」というメカニズムによる抗真菌剤が可能であることを証明した。
本発明者らは、更に前記式（Ｉａ）で表される化合物が作用している標的蛋白質を特定するため、前記式（Ｉａ）で表される化合物に対し耐性を付与する遺伝子の探索を行った。
S. cerevisiaeに、S. cerevisiae遺伝子のプラスミドライブラリーを導入し、過剰発現により、前記式（Ｉａ）で表される化合物に対して耐性を示すようになったS. cerevisiaeよりプラスミドを回収して、耐性遺伝子をクローニングし、塩基配列を決定して、同遺伝子をGWT1と命名した（配列番号１）。GWT1遺伝子産物を過剰発現させたS. cerevisiaeでは、前記式（Ｉａ）で表される化合物存在下でも、前述のGPIアンカー蛋白質のＣ末端を有するレポータ酵素は、細胞壁へ輸送された。また、前記式（Ｉａ）で表される化合物存在下でも、細胞壁が正常であることが透過型電子顕微鏡観察において確認された。
更に、S. cerevisiaeのゲノムDNA上にランダムに点突然変異を導入し、前記式（Ｉａ）で表される化合物特異的に耐性を示すようになった変異株R1, R5を単離したところ、R1変異株ではGWT1遺伝子の405番目のコドンがGTCからATCに、またR5変異株では140番目のコドンがGGGからAGGに変化する点突然変異が見出された。これら変異GWT1遺伝子をGWT1遺伝子破壊株に導入すると前記式（Ｉａ）で表される化合物に対して耐性を示すことから、この化合物に対する耐性はGWT1遺伝子のみで説明可能なことが明らかとなった。これらのことから、前記式（Ｉａ）で表される化合物は、GWT1遺伝子産物に直接作用して、GWT1タンパク質の機能を阻害していることが示唆された。
同様な方法により、C. albicansの耐性遺伝子（配列番号３、及び５）もクローニングし塩基配列を決定し、同遺伝子をCaGWT1と命名した。
また、データベースからのGWT1とのホモロジー検索により、Schizosaccharomyces pombe（以下S.pombe）のホモログ（配列番号２７）が見出された。更に、S.cerevisiae，S.pombe，C.albicansのGWT1遺伝子のコードする蛋白において、高度に保存されている領域の配列を基にプライマーを設定してPCRを行うことによりAspergillus fumigatus（以下A.fumigatus）ホモログ（配列番号３９、４１）が見出された。また、データベースからのGWT1とのホモロジー検索により見出された配列を基にPCRを行って、Cryptococcus neoformans（以下C.neoformans）ホモログ（配列番号５４、５８）が見出された。
すなわち本発明は、
１．真菌における過剰発現により、真菌に対し下記式（Ｉａ）で示される化合物に対する耐性を付与する作用を有する蛋白質をコードする、下記（ａ）から（ｅ）のいずれかに記載のDNA。
（ａ）配列番号：２、４、６、２８、４０または５９に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするDNA
（ｂ）配列番号：１、３、５、２７、３９、４１、５４または５８に記載の塩基配列を含むDNA
（ｃ）配列番号：１、３、５、２７、３９、４１、５４または５８に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA
（ｄ）配列番号：２、４、６、２８、４０または５９に記載のアミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が付加、欠失、置換および／または挿入されたアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするDNA
（ｅ）配列番号：２９及び３１あるいは配列番号：２９及び３０をプライマーとして増幅されるDNA
２．その機能の欠損により真菌の細胞壁におけるGPIアンカー蛋白質量を減少させる作用を有する蛋白質をコードする、下記（ａ）から（ｅ）のいずれかに記載のDNA。
（ａ）配列番号：２、４、６、２８、４０または５９に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするDNA
（ｂ）配列番号：１、３、５、２７、３９、４１、５４または５８に記載の塩基配列を含むDNA
（ｃ）配列番号：１、３、５、２７、３９、４１、５４または５８に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA
（ｄ）配列番号：２、４、６、２８、４０または５９に記載のアミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が付加、欠失、置換および／または挿入されたアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするDNA
（ｅ）配列番号：２９及び３１あるいは配列番号：２９及び３０をプライマーとして増幅されるDNA
ここでストリンジェントな条件とは、例えば65℃ 4 x SSCにおけるハイブリダイゼーション、次いで65℃で１時間0.1 x SSC中での洗浄である。また別法としてストリンジェントな条件は、50%ホルムアミド中42℃ 4 x SSCである。また、PerfectHybTM（TOYOBO）溶液中65℃2.5時間ハイブリダイゼーション、次いで1).2 x SSC, 0.05% SDS溶液：25℃5分、2).2 x SSC, 0.05% SDS溶液：25℃15分、3).0.1 x SSC, 0.1% SDS溶液50℃20分の洗浄といった条件も許される。
また該DNAを欠失するとは、機能を持った該DNAの遺伝子産物の発現が無い、あるいは発現が減少することを意味し、例えば相同組換えの技術を使って、該DNAのコード領域に無関係なDNA、例えば選択マーカー等を挿入することにより、該DNAを欠失させることを意味する。
真菌細胞壁でのGPIアンカー蛋白質由来の蛋白質は、1).GPIアンカー蛋白質の細胞壁への輸送過程を反映したレポータ系、2).細胞壁中のGPIアンカー蛋白質の一種類を定量するELISA、3).動物細胞への付着といったGPIアンカー蛋白質の活性、4).透過型電子顕微鏡による菌体最外層の綿状線維構造の観察、により定量が可能であり、これらの方法を単独であるいは組合わせて用いることにより、該蛋白質が減少することが確認できる。
３．１または２に記載のDNAによりコードされる蛋白質。
４．１または２に記載のDNAが挿入されたベクター。
５．１または２に記載のDNAまたは４に記載のベクターを保持する形質転換体。
６．３に記載の蛋白質が過剰発現している真菌である、５に記載の形質転換体。
７．３に記載の蛋白質の機能が欠損している真菌。
８．５に記載の形質転換体を培養し、該形質転換体またはその培養上清から発現させた蛋白質を回収する工程を含む、３に記載の蛋白質の製造方法。
９．３に記載の蛋白質に結合する抗体。
１０．抗真菌作用を有する化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）３に記載の蛋白質に被検試料を接触させる工程、
（ｂ）該蛋白質と被検試料との結合活性を検出する工程、
（ｃ）該蛋白質に結合する活性を有する化合物を選択する工程、を含む方法。
１１．抗真菌作用を有する化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）３に記載の蛋白質が過剰発現している真菌に被検試料を接触させる工程、
（ｂ）該真菌におけるGPIアンカー蛋白質の細胞壁への輸送量を検出する工程、
（ｃ）３に記載の蛋白質が過剰発現していない真菌に被検資料を接触させた場合と比較して、工程（ｂ）において検出されるGPIアンカー蛋白質の細胞壁への輸送量を減少させる化合物を選択する工程、を含む方法。
ここで被検試料によるGPIアンカー蛋白質の細胞壁への輸送量の減少は、例えば増殖速度の低下、膨化、温度感受性、細胞壁でのGPIアンカー蛋白質由来の蛋白質の減少等により検出することが可能であるが、好ましくは、細胞壁でのGPIアンカー蛋白質由来の蛋白質の減少により検出することが望ましい。
GPIアンカー蛋白質由来の蛋白質の減少は、1).GPIアンカー蛋白質の細胞壁への輸送過程を反映したレポータ系、2).細胞壁中のGPIアンカー蛋白質の一種類を定量するELISA、3).動物細胞への付着といったGPIアンカー蛋白質の活性、4).透過型電子顕微鏡による菌体最外層の綿状線維構造の観察、により定量が可能であり、これらの方法を単独であるいは組合わせて用いることにより、GPIアンカー蛋白質の細胞壁への輸送量の減少が検定できる。
１２．前記１０または１１に記載のスクリーニングにより単離しうる、抗真菌作用を有する化合物。
１３．真菌においてGPIアンカー蛋白質の細胞壁への輸送を阻害する化合物を有効成分とする抗真菌剤。
１４．９に記載の抗体または前記１２に記載の化合物を有効成分とする、抗真菌剤。
１５．一般式(I)
〔式中R1aおよびR2aは同一または相異なってそれぞれ水素原子、ハロゲン原子、水酸基、ニトロ基、シアノ基、トリフルオロメチル基、トリフルオロメトキシ基、置換されてもよいC1-6アルキル基、C2-6アルケニル基、C2-6アルキニル基、置換されてもよいC1-6アルコキシ基、または式
（式中X1は単結合、カルボニル基、または式 -S(O)2- で表わされる基を意味する；
R5aおよびR6aは同一または相異なって、水素原子、または置換されていてもよいC1-6アルキル基を意味する）で表わされる基を示す。また、R1aとR2aは一緒になって、置換されていてもよいベンゼン環、置換されていてもよいピリジン環、置換されていてもよいピロール環、置換されていてもよいチオフェン環、置換されていてもよいフラン環、置換されていてもよいピリダジン環、置換されていてもよいピリミジン環、置換されていてもよいピラジン環、置換されていてもよいイミダゾール環、置換されていてもよいオキサゾール環、置換されていてもよいチアゾール環、置換されていてもよいピラゾール環、置換されていてもよいイソオキサゾール環、置換されていてもよいイソチアゾール環、置換されていてもよいシクロヘキサン環、および置換されていてもよいシクロペンタン環からなる群から選ばれる縮合環を形成してもよい；
R3a、およびR4aは同一または相異なってそれぞれ、水素原子、ハロゲン原子、水酸基、ニトロ基、シアノ基、カルボキシル基、ホルミル基、ヒドロキシイミノ基、トリフルオロメチル基、トリフルオロメトキシ基、C1-6アルキル基、C1-6アルコキシ基、C2-6アルケニル基、C2-6アルキニル基、式 -C(O)NR7aR7b （式中、R7aおよびR7bは同一または相異なってそれぞれ水素原子、またはC1-6アルキル基を意味する）、式 -CO2R7a （式中、R7aは前記定義と同意義を意味する）、式 -S(O)nR7a （式中、nは０ないし２の整数を意味する。R7aは前記定義と同意義を意味する）、式 -S(O)2NR7aR7b （式中、R7aおよびR7bは前記定義と同意義を意味する）、式
（式中X2は単結合、カルボニル基、または式 -S(O)2- で表わされる基を意味する；
R5bおよびR6bは同一または相異なっていて、水素原子、置換されていてもよいC1-6アルキル基、または置換されていてもよいC6-14アリール基を意味する）で表わされる基、または式
（式中、Z1は単結合、酸素原子、ビニレン基、またはエチニレン基を意味する；
Z2は単結合、または０ないし４個の置換基で置換されてもよいC1-6アルキル基を意味する）で表わされる基を意味する。R3aとR4aは一緒になって、メチレンジオキシ基、または1,2-エチレンジオキシ基を意味してもよく、またR3aとR4aは一緒になって、置換されていてもよいベンゼン環、置換されていてもよいピリジン環、置換されていてもよいピロール環、置換されていてもよいチオフェン環、置換されていてもよいフラン環、置換されていてもよいピリダジン環、置換されていてもよいピリミジン環、置換されていてもよいピラジン環、置換されていてもよいイミダゾール環、置換されていてもよいオキサゾール環、置換されていてもよいチアゾール環、置換されていてもよいピラゾール環、置換されていてもよいイソオキサゾール環、置換されていてもよいイソチアゾール環、置換されていてもよいシクロヘキサン環および置換されていてもよいシクロペンタン環からなる群から選ばれる縮合環の形成を意味してもよい。ただし、R1aおよびR2aがともに水素原子を意味する場合は除く。〕で示される化合物もしくはその塩またはそれらの水和物を有効成分とする前記１３に記載の抗真菌剤。
１６．式
で表される化合物（Ｉa）を有効成分とする前記１３に記載の抗真菌剤。
１７．一般式(II)
〔式中Arは下記式（IIIa）−（IIIf）からなる群
（式中、Kは硫黄原子、酸素原子、または式 -NH- で表わされる基を意味する；
R1b、R2bは同一または相異なってそれぞれ水素原子、ハロゲン原子、水酸基、ニトロ基、シアノ基、トリフルオロメチル基、トリフルオロメトキシ基、式
（式中X3は単結合、カルボニル基、または式 -S(O)2- で表わされる基を意味する；
R5cおよびR6cは同一または相異なっていて、水素原子、置換されていてもよいC1-6アルキル基を意味する）で表わされる基、または式 -X4-R8a（式中、 X4は、単結合、酸素原子、または硫黄原子を意味する；R8aはC1-6アルキル基、C2-6アルケニル基、C2-6アルキニル基、C3-8シクロアルキル基、またはC3-8シクロアルケニル基を意味する）で表わされる基を示す。また、R1b、R2bは一緒になってメチレンジオキシ基、または1,2-エチレンジオキシ基を形成してもよい。)から選ばれる置換基を意味する；
R3b、およびR4bは同一または相異なってそれぞれ、水素原子、ハロゲン原子、水酸基、ニトロ基、シアノ基、カルボキシル基、ホルミル基、ヒドロキシイミノ基、トリフルオロメチル基、トリフルオロメトキシ基、C1-6アルキル基、C1-6アルコキシ基、C2-6アルケニル基、C2-6アルキニル基、または式、
（式中、Z1bは単結合、ビニレン基、またはエチニレン基を意味する；
Z2bは単結合、または０ないし４個の置換基で置換されてもよいC1-6アルキル基を意味する）で表わされる基を意味する。；
ただし（１）Arが、R1bおよびR2bがともに水素原子である前記式(IIId)で表わされる場合、（２）R3bまたはR4bの少なくとも一方が水素原子を示し、もう一方が水素原子、メトキシ基、水酸基、メチル基、ベンジルオキシ基、またはハロゲン原子であり、 Arが、R1bおよびR2bがともに水素原子またはメトキシ基を意味する前記式(IIIc)で表わされる場合、（３）R3bまたはR4bの少なくとも一方が水素原子を示し、もう一方が水素原子、水酸基、メトキシ基、またはベンジルオキシ基であり、Arが、R1bおよびR2bがともに水酸基またはベンジルオキシ基を意味する前記式(IIIc)で表わされる場合、または（４）Arが、R1bが水素原子でR2bがホルミル基、ヒドロキシメチル基またはメトキシカルボニル基である前記式(IIId)で表わされる場合を除く。〕で示される化合物もしくはその塩またはそれらの水和物。
１８．Arが式、
（式中、R1cが水素原子、置換されてもよいC1-6アルキル基、ベンジル基を意味する）で表わされ、かつR3bが水素原子を意味する場合を除いた、１７．記載の化合物もしくはその塩またはそれらの水和物。
１９． 一般式(IIIc2)
〔式中R1b、R2bは前記定義と同意義を意味する。ただし、（１）R1bが式R1c-O-（式中、 R1cは前記定義と同意義を意味する）で表わされる基であり、R2bが水素原子であり、 R3bが水素原子を意味する場合、（２）R3bまたはR4bの少なくとも一方が水素原子を示し、もう一方が水素原子、メトキシ基、水酸基、メチル基、ベンジルオキシ基、またはハロゲン原子であり、R1bおよびR2bがともに水素原子またはメトキシ基を意味する場合、または（３） R3bまたはR4bの少なくとも一方が水素原子を示し、もう一方が水素原子、水酸基、メトキシ基、またはベンジルオキシ基であり、R1bおよびR2bがともに水酸基またはベンジルオキシ基を意味する場合を除く。〕で表される化合物もしくはその塩またはそれらの水和物。
２０．抗真菌作用を有する前記１７記載の抗真菌剤。
２１．R3a、およびR4aのうち少なくとも１つが、式 -C(O)NR7aR7b （式中、R7aおよびR7bは前記定義と同意義を意味する）、式 -CO2R7a （式中、R7aは前記定義と同意義を意味する）、式 -S(O)nR7a （式中、nは０ないし２の整数を意味する。R7aは前記定義と同意義を意味する）、式 -S(O)2NR7aR7b （式中、R7aおよびR7bは前記定義と同意義を意味する）、式
（式中X2、R5bおよびR6bは前記定義と同意義を意味する）で表わされる基、または０ないし４個の置換基で置換されてもよいC1-6アルコキシ基を意味し、またはR3aとR4aは一緒になって、メチレンジオキシ基、または1,2-エチレンジオキシ基を意味する前記１５．記載の抗真菌剤
２２．抗真菌作用を有する化合物が、（１）1-ベンジルイソキノリン、（２）1-(4-ブロモベンジル)イソキノリン、（３）1-(4-クロロベンジル)イソキノリン、（４）1-(4-フルオロベンジル)イソキノリン、（５）1-(4-ヨードベンジル)イソキノリン、（６）1-(3-メチルベンジル)イソキノリン、（７）1-(4-メチルベンジル)イソキノリン、（８）1-(3,4-ジメチルベンジル)イソキノリン、（９）1-(3-メトキシベンジル)イソキノリン、（１０）1-(4-メトキシベンジル)イソキノリン、（１１）1-(3,4-メチレンジオキシベンジル)イソキノリン、（１２）1-(4-ベンジルオキシベンジル)イソキノリン、（１３）1-(4-シアノベンジル)イソキノリン、（１４）1-(4-ニトロベンジル)イソキノリン、（１５）1-(4-アミノベンジル)イソキノリン、（１６）1-(4-メトキシベンジル)-6,7-ジクロロ-イソキノリン、（１７）1-(4-メトキシ-2-ニトロ-ベンジル)-イソキノリン、（１８）1-(4-メトキシベンジル)-6,7-メチレンジオキシ-イソキノリン、（１９）1-(2-アミノ-4-メトキシ-ベンジル)イソキノリン、（２０）1-(4-メトキシベンジル)-7-ヒドロキシ-6-メトキシ-イソキノリン、（２１）1-(4-ベンジルオキシベンジル)-6,7-ジメトキシ-イソキノリン、（２２）1-(4-メトキシベンジル)-6,7-ジメトキシ-イソキノリン、（２３）1-(4-メトキシ-2-ニトロ-ベンジル)-イソキノリン、（２４）3-[4-(1-イソキノリルメチル)フェノキシ]プロピルシアニド、（２５）1-[4-(2,2,3,3-テトラフルオロプロポキシ)ベンジル]イソキノリン、（２６）1-[4-(2-ピペリジノエトキシ)ベンジル]イソキノリン、（２７）4-(1-イソキノリルメチル)フェニル(2-モルフォリノエチル)エーテル、（２８）1-[4-(2-メトキシエトキシ)ベンジル]イソキノリン、（２９）N-{2-[4-(1-イソキノリルメチル)フェノキシ]エチル}-N,N-ジメチルアミン、（３０）1-[4-(フェネチルオキシ)ベンジル]イソキノリン、（３１）1-{4-[(2-メチルアリル)オキシ]ベンジル}イソキノリン、（３２）1-(4-イソブトキシベンジル)イソキノリン、（３３）1-[4-(2-フェノキシエトキシ)ベンジル]イソキノリン、（３４）メチル2-[4-(1-イソキノリルメチル)フェノキシ]アセテート、（３５）2-[4-(1-イソキノリルメチル)フェノキシ]-1-エタノール、（３６）t-ブチルN-{2-[4-(1-イソキノリルメチル)フェノキシ]エチル}カーバメート、（３７）1-{4-[3-(テトラヒドロ-2H-2-ピラニルオキシ)プロポキシ]ベンジル}イソキノリン、（３８）2-[4-(1-イソキノリルメチル)フェノキシ] -1-エタンアミン、（３９）1-[4-(3-ピペリジノプロポキシ)ベンジル]イソキノリン、（４９）3-[4-(1-イソキノリルメチル)フェノキシ]-1-プロパノール、（４１）1-[4-(2-エチルブトキシ)ベンジル]イソキノリン、（４２）4-[4-(1-イソキノリルメチル)フェノキシ]ブタノイックアシッド、（４３）1-(4-{3-[(4-ベンジルピペラジノ)スルフォニル]プロポキシ}ベンジル)イソキノリン、（４４）1-(4-{3-[4-(4-クロロフェニル)ピペラジノ]プロポキシ}ベンジル)イソキノリン、（４５）4-(1-イソキノリルメチル)アニリン、（４６）N-[4-(1-イソキノリルメチル)フェニル]ブタンアミド、（４７）N-[4-(1-イソキノリルメチル)フェニル]プロパンアミド、（４８）N-[4-(1-イソキノリルメチル)フェニル]-1-エタンスルフォンアミド、（４９）N-[4-(1-イソキノリルメチル)フェニル]-N-メチル-エタンスルフォンアミド、（５０）N-[4-(1-イソキノリルメチル)フェニル]-N-メチルアミン、（５１）N-[4-(1-イソキノリルメチル)フェニル]-N-プロピルアミン、または（５２）N-[4-(1-イソキノリルメチル)フェニル]-N-メチル-N-プロピルアミンである前記１５．記載の抗真菌剤。
２３．治効量の前記１３から２２のいずれかに記載の抗真菌剤を哺乳動物に投与することを含む、真菌感染症の治療方法、に関する。
以下に、本願明細書において記載する用語、記号等の意義を説明し、本発明を詳細に説明する。
なお、本願明細書中においては、化合物の構造式が便宜上一定の異性体を表すことがあるが、本発明には化合物の構造上生ずる総ての幾何異性体、不斉炭素に基づく光学異性体、立体異性体、互変異性体等の異性体および異性体混合物を含み、便宜上の式の記載に限定されるものではなく、いずれか一方の異性体でも混合物でもよい。従って、分子内に不斉炭素原子を有し光学活性体およびラセミ体が存在することがあり得るが、本発明においては特に限定されず、いずれの場合も含まれる。さらに結晶多形が存在することもあるが同様に限定されず、いずれかの結晶形単一または混合物であってもよく、また、無水物であっても水和物であってもどちらでもよい。
また本発明化合物が、生体内で酸化、還元、加水分解、または抱合などの代謝を受けて抗真菌作用を示す化合物も含有する。またさらに、本発明は生体内で酸化、還元、加水分解などの代謝を受けて本発明化合物を精製する化合物をも含有する。
本明細書中において表される「C1-6アルキル基」とは、炭素数１ないし６個の直鎖状または分枝鎖状のアルキル基を意味し、具体的には例えばメチル基、エチル基、ｎ-プロピル基、ｉ-プロピル基、ｎ-ブチル基、ｉ-ブチル基、tert-ブチル基、ｎ-ペンチル基、ｉ-ペンチル基、ネオペンチル基、ｎ-ヘキシル基、1-メチルプロピル基、１,２-ジメチルプロピル基、２-エチルプロピル基、１-メチル-２-エチルプロピル基、１-エチル-２-メチルプロピル基、１,１,２-トリメチルプロピル基、１-メチルブチル基、２-メチルブチル基、１,１-ジメチルブチル基、２,２-ジメチルブチル基、２-エチルブチル基、１,３-ジメチルブチル基、２-メチルペンチル基、３-メチルペンチル基等があげられる。
本明細書中において表される「C2-6アルケニル基」とは、炭素数２ないし６個の直鎖状または分枝鎖状のアルケニル基を意味し、具体的には例えばビニル基、アリル基、１-プロペニル基、イソプロペニル基、１-ブテン-１-イル基、１-ブテン-２-イル基、１-ブテン-３-イル基、２-ブテン-１-イル基、２-ブテン-２-イル基等があげられる。
本明細書中において表される「C2-6アルキニル基」とは、炭素数２ないし６個の直鎖状または分枝鎖状のアルキニル基を意味し、具体的には例えば、エチニル基、１-プロピニル基、２-プロピニル基、ブチニル基、ペンチニル基、ヘキシニル基等があげられる。
本明細書中において表される「C1-6アルコキシ基」とは前記定義の「C1-6アルキル基」が結合したオキシ基であることを意味し、具体的には、例えばメトキシ基、エトキシ基、n-プロポキシ基、i-プロポキシ基、n-ブトキシ基、i-ブトキシ基、sec-ブトキシ基、t-ブトキシ基、n-ペンチルオキシ基、i-ペンチルオキシ基、sec-ペンチルオキシ基、t-ペンチルオキシ基、ネオペンチルオキシ基、1-メチルブトキシ基、2-メチルブトキシ基、1,1-ジメチルプロポキシ基、1,2-ジメチルプロポキシ基、n-ヘキシルオキシ基、i-ヘキシルオキシ基、1-メチルペンチルオキシ基、2-メチルペンチルオキシ基、3-メチルペンチルオキシ基、1,1-ジメチルブトキシ基、1,2-ジメチルブトキシ基、2,2-ジメチルブトキシ基、1,3-ジメチルブトキシ基、2,3-ジメチルブトキシ基、3,3-ジメチルブトキシ基、1-エチルブトキシ基、2-エチルブトキシ基、1,1,2-トリメチルプロポキシ基、1,2,2-トリメチルプロポキシ基、1-エチル-1−メチルプロポキシ基、1-エチル-2−メチルプロポキシ基などが挙げられる。
本明細書中において表される「C6-14アリール基」とは、炭素数6ないし14の芳香族環基をいい、具体的には例えば、フェニル基、1-ナフチル基、2-ナフチル基、as-インダセニル基、s-インダセニル基、アセナフチレニル基などが挙げられる。
本明細書中において表わされる「ハロゲン原子」とは、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子を意味する。
本明細書中において表わされる「置換されていてもよい」とは、「置換可能な部位に、任意に組み合わせて１または複数個の置換基を有してもよい」と同意義であり、置換基は具体的には例えば、水素原子、ハロゲン、ニトロ基、シアノ基、ヒドロキシル基、メルカプト基、ヒドロキシアルキル基、カルボキシル基、C1-6アルコキシカルボニル基、C2-7アシルアミノ基、C1-6アルキルアミノ基、ピリジル基、C1-6アルキルスルフィニル基、C1-6アルキルスルフォニル基、C1-6アルキルスルファモイル基、C1-6アルキルスルフィナモイル基、C1-6アルキルスルフェナモイル基、テトラヒドロピラニル基、C1-6アルキルカルバモイル基、または式 -X4-R8a（式中、X4は、単結合、酸素原子、または硫黄原子を意味する；R8aはC1-6アルキル基、C2-6アルケニル基、C2-6アルキニル基、C6-14アリール基、C3-8シクロアルキル基、またはC3-8シクロアルケニル基を意味する）などが挙げられる。
本明細書中において表わされる「０ないし４個の置換基で置換されていてもよい」とは、「置換可能な部位に、任意に組み合わせて１または４個の置換基を有してもよい」と同意義であり、置換基は前記定義と同意義である。
本発明における「塩」とは薬理学的に許容される塩を示し、本発明化合物と付加塩を形成したものであれば特に限定されないが、好ましい例としては、フッ化水素酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩などのハロゲン化水素酸塩；硫酸塩、硝酸塩、過塩素酸塩、リン酸塩、炭酸塩、重炭酸塩などの無機酸塩；酢酸塩、シュウ酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩などの有機カルボン酸塩；メタンスルホン酸塩、トリフルオロメタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、トルエンスルホン酸塩、カンファースルホン酸塩などの有機スルホン酸塩；アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩などのアミノ酸塩；トリメチルアミン塩、トリエチルアミン塩、プロカイン塩、ピリジン塩、フェネチルベンジルアミン塩などのアミンとの塩；ナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩；マグネシウム塩、カルシウム塩などのアルカリ土類金属塩等があげられる。
以下に本発明に記載された、１．細胞壁合成に関与する蛋白質をコードするDNAを得る方法、２．被検試料がGPIアンカー蛋白質の細胞壁への輸送過程に影響を及ぼすか否かを検定する方法、３．前記式（Ｉａ）の化合物を得る方法について開示する。
１．真菌の細胞壁合成に関与する蛋白質をコードするDNAを得る方法
以下に、(1).真菌に過剰発現することにより、前記式（Ｉａ）に記載の化合物に対する耐性を獲得する蛋白質をコードするDNAを得る方法、(2).配列番号１、配列番号３あるいは配列番号５に記載のDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNAを得る方法、(3).ホモロジー検索を基に、真菌の細胞壁合成に関与する蛋白質をコードするDNAを得る方法、(4). 前記式（Ｉａ）に記載の化合物に対する耐性を獲得する蛋白質を過剰発現、あるいは欠失した真菌を得る方法について述べる。
(1).真菌に過剰発現することにより、前記式（Ｉａ）に記載の化合物に対する耐性を獲得する蛋白質をコードするDNAを得る方法
ここで真菌とは、接合菌・子嚢菌・担子菌・不完全菌門に属すもので、好ましくは病原性真菌、Mucor・Saccharomyces・Candida・Cryptococcus・Trichosporon・Malassezia・Aspergillus・Trichophyton・Microsporum・Sporothrix・Blastmyces・Coccidioides・Paracoccidioides・Penicillinium・Fusariumであり、更に好ましくはC. albicans・C. glabrata、C. neoformans及びA. fumigatusである。遺伝的な解析の容易なS. cerevisiae及びS. pombeも好ましい菌種である。
真菌に、当該真菌遺伝子のプラスミドライブラリーを導入する。S. cerevisiae及びS. pombeのプラスミドライブラリーはATCC(Information for ATCC Number:37323)から入手可能であり、C. albicansのプラスミドライブラリーはNavaro-Garcia F et al, Mol. Cell. Biol., 15:2197-2206, 1995に記載の方法により作製可能である。得られたプラスミドライブラリーは、Gietz D et al, Nucl. Acids Res. 20:1425, 1992に記載の方法により真菌に導入する。あるいは、YEASTMAKERTM Yeast Transformation System(Clontech)等のキットを使うことも許される。
プラスミドライブラリーを導入した真菌は、前記式（Ｉａ）に記載の化合物の存在下で培養する。具体的には、前記式（Ｉａ）に記載の化合物を1.56μg/mlから25μg/ml、好ましくは1.56μg/mlから6.25μg/ml、更に好ましくは3.125μg/mlの濃度に含む寒天培地上にプラスミドライブラリーを導入した真菌を接種し、適当な時間、30℃から42℃で２日から５日、好ましくは37℃で３日間培養する。増殖してきたコロニーを、前記式（Ｉａ）に記載の化合物を含む培地中で更に培養し、増殖させた菌体よりプラスミドを精製する。プラスミドの精製は、例えばMETHODS IN ENZYMOLOGY, Vol. 194:169-182 (1991)に記載の方法に行うことができる。
得られたプラスミドは、好ましくは直接塩基配列を決定するが、必要で有れば、適当なベクター、例えば塩基配列の決定に適したpBluescript II、pUC19等にリクローニングを行い、塩基配列を決定する。塩基配列の決定は、例えばABI377 system（PE apllied Biosystems社製）マニュアルに記載の方法で行うことができる。
本発明の実施例においては、S. cerevisiaeでは独立に取得した27コロニーの全てが、C. albicansでは30コロニー中28コロニーが、本発明に記載のDNAを含んでいた。前記式（Ｉａ）に記載の化合物に対して耐性を付与する遺伝子は、該真菌にただ一つ存在し、上記の方法により取得することが可能である。
(2).配列番号１、配列番号３あるいは配列番号５に記載のDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNAを得る方法
本発明に記載の、真菌の細胞壁合成に関与する蛋白質をコードするDNAを得る方法としては、例えばS. cerevisiaeの遺伝子DNAを鋳型とし、配列番号１に記載の塩基配列の情報よりプライマーを設計して、あるいはC. albicansの遺伝子DNAを鋳型とし、配列番号３あるいは配列番号５に記載の塩基配列の情報よりプライマーを設計して、PCRを行い、増幅されたDNAを適当なベクター、例えばpBlueScript等にクローニングすることにより得る方法が挙げられる。プライマーは増幅したい領域に応じて適宜設計するが、好ましくは15 bp以上、更に好ましくは20 bp以上の長さが望ましく、場合によっては制限酵素部位等、後のDNA構築に必要な配列を付加しても構わない。PCRの条件はプライマーの長さ、増幅する領域の長さ、用いる鋳型DNAの量等に合わせ適宜決定できる。例えばC. albicansの遺伝子DNA 200 ngを鋳型とし、配列番号２１及び配列番号２２をプライマーとして94℃4分→（94℃30秒→68℃5分）x 35サイクル→72℃4分の条件で、真菌の細胞壁合成に関与する蛋白質をコードするDNAを得ることができる。
PCRで得られたDNAは、細胞壁合成に関与する蛋白質をコードするDNAとホモロジーのある、他類の真菌のDNAを得るためのプローブとしても使用することができる。具体的には、例えばS. cerevisiaeの細胞壁合成に関与する蛋白質をコードする、C. albicansの相同遺伝子を得るために、C. albicansの遺伝子ライブラリーあるいはc-DNAライブラリーから、S. cerevisiaeの遺伝子DNAを鋳型としてPCRで得られたDNAをプローブとし、ストリンジェントな条件で、ハイブリダイズするDNAをクローニングを行うことができる。ここでストリンジェントな条件とは、例えば65℃ 4 x SSCにおけるハイブリダイゼーション、次いで65℃で１時間0.1 x SSC中での洗浄である。また別法としてストリンジェントな条件は、50%ホルムアミド中42℃ 4 x SSCである。また、PerfectHybTM（TOYOBO）溶液中65℃2.5時間ハイブリダイゼーション、次いで1).2 x SSC, 0.05% SDS溶液：25℃5分、2).2 x SSC, 0.05% SDS溶液：25℃15分、3).0.1 x SSC, 0.1% SDS溶液50℃20分の洗浄といった条件も許される。
本発明の実施例では、サザンブロット解析により、C. albicansには配列番号１に記載するDNAとハイブリダイズする遺伝子が１つだけ存在することが明らかとなっており、更に該遺伝子をクローニングしたことが示されている。上記方法により、配列番号１あるいは配列番号３とハイブリダイズするDNAを取得することが可能である。
(3).ホモロジー検索を基に、真菌の細胞壁合成に関与する蛋白質をコードするDNAを得る方法
本発明により、S. cerevisiae，C. albicans，S. pombe，A. fumigatus及びC. neoformansのGWT1ホモログが明らかとなっている。これら遺伝子の間で保存されている領域は、GWT1遺伝子産物が機能を発揮するために重要であると考えられ、これ以外の真菌においても保存されている可能性が高い。
そこで、保存されている領域のアミノ酸配列を基に、プローブを作製してハイブリダイズを行う、あるいはプライマーを設定してPCRを行うことにより、真菌の細胞壁合成に関与する蛋白質をコードするDNAを得ることができる。PCRのプライマーは、保存されている領域をコードするように設定されれば、如何なる配列も許されるが、好ましくは配列番号２９及び３１あるいは配列番号２９及び３０が望ましい。
また別法としては、データベースに登録された遺伝子断片から、GWT1とホモロジーを示す塩基配列を探し出し、その塩基配列を基にプライマーを設定して、cDNAより、あるいはゲノムDNAよりPCRを行うことにより、真菌の細胞壁合成に関与する蛋白質をコードするDNAを得ることができる。
得られた配列を基に、全長遺伝子を得るPCRの方法としては、3' RACE・5' RACE・inverse PCR等の手法が挙げられ、またハイブリダイズにより隣接した配列を含むクローンを選択することも可能である。これらの手法を組合わせることにより、全長遺伝子を得ることができる。
(4). 前記式（Ｉａ）に記載の化合物に対する耐性を獲得する蛋白質を過剰発現、あるいは欠失した真菌を得る方法
本発明に記載の、前記式（Ｉａ）に記載の化合物に対する耐性を獲得する蛋白質を過剰発現した真菌、好ましくはS. cerevisiaeは、該蛋白質を発現する発現ベクター、例えば真菌で強制発現が可能なプロモーター、好ましくは出芽酵母エノラーゼ遺伝子（ENO1）のプロモーターの下流に、配列番号１に記載のDNAをつないだ発現ベクターを、真菌染色体上のある特定の位置に挿入する方法により得られる。
挿入する方法は、例えばpRS304（Sikorski RS et al, Genetics. 122(1):19-27, 1989）のマルチクローニングサイトに挿入したい配列を挿入し、インテグレーション用ベクターを作製して、真菌に導入することにより行うことができる。詳しい方法はMETHODS IN ENZYMOLOGY Vol.194:281-301 (1991)を参照できる。
またC. albicansの過剰発現株は、C. albicans用発現ベクター、例えばpCARS1、pRM1等（Pla J et al, Yeast 12:1677-1702, 1996）に配列番号３あるいは配列番号５に記載の遺伝子を組み込んでC. albicansに形質転換する（Sanglard D et al, Antimicrobiol. Agents Chemother. 40:2300-2305, 1996）ことにより得られる。
本発明に記載の、前記式（Ｉａ）に記載の化合物に対する耐性を獲得する遺伝子を欠失した真菌、好ましくはS. cerevisiaeは、以下の方法により得ることができるが、この例示によって本発明は限定されない。
マーカー遺伝子、好ましくはS. pombeのhis5遺伝子を鋳型とし、両端に30 bp以上好ましくは40 bp以上の欠失したい遺伝子、S. cerevisiaeの場合配列番号１に記載の遺伝子の配列を含んだPCR産物が得られるように設計したプライマーを用いPCR増幅を行う。PCR産物を精製し、真菌に導入後、マーカー遺伝子に対応した選択、his5であればhis-の培地で培養して、欠失株を得ることができる。
また、C. albicansの欠失株は、配列番号３あるいは配列番号５に記載の塩基配列情報を基に、hisG-URA3-hisGカセットを用いた常法（Fonzi WA et al, Genetics 134:717-728,1993）により得られる。
２．被検試料がGPIアンカー蛋白質の細胞壁への輸送過程に影響を及ぼすか否かを検定する方法
被検試料が、GPIアンカー蛋白質の細胞壁への輸送過程を阻害するか否か、あるいはGPIアンカー蛋白質の真菌表層への発現を阻害するか否かは、(1).レポータ酵素を用いる方法、(2).真菌細胞壁の表層糖蛋白質と反応する抗体を用いる方法、(3).動物細胞に対する付着能により検定する方法、(4).真菌を光学顕微鏡あるいは電子顕微鏡で観察する方法により検定できる。
以下に説明する(1)〜(4)の方法により、好ましくは(1)〜(4)の方法を組み合わせて用いることにより、被検試料がGPIアンカー蛋白質の細胞壁への輸送過程を阻害する、あるいはGPIアンカー蛋白質の真菌表層への発現を阻害すると判断され、しかも本件発明に記載のDNAがコードする蛋白質を、真菌に過剰発現させることにより、その阻害の程度が減弱する、あるいは阻害が見られなくなる場合に、被検試料は、GPIアンカー蛋白質の細胞壁への輸送過程に影響を与えたと判断される。
以下、(1)〜(4)の方法を説明する。
(1).レポータ酵素を用いる方法
GPIアンカー蛋白質の細胞壁への輸送過程は、例えばGPIアンカー蛋白質を放射性同位元素で標識し、真菌細胞壁画分を分画後、GPIアンカー蛋白質に対する抗体による免疫沈降を行うといったトレーサー実験により定量することが可能である。また、より容易には、GPIアンカー蛋白質に共通して見られ、輸送のシグナルとして働いていると考えられるＣ末端配列を、測定の容易な酵素との融合蛋白質（レポータ酵素）として発現させ、真菌細胞壁画分を分画後、各画分の酵素活性を測定するレポータ系により定量することが可能である（Van Berkel MAA et al, FEBS Letters, 349:135-138, 1994）。以下にレポータ酵素を用いた方法について説明するが、これは本発明を限定するものではない。
先ず、レポータ遺伝子を構築し真菌に導入する。レポータ遺伝子は、真菌で働くプロモータ配列に続き、それぞれシグナル配列・レポータ酵素・GPIアンカー蛋白質Ｃ末端配列をコードするDNAを、reading frameを合わせてつなぎ合わせて構築する。プロモータ配列としては、例えばGAL10、ENO1のプロモータの配列等が挙げられる。シグナル配列としては、例えばα-ファクター、インべルターゼ、リゾチームのシグナル配列等が挙げられる。レポータ酵素としては、例えばβラクタマーゼ・リゾチーム・アルカリホスファターゼ・βガラクトシダーゼ等が挙げられる。酵素活性は持たないが容易に検出が可能なGreen Fluorescence Protein (GFP)を用いても良い。GPIアンカー蛋白質Ｃ末端配列としては、例えばα-agglutininＣ末端配列・CWP2Ｃ末端配列等が挙げられる。また、構築したレポータ遺伝子を含むベクター中に、適当な選択マーカ、例えばLEU2、URA3等を挿入しておくことが好ましい。
構築したレポータ遺伝子を適当な方法、例えば酢酸リチウム法（Gietz D et al, Nucl. Acids Res. 20:1425, 1992）により真菌に導入し、必要であれば選択マーカに適した方法、LEU2であればLeu-の培地、URA3であればUra-の培地で培養し、DNAが導入された真菌を選択する。
被検試料がGPIアンカー蛋白質の細胞壁への輸送過程に影響を与えるか否かは、以下の方法により検定する。
レポータ遺伝子を導入した真菌を、被検試料の存在下、適当な条件、例えば30℃で48時間培養する。培養後、培養上清を遠心分離し、培養上清画分のレポータ酵素の活性を測定する。残された菌体画分は、洗浄後、適当な方法例えばグルカナーゼで細胞壁グルカンを分解することにより、細胞壁成分を分離し、細胞壁画分及び細胞質画分のレポータ酵素の活性を測定する。なおアッセイを簡便に行うため、遠心分離後、菌体の洗浄は行わずに、菌体画分中に残る培養上清画分由来のレポータ酵素量を比例計算により求め、菌体画分のレポータ酵素量から差し引いて菌体画分中のレポータ酵素量とすることも許される。
被検試料に、一細胞当たりの培養上清画分中のレポータ酵素活性を上昇させる、あるいは一細胞当たりの細胞壁画分中のレポータ酵素活性を低下させる活性が認められれば、該被検試料はGPIアンカー蛋白質の細胞壁への輸送過程に影響を与えたと判断される。
(2).真菌細胞壁の表層糖蛋白質と反応する抗体を用いる方法
被検試料がGPIアンカー蛋白質の真菌表層での発現に影響を与えるか否かは、真菌細胞壁中のGPIアンカー蛋白質を、該蛋白質と反応する抗体によって定量することにより検出が可能である。
抗体としては、例えばGPIアンカー蛋白質例えばα-agglutinin・Cwp2p・Als1p等のアミノ酸配列より抗原決定基を予想して（Chen MH et al, J. Biol. Chem., 270:26168-26177, 1995, Van Der Vaat JM et al, J. Bacteriol., 177:3104-3110,1995, Hoyer LL et al, Mol. Microbiol., 15:39-54, 1995）、その領域のペプチドを合成し、抗原性のある物質例えば異種蛋白質等に結合させて、家兎等に免疫してポリクローナル抗体を、マウス等に免疫してモノクローナル抗体を得ることが可能である。また、好ましくは、Als1pペプチドに対する家兎ポリクローナル抗体が望ましい。
また別法として真菌、好ましくはGPIアンカー蛋白質例えばα-agglutinin・ Cwp2p・Als1p等を過剰発現させた真菌を、場合によっては更に部分精製したGPIアンカー蛋白質を、マウス等に免疫し、融合後得られたクローンを、その産生する抗体をELISA・Western blot解析等で選択することにより、GPIアンカー蛋白質に対するモノクローナル抗体を得ることが可能である。
被検試料がGPIアンカー蛋白質の細胞壁への輸送過程に影響を与え、細胞壁中のGPIアンカー由来蛋白質の量を減少させるか否かは、以下の方法により検定できる。
真菌を、被検試料の存在下、適当な条件、例えば30℃、48時間培養する。培養した真菌を遠心により集菌し、菌体を好ましくはガラスビーズを用いて破砕する。洗浄した破砕菌体を、好ましくはSDSで抽出遠心後、沈殿を洗浄する。抽出後の破砕菌体を、グルカンを分解する酵素、好ましくはグルカナーゼで処理し、その遠心上清をGPIアンカー蛋白質サンプルとする。
抗Als1pペプチド抗体を、96 wellプレートに4℃、overnightでコーティングする。洗浄液好ましくは0.05% Tween 20含有PBS(PBST)で洗浄後、96 wellプレートの非特異的吸着部位をブロックする試薬、好ましくはBSA・ゼラチン等の蛋白質、更に好ましくはブロックエースでブロッキングする。再度洗浄液好ましくはPBSTで洗浄後、場合によっては適当に希釈したGPIアンカー蛋白質サンプルを加え、適当な時間例えば室温で2時間反応させる。洗浄液好ましくはPBSTで洗浄後、酵素標識したC. albicansに対する抗体、好ましくはHRP標識抗カンジダ抗体を、適当な時間例えば室温で2時間反応させる。標識の方法は酵素標識であっても、放射性同位元素による標識であっても許される。洗浄液好ましくはPBSTで洗浄後、標識に適した方法、酵素標識であれば基質溶液を加え、反応停止後490 nmの吸光度を測定することにより、GPIアンカー蛋白質サンプル中のAls1p量を算出する。
(3).動物細胞に対する付着能により検定する方法
被検試料がGPIアンカー蛋白質の真菌表層での発現に影響を与えるか否かは、真菌細胞壁中のGPIアンカー蛋白質の活性、好ましくは真菌の動物細胞への付着能等を測定することにより、検定が可能である。GPIアンカー蛋白質の活性としては、動物細胞への付着に関与するAls1p、Hwp1等の他に、matingに関与するα-agglutinin、酵母の凝集に関与するFlo1p等が知られている。以下に、真菌の動物細胞への付着能により検定する方法について具体的に記載するが、本発明はこれにより限定されるものではない。
真菌としては、細胞に対する付着能を有する真菌を使用し、好ましくは真菌はC. albicansであることが望ましい。哺乳類細胞としては真菌が接着する性質を有する細胞を使用し、好ましくは細胞は腸管上皮細胞であることが望ましい。哺乳類細胞を培養し、適当な方法例えばエタノール固定により固定する。そこへ被検試料と適当な時間、例えば30℃で48時間インキュベートした真菌を接種し、一定時間例えば30℃で1時間培養後、培養上清を除去しバッファーで洗浄して寒天培地、例えばサブロー・デキストロース寒天培地（Difco）を重層する。30℃一晩培養後、コロニー数をカウントし、付着率を計算する。
被検試料に、化合物処理を行わなかった真菌と比較して、細胞に付着することにより形成されたコロニー数を低下させる活性が認められれば、該被検試料はGPIアンカー蛋白質の細胞壁への輸送過程に影響を与えたと判断される。
(4).真菌を電子顕微鏡あるいは光学顕微鏡で観察する方法
被検試料がGPIアンカー蛋白質の真菌表層での発現に影響を与えるか否かは、真菌細胞壁の構造を電子顕微鏡により観察することにより検定が可能である。
被検試料の存在下で、真菌例えばC. albicansを、一定時間例えば30℃で48時間培養し、透過型電子顕微鏡を用いて超微形態学的構造を観察する。ここで、透過型電子顕微鏡による観察は、例えば電子顕微鏡チャートマニュアル（医学出版センター）に記載の方法により行うことができる。透過型電子顕微鏡像で見られる、電子密度の高い菌体最外層の綿状線維構造は、GPIアンカー蛋白質を構成成分とする表層糖蛋白質層であると考えられ、既存の他の抗真菌剤では影響を受けない。無処置菌体と比較し、この電子密度の高い菌体最外層の綿状線維構造が、僅かな高電子密度の層を残して消失している場合は、該被検試料が、GPIアンカー蛋白質の細胞壁への輸送過程に影響を与えたと判断される。
また透過型電子顕微鏡に併せ、光学顕微鏡下による観察で、真菌細胞が大きく膨化し出芽（分裂）が阻害されている像が観察される場合、該被検試料が細胞壁に対して影響を与えていると判断される。
式(Ｉ）
(式中の記号は前記定義に同意義を意味する。）で表わされる本発明化合物は、これまでに知られている通常の有機化学反応などを利用して合成することができるが、例えば以下の方法で合成することができる。
一般製造方法（１）
(式中、Xはハロゲン基、アシル基などの脱離基を表す。R3cは、R3aと同意義を示す。式中のその他の記号は前記定義と同意義を意味する。）
A1工程 ライセルト(Reissert）化合物（V）を製造する反応である。Org. Synth., VI, 115(1988)、Heterocycles, 36(11), 2489(1993)、J. Chem. Soc. (C), 666(1969)、またはJ. Heterocycl. Chem., 29(5), 1165(1992)などの文献に記載の反応条件に基づいて製造することができる。用いる試薬としては具体的には、例えばベンゾイルクロリドとシアン化カリウムの組み合わせの条件等があげられる。
A2工程 アルキル化の工程である。化合物(V)と置換基を有するベンジルハライド誘導体や置換基を有するベンジルメタンスルフォナート誘導体などと塩基存在下反応させることにより化合物(VI)を製造することができる。塩基としては具体的には、例えば水素化ナトリウム、水酸化ナトリウムなどを挙げることができる。
A3工程 加水分解反応の工程である。化合物(VI)を塩基存在下、加水分解することにより化合物(I)を製造することができる。
A法とは、A1工程、A2工程そしてA3工程を経由して化合物(I)を製造する方法である。
B1工程 化合物(V)から化合物(VII)への工程である。化合物(V)と置換基を有するベンズアルデヒドを塩基と相間移動触媒の存在下、反応させることにより化合物(VII)を製造することができる。例えば、塩基としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどが挙げられる。相間移動触媒としては、トリエチルベンジルアンモニウムクロリドなどが挙げられる。
B2工程 アルコールからケトンへの酸化の工程である。アルコールからケトンへの酸化反応で一般に用いられる酸化剤、条件を用いることによりケトン体(VIII)を製造することができる。酸化剤としては具体的には、例えば二酸化マンガン、二酸化クロムまたはベンゾキノンなどが挙げられる。
B3工程 ケトンからメチレンへの還元の工程である。ケトン体(VIII)からメチレン体(I)への還元反応で一般に用いられる還元剤の条件を用いることによりメチレン体(I)を製造することができる。例えば、還元剤としては、ヒドラジン水和物と水酸化ナトリウムあるいは水酸化カリウム、トリエチルシランとボロントリフルオライドあるいはトリフルオロメタンスルフォン酸などが挙げられる。
B法とは、A1工程、B1工程、B2工程そしてB3工程を経由して化合物(I)を製造する方法である。
C1工程 水酸基のハロゲン化あるいはアシル化の工程である。化合物(VII)をハロゲン化剤あるいはアシル化剤を用いて化合物(IX)を製造することができる。ハロゲン化剤としては、例えば塩化チオニル、濃塩酸、三臭化リンなどがあげられる。また、アシル化剤としては、例えばアセチルクロリドなどの酸ハライド、無水酢酸などの酸無水物などが挙げられる。
C2工程 ハロゲン基あるいはアシル基の還元的脱離反応の工程である。化合物(IX)を触媒などを用いて水素化脱離することにより化合物(I)を製造することができる。
例えば、触媒としては、パラジウム−炭素などが挙げられる。
C法とは、A1工程、B1工程、C1工程そしてC2工程を経由して化合物(I)を製造する方法である。
一般製造方法（２）
一般式(Ｉ)で表わされる本発明化合物は、以下の方法でも合成することができる。
(式中、Xはハロゲン基、アシル基などの脱離基を表す。式中のその他の記号は前記定義と同意義を意味する。）
D1工程 グリニャール反応とそれに続く酸加水分解反応の工程である。化合物(X)と置換基を有していてもよいフェニルグリニャール試薬を反応させ、続いて酸存在下加水分解することにより化合物(VIII)を製造することができる。
D2工程 B3工程と同様な条件により、ケトン体(VIII)からメチレン体(I) を製造することができる。
D法とは、D1工程とD2工程を経由して化合物(I)を製造する方法である。
E1工程 ケトンからアルコールへの還元反応の工程である。ケトンからアルコールへの還元反応で一般に用いられる還元剤、条件を用いて化合物(VIII)から化合物(VII)を製造することができる。用いる還元剤としては具体的には、例えば水素化ホウ素ナトリウム、水素化アルミニウムリチウムなどが挙げられる。
E2工程 C1工程と同様な条件により、アルコール体(VII)からハロゲン化あるいはアシル化体(IX)を製造することができる。
E3工程 C2工程と同様な還元的脱離反応の条件で、化合物(IX)から化合物(I)を製造することができる。
E法とは、D1工程、E1工程、E2工程そしてE3工程を経由して化合物(I)を製造する方法である。
一般製造方法（３）
一般式(Ｉ)で表わされる本発明化合物は、以下の方法でも合成することができる。
(式中の記号は前記定義に同意義を意味する。）
F1工程 塩素化反応の工程である。化合物(XI)を塩素化剤用いることにより化合物(XII)を製造することができる。塩素化剤としては、例えばオキシ塩化リン、塩化チオニルなどが挙げられる。
F2工程 グリニャール試薬とのカップリング反応の工程である。Arch. Pharm, 314, 156(1981)などの文献に記載の反応条件に基づいて、化合物(XII)に置換基を有していても良いベンジルグリニャール試薬を触媒存在下反応させることにより化合物(I)を製造することができる。触媒としては、例えば、[1,1'-ビス(ジフェニルホスフィノ)フェロセン]ジクロロニッケル(II)などが挙げられる。
F法とは、F1工程とF2工程を経由して化合物(I)を製造する方法である。
一般製造方法（４）
本発明化合物、一般式(Ｉ)のうち、R1aとR2aが一緒になってベンゼン環、ピリジン環、ピロール環、チオフェン環、フラン環、シクロヘキサン環、またはシクロペンタン環などの縮合環を形成する場合、以下の方法で合成することができる。
(式中の記号は前記定義に同意義を意味する。)
製造方法の例としてイソキノリン環を形成する場合の製造方法を示す。
G1工程 縮合反応とそれに続く還元反応の工程である。置換基を有していてもよいベンズアルデヒド誘導体(XIII)とニトロメタンとの縮合反応後、ニトロ基の還元を行うことにより化合物(XIV)を製造することができる。例えば、ニトロ基の還元に用いられる試薬としては、パラジウム−炭素とギ酸アンモニウム、水素化アルミニウムリチウムなどの組み合わせが挙げられる。
G2工程 アミド結合形成反応である。化合物(XIV)と置換基を有していても良いフェニル酢酸クロリドをアミド結合生成反応に用いるカップリング試薬を用いることにより化合物(XV)を製造することができる。例えば、N,N’-ジシクロヘキシルカルボジイミドとN-ヒドロキシスクシンイミド、N,N’-ジシクロヘキシルカルボジイミドとN-ヒドロキシベンゾトリアゾール、1,1’-カルボニルジイミダゾールなどが挙げられる。
G3工程 環化反応の工程である。化合物(XV)をOrganic Reaction, 6, 74(1951)、J. Hetetocyclic Chem., 30, 1581(1993)などの文献に記載の反応条件に基づいて、製造することができる。例えば、試薬としてはオキシ塩化リン、ポリリン酸などが挙げられる。
G法とは、G1工程、G2工程そしてG3工程を経由して化合物(I)を製造する方法である。
一般製造方法（５−１）
前記の一般製造方法で合成した化合物(Ｉ)のR3a、R4aの置換基変換
（５−１）アミノ基、アミド基、スルホンアミド基等への置換基の変換
(式中の記号は前記定義に同意義を意味する。)
H1工程 ニトロ基の還元反応である。化合物(XVI)を一般的に利用されるニトロ基の還元法で還元することにより化合物(XVII)を製造することができる。例えば、ニトロ基の還元法としては、パラジウム−炭素、水酸化パラジウムよる接触水素化還元、鉄―塩化アンモニウム、鉄―塩酸、鉄―酢酸などによる還元が挙げられる。
H2工程 アシル化あるいはスルフォニル化反応の工程である。化合物(XVII)を酸クロリドあるいは酸無水物を用いることにより化合物(XVIII)を製造することができる。
H法とは、H1工程とH2工程を経由して化合物(XVIII)を製造する方法である。
(式中の記号は前記定義に同意義を意味する。）
I1工程 還元的アミノ化反応の工程である。化合物(XIX)と置換基を有していても良いアルデヒドをJ. Am. Chem. Soc., 93, 2897(1971)、Comprehensive Organic Synthese, 8, 25(1991)、Tetrahedron, 40, 1783(1984)そしてTetrahedron, 41, 5307(1985)などの文献に記載の反応条件に基づいて、化合物(XX)を製造することができる。例えば、還元的アミノ化試薬としては、トリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム、シアン水素化ホウ素ナトリウム、ボラン-ピリジン錯体、パラジウム-炭素／水素等が挙げられる。
I2工程 アシル化、スルフォニル化あるいは還元的アミノ化反応の工程である。化合物(XX)を酸クロリドあるいは酸無水物を用いることにより化合物(XXIa)あるいは化合物(XXIb)を製造することができる。または、還元的アミノ化反応をI1工程と同様に行うことにより化合物(XXIc)を製造することができる。
I法とは、I1工程とI2工程を経由することにより化合物(XXIa)、化合物(XXIb)あるいは化合物(XXIc)を製造する方法である。
一般製造方法（５−２）
前記の一般製造方法で合成した化合物(Ｉ)のR3a、R4aの置換基変換
（５−２）水酸基、アルコキシ基等への置換基の変換
(式中の記号は前記定義に同意義を意味する。)
J1工程 脱メチル化反応で、Bull. Chem. Soc. Jpn., 44, 1986(1971)、Org. Synth., Collect. Vol. V, 412(1073)、J. Am. Chem. Soc., 78, 1380(1956)、またはJ. Org. Chem., 42, 2761(1977)などの文献に記載の反応条件に基づいて、化合物(XXII)から化合物(XXIII)を製造することができる。例えば、脱メチル化反応に使用される試薬としては、47%臭化水素酸水溶液、ボロントリブロミド、ピリジン塩酸塩そしてヨードトリメチルシランなどが挙げられる。
J2工程 アルキル化反応の工程である。化合物(XXIII)を塩基存在下置換基されていても良いアルキルハライドあるいは置換基されていてもよいアルキルメタンスルフォネートなどと反応させることにより化合物(XXIV)を製造することができる。
J法とは、J1工程とJ2工程を経由して化合物(XXIV)を製造する方法である。
一般製造方法（５−３）
前記の一般製造方法で合成した化合物(Ｉ)のR3a、R4aの置換基変換
（５−３）ビニレン基またはエチニレン基、アルキル基等への置換基の変換
(式中の記号は前記定義に同意義を意味する。）
K1工程 トリフラート化反応の工程である。化合物(XXIII)を塩基存在下トリフルオロメタンスルフォン酸無水物と反応させることにより化合物(XXV)を製造することができる。
K2工程 アルキンとのカップリング反応の工程である。化合物(XXV)とアルキン誘導体をパラジウムのホスフィン錯体、ヨウ化銅そして塩基存在下、カップリングすることにより化合物(XXVI)を製造することができる。例えば、パラジウムのホスフィン錯体を系中で生成させる試薬としては、パラジウム−炭素とトリフェニルホスフィン、テトラキストリフェニルホスフィンパラジウム(0)とトリフェニルホスフィン、ジクロロビストリフェニルホスフィンパラジウム(II)、酢酸パラジウム(II)とトリ（ο-トリル）ホスフィン、酢酸パラジウム(II)と1,1’-ビス(ジフェニルフォスフィノ)フェロセンなどが挙げられる。塩基としては、トリエチルアミン、ピペリジン、ピリジン、炭酸カリウムなどが挙げられる。反応により塩化リチウムを使用することがある。
K3工程 不飽和炭化水素の還元反応の工程である。化合物(XXVI)を触媒を用いた接触水素化還元などにより化合物(XXVIIa)あるいは化合物(XXVIIb)を製造する方法である。例えば、触媒として用いられるものとしてはパラジウム−炭素、水酸化パラジウム、酸化白金、パラジウム−炭素―炭酸カルシウムなどが挙げられる。
(式中の記号は前記定義に同意義を意味する。)
L1工程 アルケンとのカップリング反応（ヘック（Heck）反応）の工程である。J. Org. Chem., 37, 2320(1972)、Org. Reactions., 27, 345(1982)、Comprehensive Organic Synthesis, Vol. 4, 833(1991)、Palladium Reagents and Catalysts, 125(1995)、Chem. Commun., 1287(1984)、Tetrahedron Lett, 26, 2667(1985)そしてTetrahedron Lett, 31, 2463(1990)などの文献に記載の反応条件に基づいて、触媒（パラジウム錯体と配位子など）を用いて、化合物(XXVIII)から化合物(XXVIIa)を製造することができる。この反応に用いる触媒（パラジウム錯体と配位子）の組み合わせとしては、例えば酢酸パラジウム(II)と1,1’-ビス(ジフェニルフォスフィノ)フェロセン、酢酸パラジウム(II)とトリ(ο-トリル)フォスフィンなどが挙げられる。用いられる3級塩基としてはトリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミンそして1,8-ジアザビシクロ[5.4.0]-7-ウンデセンなどが挙げられる。化合物(XXVIII)のXは脱離基を意味し、例えばハロゲン基、トリフルオロメタンスルフォニルオキシ基などを挙げることができる。
L2工程 K3工程と同様な不飽和炭化水素の還元反応の条件により、化合物(XXVIIa)から化合物(XXVIIb)を製造することができる。
L法とは、L1工程により化合物(XXVIIa)、続いてL2工程により化合物(XXVIIb)を製造する方法である。
本発明にかかる前記式（Ｉ）で表わされる化合物について得られる種々の異性体は、通常の分離手段（例えば再結晶、クロマトグラフィー等）を用いることにより精製し、単離することができる。
本発明にかかる化合物もしくはその塩またはそれらの水和物は、それ自体を哺乳動物（好ましくはヒト）に投与することもできるが、慣用されている方法により錠剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、被覆錠剤、カプセル剤、シロップ剤、トローチ剤、吸入剤、坐剤、注射剤、軟膏剤、眼軟膏剤、点眼剤、点鼻剤、点耳剤、パップ剤、ローション剤等として製剤化して投与することもできる。製剤化には通常用いられる製剤化助剤（例えば賦形剤、結合剤、滑沢剤、着色剤、矯味矯臭剤や、および必要により安定化剤、乳化剤、吸収促進剤、界面活性剤、ｐＨ調製剤、防腐剤、抗酸化剤など）を使用することができ、一般に医薬品製剤の原料として用いられる成分を配合して常法により製剤化される。例えば経口製剤を製造するには、本発明にかかる化合物またはその薬理学的に許容される塩と賦形剤、さらに必要に応じて結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味矯臭剤などを加えた後、常法により散剤、細粒剤、顆粒剤、錠剤、被覆錠剤、カプセル剤等とする。これらの成分としては例えば、大豆油、牛脂、合成グリセライド等の動植物油；流動パラフィン、スクワラン、固形パラフィン等の炭化水素；ミリスチン酸オクチルドデシル、ミリスチン酸イソプロピル等のエステル油；セトステアリルアルコール、ベヘニルアルコール等の高級アルコール；シリコン樹脂；シリコン油；ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン硬化ひまし油、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロックコポリマー等の界面活性剤；ヒドロキシエチルセルロース、ポリアクリル酸、カルボキシビニルポリマー、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、メチルセルロースなどの水溶性高分子；エタノール、イソプロパノールなどの低級アルコール；グリセリン、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、ソルビトールなどの多価アルコール；グルコース、ショ糖などの糖；無水ケイ酸、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、ケイ酸アルミニウムなどの無機粉体、精製水などがあげられる。賦形剤としては、例えば乳糖、コーンスターチ、白糖、ブドウ糖、マンニトール、ソルビット、結晶セルロース、二酸化ケイ素などが、結合剤としては、例えばポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、メチルセルロース、エチルセルロース、アラビアゴム、トラガント、ゼラチン、シェラック、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリプロピレングリコール・ポリオキシエチレン・ブロックポリマー、メグルミンなどが、崩壊剤としては、例えば澱粉、寒天、ゼラチン末、結晶セルロース、炭酸カルシウム、炭酸水素ナトリウム、クエン酸カルシウム、デキストリン、ペクチン、カルボキシメチルセルロース・カルシウム等が、滑沢剤としては、例えばステアリン酸マグネシウム、タルク、ポリエチレングリコール、シリカ、硬化植物油等が、着色剤としては医薬品に添加することが許可されているものが、矯味矯臭剤としては、ココア末、ハッカ脳、芳香散、ハッカ油、竜脳、桂皮末等が用いられる。これらの錠剤・顆粒剤には糖衣、その他必要により適宜コーティングすることはもちろん差支えない。また、シロップ剤や注射用製剤等の液剤を製造する際には、本発明にかかる化合物またはその薬理学的に許容される塩にpH調整剤、溶解剤、等張化剤などと、必要に応じて溶解補助剤、安定化剤などを加えて、常法により製剤化する。外用剤を製造する際の方法は限定されず、常法により製造することができる。すなわち製剤化にあたり使用する基剤原料としては、医薬品、医薬部外品、化粧品等に通常使用される各種原料を用いることが可能である。使用する基剤原料として具体的には、例えば動植物油、鉱物油、エステル油、ワックス類、高級アルコール類、脂肪酸類、シリコン油、界面活性剤、リン脂質類、アルコール類、多価アルコール類、水溶性高分子類、粘土鉱物類、精製水などの原料が挙げられ、さらに必要に応じ、pH調整剤、抗酸化剤、キレート剤、防腐防黴剤、着色料、香料などを添加することができるが、本発明にかかる外用剤の基剤原料はこれらに限定されない。また必要に応じて分化誘導作用を有する成分、血流促進剤、殺菌剤、消炎剤、細胞賦活剤、ビタミン類、アミノ酸、保湿剤、角質溶解剤等の成分を配合することもできる。なお上記基剤原料の添加量は、通常外用剤の製造にあたり設定される濃度になる量である。
本発明にかかる化合物もしくはその塩またはそれらの水和物を投与する場合、その形態は特に限定されず、通常用いられる方法により経口投与でも非経口投与でもよい。例えば錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、シロップ剤、トローチ剤、吸入剤、坐剤、注射剤、軟膏剤、眼軟膏剤、点眼剤、点鼻剤、点耳剤、パップ剤、ローション剤などの剤として製剤化し、投与することができる。本発明にかかる医薬の投与量は、症状の程度、年齢、性別、体重、投与形態・塩の種類、疾患の具体的な種類等に応じて適宜選ぶことができる。
本発明にかかる抗真菌剤は、患者に対して治効量投与される。ここで「治効量」とは、意図される薬理学的結果を生じさせ、処置されるべき患者の症状を回復または軽減するために有効な薬剤の量である。投与量は、患者の体重、疾患の種類、症状の程度、患者の年齢、性差、薬剤に対する感受性差などにより著しく異なるが、通常成人として１日あたり、約0.03-1000 mg、好ましくは0.1-500 mg、さらに好ましくは0.1-100 mgを１日１−数回、または数日に１−数回に分けて投与する。注射剤の場合は、通常約1μｇ/kg-3000μｇ/kgであり、好ましくは約3μｇ/kg-1000μｇ/kgである。
[実施例Ａ]
以下の実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を制限するものではない。
実施例Ａ１ レポータ遺伝子の構築とS. cerevisiaeへの導入
(1).リゾチームをレポータ酵素とするレポータ遺伝子の構築
ENO1プロモーター＋分泌シグナル＋リゾチーム遺伝子を含むプラスミドpESH（Ichikawa K et al, Biosci. Biotech. Biochem., 57(10), 1686-1690, 1993）を鋳型に、配列番号８及び配列番号９に記載のオリゴヌクレオチドをプライマーとして、プロモータ配列を含むリゾチーム遺伝子をPCRにより増幅し、pCR-Script SK(+)のSalI-EcoRI siteにサブクローニングした(a)。また、S. cerevisiae染色体DNAを鋳型に、配列番号１０及び配列番号１１に記載のオリゴヌクレオチドをプライマーとしてCWP2遺伝子をPCR増幅し、pUC19のEcoRI-HindIII siteにサブクローニングした(b)。同様に、pYES2（INVITROGEN）を鋳型に、配列番号１２及び配列番号１３に記載のオリゴヌクレオチドをプライマーとしてしてCYC1ターミネーターをPCR増幅し、pUC19の新たに導入したNotI-KpnI siteサブクローニングした(c)。
次に、pESHのSalI-HindIII切断部分にSalI-EcoRIで切り出したリゾチーム遺伝子(a)およびEcoRI-HindIIIで切り出したCWP2遺伝子(b)を挿入した。最後に、ENO1プロモーター＋分泌シグナル＋リゾチーム遺伝子＋CWP2遺伝子を含む遺伝子をBamHI-HindIIIで切り出し、インテグレーション用ベクターpRS306（Sikorski RS et al, Genetics. 122(1):19-27, 1989）に挿入後、HindIII-KpnI切断部分にHindIII-KpnIで切り出したCYC1ターミネーター(c)を挿入し、pRLW63Tを作製した。
(2).セファロスポリナーゼをレポータ酵素とするレポータ遺伝子の構築
上述のpESHを鋳型にして、ENO1プロモーターＣ末＋分泌シグナル部分(d)を鋳型にし、配列番号１４及び配列番号１５に記載のオリゴヌクレオチドをプライマーとして、プロモータ配列・分泌シグナル部分を含むDNAをPCRにより増幅し、pUC19の新たに導入したBamHI-NotI siteににサブクローニングした(d)。また、Citrobacter freundii染色体DNAを鋳型にし、配列番号１６及び配列番号１７に記載のオリゴヌクレオチドをプライマーとして、セファロスポリナーゼ遺伝子をPCR増幅し、pUC19の新たに導入したNspV-XbaI siteにサブクローニングした(e)。同様にS. cerevisiae染色体DNAを鋳型にし、配列番号１８及び配列番号１９に記載のオリゴヌクレオチドをプライマーとして、CWP2遺伝子PCR増幅し、pUC19のXbaI-HindIII siteにサブクローニングした(f)。
(d)を挿入したプラスミドのBamHI-SalI切断部分にpESHのBamHI-SalI断片を挿入し、ENO1プロモーター全長＋分泌シグナル部分を作製後、NspV-HindIII切断部分にNspV-XbaIで切り出したセファロスポリナーゼ遺伝子およびXbaI-HindIIIで切り出したCWP2遺伝子を挿入した。次いで、EcoRI-HindIIIで切り出し、上述のpRS306に挿入後、HindIII-KpnI切断部分にCYC1ターミネーターを挿入して、pRCW63Tを作製した。
(3).レポータ遺伝子のS. cerevisiaeへの導入
S. cerevisiae G2-10株を、10 mlのYPD培地にて30℃で振とう培養し、対数増殖後期(2〜5 x 107 cells/ml)の時点で集菌した。滅菌水で洗浄後、YEASTMAKERTM Yeast Transformation System(Clontech)を用いた酢酸リチウム法（YEASTMAKERTM Yeast Transformation System User Manualに記載）によって上述したpRLW63TおよびをpRCW63Tを導入した。pRLW63TはEcoRVで、pRCW63TはApaIでURA3遺伝子を切断したものを用いた。SD(Ura-)培地で30℃、3日間培養後、増殖したコロニーをYPD培地で培養した。
リゾチームおよびセファロスポリナーゼ活性の局在を確認したところ、両活性共に主として細胞壁に局在し、CWP2のC端配列が細胞壁への輸送シグナルとして働いていることが確認された。
実施例Ａ２ S. cerevisiaeレポータ系による薬剤のスクリーニング
リゾチームと比較して、セファロスポリナーゼの方が酵素反応の感度が良いことから、化合物のスクリーニングには、pRCW63Tを導入したS. cerevisiae（S. cerevisiae CW63株）を用いた。
YPD液体培地に30℃、48時間静置培養後、YPD液体培地で100倍希釈した菌液（3〜5 x 105 cells/ml）75μl/wellを、被検試料希釈液25μl/wellが入ったＶ底96 wellプレートに接種し、30℃で48時間静置培養した。プレートを遠心後、上清25μlを96 well平底プレートにサンプリングし、培養上清画分とした。
沈殿した菌を懸濁し、2.4 Mソルビトールで調整したザイモリエース（生化学工業）溶液75μl/wellを加え、30℃、1時間作用させた。プレートを遠心後、上清10μlを96 well平底プレートにサンプリングし、15μlのリン酸バッファーを加え、細胞壁画分とした。
プールしたサンプルに200μMニトロセフィン溶液を加え、一定時間後にクエン酸バッファーで反応停止後、490 nmの吸光度を測定することにより、培地および細胞壁画分中のセファロスポリナーゼ活性を測定した。
また、被検試料存在下での菌の増殖は、肉眼による観察で判定した。
図２には、前記式（Ｉａ）に記載の化合物の存在下では、0.39〜1.56μg/mlの濃度で培養上清画分中のセファロスポリナーゼ活性が上昇し、細胞壁画分中の活性が低下することを示した。この様に、培養上清画分中のセファロスポリナーゼ活性を上昇させ、かつ細胞壁画分中のセファロスポリナーゼ活性を減少させる化合物を、GPIアンカー蛋白質の細胞壁への輸送過程を阻害する化合物とした。
実施例Ａ３ カンジダの動物細胞への付着を指標とした薬剤のスクリーニング
6穴マルチウェルプレートの各穴に、10%牛胎児血清および2 mMグルタミンを含むD-MEM培地（日水製薬）で1 x 105個/mlに調整したIEC-18細胞を、3 mlずつ分注した。該プレートを炭酸ガスインキュベータ内で37℃、3日間培養後、培養上清を除去し、エタノール固定した。
各濃度の被検試料を含有したサブロー・デキストロース液体培地で30℃・48時間培養したC. albicansを4 x 102個/mlに調整し、固定したIEC-18細胞を培養したプレートの各穴に、1 ml接種した。30℃・1時間培養後、培養上清を除去し、PBSで洗浄後、サブロー・デキストロース寒天培地（Difco）を2 ml重層した。30℃、一夜培養後、増殖してきたコロニー数（CFU）をカウントし、付着率を算出した。
図３には前記式（Ｉａ）に記載の化合物で、増殖抑制の見られない1.56μg/mlの濃度でも、C. albicansの動物細胞への付着が半分程度にまで抑制されたことを示した。処理しないC.albicansと比較して、細胞に付着したCFUを減少させた被検試料を、C.albicansの動物細胞への付着を抑制する化合物とした。
実施例Ａ４ ELISAによるGPIアンカー蛋白質の定量値を指標とした薬剤のスクリーニング
(1).抗Als1pペプチド抗体の作製
配列番号２０に記載の合成ペプチドをKLHとコンジュゲートし、家兎に免疫した。得られた抗血清をアフィニティ精製し、IgG画分を抗Als1pペプチド抗体とした。
(2).抗Als1pペプチド抗体を用いたELISAによる薬剤のスクリーニング
C. albicansを、各濃度の被検薬剤を含有したサブロー・デキストロース液体培地中（5 ml）で30℃・48時間培養し、遠心による集菌、洗浄後、300μlのトリス塩酸バッファーに懸濁した。懸濁した菌体を、ガラスビーズを入れたマイクロチューブに移し、1分間の攪拌、1分間の氷冷を10回繰り返すことにより破砕した。洗浄した破砕菌体を2% SDSで95℃・10分間抽出し、遠心後、沈殿をリン酸バッファーで5回洗浄した。その沈殿に5μg/mlのザイモリエース溶液0.5 mlを加え37℃・1時間反応後、その遠心上清をGPIアンカー蛋白質サンプルとした。
50μlの抗Als1pペプチド抗体(40μg/ml)を、96 wellプレートに4℃・overnightコーティングした。0.05% Tween 20含有PBS（PBST）で5回洗浄後、25%ブロックエースで室温、2時間ブロッキングした。PBSTで3回洗浄後、2倍階段希釈したGPIアンカー蛋白質サンプル50μlを室温、2時間反応させた。PBSTで5回洗浄後、1000倍希釈したHRP標識抗カンジダ抗体（ViroStat）100μlを室温、2時間反応させ、PBSTで5回洗浄後、基質溶液75μlを加えた。反応停止後、490 nmの吸光度を測定した。
図４には、前記式（Ｉａ）に記載の化合物の存在下では、0.1〜0.39μg/mlの濃度で、培養上清画分中のAls1p抗原量が上昇し、細胞壁画分中の抗原量が低下していることを示した。この様に、化合物で処理しないC.albicansと比較して、ELISAで定量した培養上清画分中のAls1p量細を上昇させ、あるいは胞壁画分中のAls1p量を減少させた化合物を、C.albicansのGPIアンカー蛋白質の細胞壁への輸送過程を阻害する化合物とした。
実施例Ａ５ 被検試料の存在下で培養したC. albicans細胞壁の電子顕微鏡による観察
各濃度の被検薬剤を含有したサブロー・デキストロース液体培地中（5 ml）で30℃・48時間培養後、遠心、集菌したC. albicansを過マンガン酸カリ固定法により固定し、透過型電子顕微鏡像を観察した。
菌体最外層に電子密度の高い綿状線維構造が観察され、GPIアンカー蛋白質を構成成分とする表層糖蛋白質層であると考えらた。この綿状線維構造は既存の他の抗真菌剤では影響を受けなかった。
前記式（Ｉａ）に記載の化合物の存在下で培養したC. albicansは、無処置菌体と比較し、電子密度の高い菌体最外層の綿状線維構造が、僅かな高電子密度の層を残して消失していた。この様に、電子密度の高い菌体最外層の綿状線維構造が消失している場合に、被検試料をGPIアンカー蛋白質の細胞壁への輸送過程に影響を与える化合物とした。
実施例Ａ６ S. cerevisiaeの前記式（Ｉａ）に記載の化合物に対する耐性遺伝子のスクリーニング
S. cerevisiae遺伝子のプラスミドライブラリーは、ATCC(Information for ATCC Number:37323)から入手した。
S. cerevisiae G2-10株を、10 mlのYPD培地にて30℃で振とう培養し、対数増殖後期(1〜2 x 107 cells/ml)の時点で集菌した。滅菌水で洗浄後、YEASTMAKERTM Yeast Transformation System(Clontech)を用いた酢酸リチウム法（YEASTMAKERTM Yeast Transformation System User Manualに記載）によって、S. cerevisiae遺伝子のプラスミドライブラリーを導入し、SD（Leu-）プレート上にに撒いて、約80000個のコロニーを得た。コロニーを回収・希釈し、前記式（Ｉａ）に記載の化合物を 1.56μg/ml及び3.125μg/mlの濃度で含むSD（Leu-）プレートに、プレート当たり57万コロニーになるように撒いた。その後、37℃で72時間インキュベートして耐性クローンを獲得した。
27個のクローンをピックアップし、METHODS IN ENZYMOLOGY, Vol. 194:169-182 (1991)に記載の方法によりプラスミドを回収して、インサートを解析したところ、27個全てが同一のフラグメントを含んでいた。
ABI377 system（PE apllied Biosystems社製）を用いて塩基配列を決定した結果、配列番号１に記載のDNAが、前記式（Ｉａ）に記載の化合物に対する耐性を付与するDNAであることが明らかとなりGWT1と命名した。
実施例Ａ７ S. cerevisiae GWT1遺伝子の、C. albicansホモログのサザンブロット解析
25μgのC. albicansゲノムDNAを、EcoRI（TaKaRa）、HindIII（TaKaRa）、BamHI（TOYOBO）、PstI（New England Biolabs）（２種類の酵素の組み合わせも含む）で16時間処理後、エタノール沈殿により濃縮し、25μlの滅菌水に溶解してサンプルとした。制限酵素消化した25μgのgenome DNAを、0.75％アガロースゲル電気泳動法により分離し、ナイロンメンブレン（GeneScreen PLUS /NEN）へトランスファーした。
プローブは、配列番号１に記載の約1.5 kbのDNAフラグメント20 ngを、ランダムプライマー法によりalpha33P-dCTPでラベルし、GeneQuantカラム（Amersham-Pharmacia）を用いて精製し作製した。
ハイブリダイゼーションは、メンブレンを、10 mlのPerfectHybTM（TOYOBO）溶液に浸し65℃で１時間プレインキュベーションをおこなった後、ラベルした上記プローブを添加し、65℃で更に2.5時間インキュベーションした。洗浄は、1).2 x SSC, 0.05% SDS溶液：25℃5分、2).2 x SSC, 0.05% SDS溶液：25℃15分、3).0.1 x SSC, 0.1% SDS溶液50℃20分で行った。洗浄後のメンブレンをサランラップで包み、Imaging Plate（FUJI）と室温で12時間接触させ、Imaging Plateに転写されたイメージをBAS2000（FUJI）を用いて取り込み、画像解析をおこなった。
その結果、EcoRIで6.5 kb、HindIIIで4.0 kb、EcoRI-HindIIIで2.0 kb、EcoRI-PstIで2.5 kbの単一のバンドが観察され（図５）、C. albicansの前記式（Ｉａ）に記載の化合物に対する耐性遺伝子のホモログは、単一の遺伝子として存在することが予想された。
実施例Ａ８ C. albicansの前記式（Ｉａ）に記載の化合物に対する耐性遺伝子のスクリーニング
C. albicansのゲノムライブラリーは、Navaro-Garcia F et al, Mol. Cell. Biol., 15:2197-2206, 1995に記載の方法により作製した。具体的には、C. albicansのゲノムDNAをSau3AIで部分消化した後、３〜５ kb前後のDNAフラグメントを回収し、YEp352シャトルベクターのBamHIサイトに挿入した。
S. cerevisiae G2-10株を、10 mlのYPD培地にて30℃で振とう培養し、対数増殖後期(2〜5 x 107 cells/ml)の時点で集菌した。滅菌水で洗浄後、YEASTMAKERTM Yeast Transformation System(Clontech)を用いた酢酸リチウム法（YEASTMAKERTM Yeast Transformation System User Manualに記載）によって、C. albicansのゲノムライブラリーを導入し、SD（Ura-）プレート上にに撒いて、約25000個のコロニーを得た。コロニーを回収・希釈し、前記式（Ｉａ）に記載の化合物を 1.56μg/mlの濃度で含むSDプレートに、プレート当たり50万コロニーになるように撒いた。その後、30℃で６時間、37℃へ移して66時間インキュベートして耐性クローンを獲得した。
30個のクローンをピックアップし、METHODS IN ENZYMOLOGY, Vol. 194:169-182 (1991)に記載の方法によりプラスミドを回収して、インサートを解析したところ、30個のうち28個が同一のフラグメントを含んでいた。
ABI377 system（PE apllied Biosystems社製）を用いて、塩基配列を決定した結果、配列番号３に記載のDNAが、前記式（Ｉａ）に記載の化合物に対する耐性を付与するDNAであることが明らかとなった。
実施例Ａ９ C. albicans臨床分離株からの前記式（Ｉａ）に記載の化合物に対する耐性遺伝子ホモログのクローニング
発明者らが保存するC. albicans臨床分離株より精製した、ゲノムDNAを鋳型とし、配列番号２１及び配列番号２２をプライマーとしてPCRによる増幅を行った。独立した３本のPCRサンプルから、いずれも約1.6 kbのDNAフラグメントが増幅され、増幅されたフラグメントを精製し、pT7-Blueベクター（Novagen）にサブクローニングして塩基配列を決定したところ、配列番号５に示すDNA配列が見いだされた。実施例Ａ７に記載のDNA（配列番号３）との間で３箇所の配列が異なっていた。
また、Stanford大のsequenceセンター(http://sequence-www.stanford.edu/)で決定されたC. albicans遺伝子塩基配列中にも、実施例Ａ７に記載のDNAのホモログが見出され（配列番号７）、実施例Ａ７に記載のDNA（配列番号３）との間で４箇所の配列が異なっていた。
実施例Ａ１０ GWT1遺伝子産物を過剰発現したS. cerevisiaeの作製
実施例Ａ６で得られた前記式（Ｉａ）に記載の化合物に対する耐性クローンより精製したプラスミドを鋳型とし、配列番号２３及び配列番号２４をプライマーとして、PCR増幅を行った。PvuIIで切断したPCR産物を、実施例Ａ1で作製したpRLW63TのSalI-HindIII切断部分に挿入した。BamHI-KpnIでインサート全体を切り出し、pRS304（Sikorski RS et al, Genetics. 122(1):19-27, 1989）のMCSに挿入し、インテグレーション用ベクターを作製した。
セファロスポリナーゼ遺伝子ををレポータ遺伝子として持つ、S. cerevisiae CW63株を実施例Ａ1に記載の方法で培養し、インテグレーション用ベクターのTRP1をEcoRVで切断後、実施例Ａ1に記載の方法で形質転換した。SD(Trp-)培地で30℃、3日間培養することによりGWT1過剰発現株を得た（S. cerevisiae CW63/GWT1株)。
GWT1過剰発現株は、前記式（Ｉａ）に記載の化合物に対して耐性を示す以外に、野生株との差異は見られず、他の抗真菌剤シクロヘキシミド、ベノミル、アンホテリシンＢに対して感受性であった。
実施例Ａ１1 GWT1遺伝子を欠失したS. cerevisiaeの作製
S. pombeのhis5遺伝子（Longtine MS et al, Yeast, 14:953-961, 1998）を鋳型とし、配列番号２５及び配列番号２６をプライマーとして、両端にGWT1配列を含むhis5カセットをPCRで増幅した。
S. cerevisiae G2-10を実施例Ａ1に記載の方法で培養、集菌し、上述のPCR産物を実施例Ａ1に記載の方法で形質転換した。SD(His-)培地で30℃、5〜7日間培養することによりGWT1欠失株を得た。
GWT1欠失株は生育が非常に遅いものの、その生育は前記式（Ｉａ）に記載の化合物の影響を受けず、GWT1遺伝子産物が該化合物の標的であることが示唆された。また、GWT1欠失株は、高温で生育できない、細胞が膨化しているといった特徴を示し、透過型電子顕微鏡による観察では、電子密度の高い菌体最外層の綿状線維構造が、消失していた。
実施例Ａ１２ GWT1遺伝子産物を過剰発現したS. cerevisiaeにおける前記式（Ｉａ）に記載の化合物の活性
S. cerevisiae CW63株及びGWT1遺伝子を導入したS. cerevisiae CW63/GWT1を用い、実施例Ａ2に記載した方法に準じた方法で、前記式（Ｉａ）に記載の化合物の活性を検討した。
その結果、S. cerevisiae CW63株では、培養上清画分中のセファロスポリナーゼ活性が上昇し、細胞壁画分中の活性が低下している前記式（Ｉａ）に記載の化合物濃度（0.39〜1.56μg/ml）でも、S. cerevisiae CW63/GWT1株では影響が見られず、またS. cerevisiae CW63株では増殖が抑制される前記式（Ｉａ）に記載の化合物濃度（> 3.13μg/ml）でも、S. cerevisiae CW63/GWT1株では増殖抑制が見られなかった（図６)。
実施例Ａ１３ (4-ブチルフェニル)(1-イソキノリル)ケトンの合成
窒素雰囲気下、マグネシウム338 mg（13.9ミリモル）とテトラヒドロフラン6.5 mlの混合溶液に、１−ブロモ−４−ブチルベンゼン2.29 ml（13.0ミリモル）と開始剤として触媒量の１，２−ジブロモエタンを加え、１０分間還流下撹拌した。この溶液を０℃まで冷却し、１−イソキノリンカルボニトリル1.0 g（6.49ミリモル）のテトラヒドロフラン溶液を加え、さらに室温で１時間、70℃で３時間撹拌した。その後、再度０℃に冷却し、濃塩酸2.56 mlそしてメタノール11 mlを加えた後、２時間加熱還流した。濃縮後残渣を５規定水酸化ナトリウムとトルエンに溶解し、セライトで濾過した。濾液のトルエン層を分配し、水洗、硫酸マグネシウムで乾燥、濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、表題化合物1.72 gを得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):0.93(3H, t), 1.32-1.43(2H, m), 1.58-1.66(2H, m), 2.68(2H, t), 7.28(2H, d), 7.61(1H, td), 7.74(1H, td), 7.80(1H, d), 7.87(2H, d), 7.92(1H, d), 8.20(1H, d), 8.60(1H, d)
実施例Ａ１４ 前記式（Ｉａ）に記載の化合物{1-(4-ブチルベンジル)イソキノリン}の合成
実施例Ａ１３の化合物1.72 g（5.95ミリモル）、ヒドラジン１水和物836 mg（16.7ミリモル）そして水酸化カリウム769 mg（13.7ミリモル）をジエチレングリコール8.5 mlに加え、80℃で１時間、160℃で３時間半そして200℃で１時間撹拌した。室温まで冷却後、氷水を加え酢酸エチルで抽出した。これを水洗後、硫酸マグネシウムで乾燥、濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、前記式（Ｉａ）に記載の化合物を914 mgを得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):0.89(3H, t), 1.26-1.36(2H, m), 1.50-1.59(2H, m), 2.53(2H, t), 4.64(2H, s), 7.06(2H, d), 7.19(2H, d), 7.53(1H, td), 7.56(1H, d), 7.64(1H, td), 7.81(1H, d), 8.18(1H, dd,), 8.50(1H, d)
実施例Ａ１５ 前記式（Ｉａ）に記載の化合物{1-(4-ブチルベンジル)イソキノリン}の製造方法の別法
６０％水素化ナトリウム16 mg（0.40ミリモル）のジメチルホルムアミド（1.8 ml）溶液に窒素雰囲気下−１６℃で、Org.Synth.,VI,115(1988)の文献に基づいて合成した1-シアノ-2-ベンゾイル-1,2-ジヒドロイソキノリン100 mg（0.38ミリモル）と４−n-ブチルベンジルクロリド70 mg（0.38ミリモル）のジメチルホルムアミド（3.6 ml）溶液を滴下し、さらに室温で30分間撹拌した。水を加え、濃縮し、残渣にトルエンと水を加えた。トルエン層を水洗後、炭酸カリウムで乾燥後、濃縮した。残渣のエタノール(1.6 ml)溶液に50%水酸化ナトリウム水溶液（0.63 ml）を加え、２時間加熱還流した。濃縮後、トルエンと水を加えた。トルエン層を水洗後、炭酸カルシウムで乾燥後、濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、前記式（Ｉａ）に記載の化合物18 mgを得た。
実施例Ａ１６ S. cereviciae GWT1遺伝子の、C. albicansホモログのクローニング
HindIII（TaKaRa）で16時間処理した25μgのC. albicansゲノムDNAを、0.75%アガロースゲル電気泳動法により分離し、約3.5から4.5 kbの大きさのDNAフラグメントをゲルから回収した。回収したDNAフラグメントをpKF3ベクター（TaKaRa）のHindIIIサイトに挿入して、カンジダゲノムライブラリを作製した。
作製したライブラリを用いて約１万個のコロニーをLB/Ampicillinプレートにdisplayした後、Colony/Plaque Screen（NEN）メンブレンを用いてコロニーリフトを行いハイブリダイゼーションに供した。プローブは、配列番号１に記載の約1.5 kbのDNAフラグメント20 ngを、ランダムプライマー法によりalpha33P-dCTPでラベルし、GeneQuantカラム（Amersham-Pharmacia）を用いて精製し作製した。
ハイブリダイゼーションは、メンブレンをPerfectHybTM（TOYOBO）溶液に浸し65℃で１時間プレインキュベーションをおこなった後、ラベルした上記プローブを添加し、65℃で更に2.5時間インキュベーションした。洗浄は、1).2 x SSC, 0.05% SDS溶液：25℃5分、2).2 x SSC, 0.05% SDS溶液：25℃15分、3).0.1 x SSC, 0.1% SDS溶液50℃20分で行った。洗浄後のメンブレンをサランラップで包み、X-RAY FILM（KONICA）に室温で24時間接触させた後現像した。感光したスポットに相当する大腸菌コロニーを分離して、２次スクリーニングに供した。分離したコロニーをLB/Ampicillinプレートに約200個づつdisplayし、１次スクリーニング同様にコロニーリフトをおこないハイブリダイゼーションに供した。ハイブリダイゼーションの条件は１次スクリーニングと同一の条件でおこなった。
その結果、プローブと強く反応する大腸菌の単一なコロニーが分離された。このコロニーからプラスミドを回収し、含有する配列を決定したところ、実施例Ａ９で見出された配列（配列番号５）と同一の新規配列が見いだされ（カンジダGWT1の配列）、C. albicansホモログであることが予想された。
実施例Ａ１７ S. cereviciae GWT1遺伝子の、S. Pombeホモログ
データベース検索により、S. cereviciae GWT1遺伝子とホモロジーを示すS. Pombe遺伝子（配列番号２７、及びその遺伝子産物のアミノ酸配列：配列番号２８)が見出され、GWT1のS. Pombeホモログであると考えられた。
実施例Ａ１８ S. cereviciae GWT1遺伝子の、Aspergillus fumigatusホモログのクローニング
発明者らは遺伝子配列解析により、S.cerevisiae，S.pombe，C.albicansのGWT1遺伝子のコードする蛋白において高度に保存されている領域を２カ所見いだした（図７）。この保存領域のアミノ酸をコードするDNAの予測から、配列番号２９、配列番号３０及び配列番号３１のプライマーを設計した。STRATAGENE社から購入したライブラリ（Aspergillus fumigatus cDNA library:#937053）1μlを鋳型に用いて、配列番号２９および配列番号３１のプライマーを用いてPCR増幅をおこなった。さらにこの増幅サンプル1μlを鋳型に、配列番号２９および配列番号３０のプライマーでnested-PCRをおこなった結果、約250 bpの単一フラグメントの増幅が確認された。このフラグメントの配列を決定したところ配列番号３２に示す、S.cerevisiaeのGWT1遺伝子と相同性を有する新規の配列が得られ、これがA.fumigatusのホモログであることが予想された。
全長のcDNAを獲得するために、増幅フラグメントの配列をもとに配列番号３３および配列番号３４のプライマーを設計した。また、ライブラリの遺伝子挿入部位の外側のプライマー配列番号３５および配列番号３６を設計した。A.fumigatus cDNAライブラリを鋳型にして、配列番号３３および配列番号３５のプライマーセット、または配列番号３４および配列番号３６のプライマーセットを用いてPCRをおこなった結果、両者から約1 kbのDNAフラグメントの増幅が確認された。これらのフラグメントの塩基配列を決定した結果、配列番号１に示すS.cerevisiaeのGWT1遺伝子と高い相同性を有する新規の配列が得られた。同配列はS.cerevisiae，S.pombe，C.albicansのGWT1遺伝子と全体を通じて高い相同性を有することから、この配列がA.fumigatusのホモログであることが強く示唆された。
A.fumigatusのホモログ全体をクローニングするために、得られた配列をもとに、開始コドン上流に相当する配列番号３７に示すプライマーおよび終止コドン下流に相当するプライマー配列番号３８を新たに設計した。A.fumigatus cDNAライブラリ（STRATAGENE社）およびA.fumigatusゲノムライブラリ（STRATAGENE社）を鋳型に、配列番号３７および配列番号３８のプライマーで３５サイクルのＰＣＲをおこなった結果、両方の鋳型から約1.6kbの単一な増幅フラグメントが検出された。このフラグメントの塩基配列をダイレクトシークエンスによって決定した結果、cDNAライブラリからは配列番号３９に示す塩基配列が見いだされ、配列番号４０に示す501アミノ酸からなる蛋白をコードしていることが示唆された。また、ゲノムライブラリからは配列番号４１に示す塩基配列が見いだされ、77塩基対からなるイントロンを１カ所有していることが判った。
実施例Ａ１９ S. cereviciae GWT1遺伝子の、Cryptococcusホモログのクローニング
1).データベースサーチ
データベースサーチによってS. cereviciae GWT1遺伝子と相同性のある遺伝子を検索した結果、スタンフォード大学のゲノムセンターのサーバー（http://baggage.stanford.edu/cgi-misc/cneoformans/）から、502042C05.x1の配列を見いだした。また、米国オクラホマ大学のサーバー（http://www.genome.ou.edu/cneo_blast.html）から、b6e06cn.f1の配列を見いだした。
2).ゲノムDNAを鋳型としたPCR
502042C05.x1の配列をもとに配列番号４２のプライマーを作製し、またb6e06cn.f1の配列をもとに配列番号４３のプライマーを作製した。クリプトコッカス（Cryptococcus neoformans）のゲノムDNAを鋳型にして、配列番号４２のプライマーおよび配列番号４３のプライマーを用いてPCR増幅を行ったところ、約2 kbの増幅フラグメントが検出された。このフラグメントの塩基配列を決定したところ、配列番号４４に示す、S. cerevisiaeのGWT1遺伝子と相同性を有する新規の配列が得られた。
クリプトコッカスGWT1遺伝子の開始コドン上流の配列を獲得するために、502042C05.x1の配列をもとに配列番号４５のプライマーを設計し、また配列番号４４の配列をもとに配列番号４６のプライマーを設計した。クリプトコッカスのゲノムDNAを鋳型にして、配列番号４５のプライマーおよび配列番号４６のプライマーを用いてPCR増幅を行ったところ、約500 bpの増幅フラグメントが検出された。このフラグメントの塩基配列を決定したところ、配列番号４７に示す配列が得られ、配列番号４４とオーバーラップすることが判った。
3).3'-RACE
クリプトコッカスGWT1遺伝子の3'末端の配列を得るために、3'-RACEをおこなった。クリプトコッカスから抽出した16μgのtotal RNAをもとに配列番号４８で示すadaptor-primerでプライミングし、SuperScript II Reverse Transcriptase（GIBCO/BRL社製）を用いて逆転写反応をおこない、以降のRT-PCRの鋳型となる１本鎖cDNAを作製した。１本鎖cDNAを鋳型に、配列番号４９および配列番号５０に示すプライマーで35サイクルのPCRをおこなった結果、約1.2 kbの増幅フラグメントが検出された。このフラグメントの塩基配列をDirect-Sequence法によって解析したところ、配列番号５１に示す、S.cerevisiaeのGWT1遺伝子と相同性を有する新規の配列が得られた。
4).全長ゲノムDNAのPCR
配列番号４７をもとに設計した配列番号５２のプライマーおよび、配列番号５１をもとに設計した配列番号５３のプライマーを用いて、クリプトコッカスのゲノムDNAを鋳型に独立した3本のpreparationで35サイクルのPCRをおこなった。その結果、独立した3本のtubeからはいずれも約2 kbの増幅フラグメントが検出されたので、それぞれ個別にDirect-Sequenceに供し、全塩基配列を決定した。その結果、3つの独立した配列は完全に一致し、配列番号５４に示すクリプトコッカスのGWT1遺伝子ホモログ全長を含む配列が得られた。
5).cDNA配列の決定
配列番号５４に示すゲノム由来のクリプトコッカスGWT1遺伝子配列を、3'-RACEによって得られたcDNA配列５１と比較することにより、２カ所のイントロンの存在が示唆された。また、開始ATG以降のOpen Reading Frame が通っていないことから、さらにもう１カ所のイントロンの存在が示唆された。そこで、予想されるアミノ酸配列およびスプライシング・ドナー/アクセプター配列から、cDNA構造を予測し、エクソン間のジャンクションと予想される部位に、配列番号５５および配列番号５６で示すプライマーを設計した。クリプトコッカス由来の一本鎖cDNAをテンプレートに上記プライマーを用いて35サイクルのPCRをおこなった結果、約1.4 kbの増幅フラグメントが確認された。同フラグメントをDirect-Sequenceに供し塩基配列の決定をおこなった結果、配列番号５７に示す配列が得られ、配列番号５４と照合することにより、クリプトコッカスのGWT1遺伝子のcDNA配列が配列番号５８に示す構造であることが示唆された。同配列はS.cerevisiae，S.pombe，C.albicans，A.fumigatusのGWT1遺伝子と部分的に高い相同性を有することから、この配列がクリプトコッカスのホモログであることが強く示唆された。
実施例Ａ２０ 前記式（Ｉａ）で表される化合物に対し耐性を付与する遺伝子変異
pRLW63Tを導入することによりリゾチーム遺伝子をレポータ遺伝子として持つ、S. cerevisiae LW63株をメタンスルホン酸エチルで処理した後、前記式（Ｉａ）で表される化合物を1.56, 3.13, 6.25μg/mlの濃度で含むSD培地で37℃、３日間培養することにより耐性変異株を５株得た(R1〜R5)。この内、R1変異株およびR5変異株は、一遺伝子変異により前記式（Ｉａ）で表される化合物に対する特異的な耐性形質を獲得していることがわかった。この２つの突然変異株がGWT1遺伝子上に変異を持っているかどうかを確かめるために、両変異株からゲノムDNAを抽出し、GWT1遺伝子部分について塩基配列決定を行った。この結果、R1変異株では1213番目のグアニンがアデニンに変異していた。またR5変異株では418番目のグアニンからアデニンに変異していた。これによりR1変異株では405番目のアミノ酸であるイソロイシンがバリンに、またR5変異株では140番目のアミノ酸であるグリシンがアルギニンに変わっていることが判明した。
次にこれらの変異が前記式（Ｉａ）で表される化合物に対する特異的な耐性形質獲得の原因となっているかを確かめるために、両変異株由来ゲノムDNAを鋳型として配列番号６０及び６１に記載のプライマーを用いて変異GWT1遺伝子（R1またはR5）を単離した。同時にGWT1のプロモータ領域（配列番号６２）、およびターミネーター領域（配列番号６３）を単離し、GWT1遺伝子プロモータ、変異GWT1遺伝子ORF、およびGWT1遺伝子ターミネーターをpRS316ベクターに挿入して、変異GWT1遺伝子を１コピー発現するプラスミドを構築した(pRS316GWT1-R1, pRS316GWT1-R5)。これをGWT1遺伝子が１コピーのみ破壊されている２倍体株(WDG1)に導入した。このコロニーを胞子形成培地上で培養することにより胞子を形成させ、四分子分析を行うことにより、上記プラスミドを持ち、かつ染色体上のGWT1遺伝子が破壊されているクローンを得た。これを前記式（Ｉａ）で表される化合物を含む培地で培養したところ、もとのR1変異株、R5変異株と同様に、前記式（Ｉａ）で表される化合物に対して耐性を示した。以上のことから、GWT1遺伝子上に起こったアミノ酸変異を伴う点突然変異により前記式（Ｉａ）で表される化合物に対する特異的な耐性形質が付与されることが明らかとなり、この化合物がGWT1タンパク質に直接結合してその機能を阻害していることが強く示唆された。
[実施例Ｂ]
本発明にかかる化合物は、例えば以下の実施例に記載した方法により製造することができる。ただし、これらは例示的なものであって、本発明にかかる化合物は如何なる場合も以下の具体例に制限されるものではない。
実施例Ｂ１
1-（クロロメチル）-4-n-ブチルベンゼン
4-n-ブチルベンジルアルコール2.0 g（12ミリモル）のエーテル（25 ml）溶液に、塩化チオニル2.5 ml（34ミリモル）を加え、室温で３時間撹拌した。濃縮後、ベンゼンによる共沸により過剰の塩化チオニルを除去し、表題化合物2.3 gを得た。この化合物は精製することなく次の反応に用いた。
実施例Ｂ2
1-（4-ブチルベンジル）イソキノリン
６０％水素化ナトリウム16 mg（0.40ミリモル）のジメチルホルムアミド（1.8 ml）溶液に窒素雰囲気下−１６℃で、Org. Synth.,VI, 115(1988)の文献に基づいて合成した1-シアノ-2-ベンゾイル-1,2-ジヒドロイソキノリン100 mg（0.38ミリモル）と４−n-ブチルベンジルクロリド70 mg（0.38ミリモル）のジメチルホルムアミド（3.6 ml）溶液を滴下し、さらに室温で３０分間撹拌した。水を加え、減圧濃縮し、残渣にトルエンと水を加えた。トルエン層を水洗後、炭酸カリウムで乾燥後、減圧濃縮した。残渣のエタノール(1.6 ml)溶液に５０％水酸化ナトリウム水溶液（0.63 ml）を加え、２時間加熱還流した。濃縮後、トルエンと水を加えた。トルエン層を水洗後、炭酸カルシウムで乾燥後、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、表題化合物18 mgを得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):0.89(3H, t), 1.26-1.36(2H, m), 1.50-1.59(2H, m), 2.53(2H, t), 4.64(2H, s), 7.06(2H, d), 7.19(2H, d), 7.53(1H, td), 7.56(1H, d), 7.64(1H, td), 7.81(1H, d), 8.18(1H, dd), 8.50(1H, d)
実施例Ｂ3
（4-ブチルフェニル）（1-イソキノリル）ケトン
窒素雰囲気下、マグネシウム338 mg（14ミリモル）とテトラヒドロフラン6.5 mlの混合溶液に、１−ブロモ−４−ブチルベンゼン2.29 ml（13ミリモル）と開始剤として触媒量の１，２−ジブロモエタンを加え、１０分間還流下撹拌した。この溶液を０℃まで冷却し、１−イソキノリンカルボニトリル1.0g（6.5ミリモル）のテトラヒドロフラン溶液を加え、さらに室温で１時間、７０℃で３時間撹拌した。その後、再度０℃に冷却し、濃塩酸2.6 mlそしてメタノール11 mlを加えた後、２時間加熱還流した。濃縮後、残渣を５規定水酸化ナトリウムとトルエンに溶解し、セライトで濾過した。濾液のトルエン層を分離し、水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、表題化合物1.7 gを得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):0.93(3H, t), 1.32-1.43(2H, m), 1.58-1.66(2H, m), 2.68(2H, t), 7.28(2H, d), 7.61(1H, td), 7.74(1H, td), 7.80(1H, d), 7.87(2H, d), 7.92(1H, d), 8.20(1H, d), 8.60(1H, d)
実施例Ｂ4
1-（4-ブチルベンジル）イソキノリンの製造方法の別法
実施例Ｂ3の化合物1.7 g（6.0ミリモル）、ヒドラジン１水和物836 mg（17ミリモル）そして水酸化カリウム769 mg（14ミリモル）をジエチレングリコール8.5 mlに加え、８０℃で１時間、１６０℃で３時間半そして２００℃で１時間撹拌した。室温まで冷却後、氷水を加え酢酸エチルで抽出した。これを水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、表題化合物914 mgを得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):0.89(3H, t), 1.26-1.36(2H, m), 1.50-1.59(2H, m), 2.53(2H, t), 4.64(2H, s), 7.06(2H, d), 7.19(2H, d), 7.53(1H, td), 7.56(1H, d), 7.64(1H, td), 7.81(1H, d), 8.18(1H, dd), 8.50(1H, d)
実施例Ｂ５
1-（4-エチルベンジル）イソキノリン
p-エチルベンジルクロリドを用いて実施例Ｂ２と同様にして表題化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):1.18(3H, t), 2.57(2H, q), 4.64(2H, s), 7.08(2H, d), 7.20(2H, d), 7.50-7.55(2H, m), 7.61-7.65(1H, m), 7.80(1H, d), 8.16-8.18(1H, m), 8.49(1H, d)
実施例Ｂ６
（4-プロピルフェニル）メタノール
０℃まで冷却したp-n-プロピルベゾイックアシッド5.0 g（32ミリモル）のテトラヒドロフラン（20 ml）溶液に、水素化ホウ素ナトリウム2.9 g（76ミリモル）と濃硫酸のエーテル（エーテル4.0 mlに濃硫酸2.0 mlを加えて調製した。）溶液を反応系内の温度が２０℃以上に上昇しないように滴下し、室温で３時間撹拌した。氷冷後、メタノールと１規定水酸化ナトリウムを加え酢酸エチルで抽出した。酢酸エチル層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、減圧濃縮し、表題化合物を4.33 g 得た。この化合物は精製することなく次の反応に用いた。
実施例Ｂ７
1-（クロロメチル）-4-プロピルベンゼン
実施例Ｂ６の化合物を実施例Ｂ１と同様にして表題化合物を得た。この化合物はさらに精製することなく次の反応に用いた。
実施例Ｂ８
1-（4-プロピルベンジル）イソキノリン
実施例Ｂ７の化合物を実施例Ｂ２と同様にして表題化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):0.90(3H, t), 1.55-1.61(2H, m), 2.51(2H, t), 4.64(2H, s), 7.06(2H, d), 7.19(2H, d), 7.51-7.55(2H, m), 7.61-7.65(1H, m), 7.81(1H, d), 8.17(1H, dd), 8.49(1H, d)
実施例Ｂ９
（4-ペンチルフェニル）メタノール
4-n-アミルベンゾイックアシッドを実施例Ｂ６と同様に還元して表題化合物を得た。
実施例Ｂ１０
1-（クロロメチル）-4-ペンチルベンゼン
実施例Ｂ９の化合物を実施例Ｂ１と同様にして表題化合物を得た。この化合物はさらに精製することなく次の反応に用いた。
実施例Ｂ１１
1-（4-ペンチルベンジル）イソキノリン
実施例Ｂ１０を実施例Ｂ２と同様にして表題化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):0.86(3H, t), 1.26-1.33(4H, m), 1.52-1.59(2H, m), 2.52(2H, t), 4.64(2H, s), 7.06(2H, d), 7.18(2H, d), 7.50-7.55(2H, m), 7.61-7.65(1H, m), 7.80(1H, d), 8.17(1H, dd), 8.49(1H, d)
実施例Ｂ１２
（4-ヘキシルフェニル）メタノール
4-n-ヘキシルベンゾイックアシッドを実施例Ｂ６と同様に還元して表題化合物を得た。この化合物はさらに精製することなく次の反応に用いた。
実施例Ｂ１３
1-（クロロメチル）-4-ヘキシルベンゼン
実施例Ｂ１２の化合物を実施例Ｂ１と同様にして表題化合物を得た。この化合物はさらに精製することなく次の反応に用いた。
実施例Ｂ１４
1-（4-ヘキシルベンジル）イソキノリン
実施例Ｂ１３の化合物を実施例Ｂ２と同様にして表題化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):0.86(3H, t), 1.26-1.31(6H, m), 1.51-1.58(2H, m), 2.52(2H, t), 4.63(2H, s), 7.06(2H, d), 7.18(2H, d), 7.50-7.55(2H, m), 7.61-7.65(1H, m), 7.80(1H, d), 8.17(1H, dd), 8.49(1H, d)
実施例Ｂ１５
1-（4-イソプロピルベンジル）イソキノリン
p-イソプロピルベンジルクロリドを実施例Ｂ２と同様にして表題化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):1.19(6H, d), 2.80-2.87(1H, m), 4.64(2H, s), 7.11(2H, d), 7.21(2H, d), 7.51-7.56(2H, m), 7.61-7.65(1H, m), 7.81(1H, d), 8.19(1H, dd), 8.50(1H, d)
実施例Ｂ１６
1-[4-(tert-ブチル)ベンジル]イソキノリン
4-tert-ブチルベンジルクロリドを実施例Ｂ２と同様にして表題化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):1.26(9H, s), 4.64(2H, s), 7.22(2H, d), 7.27(2H, d), 7.52-7.56(2H, m), 7.62-7.66(1H, m), 7.81(1H, d), 8.19(1H, dd), 8.50(1H, d)
実施例Ｂ１７
(4-イソブチルフェニル)メタノール
4-イソブチルベンゾイックアシッドを実施例Ｂ６と同様に還元して表題の化合物を得た。さらに精製することなく次の反応に用いた。
実施例Ｂ１８
1-(クロロメチル)-4-イソブチルベンゼン
実施例Ｂ１７の化合物を実施例Ｂ１と同様にして表題化合物を得た。さらに精製することなく次の反応に用いた。
実施例Ｂ１９
1-(4-イソブチルベンジル)イソキノリン
実施例Ｂ１８の化合物を実施例Ｂ２と同様にして表題化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):0.86(6H, d), 1.75-1.83(1H, m), 2.39(2H, d), 4.66(2H, s), 7.02(2H, d), 7.18(2H, d), 7.52-7.58(2H, m), 7.63-7.67(1H, m), 7.82(1H, d), 8.18(1H, d), 8.50(1H, d)
実施例Ｂ２０
1-(クロロメチル)-4-(トリフルオロメチル)ベンゼン
4-トリフルオロメチルベンジルアルコールを実施例Ｂ１と同様にして表題化合物を得た。さらに精製することなく次の反応に用いた。
実施例Ｂ２１
1-[4-(トリフルオロメチル)ベンジル]イソキノリン
実施例Ｂ２０の化合物を実施例Ｂ２と同様にして表題化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):4.73(2H, s), 7.39(2H, d), 7.51(2H, d), 7.54-7.60(2H, m), 7.65-7.69(1H, m), 7.84(1H, d), 8.09-8.10(1H, m), 8.51(1H, d)
実施例Ｂ２２
1-(クロロメチル)-4-(トリフルオロメトキシ)ベンゼン
4-トリフルオロメトキシベンジルアルコールを実施例Ｂ１と同様にして表題化合物を得た。さらに精製することなく次の反応に用いた。
実施例Ｂ２３
1-[4-(トリフルオロメトキシ)ベンジル]イソキノリン
実施例Ｂ２２の化合物を実施例Ｂ２と同様にして表題化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):4.67(2H, s), 7.10(2H, d), 7.27(2H, d), 7.54-7.59(2H, m), 7.64-7.68(1H, m), 7.84(1H, d), 8.11(1H, dd), 8.50(1H, d)
実施例Ｂ２４
1-(クロロメチル)-2-ヨードベンゼン
０℃に冷却したo-ヨードベンジルアルコール5.0 g（21ミリモル）の塩化メチレン（50 ml）溶液に、メタンスルフォニルクロリド2.0 ml（29ミリモル）とトリエチルアミン3.6 ml（26ミリモル）を加え、その温度で１９時間撹拌した。５％炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、塩化メチレンで抽出した。塩化メチレン層を無水硫酸マグネシウムで乾燥後、減圧濃縮し、表題化合物を5.34 g 得た。
実施例Ｂ２５
1-(2-ヨードベンジル)イソキノリン
実施例Ｂ２４の化合物を実施例Ｂ２と同様にして表題化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):4.74(2H, s), 6.81-6.84(1H, m), 6.87-6.92(1H, m), 7.11-7.15(1H, m), 7.55-7.57(1H, m), 7.60(1H, d), 7.64-7.68(1H, m), 7.83-7.86(1H, m), 7.89-7.91(1H, m), 8.00-8.02(1H, m), 8.50(1H, d)
実施例Ｂ２６
1-[2-(2-フェニル-1-エチニル)ベンジル]イソキノリン
窒素雰囲気下、実施例Ｂ２５の化合物345 mg（1.07ミリモル）のピロリジン（1.5 ml）溶液に、テトラキストリフェニルフォスフィンパラジウム58 mg（0.05ミリモル）とエチニルベンゼン204 mg（2.0ミリモル）のピロリジン（1.5 ml）溶液を加え、８０℃で３時間撹拌した。室温まで冷却後、酢酸エチルで希釈後、飽和塩化アンモニウム水溶液で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィーで精製し、表題化合物280 mgを得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):4.95(2H, s), 6.98-7.06(2H, m), 7.10-7.21(2H, m), 7.31-7.35(3H, m), 7.48-7.51(3H, m), 7.57-7.65(2H, m), 7.82(1H, d), 8.25(1H, d), 8.52(1H, d)
実施例Ｂ２７
1-(2-フェニルエチルベンジル)イソキノリン
実施例Ｂ２６の化合物280 mg（0.88ミリモル）のテトラヒドロフラン（30 ml）溶液に、パラジウム−炭素（10%）230 mgを加え、室温で水素雰囲気下（1 atm）で３時間撹拌した。触媒を濾去し、得られた濾液を減圧濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィーで精製し、表題化合物162 mgを得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):2.90-2.94(2H, m), 3.07-3.10(2H, m), 4.67(2H, s), 6.80(1H, d), 7.02-7.06(1H, m), 7.15-7.30(7H, m), 7.49-7.53(1H, m), 7.58(1H, d), 7.64-7.68(1H, m), 7.84(1H, d), 7.95(1H, d), 8.50(1H, d)
実施例Ｂ２８
1-{2-[4-(テトラヒドロ-2H-2-ピラニルオキシ)-1-ブチニル]ベンジル}イソキノリン
窒素雰囲気下、実施例Ｂ２５の化合物345 mg（1.07ミリモル）のピロリジン（1.5 ml）溶液に、テトラキストリフェニルフォスフィンパラジウム58 mg（0.05ミリモル）と2-(3-ブチニルオキシ)-テトラヒドロ-2H-ピラン208 mg（2.0ミリモル）のピロリジン（1.5 ml）溶液を加え、４日間室温で撹拌し、さらに８０℃で３０分間撹拌した。室温まで冷却後、酢酸エチルで希釈後、飽和塩化アンモニウム水溶液で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィーで精製し、表題化合物277 mgを得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):1.42-1.60(4H, m), 1.64-1.68(1H, m), 1.75-1.81(1H, m), 2.76-2.80(2H, m), 3.46-3.51(1H, m), 3.60-3.66(1H, m), 3.85-3.95(2H, m), 4.64-4.66(1H, m), 4.85(2H, s), 6.95-6.98(1H, m), 7.05-7.13(2H, m), 7.44-7.46(1H, m), 7.49-7.53(1H, m), 7.56(1H, d), 7.60-7.65(1H, m), 7.80-7.82(1H, m), 8.15-8.18(1H, m), 8.49-8.51(1H, m)
実施例Ｂ２９
4-[2-(1-イソキノリルメチル)フェニル]-3-ブチン-1-オール
実施例Ｂ２８の化合物200 mg（0.54ミリモル）を０℃まで冷却した後、塩酸―メタノール溶液（10%）を5 ml加え、１５分間撹拌した。飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、酢酸エチルで抽出した。酢酸エチル層を無水硫酸マグネシウムで乾燥後、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィーで精製し、表題化合物86 mgを得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):2.72(2H, t), 3.53-3.60(1H, brs), 3.85(2H, t), 4.85(2H, s), 7.12-7.15(2H, m), 7.22-7.24(1H, m), 7.42-7.44(1H, m), 7.55-7.59(2H, m), 7.63-7.67(1H, m), 7.81(1H, d), 8.30(1H, m), 8.46(1H, m)
実施例Ｂ３０
4-[2-(1-イソキノリルメチル)フェニル]-1-ブタノール
実施例Ｂ２９の化合物44 mg（0.15ミリモル）のテトラヒドロフラン（5 ml）溶液に、パラジウム−炭素（10%）10mgを加え、室温で水素雰囲気下（1 atm）１時間撹拌した。触媒を濾去後、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィーで精製し、表題化合物18 mgを得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):1.61-1.75(4H, m), 2.33(1H, brs), 2.77(2H, t), 3.67(2H, t), 4.70(2H, s), 6.91(1H, d), 7.02-7.06(1H, m), 7.12-7.16(1H, m), 7.19-7.21(1H, m), 7.50-7.55(1H, m), 7.57(1H, d), 7.63-7.67(1H, d), 7.83(1H, d), 8.09(1H, d), 8.47(1H, d)
実施例Ｂ３１
1-ブロモ-2-(クロロメチル)ベンゼン
p-ブロモベンジルアルコールを実施例Ｂ１と同様にして表題化合物を得た。
実施例Ｂ３２
1-(4-ブロモベンジル)イソキノリン
実施例Ｂ３１の化合物を実施例Ｂ２と同様にして表題化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):4.61(2H, s), 7.14-7.16(2H, m), 7.35-7.39(2H, m), 7.52-7.58(2H, m), 7.63-7.67(1H, m), 7.82(1H, d), 8.07-8.10(1H, m), 8.49(1H, d)
実施例Ｂ３３
エチル(E)-3-[4-(イソキノリルメチル)フェニル]-2-プロペノエート
窒素雰囲気下、実施例Ｂ３２の化合物100 mg（0.34ミリモル）とプロピオン酸ビニルエステル73μl（0.67ミリモル）のジメチルホルムアミド1.0 ml溶液に、トリス（2-メチルフェニル）ホスフィン20 mg（0.067ミリモル）、パラジウム(II)アセテート7.5 mg（0.034ミリモル）そしてトリエチルアミン70μl（0.50ミリモル）を加え、４時間１００℃で加熱撹拌した。この溶液を室温まで戻した後、水を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、表題化合物74 mgを得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):1.32(3H, t), 4.24(2H, q), 4.69(2H, s), 6.36(1H, d), 7.29(2H, d), 7.42(2H, d), 7.53-7.67(4H, m), 7.83(1H, d), 8.11-8.13(1H, m), 8.50(1H, d)
実施例Ｂ３４
エチル3-[4-(1-イソキノリルメチル)フェニル]プロパノエート
実施例Ｂ３３の化合物71 mg（0.22ミリモル）のメタノール(5.0 ml)溶液に、パラジウム-炭素（10％、20 mg）を加え、室温で常圧水素雰囲気下、５時間半撹拌した。反応液より触媒を濾別した後、濾液を減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、表題化合物52 mgを得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):1.20(3H, t), 2.56(2H, t), 2.88(2H, t), 4.09(2H, q), 4.64(2H, s), 7.09(2H, d), 7.20(2H, d), 7.51-7.57(2H, m), 7.62-7.66(1H, m), 7.82(1H, d), 8.15(1H, dd), 8.50(1H, d)
実施例Ｂ３５
3-[4-(1-イソキノリルメチル)フェニル]-1-プロパノール
窒素雰囲気下、０℃に冷却したテトラヒドロフラン1.0 mlにリチウムアルミニウムヒドリド6 mg（0.16ミリモル）を加えた。この溶液に実施例Ｂ３４の化合物46 mg（0.14ミリモル）のテトラヒドロフラン（1.0 ml）溶液を加え、その温度で３時間撹拌した。反応液にメタノールと水（9:1, 1.0 ml）の混合液を加え、さらに飽和塩化アンモニウム水溶液を加えた後、クロロホルムで抽出した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥後、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、表題化合物22 mgを得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):1.30-1.35(1H, brs), 1.81-1.88(2H, m), 2.64(2H, t), 3.62-3.65(2H, m), 4.64(2H, s), 7.09(2H, d), 7.20(2H, d), 7.51-7.57(2H, m), 7.62-7.66(1H, m), 7.81(1H, d), 8.16-8.18(1H, m), 8.49(1H, d)
実施例Ｂ３６
1-イソキノリル(4-メトキシフェニル)ケトン
窒素雰囲気下、マグネシウム3059 mg(125.8ミリモル）とテトラヒドロフラン(20 ml)の混合溶液に、4-ブロモアニソール15.3 ml（122ミリモル）と開始剤として触媒量の１，２−ジブロモエタンを加え、加熱還流下45分間撹拌した。この溶液を０℃まで冷却し、1-イソキノリンカルボニトリル10.78 g（69.9ミリモル）のテトラヒドロフラン溶液(30 ml)を滴下後、室温で2時間撹拌した。反応混合物を氷冷し、濃塩酸24 mlとメタノール120 mlを加え、1.5時間加熱還流した。氷冷後、水酸化ナトリウム水溶液を加えpH8とした後、エーテルで抽出し、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、表題化合物15.87 gを得た。
1H-NMR(CDCl3) δ(ppm):3.88(3H, s), 6.95(2H, d), 7.61(1H, dd), 7.74(1H, dd), 7.76(1H, d), 7.85(2H, d), 8.17(1H, dd), 8.60(1H, d).
実施例Ｂ３７
1-イソキノリル(4-メトキシフェニル)メタノール
氷冷した実施例Ｂ３６の化合物8608 mgのエタノール(170 ml)溶液に、水素化ホウ素ナトリウム1855 mgを加え、室温で35分間撹拌した。さらに水素化ホウ素ナトリウム957 mgを加え40℃で40分間撹拌した。反応混合物を減圧濃縮し、水を加えエーテルで抽出した。有機層を水と飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、減圧濃縮した。得られた表題化合物7881 mg はさらに精製することなく次反応に用いた。
1H-NMR(DMSO-d6)δ(ppm):3.66(3H, s), 6.30-6.32(1H, brs), 6.81(2H, d), 7.28(2H, d), 7.54(1H, dd), 7.68(1H, dd), 7.76(1H, d), 7.94(1H, d), 8.37(1H, d), 8.47(1H, d).
水酸基のプロトンは、NMRのチャート上観測されていない。
実施例Ｂ３８
1-イソキノリル(4-メトキシフェニル)メチルアセテート
実施例Ｂ３７の化合物7881 mgのピリジン(100 ml)溶液に、無水酢酸20 mlを加え、50℃で4時間撹拌した。反応混合物を減圧濃縮後、さらにトルエン共沸した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、表題化合物8.79 g を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):2.22(3H, s), 3.76(3H, s), 6.84(2H, d), 7.39(2H, d), 7.54(1H, dd), 7.56(1H, s), 7.60(1H, d), 7.64(1H, dd), 7,82(1H, d), 8.19(1H, d), 8.57(1H, d).
実施例Ｂ３９
1-(4-メトキシベンジル)イソキノリン
実施例Ｂ３８の化合物8.79 gのメタノール(150 ml)溶液に、10%パラジウム-炭素4.0 gを加え、室温で常圧水素雰囲気下5.5時間撹拌した。触媒をセライトで濾去し、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、表題化合物4.48 gを得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):3.74(3H, s), 4.61(2H, s), 6.79(2H, d), 7.21(2H, d), 7.53(1H, dd), 7.56(1H, d), 7.63(1H, dd), 7.80(1H, d), 8.16(1H, d), 8.49(1H, d).
実施例Ｂ４０
4-(1-イソキノリルメチル)フェノール
実施例Ｂ３９の化合物2185 mgに47%臭化水素酸水溶液40 mlを加え、14時間加熱還流した。室温まで戻した後、さらに氷冷し50%水酸化ナトリウム水溶液で中和し、酢酸エチルで抽出した。酢酸エチル層を水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、減圧濃縮した。得られた粉末を石油エーテルで洗浄し、表題化合物1822 mgを得た。
1H-NMR(DMSO-d6)δ(ppm):4.48(2H, s), 6.61(2H, d), 7.07(2H, d), 7.60(1H, dd), 7.68(1H, d), 7.71(1H, dd), 7.92(1H, d), 8.27(1H, d), 8.41(1H, d), 9.19(1H, brs).
実施例Ｂ４１
4-(1-イソキノリルメチル)フェニルトリフルオロメタンスルホネート
氷冷した実施例Ｂ４０の化合物513 mgのピリジン(10 ml)溶液に、トリフルオロメタンスルフォン酸無水物0.55 mlを滴下し、その温度で45分間撹拌した。その反応溶液に氷を加えエーテルで抽出した。有機層を水と飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、表題化合物を546 mgを得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):4.69(2H, s), 7.16(2H, d), 7.35(2H, d), 7.57(1H, dd), 7,60(1H, d), 7.68(1H, dd), 7.85(1H, d), 8.09(1H, d), 8.50(1H, d).
実施例Ｂ４２
1-[4-(2-フェニル-1-エチニル)ベンジル]イソキノリン
脱気した後、窒素置換した実施例Ｂ４１の化合物88 mgのN,N-ジメチルホルムアミド(2.0 ml)溶液に、フェニルアセチレン53μl、酢酸パラジウム9 mg、1,1’-ビス(ジフェニルフォスフィノ)フェロセン67 mg、ヨウ化銅(I)3 mg、塩化リチウム20 mgそしてトリエチルアミン50μlを加え、80℃で8時間撹拌した。室温まで戻した後、水を加え酢酸エチルで抽出した。有機層を水と飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、表題化合物53 mgを得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):4.69(2H, s), 7.12-7.32(3H, m), 7.25(2H, d), 7.42(2H, d),7.43-7.52(2H, m), 7.54(1H, dd), 7.58(1H, d), 7.65(1H, dd), 7.83(1H, d), 8.10(1H, d), 8.51(1H, d).
実施例Ｂ４３
1-(4-フェネチルベンジル)イソキノリン
実施例Ｂ４２の化合物45 mgのテトラヒドロフラン(2 ml)溶液に、10%パラジウム-炭素触媒20 mgを加え、室温で常圧水素雰囲気下2時間撹拌した。触媒をセライトで濾去し、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、表題化合物23 mgを得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):2.78-2.90(4H, m), 4.64(2H, s), 7.07(2H, d), 7.10-7.20(5H, m), 7.22(2H, d), 7.53(1H, dd), 7.55(1H, d), 7.63(1H, dd), 7.80(1H, d), 8.15(1H, d), 8.49(1H, d).
実施例Ｂ４４
1-[4-(4-フェニル-1-ブチニル)ベンジル]イソキノリン
実施例Ｂ４１の化合物と4-フェニル-1-ブチンを用い、実施例Ｂ４２と同様に処理して表題化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):2.65(2H, t), 2.88(2H, t), 4.68(2H, s), 7.12-7.40(9H, m), 7.50-7.70(3H, m), 7.80-7.88(1H, m), 8.00-8.10(1H, m), 8.48-8.51(1H, m).
実施例Ｂ４５
1-[4-(4-フェニル-1-ブチル)ベンジル]イソキノリン
実施例Ｂ４４の化合物を実施例Ｂ４３と同様に処理して表題化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):1.55-1.80(4H, m), 2.50-2.65(4H, m), 4.68(2H, s), 7.00-7.30(9H, m), 7.52(1H, dd), 7.56(1H, d), 7.63(1H, dd), 7.81(1H, d), 8.15(1H, d), 8.50(1H, d).
実施例Ｂ４６
1-{4-[4-(テトラヒドロ-2H-2-ピラニルオキシ)-1-ブチニル]ベンジル}イソキノリン
実施例Ｂ４１の化合物と2-(3-ブチニルオキシ)テトラヒドロ-2H-ピランを用い、実施例Ｂ４２と同様に処理して表題化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):1.48-1.90(6H, m), 2.67(2H, t), 3.49-3.55(1H, m), 3.60(1H, dd), 3.65-3.94(2H, m), 4.66(2H, s), 4.65-4.70(1H, m), 7.14-7.20(2H, m), 7.23-7.30(2H, m), 7.53(1H, dd), 7.58(1H, d), 7.65(1H, dd), 7.82(1H, d), 8.10(1H, d), 8.49(1H, d).
実施例Ｂ４７
4-[4-(1-イソキノリルメチル)フェニル]-3-ブチン-1-オール
実施例Ｂ４６の化合物1048 mgを10%塩酸-メタノール溶液50 mlに溶解し、室温で1.5時間撹拌した。反応混合物を氷冷し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え酢酸エチルで抽出した。有機層を水、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、表題化合物666 mgを得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):2.65(2H, t), 3.77(2H, t), 4.65(2H, s), 7.18(2H, d), 7.29(2H, d), 7.52(1H, dd), 7.57(1H, d), 7.64(1H, dd), 7.81(1H, d), 8.07(1H, d), 8.49(1H, d).
水酸基のプロトンは、NMRのチャート上観測されていない。
実施例Ｂ４８
4-[4-(1-イソキノリルメチル)フェニル]-1-ブタノール
実施例Ｂ４７の化合物を実施例Ｂ４３と同様に処理して表題化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):1.50-1.70(4H, m), 2.57(2H, t), 3.62(2H, t), 4.64(2H, s), 7.06(2H, d), 7.18(2H, d), 7.53(1H, dd), 7.55(1H, d), 7.63(1H, dd), 7.80(1H, d), 8.16(1H, d), 8.49(1H, d).
水酸基のプロトンは、NMRのチャート上観測されていない。
実施例Ｂ４９
1-[4-(3-シクロペンチル-1-プロピニル)ベンジル]イソキノリン
実施例Ｂ４１と3-シクロペンチル-1-プロピンを用い、実施例Ｂ４２と同様に処理して表題化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):1.25-1.35(2H, m), 1.45-1.70(6H, m), 1.75-1.85(2H, m), 2.05-2.13(1H, m), 4.65(2H, s), 7.17(2H, d), 7.27(2H, d), 7.51(1H, dd), 7.56(1H, d), 7.64(1H, dd),
7.81(1H, d), 8.08(1H, d), 8.49(1H, d).
実施例Ｂ５０
1-[4-(3-シクロペンチルプロピル)ベンジル]イソキノリン
実施例Ｂ４９を実施例Ｂ４３と同様に処理して表題化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):1.25-1.74(13H, m), 2.49-2.54(2H, m), 4.64(2H, s), 7.06(2H, d), 7.18(2H, d), 7.53(1H, dd), 7.55(1H, d), 7.63(1H, dd), 7.80(1H, d), 8.17(1H, d), 8.49(1H, d).
実施例Ｂ５１
4-[4-(1-イソキノリルメチル)フェニル]-2-メチル-3-ブチン-2-オール
実施例Ｂ４１の化合物と2-メチル-3-ブチン-2-オールを用いて実施例Ｂ４２と同様に処理して表題化合物を得た。
1H-NMR(DMSO-d6)δ(ppm):1.35(1H, s), 1.40(6H, s), 4.62(2H, s), 7.20-7.30(4H, m), 7.61(1H, dd), 7.71(1H, d), 7.69-7.76(1H, m), 7.95(1H, d), 8.26(1H, d), 8.42(1H, d).
実施例Ｂ５２
4-[4-(1-イソキノリルメチル)フェニル]-2-メチル-2-ブタノール
実施例Ｂ５１の化合物を実施例Ｂ４３と同様に処理して表題化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):1.25(6H, s), 1.70-1.77(2H, m), 2.60-2.67(2H, m), 4.64(2H, s), 7.08(2H, d), 7.19(2H, d), 7.53(1H, dd), 7.55(1H, d), 7.63(1H, dd), 7.80(1H, d), 8.16(1H, d), 8.49(1H, d).
水酸基のプロトンは、NMRのチャート上観測されていない。
実施例Ｂ５３
1-[4-(3-メトキシ-1-プロピニル)ベンジル]イソキノリン
実施例Ｂ４１の化合物とメチルプロパルギルエーテルを用いて、実施例Ｂ４２と同様に処理して表題化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):3.42(3H, s), 4.29(2H, s), 4.66(2H, s), 7.21 (2H, d), 7.34(2H, d), 7.54(1H, dd), 7.58(1H, d), 7.65(1H, dd) 7.82(1H, d), 8.10(1H, d) 8.49(1H, d).
実施例Ｂ５４
1-[4-(3-メトキシプロピル)ベンジル]イソキノリン
実施例Ｂ５３の化合物を実施例Ｂ４３と同様に処理して表題化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):1.78-1.87 (2H, m), 2.06(2H, t), 3.31(3H, s), 3.35(2H, t), 4.64(2H, s), 7.07(2H, d), 7.22(2H, d), 7.53(1H, dd), 7.55(1H, d), 7.64(1H, dd), 7.81(1H, d), 8.17(1H, d),8.49(1H, d).
実施例Ｂ５５
1-{4-[2-(2-ピリジル)-1-エチニル]ベンジル}イソキノリン
実施例Ｂ４１の化合物と2-エチニルピリジンを用いて、実施例Ｂ４２と同様に処理し、表題化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):4.71(2H, s), 7.20-7.25(2H, m), 7.29(2H, d), 7.48-7.53(1H, m), 7.51(2H, d), 7.57(1H, dd), 7.61(1H, d), 7.67(1H, dd), 7.85(1H, d), 8.13(1H, d), 8.53(1H, d), 8.59-8.63(1H, m).
実施例Ｂ５６
1-{4-[2-(2-ピリジル)エチル]ベンジル}イソキノリン
実施例Ｂ５５の化合物を実施例Ｂ４３と同様に処理して表題化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):2.94-3.06(4H, m), 4.64(2H, s), 7.04(1H, d), 7.09(1H, dd), 7.09(2H, d), 7.18(2H, d), 7.53(1H, ddd), 7.54(1H, dd), 7.55(1H, d), 7.64(1H, d), 7.81(1H, d), 8.15(1H, d), 8.49(1H, d), 8.53(1H, dd).
実施例Ｂ５７
1-{4-[2-(3-ピリジル)-1-エチニル]ベンジル}イソキノリン
実施例Ｂ４１の化合物と3-エチニルピリジンを用いて、実施例Ｂ４２と同様に処理し、表題化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):4.69(2H, s), 7.27(2H, d), 7.31(1H, dd), 7.43(2H, d), 7.55(1H, dd), 7.59(1H, d), 7.66(1H, dd), 7.82(1H, ddd), 7.83(1H, d), 8.10(1H, d), 8.51(1H, d), 8.60(1H, dd), 8.77(1H, d).
実施例Ｂ５８
1-{4-[2-(3-ピリジル)エチル]ベンジル}イソキノリン
実施例Ｂ５７を実施例Ｂ４３と同様に処理し、表題化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):2.80-2.90(4H, m), 4.65(2H, s),7.04(2H, d), 7.15(1H, dd), 7.19(2H, d), 7.39(1H, dd), 7.54(1H, dd), 7.56(1H, d), 7.64(1H, dd), 7.81(1H, d), 8.15(1H, d), 8.40(1H, d), 8.42(1H, d), 8.49(1H, d).
実施例Ｂ５９
N-(2-プロピニル)アセトアミド
氷冷したプロパルギルアミン3023 mgの塩化メチレン(30 ml)溶液に、ピリジン16.3 mlと無水酢酸10.4 mlを加え、室温で1時間撹拌した。反応混合物を氷に注ぎ、酢酸エチルで抽出し、1規定塩酸、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液そして飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、シリカゲルを用いて濾過した。減圧濃縮し、表題化合物743 mg を得た。得られた化合物はさらに精製することなく次反応に用いた。
1H-NMR(DMSO-d6)δ(ppm):1.79(3H, s), 3.07(1H, t), 3.81(2H, d), 8.25(1H, brs).
実施例Ｂ６０
N-{3-[4-(1-イソキノリルメチル)フェニル]-2-プロピニル}アセトアミド
実施例Ｂ４１の化合物と実施例Ｂ５９の化合物を用いて、実施例Ｂ４２と同様に処理し、表題化合物を得た。
1H-NMR(DMSO-d6)δ(ppm):1.79(3H, s), 4.04(2H, s), 4.61(2H, s), 7.45-7.68(4H, m), 7.68-7.75(2H, m), 7.90-8.00(1H, m), 8.25-8.38(2H, m), 8.40-8.45(1H, m).
実施例Ｂ６１
N-{3-[4-(1-イソキノリルメチル)フェニル]プロピル}アセトアミド
実施例Ｂ６０を実施例Ｂ４３と同様に処理し、表題化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):1.95(3H, s), 1.74-1.84(2H, m), 2.55(2H, t), 3.25(2H, dt), 4.68(2H, s), 7.10(2H, d), 7.18(2H, d), 7.20-7.28(1H, m), 7.50-7.58(2H, m), 7.60-7.68(1H, m), 7.75-7.85(1H, m), 8.10-8.16(1H, m), 8.45-8.50(1H, m).
実施例Ｂ６２
N-(2-プロピニル)メタンスルホンアミド
氷冷したプロパルギルアミン3023 mgの塩化メチレン(30 ml)溶液に、トリエチルアミン9.77 mlを加え、メタンスルホニルクロリド5.19 mlを滴下した後、その温度で3時間撹拌し、その後室温に昇温し、さらに2時間撹拌した。反応混合物に氷を加え、酢酸エチルで抽出し、飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、減圧濃縮した。残渣をメタノール120 mlに溶解し、炭酸カリウム11.7 gを加え、室温で3時間撹拌した。反応混合物を減圧濃縮し、氷冷下希塩酸で中和した後、酢酸エチルで抽出した。飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、表題化合物6.67 gを得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):2.39(1H, t), 3.10(3H, s), 3.99(2H, dd), 4.60(1H, brs).
実施例Ｂ６３
N-{3-[4-(1-イソキノリルメチル)フェニル]-2-プロピニル}メタンスルホンアミド
実施例Ｂ４１の化合物と実施例Ｂ６２の化合物を用いて、実施例Ｂ４２と同様に処理し、表題化合物を得た。
1H-NMR(DMSO-d6)δ(ppm):2.97(3H, s), 4.00(2H, d), 4.63(2H, s), 7.25-7.37(4H, m), 7.57(1H, t), 7.62(1H, dd), 7.71(1H, d), 7.73(1H, dd), 7.94(1H, d), 8.28(1H, d), 8.42(1H, d).
実施例Ｂ６４
N-{3-[4-(1-イソキノリルメチル)フェニル]プロピル}メタンスルホンアミド
実施例Ｂ６３の化合物を実施例Ｂ４３と同様に処理し、表題化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):1.80-1.90(2H, m), 2.62(2H, t), 2.89(3H, s), 3.11(2H, dt), 4.25(1H, brs), 4.64(2H, s), 7.05(2H, d), 7.20(2H, d), 7.50(1H, dd), 7.56(1H, d), 7.63(1H, dd), 7.81(1H, d), 8.15(1H, d), 8.49(1H, d).
実施例Ｂ６５
1-{4-[3-(エチルスルファニル)-1-プロピニル]ベンジル}イソキノリン
実施例Ｂ４１の化合物とプロパルギルエチルスルフィドを用いて、実施例Ｂ４２と同様に処理し、表題化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):1.30(3H, t), 2.73(2H, q), 3.47(2H, s), 4.67(2H, s), 7.20-7.32(4H, m), 7.52(1H, dd), 7.57(1H, d), 7.64(1H, dd), 7.81(1H, d), 8.08(1H, d), 8.49(1H, d).
実施例Ｂ６６
t-ブチルN-(2-プロピニル)カルバメート
氷冷したプロパルギルアミン3040 mgのテトラヒドロフラン(20 ml)溶液に、ジ-t-ブチル-ジカルボナート10.84 gのテトラヒドロフラン溶液（20 ml）を滴下し、徐々に室温まで昇温し、20時間撹拌した。反応混合物に水を加え、酢酸エチルで抽出し、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、減圧濃縮し、表題化合物9.34 gを得た。得られた化合物はさらに精製することなく次反応に用いた。
1H-NMR(DMSO-d6)δ(ppm):1.36(9H, s),3.04(1H, t),3.62-3.70(2H, m),7.20-7.30(1H, m)
実施例Ｂ６７
tert-ブチル N-{3-[4-(1-イソキノリルメチル)フェニル]-2-プロピニル}カルバメート
実施例Ｂ４１の化合物と実施例Ｂ６６の化合物を用いて、実施例Ｂ４２と同様に処理し、表題化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):1.45(9H, s), 4.06-4.13(2H, m), 4.66(2H, s), 7.19(2H, d), 7.20-7.28(1H, m), 7.29(2H, d), 7.52(1H, dd), 7.57(1H, d), 7.65(1H, dd), 7.82(1H, d), 8.08(1H, d), 8.49(1H, d).
実施例Ｂ６８
tert-ブチル N-{3-[4-(1-イソキノリルメチル)フェニル]プロピル}カルバメート
実施例Ｂ６７の化合物を実施例Ｂ４３と同様に処理し、表題化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):1.43(9H, s), 1.70-1.81(2H, m), 2.54-2.60(2H, m), 3.01-3.20(2H, m), 4.47-4.57(1H, m), 4.65(2H, s), 7.07(2H, d), 7.21(2H, d), 7.55(1H, dd), 7.57(1H, d), 7.65(1H, dd), 7.83(1H, d), 8.18(1H, d), 8.51(1H, d).
実施例Ｂ６９
3-[4-(1-イソキノリルメチル)フェニル]-2-プロピン-1-アミン
氷冷した実施例Ｂ６７の化合物4 mgの塩化メチレン(0.6 ml)溶液に、トリフルオロ酢酸0.3 mlを加え、その温度で1時間撹拌した。反応混合物に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、酢酸エチルで抽出し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、表題化合物を4 mgを得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):3.60-3.68(2H, m),4.66(2H, s),7.19(2H, d), 7.29(2H, d), 7.53(1H, dd), 7.56(1H, d), 7.63(1H, dd), 7.82(1H, d), 8.10(1H, d), 8.49(1H, d).
アミンのプロトンは、NMRのチャート上観測されていない。
実施例Ｂ７０
3-[4-(1-イソキノリルメチル)フェニル]-1-プロパンアミン
実施例Ｂ６８の化合物を実施例Ｂ６９と同様に処理し、表題化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):1.20-1.30(2H, m), 1.78-1.88(2H, m), 2.45-2.52(2H, m), 2.73-2.81(2H, m), 4.55(2H, s), 6.94(2H, d), 7.08(2H, d), 7.50(1H, dd), 7.51(1H, d), 7.61(1H, dd), 7.76(1H, d), 8.10(1H, d), 8.38(1H, d).
実施例Ｂ７１
N-メチル-N-(2-プロピニル)アセトアミド
N-メチル-N-(2-プロピニル)アミンを実施例Ｂ５９と同様に処理し、表題化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):2.11(2.1H, s), 2.17(0.9H, s),2.21(0.7H, t), 2.31(0.3H, t), 3.00(0.9H, s), 3.08(2.1H, s), 4.04(0.6H, d), 4.23(1.4H, d).
なお、この化合物はアミド幾何異性体の7:3の混合物である。
実施例Ｂ７２
N-{3-[4-(1-イソキノリルメチル)フェニル]-2-プロピニル} N-メチルアセトアミド
実施例Ｂ４１の化合物と実施例Ｂ７１の化合物を実施例Ｂ４２と同様に処理し、表題化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):2.10(1.8H, s), 2.11(1.2H, s), 3.01(1.2H, s), 3.10(1.8H, s), 4.21(1.2H, s), 4.41(0.8H, s), 4.67(2H, s), 7.18-7.23(2H, m), 7.29-7.32(2H, m), 7.53(1H, dd), 7.58(1H, d), 7.65(1H, dd), 7.82(1H, d), 8.09(1H, d), 8.49(1H, d).
なお、この化合物はアミド幾何異性体の3:2の混合物である。
実施例Ｂ７３
N-{3-[4-(1-イソキノリルメチル)フェニル]プロピル}- N1-メチルアセトアミド
実施例Ｂ７２の化合物を実施例Ｂ４３と同様に処理し、表題化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):1.70-1.90(2H, m), 1.89(1.5H, s), 2.03(1.5H, s), 2.50-2.59(2H, m), 2.88(1.5H, s), 2.91(1.5H, s), 3.20-3.25(1H, m), 3.36-3.40(1H, m), 4.66(2H, s), 7.03-7.10(2H, m), 7.18-7.30(2H, m), 7.53(1H, dd), 7.58(1H, d), 7.66(1H, dd), 7.82(1H, d), 8.17(1H, d), 8.50(1H, d).
なお、この化合物はアミド幾何異性体の1:1の混合物である。
実施例Ｂ７４
N-メチル- N-(2-プロピニル)メタンスルホンアミド
氷冷したN-メチル- N-(2-プロピニル)アミン2603 mgの塩化メチレン(25 ml)溶液に、トリエチルアミン6.55 mlを加えた後、メタンスルホニルクロリド3.50 mlを滴下後、その温度で1時間撹拌し、さらに室温で2時間撹拌した。反応混合物に氷を加え、酢酸エチルで抽出し、1規定塩酸、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液そして飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し後、シリカゲル濾過した。濾液を減圧濃縮し、表題化合物4522 mgを得た。得られた化合物はさらに精製することなく次反応に用いた。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):2.41(1H, t), 2.93(3H, s), 2.96(3H, s), 4.09(2H, d).
実施例Ｂ７５
N-{3-[4-(1-イソキノリルメチル)フェニル]-2-プロピニル}- N-メチルメタンスルホンアミド
実施例Ｂ４１の化合物と実施例Ｂ７４の化合物を実施例Ｂ４２と同様に処理し、表題化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):2.95(3H, s), 2.97(3H, s), 4.26(2H, s), 4.68(2H, s), 7.24(2H, d), 7.31(2H, d), 7.55(1H, dd), 7.59(1H, d), 7.66(1H, dd), 7.83(1H, d), 8.10(1H, d), 8.49(1H, d).
実施例Ｂ７６
N-{3-[4-(1-イソキノリルメチル)フェニル]プロピル}- N-メチルメタンスルホンアミド
実施例Ｂ７５の化合物を実施例Ｂ４３と同様に反応させ、残査はLC-MS[溶出溶媒：0.1%トリフルオロ酢酸含有アセトニトリル溶液：0.1%トリフルオロ酢酸含有水溶液=1：99〜100：0/20分サイクル、流速：20 ml/分、カラム：YMC Combiprep ODS-AM, 20 mmΦ x 50 mm(long)]により分離精製し、表題化合物を得た。
MS m/z(ESI:MH+):369.2
実施例Ｂ７７
5-[4-(1-イソキノリルメチル)フェニル]-4-ペンチン-2-オール
実施例Ｂ４１の化合物と4-ペンチン-2-オールを用いて、実施例Ｂ４２と同様に処理し、表題化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):1.27(3H, t), 2.38-2.62(2H, m), 3.95-4.03(1H, m), 4.65(2H, s), 7.19(2H, d), 7.29(2H, d), 7.52(1H, dd), 7.57(1H, d), 7.64(1H, dd), 7.81(1H, d), 8.08(1H, d), 8.48(1H, d).
水酸基のプロトンは、NMRのチャート上観測されていない。
実施例Ｂ７８
5-[4-(1-イソキノリルメチル)フェニル]-2-ペンタノール
実施例Ｂ７７の化合物を実施例Ｂ４３と同様に反応させ、残査はLC-MS[溶出溶媒：0.1%トリフルオロ酢酸含有アセトニトリル溶液：0.1%トリフルオロ酢酸含有水溶液=1：99〜100：0/20分サイクル、流速：20 ml/分、カラム：YMC Combiprep ODS-AM, 20 mmΦ x 50 mm(long)]により分離精製し、表題化合物を得た。
MS m/z(ESI:MH+):306.2
実施例Ｂ７９
3-ブチルフェノール
1-ブチル-3-メトキシベンゼンを実施例Ｂ４０と同様に処理し表題化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):0.94(3H, t), 1.30-1.55(2H, m), 1.55-1.62(2H, m), 2.56(2H, t), 4.76(1H, brs), 6.63(1H, dd), 6.66(1H, d), 6.75(1H, d), 7.12(1H, dd).
実施例Ｂ８０
1-ブチル-3-(メトキシメトキシ)ベンゼン
氷冷した実施例Ｂ７９の化合物318 mgのジメチルホルムアミド(5 ml)溶液に、60%鉱油分散の水素化ナトリウム102 mgを加え、室温で30分間撹拌した。再度氷冷し、クロロメチルメチルエーテル0.18 mlを加え、室温で12時間撹拌した。反応混合物に水を加え、酢酸エチルで抽出し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液と飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、シリカゲル濾過した。濾液を減圧濃縮し、表題化合物341 mgを得た。得られた化合物はさらに精製することなく次反応に用いた。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):0.94(3H, t), 1.30-1.42(2H, m), 1.55-2.04(2H, m), 2.58(2H, t), 3.49(3H, s), 5.17(2H, s), 6.80-6.87(3H, m), 7.18(1H, dd).
実施例Ｂ８１
4-ブチル-2-(メトキシメトキシ)ベンズアルデヒド
-20℃に冷却した実施例Ｂ８０の化合物2396 mgの石油エーテル溶液に、t-ブチルリチウムのペンタン溶液(1.51 M)10.6 mlを滴下し、-10℃から0℃の温度範囲で1.5時間撹拌した。その反応溶液を-70℃に冷却し、無水エーテル17 ml、ジメチルホルムアミド1.91 mlを加え、その温度で3時間撹拌し、室温でさらに1時間撹拌した。反応混合物を氷冷し、飽和塩化アンモニウム水溶液を加え、酢酸エチルで抽出した。飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、表題化合物1821 mgを得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):0.94(3H, t), 1.32-1.42(2H, m), 1.57-1.65(2H, m), 2.64(2H, t), 3.54(3H, s), 5.29(2H, s), 6.91(1H, d), 7.01(1H, s),7.76(1H, d),10.44(1H, s).
実施例Ｂ８２
[4-ブチル-2-(メトキシメトキシ)フェニル](1-イソキノリル)メタノール
Org. Synth.,IV, 115(1988)の文献に基づいて合成した1-シアノ-ベンゾイル-1,2-ジヒドロイソキノリン815 mg、実施例Ｂ８１の化合物869 mgそしてトリエチルベンジルアンモニウムクロリド7 mgの塩化メチレン(1.6 ml)溶液に、50%水酸化ナトリウム水溶液1.4 mlを加え、10分間水浴中で超音波を照射した。反応混合物に塩化メチレン8.3 mlとエタノール4.4 mlを加え、さらに85分間水浴中で超音波を照射した。反応混合物に水を加え、塩化メチレンで抽出した。無水硫酸マグネシウムで乾燥後、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、表題化合物1144 mgを得た。
1H-NMR(DMSO-d6)δ(ppm):0.86(3H, t), 1.22-1.31(2H, m), 1.44-1.52(2H, m), 2.44-2.51(2H, m), 3.16(3H, s), 5.10(1H, d), 5.12(1H, d), 6.72(1H, s), 6.75(1H, d), 6.84(1H, s), 7.21(1H, d), 7.61(1H, dd), 7.72(1H, dd), 7.74(1H, d), 7.95(1H, d), 8.31(1H, d), 8.42(1H, d).
水酸基のプロトンは、NMRのチャート上観測されていない。
実施例Ｂ８３
[4-ブチル-2-(メトキシメトキシ)フェニル](1-イソキノリル)メチル アセテート
実施例Ｂ８２の化合物を実施例Ｂ３８と同様に処理し、表題化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):0.90(3H, t), 1.28-1.40(2H, m), 1.50-1.60(2H, m), 2.22(3H, s), 2.54(2H, t), 3.41(3H, s), 5.22(1H, d), 5.26(1H, d), 6.77(1H, d), 6.94(1H, s), 7.29(1H, d), 7.55(1H, dd), 7.58(1H, d), 7.70(1H, dd), 7.81(1H, d), 8.05(1H, s), 8.35(1H, d), 8.55(1H, d).
実施例Ｂ８４
1-[4-ブチル-2-(メトキシメトキシ)ベンジル]イソキノリン
実施例Ｂ８３の化合物を実施例Ｂ３９と同様に処理し、表題化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):0.89(3H, t), 1.28-1.37(2H, m), 1.50-1.58(2H, m), 2.53(2H, t), 3.46(3H, s), 4.65(2H, s), 5.24(2H, s), 6.66(1H, dd), 6.89(1H, d), 6.92(1H, d), 7.51(1H, dd), 7.53(1H, d), 7.62(1H, dd), 7.79(1H, d), 8.23(1H, d), 8.47(1H, d).
実施例Ｂ８５
5-ブチル-2-(1-イソキノリルメチル)フェノール
実施例Ｂ８４の化合物88 mgのメタノール(1.5 ml)溶液に、5規定塩酸1.0 mlを加え、室温で14時間撹拌した。5規定水酸化ナトリウム水溶液にて中和した後、リン酸緩衝液でpHを6.8に調整し酢酸エチルで抽出した。無水硫酸マグネシウムで乾燥後、減圧濃縮し、表題化合物44 mgを得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):0.89(3H, t), 1.23-1.37(2H, m), 1.48-1.60(2H, m), 2.51(2H, t), 4.56(2H, s), 6.65(1H, dd), 6.82(1H, d), 7.21(1H, d), 7.55(1H, d), 7.68(1H, dd), 7.72(1H, dd), 7.82(1H, d), 8.35(1H, d), 8.44(1H, d).
水酸基のプロトンは、NMRのチャート上観測されていない。
実施例Ｂ８６
N-{3-[4-(1-イソキノリルメチル)フェニル]-2-プロピニル}-N,N-ジメチルアミン
実施例Ｂ４１の化合物と1-ジメチルアミノ-2-プロピンを用いて、実施例Ｂ４２と同様に処理し、表題化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):2.04(3H, s), 2.34(3H, s), 3.47(2H,s), 4.66(2H, s), 7.20(2H, d), 7.32(2H, d), 7.53(1H, dd), 7.56(1H, d), 7.65(1H, dd), 7.82(1H, d), 8.10(1H, d), 8.50(1H, d).
実施例Ｂ８７
1-{4-[3-(テトラヒドロ-2H-2-ピラニルオキシ)-1-プロピニル]ベンジル}イソキノリン
実施例Ｂ４１の化合物とテトラヒドロ-2-(2-プロピニルオキシ)-2H-ピランを用いて、実施例Ｂ４２と同様に処理し、表題化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):1.45-1.85(6H, m),3.50-3.60(1H, m), 3.84-3.90(1H, m), 4.42(1H, d), 4.48(1H, d), 4.66(2H, 8), 4.87(1H, dd), 7.15-7.21(2H, m), 7.33-7.36(2H, m), 7.50-7.70(3H, m), 7.81-7.86(1H, m), 8.07-8.10(1H, m), 8.48-8.51(1H, m).
実施例Ｂ８８
3-[4-(1-イソキノリルメチル)フェニル]-2-プロピン-1-オール
実施例Ｂ８７の化合物を実施例Ｂ４７と同様に処理し、表題化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):1.20-1.30(1H, m), 4.46(2H, s), 4.67(2H, s), 7.23(2H, d), 7.31(2H, d), 7.53(1H, dd), 7.58(1H, d), 7.65(1H, dd), 7.83(1H, d), 8.09(1H, d), 8.49(1H, d).
実施例Ｂ８９
N,N-ジメチル-4-ペンチンアミド
4-ペンチノイック酸552 mgの塩化メチレン(150 ml)溶液に、ジメチルアミン(2Mテトラヒドロフラン溶液)8.53 ml、トリエチルアミン2.59 mlそして1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド3221 mgを加え、室温で24時間撹拌した。反応混合物を1規定塩酸、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、水そして飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、減圧濃縮し、表題化合物129 mg を得た。得られた化合物はさらに精製することなく次反応に用いた。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):1.96-1.99(1H, m), 2.50-2.60(4H, m), 2.96(3H, s), 3.02(3H, s).
実施例Ｂ９０
N,N-ジメチル-5-[4-(1-イソキノリルメチル)フェニル]-4-ペンチンアミド
実施例Ｂ４１の化合物と実施例Ｂ８９の化合物を用いて、実施例Ｂ４２と同様に処理し、表題化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):2.59-2.64(2H, m), 2.71-2.75(2H, m), 2.96(3H, s), 3.03(3H, s), 4.66(2H, s), 7.18(2H, d), 7.28(2H, d), 7.43-7.70(3H, m), 7.90(1H, d), 8.09(1H, d), 8.50(1H, d).
実施例Ｂ９１
1-メチル-2-プロピニルテトラヒドロ-2H-2-ピラニルエーテル
3-ブチン-2-オール3051 mgのジクロロメタン(150 ml)溶液に、3,4-ジヒドロ-2H-ピラン7.15 mlとピリジニウムp-トルエンスルホン酸2187 mgを加え、室温で29時間撹拌した。
反応混合物を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、水そして飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、表題化合物を4698 mgを得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):1.45(1.05H, d),1.48(1.95H, d), 1.50-1.90(6H, m), 2.37(0.65H, d), 2.43(0.35H, d), 3.50-3.60(1.3H, m), 3.80-3.86(0.7H, m),4.4-3-4.50(0.35H, m), 4.52-4.60(0.65H, m), 4.77(0.35H, t), 4.94(0.65H, t).
実施例Ｂ９２
1-{4-[3-(テトラヒドロ-2H-2-ピラニルオキシ)-1-ブチニル]ベンジル}イソキノリン
実施例Ｂ４１の化合物と実施例Ｂ９１の化合物を用いて、実施例Ｂ４２と同様に処理し、表題化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):1.40-1.80(6H, m), 1.49(1.05H, d), 1.52(1.95H, d), 3.49-3.60(1H, m), 3.80-3.88(0.65H, m), 3.99-4.06(0.35H, m), 4.65(2H, s), 4.74(1H, q), 4.83(0.35H, t), 4.97(0.65H, t), 7.18-7.22(2H, m), 7.32(2H, d), 7.54(1H, dd), 7.57(1H, d), 7.64(1H, dd), 7.82(1H, d), 8.08(1H, d), 8.49(1H, d).
実施例Ｂ９３
4-[4-(1-イソキノリルメチル)フェニル]-3-ブチン-2-オール
実施例Ｂ９２の化合物を実施例Ｂ４７と同様の方法で処理し、表題化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):1.53(3H, d), 2.15(1H, brs), 4.68(2H, s), 4.72(1H, q), 7.21(2H, d), 7.31(2H, d), 7.54(1H, dd), 7.59(1H, d), 7.66(1H, dd), 7.84(1H, d), 8.10(1H, d), 8.51(1H, d).
実施例Ｂ９４
4-[4-(1-イソキノリルメチル)フェニル]-2-ブタノール
実施例Ｂ９３の化合物を実施例Ｂ４３と同様に反応させ、残査はLC-MS[溶出溶媒：0.1%トリフルオロ酢酸含有アセトニトリル溶液：0.1%トリフルオロ酢酸含有水溶液=1：99〜100：0/20分サイクル、流速：20 ml/分、カラム：YMC Combiprep ODS-AM, 20 mmΦ x 50 mm(long)]により分離精製し、表題化合物を得た。
MS m/z(ESI:MH+):292.2
実施例Ｂ９５
2-メチル-4-ペンチン-2-オール
0℃に冷却したイソブチレンオキシド1889 mgのテトラヒドロフラン(13 ml)とジメチルスルホキシド(20 ml)の混合溶液に、リチウムアセチリド-エチレンジアミン錯体を少しずつ加え、0℃にて5時間撹拌した。反応混合物に水を加え、酢酸エチルで抽出し、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、シリカゲルを用いて濾過した。濾液を減圧濃縮し、表題化合物3316 mgを得た。このものはそれ以上精製することなく次反応に用いた。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):1.33(6H, s), 2.09(1H, t), 2.38(2H, t).
水酸基のプロトンは、NMRのチャート上観測されていない。
実施例Ｂ９６
5-[4-(1-イソキノリルメチル)フェニル]-2-メチル-4-ペンチン-2-オール
実施例Ｂ４１の化合物と実施例Ｂ９５の化合物を用いて、実施例Ｂ４２と同様に処理し、表題化合物を得た。
1H-NMR(DMSO-d6)δ(ppm):1.18(6H, s), 2.28(1H, s), 2.42(2H, s), 4.62(2H, s), 7.10-7.30(4H, m), 7.62(1H, dd), 7.71(1H, d), 7.72(1H, dd), 7.94(1H, d), 8.27(1H, d), 8.42(1H, d).
実施例Ｂ９７
5-[4-(1-イソキノリルメチル)フェニル]-2-メチル-2-ペンタノール
実施例Ｂ９６の化合物を実施例Ｂ４３と同様に反応させ、残査はLC-MS[溶出溶媒：0.1%トリフルオロ酢酸含有アセトニトリル溶液：0.1%トリフルオロ酢酸含有水溶液=1：99〜100：0/20分サイクル、流速：20 ml/分、カラム：YMC Combiprep ODS-AM, 20 mmΦ x 50 mm(long)]により分離精製し、表題化合物を得た。
MS m/z(ESI:MH+):320.2
実施例Ｂ９８
4-ベンジルオキシ-2-(メトキシメトキシ)ベンズアルデヒド
4-ベンジルオキシ-2-ヒドロキシベンズアルデヒド2071 mgのテトラヒドロフラン(30 ml)溶液に、N,N-ジイソプロピルエチルアミン1.98 mlとクロロメチルメチルエーテル0.76 mlを加え、加熱還流下19時間撹拌した。この反応溶液にN,N-ジイソプロピルエチルアミン2.7 mlとクロロメチルメチルエーテル1.04 mlを加え、加熱還流下さらに１0時間撹拌した。反応混合物に水を加え、酢酸エチルで抽出し、飽和塩化アンモニウム水溶液、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、シリカゲル及びアルミナを用いて濾過した。濾液を減圧濃縮し、表題化合物2470 mg を得た。この化合物はさらに精製することなく次反応に用いた。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):3.52(3H, s), 5.12(2H, s), 5.27(2H, s), 6.68(1H, dd), 6.80(1H, d), 7.33-7.45(5H, m), 7.82(1H, d), 10.33(1H, s).
実施例Ｂ９９
[4-(ベンジルオキシ)-2-(メトキシメトキシ)フェニル](1-イソキノリル)メタノール
実施例Ｂ９８の化合物を実施例Ｂ８２と同様に処理し、表題化合物を得た。
1H-NMR(DMSO-d6)δ(ppm):3.16(3H, s), 5.01(2H, s), 5.11(1H, d), 5.14(1H, d), 6.59(1H, dd), 6.66-6.70(2H, m), 7.18(1H, d), 7.31(1H, d), 7.34-7.42(4H, m), 7.61(1H, dd), 7.71(1H, d), 7.75(1H, d), 7.95(1H, d), 8.28(1H, d), 8.43(1H, d).
水酸基のプロトンは、NMRのチャート上観測されていない。
実施例Ｂ１００
[4-(ベンジルオキシ)-2-(メトキシメトキシ)フェニル](1-イソキノリル)メチル アセテート
実施例Ｂ９９の化合物を実施例Ｂ３８と同様に処理し、表題化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):2.21(3H, s), 3.42(3H, s), 4.98(1H, d), 5.00(1H, d),5.21-5.27(2H, m), 6.54(1H, dd), 6.81(1H, d), 7.25(1H, d), 7.30-7.41(5H, m), 7.53(1H, dd), 7.57(1H, d), 7.63(1H, dd), 7.80(1H, d), 8.00(1H, s), 8.29(1H, d), 8.55(1H, d).
実施例Ｂ１０１
4-(1-イソキノリルメチル)-3-(メトキシメトキシ)フェノール
実施例Ｂ１００の化合物を実施例Ｂ３９と同様に処理し、表題化合物を得た。
1H-NMR(DMSO-d6)δ(ppm):3.36(3H, s), 4.44(2H, s), 5.17(2H, s), 6.22(1H, d), 6.52(1H, s), 6.67(1H, d), 7.57-7.76(3H, m), 7.92(1H, d), 8.22(1H, d), 8.37(1H, d), 9.24(1H, brs).
実施例Ｂ１０２
4-(1-イソキノリルメチル)-3-(メトキシメトキシ)フェニルトリフルオロメタンスルホネート
実施例Ｂ１０１の化合物を実施例Ｂ４１と同様に処理して表題化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):3.43(3H, s), 4.65(2H, s), 5.24(2H, s), 6.77(1H, dd), 7.04(1H, d), 7.07(1H, d), 7.54-7.61(2H, m), 7.67(1H, dd), 7.84(1H, d), 8.16(1H, d), 8.47(1H, d).
実施例Ｂ１０３
1-{2-(メトキシメトキシ)-[4-(テトラヒドロ-2H-2-ピラニルオキシ)-1-ブチニル]ベンジル}イソキノリン
実施例Ｂ１０２の化合物と2-(3-ブチニルオキシ)テトラヒドロ-2H-ピランを用い、実施例Ｂ４２と同様に処理して表題化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):1.51-1.90(6H, m), 2.68(2H, t), 3.50(3H, s), 3.49-3.55(1H, m), 3.58-3.65(1H, m), 3.84-3.94(2H, m), 4.63-4.68(1H, m), 4.65(2H, s), 5.23(2H, s), 6.76(1H, dd), 7.04(1H, d), 7.07(1H, d), 7.49-7.69(3H, m), 7.81(1H, d), 8.14(1H, d), 8.47(1H, d).
実施例Ｂ１０４
5-(4-ヒドロキシ-1-ブチニル)-2-(1-イソキノリルメチル)フェノール
実施例Ｂ１０３の化合物を実施例Ｂ８５と同様に処理して表題化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):1.80(1H, brs), 2.66(2H, t), 3.73-3.82(2H, m), 4.58(2H, s), 6.87(1H, d), 7.04(1H, s), 7.23(1H, d), 7.60(1H, d), 7.69-7.78(2H, m), 7.86(1H, d), 8.37(1H, d), 8.42(1H, d).
フェノール性水酸基のプロトンは、NMRのチャート上観測されていない。
実施例Ｂ１０５
1-(t-ブチル)-1,1-ジメチルシリル{4-[4-(1-イソキノリルメチル)フェニル]-2-メチル-3-ブチニル}エーテル
氷冷した四臭化炭素11.19 gの塩化メチレン(60 ml)溶液に、トリフェニルフォスフィン18.37 gを加え、その温度で1時間撹拌した。この溶液にTetrahedron Lett.,4347 (1979)の文献に基づいて合成した3-{[1-(t-ブチル)-1,1-ジメチルシリル]オキシ}-2-メチルプロパナールの塩化メチレン溶液(14 ml)を滴下し、さらに1時間撹拌した。反応混合物を塩化メチレンで希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和塩化アンモニウム水溶液そして飽和食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥後、減圧濃縮した。このものにエーテルを加え不溶物を濾別し、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、t-ブチル[(4,4-ジブロモ-2-メチル-3-ブテニル)オキシ]ジメチルシラン2385 mgを得た。
次いで、-70℃に冷却したt-ブチル[(4,4-ジブロモ-2-メチル-3-ブテニル)オキシ]ジメチルシラン1326 mgのテトラヒドロフラン(10 ml)溶液にn-ブチルリチウム2.47Mヘキサン溶液3.15 mlを滴下し、その温度で1時間撹拌した。飽和塩化アンモニウム水溶液を加え、室温に昇温した。反応混合物に水を加え、エーテルで抽出した。エーテル層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、シリカゲル濾過し、濾液を減圧濃縮した。得られた残渣と実施例Ｂ４１の化合物を実施例Ｂ４２と同様に処理して、表題化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):0.07(6H, s), 0.90(9H, s), 1.18(3H, d),2.70-2.80(1H, m), 3.47(1H, dd), 3.70(1H, dd), 4.65(2H, s), 7.16(2H, d), 7.27(2H, d), 7.51(1H, dd), 7.56(1H, d), 7.64(1H, dd), 7.81(1H, d), 8.07(1H, d), 8.49(1H, d).
実施例Ｂ１０６
4-[4-(1--イソキノリルメチル)フェニル]-2-メチル-3-ブチン-1-オール
実施例Ｂ１０５の化合物を実施例Ｂ４７と同様に処理して表題化合物を得た。
1H-NMR(DMSO-d6)δ(ppm):1.11(3H, d), 2.60-2.70(1H, m), 3.28(1H, d), 3.44(1H, d), 4.58(2H, s), 4.85-4.90(1H, m), 7.23(4H, s), 7.61(1H, dd), 7.70(1H, d), 7.71(1H, dd), 7.93(1H, d), 8.25(1H, d), 8.42(1H, d).
実施例Ｂ１０７
1-{[1-(t-ブチル)-1,1-ジメチルシリル]オキシ}-3-ブチン-2-オール
窒素雰囲気下、無水テトラヒドロフラン20 mlを-78℃に冷却し、エチニルマグネシウムブロミド0.5モルのテトラヒドロフラン溶液90 mlを加えた。この溶液にt-ブチルジメチルシロキシアセトアルデヒド6000 mgのテトラヒドロフラン溶液(30 ml)を滴下した。-78℃で45分間、室温に昇温し1時間40分撹拌した。反応混合物を氷冷し、飽和塩化アンモニウム水溶液を加え、エーテルで抽出し、水と飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、シリカゲルを用いて濾過した。濾液を減圧濃縮し、表題化合物8.55 gを得た。この化合物はさらに精製することなく次反応に用いた。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):0.08(6H, s), 0.91(9H, s), 2.43 (1H, d), 2.60-2.66(1H, m), 3.65-3.70(1H, m), 3.73-3.81(1H, m), 4.38-4.42(1H, m).
実施例Ｂ１０８
1-{[1-(t-ブチル)-1,1-ジメチルシリル]オキシ}メチル)-2-プロピニル アセテート
実施例Ｂ１０７の化合物を実施例Ｂ３８と同様に処理し、表題化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):0.08(6H, s), 0.90(9H, s), 2.11(3H, s), 2.44(1H,d), 3.80-3.88(2H, m), 5.41-5.55(1H, m).
実施例Ｂ１０９
4-[4-(1-イソキノリルメチル)フェニル]-3-ブチン-1,2-ジオール
実施例Ｂ４１の化合物と実施例Ｂ１０８の化合物を用い、実施例Ｂ４２と同様に処理し、カップリング成績体を得た。さらにその成績体を実施例Ｂ４７と同様に水酸基保護基を脱保護し、表題化合物を得た。
1H-NMR(DMSO-d6)δ(ppm):3.40-3.45(1H, m), 3.70-3.82(1H, m), 4.30-4.35(1H, m), 4.63(2H, s), 4.90(1H, t), 5.46(1H, d), 7.25-7.30(4H, m), 7.62(1H, dd), 7.71(1H, d), 7.73(1H, dd), 7.94(1H, d), 8.28(1H, d), 8.43(1H, d).
実施例Ｂ１１０
1-{4-[2-(2,2-ジメチル-1,3-ジオキソラン-4-イル)-1-エチニル]ベンジル}イソキノリン
実施例Ｂ１０９の化合物34 mgのジメチルホルムアミド(2 ml)溶液に、2,2-ジメトキシプロパン0.36 ml、10-カンファースルホン酸43 mgそしてモレキュラシーブ4Åを加え、75℃で9時間撹拌した。反応混合物に飽和炭酸ナトリウム水溶液を加え、酢酸エチルで抽出し、水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、表題化合物を14 mgを得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):1.40(3H, s), 1.50(3H, s), 3.97(1H, dd), 4.21(1H, dd), 4.66(2H, s), 4.91(1H, dd), 7.19(2H, d), 7.32(2H, d), 7.52(1H, dd), 7.65-7.78(2H, m), 8.08(1H, d), 8.09(1H, d), 8.49(1H, d).
実施例Ｂ１１１
t-ブチル{[2-(1-エトキシエトキシ)-3-ブチニル]オキシ}ジメチルシラン
1-{[1-(t-ブチル)-1,1-ジメチルシリル]オキシ}-3-ブチン-2-オール1687 mgの塩化メチレン(90 ml)溶液に、エチルビニルエーテル1.21 mlとピリジニウムp-トルエンスルホン酸塩317 mgを加え、室温で1時間撹拌した。塩化メチレン層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液と飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、減圧濃縮し、表題化合物1962 mgを得た。この化合物はさらに精製することなく次反応に用いた。
1H-NMR(DMSO-d6)δ(ppm):0.00(6H, s), 0.81(9H, s), 1.01-1.07(3H, m), 1.10-1.20(1H, m), 1.18(3H, d), 3.35-3.63(4H, m), 4.18-4.27(1H, m), 4.74(0.5H, q), 4.81(0.5H, q).
実施例Ｂ１１２
1-{4-[4-{[1-(t-ブチル)-1,1-ジメチルシリル]オキシ}-3-(1-エトキシエトキシ) -1-ブチニル]ベンジル}イソキノリン
実施例Ｂ４１の化合物と実施例Ｂ１１１の化合物を用いて、実施例Ｂ４２と同様に処理し、表題化合物を得た。
1H-NMR(DMSO-d6)δ(ppm):0.00(6H, s), 0.80(9H, s), 1.01-1.05(3H, m), 1.19(3H, d), 3.39-3.70(4H, m), 4.41(0.5H, t), 4.48(0.5H, t), 4.59(2H, s), 4.79(0.5H, q), 4.87(0.5H, q), 7.20-7.30(4H, m), 7.58(1H, dd), 7.68(1H, d), 7.69(1H, dd), 7.91(1H, d), 8.24(1H, d), 8.38(1H, d).
実施例Ｂ１１３
1-{[1-(t-ブチル)-1,1-ジメチルシリル]オキシ}4-[4-(1-イソキノリルメチル)フェニル]-3-ブチン-2-オール
実施例Ｂ１１２の化合物474 mgのメタノール(15 ml)溶液に、ピリジニウムp-トルエンスルホン酸塩486 mgを加え、室温で24時間撹拌した。反応混合物に酢酸エチルを加え、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液と飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、表題化合物265 mgを得た。
1H-NMR(DMSO-d6)δ(ppm):0.01(6H, s), 0.82(9H, s), 3.55-3.62(2H, m), 4.30-4.39(1H, m), 4.61(2H, s), 5.51(1H, d), 7.20-7.27(4H, m), 7.50-7.63(1H, m), 7.67-7.74(2H, m), 7.92(1H, d), 8.27(1H, d), 8.41(1H, d).
実施例Ｂ１１４
1-(t-ブチル)- 1,1- ジメチルシリル{2-フルオロ-4-[4-(1-イソキノリルメチル)フェニル] -3-ブチニル}エーテル
窒素雰囲気下、-78℃に冷却した(ジエチルアミノ)サルファートリフルオリド44μlの塩化メチレン(2 ml)溶液に、実施例Ｂ１１３の化合物116 mgの塩化メチレン溶液(2 ml)を滴下し、15分間撹拌後、室温でさらに8時間撹拌した。反応混合物に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、塩化メチレンで抽出した。塩化メチレン層を水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、表題化合物42 mgを得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):0.10(6H, s), 0.91(9H, s), 3.83-4.00(2H, m), 4.67(2H, s), 5.17(1H, ddd), 7.22(2H, d), 7.34(2H, d), 7.53(1H, dd), 7.58(1H, d), 7.65(1H, dd), 7.83(1H, d), 8.08(1H, d), 8.50(1H, d).
実施例Ｂ１１５
2-フルオロ-4-[4-(1-イソキノリルメチル)フェニル]-3-ブチン-1-オール
実施例Ｂ１１４の化合物を実施例Ｂ４７と同様に処理し、表題化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):1.31(1H, brs), 3.77-3.95(2H, m), 4.67(2H, s), 5.35(1H, ddd), 7.22(2H, d), 7.35(2H, d), 7.53(1H, dd), 7.58(1H, d), 7.65(1H, dd), 7.83(1H, d), 8.07(1H, d), 8.50(1H, d).
実施例Ｂ１１６
1-(t-ブチル)- 1,1-ジメチルシリル{6- [4-(1-イソキノリルメチル)フェニル]-5-ヘキシニル}エーテル
実施例Ｂ４１の化合物とt-ブチル(5-ヘキシニルオキシ)ジメチルシランを用いて、実施例Ｂ４２と同様に処理し、表題化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):0.04(6H, s), 0.88(9H, s), 1.55-1.70(4H, m), 2.39(2H, t), 3.64(2H, t), 4.65(2H, s), 7.17(2H, d), 7.27(2H, d), 7.51(1H, dd), 7.55(1H, d), 7.64(1H, dd), 7.82(1H, d), 8.08(1H, d), 8.49(1H, d).
実施例Ｂ１１７
6-[4-(1-イソキノリルメチル)フェニル]-5-ヘキシン-1-オール
実施例Ｂ１１６の化合物実施例Ｂ４７と同様に処理し、表題化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):1.60-1.80(4H, m), 2.42(2H, t), 3.69(2H, t), 4.65(2H, s), 7.17(2H, d), 7.27(2H, d), 7.52(1H, dd), 7.57(1H, d), 7.64(1H, dd), 7.81(1H, d), 8.08(1H, d), 8.49(1H, d).
水酸基のプロトンは、NMRのチャート上観測されていない。
実施例Ｂ１１８
6-[4-(1-イソキノリルメチル)フェニル]-1-ヘキサノール
実施例Ｂ１１７の化合物を実施例Ｂ４３と同様に反応させ、残査はLC-MS[溶出溶媒：0.1%トリフルオロ酢酸含有アセトニトリル溶液：0.1%トリフルオロ酢酸含有水溶液=1：99〜100：0/20分サイクル、流速：20 ml/分、カラム：YMC Combiprep ODS-AM, 20 mmΦ x 50 mm(long)]により分離精製し、表題化合物を得た。
MS m/z(ESI:MH+):320.2
実施例Ｂ１１９
2-(4-ペンチニルオキシ)テトラヒドロ-2H-ピラン
4-ペンチン-1-オールを実施例Ｂ９１と同様に処理し、表題化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):1.50-1.90(8H, m), 1.95(1H, t), 2.30-2.35(2H, m), 3.46-3.54(2H, m), 3.80-3.90(2H, m), 4.60(1H, dd).
実施例Ｂ１２０
1-{4-[5-(テトラヒドロ-2H-2-ピラニルオキシ)-1-ペンチニル]ベンジル}イソキノリン
実施例Ｂ４１の化合物と実施例Ｂ１１９の化合物を用いて、実施例Ｂ４２と同様に処理し、表題化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):1.49-1.90(8H, m), 2.49(2H, t), 3.47-3.54(2H, m), 3.82-3.90(2H, m), 4.60(1H, dd), 4.65(2H, s), 7.17(2H, d), 7.27(2H, d), 7.52(1H, dd), 7.58(1H, d), 7.64(1H, dd), 7.82(1H, d), 8.09(1H, d), 8.49(1H, d).
実施例Ｂ１２１
5-[4-(1-イソキノリルメチル)フェニル]-4-ペンチン-1-オール
実施例Ｂ１２０の化合物を実施例Ｂ４７と同様に処理し、表題化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):1.80-1.88(2H, m), 2.51(2H, t), 3.80(2H, t), 4.65(2H, s), 7.18(2H, d), 7.29(2H, d), 7.52(1H, dd), 7.58(1H, d), 7.65(1H, dd), 7.82(1H, d), 8.09(1H, d), 8.49(1H, d).
水酸基のプロトンは、NMRのチャート上観測されていない。
実施例Ｂ１２２
5-[4-(1-イソキノリルメチル)フェニル]-4-ペンチニルシアニド
実施例Ｂ４１の化合物と5-シアノ-1-ペンチンを用いて、実施例Ｂ４２と同様に処理し、表題化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):1.85-1.98(2H, m), 2.40-2.60(4H, m), 4.66(2H, s), 7.20(2H, d), 7.28(2H, d), 7.53(1H, dd), 7.58(1H, d), 7.65(1H, dd), 7.83(1H, d), 8.09(1H, d), 8.50(1H, d).
実施例Ｂ１２３
1-[4-(3-メチル-1-ブチニル)ベンジル]イソキノリン
実施例Ｂ４１の化合物と3-メチル-1-ブチンを用いて、実施例Ｂ４２と同様に処理し、表題化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):1.23(6H, d), 2.70-2.78(1H, m), 4.65(2H, s), 7.18(2H, d), 7.28(2H, d), 7.51(1H, dd), 7.58(1H, d), 7.64(1H, dd), 7.82(1H, d), 8.08(1H, d), 8.50(1H, d).
実施例Ｂ１２４
1-[4-(5-メチル-1-ヘキシニル)ベンジル]イソキノリン
実施例Ｂ４１の化合物と5-メチル-1-ヘキシンを用いて、実施例Ｂ４２と同様に処理し、表題化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):0.91(6H, d), 1.47(2H, dt), 1.68-1.77(1H, m), 2.37(2H, t), 4.65(2H, s), 7.17(2H, d), 7.28(2H, d), 7.52(1H, dd), 7.57(1H, d), 7.64(1H, dd), 7.81(1H, d), 8.09(1H, d), 8.49(1H, d).
実施例Ｂ１２５
4-ペンチンアミド
4-ペンチノイック酸2446 mgのクロロホルム(75 ml)溶液に、1-エトキシカルボニル-2-エトキシ-1,2-ジヒドロキノリン6775 mgと炭酸水素アンモニウム5905 mgを加え、室温で17.5時間撹拌した。反応混合物をセライトを用いて濾過し、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、表題化合物を249 mgを得た。
1H-NMR(DMSO-d6)δ(ppm):2.21(2H, t), 2.29-2.33(2H, m), 2.73(1H, t), 6.78-6.88(1H, m), 7.28-7.38(1H, m).
実施例Ｂ１２６
5-[4-(1-イソキノリルメチル)フェニル]-4-ペンチンアミド
実施例Ｂ４１の化合物と実施例Ｂ１２５の化合物を用いて、実施例Ｂ４２と同様に処理し、表題化合物を得た。
1H-NMR(DMSO-d6)δ(ppm):2.51(2H, t), 2.85(2H, t), 3.70(2H, brs), 4.59(2H, s), 7.05(2H, d), 7.23(2H, d), 7.61(1H, dd), 7.70(1H, d), 7.72(1H, dd), 7.94(1H, d), 8.30(1H, d), 8.43(1H, d).
実施例Ｂ１２７
t-ブチル4-ペンチノエート
4-ペンチノイックアシッド2550 mgのN,N-ジメチルアセトアミド(230 ml)溶液に、ベンジルトリエチルアンモニウムクロリド5.92 g、炭酸カリウム93.4 gそしてt-ブチルブロミド143 mlを加え、55℃にで24時間撹拌した。反応混合物に水を加え、酢酸エチルで抽出し、水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、シリカゲルを用いて濾過した。濾液を減圧濃縮し、表題化合物2.10 gを得た。この化合物はさらに精製することなく次反応に用いた。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):1.46(9H, s), 1.96-1.97(1H, m), 2.45-2.47(4H, m).
実施例Ｂ１２８
t-ブチル5-[4-(1-イソキノリルメチル)フェニル]-4-ペンチノエート
実施例Ｂ４１の化合物と実施例Ｂ１２７の化合物を用いて、実施例Ｂ４２と同様に処理し、表題化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):1.45(9H, s), 2.49(2H, t), 2.64(2H, t), 4.64(2H, s), 7.21(2H, d), 7.26(2H, d), 7.52(1H, dd), 7.57(1H, d), 7.64(1H, dd), 7.82(1H, d), 8.09(1H, d), 8.49(1H, d).
実施例Ｂ１２９
5-[4-(1-イソキノリルメチル)フェニル]-4-ペンチノイック酸
実施例Ｂ１２８の化合物を実施例Ｂ６９と同様に反応させ、残査はLC-MS[溶出溶媒：0.1%トリフルオロ酢酸含有アセトニトリル溶液：0.1%トリフルオロ酢酸含有水溶液=1：99〜100：0/20分サイクル、流速：20 ml/分、カラム：YMC Combiprep ODS-AM, 20 mmΦ x 50 mm(long)]により分離精製し、表題化合物を得た。
MS m/z(ESI:MH+):316.1
以下の実施例の化合物は次の様に合成した。即ち実施例Ｂ３３に従い、実施例Ｂ４１の化合物と以下の各種反応剤を反応させ表題化合物を得た。各種反応剤とはアクリルアミド、N,N-ジメチルアクリルアミド、アクリル酸t-ブチルエステル、メチルビニルスルホンである。またその様にして得られたカップリング成績体を実施例Ｂ３９に従い還元するか、または実施例Ｂ４０に従いt-ブチルエステルを脱保護するか、またはその両方を行った。精製はシリカゲルカラムクロマトグラフィーもしくはLC-MS[溶出溶媒：0.1%トリフルオロ酢酸含有アセトニトリル溶液：0.1%トリフルオロ酢酸含有水溶液=1：99〜100：0/20分サイクル、流速：20 ml/分、カラム：YMC Combiprep ODS-AM, 20 mmΦ x 50 mm(long)]により行った。
実施例Ｂ１３０
(E)-3-[4-(1-イソキノリルメチル)フェニル]-2-プロペンアミド
MS m/z(ESI:MH+):289.3
実施例Ｂ１３１
3-[4-(1-イソキノリルメチル)フェニル]-2-プロパンアミド
MS m/z(ESI:MH+):291.2
実施例Ｂ１３２
N,N-ジメチル-(E)- 3-[4-(1-イソキノリルメチル)フェニル]-2-プロペンアミド
MS m/z(ESI:MH+):317.3
実施例Ｂ１３３
N,N-ジメチル3-[4-(1-イソキノリルメチル)フェニル]プロパンアミド
MS m/z(ESI:MH+):319.1
実施例Ｂ１３４
t-ブチル(E)-3-[4-(1-イソキノリルメチル)フェニル]-2-プロペノエート
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):1.51(9H, s), 4.68(2H, s), 6.28(1H, d), 7.27(2H, d), 7.39(2H, d), 7.49-7.60(3H, m), 7.65(1H, dd), 7.82(1H, d), 8.11(1H, d), 8.50(1H, d).
実施例Ｂ１３５
(E)-3-[4-(1-イソキノリルメチル)フェニル]-2-プロペノイック酸
MS m/z(ESI:MH+):290.2
実施例Ｂ１３６
t-ブチル 3-[4-(1-イソキノリルメチル)フェニル]プロパノエート
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):1.37(9H, s), 2.47(2H, t), 2.83(2H, t), 4.64(2H, s), 7.07(2H, d), 7.19(2H, d), 7.52(1H, dd), 7.56(1H, d), 7.63(1H, dd), 7.81(1H, d), 8.14(1H, d), 8.49(1H, d).
実施例Ｂ１３７
3-[4-(1-イソキノリルメチル)フェニル]プロパノイック酸
MS m/z(ESI:MH+):292.1
実施例Ｂ１３８
(E)-2-[4-(1-イソキノリルメチル)フェニル]-1-エテニルメチルスルホン
MS m/z(ESI:MH+):324.1
実施例Ｂ１３９
1-{4-[2-(メチルスルホニル)エチル]ベンジル}イソキノリン
MS m/z(ESI:MH+):326.1
実施例Ｂ１４０
2-ベンゾイル-6,7-ジメトキシ-1,2-ジヒドロ-1-イソキノリンカルボニトリル
Tetrahedron,37(23),3977(1981)に基づいて合成した6,7-ジメトキシイソキノリン1.0 g（5.3ミリモル）の塩化メチレン（6.0 ml）溶液にシアン化カリウム1.0 g（16ミリモル）水溶液(2.3 ml)と塩化ベンゾイル1.1 ml（9.5ミリモル）を加え、加熱還流下２時間撹拌した。室温まで戻した後、セライトを用いて濾過を行い、塩化メチレンと水で洗浄した。得られた濾液を分離し、塩化メチレン層を水、２規定塩酸、水そして２規定水酸化ナトリウムで洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、表題化合物573 mgを得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):3.92(3H, s), 3.94(3H, s), 5.99(1H, d), 6.51-6.55(2H, m), 6.73(1H, s), 6.85(1H, s), 7.45-7.49(2H, m), 7.53-7.56(1H, m), 7.58-7.61(2H, m)
実施例Ｂ１４１
1-(4-ブチルベンジル)-6,7-ジメトキシイソキノリン
実施例Ｂ１４０の化合物と実施例Ｂ１の化合物を実施例Ｂ２と同様にして表題化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):0.90(3H, t), 1.27-1.36(2H, m), 1.51-1.58(2H, m), 2.54(2H, t), 3.88(3H, s), 4.01(3H, s), 4.57(2H, s), 7.05(1H, s), 7.07(2H, d), 7.19(2H, d), 7.32(1H, s), 7.43(1H, d), 8.37(1H, d)
実施例Ｂ１４２
1-(3-メトキシフェニル)-2-ニトロ-1-エタノール
m-アニスアルデヒド5.0 g（37ミリモル）とニトロメタン4.0 ml（73ミリモル）のメタノール（50 ml）溶液に、水酸化ナトリウム水溶液（水酸化ナトリウム1.5 g（37ミリモル）を水15 mlに溶解した。）を、溶液の温度が３０℃を越えないように滴下した。その後、室温で４時間撹拌した。氷冷後、酢酸水溶液（氷酢酸（37ミリモル）を水250 mlに溶解した。）を反応溶液に加え、酢酸エチルで抽出した。酢酸エチル層を、水と５％炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、表題化合物6.09 g を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):3.83(3H, s), 4.52(1H, dd), 4.61(1H, dd), 4.76-4.78(1H, m), 5.44-5.48(1H, m), 6.90(1H, dd), 6.96-6.98(2H, m), 7.25-7.34(1H, m)
実施例Ｂ１４３
2-アミノ-1-(3-メトキシフェニル)-1-エタノール
実施例Ｂ１４２の化合物3.0 g（15ミリモル）のテトラヒドロフラン（43 ml）とメタノール（43 ml）の混合溶液に、パラジウム−炭素（10%）0.64 gとギ酸アンモニウム4.8 gを加え、室温で１８時間撹拌した。触媒を濾去した後、濾液をエーテルで希釈し析出物を濾去し、得られた濾液を濃縮し、表題化合物を1.82 g 得た。この化合物はさらに精製することなく次の反応に用いた。
実施例Ｂ１４４
2-(4-ブチルフェニル)アセティックアシッド
4-n-ブチルベンジルアルコール9.6g（59ミリモル）のエーテル（120 ml）溶液に塩化チオニル4.7 ml（66ミリモル）を滴下し、室温で２時間撹拌した。減圧下、溶媒を除去し、過剰の塩化チオニルをベンゼンで共沸することにより除去した。残渣のジメチルスルフォキサイド（50 ml）溶液に、シアン化ナトリウム86 g（1.8モル）とヨウ化n-テトラブチルアンモニウム2.2 g（5.9ミリモル）を加え、室温で１６時間撹拌した。水を加え、酢酸エチルで抽出した。酢酸エチル層を、水と飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、n-ブチルフェニルアセトニトリル8.2 gを黄色油状物として得た。次に、水58 mlに濃硫酸48 mlを滴下し、その温度を５０℃まで冷却した。その溶液に、上記で得られたn-ブチルフェニルアセトニトリル8.2 gを滴下し、加熱還流下１６時間撹拌した。室温まで冷却後、析出した結晶をろ取し、水で洗浄した。その結晶を0.1規定の水酸化ナトリウム水溶液（200 ml）に溶解し、Norit5 gを加え、還流下２時間撹拌した。セライトを用いてNoritを濾去し、濾液を室温まで冷却後、1規定塩酸を用いて濾液を酸性にすることにより、結晶が析出した。析出した結晶をろ取し、水で洗浄し、結晶を乾燥後、表題化合物3.5 gを得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):0.93(3H, t), 1.30-1.40(2H, m), 1.53-1.62(2H, m), 2.59(2H, t), 3.62(2H, s), 7.15(2H, d), 7.20(2H, d) 但し、カルボキシル基のOHはNMRのチャート上は見えていない。
実施例Ｂ１４５
N-[2-ヒドロキシ-2-(3-メトキシフェニル)エチル]-2-(4-ブチルフェニル)アセタミド
実施例Ｂ１４４の化合物1.0 g（5.2ミリモル）のベンゼン（10 ml）溶液に、塩化チオニル0.76 ml（10ミリモル）を加え、還流下２時間撹拌した。濃縮後、さらにベンゼンと共沸させることにより過剰の塩化チオニルを除去した。得られた残渣と実施例Ｂ１４３の化合物0.87 g（5.2ミリモル）のエーテル（5 ml）溶液に、水酸化ナトリウム水溶液（水酸化ナトリウム0.21 gを水4.2 mlに溶解した。）を加え室温で３０分間激しく撹拌した。エーテル層を分離後、減圧濃縮し、表題化合物600 mgを得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):0.94(3H, t), 1.31-1.40(2H, m), 1.57-1.63(2H, m), 2.60(2H, m), 3.30-3.37(1H, m), 3.56(2H, s), 3.60-3.66(1H, m), 3.80(3H, s), 3.81(1H, d), 4.79-4.81(1H, m), 6.80-6.89(3H, m), 7.10(2H, d), 7.16(2H, d), 7.20-7.25(1H, m)
実施例Ｂ１４６
1-(4-ブチルベンジル)-6-メトキシイソキノリン
実施例Ｂ１４５の化合物600 mg（1.7ミリモル）のアセトニトリル（15 ml）溶液に、オキシ塩化リン1.6 mlを加え、還流下１時間３０分間撹拌した。氷冷後、５％炭酸水素ナトリウム水溶液を用いてアルカリ性にした後、酢酸エチルで抽出し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、表題化合物82 mg を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):0.89(3H, t), 1.27-1.36(2H, m), 1.50-1.58(2H, m), 2.53(2H, t), 3.92(3H, s), 4.57(2H, s), 7.05-7.07(3H, m), 7.13-7.18(3H, m), 7.45(1H, d), 8.06(1H, d), 8.41(1H, d)
実施例Ｂ１４７
1-(4-ブチルベンジル)-6-イソキノリノール
実施例Ｂ１４６の化合物82 mgに４７％臭化水素水を加え、還流下１９時間撹拌した。減圧濃縮した後、水を加え、炭酸ナトリウムで中和することにより結晶を析出させた。得られた結晶をろ取し、水で洗浄後、結晶を乾燥し、表題化合物74 mg を得た。
1H-NMR(CD3OD)δ(ppm):0.89(3H, t), 1.25-1.34(2H, m), 1.49-1.57(2H, m), 2.52(2H, t), 4.63(2H, s), 7.03-7.13(6H, m), 7.49(1H, d), 8.10(1H, d), 8.18(1H, d)
実施例Ｂ１４８
1-(4-ブチルベンジル)-6-プロポキシイソキノリン
実施例Ｂ１４７の化合物20 mg（0.069ミリモル）と1-ヨードプロパン0.4 ml（4.1ミリモル）のトルエン（1.0 ml）溶液に炭酸銀40 mg（0.14ミリモル）を加え、遮光下５０℃で４時間撹拌した。室温まで冷却後、セライトを用いて濾過し、トルエン−メタノール（9:1）混合溶液で洗浄した。得られた濾液を減圧濃縮した後、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、表題化合物13 mgを得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):0.90(3H, t), 1.08(3H, t), 1.30-1.33(2H, m), 1.51-1.57(2H, m), 1.86-1.91(2H, m), 2.54(2H, t), 4.05(2H, t), 4.58(2H, s), 7.05-7.07(3H, m), 7.14-7.18(3H, m), 7.43-7.44(1H, m), 8.05-8.07(1H, m), 8.40-8.41(1H, m)
実施例Ｂ１４９
1-(4-ブチルベンジル)-6-(2-ピペリジノエトキシ)イソキノリン
実施例Ｂ１４８と同様にして表題化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):0.89(3H, t), 1.26-1.36(2H, m), 1.46-1.57(8H, m), 2.50-2.54(6H, m), 2.83-2.86(2H, m), 4.23(2H, t), 4.56(2H, s), 7.04-7.06(3H, m), 7.13-7.17(3H, m), 7.43(1H, d), 8.04(1H, d), 8.40(1H, d)
実施例Ｂ１５０
N-(-{[1-(4-ブチルベンジル)-6-イソキノリル]オキシ}エチル)-N,N-ジメチルアミン
実施例Ｂ１４８と同様にして表題化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):0.89(3H, t), 1.26-1.36(2H, m), 1.49-1.57(2H, m), 2.37(6H, s), 2.52(2H, t), 2.80(2H, t), 4.19(2H, t), 4.57(2H, s), 7.04-7.06(3H, m), 7.15-7.19(3H, m), 7.43(1H, d), 8.05(1H, d), 8.40(1H, d)
実施例Ｂ１５１
2-ベンゾイル-7-メトキシ-1,2-ジヒドロ-1-イソキノリンカルボニトリル
Tetrahedron, 27, 1253 (1971)に基づいて合成した7-メトキシイソキノリンを実施例Ｂ１４０と同様にして表題化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):3.87(3H, s), 6.03(1H, brd), 6.56-6.54(2H, m), 6.90(1H, s), 6.95(1H, dd), 7.17(1H, d), 7.46-7.50(2H, m), 7.54-7.62(3H, m)
実施例Ｂ１５２
1-(4-ブチルベンジル)-7-メトキシイソキノリン
実施例Ｂ１の化合物と実施例Ｂ１５１の化合物を実施例Ｂ２と同様にして表題化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):0.89(3H, t), 1.27-1.36(2H, m), 1.56-1.58(2H, m), 2.55(2H, t), 3.82(3H, s), 4.59(2H, s), 7.07(2H, d), 7.20(2H, d), 7.26-7.29(1H, m), 7.35(1H, d), 7.49(1H, d), 7.70(1H, d), 8.38-8.40(1H, m)
実施例Ｂ１５３
1-(4-ブロモベンジル)-7-メトキシイソキノリン
実施例Ｂ３１の化合物と実施例Ｂ１５１の化合物を実施例Ｂ２と同様にして表題化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):3.84(3H, s), 4.57(2H, s), 7.14-7.16(2H, m), 7.26(1H, s), 7.29-7.32(1H, m), 7.37-7.39(2H, m), 7.51(1H, d), 7.73(1H, d), 8.39(1H, d)
実施例Ｂ１５４
1-(4-ブチルベンジル)-7-イソキノリノール
実施例Ｂ１５２の化合物を実施例Ｂ１４７と同様にして表題化合物を得た。
1H-NMR(DMSO-d6)δ(ppm):0.83(3H, t), 1.21-1.26(2H, m), 1.44-1.48(2H, m), 4.68(2H, s), 7.11(2H, d), 7.18(2H, d), 7.59-7.62(2H, m), 8.10-8.17(2H, m), 8.38(1H, d), 10.9(1H, brs) (但し、ブチル基のメチレンプロトン２個分がDMSOのシグナルに重なっていて見えない。)
実施例Ｂ１５５
1-(4-ブチルベンジル)-7-イソキノリル トリフルオロメタンスルフォネート
実施例Ｂ１５４の化合物1.0 g（2.7ミリモル）のジメチルホルムアミド（30 ml）溶液にJ. Org. Chem.,64, 7638(1999)に基づいて合成した4-ニトロフェノールトリフラート0.72 g（2.7ミリモル）と炭酸カリウム1.1 g（8.1ミリモル）を加え、室温で２時間撹拌した。水を加え、酢酸エチルで抽出した。酢酸エチル層を１規定水酸化ナトリウムと飽和食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥後、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、表題化合物1.0 gを得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):0.90(3H, t), 1.27-1.37(2H, m), 1.51-1.59(2H, m), 2.54(2H, t), 5.10(2H, s), 6.38(1H, s), 6.95(2H, d), 7.04(2H, d), 7.44(1H, d), 7.55(1H, d), 7.75(1H, d), 8.45(1H, d)
実施例Ｂ１５６
1-(4-ブチルベンジル)-7-イソキノリンカルボニトリル
窒素雰囲気下、実施例Ｂ１５５の化合物400 mg（0.95ミリモル）のジメチルホルムアミド（2 ml）溶液に、シアン化亜鉛215 mg（1.8ミリモル）、テトラキストリフェニルフォスフィンパラジウム41 mg（0.035ミリモル）そして塩化リチウム120 mg（2.8ミリモル）を加え１２０℃で２時間撹拌した。室温まで冷却後、飽和炭酸水素ナトリウムを加え、酢酸エチルで抽出した。酢酸エチル層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、表題化合物71 mgを得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):0.89(3H, t), 1.26-1.35(2H, m), 1.47-1.55(2H, m), 2.50(2H, t), 4.91(2H, s), 6.97(2H, d), 7.07(2H, d), 7.28-7.31(1H, m), 7.42(1H, d), 7.51(1H, d), 7.74(1H, d), 8.34(1H, d)
実施例Ｂ１５７
1-(4-ブチルベンジル)-7-[2-(1,1,1-トリメチルシリル)-1-エチニル]イソキノリン
実施例Ｂ１５５の化合物100 mg（0.24ミリモル）とトリメチルシリルアセチレン65μl（0.47ミリモル）のジメチルホルムアミド（3.0 ml）溶液に、酢酸パラジウム11 mg（0.047ミリモル）、1,1-ビスジフェニルフォスフィノフェロセン72 mg（0.13ミリモル）そして塩化リチウム25 mg（0.59ミリモル）を加え窒素置換した。この溶液にトリエチルアミン59μl（0.43ミリモル）とヨウ化銅2 mg（0.018ミリモル）を加え、８０℃で２１時間撹拌した。室温まで冷却後、水と酢酸エチルを加え分配した。酢酸エチル層を水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、表題化合物7.0 mg を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):0.28-0.32(9H, m), 0.92(3H, t), 1.32-1.38(2H, m), 1.54-1.57(2H, m), 2.57(2H, t), 4.63(2H, s), 7.10(2H, d), 7.20(2H, d), 7.52(1H, d), 7.67-7.69(1H, m), 7.75(1H, d), 8.34(1H, d), 8.51(1H, d)
実施例Ｂ１５８
1-(4-ブチルベンジル)-7-(1-エチニル)イソキノリン
実施例Ｂ１５７の化合物6 mg（0.016ミリモル）のメタノール(1.0 ml)溶液に、炭酸カリウム13 mg（0.094ミリモル）を加え室温で１時間撹拌した。減圧濃縮した後、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、表題化合物3.0 mg を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):0.91(3H, t), 1.29-1.38(2H, m), 1.52-1.57(2H, m), 2.55(2H, t), 3.19(1H, s), 4.62(2H, s), 7.09(2H, d), 7.20(2H, d), 7.53(1H, d), 7.67-7.69(1H, m), 7.77(1H, d), 8.36(1H, s), 8.52(1H, d)
実施例Ｂ１５９
1-(4-ブチルベンジル)-7-エチルイソキノリン
実施例Ｂ１５８の化合物2.0 mgのテトラヒドロフラン（2.0 ml）溶液に、パラジウム−炭素5.0 mg（10%）を加え、室温で窒素雰囲気下（1 atom）１時間撹拌した。触媒を濾去し、濾液を濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、表題化合物0.21 mgを得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):0.89(6H, t), 1.25-1.32(2H, m), 1.48-1.57(2H, m), 2.53(2H, t), 2.80(2H, q), 4.62(2H, s), 7.06(2H, d), 7.20(2H, d), 7.49-7.52(2H, m), 7.73(1H, d), 7.95(1H, s), 8.43(1H, d)
実施例Ｂ１６０
1-(4-ブチルベンジル)-7-[4-(テトラヒドロ-2H-2-ピラニルオキシ)-1-ブチニル]イソキノリン
実施例Ｂ１５５の化合物100 mg（0.24ミリモル）と2-(3-ブチニルオキシ)テトラヒドロ-2H-ピラン73 mg（0.47ミリモル）のジメチルホルムアミド（3.0 ml）溶液に、酢酸パラジウム11 mg（0.047ミリモル）、1,1-ビスジフェニルフォスフィノフェロセン72 mg（0.13ミリモル）そして塩化リチウム25 mg（0.59ミリモル）を加え系内を窒素置換した。さらに、トリエチルアミン59μl（0.43ミリモル）とヨウ化銅2 mg（0.018ミリモル）を加え、８０℃で２４時間撹拌した。室温まで冷却後、水を加え酢酸エチルで抽出した。酢酸エチル層を水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、表題化合物25 mgを得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):0.90(3H, t), 1.28-1.38(2H, m), 1.52-1.67(6H, m), 1.72-1.79(1H, m), 1.79-1.88(1H, m), 2.54(2H, t), 2.78(2H, t), 3.53-3.56(1H, m), 3.66-3.72(1H,m), 3.91-3.99(2H, m), 4.60(2H, s), 4.71-4.73(1H, m), 7.08(2H, d), 7.19(2H, d), 7.50(1H, d), 7.59-7.62(1H, m), 7.72(1H, d), 8.24(1H, s), 8.48(1H, d)
実施例Ｂ１６１
4-[1-(4-ブチルベンジル)-7-イソキノリル]-3-ブチン-1-オール
実施例Ｂ１６０の化合物を実施例Ｂ２９と同様にして表題化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):0.89(3H, t), 1.27-1.39(2H, m), 1.51-1.57(2H, m), 1.83(1H, brs), 2.55(2H, t), 2.75(2H, t), 3.84-3.89(2H, m), 4.60(2H, s), 7.08(2H, d), 7.18(2H, d), 7.50(1H, d), 7.60-7.62(1H, m), 7.73(1H, d), 8.25(1H, s), 8.48(1H, d)
実施例Ｂ１６２
4-[1-(4-ブチルベンジル)-7-イソキノリル]-1-ブタノール
実施例Ｂ１６１の化合物を実施例Ｂ３０と同様にして表題化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):0.89(3H, t), 1.28-1.36(2H, m), 1.50-1.59(4H, m), 1.67-1.77(3H, m), 2.53(2H, t), 2.79(2H, t), 3.63(2H, t), 4.62(2H, s), 7.06(2H, d), 7.18(2H, d), 7.47-7.52(2H, m), 7.73(1H, d), 7.92(1H, s), 8.43(1H, d)
実施例Ｂ１６３
1-(4-ブチルベンジル)-7-プロポキシイソキノリン
実施例Ｂ１５４の化合物を実施例Ｂ１４８と同様にして表題化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):0.90(3H, t), 1.05(3H, t), 1.27-1.36(2H, m), 1.50-1.56(2H, m), 1.76-1.84(2H, m), 2.53(2H, t), 3.92(2H, t), 4.58(2H, s), 7.06(2H, d), 7.19(2H, d), 7.26-7.29(1H, m), 7.34(1H, d), 7.48(1H, d), 7.70(1H, d), 8.38(1H, d)
実施例Ｂ１６４
1-(4-ブチルベンジル)-7-(2-ピペリジノエトキシ)イソキノリン
実施例Ｂ１４８と同様にして表題化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):0.89(3H, t), 1.27-1.36(2H, m), 1.43-1.58(4H, m), 1.61-1.69(4H, m), 2.51-2.55(6H, m), 2.79(2H, t), 4.11(2H, t), 4.57(2H, s), 7.06(2H, d), 7.18(2H, d), 7.28-7.30(1H, m), 7.36(1H, d), 7.48(1H, d), 7.70(1H, d), 8.38(1H, d)
実施例Ｂ１６５
N-(2-{[1-(4-ブチルベンジル)-7-イソキノリル]オキシ}エチル)-N,N-ジメチルアミン
実施例Ｂ１４８と同様にして表題化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):0.89(3H, t), 1.27-1.36(2H, m), 1.50-1.57(2H, m), 2.35(6H, s), 2.53(2H, t), 2.75(2H, t), 4.06(2H, t), 4.58(2H, s), 7.06(2H, d), 7.18(2H, d), 7.30-7.33(1H, m), 7.36(1H, d), 7.48(1H, d), 7.70(1H, d), 8.39(1H, d)
実施例Ｂ１６６
1-(4-ブチルベンジル)-7-イソキノリル(2-モルフォリノエチル)エーテル
実施例Ｂ１４８と同様にして表題化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):0.89(3H, t), 1.27-1.36(2H, m), 1.50-1.58(2H, m), 2.51-2.58(6H, m), 2.81(2H, t), 3.75(4H, t), 4.11(2H, t), 4.58(2H, s), 7.06(2H, d), 7.17(2H, d), 7.28-7.31(1H, m), 7.35(1H, d), 7.49(1H, d), 7.71(1H, d), 8.39(1H, d)
実施例Ｂ１６７
7-(ベンジルオキシ)-1-(4-ブチルベンジル)イソキノリン
実施例Ｂ１４８と同様にして表題化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):0.89(3H, t), 1.27-1.36(2H, m), 1.50-1.54(2H, m), 2.54(2H, t), 4.54(2H, s), 5.06(2H, s), 7.05(2H, d), 7.14(2H, d), 7.34-7.43(7H, m), 7.49(1H, d), 7.72(1H, d), 8.39(1H, d)
実施例Ｂ１６８
1-(4-ブチルベンジル)-7-(2-ピリジルメトキシ)イソキノリン
実施例Ｂ１４８と同様にして表題化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):0.89(3H, t), 1.27-1.36(2H, m), 1.49-1.57(2H, m), 2.52(2H, t), 4.51(2H, s), 5.25(2H, s), 7.02(2H, d), 7.14(2H, d), 7.24-7.27(1H, m), 7.40(1H, dd), 7.47-7.50(3H, m), 7.68-7.72(1H, d), 7.74(1H, d), 8.39(1H, d), 8.64-8.66(1H, m)
実施例Ｂ１６９
1-(4-ブチルベンジル)-7-(3-ピリジルメトキシ)イソキノリン
実施例Ｂ１４８と同様にして表題化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):0.89(3H, t), 1.27-1.36(2H, m), 1.50-1.58(2H, m), 2.54(2H, t), 4.57(2H, s), 5.06(2H, s), 7.07(2H, d), 7.15(2H, d), 7.31-7.36(2H, m), 7.42(1H, d), 7.51(1H, d), 7.74-7.76(2H, m), 8.42(1H, d), 8.61-8.62(1H, m), 8.69-8.70(1H, m)
実施例Ｂ１７０
1-(4-ブチルベンジル)-7-(4-ピリジルメトキシ)イソキノリン
実施例Ｂ１４８と同様にして表題化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):0.89(3H, t), 1.27-1.36(2H, m), 1.50-1.56(2H, m), 2.54(2H, t), 4.53(2H, s), 5.09(2H, s), 7.04(2H, d), 7.09(2H, d), 7.33-7.39(4H, m), 7.51(1H, d), 7.76(1H, d), 8.41(1H, d), 8.63-8.64(2H, m)
実施例Ｂ１７１
1-(4-ブチルベンジル)-7-[(2-メトキシベンジル)オキシ]イソキノリン
実施例Ｂ１４８と同様にして表題化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):0.89(3H, t), 1.27-1.36(2H, m), 1.50-1.57(2H, m), 2.53(2H, t), 3.82(3H, s), 4.52(2H, s), 5.04(2H, s), 6.88-6.91(1H, m), 6.99-7.02(2H, m), 7.05(2H, d), 7.14(2H, d), 7.32(1H, t), 7.36(1H, dd), 7.43(1H, d), 7.48(1H, d), 7.72(1H, d), 8.39(1H, d)
実施例Ｂ１７２
1-(4-ブチルベンジル)-7-[(3-メトキシベンジル)オキシ]イソキノリン
実施例Ｂ１４８と同様にして表題化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):0.89(3H, t), 1.27-1.36(2H, m), 1.50-1.56(2H, m), 2.53(2H, t), 3.90(3H, s), 4.53(2H, s), 5.16(2H, s), 6.93-6.98(2H, m), 7.03(2H, d), 7.15(2H, d), 7.30-7.35(1H, m), 7.37(1H, dd), 7.41-7.43(1H, m), 7.47(1H, d), 7.51(1H, d), 7.71(1H, d), 8.37(1H, d)
実施例Ｂ１７３
1-(4-ブチルベンジル)-7-[(4-メトキシベンジル)オキシ]イソキノリン
実施例Ｂ１４８と同様にして表題化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):0.89(3H, t), 1.27-1.37(2H, m), 1.51-1.57(2H, m), 2.54(2H, t), 3.83(3H, s), 4.55(2H, s), 4.99(2H, s), 6.93(2H, d), 7.06(2H, d), 7.15(2H, d), 7.32-7.36(3H, m), 7.44(1H, d), 7.48(1H, d), 7.71(1H, d), 8.38(1H, d)
実施例Ｂ１７４
7-(1,3-ベンゾオキシオール-5-イルメトキシ)-1-(4-ブチルベンジル)イソキノリン
実施例Ｂ１４８と同様にして表題化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):0.89(3H, t), 1.27-1.37(2H, m), 1.51-1.57(2H, m), 2.54(2H, t), 4.55(2H, s), 4.95(2H, s), 5.98(2H, s), 6.82(1H, d), 6.88(1H, dd), 6.92(1H, d), 7.06(2H, d), 7.15(2H, d), 7.33(1H, dd), 7.42(1H, d), 7.48(1H, d), 7.72(1H, d), 8.39(1H, d)
実施例Ｂ１７５
1-(4-ブチルベンジル)-7-[(2-ニトロベンジル)オキシ]イソキノリン
実施例Ｂ１４８と同様にして表題化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):0.87(3H, t), 1.26-1.34(2H, m), 1.48-1.56(2H, m), 2.51(2H, t), 4.53(2H, s), 5.49(2H, s), 7.03(2H, d), 7.14(2H, d), 7.40(1H, dd), 7.430-7.434(1H, m), 7.45-7.49(1H, m), 7.51(1H, d), 7.64-7.68(1H, m), 7.76(1H, d), 7.85-7.87(1H, m), 8.22-8.24(1H, d), 8.41(1H, d)
実施例Ｂ１７６
1-(4-ブチルベンジル)-7-[(3-ニトロベンジル)オキシ]イソキノリン
実施例Ｂ１４８と同様にして表題化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):0.89(3H, t), 1.27-1.36(2H, m), 1.50-1.56(2H, m), 2.54(2H, t), 4.55(2H, s), 5.14(2H, s), 7.05(2H, d), 7.11(2H, d), 7.37-7.40(2H, m), 7.51(1H, d), 7.55-7.59(1H, m), 7.73-7.78(2H, m), 8.19-8.22(1H, m), 8.32-8.33(1H, m), 8.42(1H, d)
実施例Ｂ１７７
1-(4-ブチルベンジル)-7-(フェネチルオキシ)イソキノリン
実施例Ｂ１４８と同様にして表題化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):0.89(3H, t), 1.26-1.36(2H, m), 1.49-1.57(2H, m), 2.52(2H, t), 3.10(2H, t), 4.18(2H, t), 4.56(2H, s), 7.04(2H, d), 7.16(2H, d), 7.26-7.28(4H, m), 7.33-7.35(3H, m), 7.48(1H, d), 7.70(1H, d), 8.38-8.39(1H, m)
実施例Ｂ１７８
1-(4-ブチルベンジル)-7-(3-フェニルプロポキシ)イソキノリン
実施例Ｂ１４８と同様にして表題化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):0.89(3H, t), 1.27-1.36(2H, m), 1.49-1.57(2H, m), 2.09-2.15(2H, m), 2.52(2H, t), 2.82(2H, t), 3.97(2H, t), 4.55(2H, s), 7.04(2H, d), 7.16(2H, d), 7.20-7.23(3H, m), 7.27-7.33(4H, m), 7.48(1H, d), 7.70(1H, d), 8.38(1H, d)
実施例Ｂ１７９
1-(4-ブチルベンジル)-7-(2-シクロヘキシルエトキシ)イソキノリン
実施例Ｂ１４８と同様にして表題化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):0.89(3H, t), 0.94-1.02(2H, m), 1.17-1.36(4H, m), 1.36-1.57(4H, m), 1.65-1.76(7H, m), 2.53(2H, t), 3.98(2H, t), 4.58(2H, s), 7.06(2H, d), 7.19(2H, d), 7.25-7.28(1H, m), 7.33(1H, d), 7.47(1H, d), 7.69(1H, d), 8.37(1H, d)
実施例Ｂ１８０
6-ベンゾイル-5,6-ジヒドロ[1,3]ジオキソロ[4,5-g]イソキノリン-5-カルボニトリル
[1,3]ジオキソロ[4,5-g]イソキノリンを実施例Ｂ１４０と同様にして表題化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):5.94-5.96(1H, m), 6.03(1H, d), 6.04(1H, d), 6.47-6.54(2H, m), 6.70(1H, s), 6.83(1H, s), 7.45-7.49(2H, m), 7.54-7.62(3H, m)
実施例Ｂ１８１
5-(4-ブチルベンジル)[1,3]ジオキソロ[4,5-g]イソキノリン
実施例Ｂ１８０の化合物と実施例Ｂ１の化合物を実施例Ｂ２と同様にして表題化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):0.90(3H, t), 1.28-1.37(2H, m), 1.51-1.57(2H, m), 2.54(2H, t), 4.50(2H, s), 6.05(2H, s), 7.05-7.07(3H, m), 7.16(2H, d), 7.38(7.40(2H, m), 8.35(1H, d)
実施例Ｂ１８２
2-ベンゾイル-6-ブロモ-1,2-ジヒドロ-1-イソキノリンカルボニトリル
J. Am. Chem. Soc., 183(1942)に基づいて合成した6-ブロモイソキノリンを実施例Ｂ１４０と同様にして表題化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):6.01(1H, d), 6.53(1H, brs), 6.70(1H, brd), 7.24(1H, d), 7.33(1H, d), 7.47-7.51(3H, m), 7.56(3H, m)
実施例Ｂ１８３
6-ブロモ-1-(4-ブチルベンジル)イソキノリン
実施例Ｂ１８２の化合物と実施例Ｂ１の化合物を実施例Ｂ２と同様にして表題化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):0.89(3H, t), 1.27-1.36(2H, m), 1.50-1.58(2H, m), 2.53(2H, t), 4.60(2H, s), 7.06(2H, d), 7.15(2H, d), 7.46(1H, d), 7.59(1H, q), 7.98(1H, d), 8.02(1H, d), 8.51(1H, d)
実施例Ｂ１８４
2-ベンゾイル-5-ブロモ-1,2-ジヒドロ-1-イソキノリンカルボニトリルと2-ベンゾイル-7-ブロモ-1,2-ジヒドロ-1-イソキノリンカルボニトリルの混合物
J. Am. Chem. Soc., 61, 183(1939)に基づいて合成した5-または7-ブロモイソキノリンを実施例Ｂ１４０と同様にして表題化合物を得た。得られた化合物は分離精製することなく次の反応に用いた。
実施例Ｂ１８５
7-ブロモ-1-(4-ブチルベンジル)イソキノリン
実施例Ｂ１８４の化合物と実施例Ｂ１の化合物を実施例Ｂ２と同様にして表題化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):0.90(3H, t), 1.28-1.37(2H, m), 1.51-1.58(2H, m), 2.55(2H, t), 4.58(2H, s), 7.09(2H, d), 7.18(2H, d), 7.51-7.53(1H, m), 7.69-7.70(2H, m), 8.33-8.34(1H, m), 8.52(1H, d)
実施例Ｂ１８６
5-ベンゾイル-4,5-ジヒドロチエノ[3,2-c]ピリジン-4-カルボニトリル
J. Heterocycl. Chem., 30, 183 (1993)に基づいて合成したチエノ[3,2-c]ピリジンを実施例Ｂ１４０と同様にして表題化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):6.05(1H, d), 6.57(1H, brd), 6.66(1H, s), 7.07(1H, d), 7.32(1H, d), 7.46-7.50(2H, m), 7.54-7.62(3H, m)
実施例Ｂ１８７
4-(4-ブチルベンジル)チエノ[3,2-c]ピリジン
実施例Ｂ１８６の化合物と実施例Ｂ１の化合物を実施例Ｂ２と同様にして表題化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):0.90(3H, t), 1.27-1.37(2H, m), 1.51-1.59(2H, m), 2.54(2H, t), 4.47(2H, s), 7.07(2H, d), 7.19(2H, d), 7.42(1H, d), 7.47(1H, dd), 7.68(1H, d), 8.41(1H, d)
実施例Ｂ１８８
4-(4-メトキシベンジル)チエノ[3,2-c]ピリジン
実施例Ｂ１８６の化合物と4-メトキシベンジルクロリドを実施例Ｂ２と同様にして表題化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):3.75(3H, s), 4.44(2H, s), 6.79-6.82(2H, m), 7.19-7.22(2H, m), 7.43(1H, d), 7.46(1H, dd), 7.68(1H, d), 8.41(1H, d)
実施例Ｂ１８９
4-(チエノ[3,2-c]ピリジン-4-イルメチル)フェニル トリフルオロメタンスルフォネート
０℃に冷却した実施例Ｂ１８８の化合物510 mg（2.0ミリモル）の塩化メチレン（10 ml）溶液に、三臭化ホウ素の塩化メチレン溶液10 ml（1.0M, 10ミリモル）を滴下し、その温度で１時間半撹拌した。飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え弱アルカリ性にした後、酢酸エチルで抽出し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、減圧濃縮した。得られた残渣をピリジンに溶解し、０℃に冷却した後、トリフルオロメタンスルフォニック アンハイドライド0.34 ml（2.1ミリモル）を滴下し、その温度で２時間撹拌した。氷水に注ぎ、酢酸エチルで抽出し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィーで精製し、表題化合物312 mg を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):4.52(2H, s), 7.16-7.18(2H, m), 7.36(2H, m), 7.43-7.44(1H, m), 7.49(1H, d), 7.73(1H, d), 8.42(1H, d)
実施例Ｂ１９０
4-(4-ブロモベンジル)チエノ[3,2-c]ピリジン
実施例Ｂ１８６の化合物と実施例Ｂ３１の化合物を実施例Ｂ２と同様にして表題化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):4.45(2H, s), 7.14-7.16(2H, m), 7.37-7.39(2H, m), 7.41-7.43(1H, m), 7.45(1H, d), 7.71(1H, d), 8.41(1H, d)
実施例Ｂ１９１
4-(4-ブロモ-2-フルオロベンジル)チエノ[3,2-c]ピリジン
実施例Ｂ１８６の化合物と4-ブロモ2-フルオロベンジブロミドを実施例Ｂ２と同様にして表題化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):4.46(2H, s), 7.11(1H, t), 7.15-7.18(1H, m), 7.22-7.25(1H, m), 7.47(1H, d), 7.49(1H, d), 7.71(1H, d), 8.41(1H, d)
実施例Ｂ１９２
4-{4-[4-(テトラヒドロ-2H-2-ピラニルオキシ)-1-ブチニル]ベンジル}チエノ[3,2-c]ピリジン
実施例Ｂ１８９の化合物と2-(3-ブチニルオキシ)テトラヒドロ-2H-ピランを実施例Ｂ４２と同様に処理し、表題化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):1.40-1.90(6H, m), 2.69(2H, t), 3.45-3.65(2H, m), 3.78-3.95(2H, m), 4.48(2H, s), 4.66-4.69(1H, m), 7.18(2H, d), 7.27(2H, d), 7.41(1H, d), 7.44(1H, d), 7.70(1H, d), 8.41(1H, d).
実施例Ｂ１９３
4-[4-(チエノ[3,2-c]ピリジン-4-イルメチル)フェニル]-3-ブチン-1-オール
実施例Ｂ１９２の化合物を実施例Ｂ４７と同様に処理し、表題化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):2.67(2H, t), 3.79(2H, t), 4.50(2H, s), 7.20(2H, d), 7.32(2H, d), 7.41(1H, d), 7.44(1H, d), 7.71(1H, d), 8.42(1H, d).
水酸基のプロトンは、NMRのチャート上観測されていない。
実施例Ｂ１９４
6-ベンゾイル-6,7-ジヒドロチエノ[2,3-c]ピリジン-7-カルボニトリル
J. Heterocycl. Chem., 30, 183(1993)に基づいて合成したチエノ[2,3-c]ピリジンを実施例Ｂ１４０と同様にして表題化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):6.07(1H, d), 6.56(1H, brd), 6.75(1H, s), 6.97(1H, d), 7.37(1H, d), 7.46-7.51(2H, m), 7.54-7.64(3H, m)
実施例Ｂ１９５
7-(4-ブチルベンジル)チエノ[2,3-c]ピリジン
実施例Ｂ１９４の化合物と実施例Ｂ１の化合物を実施例Ｂ２と同様にして表題化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):0.90(3H, t), 1.28-1.37(2H, m), 1.51-1.59(2H, m), 2.55(2H, t), 4.40(2H, s), 7.09(2H, d), 7.28(2H, d), 7.34(1H, d), 7.57(1H, d), 7.62(1H, d), 8.47(1H, d)
実施例Ｂ１９６
7-(4-メトキシベンジル)チエノ[2,3-c]ピリジン
実施例Ｂ１９４の化合物と4-メトキシベンジルクロリドを実施例Ｂ２と同様にして表題化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):3.76(3H, s), 4.38(2H, s), 6.81-6.83(2H, m), 7.28-7.30(2H, m), 7.35(1H, d), 7.57(1H, d), 7.62(1H, d), 8.47(1H, d)
実施例Ｂ１９７
4-(チエノ[2,3-c]ピリジン-7-イルメチル)フェニル トリフルオロメタンスルフォネート
実施例Ｂ１９６の化合物を実施例Ｂ１８９と同様にして表題化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):4.44(2H, s), 7.17-7.19(2H, m), 7.38-7.40(1H, m), 7.44-7.46(2H, m), 7.61(1H, d), 7.65-7.67(1H, m), 8.47-8.49(1H, m)
実施例Ｂ１９８
7-(4-ブロモベンジル)チエノ[2,3-c]ピリジン
実施例Ｂ１９４の化合物と実施例Ｂ３１の化合物を実施例Ｂ２と同様にして表題化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):4.37(2H, s), 7.23-7.25(2H, m), 7.37(1H, d), 7.39-7.41(2H, m), 7.59(1H, d), 7.63-7.65(1H, m), 8.47(1H, d)
実施例Ｂ１９９
7-(4-ブロモ-2-フルオロベンジル)チエノ[2,3-c]ピリジン
実施例Ｂ１９４の化合物と4-ブロモ2-フルオロベンジブロミドを実施例Ｂ２と同様にして表題化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):4.40-4.41(2H, m), 7.12-7.20(2H, m), 7.23-7.26(1H, m), 7.37-7.39(1H, m), 7.59-7.62(1H, m), 7.65-7.67(1H, m), 8.45-8.47(1H, m)
実施例Ｂ２００
7-{4-[4-(テトラヒドロ-2H-2-ピラニルオキシ)-1-ブチニル]ベンジル}チエノ[2,3-c]ピリジン
実施例Ｂ１９７の化合物と2-(3-ブチニルオキシ)テトラヒドロ-2H-ピランを実施例Ｂ４２と同様に処理し、表題化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):1.50-1.90(6H, m), 2.69(2H, t), 3.49-3.54(1H, m), 3.58-3.65(1H, m), 3.85-3.95(2H, m), 4.41(2H, s), 4.68(1H, t), 7.26-7.31(4H, m), 7.36(1H, d), 7.58(1H, d), 7.63(1H, d), 8.47(1H, d).
実施例Ｂ２０１
4-[4-(チエノ[2,3-c]ピリジン-7-イルメチル)フェニル]-3-ブチン-1-オール
実施例Ｂ２００の化合物を実施例Ｂ４７と同様に処理し、表題化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):1.99(1H, brs), 2.67(2H, t), 3.79(2H, t), 4.42(2H, s), 7.27-7.34(4H, m), 7.36(1H, d), 7.59(1H, d), 7.64(1H, d), 8.47(1H, d).
実施例Ｂ２０２
2-クロロ-3-(メトキシメトキシ)ピリジン
窒素雰囲気下、氷冷した2-クロロ-3-ヒドロキシピリジン2.05 g (15.8ミリモル)のテトラヒドロフラン(30 ml)溶液に、66%水素化ナトリウム633 mg (17.4ミリモル)を加え、その温度で15分間攪拌した。その反応溶液にクロロメチルメチルエーテル1.32 ml (17.4ミリモル)を加え、その温度で30分間攪拌後、さらに室温で2時間攪拌した。水を加え、酢酸エチルを用いて抽出し、飽和食塩水で洗浄後、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、表題化合物2.44 gを得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):3.53(3H, s), 5.28(2H, s), 7.19(1H, dd), 7.49(1H, dd), 8.06(1H, dd)
実施例Ｂ２０３
2-クロロ-4-ヨード-3-(メトキシメトキシ)ピリジン
窒素雰囲気下、-78℃に冷却した1.51 M t-ブチルリチウム-n-ペンタン溶液8.01 ml (12.1ミリモル)のジエチルエーテル(15 ml)溶液に、実施例Ｂ２０２の化合物1.40 g (8.06ミリモル)のジエチルエーテル8 ml溶液を滴下し、その温度で15分間攪拌した。その反応溶液にヨウ素3.07 g (12.1ミリモル)を加え、徐々に室温まで昇温させた。チオ硫酸ナトリウム水溶液を加え、ジエチルエーテル層を分配し、飽和食塩水で洗浄後、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、表題化合物356 mgを得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):3.73(3H, s), 5.22(2H, s), 7.69(1H, d), 7.80(1H, d)
実施例Ｂ２０４
7-クロロフロ[2,3-c]ピリジン
実施例Ｂ２０３の化合物36.6 mg (0.143ミリモル)、テトラキストリフェニルホスフィンパラジウム16.5 mg (0.0143ミリモル)そしてヨウ化第1銅2.7 mg (0.014ミリモル)のジメチルホルムアミド(1.5 ml)溶液に、トリメチルシリルアセチレン28.3μl(0.201ミリモル)とトリエチルアミン59.8μl(0.429ミリモル)を加え、50℃で4時間攪拌した。室温まで放冷後水を加え、酢酸エチルを用いて抽出し、飽和食塩水で洗浄後、減圧濃縮した。残渣のメタノール(5 ml)溶液に、炭酸カリウム100 mg(0.724ミリモル)を加え、室温で1時間攪拌した。水を加え、ジエチルエーテルを用いて抽出し、飽和食塩水で洗浄後、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、表題化合物5.5 mgを得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):6.89(1H, d), 7.51(1H, d), 7.83(1H, d), 8.21(1H, d)
実施例Ｂ２０５
4-ブチルベンジルマグネシウムクロリド
実施例Ｂ１の化合物1.04 g (5.69ミリモル)、マグネシウム761 mg (31.3ミリモル)そして触媒量の1,2-ジブロモエタンのジエチルエーテル(11 ml)の混合液を加熱還流によりイニシエーションした後、熱源を除き、さらに実施例Ｂ１の化合物4.16 g (22.8ミリモル)のジエチルエーテル60 ml溶液を緩やかな還流を保つ速度で滴下し、30分間加熱還流した。室温まで放冷し表題化合物を0.4 Mジエチルエーテル溶液として得、そのまま次の反応に用いた。
実施例Ｂ２０６
7-(4-ブチルベンジル)フロ[2,3-c]ピリジン
実施例Ｂ２０４の化合物5.0 mg (0.033ミリモル)と[1,1'-ビス(ジフェニルホスフィノ)フェロセン]ジクロロニッケル(II)4.5 mg (0.0065ミリモル)のテトラヒドロフラン(1 ml)溶液に、実施例Ｂ２０５の化合物300μl(0.1ミリモル)を加え、50℃で1時間攪拌した。室温まで放冷後、酢酸エチルを加え、飽和塩化アンモニア水溶液と飽和食塩水で洗浄後、減圧濃縮した。残渣をNH-シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、表題化合物2.9 mgを得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):0.89(3H, t), 1.29-1.35(2H, m), 1.50-1.58(2H, m), 2.54(2H, t), 4.40(2H, s), 6.78(1H, d), 7.08(2H, d), 7.30(2H, d), 7.40(1H, d), 7.72(1H, d), 8.34(1H, d)
実施例Ｂ２０７
7-(4-ブチルベンジル)-1H-ピロロ[2,3-c]ピリジン
氷冷下、2-クロロ-3-アミノピリジンから特開平7-165708に記載の方法に基づいて合成した1-クロロピロロピリジン19.4 mg (0.127ミリモル)とジクロロ(ジフェニルホスフィノプロパン)ニッケル6.9 mg(0.013ミリモル)のテトラヒドロフラン(1 ml)溶液に、実施例Ｂ２０５の化合物800μl(0.3ミリモル)を加え、加熱還流下4時間撹拌した。室温まで放冷後、酢酸エチルを加え、飽和塩化アンモニア水溶液と飽和食塩水で洗浄後、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、表題化合物7.1 mgを得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):0.91(3H, t), 1.31-1.37(2H, m), 1.55-1.59(2H, m), 2.58(2H, t), 4.44(2H, s), 6.50(1H, d), 7.12(2H, d), 7.18(1H, d), 7.22(2H, d), 7.45(1H, d), 8.21(1H, d)
NHのプロトンは、NMRのチャート上観測されていない。
実施例Ｂ２０８
4-(4-ブチルベンジル)-1-イミダゾ[4,5-c]ピリジン
4-アミノ-2-クロロピリジンからJ.Heterocycl.chem.,2,196(1965)の文献記載の方法に基づいて合成した1-クロロイミダゾピリジン88.6 mg (0.577ミリモル)とジクロロ(ジフェニルホスフィノプロパン)ニッケル31.3 mg (0.0577ミリモル)のテトラヒドロフラン(2 ml)溶液に、実施例Ｂ２０５の化合物3.45 ml(1.38ミリモル)を加え、加熱還流下2時間撹拌した。室温まで放冷後、酢酸エチルを加え、シリカゲルを用いて濾過し、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、表題化合物64.2 mgを得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):0.86(3H, t), 1.23-1.32(2H, m), 1.44-1.52(2H, m), 2.47(2H, t), 4.56(2H, s), 7.02(2H, d), 7.19(2H, d), 7.34(1H, d), 8.00(1H, s), 8.25-8.27(1H, m)
NHのプロトンは、NMRのチャート上観測されていない。
実施例Ｂ２０９
4-ブロモ-1-イソキノリノール
氷冷した1-ヒドロキシイソキノリン5.01 g (34.5ミリモル)の酢酸(50 ml)溶液に、臭素1.78 ml (34.5ミリモル)を加え、室温で2時間攪拌した。その反応溶液に水、酢酸エチルそしてテトラヒドロフランを加え、濾紙を用いて濾過した。有機層を飽和食塩水で洗浄後、減圧濃縮した。残渣を酢酸エチルとヘキサンを用いて再結晶し、表題化合物6.19 gを得た。
1H-NMR(DMSO-d6)δ(ppm):7.56(1H, s), 7.59-7.63(1H, m), 7.76-7.78(1H, m), 7.84-7.89(1H, m), 8.23-8.26(1H, m), 11.59(1H, br s)
実施例Ｂ２１０
1,4-ジブロモイソキノリン
実施例Ｂ２０９の化合物1.40 g (8.06ミリモル)と3臭化リン6 mlの混合液を150℃で１時間攪拌した後、さらに１時間加熱還流した。室温まで放冷後、その反応溶液を氷に注ぎ、室温まで昇温させた。酢酸エチルを加え、飽和食塩水で洗浄後、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、表題化合物845 mgを得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):7.76-7.80(1H, m), 7.86-7.90(1H, m), 8.19(1H, d), 8.31-8.34(1H, m), 8.48(1H, s)
実施例Ｂ２１１
4-ブロモ-1-(4-ブチルベンジル)イソキノリン
実施例Ｂ２１０の化合物200 mg (0.697ミリモル)と[1,1'-ビス(ジフェニルホスフィノ)フェロセン]ジクロロニッケル(II)75.6 mg (0.139ミリモル)のテトラヒドロフラン(2 ml)溶液に、実施例Ｂ２０５の化合物2.5 ml(1ミリモル)を加え、室温で30分間攪拌した。酢酸エチルを加え、飽和塩化アンモニア水溶液、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液そして飽和食塩水で洗浄後、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、表題化合物98 mgを得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):0.89(3H, t), 1.29-1.34(2H, m), 1.51-1.60(2H, m), 2.53(2H, t), 4.59(2H, s), 7.06(2H, d), 7.16(2H, d), 7.57-7.61(1H, m), 7.73-7.77(1H, m), 8.15-8.19(2H, m), 8.69(1H, s)
実施例Ｂ２１２
1-(4-ブチルベンジル)-5,6,7,8-テトラヒドロイソキノリン
実施例Ｂ２１１の化合物13.0 mg (0.0367ミリモル)を酢酸エチルとメタノールの混合液(1:1, 1 ml)に溶解し、10%パラジウム−炭素(50%含水)13 mgを加え、室温で常圧水素雰囲気下12時間攪拌した。反応系中を窒素置換した後、触媒をセライトを用いて濾去した。得られた濾液を減圧濃縮し、表題化合物8.8 mgを得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):0.90(3H, t), 1.28-1.38(2H, m), 1.52-1.59(2H, m), 1.74-1.82(4H, m), 2.55(2H, t), 2.66(2H, t), 2.81(2H, t), 4.26(2H, s), 7.07-7.15(5H, m), 8.32(1H, d)
実施例Ｂ２１３
1-[2-(フェニル)ベンジル]イソキノリン
n-ブチルベンジルクロリドの代わりに2-フェニルベンジルブロミドを用いて、実施例Ｂ２と同様に処理し、表題化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):4.62(2H, s), 7.05(1H, d), 7.16(1H, dd), 7.22-7.50(8H, m), 7.52(1H, d), 7.58(1H, dd), 7.65(1H, d), 7.76(1H, d), 8.47(1H, d).
実施例Ｂ２１４
1-[4-フルオロ-2-(トリフルオロメチル)ベンジル] イソキノリン
n-ブチルベンジルクロリドの代わりに4-フルオロ-2-(トリフルオロメチル)ベンジルメタンスルホナートを用いて、実施例Ｂ２と同様に処理し、表題化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):4.83(2H, s), 6.87(1H, dd), 7.01(1H, ddd), 7.43(1H, dd), 7.54(1H, dd), 7.61(1H, d), 7.67(1H, dd), 7.85(1H, d), 7.96(1H, d), 8.49(1H, d).
実施例Ｂ２１５
1,3-ベンゾジオキソイル-4-イル(1-イソキノリル)メタノール
2,3-メチレンジオキシベンズアルデヒドを実施例Ｂ８２と様に処理し、表題化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):5.97-5.99(1H, m), 6.09(1H, brs), 6.20-6.40(1H, m), 6.54-6.60(2H, m), 6.65-6.70(2H, m), 7.52(1H, dd), 7.63(1H, d), 7.64(1H, dd), 7.84(1H, d), 8.04(1H, d), 8.53(1H, d).
実施例Ｂ２１６
1,3-ベンゾジオキソイル-4-イル(1-イソキノリル)メチル アセテート
実施例Ｂ２１５の化合物を実施例Ｂ３８と同様に処理し、表題化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):2.23(3H, s), 5.98-6.02(2H, m), 6.74-6.79(1H, m), 6.90-6.93(1H, m), 7.15-7.19(1H, m), 7.23-7.28(1H, m), 7.58(1H, dd), 7.60(1H, d), 7.66(1H, dd), 7.83(1H, d), 8.28(1H, d), 8.57(1H, d).
実施例Ｂ２１７
1-(1,3-ベンゾジオキソイル-4-イルメチル)イソキノリン
実施例Ｂ２１６の化合物を実施例Ｂ３９と同様に処理し、表題化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):4.62(2H, s), 6.02(2H, s), 6.64-6.70(3H, m), 7.57(1H, dd), 7.58(1H, d), 7.66(1H, dd), 7.83(1H, d), 8.23(1H, d), 8.50(1H, d).
実施例Ｂ２１８
1-(1-ナフチルメチル)イソキノリン
n-ブチルベンジルクロリドの代わりに1-(クロロメチル)ナフタレンを用いて、実施例Ｂ２と同様に処理し、表題化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):5.13(2H, s), 6.96(1H, d), 7.29(1H, d), 7.45-7.67(5H, m), 7.72(1H, d), 7.84-7.90(2H, m), 8.08(1H, d), 8.26(1H, d), 8.52(1H, d).
実施例Ｂ２１９
3-ブロモフェニルブチレート
氷冷した3-ブロモフェノール10.0 gのピリジン(50 ml)溶液に、n-ブチリルクロリド7.25 mlを加え、その温度で3時間撹拌した後、室温でさらに3.5時間撹拌した。反応混合物に氷を加え、酢酸エチルで抽出し、1規定塩酸と水で洗浄後、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、減圧濃縮した。残査をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し表題化合物12.77 gを得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):1.04(3H, t), 1.72-1.82(2H, m), 2.54(2H, t), 7.04(1H, dd), 7.22-7.29(2H, m), 7.36(1H, d).
実施例Ｂ２２０
1-(4-ブロモ-2-ヒドロキシフェニル)-1-ブタノン
窒素雰囲気下、実施例Ｂ２１９の化合物12.77 gのクロロベンゼン(70 ml)溶液に塩化アルミニウム10.51 gを加え、加熱還流下9時間撹拌した。反応混合物を室温に冷却し、氷を加え酢酸エチルで抽出し、水で洗浄後、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、減圧濃縮した。この化合物はさらに精製することなく次反応に用いた。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):0.91(3H, t), 1.53-1.65(2H, m), 3.00(2H, t), 7.02(1H, dd), 7.19(1H, d), 7.78(1H, d), 12.50(1H, s).
実施例Ｂ２２１
1-(4-ブロモ-2-メトキシフェニル)-1-ブタノン
実施例Ｂ２２０の化合物13.30 gのアセトン(75 ml)溶液に、炭酸カリウム9.07 gとヨウ化メチル3.92 mlを加え、加熱還流下4時間撹拌した。反応混合物をセライトを用いて濾過し、エーテルを加え不溶物を濾過し、濾液を減圧濃縮した。残査をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、表題化合物9.52 gを得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):0.95(3H, t), 1.64-1.74(2H, m), 2.91(2H, t), 3.90(3H, s), 7.10(1H, d), 7.14(1H, dd), 7.54(1H, d).
実施例Ｂ２２２
4-ブロモ-1-ブチル-2-メトキシベンゼン
実施例Ｂ２２１の化合物を実施例Ｂ３と同様に還元し、表題化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):0.92(3H, t),1.29-1.39(2H, m), 1.48-1.56(2H, m), 2.54(2H, t), 3.81(3H, s), 6.95(1H, s), 6.96-7.02(2H, m).
実施例Ｂ２２３
(4-ブチル-3-メトキシフェニル)(1-イソキノリル)ケトン
実施例Ｂ２２２の化合物を実施例Ｂ３６と同様に処理し、表題化合物を含む混合物として得た。
この混合物は分離精製することなく次の反応に用いた。
実施例Ｂ２２４
(4-ブチル-3-メトキシフェニル)(1-イソキノリル)メタノール
実施例Ｂ２２３の化合物を実施例Ｂ３７と同様に処理し、表題化合物を含む混合物として得た。
この混合物は分離精製することなく次の反応に用いた。
実施例Ｂ２２５
(4-ブチル-3-メトキシフェニル)(1-イソキノリル)メチル アセテート
実施例Ｂ２２４の化合物を実施例Ｂ３８と同様に処理し、表題化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):0.90(3H, t), 1.24-1.38(2H, m), 1.46-1.60(2H, m), 2.24(3H, s), 2.54(2H, t), 3.76(3H, s), 6.97(1H, s), 6.98(1H, d), 7.06(1H, d), 7.53-7.67(4H, m), 7.83(1H, d), 8.26(1H, d), 8.58(1H, d).
実施例Ｂ２２６
1-(4-ブチル-3-メトキシベンジル)イソキノリン
実施例Ｂ２２５の化合物を実施例Ｂ３９と同様に処理し、表題化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):0.89(3H, t), 1.27-1.38(2H, t), 1.45-1.54(2H, t), 2.52(2H, t), 3.72(3H, s), 4.63(2H, s), 6.78(1H, d), 6.79(1H, s), 6.99(1H, d), 7.53(1H, dd), 7.55(1H, d), 7.64(1H, dd), 7.80(1H, d), 8.19(1H, d), 8.49(1H, d).
実施例Ｂ２２７
2-ブチル-5-(1-イソキノリルメチル)フェノール
実施例Ｂ２２６の化合物を実施例Ｂ４０と同様に処理し、表題化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):0.91(3H, t), 1.30-1.40(2H, m), 1.52-1.65(2H, m), 2.55(2H, t), 4.55(2H, s), 6.46(1H, brs), 6.85(1H, d), 7.03(1H, d), 7.32-7.40(1H, m), 7.55(1H, dd), 7.68(1H, dd), 7.81(1H, d), 7.94-8.05(1H, m), 8.14(1H, d).
フェノール性水酸基のプロトンは、NMRのチャート上観測されていない。
実施例Ｂ２２８
2-ブロモ-3-(メトキシメトキシ)ピリジン
2-ブロモ-3-ヒドロキシピリジンを用い、実施例Ｂ２０２と同様に合成した。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):3.53(3H, s), 5.29(2H, s), 7.19-7.23(1H, m), 7.42-7.45(1H, m), 8.04-8.06(1H, m)
実施例Ｂ２２９
2-(4-ブチルベンジル)-3-(メトキシメトキシ)ピリジン
氷冷した実施例Ｂ２２８の化合物524 mg (2.40ミリモル)とジクロロ(ジフェニルホスフィノプロパン)ニッケル65.0 mg (0.120ミリモル)のテトラヒドロフラン(10 ml)混合溶液に、実施例Ｂ２０５の化合物7 ml(3ミリモル)を加え、加熱還流下5時間撹拌した。室温まで放冷後、酢酸エチルを加え、飽和塩化アンモニア水溶液、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液そして飽和食塩水で洗浄後、減圧濃縮した。残渣をNH-シリカゲルを用いて濾過した。減圧濃縮した後、残渣をメタノール(15 ml)に溶解し、トリエチルアミン500μl(3.59ミリモル)と10%パラジウム−炭素(50%含水)50 mgを加え、室温で常圧水素雰囲気下3時間攪拌した。反応系中を窒素置換した後、セライトを用いて触媒を濾去し、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、表題化合物280 mgを得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):0.89(3H, t), 1.28-1.34(2H, m), 1.52-1.58(2H, m), 2.53(2H, t), 3.33(3H, s), 4.16(2H, s), 5.16(2H, s), 7.04-7.10(3H, m), 7.20(2H, d), 7.33-7.35(1H, m), 8.19-8.20(1H, m)
実施例Ｂ２３０
2-(4-ブチルベンジル)-3-ピリジノール
実施例Ｂ２２９の化合物256 mg (0.849ミリモル)の塩化メチレン(5 ml)溶液に、トリフルオロ酢酸1 mlを加え、室温で終夜攪拌した。反応溶液に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、酢酸エチルを加え、飽和食塩水で洗浄後、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、表題化合物182 mgを得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):0.90(3H, t), 1.28-1.37(2H, m), 1.51-1.58(2H, m), 2.54(2H, t), 4.20(2H, s), 7.02-7.08(4H, m), 7.22(2H, d), 8.08-8.09(1H, m)
フェノール性水酸基のプロトンは、NMRのチャート上観測されていない。
実施例Ｂ２３１
2-(4-ブチルベンジル)-3-メトキシピリジン
実施例Ｂ２３０の化合物19.2 mg (0.0796ミリモル)のアセトン(1 ml)溶液に、炭酸カリウム33.0 mg (0.239ミリモル)とヨウ化メチル14.9μl (0.239ミリモル)を加え、室温で3時間攪拌した。その反応溶液に酢酸エチルを加え、飽和食塩水で洗浄後、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、表題化合物1.47 mgを得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):0.90(3H, t), 1.32-1.34(2H, m), 1.53-1.57(2H, m), 2.54(2H, t), 3.82(3H, s), 4.14(2H, s), 7.06(2H, d), 7.10-7.11(2H, m), 7.21(2H, d), 8.12-8.14(1H, m)
実施例Ｂ２３２
2-(4-ブチルベンジル)-3-クロロピリジン
氷冷した2,3-ジクロロピリジン525 mg (3.55ミリモル)とジクロロ(ジフェニルホスフィノプロパン)ニッケル96.2 mg (0.178ミリモル)のテトラヒドロフラン(4 ml)混合液に、実施例Ｂ２０５の化合物12 ml(5ミリモル)を加え、室温で1時間攪拌した。反応液に酢酸エチルを加え、飽和塩化アンモニア水溶液、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液そして飽和食塩水で洗浄後、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、表題化合物199 mgを得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):0.91(3H, t), 1.29-1.38(2H, m), 1.52-1.60(2H, m), 2.56(2H, t), 4.28(2H, s), 7.08-7.13(3H, m), 7.21(2H, d), 7.64(1H, dd), 8.46(1H, dd)
実施例Ｂ２３３
2-(4-ブチルベンジル)-3-エチルピリジン
実施例Ｂ２３２の化合物12.9 mg (0.0496ミリモル)とジクロロ(ジフェニルホスフィノフェロセン)ニッケル3.4 mg (0.0050ミリモル)のテトラヒドロフラン(1 ml)混合液に、0.97Mエチルマグネシウムクロリド102μl(0.993ミリモル)を加え、50℃で1時間攪拌し、さらに2時間加熱還流した。室温まで放冷後、その反応溶液に酢酸エチルを加え、飽和塩化アンモニア水溶液と飽和食塩水で洗浄後、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、表題化合物3.29 mgを得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):0.90-0.93(6H, m), 1.30-1.37(2H, m), 1.54-1.59(2H, m), 2.55-2.59(4H, m), 4.12(2H, s), 7.05-7.18(5H, m), 7.55-7.59(1H, m), 8.53-8.55(1H, m)
実施例Ｂ２３４
tert-ブチル N-(2-ブロモ-3-ピリジル)カルバメート
氷冷した3-アミノピリジン3.97 g (42.2ミリモル)のジメチルホルムアミド(25 ml)混合液に、N-ブロモコハク酸イミド7.51 g(42.2ミリモル)を加え、その温度で30分間攪拌した。その反応溶液に酢酸エチルを加え、飽和食塩水で洗浄後、減圧濃縮した。残渣の塩化メチレン(20 ml)溶液を氷冷した後、トリエチルアミン3.74 ml(26.8ミリモル)、触媒量のジメチルアミノピリジンそしてジ-t-ブチル ジカーボネート3.08 ml(13.4ミリモル)を加え、室温で終夜攪拌した。減圧濃縮した後、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、表題化合物344 mgを得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):1.55(9H, s), 7.03(1H, brs), 7.25(1H, dd), 8.03(1H, dd), 8.46(1H, d)
実施例Ｂ２３５
2-ブロモ-3-(N-t-ブトキシカルボニル-N-メチル)アミノピリジン
氷冷した実施例Ｂ２３４の化合物344 mg (1.26ミリモル)のジメチルホルムアミド(5 ml)溶液に、ヨウ化メチル157μl(2.52ミリモル)と66%水素化ナトリウム91.6 mg (2.52ミリモル)を加え、その温度で40分間攪拌した。その反応溶液に酢酸エチルを加え、飽和食塩水で洗浄後、シリカゲルを用いて濾過した。有機層を減圧濃縮し、表題化合物356 mgを得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):1.36(9H, s), 3.17(3H, s), 7.30(1H, dd), 7.55(1H, d), 8.30(1H, dd)
実施例Ｂ２３６
N-[2-(4-ブチルベンジル)-3-ピリジル]-N-メチルアミン
実施例Ｂ２３５の化合物62.8 mg (0.219ミリモル)を用い、実施例Ｂ２１１と同様にして4-ブチルベンジル基を導入することにより得られた化合物の塩化メチレン(2 ml)溶液に、トリフルオロ酢酸2 mlを加え、室温で1時間攪拌した。反応液を炭酸水素ナトリウム水溶液中に滴下し、酢酸エチルを加え、飽和食塩水で洗浄後、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、表題化合物29.7 mgを得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):0.91(3H, t), 1.29-1.38(2H, m), 1.53-1.60(2H, m), 2.56(2H, t), 2.72(3H, s), 3.63(1H, br s), 4.09(2H, s), 6.86(1H, d), 7.08-7.12(5H, m), 7.98(1H, dd)
実施例Ｂ２３７
N-[2-(4-ブチルベンジル)-3ピリジル]-N,N-ジメチルアミン
氷冷した実施例Ｂ２３６の化合物26.8 mg (0.105ミリモル)の塩化メチレン(2 ml)溶液に、酢酸12.1μl(0.211ミリモル)、37%ホルマリン15.8μl(0.211ミリモル)そしてトリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム44.7 mg (0.211ミリモル)を加え、室温で30分間攪拌した。酢酸エチルを加え、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液と飽和食塩水で洗浄後、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、表題化合物23.3 mgを得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):0.91(3H, t), 1.30-1.36(2H, m), 1.52-1.59(2H, m), 2.55(2H, t), 2.67(6H, s), 4.24(2H, s), 7.06(2H, d), 7.10(1H, dd), 7.18(2H, d), 7.40(1H, dd), 8.27(1H, dd)
実施例Ｂ２３８
2-(4-ブチルベンジル)-4-メトキシピリジン
2-クロロ-4-メトキシピリジンを用い、実施例Ｂ２１１と同様にして表題化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):0.91(3H, t), 1.31-1.37(2H, m), 1.53-1.59(2H, m), 2.57(2H, t), 3.78(3H, s), 4.06(2H, s), 6.61-6.65(2H, m), 7.11(2H, d), 7.17(2H, d), 8.36(1H, d)
実施例Ｂ２３９
2-(4-ブチルベンジル)-4-クロロピリジン
氷冷した実施例Ｂ２３８の化合物52.0 mg (0.204ミリモル)のジメチルホルムアミド(1 ml)溶液に、オキシ塩化リン57.0μl(0.612ミリモル)を加え、100℃で8時間攪拌した。放冷後、その反応溶液を氷に注ぎ、室温まで昇温した後、酢酸エチルを加え、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液と飽和食塩水で洗浄後、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、表題化合物2.29 mgを得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):0.92(3H, t), 1.31-1.38(2H, m), 1.53-1.61(2H, m), 2.59(2H, t), 4.10(2H, s), 7.12-.18(6H, m), 8.44(1H, d)
実施例Ｂ２４０
2-クロロ-3-メトキシピリジン
2-クロロ-3-ヒドロキシピリジンを用い、実施例Ｂ２３１と同様にして表題化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):3.93(3H, s), 7.21-7.22(2H, m), 7.99-8.01(1H, m)
実施例Ｂ２４１
2-クロロ-3,4-ジメトキシピリジン
窒素雰囲気下、-78℃に冷却した1.06 Mフェニルリチウム シクロペンタン-ジエチルエーテル溶液のテトラヒドロフラン(11 ml)溶液に、ジイソプロピルアミン84.0μl(0.599ミリモル)と実施例Ｂ２４０の化合物860 mg (5.99ミリモル)のテトラヒドロフラン4 ml溶液を加え、-40℃で1時間撹拌した後、さらに-18℃で20分間攪拌した。その反応溶液を-78℃に再冷却した後、トリメトキシボレート2.04 ml(18.0ミリモル)を滴下し、0℃で20分間攪拌した。その温度で29%アンモニア水溶液30 ml、塩化アンモニウム4.5 gそして30%過酸化水素水12 mlを順次加え、室温で2時間攪拌した。飽和チオ硫酸ナトリウム、酢酸そして酢酸エチルを加え、飽和食塩水で洗浄した。そしてシリカゲルを用いて濾過して得られた酢酸エチル層を、減圧濃縮した。残渣を用い、実施例Ｂ２３１と同様にして表題化合物31.3 mgを得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):3.89(3H, s), 3.94(3H, s), 6.82(1H, d), 8.05(1H, d)
実施例Ｂ２４２
2-(4-ブチルベンジル)-3,4-ジメトキシピリジン
実施例Ｂ２４１の化合物を用い、実施例Ｂ２０６と同様にして表題化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):0.90(3H, t), 1.26-1.35(2H, m), 1.53-1.57(2H, m), 2.54(2H, t), 3.70(3H, s), 3.89(3H, s), 4.12(2H, s), 6.72(1H, d), 7.06(2H, d), 7.21(2H, d), 8.20(1H, d)
実施例Ｂ２４３
2,4-ジ(4-ブチルベンジル)-3-メトキシピリジン
窒素雰囲気下、-78℃に冷却した1.43 M t-ブチルリチウムn-ペンタン溶液2.76 ml(3.95ミリモル)のジエチルエーテル(5 ml)溶液に、実施例Ｂ２４０の化合物436 mg (3.04ミリモル)のジエチルエーテル(2 ml)溶液を加え、その温度で30分間攪拌した。その反応溶液ににテトラメチルエチレンジアミン688μl(4.56ミリモル)とヘキサクロロエタン719 mg(3.04ミリモル)のジエチルエーテル3 ml溶液を加え、その温度でさらに1時間攪拌した。徐々に室温まで昇温した後、酢酸エチルを加え、飽和食塩水で洗浄した。そしてシリカゲルを用いて濾過して得られた酢酸エチル層を減圧濃縮した。残渣を用い、実施例Ｂ２０６と同様にして表題化合物10.1 mgを得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):0.89-0.94(6H, m), 1.31-1.37(4H, m), 1.52-1.62(4H, m), 2.53-2.59(4H, m), 3.74(3H, s), 4.07(2H, s), 4.13(2H, s), 6.84(1H, d), 6.98(1H, d), 7.04-7.22(8H, m)
実施例Ｂ２４４
2-(4-ブロモ-2-フルオロベンジル)-3-(メトキシメトキシ)ピリジン
窒素雰囲気下、-78℃に冷却した2.47 M n-ブチルリチウムn-ヘキサン溶液862μl(2.13ミリモル)のテトラヒドロフラン(3 ml)溶液に、実施例Ｂ２２８の化合物422 mg (1.94ミリモル)のテトラヒドロフラン(3 ml)溶液を加え、その温度で1時間攪拌した。その反応溶液に臭化第1銅139 mg(0.968ミリモル)を加え、0℃で1時間攪拌した後、-78℃に再冷却し、4-ブロモ-2-フルオロベンジルブロミド259 mg(0.968ミリモル)を加え、0℃で1時間攪拌した。その溶液にテトラメチルエチレンジアミン584μl(3.88ミリモル)を加え、その温度でさらに1時間攪拌した。反応液にジエチルエーテルとアンモニア水溶液を加え、有機層を飽和食塩水で洗浄後、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、表題化合物81.0 mgを得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):3.38(3H, s), 4.17(2H, s), 5.18(2H, s), 7.04(1H, t), 7.11-7.22(3H, m), 7.38(1H, dd), 8.19(1H, dd)
実施例Ｂ２４５
2-(4-ブロモ-2-フルオロベンジル)-3-ピリジノール
実施例Ｂ２４４の化合物134 mg (0.411ミリモル)の塩化メチレン(4 ml)にトリフルオロ酢酸1 mlを加え、室温で終夜攪拌した。飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を用いて中和後、酢酸エチルを加え、酢酸エチル層を飽和食塩水で洗浄後、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し表題化合物97.5 mgを得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):4.17(2H, s), 7.10-7.24(5H, m), 8.15(1H, t)
フェノール性水酸基のプロトンは、NMRのチャート上観測されていない。
実施例Ｂ２４６
2-(4-ブロモ-2-フルオロベンジル)-3-メトキシピリジン
実施例Ｂ２４５の化合物15.8 mg (0.0560ミリモル)のジメチルホルムアミド(1 ml)溶液に、炭酸カリウム38.7 mg (0.280ミリモル)とヨウ化メチル10.5μl (0.168ミリモル)を加え、室温で2時間攪拌した。反応液に酢酸エチルを加え、飽和食塩水で洗浄後、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、表題化合物14.0 mgを得た。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):3.82(3H, s), 4.15(2H, s), 7.03(1H, t), 7.12-7.22(4H, m), 8.13(1H, dd)
以下の実施例Ｂ化合物は、実施例Ｂ２４６と同様に合成し、精製はLC-MS[溶出溶媒：0.1%トリフルオロ酢酸含有アセトニトリル溶液：0.1%トリフルオロ酢酸含有水溶液＝1:99〜100:0/ 20分サイクル、流速：20 ml/分、カラム：YMC Combiprep ODS-AM、20 mmΦ x 50 mm(Long)]により行った。
実施例Ｂ２４７
2-(4-ブロモ-2-フルオロベンジル)-3-エトキシピリジン
MS m/z (ESI:MH+):310.0
実施例Ｂ２４８
2-(4-ブロモ-2-フルオロベンジル)-3-プロポキシピリジン
MS m/z (ESI:MH+):324.0
実施例Ｂ２４９
2-(4-ブロモ-2-フルオロベンジル)-3-ブトキシピリジン
MS m/z (ESI:MH+):338.1
実施例Ｂ２５０
2-(4-ブロモ-2-フルオロベンジル)-3-(ペンチルオキシ)ピリジン
MS m/z (ESI:MH+):352.1
実施例Ｂ２５１
2-(4-ブロモ-2-フルオロベンジル)-3-(ヘキシルオキシ)ピリジン
MS m/z (ESI:MH+):366.0
実施例Ｂ２５２
2-(4-ブロモ-2-フルオロベンジル)-3-(2-フルオロエトキシ)ピリジン
MS m/z (ESI:MH+):328.0
実施例Ｂ２５３
2-(4-ブロモ-2-フルオロベンジル)-3-(3-フルオロプロポキシ)ピリジン
MS m/z (ESI:MH+):342.0
実施例Ｂ２５４
2-(4-ブロモ-2-フルオロベンジル)-3-イソプロポキシピリジン
MS m/z (ESI:MH+):324.0
実施例Ｂ２５５
2-(4-ブロモ-2-フルオロベンジル)-3-(2,2,2-トリフルオロエトキシ)ピリジン
MS m/z (ESI:MH+):364.0
実施例Ｂ２５６
2-(4-ブロモ-2-フルオロベンジル)-3-(3,3,3-トリフルオロプロポキシ)ピリジン
MS m/z (ESI:MH+):378.0
実施例Ｂ２５７
［実施例Ａ２］に記載したS. cerevisiaeレポーター系を用いて化合物を評価した。細胞壁画分のセファロスポリナーゼ活性が化合物無処理時の50%以下になる最小濃度をIC50値とした。代表的な化合物の効果を表１に示す。
産業上の利用の可能性
本発明は、GPIアンカー蛋白質の細胞壁への輸送過程に関与する蛋白質をコードする遺伝子を明らかにした。更に本発明は、該蛋白質の活性を阻害する化合物のスクリーニング法も開示し、該阻害活性を持つ代表的な化合物をも開示するものである。
本発明は、GPIアンカー蛋白質の細胞壁への輸送過程を阻害するという、新規メカニズムの抗真菌剤が可能であることを、新規化合物をもって示した。
図１は、GPIアンカー蛋白質の細胞壁への輸送過程の模式図。GPIアンカー蛋白質は、一旦GPI（Glycosylphosphatidylinositol）にアンカーした後、細胞壁に輸送される。 図２は、S. cerevisiaeレポータ系での前記式（Ｉａ）に記載の化合物の活性を示すグラフ。前記式（Ｉａ）に記載の化合物の存在下では、0.39〜1.56μg/mlの濃度で培養上清画分中のセファロスポリナーゼ活性が上昇、細胞壁画分中の活性が低下し、3.13μg/ml以上の濃度で増殖抑制が見られた。 図３は、C. albicansの動物細胞付着への前記式（Ｉａ）に記載の化合物の影響を示すグラフ。増殖抑制の見られない1.56μg/mlの濃度でも、C. albicansの動物細胞への付着が半分程度にまで抑制された。 図４は、C. albicansのAls1p抗原量への前記式（Ｉａ）に記載の化合物の影響を示すグラフ。前記式（Ｉａ）に記載の化合物の存在下では、0.1〜0.39μg/mlの濃度で、培養上清画分中のAls1p抗原量が上昇し、細胞壁画分中の抗原量が低下した。 図５は、C. albicans遺伝子のGWT1遺伝子をプローブとしたサザンブロット解析を示す写真。EcoRIで6.5 kb、HindIIIで4.0 kb、EcoRI-HindIIIで2.0 kb、EcoRI-PstIで2.5 kbの単一のバンドが観察され、C. albicansの前記式（Ｉａ）に記載の化合物に対する耐性遺伝子のホモログは、単一の遺伝子として存在することが予想された。 図６は、GWT1遺伝子産物を過剰発現したS. cerevisiaeにおける前記式（Ｉａ）に記載の化合物の活性を示すグラフ。S. cerevisiae CW63株（図中の「W/T」）では、培養上清画分中のセファロスポリナーゼ活性が上昇し、細胞壁画分中の活性が低下している前記式（Ｉａ）に記載の化合物濃度（0.39〜1.56μg/ml）でも、S. cerevisiae CW63/GWT1株では影響が見られず、またS. cerevisiae CW63株では増殖が抑制される前記式（Ｉａ）に記載の化合物濃度（> 3.13μg/ml）でも、S. cerevisiae CW63/GWT1株（図中の「O/E」）では増殖抑制が見られなかった。 図７は、S.cerevisiae，S.pombe，C.albicansのGWT1遺伝子のコードする蛋白において高度に保存されている領域を整列させた図。

Claims (23)

  1. 真菌における過剰発現により、真菌に対し下記式（Ｉａ）で示される化合物に対する耐性を付与する作用を有する蛋白質をコードする、下記（ａ）から（ｅ）のいずれかに記載のDNA。
    （ａ）配列番号：２、４、６、２８、４０または５９に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするDNA
    （ｂ）配列番号：１、３、５、２７、３９、４１、５４または５８に記載の塩基配列を含むDNA
    （ｃ）配列番号：１、３、５、２７、３９、４１、５４または５８に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA
    （ｄ）配列番号：２、４、６、２８、４０または５９に記載のアミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が付加、欠失、置換および／または挿入されたアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするDNA
    （ｅ）配列番号：２９及び３１あるいは配列番号：２９及び３０をプライマーとして増幅されるDNA
  2. その機能の欠損により真菌の細胞壁におけるGPIアンカー蛋白質量を減少させる作用を有する蛋白質をコードする、下記（ａ）から（ｅ）のいずれかに記載のDNA。
    （ａ）配列番号：２、４、６、２８、４０または５９に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするDNA
    （ｂ）配列番号：１、３、５、２７、３９、４１、５４または５８に記載の塩基配列を含むDNA
    （ｃ）配列番号：１、３、５、２７、３９、４１、５４または５８に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA
    （ｄ）配列番号：２、４、６、２８、４０または５９に記載のアミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が付加、欠失、置換および／または挿入されたアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするDNA
    （ｅ）配列番号：２９及び３１あるいは配列番号：２９及び３０をプライマーとして増幅されるDNA
  3. 請求項１または２に記載のDNAによりコードされる蛋白質。
  4. 請求項１または２に記載のDNAが挿入されたベクター。
  5. 請求項１または２に記載のDNAまたは請求項４に記載のベクターを保持する形質転換体。
  6. 請求項３に記載の蛋白質が過剰発現している真菌である、請求項５に記載の形質転換体。
  7. 請求項３に記載の蛋白質の機能が欠損している真菌。
  8. 請求項５に記載の形質転換体を培養し、該形質転換体またはその培養上清から発現させた蛋白質を回収する工程を含む、請求項３に記載の蛋白質の製造方法。
  9. 請求項３に記載の蛋白質に結合する抗体。
  10. 抗真菌作用を有する化合物をスクリーニングする方法であって、
    （ａ）請求項３に記載の蛋白質に被検試料を接触させる工程、
    （ｂ）該蛋白質と被検試料との結合活性を検出する工程、
    （ｃ）該蛋白質に結合する活性を有する化合物を選択する工程、を含む方法。
  11. 抗真菌作用を有する化合物をスクリーニングする方法であって、
    （ａ）請求項３に記載の蛋白質が過剰発現している真菌に被検試料を接触させる工程、
    （ｂ）該真菌におけるGPIアンカー蛋白質の細胞壁への輸送量を検出する工程、
    （ｃ）請求項３に記載の蛋白質が過剰発現していない真菌に被検試料を接触させた場合と比較して、工程（ｂ）において検出されるGPIアンカー蛋白質の細胞壁への輸送量を減少させる化合物を選択する工程、を含む方法。
  12. 請求項１０または１１に記載のスクリーニングにより単離しうる、抗真菌作用を有する化合物。
  13. 真菌においてGPIアンカー蛋白質の細胞壁への輸送を阻害する化合物を有効成分とする抗真菌剤。
  14. 請求項９に記載の抗体または請求項１２に記載の化合物を有効成分とする、抗真菌剤。
  15. 〔式中R1aおよびR2aは同一または相異なってそれぞれ水素原子、ハロゲン原子、水酸基、ニトロ基、シアノ基、トリフルオロメチル基、トリフルオロメトキシ基、置換されてもよいC1-6アルキル基、C2-6アルケニル基、C2-6アルキニル基、置換されてもよいC1-6アルコキシ基、または式
    （式中X1は単結合、カルボニル基、または式 -S(O)2- で表わされる基を意味する；
    R5aおよびR6aは同一または相異なって、水素原子、または置換されていてもよいC1-6アルキル基を意味する）で表わされる基を示す。また、R1aとR2aは一緒になって、置換されていてもよいベンゼン環、置換されていてもよいピリジン環、置換されていてもよいピロール環、置換されていてもよいチオフェン環、置換されていてもよいフラン環、置換されていてもよいピリダジン環、置換されていてもよいピリミジン環、置換されていてもよいピラジン環、置換されていてもよいイミダゾール環、置換されていてもよいオキサゾール環、置換されていてもよいチアゾール環、置換されていてもよいピラゾール環、置換されていてもよいイソオキサゾール環、置換されていてもよいイソチアゾール環、置換されていてもよいシクロヘキサン環、および置換されていてもよいシクロペンタン環からなる群から選ばれる縮合環の形成してもよい；
    R3a、およびR4aは同一または相異なってそれぞれ、水素原子、ハロゲン原子、水酸基、ニトロ基、シアノ基、カルボキシル基、ホルミル基、ヒドロキシイミノ基、トリフルオロメチル基、トリフルオロメトキシ基、C1-6アルキル基、C1-6アルコキシ基、C2-6アルケニル基、C2-6アルキニル基、式 -C(O)NR7aR7b （式中、R7aおよびR7bは同一または相異なってそれぞれ水素原子、またはC1-6アルキル基を意味する）、式 -CO2R7a （式中、R7aは前記定義と同意義を意味する）、式 -S(O)nR7a （式中、nは０ないし２の整数を意味する。R7aは前記定義と同意義を意味する）、式 -S(O)2NR7aR7b （式中、R7aおよびR7bは前記定義と同意義を意味する）、式
    （式中X2は単結合、カルボニル基、または式 -S(O)2- で表わされる基を意味する；
    R5bおよびR6bは同一または相異なっていて、水素原子、置換されていてもよいC1-6アルキル基、または置換されていてもよいC6-14アリール基を意味する）で表わされる基、または式
    （式中、Z1は単結合、酸素原子、ビニレン基、またはエチニレン基を意味する；
    Z2は単結合、または０ないし４個の置換基で置換されてもよいC1-6アルキル基を意味する）で表わされる基を意味する。R3aとR4aは一緒になって、メチレンジオキシ基、または1,2-エチレンジオキシ基を意味してもよく、またR3aとR4aは一緒になって、置換されていてもよいベンゼン環、置換されていてもよいピリジン環、置換されていてもよいピロール環、置換されていてもよいチオフェン環、置換されていてもよいフラン環、置換されていてもよいピリダジン環、置換されていてもよいピリミジン環、置換されていてもよいピラジン環、置換されていてもよいイミダゾール環、置換されていてもよいオキサゾール環、置換されていてもよいチアゾール環、置換されていてもよいピラゾール環、置換されていてもよいイソオキサゾール環、置換されていてもよいイソチアゾール環、置換されていてもよいシクロヘキサン環および置換されていてもよいシクロペンタン環からなる群から選ばれる縮合環の形成を意味してもよい。ただし、R1aおよびR2aがともに水素原子を意味する場合は除く。〕で示される化合物もしくはその塩またはそれらの水和物を有効成分とする請求項１３に記載の抗真菌剤。
  16. 式
    で表される化合物（Ｉa）を有効成分とする請求項１３に記載の抗真菌剤。
  17. 一般式(II)
    〔式中Arは下記式（IIIa）−（IIIf）からなる群
    （式中、Kは硫黄原子、酸素原子、または式 -NH- で表わされる基を意味する；
    R1b、R2bは同一または相異なってそれぞれ水素原子、ハロゲン原子、水酸基、ニトロ基、シアノ基、トリフルオロメチル基、トリフルオロメトキシ基、式
    （式中X3は単結合、カルボニル基、または式 -S(O)2- で表わされる基を意味する；
    R5cおよびR6cは同一または相異なっていて、水素原子、置換されていてもよいC1-6アルキル基を意味する）で表わされる基、または式 -X4-R8a（式中、 X4は、単結合、酸素原子、または硫黄原子を意味する；R8aはC1-6アルキル基、C2-6アルケニル基、C2-6アルキニル基、C3-8シクロアルキル基、またはC3-8シクロアルケニル基を意味する）で表わされる基を示す。また、 R1b、R2bは一緒になってメチレンジオキシ基、または1,2-エチレンジオキシ基を形成してもよい。)から選ばれる置換基を意味する；
    R3b、およびR4bは同一または相異なってそれぞれ、水素原子、ハロゲン原子、水酸基、ニトロ基、シアノ基、カルボキシル基、ホルミル基、ヒドロキシイミノ基、トリフルオロメチル基、トリフルオロメトキシ基、C1-6アルキル基、C1-6アルコキシ基、C2-6アルケニル基、C2-6アルキニル基、または式、
    （式中、Z1bは単結合、ビニレン基、またはエチニレン基を意味する；
    Z2bは単結合、または０ないし４個の置換基で置換されてもよいC1-6アルキル基を意味する）で表わされる基を意味する。；
    ただし（１） Arが、R1bおよびR2bがともに水素原子である前記式 (IIId) で表わされる場合、（２） R3bまたはR4bの少なくとも一方が水素原子を示し、もう一方が水素原子、メトキシ基、水酸基、メチル基、ベンジルオキシ基、またはハロゲン原子であり、 Arが、R1bおよびR2bがともに水素原子またはメトキシ基を意味する前記式 (IIIc) で表わされる場合、、（３） R3bまたはR4bの少なくとも一方が水素原子を示し、もう一方が水素原子、水酸基、メトキシ基、またはベンジルオキシ基であり、 Arが、R1bおよびR2bがともに水酸基またはベンジルオキシ基を意味する前記式 (IIIc)で表わされる場合、または（４）Arが、R1bが水素原子でR2bがホルミル基、ヒドロキシメチル基またはメトキシカルボニル基である前記式 (IIId) で表わされる場合を除く。〕で示される化合物もしくはその塩またはそれらの水和物。
  18. Arが式、
    （式中、R1cが水素原子、置換されてもよいC1-6アルキル基、ベンジル基を意味する）で表わされ、かつ R3bが水素原子を意味する場合を除いた、請求項１７記載の化合物もしくはその塩またはそれらの水和物。
  19. 一般式(IIIc2)
    〔式中R1b、R2bは前記定義と同意義を意味する。ただし、（１）R1bが式R1c-O-（式中、R1cは前記定義と同意義を意味する）で表わされる基であり、R2bが水素原子であり、R3bが水素原子を意味する場合、（２）R3bまたはR4bの少なくとも一方が水素原子を示し、もう一方が水素原子、メトキシ基、水酸基、メチル基、ベンジルオキシ基、またはハロゲン原子であり、R1bおよびR2bがともに水素原子またはメトキシ基を意味する場合、または（３） R3bまたはR4bの少なくとも一方が水素原子を示し、もう一方が水素原子、水酸基、メトキシ基、またはベンジルオキシ基であり、R1bおよびR2bがともに水酸基またはベンジルオキシ基を意味する場合を除く。〕で表される化合物もしくはその塩またはそれらの水和物。
  20. 抗真菌作用を有する請求項１７記載の抗真菌剤。
  21. R3a、およびR4aのうち少なくとも１つが、式 -C(O)NR7aR7b （式中、R7aおよびR7bはは前記定義と同意義を意味する）、式 -CO2R7a （式中、R7aは前記定義と同意義を意味する）、式 -S(O)nR7a （式中、nは０ないし２の整数を意味する。R7aは前記定義と同意義を意味する）、式 -S(O)2NR7aR7b （式中、R7aおよびR7bは前記定義と同意義を意味する）、式
    （式中X2、R5bおよびR6bは前記定義と同意義を意味する）で表わされる基、またはは０ないし４個の置換基で置換されてもよいC1-6アルコキシ基を意味し、またはR3aとR4aは一緒になって、メチレンジオキシ基、または1,2-エチレンジオキシ基を意味する請求項１５記載の抗真菌剤。
  22. 抗真菌作用を有する化合物が、（１）1-ベンジルイソキノリン、（２）1-(4-ブロモベンジル)イソキノリン、（３）1-(4-クロロベンジル)イソキノリン、（４）1-(4-フルオロベンジル)イソキノリン、（５）1-(4-ヨードベンジル)イソキノリン、（６）1-(3-メチルベンジル)イソキノリン、（７）1-(4-メチルベンジル)イソキノリン、（８）1-(3,4-ジメチルベンジル)イソキノリン、（９）1-(3-メトキシベンジル)イソキノリン、（１０）1-(4-メトキシベンジル)イソキノリン、（１１）1-(3,4-メチレンジオキシベンジル)イソキノリン、（１２）1-(4-ベンジルオキシベンジル)イソキノリン、（１３）1-(4-シアノベンジル)イソキノリン、（１４）1-(4-ニトロベンジル)イソキノリン、（１５）1-(4-アミノベンジル)イソキノリン、（１６）1-(4-メトキシベンジル)-6,7-ジクロロ-イソキノリン、（１７）1-(4-メトキシ-2-ニトロ-ベンジル)-イソキノリン、（１８）1-(4-メトキシベンジル)-6,7-メチレンジオキシ-イソキノリン、（１９）1-(2-アミノ-4-メトキシ-ベンジル)イソキノリン、（２０）1-(4-メトキシベンジル)-7-ヒドロキシ-6-メトキシ-イソキノリン、（２１）1-(4-ベンジルオキシベンジル)-6,7-ジメトキシ-イソキノリン、（２２）1-(4-メトキシベンジル)-6,7-ジメトキシ-イソキノリン、（２３）1-(4-メトキシ-2-ニトロ-ベンジル)-イソキノリン、（２４）3-[4-(1-イソキノリルメチル)フェノキシ]プロピルシアニド、（２５）1-[4-(2,2,3,3-テトラフルオロプロポキシ)ベンジル]イソキノリン、（２６）1-[4-(2-ピペリジノエトキシ)ベンジル]イソキノリン、（２７）4-(1-イソキノリルメチル)フェニル(2-モルフォリノエチル)エーテル、（２８）1-[4-(2-メトキシエトキシ)ベンジル]イソキノリン、（２９）N-{2-[4-(1-イソキノリルメチル)フェノキシ]エチル}-N,N-ジメチルアミン、（３０）1-[4-(フェネチルオキシ)ベンジル]イソキノリン、（３１）1-{4-[(2-メチルアリル)オキシ]ベンジル}イソキノリン、（３２）1-(4-イソブトキシベンジル)イソキノリン、（３３）1-[4-(2-フェノキシエトキシ)ベンジル]イソキノリン、（３４）メチル2-[4-(1-イソキノリルメチル)フェノキシ]アセテート、（３５）2-[4-(1-イソキノリルメチル)フェノキシ]-1-エタノール、（３６）t-ブチルN-{2-[4-(1-イソキノリルメチル)フェノキシ]エチル}カーバメート、（３７）1-{4-[3-(テトラヒドロ-2H-2-ピラニルオキシ)プロポキシ]ベンジル}イソキノリン、（３８）2-[4-(1-イソキノリルメチル)フェノキシ] -1-エタンアミン、（３９）1-[4-(3-ピペリジノプロポキシ)ベンジル]イソキノリン、（４９）3-[4-(1-イソキノリルメチル)フェノキシ]-1-プロパノール、（４１）1-[4-(2-エチルブトキシ)ベンジル]イソキノリン、（４２）4-[4-(1-イソキノリルメチル)フェノキシ]ブタノイックアシッド、（４３）1-(4-{3-[(4-ベンジルピペラジノ)スルフォニル]プロポキシ}ベンジル)イソキノリン、（４４）1-(4-{3-[4-(4-クロロフェニル)ピペラジノ]プロポキシ}ベンジル)イソキノリン、（４５）4-(1-イソキノリルメチル)アニリン、（４６）N-[4-(1-イソキノリルメチル)フェニル]ブタンアミド、（４７）N-[4-(1-イソキノリルメチル)フェニル]プロパンアミド、（４８）N-[4-(1-イソキノリルメチル)フェニル]-1-エタンスルフォンアミド、（４９）N-[4-(1-イソキノリルメチル)フェニル]-N-メチル-エタンスルフォンアミド、（５０）N-[4-(1-イソキノリルメチル)フェニル]-N-メチルアミン、（５１）N-[4-(1-イソキノリルメチル)フェニル]-N-プロピルアミン、または（５２）N-[4-(1-イソキノリルメチル)フェニル]-N-メチル-N-プロピルアミンである請求項１５記載の抗真菌剤。
  23. 治効量の請求項１３から２２のいずれかに記載の抗真菌剤を哺乳動物に投与することを含む、真菌感染症の治療方法。
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