WO2004048604A1 - Gwt1遺伝子産物の酵素活性を阻害する化合物をスクリーニングする方法 - Google Patents

Gwt1遺伝子産物の酵素活性を阻害する化合物をスクリーニングする方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2004048604A1
WO2004048604A1 PCT/JP2003/014909 JP0314909W WO2004048604A1 WO 2004048604 A1 WO2004048604 A1 WO 2004048604A1 JP 0314909 W JP0314909 W JP 0314909W WO 2004048604 A1 WO2004048604 A1 WO 2004048604A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
protein
gpi
gwt1
dna
seq
Prior art date
Application number
PCT/JP2003/014909
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Kappei Tsukahara
Mamiko Tsuchiya
Yoshifumi Jigami
Kenichi Nakayama
Mariko Umemura
Michiyo Okamoto
Original Assignee
Eisai Co., Ltd.
National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Eisai Co., Ltd., National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology filed Critical Eisai Co., Ltd.
Priority to DE60314538T priority Critical patent/DE60314538T2/de
Priority to AU2003284635A priority patent/AU2003284635A1/en
Priority to EP03774148A priority patent/EP1564299B1/en
Priority to US10/536,935 priority patent/US8323917B2/en
Priority to JP2004555006A priority patent/JP4061309B2/ja
Publication of WO2004048604A1 publication Critical patent/WO2004048604A1/ja

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/48—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/18—Testing for antimicrobial activity of a material

Definitions

  • the present invention relates to a method for screening an antifungal agent having a GPI synthase inhibitory activity involved in fungal cell wall synthesis.
  • An object of the present invention is to inhibit the transport of the GPI anchor protein to the fungal cell wall, thereby inhibiting the synthesis of the fungal cell wall, and inhibiting the adhesion to the host cell so that the pathogenic fungus cannot exert its pathogenicity.
  • the protein encoded by the DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 in Saccharomyces care 'siae has the nucleotide sequence of SEQ ID NOS: 3 and 5 in Candida bics w.
  • the protein encoded by the DNA has the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7 in Schizosacc haromyces pombe, and the protein encoded by the DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7 in Aspergillus
  • the protein encoded by the DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NOS: 12 and 13 in Cryptococcus ⁇ o / owa ⁇ s is involved in the process of transporting the GPI anchor protein to the cell wall. It was found to be involved and named GWT1 gene.
  • the GWT1 gene product (hereinafter referred to as GWT1 protein) is a GPI biosynthetic pathway ( Figure 1, Kinoshita and Inoue, Curr Op in Chem Biol 2000 Dec; 4 (6): 632-8; Ferguson et al., Biochim Biophys Acta 1999 Oct 8; 1455 (2-3): 327-40) Compound that inhibits the activity by transferring an acyl group to GlcN-PI and synthesizing GlcN- (acyl) PI.
  • the present inventors thought that a compound that inhibits the synthesis of fungal cell walls could be found by screening for the present invention, and thus completed the present invention.
  • the present invention provides the following 1 to 4.
  • GWT1 is a fungal cell wall synthesis gene disclosed in WO 02/04626, and overexpressed means not a gene originally possessed but a gene expressed from a gene introduced from the outside.
  • GlcN- (acyl) PI is the biosynthetic pathway of GPI ( Figure 1, Kinoshita and Inoue, Curr Opin Chem Biol 2000 Dec; 4 (6): 632-8; Ferguson et al., Biochim Biophys Act a 1999 Oct 8; 1455 (2-3): 327-40)
  • stringent conditions refers to, for example, high predication in 4 ⁇ SSC at 65 ° C., followed by washing in 0.1 ⁇ SSC at 65 for 1 hour.
  • stringent conditions are 42 ° C. 4 ⁇ SSC in 50% formamide.
  • a protein comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids have been added, deleted, substituted and Z or inserted can be obtained by methods known to those skilled in the art, for example, site-directed mutagenesis (Sambck, J. et al. , Fritsch, E, F., and Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY) or the like. Such mutations can also occur in nature.
  • the number of amino acid mutations is not particularly limited as long as the activity of transferring an acyl group to GlcN-PI is maintained. Typically, it is within 30 amino acids, preferably within 10 amino acids, and more preferably within 3 amino acids.
  • the amino acid mutation site is not particularly limited as long as the above activity is maintained.
  • the protein or mutant protein prepared using the above hybridization is usually a protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, or 14, and an amino acid sequence thereof. Have high homology (eg, 60% or more, 70% or more, 80% or more, 90% or more, or 95% or more homology).
  • Amino acid sequence homology can be determined using the BLASTx (amino acid level) program (Altschul et al. J. Mol. Biol. 215: 403-410, 1990). The program is based on the algorithm BLAST by Karlin and Altschul (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264-2268, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5877, 1993). I have.
  • wordlength 3.
  • the analysis can be performed as described in Altschul et al. (Nucleic. Acids. Res. 25: 3389-3402, 1997).
  • BLAST and Gapped BLAST programs use the default parameters of each program. Specific methods of these analysis methods are known (http: @www. Ncbi. Nlm. Nih. Gov.).
  • test sample inhibits the process of transporting the GPI anchor protein to the cell wall, and whether or not the expression of the GPI anchor protein on the fungal surface is inhibited; Or a step of testing whether fungal growth is suppressed or not.
  • the GWT1 protein is prepared from the membrane fraction of a fungus, preferably fiSl ceres ⁇ , C. albicans S S. pombe ⁇ A. fum igatus ⁇ C. neoforins, and more preferably ⁇ i ceresj'ae.
  • the prepared membrane fraction may be used as it is or may be used after further purification.
  • the transfer of DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 11, 12 or 13 into a fungus and overexpression of GWT1 protein to measure transacylation activity Can be easily performed.
  • the 5: cerevisiae (D case is described below in detail.
  • the GWT1 gene is obtained by designing primers based on the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 11, 12 or 13 and performing PCR using fungal DNA as type III. Can be obtained.
  • GWT1 gene An expression vector that works in cer e, for example, a promoter and terminator suitable for the multiclonal site of YEp352, for example, GAPDH from pKTIO (Tanaka et al, Mol. Cell Biol., 10: 4303-4313, 1990). Insert a GWT1 expression plasmid into the expression vector into which the promoter and GAPDH terminator have been inserted.
  • ⁇ Care 'siae for example, G2-10 strain, is cultured in a suitable medium such as * YPD medium (Yeast extract-Polypeptone-Dextrose medium) at an appropriate temperature of, for example, 30. Collect bacteria.
  • * YPD medium Yeast extract-Polypeptone-Dextrose medium
  • the GWT1 expression plasmid is introduced into 5: care iae, for example, by the lithium acetate method.
  • the lithium acetate method is described in the YEAST MAKER TM Yeast Transformation System (Clonetech) User Manual.
  • GWT1 overexpressing strain and empty vector-introduced strain can be obtained by culturing in SD ⁇ ura-) medium at 30 ° C for 2 days.
  • the strain into which the GWT1 gene is introduced is preferably a deletion strain in which the GWT1 gene has been deleted.
  • GWT1 gene deleted cerevisiae the following Method.
  • a PCR product containing a marker gene, preferably the his5 gene of e, of type III and a GWT1 gene sequence to be deleted at both ends of 30 bp or more, preferably 40 bp or more (for example, the sequence of SEQ ID NO: 1) is obtained. Perform PCR amplification using primers designed to be used. After purifying the PCR product and introducing it into fungi, a deletion strain can be obtained by culturing in a is5 or is5 medium for selection corresponding to the marker gene.
  • the cerevisiae into which the GWT1 gene has been introduced is cultured with shaking in an appropriate medium, for example, an SD (ura-) liquid medium at an appropriate temperature, for example, 24 ° C., and the cells are collected at the mid-logarithmic phase.
  • an appropriate medium for example, an SD (ura-) liquid medium at an appropriate temperature, for example, 24 ° C.
  • TM buffer 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 2 mM MgCl 2
  • suspend the cells with an appropriate amount for example, 2 ml of TM buffer + protease inhibitor (Complete TM (Roche)).
  • Add 1.5 ml glass beads for example, repeat vortexing for 30 seconds and placing on ice for 30 seconds 10 times) to disrupt the cells.
  • Centrifuge for example, at 1,000 g for 5 minutes to precipitate the glass beads and uncalcified cells. Transfer the supernatant to another tube and centrifuge at 13,000 g for 20 minutes to precipitate the organ membrane-containing membrane fraction (Total membrane fraction). necessary The precipitate was further suspended in 1 ml of a suitable assay buffer, centrifuged at 1,000 g for 1 minute to remove the unsuspended portion, and the supernatant was centrifuged at 13,000, for example. Centrifuge at 20 g for 20 minutes, and resuspend the precipitate in an appropriate assay buffer to obtain a membrane fraction.
  • the GWT1 protein can be prepared by expressing it in cells other than fungi, for example, mammalian cells, insect cells, E. coli, and the like.
  • GWT1 linked to an overexpression vector having a CMV promoter is introduced into mammalian cells, and the method described in Petaja-Repo et al., J. Biol. Chem., 276: 4416-23, 2001 is used.
  • a membrane fraction can be prepared.
  • GWTl-expressing insect cells are prepared using a paculovirus expression kit such as BAC-T0-BAC Baculovirus Expression system (manufactured by Invitrogen), and from here, Okamoto et al.,
  • the membrane fraction can be prepared by the method described in J. Biol. Chem., 276: 742-751, 2001.
  • GWT1 can be prepared by connecting GWT1 to an E. coli expression vector such as pGEX (manufactured by Pfizer) and introducing it into E. coli such as BL21.
  • E. coli expression vector such as pGEX (manufactured by Pfizer)
  • Inhibitors that inhibit the use of suitable metal ions (Mg, Mn), ATP, Coenzyme A, and preferably UDP-GlcNAc in other reactions, such as nikko mycin Z, asparagine-linked sugars as chitin synthesis inhibitors
  • a buffer containing tunicamycin as a chain synthesis inhibitor add the GWT1 gene product prepared in Step 1, preferably a membrane fraction containing the GWT1 gene product, further add a test compound, and at an appropriate temperature for an appropriate time ( (For example, at 24 ° C for 15 minutes.)
  • a suitably labeled, precursor preferably GlcN- was labeled with a radioactive isotope (aC yl) PI, e.g. UDP- GlcNAc, Acyl- Coenzyme A, preferably UDP- [14 C] GlcNAc pressurized forte, further Incubate for an appropriate period of time (for example, 1 hour at 24 ° C).
  • aC yl radioactive isotope
  • the extracted reaction product is dissolved in a suitable solvent, preferably butanol, and GlcN- (acyl) PI formed in the reaction is separated by a method such as HPLC / thin layer chromatography (TL0 or the like, preferably TLC.
  • TLC in the case of deployment, developing solvent e.g. CHC1 3 / C 0H / H 2 0 (65: 25: 4), CHC1 3 / CH 3 0H / 1M NH 4 OH (10: 10: 3), It can be selected equal appropriately preferably HC1 3 / C 0H / 1M NH 4 OH (10: 10: 3) by deploying.
  • the separated GlcN- (acyl) PI is labeled with a radioisotope in a method corresponding to the label, the amount is determined by the radioactivity of the separated GlcN- (acyl) PI.
  • test compound If the amount of GlcN- (acyl) PI produced in the presence of the test compound decreases, it is determined that the test compound has the activity of inhibiting the transfer of the acyl group by the GWT1 protein.
  • the test sample in which the activity of inhibiting such transacylation was detected further inhibited the transport of the GPI anchor protein to the cell wall and inhibited the expression of the GPI anchor protein on the fungal surface. It is preferable to test whether or not to inhibit the growth of fungi. As a result of this assay, if the test sample inhibits the process of transporting the GPI anchor protein to the cell wall, inhibits the expression of the GPI anchor protein on the fungal surface, or inhibits the growth of the fungus, the sample is It is a strong candidate for antifungals. Whether the test sample has the ability to inhibit the transport process of the GPI anchor protein to the cell wall or the expression of the GPI anchor protein on the fungal surface is determined by (1) using a reporter enzyme.
  • Method (2) a method using an antibody that reacts with the surface glycoprotein of the fungal cell wall, (3) a method for assaying for the ability to adhere to animal cells, and (4) an observation of the fungus with a light microscope or an electron microscope. It can be verified by the method.
  • the methods (1) to (4) are shown in the disclosure of the invention of WO 02/04626, and are specifically disclosed in Examples.
  • the test sample inhibits the process of transporting the GPI-anchored protein to the cell wall by using the methods (1) to (4), preferably in combination with the methods (1) to (4).
  • the test sample affected the process of transporting the GPI anchor protein to the cell wall.
  • whether or not the test sample inhibits fungal growth can be determined by the usual method of measuring antifungal activity at the Kokinori (National Committee for Clinical Laboratory Standard s. 1992.Reference method for broth dilution antifungal susceptibility). Tested for yeasts. Proposed standard M27-P. National Committee for Clinica 1 Laboratory Standards, Villanova, Pa.). BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES
  • FIG. 1 is a diagram showing the GPI biosynthesis pathway.
  • Figure 2 shows the GPI lacquer of the wild-type strain (WT), the Agwtl strain ( ⁇ ) in which the GWT1 gene was disrupted, and the strain in which the GWT1 gene was introduced into the Agwtl strain ( ⁇ / G).
  • 4 is a photograph showing a result of measuring a chemical reaction.
  • FIG. 3 shows the compound of Example B2 (1- (4-butylbenzyl) isoquinoline,) and the compound of Example B60 described in Table 1 of W002 / 04626, which discloses the GWT1 gene.
  • N- (3- (4-((toisoquinolinolemethyl) phenyl) -1-2-propynyl) acetamide) 3 is a photograph showing the result of measuring the inhibitory activity of a GPI acylidani reaction in a silylated GIP detection system.
  • FIG. 4 shows the compound of Example B73 (N- (3- (4- (1-isoquinolylmethyl) phenyl) propyl)-described in Table 1 of W002 / 04626 which discloses the GWT1 gene. Inhibition of N-methylacetamide,) and the compound of Example B85 (5-butyl-2-hy-isoquinolylmethyl) phenol) in the GPI-acylation reaction in the GIP detection system was measured. It is a photograph showing. BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
  • YEp352GAPII was produced by replacing the multicloning site with the pUC18 multicloning site.
  • YEp352GAPIIClaI ASal was prepared by converting the Sail site present in the multicloning site into a Clal site.
  • the cerevisiae GWT1 gene containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 was amplified using the primers of SEQ ID NO: 15 and the primers of SEQ ID NO: 16, and was amplified at the multicloning site of the YEp35 2GAPIIClaI A Sal vector. Then, a GWT1 overexpression plasmid was prepared.
  • C. cere isise was cultured and harvested and transformed with the PCR product described above.
  • the GWT1 gene-deleted ⁇ gwtl strain was obtained by culturing the cells in an SD (His ⁇ ) medium at 30 ° C. for 5 to 7 days.
  • the ⁇ gwtl strain was cultured in a YPD medium (Yeast extract-Polypeptone-Dextrose medium) with shaking at 30 ° C., and the cells were collected at the later stage of logarithmic growth. After washing, the GWT1-expressing plasmid was introduced into the Agwtl strain by the lithium acetate method (YEAST MAKER TM Yeast Transformation System (Clonetech ⁇ ⁇ )). By culturing at 30 ° C. for 2 days in an SD (ura ⁇ ) medium, an Agwtl strain overexpressing the GWT1 gene was obtained.
  • YPD medium Yeast extract-Polypeptone-Dextrose medium
  • TM buffer 50 mM Tris-HC 1, pH 7.5, 2 mM MgCl 2
  • 2 ml TM buffer + protease inhibitor Complete TM (Roche) 1 tablet / 25 ml
  • the cell lysate was transferred to a new tube, and centrifuged at 4 ° C at 1000 g for 5 minutes to precipitate glass beads and unbroken cells.
  • the supernatant was taken in another tube, and centrifuged at 4 ° C. and 13,000 g for 20 minutes to precipitate a membrane fraction containing organelles (Total membrane fraction), and used as a membrane fraction.
  • GPI biosynthesis conspiracy is caused by deacetylation of N-acetyl-glucosaminyl-phosphat idyl inositol (GlcNAc-PI) to produce Glucosaminyl-phosphatidylinositol (GlcN-PI), and the addition of an acetyl group to Glucosaminyl It is known to proceed to -acylphosphatidylin ositol (GlcN- (acyl) PI) (Fig. 1). Therefore, the following method was used to examine whether Gwtl protein was involved in this transamination reaction.
  • an acylated GPI spot was detected in the wild-type strain, whereas no acylated GPI spot was detected in the strain in which the GWT1 gene was disrupted (Agwtl).
  • the Gwtl protein is an enzyme that catalyzes an acyl transfer reaction to GPI.
  • the GPI synthase activity assay system contains a compound that has an inhibitory activity on the activity of the GWT1 gene product, the intensity of the acylated GlcN- (acyl) PI spot will be reduced or eliminated.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

GWT1蛋白を発現した膜画分を用いた簡単なGlcN-PIへのアシル基転移反応の測定により、GPIアンカー蛋白質の真菌細胞壁への輸送を阻害する化合物がスクリーニング可能となった。GPIアンカー蛋白質が細胞壁に輸送される過程を阻害することにより、真菌細胞壁の合成を阻害し、同時に宿主細胞への付着も阻害する新規抗真菌剤が創出できる。

Description

明細書
GWT1遺伝子産物の酵素活性を阻害する化合物をスクリ一二ングする方法 技術分野
真菌の細胞壁合成に関与する GPI合成酵素阻害活性を有する抗真菌剤をスクリ一 ユングする方法に関する。 背景技術
本発明者らは、 真菌が病原性を発揮するためには宿主細胞に付着することが重 要であり、 付着に関与する付着因子は一且細胞膜に GPI (Glycosylphosphatidylin ositol) アンカリングした後、 細胞壁表層に輸送されることに着目した （非特許 文献 l ZHamada K et al, Mol. Gen. Genet. , 258： 53-59, 1998) 。 そして GPIで アンカリングされた蛋白質 （GPIアンカー蛋白質） が細胞壁に輸送される過程を阻 害することにより、 真菌細胞壁の合成を阻害し、 同時に宿主細胞への付着も阻害 する新規抗真菌剤が創出できると考えて研究に着手した。 発明の開示
本発明の課題は、 真菌細胞壁への GPIアンカー蛋白質の輸送を阻害して真菌細胞 壁の合成を阻害するとともに、 宿主細胞への付着を阻害して、 病原性真菌が病原 性を発揮できないようにする抗真菌剤を開発することにある。
本発明者らは W0 02/04626で、 Saccharomyces care 'siaeにおいて配列番号 1に 記載の塩基配列を有する DNAがコードする蛋白質が、 Candida bics wにおいて配 列番号 3及ぴ 5に記載の塩基配列を有する DNAがコードする蛋白質が、 Schizosacc haromyces pombeにおいて配列番号 7に記載の塩基配列を有する DNAがコードする 蛋白質が、 Aspergillus において配列番号 9及び 1 1に記載の塩基配列 を有する DNAがコードする蛋白質が、 Cryptococcus ^o/o wa^sにおいて配列番号 1 2及ぴ 1 3に記載の塩基配列を有する DNAがコードする蛋白質が、 GPIアンカー 蛋白質の細胞壁への輸送過程に関与することを見出し GWT1遺伝子と命名した。 更 に、 該遺伝子を欠失した真菌が細胞壁を合成できないこと、 式 (la)に示す化合物 が該蛋白質と結合して、 GPIアンカー蛋白質の細胞壁への輸送を阻害し、 真菌の細 胞壁合成を阻害することを見出した。
Figure imgf000003_0001
そして、 GWT1遺伝子産物 （以下 GWT1蛋白） 力 GPIの生合成経路 （図 1、 Kinosh ita and Inoue, Curr Op in Chem Biol 2000 Dec ;4 (6) : 632 - 8 ; Ferguson et al. , Biochim Biophys Acta 1999 Oct 8； 1455 (2-3)： 327-40) 中の GlcN- PIにァシル基を 転移し GlcN- (acyl) PIを合成する活性を有することを見出し、 本活性を阻害する化 合物をスクリ一二ングすることにより真菌細胞壁の合成を阻害する化合物を見出 すことができると考えて、 本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は、 下記 1から 4を提供するものである。
[ 1 ] · 抗真菌作用を有する化合物をスクリーニングする方法であって、
( 1 ) 過剰発現させた GWT1遺伝子にコードされる蛋白質と、 被検試料とを接触 させる工程、
( 2 ) GlcN- (acyl) PIを検出する工程、
( 3 ) GlcN- (acyl) PIを減少させる被検試料を選択する工程、 を含む方法。
ここで GWT1とは W0 02/04626に開示された真菌の細胞壁合成遺伝子であり、 過剰 発現させたとは本来持っていた遺伝子ではなく、 外部から導入した遺伝子から発 現させることを意味する。 また、 GlcN- (acyl)PIとは GPIの生合成経路 （図 1、 Kinoshita and Inoue, Curr Opin Chem Biol 2000 Dec ;4 (6) : 632- 8; Ferguson et al. , Biochim Biophys Act a 1999 Oct 8 ; 1455 (2-3) : 327- 40) 中の Glucosaminyl— phosphatidyl inositol (Glc N-PI) の Inositolにァシル基カ結合した Glucosaminyl - acylphosphatidylinositol である。
[ 2 ] . GWT1遺伝子が下記 ( a ) から （d ) のいずれかに記載の DNA、
( a ) 配列番号： 2、 4、 6、 8、 1 0または 1 4に記載のアミノ酸配列からな る蛋白質をコードする DNA
( b ) 配列番号： 1、 3、 5、 7、 9、 1 1、 1 2または 1 3に記載の塩基配列 を含む DNA
( c ) 配列番号： 1、 3、 5、 7、 9、 1 1、 1 2または 1 3に記載の塩基配列 からなる DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする DNA
( d ) 配列番号： 2、 4、 6、 8、 1 0または 1 4記載のアミノ酸配列において 1 若しくは複数のアミノ酸が付加、 欠失、 置換および Zまたは揷入されたアミ ノ酸配列からなる蛋白質をコードする DNA、
である [ 1 ]に記載の抗真菌作用を有する化合物をスクリ一ユングする方法。
ここで、 「ストリンジェントな条件」 とは、 例えば 65°C 4 X SSCにおけるハイ プリダイゼーシヨン、 次いで 65でで 1時間 0. 1 X SSC中での洗浄である。 また別法 としてストリンジェントな条件は、 50%ホルムアミド中 42°C 4 X SSCである。 また、 PerfectHyb™ (T0Y0B0) 溶液中 65°C2. 5時間ハイブリダィゼーシヨン、 次いで l) . 2x
SSC, 0. 05% SDS溶液： 25°C5分、 2) . 2xSSC, 0. 05% SDS溶液： 25°C15分、 3) . 0. IxSS
C, 0. 1% SDS溶液 50°C20分の洗浄といつた条件も許される。
また、 「1若しくは複数のアミノ酸が付加、 欠失、 置換および Zまたは挿入され たアミノ酸配列からなる蛋白質」 は、 当業者に公知の方法、 例えば、 部位特異的 変異誘発法 （Samb ck, J. , Fritsch, E, F.， and Maniatis, T. (1989) Molecular Clon ing: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY) などを用いて調製することができる。 また、 このような変異は自然界におい て生じることもある。 アミノ酸の変異数は、 GlcN- PIにァシル基を転移させる活性 が保持される限り特に制限はない。 典型的には、 30アミノ酸以内であり、 好まし くは、 10アミノ酸以内であり、 さらに好ましくは 3アミノ酸以内である。 アミノ酸 の変異部位も、 上記活性が保持される限り特に制限はない。
上記ハイプリダイゼーシヨンを利用して調製される蛋白質や変異蛋白質は、 通 常、 配列番号： 2、 4、 6、 8、 1 0または 1 4に記載のァミノ酸配列からなる 蛋白質とそのアミノ酸配列において高い相同性 （例えば、 60%以上、 70%以上、 8 0%以上、 90%以上、 あるいは 95%以上の相同性） を有する。 アミノ酸配列の相同 性は、 BLASTx (アミノ酸レベル） のプログラム（Altschul et al. J. Mol. Biol. 2 15 :403-410, 1990)を利用して決定することができる。 該プログラムは、 Karlin a nd Altschulによるアルゴリズム BLAST (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 : 2264 - 226 8， 1990、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 : 5873- 5877， 1993)に基づいている。 BLA STXによってアミノ酸配列を解析する場合には、 パラメータ一は例えば score = 50、 wordlength = 3とする。 また、 Gapped BLASTプログラムを用いて、 アミノ酸配列 を解析する場合は、 Altschulら （Nucleic. Acids. Res. 25 : 3389- 3402， 1997) に 記載されているように行うことができる。 BLASTと Gapped BLASTプログラムを用い る場合には、 各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。 これらの解析方 法の具体的な手法は公知である（http：〃 www. ncbi. nlm. nih. gov. )。
[ 3 ] . ァシルイ匕された GPIを検出する工程が薄相クロマトグラフィーである、 [ 1 ] または [ 2 ]に記載の方法。
[ 4 ] . さらに、 （4 ) 選択された被検試料が、 GPIアンカー蛋白質の細胞壁への輸 送過程を阻害するか否か、 GPIアンカー蛋白質の真菌表層への発現を阻害する か否か、 または、 真菌の増殖を抑制するか否かを検定する工程、 を含む、
[ 1 ]から [ 3 ]のいずれかに記載の方法。
以下に本発明に記載された、 1 . GWT1蛋白を調製する方法、 2 . ァシル基転移 活性の測定方法について開示する。
1 . GWT1蛋白を調製する方法
GWT1蛋白は、 真菌、 好ましく fiSl cere sヹ 、 C. albicans^ S. pombeヽ A. fum igatusヽ C. neofori ns、 更に好ましく〖i£ cerewsj'aeの膜画分から調製する。 了 シル基転移活性の測定は、 調製した膜画分をそのまま使用してもよいし、 更に精 製して用いてもよい。 真菌に、 配列番号 1、 3、 5、 7、 9、 1 1、 1 2または 1 3に記載の塩基配列の DNAを導入して、 GWT1蛋白を過剰発現させることにより、 ァシル基転移活性の測定を容易に行うことが可能である。 以下に 5： cerevisiae(D 場合について具体的に説明する。
(l) GWTl遺伝子の導入
GWT1遺伝子は、 配列番号 1、 3、 5、 7、 9、 1 1、 1 2または 1 3に記載の 塩基配列を基にプライマーを設計し、 真菌の DNAを铸型として PCRを行うことによ り得ることができる。
GWT1遺伝子を： cer eで働く発現ベクター、 例えば YEp352のマルチクロー ユングサイトに適当なプロモーター ·ターミネータ一、 例えば pKTIO (Tanaka et al, Mol. Cell Biol. , 10:4303-4313， 1990) 由来の GAPDHプロモーター及ぴ GAPDH ターミネータ一を挿入した発現べクターに挿入して GWT1発現プラスミドを作製す る。 ^ care 'siae例えば G2 - 10株を、 適当な培地例えは *YPD培地（Yeast extract - Po lypeptone- Dextrose培地）にて、 適当な温度例えば 30でで振とう培養し、 対数増殖 後期の時点で集菌する。 洗浄後、 例えば酢酸リチウム法により GWT1発現プラスミ ドを 5： care iae に導入する。 酢酸リチウム法については YEAST MAKER™ Yeast T ransformation System (Clonetech社製) User Manualに記載されている。 SD ^ura- )培地で 30°C、 2日間培養することにより GWT1過剰発現株およぴ空べクタ一導入株 を得ることができる。
また、 GWT1遺伝子を導入する菌株は、 好ましくは自身の GWT1遺伝子を欠失した 欠失株であることが望ましい。 GWT1遺伝子を欠失した cerevisiae 、 以下の方 法により得ることができる。
マーカー遺伝子、 好ましくは eの his5遺伝子を铸型とし、 両端に 30 bp以 上好ましくは 40 bp以上の欠失したい GWT1遺伝子の配列 （例えば配列番号 1に記載 の配列） を含んだ PCR産物が得られるように設計したプライマーを用い PCR増幅を 行う。 PCR産物を精製し、 真菌に導入後、 マーカー遺伝子に対応した選択、 his5で あれは is-の培地で培養して、 欠失株を得ることができる。
5： cere siae以外の真菌の発現ベクター及ぴ遺伝子導入法は、 S. の発現 ベクター pcL等及ぴその導入法について Igarashi et al, Nature 353 : 80 - 83， 1991 に、 C. a7bica 2sの発現ベクター pRMlO等及びその導入法について Pla J et al, Ye ast, 12： 1677 - 1702, 1996に、 A atosの発現ベクター pAN7- 1等及ぴその導 入法について Punt PJ et al, GENE, 56： 117-124, 1987に、 C. neofo ans( ^^ ベクター pPM8等及ぴその導入法について Monden P et al, FEMS Microbiol. Lett. : 187： 41-45， 2000に記載されている。
また、 C. bica^sの欠失株の作製法は、 Fonzi WA et al, Genetics 134： 717- 728, 1993に記載されている。
(2)膜画分の調製法
GWT1遺伝子を導入した cerevisiaeを、 適当な培地例えば SD (ura-)液体培地に て、 適当な温度例えば 24°Cで振とう培養し、 対数増殖中期の時点で集菌する。 菌 体を TM buffer (50 mM Tris-HCl, pH7. 5, 2 mM MgCl2)で洗浄した後、 適量例えば 2 mlの TM buffer + protease inhibitor (Complete™ (Roche社製） ) にて懸濁し 適量例えば 1. 5 mlのガラスビーズを加える。 これをポルテックスしては氷上に置 く操作を繰り返して （例えば、 30秒間ポルテックスして 30秒間氷上に置く操作を 1 0回繰り返して） 菌体を破砕する。
遠心例えば 1, 000 gで 5分間遠心してガラスビーズおよぴ未石皮碎の菌体を沈殿さ せる。 上清を別のチューブにとり、 遠心例えば 13， 000 gで 20分間遠心することに よりオルガネラを含む膜画分 （Total membrane fraction) を沈殿させる。 必要な らば、 更に沈殿を 1 mlの適当な assay用のバッファーに懸濁し、 遠心例えば 1, 000 gで 1分間遠心することにより懸濁されなかった部分を取り除き、 上清を遠心例え ば 13, 000 gで 20分間遠心して沈殿を適当な assay用のバッファ一に再懸濁し膜画分 とする。
cere /w'ae以外の真菌の膜画分調製は、 S. o eについては Yoko- o et al, E ur. J. Biochem. 257 : 630-637 (1998)に、 C. s 6ヹ ca/wについては Sentandreu M e t al, J. Bacteriol. , 180： 282—289， 1998に、 A /"MM' ひ sについては Mouyna I et al, J. Biol. Chem. , 275： 14882- 14889， 2000に、 C. neofo ansについては Ί hompson JR et al, J. Bacteriol. , 181： 444-453, 1999に記載の方法により行う ことができる。
別法として GWT1蛋白は、 真菌以外の細胞、 例えば哺乳類細胞、 昆虫細胞、 大腸 菌等で発現させ、 調製することができる。
哺乳類細胞では、 例えば CMVプロモーターを持つ過剰発現用ベクターにつないだ GWT1を哺乳類細胞に導入し、 Petaja- Repo et al. , J. Biol. Chem. , 276 :4416 - 23， 2001に記載の方法により膜画分を調製することができる。
昆虫細胞では、 例えば BAC - T0 - BAC Baculovirus Expression system (Invitroge n社製） 等のパキュロウィルス発現キットを用いて GWTl発現昆虫細胞 （Sf9細胞な ど） を作製し、 ここから Okamoto et al. , J. Biol. Chem.， 276: 742 - 751， 2001に 記載の方法により膜画分を調製することができる。
大腸菌では、 例えば pGEX (Pfizer社製） の大腸菌発現用ベクターに GWT1をつな ぎ、 BL21などの大腸菌に導入し GWT1蛋白を調製することができる。
2 . ァシル基転移活性の測定方法
GPIにァシル基を転移する反応の検出は、 Costello and Orlean, J. Biol. Chem. (1992) 267:8599-8603； または ranzot and Doering, Biochem. J. (1999) 340: 2 5-32に報告されている方法により可能である。 以下に具体的な方法の例を挙げる が、 以下の実験条件は使用する GWT1遺伝子産物に合わせて最適ィ匕することが好ま しい。
適当な金属イオン （Mg、 Mn) 、 ATP、 Coenzyme A、 及び好ましくは UDP- GlcNAcが 他の反応に使われるのを阻害する阻害剤、 例えばキチンの合成阻害剤として nikko mycin Z、 ァスパラギン結合型糖鎖の合成阻害剤として tunicamycinを含むパッフ ァ一に、 1で調製した GWT1遺伝子産物、 好ましくは GWT1遺伝子産物を含む膜画分 を加え、 更に被検化合物を加えて適当な温度で適当な時間 （例えば 24°Cで 15分 間） 保温する。
その後、 適当に標識した、 好ましくは放射性同位元素で標識した GlcN-(aCyl)PI の前駆体、 例えば UDP- GlcNAc、 Acyl- Coenzyme A、 好ましくは UDP- [14C] GlcNAcを加 えて、 更に適当な時間 （例えば 24°Cで 1時間） 保温する。 クロ口ホルム：メタノ ール （1 :2) を添加し攪拌して反応を止め脂質を抽出する。 抽出した反応産物を適 当な溶媒、 好ましくはブタノールに溶解し、 HPLC ·薄層クロマトグラフィー （TL 0 等の方法、 好ましくは TLCにより、 反応で生成した GlcN- (acyl)PIを分離する。 TLCで展開する場合、 展開溶媒は例えば CHC13/C 0H/H20 (65： 25： 4)、 CHC13/CH30H/1M NH4OH(10: 10:3)、
Figure imgf000009_0001
等適宜選択することができるが 好ましくは HC13/C 0H/1M NH4OH(10: 10:3)により展開する。 分離した GlcN- (acyl)P Iを、 標識に対応した方法、 放射性同位元素で標識したのであれば、 分離した Glc N - (acyl)PIの放射活性により定量する。
被検化合物が存在する場合に、 生成する GlcN- (acyl)PIが減少すれば、 被検化合 物に GWT1蛋白によるァシル基転移を抑制する活性があると判断される。
このようなァシル基転移を抑制する活性が検出された被検試料は、 さらに、 GPI ァンカ一蛋白質の細胞壁への輸送過程を阻害するか否力 GPIアンカ一蛋白質の真 菌表層への発現を阻害するか否か、 または、 真菌の増殖を抑制するか否かを検定 することが好ましい。 この検定の結果、 被検試料が、 GPIアンカー蛋白質の細胞壁 への輸送過程を阻害、 GPIアンカー蛋白質の真菌表層への発現を阻害、 または、 真 菌の増殖を阻害した場合には、 該試料は抗真菌剤の有力な候補となる。 被検試料が、 GPIアンカー蛋白質の細胞壁への輸送過程を阻害する力否か、 ある いは GPIアンカー蛋白質の真菌表層への発現を阻害するか否かは、 （1) .レポータ酵 素を用いる方法、 （2) .真菌細胞壁の表層糖蛋白質と反応する抗体を用いる方法、 (3) .動物細胞に対する付着能により検定する方法、 （4) .真菌を光学顕微鏡あるい は電子顕微鏡で観察する方法により検定できる。
(1)〜 (4)の方法は W0 02/04626の発明の開示に示されており、 実施例に具体的に 開示されている。 （1)〜(4)の方法により、 好ましくは（1)〜 (4)の方法を組み合わ せて用いることにより、 被検試料が GPIアンカー蛋白質の細胞壁への輸送過程を阻 害する、 あるいは GPIアンカー蛋白質の真菌表層への発現を阻害すると判断され、 しかも本件発明に記載の DNAがコードする蛋白質を、 真菌に過剰発現させることに より、 その阻害の程度が減弱する、 あるいは阻害が見られなくなる場合に、 被検 試料は、 GPIアンカー蛋白質の細胞壁への輸送過程に影響を与えたと判断される。 また被検試料が真菌の増殖を抑制するカゝ否かは、 通常の抗真菌活性を測定する 方法 ίこより恢疋でさる (National Committee for Clinical Laboratory Standard s. 1992. Reference method for broth dilution antifungal susceptibility te sting for yeasts. Proposed standard M27-P. National Committee for Clinica 1 Laboratory Standards, Villanova, Pa. ) 。 図面の簡単な説明
図 1は、 GPIの生合成経路を示した図である。
図 2は、 野生株 (WT) 、 GWT1遺伝子を破壊した A gwtl株 （Δ) 、 A gwtl株に GWT 1遺伝子を導入した株 （Δ/G) カゝら調製した膜画分について、 GPIァシル化反応を 測定した結果を示す写真である。
図 3は、 GWT1遺伝子を開示している W002/04626の表 1に記載の、 実施例 B 2の 化合物 （1- (4 -ブチルベンジル) イソキノリン、 ) 及ぴ、 実施例 B 6 0の化合物 (N - (3 - (4— (トイソキノリノレメチル）フエニル)一 2 -プロピニル）ァセトアミド） のァ シル化 GIP検出系における GPIァシルイ匕反応の阻害活性を測定した結果を示す写真 である。
図 4は、 GWT1遺伝子を開示している W002/04626の表 1に記載の、 実施例 B 7 3 の化合物 (N- (3- (4-(1 -ィソキノリルメチル）フエニル）プロピル) - N -メチルァセ トアミド、 ） 及び、 実施例 B 8 5の化合物 （5 -プチル- 2 -ひ-イソキノリルメチル) フエノール） のアシノレ化 GIP検出系における GPIァシル化反応の阻害活性を測定し た結果を示す写真である。 発明を実施するための最良の形態
以下に、 具体的な例をもって本発明を示すが、 本発明はこれに限られるもので はない。
[実施例 1 ] GWT1蛋白を発現した膜画分の調製
(1) . GWTl発現プラスミドの作製
S. cerevisiae で働く発現ベクターを作製するため、 YEp352のマルチクローニン グサイトに pKTIO (Tanaka et al, Mol. Cell Biol. , 10:4303-4313， 1990) 由来 の GAPDHプロモーターおよび GAPDHターミネーターを揷入し、 更にマルチクロー二 ングサイトを pUC18マルチクローニングサイトに置き換えて YEp352GAPIIを作製し た。 また GWT1遺伝子の挿入を容易にするため、 マルチクローユングサイトに存在 する Sailサイトを Clalサイトに変換した YEp352GAPIIClaI ASalを作製した。
配列番号 1に記載の塩基配列を含む cerevisiae GWT1遺伝子を配列番号 1 5に 記載のプライマーおょぴ配列番号 1 6に記載のプライマーを用いて増幅し、 YEp35 2GAPIIClaI A Salベクターのマルチクローユングサイトに揷入して GWT1過剰発現プ ラスミドを作製した。
(2) . GWT1遺伝子を欠失した： cerevisiae 厶 gwtl株の作製
S.
Figure imgf000011_0001
（Longtine MS et al, Yeast, 14： 953-961， 1998) を踌 型とし、 配列番号 1 7及ぴ配列番号 1 8をプライマーとして、 両端に GWT1配列を 含む his5カセットを PCRで増幅した。
cere isiseを培養'集菌し、 上述の PCR産物で形質転換した。 SD (His- )培地で 30°C、 5〜7日閒培養することにより GWT1遺伝子を欠失した Δ gwtl株を得た。
(3) GWT1癸現細胞の作製
Δ gwtl株を、 YPD培地（Yeast extract- Polypeptone- Dextrose培地）にて、 30°Cで 振とう培養し、 対数増殖後期の時点で集菌した。 洗浄後、 酢酸リチウム法 （YEAST MAKER™ Yeast Transformation System (Clonetech†± ) ) により GWT1発現プラス ミドを A gwtl株に導入した。 SD (ura -)培地で 30°C、 2日間培養することにより GWT 1遺伝子を過剰発現させた A gwtl株を得た。
(4)膜画分の調製
S. cerevisiae野生株、 GWT1遺伝子を欠失した A gwtl株、 あるいは Δ gwtl株に GW T1過剰発現プラスミドを導入した株を、 100 mlの YPD培地にて 24°Cで振とう培養し、 対数増殖中期 （0D6。。=1〜3) の時点で集菌した。 菌体を TM buffer (50 mM Tris-HC 1, pH7. 5, 2 mM MgCl2)で洗浄した後、 2 mlの TM buffer + protease inhibitor (Complete™ (Roche社製） 1 tablet / 25 ml)にて懸濁し、 1. 5 mlのガラスビーズ を加えた。 これを 30秒間ボルテックスして 30秒間氷上に置く操作を 10回繰り返す ことにより菌体を破砕した。 菌体破砕液を新しいチューブに移し、 4°Cで 1000g、 5 分間遠心してガラスビーズおよび未破砕の菌体を沈殿させた。 上清を別のチュー ブにとり、 4°Cで 13， 000g, 20分間遠心することによりオルガネラを含む膜画分 (To tal membrane fraction)を沈殿させ、 膜画分とした。
(5)ァシル化された GPIの検出
GPI生合成反心は、 N-acetyl-glucosaminyl-phosphat idyl inositol (GlcNAc - PI) が脱ァセチル化されることにより Glucosaminyl-phosphatidylinositol (GlcN-PI) を生じ、 これにァシル基が付加することにより Glucosaminyl- acylphosphatidylin ositol (GlcN -（acyl) PI)へと進むことが知られている （図 1 ) 。 そこで、 Gwtlタ ンパク質がこのァシル基転移反応に関わつているかを以下の方法によつて調べた。 調製した膜画分（300 /z g protein)を 50 mM Tris- HC1, pH7. 5, 2 mM MgCl2, 2 mM MnCl2, 1 mM ATP, 1 mM Coenzyme A, 21 μ g/ml tunicamycin, 10 M nikkomycin Z, 0. 5 mM Dithiothreitolに対して希釈し全量を 140 z lに合わせ、 反応液とし た。 これを 24。Cで 15分保温した後、 15 /z Ciの UDP- [14C]GlcNAcをチューブに添加し た。 24°Cにて 1時間保温した後、 1 mlのクロ口ホルム：メタノール （1 :2) を添加 し攪拌することにより反応を止めて、 脂質を抽出した。 乾燥させた脂質をプタノ ール抽出により脱塩し、 薄層クロマトグラフィー （HC13/CH30H/1M H40H(10: 10: 3) ) により、 ァシル化された GPI (GlcN-(acyl)PI) 、 ァシル化されていない GPI (GlcN- PI) 、 ァシル化も脱ァセチル化もされていない GPI (GlcNAc-PI) を分離し オートラジオグラフィ一により各スポットを検出した。
その結果、 図 2に示すように、 野生株ではァシル化された GPIのスポットが検出 されたのに対し、 GWT1遺伝子を破壊した株 （Agwtl) ではァシル化 GPIのスポット は全く検出されなかった。 また、 A gwtl株に GWT1遺伝子を導入した株では、 ァシ ル化 GPIのスポットが検出され、 ァシル化能が回復していた。 以上のことより、 Gw tlタンパク質が GPIへのァシル基転移反応を触媒する酵素であることが示された。 以上の結果より、 本 GPI合成酵素活性測定系に GWT1遺伝子産物の活性を阻害活性 を有する化合物が含まれていれば、 ァシル化した GlcN- (acyl)PIのスポットの強度 が減弱あるいは消失すると考えられ、 GlcN- (acyl)PIのスポットの強度を指標とし て 遺伝子産物の酵素活性を阻害する化合物、 更には真菌の細胞壁合成を阻害 する化合物をスクリーニングすることが可能であると考えられた。
(6)ァシル化反応を阻害する化合物のスクリ一ユング
GWT1遺伝子を開示している TO02/04626において、 GWT1遺伝子産物の活性を反映 したレポータ系での化合物の抑制活性を示した表 1に記載の、 実施例 B 2、 実施 例 B 6 0、 実施例 B 7 3、 実施例 B 8 5に記載の化合物について、 これらの化合 物を（5)に記載のァシル化 GIP検出系に添加して、 GPIァシル化反応を阻害する活性 を測定した。 これら化合物の構造は以下に記載する通りである。 実施例 B 2に記載のィ匕合物： 1- (4 -ブチルベンジル） イソキノリン
Figure imgf000014_0001
実施例 B 7 3に記載の化合物： N- (3- (4 -（1-イソキノリルメチル）フエニル）プロピ ル) - N-メチルァセトアミド
Figure imgf000014_0002
実施例 B 8 5に記載の化合物： 5 -プチル- 2 -（1-ィソキノリルメチル）フエノール
Figure imgf000014_0003
果を図 3及び図 4に示した。 W002/04626表 1の中で、 1 g/ml以下の IC50で 阻害活性を表している実施例 B 2及ぴ実施例 B 8 5に記載の化合物では、 用量依 存的なァシルイ匕 GPIのスポット強度の減少が見られるのに対し、 IC50が SO g/mlの 実施例 B 7 3の化合物では、 スポット強度の減少が見られなかった。
この結果力 ら、 本 GPIァシル化反応の測定系を用いることにより、 GWT1遺伝子産 物の酵素活性阻害する化合物をスクリ一二ングすることが可能であることが明ら かとなつた。 産業上の利用の可能性
GPIアンカー蛋白質の真菌細胞壁への輸送を阻害する化合物が、 簡単なァシル基 転移活性測定によりスクリ一ユング可能となった。

Claims

O 2004/048604 - 15 - 求の範囲
1. 抗真菌作用を有する化合物をスクリーニングする方法であって、
(1) 過剰発現させた GWT1遺伝子にコードされる蛋白質と、 被検試料とを接触 させる工程、
(2) GlcN- (acyl)PIを検出する工程、
(3) GlcN- (acyl)PIを減少させる被検試料を選択する工程、 を含む方法。
2. GWT1遺伝子が下記 (a) から （d) のいずれかに記載の DNA、
(a) 配列番号： 2、 4、 6、 8、 10または 14に記載のアミノ酸配列からな る蛋白質をコードする DNA
(b) 配列番号： 1、 3、 5、 7、 9、 11、 12または 13に記載の塩基配列 を含む DNA
(c) 配列番号： 1、 3、 5、 7、 9、 11、 12または 13に記載の塩基配列 からなる DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする DNA
(d) 配列番号： 2、 4、 6、 8、 10または 14記載のアミノ酸配列において 1 若しくは複数のアミノ酸が付加、 欠失、 置換および Zまたは挿入されたァ ミノ酸配列からなる蛋白質をコ一ドする DNA、
である請求項 1に記載の抗真菌作用を有する化合物をスクリ一ユングする方法。
3. ァシル化された GPIを検出する工程が薄相クロマトグラフィーである、 請求 項 1または 2に記載の方法。
4. さらに、 （4) 選択された被検試料が、 GPIアンカー蛋白質の細胞壁への輸 送過程を阻害する力否力、 GPIアンカー蛋白質の真菌表層への発現を阻害する か否か、 または、 真菌の増殖を抑制する力否かを検定する工程、 を含む、 請 求項 1カゝら 3のいずれかに記載の方法。
PCT/JP2003/014909 2002-11-22 2003-11-21 Gwt1遺伝子産物の酵素活性を阻害する化合物をスクリーニングする方法 WO2004048604A1 (ja)

Priority Applications (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE60314538T DE60314538T2 (de) 2002-11-22 2003-11-21 Verfahren zum screening nach verbindungen, die die enzymatische aktivität des gwt1 genproduktes hemmen
AU2003284635A AU2003284635A1 (en) 2002-11-22 2003-11-21 Method of screening compound inhibiting enzymatic activity of gwt1 gene product
EP03774148A EP1564299B1 (en) 2002-11-22 2003-11-21 Method of screening for compounds that inhibit the enzymatic activity of gwt1 gene product
US10/536,935 US8323917B2 (en) 2002-11-22 2003-11-21 Method of screening for compounds that inhibit the enzymatic activity of GWT1 gene product
JP2004555006A JP4061309B2 (ja) 2002-11-22 2003-11-21 Ｇｗｔ１遺伝子産物の酵素活性を阻害する化合物をスクリーニングする方法

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2002-339418 2002-11-22
JP2002339418 2002-11-22

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2004048604A1 true WO2004048604A1 (ja) 2004-06-10

Family

ID=32375774

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2003/014909 WO2004048604A1 (ja) 2002-11-22 2003-11-21 Gwt1遺伝子産物の酵素活性を阻害する化合物をスクリーニングする方法

Country Status (8)

Country Link
US (1) US8323917B2 (ja)
EP (1) EP1564299B1 (ja)
JP (1) JP4061309B2 (ja)
CN (1) CN100371456C (ja)
AT (1) ATE365224T1 (ja)
AU (1) AU2003284635A1 (ja)
DE (1) DE60314538T2 (ja)
WO (1) WO2004048604A1 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8252294B2 (en) 2002-11-22 2012-08-28 Eisai R&D Management Co., Ltd. Methods of screening for compounds that inhibit the biosynthesis of GPI in malaria parasites

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002004626A1 (fr) * 2000-07-07 2002-01-17 Eisai Co., Ltd. Gene de synthese de la paroi des cellules fongiques

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002004626A1 (fr) * 2000-07-07 2002-01-17 Eisai Co., Ltd. Gene de synthese de la paroi des cellules fongiques
WO2003058233A1 (fr) * 2001-12-28 2003-07-17 Eisai Co., Ltd. Technique de criblage d'un compose dote d'une activite inhibitrice de la synthese de la paroi cellulaire fongique

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BR9400600A (pt) * 1994-02-17 1995-10-24 Finep Financiadora De Estudos Processos para produção de uma protéina recombinante e/ou de glicosilfosfatidilinositol (GPI) em células de microorganismos eucariontes e para a obtenção de leveduras de S. cerevisae; célula de levedura sequência de nucleotídios; meio de cultura; medicamento ou vacina; e produto dos ditos processos
US6747137B1 (en) * 1998-02-13 2004-06-08 Genome Therapeutics Corporation Nucleic acid sequences relating to Candida albicans for diagnostics and therapeutics
CN100467597C (zh) * 2000-07-07 2009-03-11 卫材R&D管理有限公司 真菌细胞壁合成基因
WO2002046226A2 (en) * 2000-12-08 2002-06-13 Novo Nordisk A/S Trefoil factor 2 (tff2) peptides with moiety attached to asn15
US7928215B2 (en) 2002-11-22 2011-04-19 Eisai R&D Management Co., Ltd. Methods of screening for compounds that inhibit the biosynthesis of GPI in malaria parasites

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002004626A1 (fr) * 2000-07-07 2002-01-17 Eisai Co., Ltd. Gene de synthese de la paroi des cellules fongiques
WO2003058233A1 (fr) * 2001-12-28 2003-07-17 Eisai Co., Ltd. Technique de criblage d'un compose dote d'une activite inhibitrice de la synthese de la paroi cellulaire fongique

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
UMEMURA M. ET AL.: "GWT1 gene is required for inositol acylation of glycosylphosphatidylinositol anchors in yeast", J. BIOL. CHEM., vol. 278, no. 26, June 2003 (2003-06-01), pages 23639 - 23647, XP001179768 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8252294B2 (en) 2002-11-22 2012-08-28 Eisai R&D Management Co., Ltd. Methods of screening for compounds that inhibit the biosynthesis of GPI in malaria parasites

Also Published As

Publication number Publication date
AU2003284635A1 (en) 2004-06-18
CN1742095A (zh) 2006-03-01
EP1564299A1 (en) 2005-08-17
DE60314538T2 (de) 2008-02-28
US20060240429A1 (en) 2006-10-26
JP4061309B2 (ja) 2008-03-19
CN100371456C (zh) 2008-02-27
ATE365224T1 (de) 2007-07-15
DE60314538D1 (de) 2007-08-02
EP1564299A4 (en) 2006-07-05
EP1564299B1 (en) 2007-06-20
JPWO2004048604A1 (ja) 2006-03-23
US8323917B2 (en) 2012-12-04
AU2003284635A8 (en) 2004-06-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Keogh et al. Bur1 kinase is required for efficient transcription elongation by RNA polymerase II
Pluta et al. Maf1p, a negative effector of RNA polymerase III in Saccharomyces cerevisiae
Millson et al. A two-hybrid screen of the yeast proteome for Hsp90 interactors uncovers a novel Hsp90 chaperone requirement in the activity of a stress-activated mitogen-activated protein kinase, Slt2p (Mpk1p)
Schwer et al. RNA helicase dynamics in pre-mRNA splicing
Youdell et al. Roles for Ctk1 and Spt6 in regulating the different methylation states of histone H3 lysine 36
Gancedo et al. Moonlighting proteins in yeasts
Kaffman et al. Phosphorylation regulates association of the transcription factor Pho4 with its import receptor Pse1/Kap121
Pappas Jr et al. Functional interaction between Ssu72 and the Rpb2 subunit of RNA polymerase II in Saccharomyces cerevisiae
Hedbacker et al. Cyclic AMP-dependent protein kinase regulates the subcellular localization of Snf1-Sip1 protein kinase
Shor et al. Cpc2/RACK1 is a ribosome-associated protein that promotes efficient translation in Schizosaccharomyces pombe
Figaro et al. Trm112 is required for Bud23-mediated methylation of the 18S rRNA at position G1575
Han et al. Activator-specific requirement of yeast mediator proteins for RNA polymerase II transcriptional activation
El Alami et al. Arg82p is a bifunctional protein whose inositol polyphosphate kinase activity is essential for nitrogen and PHO gene expression but not for Mcm1p chaperoning in yeast
Mojzita et al. Pdc2 coordinates expression of the THI regulon in the yeast Saccharomyces cerevisiae
KR102281806B1 (ko) 3-hp를 생산할 수 있는 재조합 효모 및 이를 이용한 3-hp의 제조방법
Stribny et al. The human Golgi protein TMEM165 transports calcium and manganese in yeast and bacterial cells
Sattlegger et al. cpc-3, the Neurospora crassa homologue of yeast GCN2, encodes a polypeptide with juxtaposed eIF2α kinase and histidyl-tRNA synthetase-related domains required for general amino acid control
Ui et al. The N-terminal region of Sgs1, which interacts with Top3, is required for complementation of MMS sensitivity and suppression of hyper-recombination in sgs1 disruptants
Vozza et al. Biochemical characterization of a new mitochondrial transporter of dephosphocoenzyme A in Drosophila melanogaster
Clarke et al. Distinct roles for the essential MYST family HAT Esa1p in transcriptional silencing
Przybyla‐Zawislak et al. Genes of succinyl‐CoA ligase from Saccharomyces cerevisiae
Ishiguro et al. Essential roles of Bdp1, a subunit of RNA polymerase III initiation factor TFIIIB, in transcription and tRNA processing
Chang et al. Mutational analyses of trimethylguanosine synthase (Tgs1) and Mud2: proteins implicated in pre-mRNA splicing
Nargang et al. Identification of genes required for alternative oxidase production in the Neurospora crassa gene knockout library
Schuler et al. Galactose metabolism and toxicity in Ustilago maydis

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BW BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DE DK DM DZ EC EE EG ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NI NO NZ OM PG PH PL PT RO RU SC SD SE SG SK SL SY TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN YU ZA ZM ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): BW GH GM KE LS MW MZ SD SL SZ TZ UG ZM ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IT LU MC NL PT RO SE SI SK TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG

DFPE Request for preliminary examination filed prior to expiration of 19th month from priority date (pct application filed before 20040101)
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2004555006

Country of ref document: JP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2003774148

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 20038A91169

Country of ref document: CN

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2003774148

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2006240429

Country of ref document: US

Ref document number: 10536935

Country of ref document: US

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 10536935

Country of ref document: US

WWG Wipo information: grant in national office

Ref document number: 2003774148

Country of ref document: EP