DE60314538T2

DE60314538T2 - Verfahren zum screening nach verbindungen, die die enzymatische aktivität des gwt1 genproduktes hemmen

Info

Publication number: DE60314538T2
Application number: DE60314538T
Authority: DE
Inventors: Kappei Tsukuba-shi TSUKAHARA; Mamiko Ushiku-shi TSUCHIYA; Yoshifumi Tsukuba-shi JIGAMI; Kenichi Tsukuba-shi NAKAYAMA; Mariko Tsukuba-shi UMEMURA; Michiyo Tsukuba-shi OKAMOTO
Original assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST; Eisai R&D Management Co Ltd
Current assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST; Eisai R&D Management Co Ltd
Priority date: 2002-11-22
Filing date: 2003-11-21
Publication date: 2008-02-28
Anticipated expiration: 2023-11-22
Also published as: CN1742095A; EP1564299A4; DE60314538D1; EP1564299B1; EP1564299A1; US20060240429A1; JP4061309B2; JPWO2004048604A1; CN100371456C; AU2003284635A8; AU2003284635A1; US8323917B2; ATE365224T1; WO2004048604A1

Description

Technischer Hintergrund
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zum Screenen nach antimykotischen Mitteln, welche die Aktivität besitzen, die GPI-Synthase, welche an der Synthese der Pilzzellwände beteiligt ist, zu hemmen.
Hintergrund des Fachgebiets
Die genannten Erfinder stellten fest, dass die Adhäsion an Wirtszellen für Pilze wichtig ist, um ihre Pathogenität auszuüben, und dass die Adhäsionsfaktoren, welche an der Adhäsion der Pilzzellen beteiligt sind, zu der Oberflächenschicht der Zellwände transportiert werden, nachdem sich Glycosylphosphatidylinosit (GPI) an der Zellmembran verankert hat (Nicht-Patentdokument 1: Hamada K. et al., Mol. Gen. Genet. 258 (1998), 53-59). Demgemäß waren die genannten Erfinder der Ansicht, dass durch Hemmung des Prozesses des Transports der Proteine, welche mit GPI verankert sind (GPI-verankerte Proteine), zu den Zellwänden neue antimykotische Mittel erhalten werden können, welche die Synthese der Pilzzellwände hemmen und auch die Adhäsion der Pilzzellen an die Wirtszellen hemmen. Dementsprechend begannen die genannten Erfinder mit der Studie.
Offenbarung der Erfindung
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Entwicklung von antimykotischen Mitteln, um pathogene Pilze an der Ausübung ihrer Pathogenität durch Hemmung der Synthese der Pilzzellwände sowie durch Hemmung der Adhäsion der Pilzzellen an die Wirtszellen durch Hemmung des Transports der GPI-verankerten Proteine zu den Pilzzellwänden zu hindern.
In WO 02/04626 stellten die genannten Erfinder fest, dass die folgenden Proteine an dem Prozess des Transports der GPI-verankerten Proteine zu den Zell wänden beteiligt sind: die Proteine von Saccharomyces cerevisiae, welche durch DNAs, umfassend die Nucleotidsequenz von SEQ ID NO: 1, codiert werden; die Proteine von Candida albicans, welche durch DNAs, umfassend die Nucleotidsequenzen von SEQ ID NO: 3 und 5, codiert werden; die Proteine von Schizosaccharomyces pombe, welche durch DNAs, umfassend die Nucleotidsequenz von SEQ ID NO: 7, codiert werden; die Proteine von Aspergillus fumigatus, welche durch DNAs, umfassend die Nucleotidsequenzen von SEQ ID NO: 9 und 11, codiert werden; und die Proteine von Cryptococcus neoformans, welche durch DNAs, umfassend die Nucleotidsequenzen von SEQ ID NO: 12 und 13, codiert werden. Diese Nucleotidsequenzen werden als GWT1-Gene bezeichnet. Die genannten Erfinder stellten außerdem fest, dass GWT1-Gen-defiziente Pilze keine Zellwände synthetisieren können. Ferner stellten die Erfinder fest, dass die Verbindung, welche durch Formel (Ia) wiedergegeben wird, an die vorstehend beschriebenen Proteine bindet, um den Transport der GPI-verankerten Proteine zu den Zellwänden zu hemmen, wodurch die Synthese der Pilzzellwände gehemmt wird.
Die Erfinder entdeckten dann, dass das GWT1-Genprodukt (nachstehend bezeichnet als "GWT1-Protein") die Aktivität besitzt, durch das Übertragen einer Acylgruppe auf GlcN-PI in dem GPI-Biosyntheseweg GlcN-(acyl)PI zu synthetisieren (1; Kinoshita und Inoue, Curr. Opin. Chem. Biol. 4 (6), Dezember 2000, 632-8; Ferguson et al., Biochim. Biophys. Acta 1455 (2-3), 8. Oktober 1999, 327-340). Die Erfinder entwickelten die Idee, dass Verbindungen, welche die Synthese der Pilzzellwände hemmen, durch das Screenen nach Verbindungen, welche diese Aktivität hemmen, gefunden werden können, und vollendeten auf diese Weise die vorliegende Erfindung.
Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung [1] bis [4], wie nachstehend beschrieben, bereit.
[1] Verfahren zum Screenen nach einer Verbindung, welche eine antimykotische Aktivität besitzt, wobei das Verfahren folgende Schritte umfasst:

(1) Inkontaktbringen einer Testprobe mit einem überexprimierten Protein, welches durch das GWT1-Gen codiert wird;
(2) Nachweisen von GlcN-(acyl)PI; und
(3) Auswählen der Testprobe, welche GlcN-(acyl)PI vermindert.

Das "GWT1"-Gen verweist auf ein Gen, welches an der Synthese der Pilzzellwände beteiligt ist und das in WO 02/04626 offenbart wurde. Der Begriff "überexprimiert" bezieht sich nicht auf die Expression von nativen Genen, sondern auf die Expression von exogen eingebrachten Genen.
"GlcN-(acyl)PI" bezieht sich auf Glucosaminyl-acylphosphatidylinosit, worin eine Acylgruppe mit dem Inosit von Glucosaminyl-phosphatidylinosit (GlcN-PI) in dem GPI-Biosyntheseweg verbunden ist (1; Kinoshita und Inoue, Curr. Opin. Chem. Biol. 4 (6), Dezember 2000, 632-8; Ferguson et al., Biochim. Biophys. Acta 1455 (2-3), 8. Oktober 1999, 327-340).
[2] Verfahren nach [1], wobei das GWT1-Gen eines der folgenden ist:

(a) eine DNA, welche ein Protein codiert, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10 oder 14 umfasst;
(b) eine DNA, welche die Nucleotidsequenz von SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 12 oder 13 umfasst;
(c) eine DNA, welche unter stringenten Bedingungen mit der DNA hybridisiert, welche die Nucleotidsequenz von SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 12 oder 13 umfasst; und
(d) eine DNA, welche ein Protein codiert, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10 oder 14 umfasst, worin eine oder mehrere Aminosäuren hinzugefügt, entfernt, ersetzt und/oder inseriert sind.

Der Begriff "stringente Bedingungen" verweist zum Bespiel auf die Hybridisierung in 4x SSC bei 65°C, gefolgt von Waschen mit 0,1x SSC bei 65°C für eine Stunde. Alternativ verweisen stringente Bedingungen auf die Hybridisierung in 4x SSC mit 50% Formamid bei 42°C. Andere annehmbare Bedingungen können die Hybridisierung in PerfectHyb^TM-Lösung (TOYOBO) bei 65°C für 2,5 Stunden, gefolgt von Waschen mit (1) 2x SSC, 0,05% SDS bei 25°C für fünf Minuten; (2) 2x SSC, 0,05% SDS bei 25°C für 15 Minuten; und (3) 0,1x SSC, 0,1% SDS bei 50°C für 20 Minuten, sein.
Das "Protein, welches eine Aminosäuresequenz umfasst, worin eine oder mehrere Aminosäuren hinzugefügt, entfernt, ersetzt und/oder inseriert worden sind", kann mittels Verfahren, welche den Fachleuten bekannt sind, zum Beispiel mittels ortsspezifischer Mutagenese (Sambrook J., Fritsch E.F. und Maniatis T. (1989), Molecular Cloning: A Laborstory Manual, Cold Spring Harbor Laborstory, Cold Spring Harbor, NY), hergestellt werden. Solche Mutationen können auch natürlich vorkommen. Es gibt keine Begrenzung hinsichtlich der Anzahl der Aminosäuren, welche mutiert werden, solange das erhaltene Protein die Aktivität beibehält, eine Acylgruppe auf GlcN-PI zu übertragen. Die Anzahl der Aminosäuren, welche mutiert werden, beträgt typischerweise 30 oder weniger, vorzugsweise 10 oder weniger und mehr bevorzugt 3 oder weniger. Es gibt keine Begrenzung hinsichtlich der Position der mutierten Aminosäuren, solange das Protein die Aktivität, wie vorstehend beschrieben, beibehält.
Die Proteine und Proteinmutanten, welche unter Anwendung der vorstehend beschriebenen Hybridisierungstechniken hergestellt werden, weisen normalerweise eine hohe Homologie (zum Beispiel eine Homologie von 60% oder höher, 70% oder höher, 80% oder höher, 90% oder höher oder 95% oder höher) zu den Proteinen, welche aus der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10 oder 14 bestehen, auf dem Aminosäureniveau auf. Die Aminosäuresequenzhomologie kann mittels des BLASTx-Programms (auf dem Aminosäureniveau; Altschul et al., J. Mol. Biol. 215 (1990), 403-410) bestimmt werden. Dieses Programm basiert auf dem BLAST-Algorithmus von Karlin und Altschul (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 (1990), 2264-2268; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993), 5873-5877). Wenn die Aminosäuresequenzen mittels BLASTX analysiert werden, schließen die verwendeten Parameter zum Beispiel einen Score = 50 und eine Wortlänge = 3 ein. Alternativ, wenn das Gapped BLAST-Programm verwendet wird, können die Aminosäuresequenzen nach der Methode, welche durch Altschul et al. (Nucleic. Acids Res. 25 (1997), 3389-3402) beschrieben ist, analysiert werden. Wenn das BLAST-Programm und das Gapped BLAST-Programm verwendet werden, werden für jedes Programm die Standardparameterwerte verwendet. Spezielle Prozeduren für diese Analysen sind auf dem Fachgebiet bekannt (http://www.ncbi.nlm.nih.gov).
[3] Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Schritt des Nachweisens des acylierten GPI mittels Dünnschichtchromatographie erfolgt.
[4] Verfahren nach einem der Ansprüche [1] bis [3], wobei das Verfahren weiterhin einen Schritt 4 umfasst, um zu bestimmen, ob die ausgewählte Testprobe den Prozess des Transports eines GPI-verankerten Proteins zu einer Pilzzellwand hemmt, ob die Testprobe die Expression eines GPI-verankerten Proteins auf der Zelloberfläche eines Pilzes hemmt oder ob die Testprobe die Proliferation eines Pilzes hemmt.
Nachstehend werden Verfahren zur Herstellung eines GWT1-Proteins [1] und Verfahren zum Bestimmen der Transacylierungsaktivität [2] der vorliegenden Erfindung offenbart.
1. Verfahren zur Herstellung eines GWT1-Proteins
Das GWT1-Protein wird aus der Membranfraktion eines Pilzes hergestellt, welche vorzugsweise von S. cerevisiae, C. albicans, S. pombe, A. fumigatus oder C. neoformans und mehr bevorzugt S. cerevisiae stammt. Die Transacylierungsaktivität kann unter Verwendung der hergestellten Membranfraktion entweder direkt oder nach der Reinigung bestimmt werden. Die Transacylierungsaktivität kann durch Einbringen einer DNA mit der Nucleotidsequenz von SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 12 oder 13 in Pilzzellen, um das GWT1-Protein überzuexprimieren, leicht gemessen werden. Dieses Verfahren kann wie folgt unter Verwendung von S. cerevisiae genauer beschrieben werden:
(1) Einbringen des GWT1-Gens
Das GWT1-Gen kann durch Durchführen einer PCR unter Verwendung von Pilz-DNAs als Matrizen und von Primern, welche basierend auf einer Nucleotidsequenz von SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 12 oder 13 entworfen werden, hergestellt werden.
Das GWT1-Expressionsplasmid wird hergestellt, indem ein geeigneter Promotor und Terminator, wie ein GAPDH-Promotor und ein GAPDH-Terminator, welche von pKT10 stammen (Tanaka et al., Mol. Cell Biol. 10 (1990), 4303-4313), in die Multiclonierungsstelle eines Expressionsvektors, der in S. cerevisiae funktionsfähig ist, wie YEp352, eingeführt werden und das GWT1-Gen in den Expressionsvektor inseriert wird. S. cerevisiae-Zellen, zum Beispiel der Stamm G2-10, werden unter Schütteln in einem geeigneten Medium wie Hefeextrakt-Polypepton-Dextrose (YPD)- Medium bei einer geeigneten Temperatur, zum Beispiel bei 30°C, inkubiert. Die Pilzzellen werden in der späten logarithmischen Wachstumsphase geerntet. Nach dem Waschen werden die GWT1-Expressionsplasmide zum Beispiel mittels der Lithiumacetat-Methode in die S. cerevisiae-Zellen eingebracht. Die Lithiumacetat-Methode ist in dem Benutzerhandbuch beschrieben, das dem YEAST MAKER^TM Yeast Transformation System (Clontech) beigefügt ist. Durch Züchten der Zellen in SD(ura^–)-Medium bei 30°C für zwei Tage können ein GWT1 überexprimierender Stamm und ein Stamm, in den ein leerer Vektor eingebracht wurde, erhalten werden.
Pilzstämme, in welche das GWT1-Gen eingebracht wird, sind vorzugsweise defiziente Stämme, welche ihr natives GWT1-Gen verloren haben. GWT1-Gendefiziente S. cerevisiae-Zellen können durch ein nachstehend beschriebenes Verfahren erhalten werden.
Die PCR-Amplifikation wird unter Verwendung eines Markergens, vorzugsweise des his5-Gens von S. pombe, als eine Matrize und von Primern durchgeführt, welche derart konstruiert sind, dass PCR-Produkte erhalten werden, welche eine Deletion von 30 bp oder mehr bevorzugt 40 bp oder mehr der GWT1-Gensequenz (zum Beispiel der Sequenz von SEQ ID NO: 1) umfassen. Die erhaltenen PCR-Produkte werden gereinigt und dann in Pilzzellen eingebracht. Defiziente Stämme können durch ein Screening, welches für das Markergen geeignet ist, zum Beispiel durch Züchten der Zellen in his-Medium, wenn der Marker his5 ist, erhalten werden.
Expressionsvektoren und Verfahren zur Einführung eines Gens für andere Pilze als S. cerevisiae sind beschrieben bei: Igarashi et al., Nature 353 (1991), 80-83, für den S. pombe-Expressionsvektor pcL und dergleichen sowie Verfahren zur Einführung der Vektoren; Pla J. et al., Yeast 12 (1996), 1677-1702, für den C. albicans-Expressionsvektor pRM10 und dergleichen sowie Verfahren zur Einführung dieser Vektoren; Punt P.J. et al., Gene 56 (1987), 117-124, für den A. fumigatus-Expressionsvektor pAN7-1 und dergleichen sowie Verfahren zur Einführung dieser Vektoren; und Monden P. et al., FEMS Microbiol. Lett. 187 (2000), 41-45, für den C. neoformans-Expressionsvektor pPM8 und dergleichen sowie Verfahren zur Einführung dieser Vektoren,.
Verfahren zur Herstellung von defizienten Stämmen von C. albicans sind bei Fonzi W.A. et al., Genetics 134 (1993), 717-728, beschrieben.
(2) Verfahren zur Herstellung der Membranfraktion
S. cerevisiae-Zellen, in welche das GWT1-Gen eingebracht wird, werden unter Schütteln in einem geeigneten Medium wie SD(ura^–)-Flüssigmedium bei einer geeigneten Temperatur, zum Beispiel 24°C, gezüchtet. Die Pilzzellen werden in der mittleren logarithmischen Wachstumsphase geerntet. Nach dem Waschen mit TM-Puffer (50 mM Tris-HCl (pH 7,5) und 2 mM MgCl₂) werden die Pilzzellen in einer angemessenen Menge (zum Beispiel 2 ml) an TM-Puffer + Proteaseinhibitor (Complete^TM; Roche) suspendiert. Eine angemessene Menge (zum Beispiel 1,5 ml) an Glaskügelchen wird zu der Suspension zugegeben. Die Proben werden mit einem Vortexgerät gemischt und auf Eis gestellt, und dieser Vorgang wird wiederholt (zum Beispiel für zehn Zyklen des Mischens mit einem Vortexgerät für 30 Sekunden und des Stellens auf Eis für 30 Sekunden), um die Pilzzellen aufzubrechen.
Die Proben werden zentrifugiert, zum Beispiel bei 1000 × g für 5 Minuten, um die Glaskügelchen und die Pilzzellen, welche nicht aufgebrochen sind, zu präzipitieren. Der erhaltene Überstand wird in ein anderes Röhrchen überführt und dann zentrifugiert, zum Beispiel bei 13.000 × g für 20 Minuten, um die Membranfraktion, welche die Organellen umfasst (Gesamtmembranfraktion), zu präzipitieren. Gegebenenfalls wird das Präzipitat weiterhin in 1 ml eines geeigneten Testpuffers suspendiert und zentrifugiert, zum Beispiel bei 1000 × g für eine Minute, um solche Komponenten zu entfernen, welche nicht suspendiert sind. Der Überstand wird dann zentrifugiert, zum Beispiel bei 13.000 × g für 20 Minuten, und das erhaltene Präzipitat wird in einem geeigneten Testpuffer resuspendiert, um eine Membranfraktion zu erhalten.
Membranfraktionen von anderen Pilzzellen als von S. cerevisiae können durch die Verfahren hergestellt werden, welche bei Yoko-o et al., Eur. J. Biochem. 257 (1998), 630-637, für S. pombe; Sentandreu M. et al., J. Bacteriol. 180 (1998), 282-289, für C. albicans; Mouyna I. et al., J. Biol. Chem. 275 (2000), 14882-14889, für A. fumigatus; und Thompson J.R. et al., J. Bacteriol. 181 (1999), 444-453, für C. neoformans beschrieben sind.
Alternativ kann ein GWT1-Protein durch die Expression in anderen Zellen als Pilzzellen wie zum Beispiel Säugerzellen, Insektenzellen und E. coli-Zellen hergestellt werden.
Wenn Säugerzellen verwendet werden, kann eine Membranfraktion dadurch hergestellt werden, dass GWT1 zum Beispiel in einen Überexpressionsvektor, der einen CMV-Promotor umfasst, inseriert wird; der Vektor in Säugerzellen eingebracht wird; und anschließend das Verfahren, welches bei Petaja-Repo et al., J. Biol. Chem. 276 (2001), 4416-4423, beschrieben ist, durchgeführt wird.
Falls Insektenzellen verwendet werden, kann eine Membranfraktion dadurch hergestellt werden, dass GWT1-exprimierende Insektenzellen (wie Sf9-Zellen) unter Verwendung eines Baculovirus-Expressionskits, zum Beispiel des BAC-TO-BAC-Baculovirus-Expressionssystems (Invitrogen), erzeugt werden; und dann diese Zellen verwendet werden, um das Verfahren durchzuführen, welches bei Okamoto et al., J. Biol. Chem. 276 (2001), 742-751, beschrieben ist.
Wenn E. coli verwendet wird, kann das GWT1-Protein hergestellt werden, indem GWT1 in einen E. coli-Expressionsvektor, zum Beispiel pGEX (Amersham Biosciences), inseriert wird; und dann der Vektor in E. coli-Zellen wie BL21 eingebracht wird.
2. Verfahren zum Bestimmen der Transacylierungsaktivität
Die Transacylierungsreaktion zu GPI kann durch das Verfahren, welches bei Costello und Orlean, J. Biol. Chem. 267 (1992), 8599-8603, beschrieben ist, oder das Verfahren, welches bei Franzot und Doering, Biochem. J. 340 (1999), 25-32, beschrieben ist, nachgewiesen werden. Beispiele für spezifische Verfahren werden nachstehend erläutert, jedoch werden die nachstehenden Versuchsbedingungen vorzugsweise entsprechend der GWT1-Genprodukte, welche verwendet werden, wie folgt optimiert:
Das GWT1-Genprodukt, das vorstehend in Abschnitt 1 hergestellt wurde, vorzugsweise eine Membranfraktion, welche ein GWT1-Genprodukt umfasst, wird zusammen mit den Testverbindungen zu einem Puffer zugegeben, der geeignete Metallionen (Mg, Mn); ATP; und Coenzym A; und vorzugsweise Hemmstoffe, welche den Verbrauch von UDP-GlcNAc in anderen Reaktionen verhindern, wie Nikkomycin Z als ein Hemmstoff der Chitinsynthese und Tunicamycin als ein Hemmstoff der Synthese einer Asparagin-gebundenen Zuckerkette, umfasst. Das Gemisch wird bei einer geeigneten Temperatur für einen geeigneten Zeitraum (zum Beispiel bei 24°C für 15 Minuten) inkubiert.
Anschließend wird ein GlcN-(acyl)PI-Vorläufer (zum Beispiel UDP-GlcNAc oder Acyl-Coenzym A und vorzugsweise UDP-[¹⁴C]GlcNAc), welches mit einem geeigneten Marker, vorzugsweise mit einem Isotop, markiert ist, zu dem Gemisch zugegeben. Das erhaltene Gemisch wird weiterhin für einen geeigneten Zeitraum (zum Beispiel für eine Stunde bei 24°C) inkubiert. Ein 1:2-Gemisch von Chloroform:Methanol wird zu dem Gemisch zugegeben und gerührt, um die Reaktion zu stoppen. Anschließend werden die Lipide aus dem Gemisch extrahiert. Die extrahierten Reaktionsprodukte werden in einem geeigneten Lösungsmittel, vorzugsweise in Butanol, gelöst und dann einer HPLC, Dünnschichtchromatographie (DC) oder dergleichen und vorzugsweise einer DC unterzogen, um das bei der Umsetzung erzeugte GlcN-(acyl)PI zu isolieren. Das Entwicklungslösungsmittel für die DC kann geeignet gewählt werden, und kann zum Beispiel CHCl₃/CH₃OH/H₂O (65:25:4), CHCl₃/CH₃OH/1 M NH₄OH (10:10:3) oder CHCl₃/Pyridin/HCOOH (35:30:7) und vorzugsweise HCl₃/CH₃OH/1 M NH₄OH (10:10:3) sein. Das isolierte GlcN-(acyl)PI wird durch ein Verfahren quantifiziert, welches mit dem verwendeten Marker vereinbar ist. Falls das isolierte GlcN-(acyl)PI mit einem Isotop markiert ist, wird es basierend auf seiner Radioaktivität quantifiziert.
Wenn eine verminderte Menge an GlcN-(acyl)PI in Anwesenheit einer Testverbindung hergestellt wird, wird für die Testverbindung nachgewiesen, dass sie die Aktivität besitzt, die Transacylierung durch GWT1-Proteine zu hemmen.
Eine Testprobe, für welche nachgewiesen wurde, dass sie die Aktivität besitzt, die Transacylierung zu hemmen, wie vorstehend beschrieben, wird vorzugsweise weiter getestet, um zu bestimmen, ob sie den Prozess des Transports der GPI-verankerten Proteine zu den Pilzzellwänden hemmt, ob sie die Expression der GPI-verankerten Proteine auf der Zeltoberfläche eines Pilzes hemmt oder ob sie das Pilzwachstum hemmt. Falls die Testergebnisse zeigen, dass die Testprobe den Prozess des Transports der GPI-verankerten Proteine zu den Pilzzellwänden hemmt, die Expression der GPI-verankerten Proteine auf der Zelloberfläche eines Pilzes hemmt oder das Pilzwachstum hemmt, dann ist die Probe ein vielversprechender Kandidat für ein antimykotisches Mittel.
Verfahren, bei denen (1) Reporterenzyme verwendet werden; (2) Antikörper verwendet werden, welche mit Glycoproteinen auf der Oberflächenschicht der Pilzzellwände reagieren; (3) Pilzzellen auf ein Adhäsionsvermögen an tierische Zellen getestet werden; oder (4) Pilzzellen unter einem Lichtmikroskop oder Elektronenmikroskop untersucht werden, können angewendet werden, um zu überprüfen, ob eine Testprobe den Prozess des Transports der GPI-verankerten Proteine zu den Pilzzellwänden hemmt oder die Expression der GPI-verankerten Proteine auf der Zelloberfläche eines Pilzes hemmt.
Die Verfahren (1) bis (4) sind in WO 02/04626 eingeschlossen und in den Beispielen genau erläutert. Durch Anwendung der Verfahren (1) bis (4), vorzugsweise in Kombination miteinander, kann für eine Testprobe festgestellt werden, ob sie den Prozess des Transports der GPI-verankerten Proteine zu den Pilzzellwänden hemmt oder die Expression der GPI-verankerten Proteine auf der Zeltoberfläche eines Pilzes hemmt. Ferner kann für eine Testprobe festgestellt werden, ob sie den Prozess des Transports der GPI-verankerten Proteine zu den Zellwänden beeinflusst, wenn die Hemmung durch die Testprobe vermindert oder aufgehoben wird, falls ein Protein, welches durch eine DNA der vorliegenden Erfindung codiert wird, in Pilzzellen überexprimiert wird.
Herkömmliche Verfahren zur Messung einer antimykotischen Aktivität können ebenfalls angewendet werden, um zu bestimmen, ob eine Testprobe das Pilzwachstum hemmt (National Committee for Clinical Laborstory Standards (1992), Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing for yeasts. Vorgeschlagener Standard M27-P. National Committee for Clinical Laborstory Standards, Villanova, PA.).
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt den GPI-Biosyntheseweg.
2 ist eine Fotografie, welche die Ergebnisse des Nachweises einer GPI-Acylierung in Membranfraktionen zeigt, welche aus dem Wildtyp-Stamm (WT), dem Stamm Δgwt1, worin das GWT1-Gen unterbrochen ist, und dem Stamm Δgwt1 (MG), in den ein GWT1-Gen eingeführt wurde, hergestellt wurden.
3 ist eine Fotografie, welche die Ergebnisse des Nachweises einer Hemmaktivität auf die GPI-Acylierung von 1-(4-Butylbenzyl)isochinolin und N-(3-(4-(1-Isochinolylmethyl)phenyl)-2-propinylacetamid in dem Nachweissystem für acyliertes GPI zeigt. In WO 02/04626 , welches das GWT1-Gen offenbart, sind diese zwei Verbindungen in Tabelle 1 aufgeführt und in Beispiel B2 bzw. Beispiel B60 beschrieben.
4 ist eine Fotografie, welche die Ergebnisse des Nachweises einer Hemmaktivität auf die GPI-Acylierung von N-(3-(4-(1-Isochinolylmethyl)phenyl)propyl)-N-methylacetamid und 5-Butyl-2-(isochinolylmethyl)phenol in dem Nachweissystem für acyliertes GPI zeigt. In WO 02/04626 , welches das GWT1-Gen offenbart, sind diese zwei Verbindungen in Tabelle 1 aufgeführt und in Beispiel B73 bzw. Beispiel B85 beschrieben.
Beste Art der Durchführung der Erfindung
Nachstehend wird die vorliegende Erfindung unter Verwendung von Beispielen genau beschrieben, welche aber nicht als Begrenzung gedeutet werden sollen.
[Beispiel 1] Herstellung einer Membranfraktion, welche ein GWT1-Protein exprimiert
(1) Herstellung eines GWT1-Expressionsplasmids
Der Vektor für die Expression in S. cerevisiae, der Vektor YEp352GAPII, wurde dadurch hergestellt, dass ein GAPDH-Promotor und ein GAPDH-Terminator, welche beide von pKT10 stammen (Tanaka et al., Mol. Cell Biol. 10 (1990), 4303-4313), in die Multiclonierungsstelle von YEp352 inseriert wurden und die Multiclonierungsstelle durch diejenige von pUC18 ersetzt wurde. Um die Insertion des GWT1-Gens zu erleichtern, wurde außerdem der Vektor YEp352GAPIIClaIΔSal durch Ersetzen der ClaI-Stelle durch eine SalI-Stelle in der Multiclonierungsstelle hergestellt.
Das GWT1-Gen von S. cerevisiae, welches die Nucleotidsequenz von SEQ ID NO: 1 umfasst, wurde unter Verwendung der Primer von SEQ ID NO: 15 und 16 amplifiziert. Das erhaltene PCR-Produkt wurde in die Multiclonierungsstelle des Vektors YEp352GAPIIClaIΔSal inseriert, um das GWT1-Überexpressionsplasmid herzustellen.
(2) Erzeugung des GWT1-Gen-defizienten Stamms Δgwt1 von S. cerevisiae
Eine his5-Kassette, die an beiden Enden GWT1-Sequenzen umfasst, wurde mittels PCR unter Verwendung des his5-Gens von S. pombe (Longtine M.S. et al., Yeast 14 (1998), 953-961) als eine Matrize und der Sequenzen von SEQ ID NO: 17 und 18 als Primer amplifiziert.
S. cerevisiae-Zellen wurden gezüchtet und geerntet und dann einer Transformation mit den vorstehend beschriebenen PCR-Produkten unterzogen. Anschließend wurden die Zellen in SD(His^–)-Medium bei 30°C für 5 bis 7 Tage gezüchtet, um den GWT1-Gen-defizienten Stamm Δgwt1 zu erhalten.
(3) Herstellung von GWT1-exprimierenden Zellen
Zellen des Stamms Δgwt1 wurden unter Schütteln in Hefeextrakt-Polypepton-Dextrose (YPD)-Medium bei 30°C gezüchtet. Die Zellen wurden in der späten logarithmischen Wachstumsphase geerntet und dann gewaschen. Das Expressionsplasmid für GWT1 wurde nach der Lithiumacetat-Methode (YEAST MAKER^TM Yeast Transformation System (Clontech)) in die Zellen des Stamms Δgwt1 eingebracht. Durch Züchten der Zellen in SD(ura^–)-Medium bei 30°C für zwei Tage wurde ein Δgwt1-Stamm erhalten, der das GWT1-Gen überexprimiert.
(4) Herstellung einer Membranfraktion
Der S. cerevisiae Wildtyp-Stamm, der GWT1-Gen-defiziente Stamm Δgwt1 und der Stamm Δgwt1, in welchen das GWT1-Überexpressionsplasmid eingebracht wurde, wurden jeweils in 100 ml YPD-Medium bei 24°C unter Schütteln gezüchtet und dann in der mittleren logarithmischen Wachstumsphase geerntet (OD₆₀₀ = 1-3). Die Pilzzellen wurden mit TM-Puffer (50 mM Tris-HCl (pH 7,5) und 2 mM MgCl₂) gewaschen und dann in 2 ml TM-Puffer + Proteaseinhibitor (1 Tablette Complete^TM (Roche)/25 ml) suspendiert. Zu der Suspension wurden 1,5 ml Glaskügelchen zugegeben. Das Gemisch wurde mit einem Vortexgerät für 30 Sekunden gemischt und dann für 30 Sekunden auf Eis gestellt. Dieser Vorgang wurde zehnmal wiederholt, um die Pilzzellen aufzubrechen. Das Zellhomogenat wurde in ein neues Röhrchen überführt und bei 1000 × g bei 4°C für fünf Minuten zentrifugiert, um die Glaskügelchen und die nicht aufgebrochenen Pilzzellen zu präzipitieren. Der Überstand wurde in ein anderes Röhrchen überführt und bei 13.000 × g bei 4°C für 20 Minuten zentrifugiert, um die Membranfraktion, welche die Organellen umfasst (Gesamtmembranfraktion), zu präzipitieren. Das erhaltene Präzipitat wurde als Membranfraktion verwendet.
(5) Nachweis von acyliertem GPI
Bekanntlich wird in dem GPI-Biosyntheseweg N-Acetyl-glucosaminyl-phosphatidylinosit (GlcNAc-PI) desacyliert, um Glucosaminyl-phosphatidylinosit (GlcN-PI) zu erzeugen, an das anschließend eine Acylgruppe angehängt wird, um Glucosaminyl-acylphosphatidylinosit (GlcN-(acyl)PI) herzustellen (1). Die genannten Erfinder untersuchten daher, ob das GWT1-Protein an dieser Transacylierungsreaktion beteiligt war, wobei sie das nachstehend beschriebene Verfahren anwendeten.
Die Membranfraktion-Präparation (300 μg Protein) wurde mit einem Puffer, enthaltend 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 2 mM MgCl₂, 2 mM MnCl₂, 1 mM ATP, 1 mM Coenzym A, 21 μg/ml Tunicamycin, 10 μM Nikkomycin Z und 0,5 mM Dithiothreit, verdünnt. Die Lösung wurde für die Verwendung als eine Reaktionslösung auf ein Gesamtvolumen von 140 μl gebracht. Nach Inkubieren der Lösung bei 24°C für 15 Minuten wurden 15 μCi UDP-[¹⁴C]GlcNAc zu dem Röhrchen zugegeben und dann bei 24°C für eine weitere Stunde inkubiert. 1 ml Chloroform:Methanol (1:2) wurde zu der Lösung zugegeben und gerührt, um die Reaktion zu stoppen. Anschließend wurde das Lipid aus der Lösung extrahiert, getrocknet und mittels Butanolextraktion entsalzt. Acyliertes GPI (GlcN-(acyl)PI)), nicht-acyliertes GPI (GlcN-PI) und GPI, das weder acyliert noch desacyliert wurde (GlcNAc-PI), wurden mittels Dünnschichtchromatographie (HCl₃/CH₃OH/1 M NH₄OH (10:10:3) aufgetrennt. Jeder Fleck wurde mittels Autoradiographie nachgewiesen.
Als Ergebnis, wie in 2 gezeigt, wurde für den GWT1-Gen-defizienten Stamm (Δgwt1) kein Fleck für acyliertes GPI nachgewiesen, während er bei dem Wildtyp-Stamm nachgewiesen wurde. Der Fleck für acyliertes GPI wurde auch für den Δgwt1-Stamm nachgewiesen, in welchen ein GWT1-Gen eingebracht wurde, was zeigt, dass dieser Stamm die Fähigkeit zur Acylierung wiedererlangt hat. Diese Feststellung deutet darauf hin, dass das GWT1-Protein ein Enzym ist, welches die Transacylierung zu GPI katalysiert.
Die vorstehend beschriebenen Ergebnisse legen nahe, dass die Intensität des Flecks für acyliertes GlcN-(acyl)PI vermindert wird oder verschwindet, wenn eine Verbindung, welche die Aktivität besitzt, die Aktivität der GWT1-Genprodukte zu hemmen, in einem System zum Nachweis einer GPI-Synthase-Aktivität vorhanden ist. Demgemäß können Verbindungen, welche die enzymatische Aktivität eines GWT1-Genprodukts hemmen, sowie Verbindungen, welche die Synthese der Pilz zellwände hemmen, anhand der Intensität von GlcN-(acyl)PI-Flecken als ein Indikator gescrennt werden.
(6) Screenen nach Verbindungen, welche die Acylierung hemmen
Die nachstehenden Verbindungen werden zu dem in (5) beschriebenen Nachweissystem für acyliertes GPI zugegeben, um die Aktivität hinsichtlich der Hemmung der GPI-Acylierung zu messen. Diese Verbindungen sind in Beispiel B2, Beispiel B60, Beispiel B73 und Beispiel B85 in WO 02/04626 , welches das GWT1-Gen offenbart, beschrieben. In WO 02/04626 sind diese Verbindungen auch in Tabelle 1 aufgeführt, welche ihre Hemmaktivität in einem Reportersystem zeigt, welches die Aktivität der GWT1-Genprodukte widerspiegelt. Die Strukturen dieser Verbindungen sind nachstehend wiedergegeben:
Die Verbindung, welche in Beispiel B2 beschrieben ist: 1-(4-Butylbenzyl)isochinolin
Die Verbindung, welche in Beispiel B60 beschrieben ist: N-(3-(4-(1-Isochinolylmethylphenyl)-2-propinyl)acetamid
Die Verbindung, welche in Beispiel B73 beschrieben ist: N-(3-(4-(1-Isochinolylmethyl)phenyl)propyl)-N-methylacetamid
Die Verbindung in Beispiel B85: 5-Butyl-2-(1-isochinolylmethyl)phenol
Die Testergebnisse sind in 3 und 4 gezeigt. Von den Verbindungen, die in Tabelle 1 in WO 02/04626 aufgeführt sind, zeigten die Verbindungen, welche in Beispiel B2 und Beispiel B85 beschrieben sind, mit Hemmaktivitäten bei einem IC₅₀-Wert von 1 μg/ml oder weniger eine dosisabhängige Verminderung der Fleckenintensität des acylierten GPI. Für die Fleckenintensität der Verbindung, die in Beispiel B73 beschrieben ist, mit einem IC₅₀-Wert von 50 μg/ml wurde keine Verminderung beobachtet.
Diese Ergebnisse zeigten, dass Verbindungen, welche die enzymatische Aktivität der GWT1-Genprodukte hemmen, unter Verwendung des Testsystems auf eine GPI-Acylierung gescreent werden können.
Gewerbliche Anwendbarkeit
Die vorliegende Erfindung ermöglicht das Screenen nach Verbindungen, welche den Transport der GPI-verankerten Proteine zu den Pilzzellwänden hemmen, mittels eines einfachen Tests auf eine Transacylierungsaktivität. Sequenzprotokoll

Claims

Verfahren zum Screenen nach einer Verbindung, welche eine antimykotische Wirkung hat, wobei das Verfahren folgende Schritte umfasst: (1) Inkontaktbringen einer Testprobe mit einem überexprimierten Protein, welches vom GWT1-Gen codiert wird; (2) Nachweisen von GlcN-(acyl)PI; und (3) Auswählen der Testprobe, welche GlcN-(acyl)PI vermindert.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das GWT1-Gen eines der folgenden ist: (a) eine DNA, welche ein Protein codiert, welches die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10 oder 14 umfasst; (b) eine DNA, welche die Nucleotidsequenz von SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 12 oder 13 umfasst; (c) eine DNA, welche unter stringenten Bedingungen an die DNA hybridisiert, welche die Nucleotidsequenz von SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 12 oder 13 umfasst; und (d) eine DNA, welche ein Protein codiert, welches die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10 oder 14 umfasst, wobei eine oder mehrere Aminosäuren hinzugefügt, entfernt, ersetzt und/oder inseriert sind.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Schritt des Nachweisens des acylierten GPI mittels Dünnschichtchromatographie erfolgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Verfahren weiterhin einen Schritt 4 umfasst zum Bestimmen, ob die ausgewählte Testprobe den Prozess des Transportierens eines GPI-verankerten Proteins zur Pilzzellwand hemmt, ob die Testprobe die Expression eines GPI-verankerten Proteins auf der Zelloberfläche eines Pilzes hemmt, oder ob die Testprobe die Proliferation eines Pilzes hemmt.