JP2004515235A

JP2004515235A - Ｔｆｆペプチド

Info

Publication number: JP2004515235A
Application number: JP2002547962A
Authority: JP
Inventors: ティム，ラルス; エー．ビエルン，セレン; スロトアンデルセン，アッセル; セイエルポールセン，ステーン
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 2000-12-08
Filing date: 2001-12-06
Publication date: 2004-05-27
Also published as: US20060111278A1; WO2002046226A2; US20020151472A1; AU2002221565A1; EP1341817A2; WO2002046226A3

Abstract

トレフォイル因子ペプチド。

Description

【０００１】
発明の技術分野
本発明は新規トレフォイル因子（ＴＦＦ）ペプチド、特にＴＦＦ２ペプチド、ＴＦＦペプチドの製造方法及びＴＦＦペプチドを含む製剤組成物に関連するが、該ＴＦＦペプチドは哺乳動物の粘液層の粘性を高める作用があり、哺乳動物の、たとえば口腔、食道、胃、小腸・大腸及び結腸を含む胃腸管；気道；眼；膀胱及び子宮頚部を含む泌尿器系の粘液層損傷又は異常を伴う状態の治療に適する。
【０００２】
発明の背景
ＴＦＦペプチドは主に胃腸管に分布するペプチドファミリーを構成する。哺乳類ＴＦＦペプチドは１つ又は複数の特徴的なトレフォイル（三つ葉型）ドメインを含み、各ドメインは３８又は３９アミノ酸残基の配列からなり、うち６個のハーフシスチンが１−５、２−４及び３−６の立体配置で結合し特有のトレフォイル構造を形成している。
【０００３】
現在知られている哺乳類ＴＦＦペプチドは１つ又は２つのトレフォイルドメインを含む。１ドメイン型の哺乳類ＴＦＦペプチドは、これまでにヒト、マウス及びラットから検出されている乳がん関連のｐＳ２ペプチド（ＴＦＦ１）、それにやはりヒト、マウス及びラットから検出されている腸トレフォイル因子（ＩＴＦ）ペプチド（ＴＦＦ３）である。２ドメイン型の鎮痙ポリペプチド（ＴＦＦ２）はこれまでにヒト、ブタ、ラット及びマウスから検出されている。ヒトでは３種類のＴＦＦペプチドｈＴＦＦ１（ｈｐＳ２）、ｈＴＦＦ２（ｈＳＰ）及びｈＴＦＦ３（ｈＩＴＦ）はすべて胃腸管で通常の状態で（すなわちＴＦＦ１とＴＦＦ２は胃の上皮粘膜層で、またＴＦＦ３は小腸と結腸の上皮粘膜層で）発現する。
【０００４】
ＴＦＦペプチドの生理機能はあまりよくわかっていない。炎症性腸疾患や胃及び十二指腸の潰瘍形成などいくつかの症状に関連して胃腸管でのＴＦＦペプチドの発現の増進が報告されている。
ＷＯ９２／１４８３７にはラット及びヒト１ドメイン型ＴＦＦ３（ＩＴＦ）のクローニングと該ペプチドの胃腸障害治療への使用について記載されている。
【０００５】
発明の説明
本発明は図１に示す一般式Ｉの新規ＴＦＦ２ペプチドに関連し、式中Ｘは後述のとおりである。
本化合物は哺乳動物の、口腔、食道、胃、小腸・大腸及び結腸を含む胃腸管；気道；眼；及び膀胱及び子宮頚部を含む泌尿器系の粘液層損傷又は異常の修復に有効である。
本発明は大まかな態様では、図１の一般式Ｉで示される複数のＴＦＦ２ペプチドに関連し、式中Ｘはアミノ酸残基番号１５のアスパラギンに結合した共有結合グリコシル化を表わす。
【０００６】
更なる態様では本発明は、図１の一般式Ｉで示される複数のＴＦＦ２ペプチドに関連し、式中Ｘは糖残基及びオリゴ糖より独立に選択される。
更なる態様では本発明は、配列番号：１のアミノ酸配列を有しＣｙｓ６−Ｃｙｓ１０４、Ｃｙｓ８−Ｃｙｓ３５、Ｃｙｓ１９−Ｃｙｓ３４、Ｃｙｓ２９−Ｃｙｓ４６、Ｃｙｓ５８−Ｃｙｓ８４、Ｃｙｓ６８−Ｃｙｓ８３及びＣｙｓ７８−Ｃｙｓ９５の間にジスルフィド結合を含む複数のＴＦＦ２ペプチドであって、糖残基及びオリゴ糖より独立に選択されるＸ部分がＡｓｎ１５と共有結合した複数のＴＦＦ２ペプチドに関連する。
【０００７】
更なる態様では本発明は、配列番号：１のアミノ酸配列を有しＣｙｓ６−Ｃｙｓ１０４、Ｃｙｓ８−Ｃｙｓ３５、Ｃｙｓ１９−Ｃｙｓ３４、Ｃｙｓ２９−Ｃｙｓ４６、Ｃｙｓ５８−Ｃｙｓ８４、Ｃｙｓ６８−Ｃｙｓ８３及びＣｙｓ７８−Ｃｙｓ９５の間にジスルフィド結合を含む複数のＴＦＦ２ペプチドであって、Ａｓｎ１５と共有結合したＸ部分がＴＦＦ２ペプチドの真核宿主細胞中での発現により引き起こされるグリコシル化を特徴とする複数のＴＦＦ２ペプチドに関連する。
【０００８】
用語「複数のＴＦＦ２ペプチド」はここではＴＦＦ２ペプチドの混合物をいい、該混合物中の個別ペプチド分子のアミノ酸配列は図１のとおりであるが、アスパラギンと共有結合したＸで表わされるグリコシル化は該混合物中の個別ペプチド分子間で異なってもよい。この定義内の特殊例では、混合物中のＴＦＦ２ペプチドはすべて、グリコシル化を含めてまったく同じである。
【０００９】
この定義の狙いは、真核宿主細胞中でのＴＦＦ２ペプチドの産生が均質産物ではなく不均質産物をもたらし、個別ＴＦＦ２分子間でグリコシル化に差異が生じるといったケースへの配慮である。しかし、個別グリコシル化体のＴＦＦ２ペプチドを後で単離することも可能である。
用語「グリコシル化」はここではペプチドの翻訳後修飾により該ペプチドに糖質分子が共有結合することを意味する。グリコシル化は酵母などの真核宿主細胞中で起きてもよいし、細胞中でのペプチド産生後にｉｎｖｉｔｒｏ化学結合で起こす、たとえばペプチドを細菌に産生させた後にｉｎｖｉｔｒｏでグリコシル化することも可能である。
【００１０】
用語「糖」又は「糖残基」はここでは極性ヒドロキシル基（−ＯＨ）を含む主に炭化水素構造の糖質をいう。一般的な糖の非限定的な例は六炭糖（ヘキソース）や五炭糖（ペントース）たとえばグルコース、マンノース、ガラクトース、フコース、フルクトース又はＮ−アセチルグルコサミンなどである。用語「糖」又は「糖残基」は糖モノマー１個だけを含むモノマーに限らず、複数個の糖モノマーを含むポリマーをも包含し、また該ポリマー中の該糖モノマーは同じでも異なってもよい。
【００１１】
用語「オリゴ糖」はここでは、グリコシド結合により線状又は枝分かれ構造に結合した２〜１００個の糖モノマーを含む分子をいい、該オリゴ糖中の該糖モノマーは同じでも異なってもよい。
一実施態様ではＸは糖残基である。
別の実施態様ではＸはオリゴ糖である。
更なる実施態様ではＸは（Ｈｅｘ）_ｎ又は（ＧｌｃＮＡｃ）_２−Ｙ又はそれらの混合物より独立に選択され、式中ｎは１〜４０の整数であり、Ｙは糖残基である。
【００１２】
用語（Ｈｅｘ）_ｎはここではｎ個のヘキソースモノマーを含む枝分れ又は直鎖ヘキソースグリコシル残基からなる糖を表わし、ｎは１〜４０より独立に選択され、特定の整数でも１〜４０の範囲内の特定の区間でもよい。一般的なヘキソース残基の非限定的な例はマンノース、グルコース、ガラクトース、フコース、フルクトースなどである。（Ｈｅｘ）_２の非限定的な例はＭａｎ−Ｇｌｕ又はＭａｎ−Ｍａｎ糖残基又はそれらの混合物である。（Ｈｅｘ）_１−４の非限定的な例はＭａｎ、Ｍａｎ−Ｍａｎ及びＭａｎ−Ｇａｌ−Ｍａｎ−Ｇｌｕ糖残基の混合物、又はＧｌｕ、Ｇａｌ−Ｍａｎ−Ｇａｌ及びＭａｎ−Ｇａｌ−Ｍａｎ−Ｇａｌ糖残基の混合物である。
【００１３】
用語Ｍａｎ、Ｇｌｕ、Ｇａｌはここではそれぞれマンノース、グルコース、ガラクトースを表わす。
用語Ｈｅｘはここではヘキソースを表わす。一般的なヘキソースモノマーの非限定的な例はマンノース、グルコース、ガラクトース、フコース、フルクトースなどである。
用語（ＧｌｃＮＡｃ）_２はここでは、線状に共有結合した２つのＮ−アセチルグルコサミン残基を表わす。
用語ＧｌｃＮＡｃはここではＮ−アセチルグルコサミンを表わす。
別の実施態様ではＸは（Ｈｅｘ）_ｎであり、式中ｎは１〜４０たとえば５〜３５、１０〜２５、１２〜２０又は１３〜１７の整数である。
【００１４】
別の実施態様ではＸは（ＧｌｃＮＡｃ）_２−Ｙであり、式中Ｙは独立に選択される糖残基である。
別の実施態様ではＸは（ＧｌｃＮＡｃ）_２−（Ｈｅｘ）_ｎであり、式中ｎは１〜４０たとえば３〜３４、５〜２８、７〜２０又は１０〜１５の整数である。
別の実施態様ではＸは（ＧｌｃＮＡｃ）_２−（Ｈｅｘ）_ｎ［（ＧｌｃＮＡｃ）（Ｈｅｘ）］_ｍであり、式中ｎとｍは１〜４０より、たとえば１〜５、１〜１０、２〜３０、３〜２０、４〜１５又は５〜１０より独立に選択される整数である。
【００１５】
さらに別の実施態様ではＸは（ＧｌｃＮＡｃ）_２−（Ｈｅｘ）_ｎ［（ＧｌｃＮＡｃ）（Ｇａｌ）］_ｍであり、式中ｎとｍは１〜４０より、たとえば１〜５、１〜１０、２〜３０、３〜２０、４〜１５又は５〜１０より独立に選択される整数である。
用語（Ｈｅｘ）_ｎ［（ＧｌｃＮＡｃ）（Ｈｅｘ）］_ｍはここでは、ｍ個の（ＧｌｃＮＡｃ）（Ｈｅｘ）残基に共有結合したｎ個のヘキソースモノマーからなる枝分れ又は直鎖糖残基を表わし、ｎとｍは１〜４０より独立に選択され、特定の整数でも１〜４０の範囲内の特定の区間でもよい。一般的なＨｅｘ残基の非限定的な例はマンノース、グルコース、ガラクトース、フコース、フルクトースなどである。
【００１６】
用語（ＧｌｃＮＡｃ）（Ｈｅｘ）はここでは１つのＨｅｘ分子に共有結合した１のつＧｌｃＮＡｃ分子を表わす。
別の実施態様ではＸは（ＧｌｃＮＡｃ）_２−（Ｈｅｘ）_ｎ［（ＧｌｃＮＡｃ）（Ｈｅｘ）（ＮｅｕＡｃ）］_ｍであり、式中ｎとｍは１〜４０より、たとえば１〜５、１〜１０、２〜３０、３〜２０、４〜１５又は５〜１０より独立に選択される整数である。
別の実施態様ではＸは（ＧｌｃＮＡｃ）_２−（Ｈｅｘ）_ｎ［（ＧｌｃＮＡｃ）（Ｇａｌ）（ＮｅｕＡｃ）］_ｍであり、式中ｎとｍは１〜４０より、たとえば１〜５、１〜１０、２〜３０、３〜２０、４〜１５又は５〜１０より独立に選択される整数である。
【００１７】
用語（Ｈｅｘ）_ｎ［（ＧｌｃＮＡｃ）（Ｈｅｘ）（ＮｅｕＡｃ）］_ｍはここでは、ｍ個の（ＧｌｃＮＡｃ）（Ｈｅｘ）（ＮｅｕＡｃ）残基に共有結合したｎ個のヘキソースモノマーからなる枝分れ又は直鎖糖残基を表わし、ｎとｍは１〜４０より独立に選択され、特定の整数でも１〜４０の範囲内の特定の区間でもよい。一般的なＨｅｘ残基の非限定的な例はマンノース、グルコース、ガラクトース、フコース、フルクトースなどである。
用語（ＧｌｃＮＡｃ）（Ｈｅｘ）（ＮｅｕＡｃ）残基はここでは、１つのＨｅｘ分子に対し、また１つのＮｅｕＡｃ分子に対し、線状に共有結合した１つのＧｌｃＮＡｃ分子を表わす。
用語ＮｅｕＡｃはここではＮ−アセチルノイラミン酸を表わす。
本発明の好ましい実施態様ではＨｅｘはマンノースである。
【００１８】
用語「糖質」はここでは極性ヒドロキシル基（−ＯＨ）を含む炭化水素構造の分子をいう。
さらに別の実施態様では、Ｘは真核宿主細胞中でのＴＦＦ２ペプチドの発現により引き起こされるグリコシル化を特徴とする。
好ましい実施態様では、ＸはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅなどの酵母中でのＴＦＦ２ペプチドの発現により引き起こされるグリコシル化を特徴とする。
別の実施態様では、Ｘはヒト細胞株などの哺乳動物細胞株中でのＴＦＦ２ペプチドの発現により引き起こされるグリコシル化を特徴とする。
別の実施態様では、Ｘは昆虫細胞株中でのＴＦＦ２ペプチドの発現により引き起こされるグリコシル化を特徴とする。
【００１９】
別の実施態様では、Ｘは図７に示す高マンノース型グリコシル化を特徴とする。
別の実施態様では、Ｘは図７に示す複合型グリコシル化を特徴とする。
別の実施態様では、Ｘは図７に示すハイブリッド型グリコシル化を特徴とする。
さらに別の実施態様では、Ｘは図７に示す高マンノース型グリコシル化及び／又は複合型グリコシル化及び／又はハイブリッド型グリコシル化の混合を特徴とする。
本発明は別の態様では、図１に記載の複数のＴＦＦ２ペプチドを製薬上許容しうる担体又は希釈剤と共に含有する製剤組成物に関連する。
【００２０】
本発明は更なる態様では、配列番号：１のアミノ酸配列を有しＣｙｓ６−Ｃｙｓ１０４、Ｃｙｓ８−Ｃｙｓ３５、Ｃｙｓ１９−Ｃｙｓ３４、Ｃｙｓ２９−Ｃｙｓ４６、Ｃｙｓ５８−Ｃｙｓ８４、Ｃｙｓ６８−Ｃｙｓ８３及びＣｙｓ７８−Ｃｙｓ９５の間にジスルフィド結合を含む複数のＴＦＦ２ペプチドであって糖残基及びオリゴ糖より独立に選択されるＸ部分がＡｓｎ１５と共有結合した複数のＴＦＦ２ペプチドを含有する製剤組成物に関連する。
一実施態様では、本発明は哺乳動物の粘液層損傷又は異常を治療するための製剤組成物に関連し、該組成物は図１に記載の複数のＴＦＦ２ペプチド又は製薬上許容しうるその塩を製薬上許容しうる担体又は希釈剤と共に含有する。
【００２１】
用語「治療（する）」はここでは、何らかの症状又は病態の発現を予防することを目的とした、又は既に発現したその種の症状又は病態を治療又は緩和することを目的とした、本発明の治療活性化合物の有効量投与を意味する。従って、用語「治療（する）」は予防的、防御的治療を包含する。症状又は病態の非限定的な例は胃潰瘍又は喘息などの疾患、有害又は酸性化学物質の吸入など外部刺激による損傷に誘発される遺伝性の生体機能障害又は状態などである。
別の実施態様では、本発明は哺乳動物の、好ましくはヒトの胃腸管の粘液層損傷又は異常を治療するための製剤組成物に関連する。
用語「胃腸管」はここでは口腔、食道、胃、小腸・大腸及び結腸を非限定的に含む。
【００２２】
更なる実施態様では、本発明は哺乳動物の、好ましくはヒトの気道の粘液層損傷又は異常を治療するための製剤組成物に関連する。
更なる実施態様では、本発明は哺乳動物の、好ましくはヒトの眼の粘液層損傷又は異常を治療するための製剤組成物に関連する。
更なる実施態様では、本発明は哺乳動物の、好ましくはヒトの泌尿器系の粘液層損傷又は異常を治療するための製剤組成物に関連する。
用語「泌尿器系」はここでは尿道、膀胱、尿管、腎臓及び子宮頚部を非限定的に含む。
【００２３】
更なる実施態様では、本発明は粘液層損傷又は異常を治療するための、かつ経口、経鼻、経皮、経肺又は非経口投与用の製剤組成物に関連する。
本発明は別の態様では、図１に記載の複数のＴＦＦ２ペプチドの製造方法に関連し、該方法はＴＦＦ２ペプチドをコードするＤＮＡ配列で形質転換した好適な宿主細胞を、グリコシル化を許容するような条件下で培養するステップ及び産生されるグリコシル化ＴＦＦ２ペプチドを培養液から回収するステップを含む。
【００２４】
本発明は更なる態様では、配列番号：１のアミノ酸配列を有しＣｙｓ６−Ｃｙｓ１０４、Ｃｙｓ８−Ｃｙｓ３５、Ｃｙｓ１９−Ｃｙｓ３４、Ｃｙｓ２９−Ｃｙｓ４６、Ｃｙｓ５８−Ｃｙｓ８４、Ｃｙｓ６８−Ｃｙｓ８３及びＣｙｓ７８−Ｃｙｓ９５の間にジスルフィド結合を含む複数のＴＦＦ２ペプチドであって糖残基及びオリゴ糖より独立に選択されるＸ部分がＡｓｎ１５と共有結合した複数のＴＦＦ２ペプチドを製造する方法に関連し、該方法はＴＦＦ２ペプチドをコードするＤＮＡ配列で形質転換した真核宿主細胞を、グリコシル化を許容するような条件下で培養するステップ及び産生されるグリコシル化ＴＦＦ２ペプチドを培養液から回収するステップを含む。
【００２５】
本発明はさらに別の実施態様では、図１又は３に記載のアミノ酸配列を有するヒトＴＦＦ２ペプチドをコードするヌクレオチド配列を収めたＤＮＡコンストラクトに関連する。
本発明は更なる態様では、配列番号：１のアミノ酸配列を有するヒトＴＦＦ２ペプチドをコードするヌクレオチド配列を収めたＤＮＡコンストラクトに関連する。
一実施態様では、ＤＮＡコンストラクトは図３に示すようなアミノ酸１〜１０６のアミノ酸配列を有するヒトＴＦＦ２ペプチドをコードするヌクレオチド配列を収める。
更なる実施態様では、図３に示すようなアミノ酸配列を有するヒトＴＦＦ２ペプチドをコードするヌクレオチド配列を収めたＤＮＡコンストラクトは、リーダーペプチドとＬｙｓ−Ａｒｇ切断部位をさらにコードする。
【００２６】
別の実施態様では、図３に示すようなアミノ酸配列を有するヒトＴＦＦ２ペプチドをコードするヌクレオチド配列を収めたＤＮＡコンストラクトは、塩基対２３６〜５５３のｃＤＮＡ配列を含む。
更なる実施態様では、配列番号：１のアミノ酸配列を有するヒトＴＦＦ２ペプチドをコードするヌクレオチド配列を収めたＤＮＡコンストラクトは、配列番号：２のｃＤＮＡ配列を含む。
好ましい実施態様では、図３に示すようなアミノ酸配列を有するヒトＴＦＦ２ペプチドをコードするヌクレオチド配列を収めたＤＮＡコンストラクトは、塩基対１〜５６３の完全ｃＤＮＡ配列を含む。
【００２７】
本発明はさらに別の態様では、宿主細胞を形質転換しうる組換えベクターに関連し、該ベクターは図３に示すようなアミノ酸配列を有するヒトＴＦＦ２ペプチドをコードするヌクレオチド配列、宿主細胞内複製ロモーター、及びベクター入り細胞を識別するための選択マーカーを含む。
本発明は更なる態様では、宿主細胞を形質転換しうる組換えベクターに関連し、該ベクターは配列番号：１のアミノ酸配列を有するヒトＴＦＦ２ペプチドをコードするヌクレオチド配列、宿主細胞内複製プロモーター、及びベクター入り細胞を識別するための選択マーカーを含む。
【００２８】
用語「ベクター」はここでは宿主細胞中で増幅しうる任意の核酸体を意味する。従ってベクターは、自己複製型ベクターすなわち染色体外物質として存在しその複製が染色体複製とは独立しているベクターたとえばプラスミドでもよい。またベクターは宿主細胞に導入されると宿主細胞ゲノム中に取り込まれ、染色体と共に複製されるようなベクターでもよい。ベクターの選択はしばしば導入先の宿主細胞に依存しよう。ベクターの非限定的な例はプラスミドベクター、ファージベクター又はコスミドベクターなどである。
【００２９】
本発明の一実施態様では、組換えベクターは図３に示すようなアミノ酸配列を有するヒトＴＦＦ２ペプチドをコードするヌクレオチド配列を収めていて、酵母好ましくはサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である宿主細胞を形質転換しうる。
本発明の別の実施態様では、組換えベクターは図３に示すようなアミノ酸配列を有するヒトＴＦＦ２ペプチドをコードするヌクレオチド配列を収めていて、細菌である宿主細胞を形質転換しうる。
本発明の別の実施態様では、組換えベクターは図３に示すようなアミノ酸配列を有するヒトＴＦＦ２ペプチドをコードするヌクレオチド配列を収めていて、昆虫細胞である宿主細胞を形質転換しうる。
【００３０】
本発明のさらに別の実施態様では、組換えベクターは図３に示すようなアミノ酸配列を有するヒトＴＦＦ２ペプチドをコードするヌクレオチド配列を収めていて、哺乳動物細胞である宿主細胞を形質転換しうる。
本発明のさらに別の実施態様では、組換えベクターは図３に示すようなアミノ酸配列を有するヒトＴＦＦ２ペプチドをコードするヌクレオチド配列を収めていて、ヒト細胞である宿主細胞を形質転換しうる。
【００３１】
本発明はさらに別の態様では、酵母細胞を形質転換しうる組換えベクターで形質転換した酵母細胞に関連し、該ベクターは図３に示すようなアミノ酸配列を有するヒトＴＦＦ２ペプチドをコードするヌクレオチド配列、酵母細胞内複製プロモーター及びベクター入り酵母細胞を識別するための選択マーカーを含む。
本発明の好ましい実施態様では組換えベクターはＤＮＡプラスミドである。
従って本発明は、口腔、食道、胃、小腸・大腸及び結腸を含む胃腸管；気道；眼；及び膀胱及び子宮頚部を含む泌尿器系などの粘液層の損傷又は異常を治療するための製剤組成物の製造への、図１の一般式Ｉで示される複数のＴＦＦ２ペプチドの使用を提供する。
【００３２】
本発明のＴＦＦ２ペプチドは１つ又は複数の不斉中心をもつ場合があるが、分離された、純粋な又は部分精製された立体異性体もしくはそのラセミ混合物としての立体異性体（光学異性体）もまた発明の範囲内に包摂されるものとする。
図１の一般式Ｉで示される化合物は、製薬面の用途とは別に、粘液層損傷又は異常を伴う哺乳動物の状態を研究するためのｉｎｖｉｔｒｏ手段としても有用であろう。
式Ｉ（図１）のＴＦＦ２ペプチドはまた、口腔、食道、胃、小腸・大腸及び結腸を含む胃腸管；気道；眼；及び膀胱及び子宮頚部を含む泌尿器系などの粘液層の損傷又は異常を伴う哺乳動物の状態を評価するためのｉｎｖｉｔｒｏ手段としても有用であろう。
【００３３】
本発明の複数のＴＦＦ２ペプチドは次の疾患に関連する哺乳動物の粘液層損傷又は異常の治療に有効であることが既に明らかにされている：胃腸障害たとえば胃食道逆流、潰瘍形成、クローン病などの炎症性腸疾患、シェーグレン症候群、がん（胃、膵臓、膨大部、気管支又は扁平上皮細胞などのがん）、バレット化生、裂孔ヘルニア又は放射線療法・細菌等の感染・その他に起因する腸管損傷、気道疾患たとえば喘息、慢性及び急性気管支炎又はのう胞性線維症、眼疾患、及び泌尿器系や子宮頚部の障害。ＴＦＦ２ペプチドによる治療は大きな副作用を伴うことのない損傷部位特異的な治療であり、それは既知の療法に対する強みとなる。
【００３４】
好ましい実施態様では、本発明の複数のＴＦＦ２ペプチドは分子量がおよそ１４０００〜１５０００である。
本発明はまたムチン溶液のレオロジー特性の改善を目的としたグリコシル化Ｋ９９−ＴＦＦ２ペプチドの使用に関連する。本発明者は、グリコシル化Ｋ９９−ＴＦＦ２ペプチドが生理的及び病態生理的状態とも相関する種々のムチン溶液の粘性と弾性を高めることを見出した。
【００３５】
本発明はグリコシル化Ｋ９９−ＴＦＦ２ポリペプチドの生物活性が働く仕組みを開示するが、それはムチン溶液の粘性と弾性に対するグリコシル化Ｋ９９−ＴＦＦ２ペプチドの直接的な効果により裏付けられる。グリコシル化Ｋ９９−ＴＦＦ２ペプチドはムチン溶液の粘性を著しく高める。その最終的な効果は数倍もの粘性増大であり、流動性のムチン溶液がより高粘性のゲル様物質へと変化することからも視覚的に確認することができる。
【００３６】
Ｋ９９−ＴＦＦ２ペプチドは酵母中で発現させると、グリコシル化体と非グリコシル化体の混合物として分泌される。グリコシル化体は非グリコシル化体に比してより高粘性のゲル様物質を生成する。
グリコシル化Ｋ９９−ＴＦＦ２ペプチドは本発明者の発見によれば粘液層の粘性と弾性を高める効果があり、既存粘液層に異常が見られるような種々の適応症の治療に使用しうる。グリコシル化Ｋ９９−ＴＦＦ２ペプチドによる治療は大きな副作用を伴うことのない損傷部位特異的な治療であり、それは既知の療法に対する強みとなる。
【００３７】
グリコシル化Ｋ９９−ＴＦＦ２ペプチドは局所及び管腔適用では粘液層中のムチンの粘性と弾性を高めることができるので、次のような多様な用途への使用が期待される：
１）口腔粘膜の治療に。放射線療法や抗コリン作用薬による治療又はシェーグレン症候群に起因する唾液分泌障害の患者に、グリコシル化Ｋ９９−ＴＦＦ２ペプチドを単独で又は粘液様製剤と共に投与する。
２）風邪又はアレルギー性鼻炎に伴う鼻漏の分泌物粘性向上に。刺激物、ガス、ダスト又はフュームを誤って吸入した後の呼吸器粘膜の保護に。
【００３８】
３）逆流性食道炎、裂孔ヘルニア、バレット食道における、胃酸分泌からの食道遠位部の保護に。
４）外傷、ショック、大手術、腎又は肝疾患もしくはアスピリン又は他ＮＳＡＩＤＳ、ステロイドによる治療や飲酒に起因する胃炎に続発するストレス性胃潰瘍からの胃の保護に。
５）腸分泌物の粘性向上による急性又は持続性下痢の治療に。
６）クローン病及び潰瘍性大腸炎に際しての小腸及び結腸粘膜の保護に。
７）乾性角結膜炎／シェーグレン症候群の、又は他に起因する「ドライアイ」の患者の涙液の粘性向上を目的に点眼剤に。
８）変形性関節炎に際しての、及び関節置換術後の、滑液の粘性向上を目的とした特に膝関節への局所投与に。
【００３９】
グリコシル化Ｋ９９−ＴＦＦ２ペプチドはまた非経口適用に使用してもよい。
非経口用グリコシル化Ｋ９９−ＴＦＦ２ペプチドは胃腸管の幹細胞関連細胞により吸収される。該ペプチドはストレス性損傷からの胃の保護、及び放射線又は化学療法後の損傷からの胃腸の保護、又は潰瘍性大腸炎又はクローン病の急性増悪期の治療に使用することができる。注射グリコシル化Ｋ９９−ＴＦＦ２ペプチドは尿道内皮を覆うムコ多糖層に結合することにより膀胱の防御機構を強化し、もって慢性膀胱感染症、カテーテル装着患者又は間質性膀胱炎における細菌の接着を妨げ、もしくは膀胱乳頭腫又はがんにおける尿中増殖因子の結合を妨げる可能性がある。
【００４０】
従って更なる態様では本発明は哺乳動物の粘液層の粘性を高める製剤組成物に関連し、該組成物は複数のＴＦＦ２ペプチド又はその製薬上許容しうる塩を含有する。
更なる態様では本発明は哺乳動物の粘液層の粘性を高める製剤組成物に関連し、該組成物はグリコシル化Ｋ９９−ＴＦＦ２ペプチド又はその製薬上許容しうる塩を含有する。
更なる態様では本発明は薬剤の製造への、複数のＴＦＦ２ペプチドの使用に関連する。
更なる態様では本発明は薬剤の製造への、グリコシル化Ｋ９９−ＴＦＦ２ペプチドの使用に関連する。
【００４１】
更なる態様では本発明は哺乳動物の粘液層の粘性を高める薬剤の製造への、複数のＴＦＦ２ペプチドの使用に関連する。
更なる態様では本発明は哺乳動物の粘液層の粘性を高める薬剤の製造への、グリコシル化Ｋ９９−ＴＦＦ２ペプチドの使用に関連する。
更なる態様では本発明は被検者の粘液層のｉｎｖｉｖｏ粘性向上方法に関連し、該方法は被検者に次の成分を含有する組成物を投与するステップを含む：
ａ）製薬上許容しうる担体又は希釈剤
ｂ）治療有効量の複数のＴＦＦ２ペプチド、及び随意に
ｃ）ムチン糖タンパク調製品。
【００４２】
更なる態様では本発明は被検者の粘液層のｉｎｖｉｖｏ粘性向上方法に関連し、該方法は被検者に次の成分を含有する組成物を投与するステップを含む：
ａ）製薬上許容しうる担体又は希釈剤
ｂ）治療有効量のグリコシル化Ｋ９９−ＴＦＦ２ペプチド、及び随意に
ｃ）ムチン糖タンパク調製品。
更なる態様では本発明は哺乳動物の粘液層の粘性向上による諸状態の治療への、複数のＴＦＦ２ペプチドの使用に関連する。
本発明の一実施態様では哺乳動物は人間である。
別の態様では本発明は哺乳動物の粘液層の粘性向上による諸状態の治療への、グリコシル化Ｋ９９−ＴＦＦ２ペプチドの使用に関連する。
【００４３】
本発明の一実施態様では哺乳動物は人間である。
別の実施態様では本発明は局所適用製剤組成物に関連する。
更なる実施態様では本発明は管腔適用製剤組成物に関連する。
更なる実施態様では本発明は非経口用製剤組成物に関連する。
更なる実施態様では本発明は経口用製剤組成物に関連する。
更なる実施態様では本発明はムチン糖タンパク調製品をさらに含有する製剤組成物に関連する。
更なる実施態様では本発明は口腔粘膜治療用の製剤組成物に関連する。
【００４４】
更なる実施態様では本発明は低唾液分泌患者治療用の製剤組成物に関連する。一実施態様では、該低唾液分泌は放射線療法、抗コリン作用薬による治療又はシェーグレン症候群に起因する。
更なる実施態様では本発明は放射線療法を受けている患者治療用の製剤組成物に関連する。
更なる実施態様では本発明は抗コリン作用薬による治療を受けた患者治療用の製剤組成物に関連する。
更なる実施態様では本発明はシェーグレン症候群患者治療用の製剤組成物に関連する。
【００４５】
更なる実施態様では本発明は気道治療用製剤組成物に関連する。
更なる実施態様では本発明は風邪又はアレルギー性鼻炎に伴う鼻漏の分泌物の粘性を高めるための製剤組成物に関連する。
更なる実施態様では本発明は風邪患者治療用の製剤組成物に関連する。
更なる実施態様では本発明はアレルギー性鼻炎患者治療用の製剤組成物に関連する。
更なる実施態様では本発明は呼吸器治療用の製剤組成物に関連する。
更なる実施態様では本発明は刺激物を誤って吸入した後の呼吸器を治療するための製剤組成物に関連する。
【００４６】
更なる実施態様では本発明はガス、ダスト又はフュームを誤って吸入した後の呼吸器を治療するための製剤組成物に関連する。
更なる実施態様では本発明は食道治療用の製剤組成物に関連する。一実施態様では本発明は食道遠位部治療用の製剤組成物に関連する。
更なる実施態様では本発明は胃酸からの保護を目的とした製剤組成物に関連する。
更なる実施態様では本発明は逆流性食道炎に際して胃酸からの保護を目的とした製剤組成物に関連する。
更なる実施態様では本発明は裂孔ヘルニアに際して胃酸からの保護を目的とした製剤組成物に関連する。
【００４７】
更なる実施態様では本発明はバレット食道に際して胃酸からの保護を目的とした製剤組成物に関連する。
更なる実施態様では本発明は胃治療用製剤組成物に関連する。
更なる実施態様では本発明はストレス性胃潰瘍治療用の製剤組成物に関連する。一実施態様ではストレス性胃潰瘍は外傷に伴う続発性である。別の実施態様ではストレス性胃潰瘍はショックに伴う続発性である。更なる実施態様ではストレス性胃潰瘍は大手術に伴う続発性である。更なる実施態様ではストレス性胃潰瘍は腎疾患に伴う続発性である。更なる実施態様ではストレス性胃潰瘍は肝疾患に伴う続発性である。更なる実施態様ではストレス性胃潰瘍はアスピリン、他の非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤＳ）、ステロイド薬による治療又は飲酒に伴う続発性である。
【００４８】
更なる実施態様では本発明は鼻漏治療用製剤組成物に関連する。
更なる実施態様では本発明は小腸粘膜治療用の製剤組成物に関連する。
更なる実施態様では本発明は結腸粘膜治療用の製剤組成物に関連する。
更なる実施態様では本発明はクローン病治療用の製剤組成物に関連する。
更なる実施態様では本発明は潰瘍性大腸炎治療用の製剤組成物に関連する。
更なる実施態様では本発明は眼治療用の製剤組成物に関連する。
更なる実施態様では本発明は涙液の粘性向上用の製剤組成物に関連する。
更なる実施態様では本発明は乾性角結膜炎患者の涙液の粘性向上用の製剤組成物に関連する。
【００４９】
更なる実施態様では本発明はシェーグレン症候群患者の涙液の粘性向上用の製剤組成物に関連する。
更なる実施態様では本発明はドライアイ患者の涙液の粘性向上用の製剤組成物に関連する。
用語「ドライアイ」はここでは眼の乾きを伴う任意の症状を意味する。
更なる実施態様では本発明は点眼剤用製剤組成物に関連する。
更なる実施態様では本発明は関節治療用製剤組成物に関連する。
更なる実施態様では本発明は膝関節治療用の製剤組成物に関連する。
更なる実施態様では本発明は滑液の粘性向上用の製剤組成物に関連する。
【００５０】
更なる実施態様では本発明は変形性関節炎に際しての滑液の粘性向上用の製剤組成物に関連する。
更なる実施態様では本発明は関節置換術後の滑液の粘性向上用の製剤組成物に関連する。
更なる実施態様では本発明は膀胱治療用製剤組成物に関連する。
更なる実施態様では本発明はカテーテル装着患者治療用の製剤組成物に関連する。
【００５１】
更なる実施態様では本発明は感染症治療用の製剤組成物に関連する。一実施態様では感染症は慢性膀胱感染症である。
更なる実施態様では本発明は間質性膀胱炎治療用の製剤組成物に関連する。
更なる実施態様では本発明は乳頭腫治療用の製剤組成物に関連する。
更なる実施態様では本発明はがん治療用製剤組成物に関連する。
【００５２】
本発明はまた前記化合物の製造方法に関連する。複数のＴＦＦ２ペプチドは組換えＤＮＡ手法により生産するのが好ましい。そのためのＴＦＦ２ペプチドをコードするＤＮＡ配列は、ゲノム又はｃＤＮＡライブラリーを作製し、該ペプチドの全部又は一部をコードするＤＮＡ配列を合成オリゴヌクレオチドプローブ使用のハイブリダイゼーションにより、標準手法に基づいてスクリーニングしてもよい（Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮｅｗＹｏｒｋ，１９８９を参照）。この目的のためには、該ペプチドをコードするＤＮＡ配列はヒト由来、すなわちヒト・ゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡライブラリー由来とするのが好ましい。
【００５３】
ＴＦＦ２ペプチドをコードするＤＮＡ配列は化学合成してもよい。それには確立された標準方法たとえばＢｅａｕｃａｇｅａｎｄＣａｒｕｔｈｅｒｓ，ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔｅｒｓ２２（１９８１），１８５９−１８６９に記載のホスホアミダイト法又はＭａｔｔｈｅｓｅｔａｌ．，ＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ３（１９８４），８０１−８０５に記載の方法を使用する。ホスホアミダイト法ではオリゴヌクレオチドをたとえばＤＮＡ自動合成機で合成し、精製、アニーリング、ライゲーションを経て好適なベクター中にクローニングする。
ＤＮＡ配列は特定のプライマーを使用してＰＣＲ法により、たとえば米国特許第４，６８３，２０２号、Ｓａｉｋｉｅｔａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ２３９（１９８８），４８７−４９１又は前掲Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．に記載の要領で調製してもよい。
【００５４】
ＴＦＦ２ペプチドをコードするＤＮＡ配列は通常、組換えベクターに挿入するが、組換えベクターは組換えＤＮＡ手法の適用に好都合な任意のベクターでよい。ベクターの選択はしばしばその導入先となる宿主細胞次第であろう。従って、ベクターは自己複製型ベクターすなわち染色体外物質として存在し、その複製が染色体の複製から独立しているベクターたとえばプラスミドでもよい。またベクターは宿主細胞に導入されると宿主細胞ゲノム中に取り込まれ、染色体と共に複製されるようなベクターでもよい。
【００５５】
ベクターは、ＴＦＦ２ペプチドをコードするＤＮＡ配列が該ＤＮＡの転写に必要な追加セグメントと作動可能に連結された発現ベクターであるのが好ましい。一般に発現ベクターはプラスミド又はウイルスＤＮＡに由来するか又は両方のエレメントを含んでもよい。用語「作動可能に連結された」は、諸セグメントがそれらの所期の目的のために連携して機能するように、たとえば転写がプロモーター領域で開始され、ペプチドをコードするＤＮＡ配列に沿って進行するように配置されていることを指す。
【００５６】
プロモーターは選択した宿主細胞中で転写活性を示すような任意のＤＮＡ配列でよいし、また宿主細胞に対し同種又は異種のタンパク質をコードする遺伝子に由来してもよい。
ＴＦＦ２ペプチドをコードするＤＮＡの哺乳動物細胞中での転写を調節する好適なプロモーターの例はＳＶ４０プロモーター［Ｓｕｂｒａｍａｎｉｅｔａｌ．，Ｍｏｌ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．１（１９８１），８５４−８６４］、ＭＴ−１（メタロチオネイン遺伝子）プロモーター［Ｐａｌｍｉｔｅｒｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２２２（１９８３），８０９−８１４］又はアデノウイルス２主要後期プロモーターなどである。
【００５７】
昆虫細胞への使用に好適なプロモーターの例はポリヘドリンプロモーター［米国特許第４，７４５，０５１号；Ｖａｓｕｖｅｄａｎｅｔａｌ．，ＦＥＢＳＬｅｔｔ．３１１（１９９２），７−１１］、Ｐ１０プロモーター（Ｊ．Ｍ．Ｖｌａｋｅｔａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ６９，１９８８，ｐｐ．７６５−７７６）、オートグラファ・カリホルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）多角体病ウイルス塩基性タンパク質プロモーター（ＥＰ３９７４８５）、バキュロウイルス前初期遺伝子１プロモーター（米国特許第５，１５５，０３７号、及び５，１６２，２２２号）、又はバキュロウイルス３９Ｋ後初期遺伝子プロモーター（米国特許第５，１５５，０３７号、及び５，１６２，２２２号）などである。
【００５８】
酵母宿主細胞への使用に好適なプロモーターの例は酵母解糖遺伝子プロモーター［Ｈｉｔｚｅｍａｎｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５（１９８０），１２０７３−１２０８０；ＡｌｂｅｒａｎｄＫａｗａｓａｋｉ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎ．１（１９８２），４１９−４３４］又はアルコール脱水素酵素遺伝子プロモーター［Ｙｏｕｎｇｅｔａｌ．，ＧｅｎｅｔｉｃＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｏｆＭｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓｆｏｒＣｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｈｏｌｌａｅｎｄｅｒｅｔａｌ．ｅｄｓ．），ＰｌｅｎｕｍＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，１９８２所収］又はＴＰＩ１プロモーター（米国特許第４，５９９，３１１）又はＡＤＨ２−４ｃプロモーター［Ｒｕｓｓｅｌｌｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３０４（１９８３），６５２−６５４］などである。
【００５９】
糸状菌宿主細胞への使用に好適なプロモーターの例はＡＤＨ３プロモーター［ＭｃＫｎｉｇｈｔｅｔａｌ．，ＴｈｅＥＭＢＯＪ．４（１９８５），２０９３−２０９９］又はｔｐｉＡプロモーターである。他の有用プロモーターの例はアスペルギルス・オリゼー（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡアミラーゼ、リゾムコール・ミーヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒｍｉｅｈｅｉ）アスパラギン酸プロテアーゼ、アスペルギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）中性αアミラーゼ、アスペルギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）酸性安定αアミラーゼ、アスペルギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）又はアスペルギルス・アワモリ（Ａ．ａｗａｍｏｒｉ）グルコアミラーゼ（ｇｌｕＡ）、リゾムコール・ミーヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒｍｉｅｈｅｉ）リパーゼ、アスペルギルス・オリゼー（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）アルカリ性ホスファターゼ、アスペルギルス・オリゼー（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）トリオースリン酸イソメラーゼ又はアスペルギルス・ニドランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）アセトアミダーゼをコードする遺伝子に由来するプロモーターである。好ましいのはＴＡＫＡアミラーゼとｇｌｕＡのプロモーターである。好適なプロモーターはたとえばＥＰ２８３０２３及びＥＰ３８３７７９に記載されている。
【００６０】
ＴＦＦ２ペプチドをコードするＤＮＡ配列は、もし必要ならば、好適なターミネーターたとえばヒト成長ホルモンターミネーター（Ｐａｌｍｉｔｅｒｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２２２，１９８３，ｐｐ．８０９−８１４）又はＴＰＩ１ターミネーター（ＡｌｂｅｒａｎｄＫａｗａｓａｋｉ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎ．１（１９８２），４１９−４３４）又はＡＤＨ３ターミネーター（ＭｃＫｎｉｇｈｔｅｔａｌ．，ＴｈｅＥＭＢＯＪ．４，１９８５，２０９３−２０９９）に作動可能に連結してもよい。組換えベクターはさらにポリアデニル化シグナル（たとえばＳＶ４０又はアデノウイルス５Ｅｌｂ領域）、転写エンハンサー配列（たとえばＳＶ４０エンハンサー）及び翻訳エンハンサー配列（たとえばアデノウイルスＶＡＲＮＡをコードするもの）を含んでもよい。
【００６１】
組換えベクターはさらに、該ベクターを問題の宿主細胞中で複製可能にするＤＮＡ配列を含んでもよい。そうした配列の（宿主細胞が哺乳動物細胞である場合の）例はＳＶ４０複製起点である。
宿主細胞が酵母細胞である場合には、ベクターを複製可能にする好適な配列は酵母プラスミド２μ複製遺伝子ＲＥＰ１−３及び複製起点である。
【００６２】
ベクターはまた選択マーカーを含んでもよい。その例はジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）をコードする遺伝子又は（Ｐ．Ｒ．Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｇｅｎｅ４０，１９８５，ｐｐ．１２５−１３０に記載の）シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｐｏｍｂｅ）ＴＰＩ遺伝子など宿主細胞中の欠陥を補うような産物に対応する遺伝子、もしくは薬物（アンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、ネオマイシン、ハイグロマイシン又はメトトレキサートなど）耐性を付与する遺伝子などである。糸状菌の場合、選択マーカーの例はａｍｄＳ、ｐｙｒＧ、ａｒｇＢ、ｎｉａＤ又はｓＣである。
【００６３】
本発明のＴＦＦ２ペプチドを宿主細胞の分泌経路中に導くために、分泌シグナル配列（リーダー配列、プレプロ配列又はプレ配列ともいう）を組換えベクターに導入してもよい。分泌シグナル配列はＴＦＦ２ペプチドをコードするＤＮＡ配列と正しい読み枠内で結合する。分泌シグナル配列は通常、該ペプチドをコードするＤＮＡ配列の５’位に配置する。分泌シグナル配列は、本来該ペプチドに関連するものでも、別の分泌タンパク質をコードする遺伝子に由来するものでもよい。
【００６４】
酵母細胞からの分泌の場合、分泌シグナル配列は発現ＴＦＦ２ペプチドを該細胞の分泌経路へと確実に効率的に導くような任意のシグナルペプチドをコードしよう。該シグナルペプチドは天然体又はその機能的部分でも、合成体でもよい。好適なシグナルペプチドはα因子シグナルペプチド（米国特許第４，８７０，００８号を参照）、マウス唾液アミラーゼ（Ｏ．Ｈａｇｅｎｂｕｃｈｌｅｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ２８９，１９８１，ｐｐ．６４３−６４６を参照）、修飾カルボキシペプチダーゼ・シグナルペプチド（Ｌ．Ａ．Ｖａｌｌｓｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ４８，１９８７，ｐｐ．８８７−８９７を参照）、酵母ＢＡＲ１シグナルペプチド（ＷＯ８７／０２６７０を参照）又は酵母アスパラギン酸プロテアーゼ３（ＹＡＰ３）シグナルペプチド（Ｍ．Ｅｇｅｌ−Ｍｉｔａｎｉｅｔａｌ．，Ｙｅａｓｔ６，１９９０，ｐｐ．１２７−１３７を参照）であると判明している。
【００６５】
酵母中での効率的な分泌のためには、リーダーペプチドをコードする配列をシグナル配列の下流でかつＴＦＦ２ペプチドをコードするＤＮＡ配列の上流に挿入してもよい。該リーダーペプチドの役割は発現ペプチドが小胞体からゴルジ装置へ、さらには分泌小胞へと導かれ、培地中に分泌される（すなわちＴＦＦ２ペプチドが酵母細胞外へと、又は少なくとも細胞膜を通過して周辺腔へと輸送される）ようにすることである。リーダーペプチドは酵母α因子リーダーペプチドでもよい（その使用は米国特許第４，５４６，０８２号、４，８７０，００６号、ＥＰ１６２０１、ＥＰ１２３２９４、ＥＰ１２３５４４及びＥＰ１６３５２９などで開示されている）。また、リーダーペプチドは合成リーダーペプチドすなわち非天然型リーダーペプチドでもよい。合成リーダーペプチドはたとえばＷＯ８９／０２４６３又はＷＯ９２／１１３７８に記載の要領で合成してもよい。
【００６６】
糸状菌用のシグナルペプチドはアスペルギルス・スペーシス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｓｐｐ．）アミラーゼ又はグルコアミラーゼをコードする遺伝子、リゾムコール・ミーヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒｍｉｅｈｅｉ）リパーゼ又はプロテアーゼもしくはフミコーラ・ラヌギノサ（Ｈｕｍｉｃｏｌａｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）リパーゼをコードする遺伝子に由来するのが好都合であろう。シグナルペプチドはアスペルギルス・オリゼー（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡアミラーゼ、アスペルギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）中性αアミラーゼ、アスペルギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）酸性安定αアミラーゼ又はアスペルギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）グルコアミラーゼをコードする遺伝子に由来するのが好ましい。好適なシグナルペプチドはたとえばＥＰ２３８０２３及びＥＰ２１５５９４で開示されている。
昆虫細胞用のシグナルペプチドは昆虫遺伝子に由来するのが好都合であろう（ＷＯ９０／０５７８３を参照）。たとえば鱗翅目昆虫Ｍａｎｄｕｃａｓｅｘｔａの脂質動員ホルモン前駆体シグナルペプチド（米国特許第５，０２３，３２８号を参照）などである。
【００６７】
ＴＦＦ２ペプチドをコードするＤＮＡ配列、プロモーター、及び随意にターミネーター及び／又は分泌シグナル配列をそれぞれライゲートし、それらを、複製に必要な情報を収めた好適なベクター中に挿入するための手順は技術上周知である（たとえばＳａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮｅｗＹｏｒｋ，１９８９を参照）。
ＴＦＦ２ペプチドをコードするＤＮＡ配列の導入先となる宿主細胞は酵母、真菌及びより高等な真核細胞など、翻訳後修飾ＴＦＦ２ペプチドを産生しうるような任意の細胞でよい。
【００６８】
好適な哺乳動物細胞株の例はＣＯＳ（ＡＴＣＣＣＲＬ１６５０）、ＢＨＫ（ＡＴＣＣＣＲＬ１６３２，ＡＴＣＣＣＣＬ１０）、ＣＨＬ（ＡＴＣＣＣＣＬ３９）又はＣＨＯ（ＡＴＣＣＣＣＬ６１）細胞株などである。哺乳動物細胞にＤＮＡ配列を導入し発現させる方法はたとえばＫａｕｆｍａｎａｎｄＳｈａｒｐ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５９（１９８２），６０１−６２１；ＳｏｕｔｈｅｒｎａｎｄＢｅｒｇ，Ｌ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１（１９８２），３２７−３４１；Ｌｏｙｔｅｒｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７９（１９８２），４２２−４２６；Ｗｉｇｌｅｒｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ１４（１９７８），７２５；ＣｏｒｓａｒｏａｎｄＰｅａｒｓｏｎ，ＳｏｍａｔｉｃＣｅｌｌＧｅｎｅｔｉｃｓ７（１９８１），６０３；ＧｒａｈａｍａｎｄｖａｎｄｅｒＥｂ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ５２（１９７３），４５６；及びＮｅｕｍａｎｎｅｔａｌ．，ＥＭＢＯＪ．１（１９８２），８４１−８４５に記載されている。
【００６９】
好適な酵母細胞の例はサッカロミセス・スペーシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｓｐｐ．）又はシゾサッカロミセス・スペーシス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｓｐｐ．）の細胞、特にサッカロミセス・セレビシエー（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）又はサッカロミセス・クルイベリ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｋｌｕｙｖｅｒｉ）の細胞株である。酵母細胞を異種ＤＮＡで形質転換し異種ポリペプチドを産生させる方法はたとえば米国特許第４，５９９，３１１号、４，９３１，３７３号、４，８７０，００８号、５，０３７，７４３号及び４，８４５，０７５号で開示されており、それらの文献はすべて参照指示により本書に組み込まれる。形質転換細胞は選択マーカーにより決定される表現型に従って、一般には薬剤耐性又は特定栄養素たとえばロイシンの不在下での増殖能に従って選別する。
【００７０】
好ましい酵母用ベクターは米国特許第４，９３１，３７３号で開示されているＰＯＴ１ベクターである。ＴＦＦ２ペプチドをコードするＤＮＡ配列の前にシグナル配列及び随意にリーダー配列たとえば前述のような配列を置いてもよい。好適な酵母細胞の更なる例はクルイベロミセス・スペーシス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓｓｐｐ．）たとえばクルイベロミセス・ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）、ハンゼヌラ・スペーシス（Ｈａｎｓｅｎｕｌａｓｐｐ．）たとえばハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）又はピキア・スペーシス（Ｐｉｃｈｉａｓｐｐ．）たとえばピキア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）の細胞株である（Ｇｌｅｅｓｏｎｅｔａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３２，１９８６，ｐｐ．３４５９−３４６５；米国特許第４，８８２，２７９号を参照）。
【００７１】
他の真菌細胞の例は糸状菌たとえばアスペルギルス・スペーシス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｓｐｐ．）、ニューロスポラ・スペーシス（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａｓｐｐ．）、フサリウム・スペーシス（Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｐｐ．）又はトリコデルマ・スペーシス（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｓｐｐ．）の細胞、特にアスペルギルス・オリゼー（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス・ニドランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）又はアスペルギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）の細胞株である。タンパク質発現へのアスペルギルス・スペーシス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｓｐｐ．）の使用はたとえばＥＰ２７２２７７、ＥＰ２３８０２３、ＥＰ１８４４３８などで開示されている。フサリウム・オキシスポルム（Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）の形質転換はたとえばＭａｌａｒｄｉｅｒｅｔａｌ．，Ｇｅｎｅ７８，１９８９，１４７−１５６に記載の要領で行ってもよい。トリコデルマ・スペーシス（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｓｐｐ．）の形質転換はたとえばＥＰ２４４２３４に記載の要領で行ってもよい。
【００７２】
糸状菌を宿主細胞として使用するときは、本発明のＤＮＡコンストラクトにより、好都合には該ＤＮＡコンストラクトを宿主染色体に組み込み組換え宿主細胞とすることで、形質転換してもよい。この組込みは、該ＤＮＡ配列のほうが細胞中で安定的に維持される可能性が高いので、一般に有利と考えられる。宿主染色体へのＤＮＡコンストラクトの組込みは常法により、たとえば相同的又は非相同的組換えにより行ってよい。
【００７３】
昆虫細胞の形質転換とそこでの異種ポリペプチドの産生は、いずれも参照指示により本書に組み込まれる米国特許第４，７４５，０５１号、４，８７９，２３６号、５，１５５，０３７号、５，１６２，２２２号、ＥＰ３９７４８５に記載の要領で行ってもよい。宿主用の昆虫細胞株はレピドプテラ（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ）細胞株たとえばスポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞又はトリコプルシア・ニー（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａｎｉ）細胞が好適であろう（米国特許第５，０７７，２１４号を参照）。培養条件はたとえばＷＯ８９／０１０２９又はＷＯ８９／０１０２８、もしくは前記文献中の任意の文献に相応に開示されていよう。
【００７４】
次に、前述の形質転換又はトランスフェクト宿主細胞を好適な栄養培地中で、複数のＴＦＦ２ペプチドの発現を許容するような条件下で培養した後、産生されるペプチドの全部又は一部を回収する。使用培地は宿主細胞の培養に適した任意通常の培地たとえばサプリメントを適宜添加した最少培地又は天然培地でよい。好適な培地は市販されているが、（ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎのカタログ等で）公開されている配合表に従って調製してもよい。次いで、細胞で産生されたＴＦＦ２ペプチドを培地から回収するには、遠心又はろ過による宿主細胞と培地の分離、上清又はろ液のタンパク質性成分の塩たとえば硫酸アンモニウムによる沈殿、対象ポリペプチドのタイプに応じた多様なクロマトグラフィー（イオン交換、ゲルろ過、アフィニティーなど）による精製といった通常の手順を用いてよい。
【００７５】
本発明の製剤組成物は複数のＴＦＦ２ペプチドから、任意慣用の製剤組成物調製方法たとえばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅ，１９８５に記載の方法により調製してもよい。組成物は全身注射又は輸液に適した剤型でもよく、その場合には滅菌水又は生理食塩水又はグルコース溶液を用いて調製してもよい。組成物は周知慣用の滅菌手法で滅菌してもよい。得られる水性溶液はパッケージしそのまま使用してもよいし、無菌条件下でろ過し凍結乾燥しておき、用時に滅菌水性溶液と混ぜて投与してもよい。組成物は製薬上許容しうる補助物質、たとえば生理的条件に近似させるうえで必要となる緩衝剤、等張化剤等（酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウムなど）を含んでもよい。
【００７６】
本発明の製剤組成物は経鼻、経皮又は経腸投与用に調製してもよい。組成物に使用する製薬上許容しうる担体又は希釈剤は任意慣用の担体でよい。固体担体の例は乳糖、白土、ショ糖、タルク、ゼラチン、寒天、ペクチン、アカシア、ステアリン酸マグネシウム及びステアリン酸などである。また、担体又は希釈剤は任意周知の徐放性材料たとえばモノステアリン酸グリセリン又はジステアリン酸グリセリンを単独で、又はワックスとの混合で含んでもよい。固体担体の含量は変動幅が大きいであろうが、通常は約２５ｍｇ〜約１ｇである。
【００７７】
組成物中のＴＦＦ２ペプチド濃度は大幅に、すなわち約５重量％〜約１００重量％の範囲で変動してもよい。好ましい濃度範囲は５０〜１００重量％である。組成物の単位量投与形態中の該ペプチド含量は一般に約１ｍｇ〜約２００ｍｇ、好ましくは約２５ｍｇ〜約７５ｍｇ、特に約５０ｍｇである。
【００７８】
前述のように、本発明のグリコシル化した複数のＴＦＦ２ペプチドは該ペプチドの活性体と考えられるので、哺乳類の粘液層損傷又は異常を伴う状態の予防又は治療に使用するのが有利であると見込まれる。特に胃腸障害たとえば胃食道逆流、潰瘍形成、クローン病などを含む炎症性腸疾患、シェーグレン症候群、がん（胃、膵臓、膨大部、気管支又は扁平上皮細胞などのがん）、バレット化生、裂孔ヘルニア又は放射線療法・細菌等の感染・その他に起因する腸管損傷、気道疾患たとえば喘息、慢性及び急性気管支炎又はのう胞性線維症、眼疾患、及び泌尿器系や子宮頚部の障害などの治療への使用が見込まれる。該ポリペプチドの患者への投与量は治療対象となる状態の種類や重篤度により大きく異なろうが、一般的には０．１〜１．０ｍｇ／ｋｇ−体重である。
添付図面を参照しながら本発明をさらに詳しく説明する。
【００７９】
以下、実施例により本発明をさらに説明するが、以下の実施例は保護範囲を限定するものではない。以上の説明と以下の実施例で開示している特徴は別個でも任意の組み合わせでも、多様な形態で本発明を実現するための資料となろう。
実施例
実施例１．Ｋ９９−ＴＦＦ２用酵母発現系の構築
成熟タンパク質の位置９９にＡｓｎを付けた突然変異ｈＳＰ（ｈＳＰ−Ａｓｎ_９９）を発現するサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）発現系は既に開示されている（ＴｈｉｍＬ．，１９９３，ＦＥＢＳＬｅｔｔｅｒｓ，３１８：３４５−３５２）。
【００８０】
図２は酵母プラスミドｐＫＦＮ−１８４７（Ｔｈｉｍｅｔａｌ．，１９９３，ＦＥＢＳＬｅｔｔｅｒｓ，３１８：３４５−３５２）を示す。該プラスミドでは、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＴＰＩ１遺伝子の転写プロモーター（ＳａｌＩ−ＥｃｏＲＩフラグメント上に位置する）と転写ターミネーターの間に、ＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩフラグメントを含む発現カセットが挿入されている。
プラスミドｐＫＦＮ−１８４７のＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩフラグメントはリーダー配列、二塩基性プロセシングエンドペプチダーゼＫＥＸ２に対応するＬｙｓ−Ａｒｇ切断部位、及び突然変異ｈＳＰ−Ａｓｎ_９９からなる融合タンパク質をコードする。Ｋ９９−ＴＦＦ２をコードするプラスミドを構築するために、標準分子生物学手法（Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，１９８９など）を用いて以下のステップを実行した。
【００８１】
ＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩＤＮＡフラグメントを収めリーダー−ｈＳＰ融合タンパク質をコードする６８８ｂｐＤＮＡフラグメントをプラスミドｐＫＦＮ−１８４７からＰＣＲ法で、オリゴヌクレオチドＥＡ−ＥＣＯ：（５’−ＣＴＡＴＴＴＴＣＣＣＴＴＣＴＴＡＣＧ−３’，配列番号：３）及びＥ１４７：（５’−ＴＡＡＴＣＴＴＡＧＴＴＴＣＴＡＧＡＣＴＴＡＧＴＡＡＴＧＧＣＡＧＴＣＴＣＴＣＡＣＡＧＡＣＴＴＣＧＧＧＡＡＧＡＡＧＣ−３’，配列番号：４）を用いて増幅した。ＥＡ−ＥＣＯは、ＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩＤＮＡフラグメントを収めた発現カセットのＥｃｏＲＩ部位から１１４ｂｐ上流に位置する配列に対応する。Ｅ１４７はｈＳＰ−Ａｓｎ_９９をコードするＤＮＡ配列に単一ヌクレオチド変異を導入してｈＳＰ−Ａｓｎ_９９のＡｓｎ_９９をＬｙｓ_９９に変化させることを目的に設計した。従ってｈＳＰ−Ｌｙｓ_９９（以下、Ｋ９９−ＴＦＦ２と称する）をコードするＤＮＡ配列はＥｃｏＲＩとＸｂａＩで消化後にＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩＤＮＡフラグメントとしてクローニングすることができる。
【００８２】
リーダー−Ｋ９９−ＴＦＦ２融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列を収めたＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩＰＣＲフラグメントを、ｐＭＴ７４２（Ｅｇｅｌ−Ｍｉｔａｎｉｅｔａｌ．，Ｇｅｎｅ，１９８３，７３：１１３−１２０）のＡｐａＩ−ＥｃｏＲＩＤＮＡフラグメント（サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来のＴＰＩ１プロモーターとＡｐａＩ−ＸｂａＩベクターフラグメントとを収める）にライゲートし、プラスミドｐＥＡ３１４を得た。プラスミドｐＭＴ７１４はｐＫＦＮ−１８４７と類似した構造をもち、その制限部位は図２に示すとおりである。
【００８３】
該発現プラスミドを、アンピシリンの存在下に増殖させたＥ．ｃｏｌｉ中で複製し、標準手法（Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．，１９８９）により単離した。プラスミドＤＮＡは挿入用として然るべき制限酵素（ＥｃｏＲＩ、ＮｃｏＩ、ＡｐａＩ、ＸｂａＩなど）によりチェックし、またＫ９９−ＴＦＦ２をコードする適正なＤＮＡ配列を含むことが配列解析により示された。
プラスミドｐＥＡ３１４をサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株ＭＴ６６３に導入した。プラスミドｐＥＡ３１４を収めた形質転換酵母を、ＹＰＤ（１％酵母抽出物、２％ペプトン、２％グルコース）寒天（２％）プレート上で炭素源としてのグルコース利用によるスクリーニングにかけ、１つの形質転換体ｙＷＡ３１４を発酵用に選別した。
【００８４】
酵母株ｙＥＡ３１４をＹＰＤ培地中、３０℃で７２時間培養し（Ｇｕｔｈｒｉｅ，Ｃ＆Ｆｉｎｋ，Ｇ．Ｒ．，Ｅｄｓ．，ＧｕｉｄｅｔｏＹｅａｓｔＧｅｎｅｔｉｃｓａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ＡｃａｄｅｍｉａＰｒｅｓｓ，１９９１）、最終ＯＤ_６００を約１５〜２０とした。遠心により細胞ペレットを捨て、上清をＫ９９−ＴＦＦ２の更なる解析に使用した。
なお形質転換用宿主のサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株ＭＴ６６３（ＭＡＴａｌ／ＭＡＴα ｐｅｐ４−３／ｐｅｐ４−３ＨＩＳ４／ｈｉｓ４ｔｐｉ：：ＬＥＵ２／ｔｐｉ：：ＬＥＵ２Ｃｉｒ^＋）はＷＯ９２／１１３７８出願との関連でＤｅｕｔｓｃｈｅＳａｍｍｌｕｎｇｖｏｎＭｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎｕｎｄＺｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ（ドイツ微生物・培養細胞保存機構）に寄託番号ＤＳＭ６２７８として寄託された。ＭＴ６６３の形質転換はＷＯ９８／０１５３５に開示の要領で行った。
【００８５】
実施例２．Ｋ９９−ＴＦＦ２の精製
Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ（登録商標）ＹＭ−３３０００遠心ろ過装置を用いメーカー（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）説明書の方法に従って、ｙＥＡ３１４由来の酵母発酵上清を２．５ｍｌから０．２５ｍｌに濃縮した。１０％（ｖ／ｖ）アセトニトリルに溶かした０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸により２５℃、送液量１．０ｍｌ／分で平衡化したＶｙｄａｃ２１４ＴＰ５４逆相Ｃ４ＨＰＬＣカラム（０．４６×２５ｃｍ）に、濃縮試料（０．２５ｍｌ）を注入した。１０分間の定組成溶離後に、溶出液のアセトニトリル濃度を２５分間中に６０％（ｖ／ｖ）まで高めた。２１４ｎｍの吸光度を測定した。２７．２５４分と２８．０３８分の溶離ピーク（図４）はそれぞれグリコシル化ヒトＫ９９−ＴＦＦ２及び非グリコシル化ヒトＫ９９−ＴＦＦ２を表わすことが質量分析により判明した。
【００８６】
実施例３．Ｋ９９−ＴＦＦ２の質量分析法による解析
質量分析は窒素レーザー（３３７ｎｍ）を備えたＶｏｙａｇｅｒＲＰＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓＩｎｃ．，Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，ＭＡ）で行った。装置は遅延引き出し機構利用のリニアモードで使用し、またイオン源の加速電圧は２５ｋＶであった。
【００８７】
試料は次の要領で調製した：１μｌの試料溶液を１μｌのマトリックス溶液［アセトニトリル：水：３％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸の５：４：１混合液にアルファ−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸を溶かしたもの］と混ぜ、１μｌを試料プレート上に置き、乾燥させた。校正は２つの内標準（インスリンとチオレドキシン）を用いて行い、質量決定の正確さを０．１％以内とした。
非グリコシル化ヒトＫ９９−ＴＦＦ２の質量分析結果を図５に示す。１１９７６±２というＭＨ^＋値は分子量（ＭＷ）１１９７５±２に対応することが判明した。アミノ酸配列を基にしたヒトＫ９９−ＴＦＦ２の計算分子量は１１９７５．５である。従って、前記の測定分子量はこの計算値と十分一致する。
図６はグリコシル化ヒトＫ９９−ＴＦＦ２の質量分析結果である。
【００８８】
【表１】

【００８９】
ヒトＫ９９−ＴＦＦ２のアミノ酸配列から、該分子中には潜在Ｎ−グリコシル化部位が１つ（Ａｓｎ−１５）しか存在しないことがわかる。酵母で発現したグリコシル化ＴＦＦ２の過去の研究［Ｔｈｉｍｅｔａｌ．（１９９３）ＦＥＢＳＬｅｔｔ．３１８，３４５−３５２）からは、該グリコシル化ペプチドには２つの単糖残基すなわちマンノースとＮ−アセチルグルコサミンしか存在しないことがわかる。従ってＫ９９−ＴＦＦ２には異なるグリコシル化体が存在するものと質量分析データ（前掲の表）から推論しうる。
【００９０】
２種類の糖質側鎖すなわち（ＧｌｃＮＡｃ）_２（Ｈｅｘ）_{１０−１５}と（Ｈｅｘ）_{１３−１７}に対応する分子量は推測可能である。該グリコシル化ペプチドではマンノースが唯一のヘキソースであり、またＡｓｎ−１５が唯一のグリコシル化残基であるため、グリコシル化部位の構造はＡｓｎ−（ＧｌｃＮＡｃ）_２（Ｈｅｘ）_{１０−１５}又はＡｓｎ−（Ｈｅｘ）_{１３−１７}であるとの結論になる。Ａｓｎ−（Ｈｅｘ）_{１３−１７}は質量分析計内での断片化に由来する（２つのＧｌｃＮＡｃ残基がアセチル基を失って２つのヘキソース残基になる）という可能性がある。
グリコシル化ヒトＫ９９−ＴＦＦ２の構造は図１のとおりである。
【００９１】
実施例４．Ｋ９９−ＴＦＦ２／ムチン複合体のレオロジー特性の測定
ムチン溶液とムチン／Ｋ９９−ＴＦＦ２ゲル様物質：Ｋ９９−ＴＦＦ２を添加した種々のムチン溶液を比較する。図８からわかるように、ムチン溶液は単独では非ニュートン流体としてふるまう。その種の流体は次のようなＯｓｔｗａｌｄｄｅＷａｅｌｅモデル（べき乗則）［Ｂａｒｎｅｓ，Ｈ．Ａ．（１９８９）ＡｎＩｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎｔｏＲｈｅｏｌｏｇｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ及びＦｅｒｇｕｓｏｎ，Ｊ．ａｎｄＫｅｍｂｌｏｗｓｋｉ，Ｚ．（１９９１）ＡｐｐｌｉｅｄＦｌｕｉｄＲｈｅｏｌｏｇｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ］によって説明することができる：
【００９２】
δ ＝ｋ（γ）^ｎ
ただしδ ＝剪断応力、γ ＝剪断速度、ｎとｋは溶液に固有の定数である（ｎ＝１ならば、溶液はニュートン流体である）。本例の場合は図８から次の値が求められよう：ｎ＝０．７５、ｋ＝０．３５。
ｎ＜１なので、溶液は非球形粒子分散液又は乳濁液の特性である剪断流動化流体である。しかしｎ値が１に近いので、溶液はニュートン流体に程遠いというわけでもない。やはり図８からわかるように、その粘性は低剪断速度での０．３４Ｐａ・ｓから高剪断速度での０．１２Ｐａ・ｓまで幅がある。
【００９３】
Ｋ９９−ＴＦＦ２はムチンと共に高粘性複合体を形成するという性質がある。そうした複合体のレオロジー特性を回転式Ｒｅｏｌｏｇｉｃａレオメーター（ＲｅｏｌｏｇｉｃａＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓＡＢ，Ｌｕｎｄ，Ｓｗｅｄｅｎ）で測定する。該レオメーターはステンレス鋼Ｃ４０４製コーン＆プレート（４０ｍｍ径プレート、角度４度、ゼロギャップ）を備え、１．１７ｍｌの試料を必要とする。レオロジー試験はすべて２０℃で実施する。レオメーターは装置標準ソフトウェア（Ｖｅｒｓｉｏｎ３．６）を備えていて数種の測定を行うことができるが、２種類の基本的なレオロジー測定を行う。粘性の測定では応力が（従って粘性もまた）剪断速度の関数として求められるＣｏｎｓｔａｎｔＲａｔｅプログラムを用いる。剪断速度の範囲は０〜２０ｓ^−１に設定する。
【００９４】
レオロジー試験の更なる評価では動的振動を採用する。この目的のために、ＯｓｃｉｌｌａｔｉｏｎＳｔｒｅｓｓＳｗｅｅｐプログラムを用いて、測定結果が加えた応力とは無関係である応力範囲すなわち線形粘弾性域（ＬＶＥＲ）を確認する。次いで該Ｏｓｃｉｌｌａｔｉｏｎプログラム用にＬＶＥＲを代表するような適切な応力値を選択し、種々の周波数でレオロジー挙動が測定できるようにする（周波数掃引）。周波数掃引は０．０１〜５Ｈｚの周波数範囲で行う。
【００９５】
ムチンは次の３タイプを使用する。ムチンＩ：粗製ムチン、ブタ胃由来のタイプＩＩ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）；ムチンＩＩ：半精製ムチン、ブタ胃由来のタイプＩＩＩ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）；ムチンＩＩＩ：ウシ下顎腺由来のタイプＩ−Ｓ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）。
【００９６】
粘性変化の視覚評価試験では、１０％（ｗ／ｖ）ムチンＩ溶液をつくり、Ｋ９９−ＴＦＦ２を水に溶かしてから該ムチン溶液に加えた。この試料を混合（ボルテックスミキサーを使用）した後５分間静置し、その粘性をＫ９９−ＴＦＦ２抜きの水を加えた対照ムチン溶液との比較で視覚的に評価した。ムチン溶液に種々のＫ９９−ＴＦＦ２ペプチドを加えたときに観察しうる性状変化を視覚的に評価する（表１）。試験によっては、その効果は驚くほどであった。ムチン溶液にＫ９９−ＴＦＦ２ペプチドを加えると、試験管を逆さまにしても試験管からほとんど垂れ落ちないほど粘稠なゲル様物質が得られた。
レオロジー試験用のムチン／ＴＦＦペプチド混合物はすべてボルテックスミキサーを使用して調製し、２０℃で３０分間平衡させてから粘性を測定する。
【００９７】
性質の異なる数種のムチン製品が市販されているので、どの種類の、どの濃度のムチンが好適なのかをまず明確にする。Ｙ％（ｗ／ｖ）ムチンＩ溶液２ｍｌに定量（７ｍｇ）のＫ９９−ＴＦＦ２ペプチドを加える。このＹは６％、８％、１０％、１２％、１４％（ｗ／ｖ）のいずれかである。６％及び８％ムチン溶液ではムチン／Ｋ９９−ＴＦＦ２ゲル様構造は形成されないが、液状ムチン溶液に囲まれた繊維様沈殿物が形成される。１０％、１２％及び１４％ムチン溶液を使用すると、ムチン／Ｋ９９−ＴＦＦ２ゲル様構造が形成される。従って、更なる試験には１０％のムチン濃度を選択することができる。
【００９８】
ムチン／Ｋ９９−ＴＦＦ２ゲル様構造のレオロジー特性をさらに評価するには、振動レオロジーの手法を用いる。動的振動レオロジーは物質の微妙な粘弾性を測定する非破壊的方法であると考えられる。
ムチン／Ｋ９９−ＴＦＦ２ゲル様構造の特性を解析するために、該物質に正弦振動応力を加え、その応力応答を測定した。当初、振動応力掃引プログラムを利用していわゆる線形粘弾性域を明確にする。この領域内ではムチン／Ｋ９９−ＴＦＦ２ゲル様構造に変化は起こらず、加えた応力と測定量の間の関係は線形である。
【００９９】
粘弾性は周波数の関数としての動的弾性率Ｇ’及びＧ”により記述される。ただし、Ｇ’は貯蔵弾性率であり、Ｇ”は損失弾性率である。貯蔵弾性率（変形サイクルあたりの貯蔵・回復エネルギーの測度）は物質の粘弾性挙動の弾性成分を反映し、損失弾性率（サイクルあたり損失エネルギーの測度）は粘性成分を反映する。さらに、複素粘性率とｔａｎδ（損失正接）も求めた。複素粘性率は動的剪断に対する全抵抗の大きさの測度であり、ｔａｎδはＧ”／Ｇ’であり、ｔａｎδ ＞１は該物質の粘性成分がまさり、ｔａｎδ ＜１は弾性成分がまさることを示す。
【０１００】
ムチン溶液とＫ９９−ＴＦＦ２ゲル様物質の振動レオロジー測定には次の手順を用いる：０．０５％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウムに溶解した１０％（ｗ／ｖ）ムチンＩ溶液２ｍｌに１４ｍｇのＫ９９−ＴＦＦ２を含む水０．４ｍｌを加える。２０℃で３０分間静置後、正弦振動応力を加え、周波数を変えながらその応力応答を検出する。（ＴＦＦ添加及び無添加の）貯蔵弾性率（Ｇ’）と（ＴＦＦ添加及び無添加の）損失弾性率（Ｇ”）を種々の周波数の関数として計算する。
【０１０１】
【表２】

【０１０２】
実施例５．血中半減期の測定
用量０．５〜５ｎｍｏｌ／ｋｇのＫ９９−ＴＦＦ２を２ｍｌの注射液としてブタに皮下注射する。次の時間に採血する：投与前、投与後０分、１５分、３０分、４５分、９０分、１２０分、１８０分、２４０分、３００分、３６０分、４８０分及び１４４０分。
【０１０３】
血液試料は血液ｍｌあたり３５μｌの安定化緩衝液を入れた試験管に回収する。安定化緩衝液はＥＤＴＭ（２Ｎａ）０．１８ＭとＡｐｒｏｔｉｎｉｎ１５０００ＫＩＥ／ｍｌからなる。溶液のｐＨは７．４に調整する。血液試料は氷冷保存し２０分以内に遠心分離する（４℃、４０００ｒｐｍ、１０分）。遠心分離後に血漿を単離しマイナス２０℃で保存し測定に備える。血漿試料をＲＩＡ又はＥＬＩＳＡ法で分析する。比較のためにＫ９９−ＴＦＦ２ペプチドから血漿中濃度−時間曲線を求める。ＷｉｎＮｏｎｌｉｎＰｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌｖｅｒｓｉｏｎ３．１（ＰｈａｒｓｉｇｈｔＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）ノンコンパートメント薬物動態解析プログラムでデータを解析する。以下の薬物動態パラメーターが推定される：
【０１０４】
Ｃ_ｍａｘ最大血漿中濃度
Ｔ_ｍａｘ最大血漿中濃度到達時間
ｔ_１／２血漿中消失半減期
ＡＵＣ_{（０−ｌａｓｔ）} 時間０〜最終実測時の血漿中濃度−時間曲線下面積
ＡＵＣ時間０〜無限時間の外挿法による血漿中濃度−時間曲線下面積。
【０１０５】
実施例６．胃腸管内安定性の測定
用量０．５〜５０ｎｍｏｌ／ｋｇのＫ９９−ＴＦＦ２を５０ｍｌの水に溶解して胃内点滴注入でブタに投与する。次の時間に胃液を採取する：投与前、投与後０分、１５分、３０分、４５分、９０分、１２０分、１８０分、２４０分、３００分、３６０分、４８０分及び１４４０分。胃液試料をＲＩＡ又はＥＬＩＳＡ法で分析する。比較のためにＫ９９−ＴＦＦ２ペプチドから胃液中濃度−時間曲線を求める。実施例５の要領でデータを解析する。
【０１０６】
【表３】

【０１０７】
【表４】

【図面の簡単な説明】
【図１】
図１．グリコシル化Ｋ９９−ＴＦＦ２の構造であり、Ｘはグリコシル化を表わす。Ｃｙｓ６−Ｃｙｓ１０４、Ｃｙｓ８−Ｃｙｓ３５、Ｃｙｓ１９−Ｃｙｓ３４、Ｃｙｓ２９−Ｃｙｓ４６、Ｃｙｓ５８−Ｃｙｓ８４、Ｃｙｓ６８−Ｃｙｓ８３、Ｃｙｓ７８−Ｃｙｓ９５のジスルフィド結合は模式図である。
【図２】
図２．酵母プラスミドｐＫＦＮ１８４７（Ｔｈｉｍｅｔａｌ．，ＦＥＢＳＬｅｔｔｅｒｓ，１９９３，９９：３４５−３５２）。該プラスミドでは、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＴＰＩ１遺伝子の転写プロモーター（ＳａｌＩ−ＥｃｏＲＩフラグメント上に位置）と転写ターミネーターの間にＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩフラグメントを含む発現カセットが挿入されている。ＰＯＴは選択マーカーのシゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｐｏｍｂｅ）トリオースホスフェート・イソメラーゼ遺伝子である。ＡＭＰ−Ｒはアンピシリン耐性選択マーカーである。制限部位は実施例１で説明したプラスミドの構築に関連するものだけを示した。
【図３】
図３．実施例１で説明しているリーダー−Ｋ９９−ＴＦＦ２融合タンパク質をコードする５６３ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩフラグメントのヌクレオチド配列と対応するアミノ酸配列。リーダーに対応するアミノ酸は枠で囲ってある。成熟Ｋ９９−ＴＦＦ２のＮ末端及びＣ末端アミノ酸をそれぞれ数字の１及び１０６で示す。
【図４】
図４．グリコシル化ヒトＫ９９−ＴＦＦ２及び非グリコシル化ヒトＫ９９−ＴＦＦ２を発現する酵母株ＹＥＡ３１４に由来する上清のＶｙｄａｃ２１４ＴＰ５４Ｃ４カラムによる逆相ＨＰＬＣ。吸光度は２１４ｎｍで測定した。
【図５】
図５．非グリコシル化ヒトＫ９９−ＴＦＦ２試料のＶｏｙａｇｅｒＲＰＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計による質量スペクトル。
【図６】
図６．グリコシル化ヒトＫ９９−ＴＦＦ２試料のＶｏｙａｇｅｒＲＰＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計による質量スペクトル。
【図７】
図７．３種類（高マンノース型、複合型、ハイブリッド型）のアスパラギン（Ａｓｎ）結合糖鎖の構造。ＧｌｃＮＡｃ、ＮｅｕＡｃ、Ｍａｎ、Ｆｕｃ及びＧａｌはそれぞれＮ−アセチルグルコサミン残基、Ｎ−アセチルノイラミン酸残基、マンノース糖残基、フコース糖残基及びガラクトース糖残基を表わす。ｐ_１、ｐ_２、ｐ_３は０〜３５より独立に選択される整数であるが、ただしｐ_１＋ｐ_２＋ｐ_３＝３５とする。
【図８】
図８．ムチン溶液単独の剪断応力−剪断速度曲線。１０％（ｗ／ｖ）ムチンＩの０．０５％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウム溶液２ｍｌに０．４ｍｌの水を加えた。２０℃で３０分静置後、ＣｏｎｓｔａｎｔＲａｔｅ−指数法則近似ソフトウェアプログラムを用いて、剪断応力を剪断速度の関数として求めた。

Claims

配列番号：１のアミノ酸配列を有しＣｙｓ６−Ｃｙｓ１０４、Ｃｙｓ８−Ｃｙｓ３５、Ｃｙｓ１９−Ｃｙｓ３４、Ｃｙｓ２９−Ｃｙｓ４６、Ｃｙｓ５８−Ｃｙｓ８４、Ｃｙｓ６８−Ｃｙｓ８３及びＣｙｓ７８−Ｃｙｓ９５の間にジスルフィド結合を含む複数のＴＦＦ２ペプチドであって、糖残基及びオリゴ糖より独立に選択されるＸ部分がＡｓｎ１５と共有結合している複数のＴＦＦ２ペプチド。
Ｘが糖残基である請求項１に記載の複数のＴＦＦ２ペプチド。
Ｘが（Ｈｅｘ）_ｎもしくは（ＧｌｃＮＡｃ）_２−Ｙ又はそれらの混合物より独立に選択され、ここでｎは１〜４０の整数であり、そしてＹは糖残基である、請求項１〜２のいずれか１項に記載の複数のＴＦＦ２ペプチド。
Ｘが（Ｈｅｘ）_ｎであり、ｎは１〜４０の整数である請求項１〜３のいずれか１項に記載の複数のＴＦＦ２ペプチド。
ｎが１３〜１７の整数である請求項４に記載の複数のＴＦＦ２ペプチド。
Ｘが（ＧｌｃＮＡｃ）_２−Ｙである請求項１〜３のいずれか１項に記載の複数のＴＦＦ２ペプチド。
Ｘが（Ｈｅｘ）_ｎと（ＧｌｃＮＡｃ）_２−Ｙの混合物であり、ｎは１〜４０の整数であり、そしてＹは糖残基である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の複数のＴＦＦ２ペプチド。
Ｙが（Ｈｅｘ）_ｎでありｎは１〜４０の整数である請求項６又は７のいずれか１項に記載の複数のＴＦＦ２ペプチド。
ｎが１０〜１５の整数である請求項８に記載の複数のＴＦＦ２ペプチド。
Ｙが（Ｈｅｘ）_ｎ［（ＧｌｃＮＡｃ）（Ｈｅｘ）］_ｍであり、ｎとｍは１〜４０より独立に選択される整数である、請求項６又は７のいずれか１項に記載の複数のＴＦＦ２ペプチド。
Ｙが（Ｈｅｘ）_ｎ［（ＧｌｃＮＡｃ）（Ｇａｌ）］_ｍであり、ｎとｍは１〜４０より独立に選択される整数である、請求項６又は７のいずれか１項に記載の複数のＴＦＦ２ペプチド。
Ｙが（Ｈｅｘ）_ｎ［（ＧｌｃＮＡｃ）（Ｈｅｘ）（ＮｅｕＡｃ）］_ｍであり、ｎとｍは１〜４０より独立に選択される整数である、請求項６又は７のいずれか１項に記載の複数のＴＦＦ２ペプチド。
Ｙが（Ｈｅｘ）_ｎ［（ＧｌｃＮＡｃ）（Ｇａｌ）（ＮｅｕＡｃ）］_ｍであり、ｎとｍは１〜４０より独立に選択される整数である、請求項６又は７のいずれか１項に記載の複数のＴＦＦ２ペプチド。
Ｈｅｘがマンノースである請求項３〜５又は７〜１３のいずれか１項に記載の複数のＴＦＦ２ペプチド。
配列番号：１のアミノ酸配列を有しＣｙｓ６−Ｃｙｓ１０４、Ｃｙｓ８−Ｃｙｓ３５、Ｃｙｓ１９−Ｃｙｓ３４、Ｃｙｓ２９−Ｃｙｓ４６、Ｃｙｓ５８−Ｃｙｓ８４、Ｃｙｓ６８−Ｃｙｓ８３及びＣｙｓ７８−Ｃｙｓ９５の間にジスルフィド結合を含む複数のＴＦＦ２ペプチドであって、Ａｓｎ１５と共有結合したＸ部分が真核宿主細胞中でのＴＦＦ２ペプチドの発現により引き起こされるグリコシル化を特徴とする複数のＴＦＦ２ペプチド。
宿主細胞が酵母である請求項１５に記載の複数のＴＦＦ２ペプチド。
酵母がＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである請求項１６に記載の複数のＴＦＦ２ペプチド。
宿主細胞が哺乳動物細胞株である請求項１５に記載の複数のＴＦＦ２ペプチド。
哺乳動物細胞株がヒト細胞株である請求項１８に記載の複数のＴＦＦ２ペプチド。
宿主細胞が昆虫細胞株である請求項１５に記載の複数のＴＦＦ２ペプチド。
配列番号：１のアミノ酸配列を有しＣｙｓ６−Ｃｙｓ１０４、Ｃｙｓ８−Ｃｙｓ３５、Ｃｙｓ１９−Ｃｙｓ３４、Ｃｙｓ２９−Ｃｙｓ４６、Ｃｙｓ５８−Ｃｙｓ８４、Ｃｙｓ６８−Ｃｙｓ８３及びＣｙｓ７８−Ｃｙｓ９５の間にジスルフィド結合を含む複数のＴＦＦ２ペプチドであって糖残基及びオリゴ糖より独立に選択されるＸ部分がＡｓｎ１５と共有結合していることを特徴とする複数のＴＦＦ２ペプチドを含有する製剤組成物。
請求項１〜２０のいずれか１項に記載の複数のＴＦＦ２ペプチドを製薬上許容しうる担体又は希釈剤と共に含有する製剤組成物。
哺乳動物の粘液層の粘性を高めるための製剤組成物であって、複数のＴＦＦ２ペプチド又はその製薬上許容しうる塩を含有する製剤組成物。
複数のＴＦＦ２ペプチドが請求項１〜２０のいずれか１項に記載のペプチドである請求項２３に記載の製剤組成物。
哺乳動物がヒトである請求項２３〜２４のいずれか１項に記載の製剤組成物。
哺乳動物の粘液層損傷又は異常を治療するための製剤組成物であって、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の複数のＴＦＦ２ペプチド又はその製薬上許容しうる塩を製薬上許容しうる担体又は希釈剤と共に含有する製剤組成物。
経口、経鼻、経皮、経肺又は非経口投与用の、請求項２１〜２６のいずれか１項に記載の製剤組成物。
局所及び管腔適用用の、請求項２１〜２６のいずれか１項に記載の製剤組成物。
ムチン糖タンパク調製品をさらに含有する請求項２１〜２８のいずれか１項に記載の製剤組成物。
哺乳動物の泌尿器系の粘液層損傷又は異常を治療するための請求項２１〜２９のいずれか１項に記載の製剤組成物。
口腔粘膜治療用の請求項２１〜２９のいずれか１項に記載の製剤組成物。
低唾液分泌患者治療用の請求項３１に記載の製剤組成物。
低唾液分泌が放射線療法、抗コリン作用薬による治療又はシェーグレン症候群に起因する、請求項３２に記載の製剤組成物。
気道治療用の請求項２１〜２９のいずれか１項に記載の製剤組成物。
風邪又はアレルギー性鼻炎に伴う鼻漏の分泌物の粘性を高めるための、請求項３４に記載の製剤組成物。
刺激物、ガス、ダスト又はフュームを誤って吸入した後の呼吸器を治療するための、請求項３４に記載の製剤組成物。
食道遠位部治療用の請求項２１〜２９のいずれか１項に記載の製剤組成物。
逆流性食道炎、裂孔ヘルニア又はバレット食道に際し胃酸分泌から保護するための、請求項３７に記載の製剤組成物。
胃治療用の請求項２１〜２９のいずれか１項に記載の製剤組成物。
外傷、ショック、大手術、腎又は肝疾患もしくはアスピリン又は他ＮＳＡＩＤＳ、ステロイドによる治療や飲酒などに続発するストレス性胃潰瘍を治療するための、請求項３９に記載の製剤組成物。
下痢治療用の請求項２１〜２９のいずれか１項に記載の製剤組成物。
クローン病及び潰瘍性大腸炎に際し小腸及び結腸粘膜を治療するための、請求項２１〜２９のいずれか１項に記載の製剤組成物。
眼治療用の請求項２１〜２９のいずれか１項に記載の製剤組成物。
乾性角結膜炎／シェーグレン症候群又はドライアイの患者の涙液の粘性を高めるための、請求項４３に記載の製剤組成物。
点眼剤用である請求項４３〜４４のいずれか１項に記載の製剤組成物。
関節治療用の請求項２１〜２９のいずれか１項に記載の製剤組成物。
変形性関節炎に際して及び関節置換術後に滑液の粘性を高めるための、請求項４６に記載の製剤組成物。
慢性膀胱感染症、カテーテル装着患者又は間質性膀胱炎、もしくは膀胱乳頭腫又はがんを治療するための、請求項２１〜２９のいずれか１項に記載の製剤組成物。
配列番号：１のアミノ酸配列を有しＣｙｓ６−Ｃｙｓ１０４、Ｃｙｓ８−Ｃｙｓ３５、Ｃｙｓ１９−Ｃｙｓ３４、Ｃｙｓ２９−Ｃｙｓ４６、Ｃｙｓ５８−Ｃｙｓ８４、Ｃｙｓ６８−Ｃｙｓ８３及びＣｙｓ７８−Ｃｙｓ９５の間にジスルフィド結合を含む複数のＴＦＦ２ペプチドであって糖残基及びオリゴ糖より独立に選択されるＸ部分がＡｓｎ１５と共有結合していることを特徴とする複数のＴＦＦ２ペプチドを製造する方法であって、ＴＦＦ２ペプチドをコードするＤＮＡ配列で形質転換した真核宿主細胞を、グリコシル化を許容するような条件下で培養するステップ及び産生されるグリコシル化ＴＦＦ２ペプチドを培養液から回収するステップを含む方法。
請求項１〜２０のいずれか１項に記載の複数のＴＦＦ２ペプチドを製造する方法であって、ＴＦＦ２ペプチドをコードするＤＮＡ配列で形質転換した真核宿主細胞を、グリコシル化を許容するような条件下で培養するステップ及び産生されるグリコシル化ＴＦＦ２ペプチドを培養液から回収するステップを含む方法。
配列番号：１のアミノ酸配列を有するヒトＴＦＦ２ペプチドをコードするヌクレオチド配列を収めたＤＮＡコンストラクト。
ヌクレオチド配列がリーダーペプチドとＬｙｓ−Ａｒｇ切断部位とをさらにコードする請求項５１に記載のＤＮＡコンストラクト。
ヌクレオチド配列が配列番号：２のｃＤＮＡ配列を含む請求項５１〜５２のいずれか１項に記載のＤＮＡコンストラクト。
宿主細胞を形質転換しうる組換えＤＮＡベクターであって、配列番号：１のアミノ酸配列を有するヒトＴＦＦ２ペプチドをコードするヌクレオチド配列、宿主細胞内複製プロモーター及び選択マーカーを収めた組換えベクター。
宿主細胞が酵母である請求項５４に記載の組換えベクター。
酵母がＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである請求項５５に記載の組換えベクター。
宿主細胞が細菌である請求項５４に記載の組換えベクター。
宿主細胞が昆虫細胞である請求項５４に記載の組換えベクター。
宿主細胞が哺乳動物細胞である請求項５４に記載の組換えベクター。
哺乳動物細胞がヒト細胞である請求項５９に記載の組換えベクター。
組換えベクターがＤＮＡプラスミドである請求項５４〜６０のいずれか１項に記載の組換えベクター。
請求項５５又は５６のいずれか１項に記載の組換えベクターで形質転換した酵母細胞。
哺乳動物の粘液層の粘性を高める薬剤の製造への、複数のＴＦＦ２ペプチドの使用。
哺乳動物の粘液層の粘性を高める薬剤であって請求項２１〜４８のいずれか１項に記載の薬剤の製造への、複数のＴＦＦ２ペプチドの使用。
哺乳動物が人間である、請求項６３〜６４のいずれか１項に記載の使用。
被検者の粘液層の粘性をｉｎｖｉｖｏで高める方法であって、該被検者に
ａ）製薬上許容しうる担体又は希釈剤
ｂ）治療有効量の複数のＴＦＦ２ペプチド、及び随意に
ｃ）ムチン糖タンパク調製品
を含有する組成物を投与するステップを含む方法。
投与が局所又は管腔適用である請求項６６に記載の方法。
投与が非経口投与である請求項６６に記載の方法。
ムチンの粘性が口腔粘膜の病態に関連する請求項６６〜６８のいずれか１項に記載の方法。
病態が低唾液分泌である請求項６９に記載の方法。
低唾液分泌が放射線療法、抗コリン作用薬による治療又はシェーグレン症候群に起因する請求項７０に記載の方法。
ムチンの粘性が気道の病態に関連する請求項６６〜６８のいずれか１項に記載の方法。
病態が風邪又はアレルギー性鼻炎に伴う鼻漏の分泌物である請求項７２に記載の方法。
病態が刺激物、ガス、ダスト又はフュームの誤った吸入である請求項７２に記載の方法。
ムチンの粘性が食道遠位部の病態に関連する請求項６６〜６８のいずれか１項に記載の方法。
病態が逆流性食道炎、裂孔ヘルニア、バレット食道における胃酸分泌である請求項７５に記載の方法。
ムチンの粘性が胃の病態に関連する請求項６６〜６８のいずれか１項に記載の方法。
病態が外傷、ショック、大手術、腎又は肝疾患もしくはアスピリン又は他ＮＳＡＩＤＳ、ステロイドによる治療や飲酒に続発するストレス性胃潰瘍である請求項７７に記載の方法。
病態が下痢である請求項６６〜６８のいずれか１項に記載の方法。
ムチンの粘性が小腸又は結腸の病態に関連する請求項６６〜６８のいずれか１項に記載の方法。
病態がクローン病又は潰瘍性大腸炎である請求項８０に記載の方法。
ムチンの粘性が眼の病態に関連する請求項６６〜６８のいずれか１項に記載の方法。
病態が乾性角結膜炎／シェーグレン症候群又はドライアイである請求項８２に記載の方法。
ムチンの粘性が関節の病態に関連する請求項６６〜６８のいずれか１項に記載の方法。
病態が変形性関節炎に際しての又は関節置換術後の滑液の粘性増大である請求項８４に記載の方法。
病態が慢性膀胱感染症、カテーテル装着患者又は間質性膀胱炎、もしくは膀胱乳頭腫又はがんである請求項６６〜６８のいずれか１項に記載の方法。