JP2008189572A - インターロイキン12産生抑制剤 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】細菌由来のペプチドグリカン若しくはプロトプラスト、又は酵母由来のザイモサンを有効成分とするインターロイキン12産生抑制剤。
【選択図】なし
Description
(1)ペプチドグリカン及びプロトプラスト
ラクトバチルス・カゼイ(YIT 9029)、ラクトバチルス・ジョンソニー(JCM 2012)、ラクトバチルス・プランタラム(ATCC 14917)は200mLのDifcoTM Lactobacilli MRS培地(BD社)を用いて37℃で20時間培養した。菌体は遠心分離(8000回転、10分)により集菌し、滅菌ミリQ水を用いて遠心洗浄を3回繰り返した後、20mLの滅菌ミリQ水に懸濁して、100℃で30分間の加熱処理をした後、凍結乾燥して加熱死菌体とした。
ラクトバチルス・カゼイ由来の細胞壁、ペプチドグリカン、細胞壁多糖、プロトプラストは以下に示すとおり調製した。500mgのラクトバチルス・カゼイ加熱死菌体を0.3%ドデシル硫酸ナトリウム溶液(50mL)に懸濁し、100℃で15分間熱処理した。菌体は遠心分離により集菌し、メタノール、メタノール−クロロホルム−ミリQ水(1:1:1)及びメタノール−クロロホルム(1:1)それぞれ50mLで順に処理して脱脂し、上清を除去した後、乾燥させた。続いて、菌体を50mMトリス塩酸緩衝液(pH7.5)に懸濁し、プロナーゼ(ロッシュ社)及びベンゾンヌクレアーゼ(メルク社)で処理してタンパク質、ペプチド及び核酸を分解した。遠心分離により不溶性画分を回収し、ミリQ水で3回遠心洗浄した後、凍結乾燥して細胞壁とした。細胞壁を47%フッ化水素溶液に懸濁し、4℃で20時間処理し、遠心分離により不溶性画分を回収し、ミリQ水で3回遠心洗浄した後、凍結乾燥してペプチドグリカンとした。また、遠心分離後の上清は、ミリQ水で透析した後、凍結乾燥して細胞壁多糖とした。また、500mgのラクトバチルス・カゼイ加熱死菌体を4mMの塩化マグネシウムを含む50mMトリスマレイト緩衝液(pH7.0、50mL)に懸濁し、M−1酵素(生化学工業)を添加して37℃で16時間反応させて、細胞壁を消化した。遠心分離により不溶性成分を回収し、リン酸緩衝化生理食塩水で3回洗浄した後、凍結乾燥し、プロトプラストとした。
ラクトバチルス・ジョンソニー及びラクトバチルス・プランタラムのペプチドグリカン及びプロトプラストは、ラクトバチルス・カゼイのものと同様に調製した。スタフィロコッカス・アウレウス由来のペプチドグリカンはインビボジェン社より、サッカロマイセス・セルビシエ由来のザイモサンはモレキュラープローブ社よりそれぞれ購入した。
日本SLC社より購入した9週齢のメスのBALB/cマウスの腹腔内に4%チオグリコレート(ディフコ社)溶液2mLを投与した。4日後に腹腔内に誘導されてくる細胞をハンクス溶液(シグマ社)10mLを用いて回収し、腹腔マクロファージとした。腹腔マクロファージはハンクス溶液で3回洗浄後、10%牛胎児血清を含むRPMI 1640培地(シグマ社)に懸濁した。96ウエル培養プレート(ヌンク社)に腹腔マクロファージ(1×105個/ウエル/0.2mL)をまき、ラクトバチルス・カゼイ加熱死菌体(10μg/mL)存在下で、細菌又は菌体処理物(10μg/mL)を添加して37℃で培養した。24時間後の培養上清を回収し、IL−12p70の濃度をELISAで定量した。ELISAでのIL−12p70の濃度の定量方法について以下に説明する。96ウエルELISAプレートに抗マウスIL−12抗体(クローン9A5、200倍希釈、ファーミンジェン社)を4℃で一晩吸着させた。1%牛血清アルブミンでブロッキングした後、10倍に希釈した培養上清又は標準IL−12p70(ファーミンジェン社)を添加して室温で90分間反応させた。0.05%トライトンX100を含むリン酸緩衝化食塩水で洗浄後、ビオチン標識抗マウスIL−12抗体(クローンC17.8、1000倍希釈、ファーミンジェン社)を添加して室温で90分間反応させた。0.05%トライトンX100を含むリン酸緩衝化食塩水で洗浄後、ストレプトアビジン標識ペルオキシダーゼ(20000倍希釈、セロテック社)を添加して室温で30分間反応させた。0.05%トライトンX100を含むリン酸緩衝化食塩水で洗浄後、TMB試薬を添加して室温で10分間反応させ、1N硫酸を加えて反応を停止し、450nmの吸光値を測定した。標準IL−12p70から検量線を作成し、培養上清中の濃度を算出した。
マウス腹腔マクロファージ培養系を用いて、ラクトバチルス・カゼイ加熱死菌体、同菌より調製した細胞壁、ペプチドグリカン、細胞壁多糖、プロトプラストのIL−12産生抑制効果を調べたところ、加熱死菌体、細胞壁、細胞壁多糖はIL−12産生を抑制しなかったが、ペプチドグリカン及びプロトプラストはIL−12産生を抑制した(図1)。また、マクロファージ培養系に、ペプチドグリカン及びプロトプラストを単独で添加した(IL−12過剰産生状態でない)場合は、IL−12産生はほとんど誘導されなかった(図2)。
下記の処方で各種成分を混合して造粒、乾燥、整粒した後に、打錠して錠剤を製造した。
(処方) (mg)
ペプチドグリカン 20
微結晶セルロース 100
乳糖 80
ステアリン酸マグネシウム 0.5
メチルセルロース 12
下記の処方で処方したものを加熱殺菌後、褐色瓶にホットパック充填を行い、清涼飲料水を得た。
(処方) (g)
ザイモサン 0.8
香料 0.8
クエン酸 0.2
果糖 4
スクラロース 0.001
水 94.199
15%脱脂乳に3%グルコースを添加し、120℃で3秒間殺菌した後、ラクトバチルス・カゼイ(Lactobacillus casei)YIT 9029株を1%接種し、37℃でpH3.6まで培養してヨーグルトベース210gを得た。一方、砂糖97g、クエン酸鉄0.2g、ペプチドグリカン1gを水に溶解し、水を加え全量を790gとし、この溶液を110℃で3秒間殺菌し、シロップを得た。上記のようにして得られたヨーグルトベースとシロップを混合し、香料を1g添加した後、15Mpaで均質化して容器に充填して発酵乳製品を得た。この発酵乳製品中のラクトバチルス・カゼイの初発菌数は108cfu/mLであった。
Claims (7)
- 細菌由来のペプチドグリカン若しくはプロトプラスト、又は酵母由来のザイモサンを有効成分とするインターロイキン12産生抑制剤。
- インターロイキン12過剰産生に起因する疾患用である請求項1記載のインターロイキン12産生抑制剤。
- 細菌が、ラクトバチルス属、スタフィロコッカス属、ビフィドバクテリウム属、ストレプトコッカス属、ラクトコッカス属及びバチルス属から選ばれる1種以上の細菌である請求項1又は2記載のインターロイキン12産生抑制剤。
- 細菌が、ラクトバチルス属、スタフィロコッカス属及びビフィドバクテリウム属から選ばれる1種以上の細菌である請求項1又は2記載のインターロイキン12産生抑制剤。
- 細菌が、ラクトバチルス・カゼイ、ラクトバチルス・ジョンソニー、ラクトバチルス・プランタラム、ラクトバチルス・アシドフィルス、ラクトバチルス・ヘルベティカス、ラクトバチルス・デルブルッキー、ラクトバチルス・ガッセリ、ラクトバチルス・ラムノーサス、ラクトバチルス・ファーメンタム、スタフィロコッカス・アウレウス、ビフィドバクテリウム・ブレーベ、ビフィドバクテリウム・ビフィダム、ビフィドバクテリウム・ロンガム、ビフィドバクテリウム・アドレセンティス、ビフィドバクテリウム・インファンティス、ストレプトコッカス・サーモフィルス、ラクトコッカス・ラクチス及びバチルス・ズブチルスから選ばれる1種以上の細菌である請求項1乃至3のいずれか1項記載のインターロイキン12産生抑制剤。
- 細菌が、ラクトバチルス・カゼイ、ラクトバチルス・ジョンソニー、ラクトバチルス・プランタラム、ラクトバチルス・アシドフィルス、ラクトバチルス・ヘルベティカス、ラクトバチルス・デルブルッキー、スタフィロコッカス・アウレウス、ビフィドバクテリウム・ブレーベ、ビフィドバクテリウム・ビフィダム及びビフィドバクテリウム・ロンガムから選ばれる1種以上の細菌である請求項1乃至4のいずれか1項記載のインターロイキン12産生抑制剤。
- 酵母が、サッカロマイセス・セルビシエ、シゾサッカロマイセス・ポンベ及びカンジダ・アルビカンスから選ばれる1種以上の酵母である請求項1又は2記載のインターロイキン12産生抑制剤。
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