JP2008013468A - ユビキチンリガーゼ阻害剤 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】大豆グリシニン組成物を加水分解して得られる、グリシニンペプチド混合物を有効成分とする組成物を摂取することで、ユビキチンリガーゼCbl-bによるIRS-1のユビキチン化を阻害できた。筋萎縮を予防又は軽減する効果を得られる可能性がある。
【選択図】なし
Description
即ち、本発明は、
(1)大豆グリシニン組成物を加水分解して得られるペプチド混合物を有効成分とする、ユビキチンリガーゼ阻害剤。
(2)食品または医薬品である、(1)記載のユビキチンリガーゼ阻害剤。
(3)医薬品が経口摂取用である、(2)記載のユビキチンリガーゼ阻害剤。
(4)大豆グリシニン組成物を加水分解して得られるペプチド混合物を有効成分として用いる、ユビキチンリガーゼ阻害方法。
である。
脱脂大豆(PDI:83、水分7.0%)1kgを相対湿度90%以上の雰囲気下で脱脂大豆の品温が75℃になるように密閉容器の外側を加熱し、30分維持した。容器から脱脂大豆を取り出し、加工脱脂大豆を調製した。このPDIは73であった。加工脱脂大豆1部を水8部に溶解し、水酸化ナトリウムでpH8.0に調整した。攪拌下で1時間抽出を行い、オカラを遠心分離で除いて脱脂豆乳を得た。得られた脱脂豆乳に0.01%になるように亜硫酸水素ナトリウムを加え、硫酸でpHを5.8に調整し、遠心分離で沈殿物を回収し、水酸化ナトリウムで中和後、高温殺菌及び噴霧乾燥を行って大豆グリシニン組成物を得た。また、上澄は比較製造例1の原料とした。なお、大豆グリシニン組成物中のグリシニンの純度は、90%であった。
製造例1で調製した大豆グリシニン組成物を基質にして、以下の方法に従いペプチドを調製した。すなわち、大豆グリシニン組成物の8%溶液に対し、サモアーゼ(起源;Bacillus thermoproteolyticus, 金属プロテアーゼ, 大和化成)を対蛋白質あたり2%加え、pH9.0, 58℃で60分間作用させた。次にビオプラーゼ(起源;Bacillus sp. セリンプロテアーゼ, ナガセケムテック)を対蛋白質あたり1%加え、pH7.5,58℃で60分作用させた。スミチームFP(起源;Aspergillus sp., 金属プロテアーゼ,新日本化学工業)を対蛋白質あたり1%加え、pH7.5,58%で60分作用させた。以上の処理の後、90℃, 20分で反応を停止させた。得られたグリシニンペプチドの15%TCA可溶率は93%であった。また、アミノ酸分析機を用いて測定した遊離アミノ酸含量は、8.2%であった。
製造例1の上清を硫酸でpHを5.0に調整し、55℃で15分加温した後、水酸化ナトリウムでpHを5.5に調整し、遠心分離後、沈殿物であるLP組成物を回収した。上清を硫酸でpH4.5に調整し、遠心分離後、沈殿物であるβ-コングリシニン組成物を回収した。各分画物は水酸化ナトリウムで中和後、高温殺菌及び噴霧乾燥を行った。このようにして調製したβ-コングリシニン組成物、LP組成物を基質にして、製造例2の方法に従い、β-コングリシニンペプチド、LPペプチドを調製した。得られたβ-コングリシニンペプチド,LPペプチドの15%TCA可溶率は、それぞれ91%,93%であった。
脱脂大豆に15重量倍の水を加え、水酸化ナトリウムで中性にpHを調整し、攪拌抽出したあと豆乳を塩酸でpH4.8にして大豆蛋白質を沈殿させ、遠心分離後、沈殿物である大豆蛋白質を回収した。水酸化ナトリウムで中和後、高温殺菌及び噴霧乾燥を行って、分離大豆蛋白質を得た。なお、分離大豆蛋白質中の、グリシニンの純度は、35%であった。このようにして調製した分離大豆蛋白質を基質にして、製造例2の方法に従い、分離大豆蛋白質ペプチドを調製した。得られた分離大豆蛋白質ペプチドの15%TCA可溶率は、93%であった。
脱脂大豆1部を水10部に溶解し、水酸化ナトリウムでpH7.0に調整した。攪拌下で1時間抽出を行い、オカラを遠心分離で除いて脱脂豆乳を得た。得られた脱脂豆乳に0.1%の亜硫酸水素ナトリウムを加え、塩酸でpH6.4とした。脱脂豆乳を2〜5℃で6時間静置し、遠心分離で沈殿物を回収し、水酸化ナトリウムで中和後、高温殺菌及び噴霧乾燥を行って大豆グリシニン組成物を得た。なお、グリシニンの純度は、95%であった。このようにして調製したグリシニン組成物を基質にして、製造例2の方法に従いペプチドを調製した。
○Cbl-bとIRS-1の精製
Heck293細胞を直径10cmのディッシュ2枚に培養した。それぞれにCbl-bとIRS-1の遺伝子を含むプラスミドを導入し、Cbl-bとIRS-1を強発現させ、それぞれの抗体による免疫沈降により精製した。
精製したユビキチン化システムの各成分(E1,E2,E3(Cbl-b),ユビキチン)に基質であるIRS-1を加え、37℃で4時間反応させた。
上記反応系に、製造例2および比較製造例1〜2で調製したペプチド混合物を終濃度5μg/μlなるように加え、反応終了後、SDS-PAGEに供した。CBB染色後、ユビキチン化されたIRS-1の割合をデンシトメーターにより測定した。
図1に示すように、試験管内で再構築されたCbl-bによるIRS-1のユビキチン化において、反応系にグリシニンペプチドを加えた場合、IRS-1のユビキチン化を強く阻害することが確認された(図1,レーン6)。β-コングリシニンペプチドも阻害活性を有していたが、軽度であった(図1,レーン5)。一方、グリシニン含量の低い、分離大豆蛋白質及びLPを加水分解して得られたペプチド混合物では、阻害効果は殆ど見られなかった(図1,レーン3,4)。
Claims (4)
- 大豆グリシニン組成物を加水分解して得られるペプチド混合物を有効成分とする、ユビキチンリガーゼ阻害剤。
- 食品または医薬品である、請求項1記載のユビキチンリガーゼ阻害剤。
- 医薬品が経口摂取用である、請求項2記載のユビキチンリガーゼ阻害剤。
- 大豆グリシニン組成物を加水分解して得られるペプチド混合物を有効成分として用いる、ユビキチンリガーゼ阻害方法。
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