JP2008000097A - 増殖能を有する微生物の検出方法 - Google Patents

Abstract

【課題】固体表面や環境表面、ヒトの手掌等の皮膚表面等の被験面に付着した増殖能を有する微生物を、迅速かつ簡便に検出できる微生物の検出方法を提供すること。
【解決手段】１）粘着シートの粘着面に微生物を捕集する工程、２）前記微生物を捕集した後の粘着シートの粘着面を寒天培地と接触させた状態で微生物の培養を行い、コロニーを形成させる工程、３）前記コロニーを形成した後の粘着シートと寒天培地とからなる積層物をスキャナで撮像して被験画像を得る工程、及び４）前記被験画像を解析してコロニー数を判定する工程を含む、増殖能を有する微生物の検出方法。
【選択図】なし

Description

本発明は微生物の検出方法に関し、より詳細には、増殖能を有する微生物を粘着シートの粘着層表面に捕集後、微生物を培養してコロニーを形成させ、該コロニー数を計数することで、微生物の検出を行う微生物の検出方法に関する。

さまざまな環境において、細菌等の微生物量を迅速かつ簡便に計測することは、食品ならびに医薬品業界における製品の品質管理や作業環境の衛生管理、及び作業従事者の衛生管理状態を知る上で重要である。従来、種々の環境中の被験面上に存在する肉眼では観察することのできない微生物を観察及び計数するには、培養法、すなわち寒天等で賦形した平板培地を被験面に押し当てることにより被験面上の微生物を寒天平板培地上に転写し、該微生物をそのまま平板培地上で適当な環境のもとで培養することにより出現するコロニーを肉眼で計測する方法が一般的に利用されており、例えば、フードスタンプ（日水製薬（株））を使用したスタンプアガー法等が挙げられる。さらには、被験面を生理食塩水やリン酸緩衝液等を用いて十分に拭き取りながら微生物を捕集し、それを緩衝液に再懸濁させ、寒天平板培地で混釈培養するスワブ法も用いられている。また、水溶液中の細菌については、水溶液を細菌捕捉能力のあるメンブレンフィルターで濾過することによってメンブレンフィルター上に細菌を濾過捕集した後、細菌と寒天培地とを十分に接触させて該フィルター上にコロニーを形成させ、そのコロニー数を測定するメンブレンフィルター法が用いられている。

一方、近年、固体表面の細菌をサンプリングする手法として、粘着シートを用いた方法が提案されている（特許文献１）。該方法は、非水溶性高分子化合物を主成分とする粘着層を有する粘着シートの粘着層表面を、被験体である固体の表面に圧着、剥離して細菌を集積した後、細菌を染色し得る１種以上の蛍光性物質を含有する水溶液を該粘着層表面に接触させ、染色された菌体を観察・計数することにより、迅速かつ簡便に固体表面上の細菌を検出する方法である。しかし、該方法においては、蛍光染色された輝点を計数してそれを菌数としているため、増殖能を有する細菌数を測定することはできない。また粘着シートにより細菌を捕集し、それを寒天培地に密着させ培養した後、コロニー数を測定する方法（特許文献２）も示されているが、計数は目視であるため、迅速性に欠けるという問題がある。また、上記いずれの文献にも、固体表面に存在するゴミ等が計測に与える影響について言及しておらず、実質的に未対策のままである。
特開２００２−１４２７９７号公報 特許３６５８０２３号公報

上記事情に鑑み、本発明が解決しようとする課題は、固体表面や環境表面、ヒトの手掌等の皮膚表面等の被験面に付着した増殖能を有する微生物を、迅速かつ簡便に検出できる微生物の検出方法を提供することである。
また、固体表面や環境表面、ヒトの手掌等の皮膚表面等の被験面に付着した増殖能を有する微生物を、迅速かつ簡便に、しかも、前記被験面に付着しているゴミ等の異物の影響を受けることなく検出できる微生物の検出方法を提供することである。

本発明者等は、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、微生物を捕集した粘着シートの粘着面（微生物捕集面）を、寒天培地に接触させて微生物を培養してコロニーを形成させた後、該コロニー形成後の粘着シートと寒天培地の積層物を汎用のスキャナで撮像することで、粘着シートの粘着面（微生物捕集面）上でのコロニーの形成状況を画像データとして得ることができ、さらにかかる画像データの解析によってコロニー数を迅速に判定できること、さらに、コロニーを形成する前の粘着シートと寒天培地の積層物をスキャナで撮像して得られる画像データをブランクデータとして利用することで、より正確にコロニー数を判定できることを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、以下の通りである。
（１）次の各工程を含む、増殖能を有する微生物の検出方法。
１）粘着シートの粘着面に微生物を捕集する工程、
２）前記微生物を捕集した後の粘着シートの粘着面を寒天培地と接触させた状態で微生物の培養を行い、コロニーを形成させる工程、
３）前記コロニーを形成した後の粘着シートと寒天培地とからなる積層物をスキャナで撮像して被験画像を得る工程、
４）前記被験画像を解析してコロニー数を判定する工程、
（２）次の各工程を含む、増殖能を有する微生物の検出方法。
１）粘着シートの粘着面に微生物を捕集する工程、
２）前記微生物を捕集した後の粘着シートの粘着面を寒天培地に接触させた状態で、当該粘着シートと寒天培地からなる積層物をスキャナで撮像してブランク画像を得る工程、
３）前記微生物を捕集した後の粘着シートの粘着面を寒天培地と接触させた状態で微生物の培養を行い、コロニーを形成させる工程、
４）前記コロニーを形成した後の粘着シートと寒天培地からなる積層物をスキャナで撮像して被験画像を得る工程、
５）前記ブランク画像と被験画像をそれぞれ画像解析し、その解析結果に基づいてコロニー数を判定する工程、
（３）微生物捕集工程が、被験面に粘着シートの粘着面を圧着、剥離して被験面に存在する微生物を捕集する工程である、上記（１）又は（２）に記載の微生物の検出方法。
（４）微生物捕集工程が、メンブレンフィルターを用いて水系サンプルから微生物を濾過捕集し、該メンブレンフィルターに粘着シートの粘着面を圧着、剥離して、水系サンプル中の微生物を粘着シートの粘着面に捕集する工程である、上記（１）又は（２）に記載の微生物の検出方法。

本発明の微生物の検出方法では、粘着シートの粘着面で微生物を捕集するので、固体表面や環境表面、ヒトの手掌等の皮膚表面等の被験面に付着している増殖能を有する微生物を、簡便にかつ被験面を汚すことなくサンプリングすることができる。そして、粘着面上の微生物の検出は、粘着面に寒天培地を接触させた状態で微生物を培養してコロニーを形成させた後、かかるコロニー形成後の粘着シートと寒天培地の積層物をスキャナで撮像し、得られた被験画像（画像データ）を解析してコロニー数を判定することによって行うので、増殖能を有する微生物の微生物量を、迅速かつ簡便に計数することができる。

また、本発明の微生物の検出方法では、水中に存在する増殖能を有する微生物についても、水系サンプル中の微生物を濾過捕集したメンブレンフィルターに粘着シートの粘着面を圧着、剥離して、微生物を粘着面に転写した後、該微生物が転写された粘着面に対して上記と同様の操作を行うことで、その微生物を迅速かつ簡便に計数することができる。

また、コロニーを形成する前の粘着シートと寒天培地の積層物をスキャナで撮像してブランク画像（画像データ）を得る工程を追加した態様では、かかるブランク画像の解析結果から、微生物とともに被験面から捕集されたゴミ等の異物の数を判定できるので、該異物の数を前記コロニー数の判定結果から差し引くことで、粘着面に微生物とともに捕集されたゴミ等の異物をコロニーとして計数する誤りを無くすことができ、より正確に微生物量を計数することができる。

さらに、従来方法では微生物の検出が目視計数のため、データが数字として残されるのみで、データ解析後に異常値等を再確認することは容易ではなかったが、本方法ではコロニーを画像データとして保存するため、データを再解析することにより信頼性をさらに向上させることも可能である。

以下、本発明の実施形態について詳しく説明する。
本発明は、増殖能を有する微生物の検出方法であり、第１の態様は、１）粘着シートの粘着面に微生物を捕集する工程、２）前記微生物を捕集した後の粘着シートの粘着面を寒天培地と接触させた状態で微生物の培養を行い、コロニーを形成させる工程、３）前記コロニーを形成した後の粘着シートと寒天培地とからなる積層物をスキャナで撮像して被験画像を得る工程、及び４）前記被験画像を解析してコロニー数を判定する工程を有することが特徴である。また、第２の態様は、１）粘着シートの粘着面に微生物を捕集する工程、２）前記微生物を捕集した後の粘着シートの粘着面を寒天培地に接触させた状態で、当該粘着シートと寒天培地からなる積層物をスキャナで撮像してブランク画像を得る工程、３）前記微生物を捕集した後の粘着シートの粘着面を寒天培地と接触させた状態で微生物の培養を行い、コロニーを形成させる工程、４）前記コロニーを形成した後の粘着シートと寒天培地からなる積層物をスキャナで撮像して被験画像を得る工程、及び５）前記ブランク画像と被験画像をそれぞれ画像解析し、その解析結果に基づいてコロニー数を判定する工程を有することが特徴である。

本発明でいう、「スキャナ」とは、一般に、通信や記録のために画像や文書をデジタル静止画像情報化するために使用される、所謂、“イメージスキャナ”のことであり、「粘着シートと寒天培地からなる積層物をスキャナで撮像する」とは、当該イメージスキャナで粘着シートと寒天培地からなる積層物をその粘着シート側或いは寒天培地側からスキャンして、粘着シートと寒天培地の境界に位置する粘着シートの粘着面におけるコロニー形成状況やゴミ等の異物の存在状況を認識できるデジタル静止画像情報（画像データ）を得ることである。

［粘着シート］
本発明で使用する粘着シートとは、支持体の片面に粘着層を設けた粘着シートであって、その粘着層表面を種々の被験面（例えば、固体表面や環境表面、ヒトの手掌等の皮膚表面等）に存在する微生物やメンブレンフィルターで濾過捕集された微生物の捕集面（転写面）として使用し、かつ、該粘着層表面上で捕集した微生物を増殖させるものである。そのため、該粘着シートは、微生物捕集能を有した粘着層及び微生物の増殖を阻害しない支持体から構成され、具体的には、非水溶性高分子あるいは水溶性高分子を主成分としてなる粘着層が支持体の片面上に積層された構造を有する。

粘着層は、被験面やメンブレンフィルターに圧着、剥離して、被験面やメンブレンフィルターに存在する微生物がその表面に転写されて捕集されるのに十分な粘着性を有し、かつ、平滑性の高い表面構造を有するものである。粘着層に用いる粘着剤としては、例えば、アクリル系粘着剤、ゴム系粘着剤、シリコーン系粘着剤等の非水溶性粘着剤が挙げられるが、粘着シートと寒天培地からなる積層物をスキャナで撮像する際に、その光学特性の影響が少ないという観点から、透明性の高いアクリル系粘着剤やシリコーン系粘着剤が好ましく、アクリル系粘着剤が特に好ましい。これらの粘着剤の製造は、自体公知の方法で行うことができ、例えば、アクリル系粘着剤は、液重合、乳化重合、懸濁重合、塊状重合、光重合等いずれの方法で製造しても良い。また、これらの粘着剤は市販品を使用してもよい。

上記アクリル系粘着剤としては、モノマーとして、例えば、（メタ）アクリル酸エチル、（メタ）アクリル酸プロピル、（メタ）アクリル酸ブチル、（メタ）アクリル酸ヘキシル、（メタ）アクリル酸オクチル、（メタ）アクリル酸ノニル、（メタ）アクリル酸デシル等のアルキル基の炭素数が２〜１３の（メタ）アクリル酸のアルキルエステルを主成分とし、これに（メタ）アクリル酸、イタコン酸、マレイン酸、（メタ）アクリル酸ヒドロキシエチル、（メタ）アクリル酸メトキシエチル、（メタ）アクリル酸エトキシエチル、（メタ）アクリル酸ブトキシエチル、（メタ）アクリル酸エチレングリコールといった親水性のモノマーを一種もしくは二種以上共重合させた共重合体が挙げられる。

本発明において、粘着シートの粘着層は、その粘着特性をより良好なものとするため、イソシアネート化合物、有機過酸化物、エポキシ基含有化合物、金属キレート化合物といった熱架橋剤による処理や、紫外線、γ線、電子線等の処理により、架橋が施されているのが好ましい。

また、粘着層の厚みは、被験面への接着性や追従性、微生物捕集性等の観点から５〜１００μｍ程度が好ましく、１０〜６０μｍ程度がより好ましい。また、粘着層表面の平滑度（凹凸差）は２０μｍ以下であるのが好ましく、５μｍ以下であるのがより好ましい。なお、粘着層表面の平滑度は表面粗さ計あるいは電子顕微鏡等で粘着シートの断面を観察し、粘着層表面の凸部の頂点から凹部の最低点までの高度差を測定して求めることができる。

本発明において、粘着シートの支持体は、通常、非水溶性で、粘着層表面に大きな凹凸を形成させず、また、曲面や狭所表面にも自在に圧着させることできる柔軟な材質のシート状物であれば制限なく使用できるが、粘着シートと寒天培地からなる積層物をスキャナで撮像する際に、その光学特性の影響が少ないという観点から、非水溶性のプラスチックからなる透明性の高いフィルムが好ましく、具体的には、ポリエステル、ポリエチレン、ポリウレタン、塩化ビニル、ポリカーボネート等のフィルムが挙げられる。

支持体の厚みは、支持体として十分な強度が得られる厚みを有していれば特に制限はないが、約５〜２００μｍ程度が好ましく、また、支持体の透明度は、可視光透過率において３０％以上であるのが好ましい。また、支持体は、微生物の増殖に必要な酸素透過性を有することが重要であり、酸素透過度が１０００ｍＬ／ｍ^２／ｄ／Ｍｐａ以上であるのが好ましい。

本発明で使用する粘着シートは、従来公知の方法で製造することができる。例えば、粘着剤を含有する溶液を、剥離ライナーに塗布し、室温から２００℃で乾燥させた後、得られた粘着層の表面に支持体用のフィルムを貼り合わせるか、又は粘着剤を含有する溶液を、支持体用のフィルムに直接塗付し、室温から２００℃で乾燥させた後、得られた粘着層の表面に必要に応じて剥離ライナーを積層して、支持体及び粘着層を含むシート状原反を得、これを粘着シートの外枠の形状で打抜くことで製造することができる。なお、粘着層の形成は、カレンダー法、キャスティング法や押出し成形法等の方法を用いてもよい。

なお、本発明で使用する粘着シートは、被験面に圧着するまでは、粘着面が剥離ライナーで保護されているのが好ましい。剥離ライナーの材質は、粘着シートの使用時に粘着層から容易に剥離できるものであれば特に限定されない。具体的には、粘着層との接触面を剥離処理した中実或いは多孔性のプラスチックシート（フィルム）、上質紙又はグラシン紙とプラスチックフィルム（例えば、ポリオレフィンフィルム）とのラミネートフィルム等が挙げられる。また、本発明においては、粘着シートに電子線あるいはγ線等の放射線を照射することにより、滅菌することと同時に粘着層に用いる高分子化合物に架橋を施すことができる。また、滅菌した状態で細菌遮断性包材に封入すること等により、無菌状態を保持した形態をとることもできる。

[寒天培地]
本発明において、粘着シートの微生物捕集面（粘着面）を接触させる寒天培地としては、例えば、標準寒天培地、ソイビーン・カゼイン・ダイジェスト寒天培地（ＳＣＤ寒天培地）、ＳＣＤＬＰ寒天培地、Ｒ２Ａ培地（水質検査用）、マンニット食塩寒天培地（ぶどう球菌用）、デソキシコレーレート寒天培地、ポテトデキストロース寒天培地、サブロー・ブドウ糖寒天培地等が挙げられる。通常、寒天培地は、常法に従って、シャーレ等の容器底面に沿って平板状に形成する。かかる寒天培地の厚みは、特に制限はされないが、後述の実施例からも分かるように、寒天培地の厚みは、粘着シートと寒天培地からなる積層物を寒天培地側からスキャナで撮像して、粘着シートの粘着面上でのコロニーの形成状況やゴミ等の異物の存在状況を認識できるデジタル静止画像情報（画像データ）を得る際のコロニーやゴミ等の読取り感度に影響する。従って、粘着シートと寒天培地からなる積層物を寒天培地側からスキャナで撮像することを予定する場合、スキャナの走査能力や寒天培地の種類等によっても異なるが、一般に、寒天培地の厚みは０．２〜１０ｍｍ程度が好ましく、０．５〜４ｍｍ程度がより好ましい。
なお、後述のシート状インキュベータを使用して微生物を培養する際に使用するシート状寒天培地とは、プラスチックフィルムの所定幅方向の両縁部にギャップ調整のために粘着テープを所定の厚さとなるように貼付し、その内側に寒天培地を流し込み、その上からプラスチック板を積層することによって得ることができる。

[スキャナ]
本発明で使用するスキャナの撮像方式等は特に制限されず、固体撮像素子を使用した一般的なイメージスキャナ（汎用のイメージスキャナ）を使用することができる。また、後述の実施例で使用しているように、原稿台（コンタクトガラス）固定タイプのスキャナであれば、原稿台（コンタクトガラス）上に粘着シートと寒天培地の積層物を載置して積層物の撮像を行えるので、原稿台（コンタクトガラス）固定タイプのスキャナが撮像操作の容易性の点で好ましい。なお、撮像対象に対してスキャナそのものを移動させて撮像を行うタイプのスキャナ（所謂、“ハンディタイプ”のスキャナ）も使用可能である。但し、この場合は、寒天培地にスキャナを接触させて移動させると寒天培地の形状を維持できなくなる虞があるので、スキャナを粘着シートの支持体に接触させて、積層物を粘着シート側から撮像するのが好ましい。なお、寒天培地側からスキャナを被接触で撮像（スキャニング）するようにしてもよい。

［微生物の検出操作］
試験対象の微生物は、増殖能を有する微生物であり、一般細菌、病原性細菌、食中毒細菌等の細菌類およびカビ、酵母等の真菌類等が含まれる。

微生物のサンプリング操作は、例えば、固体表面や環境表面、ヒトの手掌等の皮膚表面等の被験面に粘着シートの粘着面を圧着、剥離して粘着面に微生物を捕集するか、或いは、メンブレンフィルターを用いて水系サンプルから微生物を濾過捕集し、該メンブレンフィルターに粘着シートの粘着面を圧着、剥離することで、粘着面に微生物を捕集する。

なお、本発明でいう「固体表面」とは、様々な環境下で取扱われる設備や器具等の固体状物品の表面のことであり、「環境表面」とは、例えば医薬品や食品の製造工場や病院等の建造物内の壁や床の表面等の衛生的であるべき環境中の種々の固定面のことである。なお、「固体表面」と「環境表面」を総称して「環境面」と呼ぶことがある。また、「水系サンプル」とは、例えば、井戸水、ミネラルウオーター等の天然水、水道水、ＲＯ（Reverse Osmosis)水等の他、半導体製造用水等の種々の産業分野で使用される水が挙げられる。

次に、微生物を捕集した粘着シートの粘着面を寒天培地に接触させ、測定対象の微生物に適した培養温度で培養し、コロニーを形成させる。そして、コロニー形成後の粘着シートと寒天培地の積層物を粘着シート側または寒天培地側からスキャナで撮像して、粘着シートの粘着面（微生物捕集面）におけるコロニーの形成状況を示す被験画像（画像データ）を得、次いで、かかる被験画像（画像データ）を解析してコロニー数を判定する。

なお、被験面や水系サンプル中に存在するゴミ等の異物が粘着面に微生物とともに捕集されて、被験画像中でのコロニーと異物との区別が容易でなくなる等の、被験面や水系サンプル中に存在するゴミ等の異物がコロニーの計数に悪影響を及ぼすことが懸念される場合は、コロニーを形成する前の粘着シートと寒天培地からなる積層物（すなわち、微生物を捕集した後の粘着シートの粘着面を寒天培地に接触させて積層した積層物）をスキャナで撮像して、粘着シートの粘着面（微生物捕集面）上での異物の存在状況を示すブランク画像（画像データ）を得、かかるブランク画像（画像データ）を解析して異物数を判定し、前記のコロニー数の判定結果からかかる異物数の判定結果を差し引くことで、最終的にコロニー数を判定するのが好ましい。このように、コロニーを形成する前の粘着シートと寒天培地の積層物をスキャナで撮像して得られた画像をブランク画像として利用することで、より正確にコロニー数を判定することができる。

また、通常は、シャーレに形成した平板状の寒天培地に微生物捕集後の粘着シートの粘着面を接触させ、この状態でシャーレとともに寒天培地と粘着シートの積層物をインキュベータ内に入れて微生物を培養した後、インキュベータから寒天倍地と粘着シートの積層物をシャーレごと取り出し、これをスキャナにセットして積層物の撮像を行うが、シート状インキュベータを使用することで、スキャナのコンタクトガラス上に、微生物捕集後の粘着シートの粘着面にシート状寒天培地を載置した積層物を載せ、さらにこの積層物の上にシート状インキュベータを配置してコロニーを形成させた後、シート状インキュベータを取外して、スキャナで積層物の撮像を行うようにしてもよい。こうすることで、作業時間が短縮し、作業の煩雑さも軽減される。なお、ブランク画像を得る場合には、シート状インキュベータを配置する前に粘着シートとシート状寒天培地の積層物の撮像操作を行えばよい。

本発明で使用するインキュベータやシート状インキュベータは、特に限定されず、従来から寒天培地上で微生物を培養する際に使用されてきた汎用のものを使用すればよい。

本発明で使用するスキャナの走査能力（解像度）は、粘着シートや寒天培地の材質や厚みなどによっても異なるが、粘着シートの粘着面上でのコロニーの存在状況やゴミ等の異物の存在状況を認識し得る画像データを得るためには、スキャナの走査能力（解像度）は１００ｄｐｉ以上であるのが好ましく、３００ｄｐｉ以上であるのがより好ましい。また、原稿台（コンタクトガラス）固定型のスキャナは、通常、スキャナの蓋部の反射面は白色であるが、コロニーやゴミ等の異物の存在状況を認識できる画像データ（被験画像、ブランク画像）を確実に得るためには、コロニーや異物とその背景面とのコントラストが高いほうが好ましいので、寒天培地又は粘着シート越しに該背景面となるスキャナの蓋部の反射面は黒色面とするのが好ましい。

スキャナで撮像して得られた画像データ（被験画像、ブランク画像）は、コンピュータに取り込み、画像解析ソフトで二値化処理してから、モニタに画像表示させ、モニタの画面上で粒子（コロニー、異物）を計数する。画像データの二値化処理を行うことでコロニーや異物を容易に計数することができる。なお、自動化ソフトを使用することで粒子（コロニー、異物）を自動計数することも可能である。

本発明の増殖能を有する微生物の検出方法は、様々な環境中の設備や器具等や建造物内の壁や床の表面等に付着した増殖能を有する微生物を容易にサンプリングでき、しかも、その微生物量を迅速かつ簡便に測定できるので、例えば、食品ならびに医薬品業界における製品の品質管理や作業環境の衛生微生物学的なモニタリング及び作業従事者の衛生管理状態のモニタリングに適用することができる。

本明細書中の物性、特性等の測定方法は次の通りである。
１．粘着層表面の平滑度（表面粗さ）
電子顕微鏡で粘着シートの断面を観察して、粘着層表面における凸部の頂点から凹部の最下点までの距離を測定する。この測定を粘着シートの縦横方向の断面において、数箇所ずつ計測し、これらの平均値を求めた。

２．支持体の酸素透過度
透過セル及び酸素検出器を備えた酸素透湿度測定装置を用いて、透過酸素量を測定し、ＪＩＳ Ｋ ７１２６に従って求めた。

以下に実施例を挙げて、本発明をさらに具体的に説明するが、これらは単なる例示であって本発明の範囲を何ら制限するものではない。

（実施例１）
１．粘着シートの作製
トルエン中、イソノニルアクリレート／２−メトキシエチルアクリレート／アクリル酸（６５／３０／５仕込み重量比）混合物を２，２’−アゾビスイソブチロニトリルを重合開始剤として共重合することにより、ゲル分率４０％（ｗ／ｗ）の共重合物のトルエン溶液を得た。この溶液を、乾燥時の厚みが２０μｍとなるように２５μｍ厚のポリカーボネートフィルムからなる透明な支持体（酸素透過度：３９５００ｍＬ／ｍ^２／ｄ／Ｍｐａ）に塗布し、１３０℃で５分間乾燥させて、粘着層を形成した。次いで、剥離処理を施したポリエチレンテレフタレートフィルム（７５μｍ厚）で粘着層表面を被覆保護するように貼り合わせた。粘着層表面の平滑度は約４μｍであった。

２．寒天平板培地の作製
トリプトソーヤ寒天培地（ＳＣＤ寒天培地；日水製薬（株））の処方に従い、培地厚みの異なる寒天平板培地を作製した。９０ｍｍシャーレにそれぞれ、３、６、１２、１５、２１、６０ｍＬ培地を入れ、寒天が固まった後、寒天の厚みを実測し、培地厚みとした。

３．寒天培地の厚みとゴミの視認性の検討
寒天培地をスキャナで撮像して得られる画像上でのゴミの視認性について検討した。方法は厚みの異なる寒天培地上に１〜２ｍｍのプラスチック粒子を散在させ、寒天培地の粒子散在面とは反対面側からスキャナで撮像し（セイコー・エプソン社製、ＧＴ−Ｘ７００（解像度：３００ｄｐｉ））、画像上に粒子が判定できるか否かをみた。なお、スキャナの蓋部の反射面には黒色紙を挿入した。

図１はスキャナで撮像して得られた画像データをモニタ（画面）に表示したものであり、図１（ａ）は寒天厚みが０．５〜２ｍｍのときの画像、図１（ｂ）は寒天厚みが２〜３ｍｍのときの画像、図１（ｃ）は寒天厚みが４〜５ｍｍのときの画像、図１（ｄ）は寒天厚みが１０ｍｍのときの画像である。寒天厚みが４ｍｍ未満のときにゴミの視認性は良好であった。

４．バックグラウンドの補正を考慮した微生物の検出
上記１．で作製した粘着シートの剥離ライナーを剥がし、剥離後の粘着シートのサンプリング面（粘着層面）を測定対象面（人の顔の頬と手の甲）に圧着し、剥離した。

次に、上記の粘着シートのサンプリング面（粘着層面）を上記２．で作製した寒天培地（厚み３ｍｍ）に積層し、この状態で、該積層物をスキャナ（セイコー・エプソン社製、ＧＴ−Ｘ７００）にセットし、撮像（解像度：３００ｄｐｉ）を行って、画像データ（ブランク）をコンピュータに取り込んだ。そして、画像データを二値化処理した後、モニターに画像を表示させ、モニターの画面上で粒子数を計数した。次に、前記粘着シートと寒天培地の積層物を３５℃の温度下に置いて２４時間微生物を培養し、培養後の積層物を再びスキャナにセットし、撮像を行って、画像データ（被験画像）をコンピュータに取り込み、二値化処理した後、モニターに画像を表示させ、モニターの画面上で粒子数を計数した。そして、かかる培養前後の粒子数の差を算出し、これを被験面上の増殖能を有する微生物量とした。なお、撮像の際、スキャナの蓋部の反射面には黒色紙を挿入した。また、二値化処理の条件は、Adobe Photoshop Elements(Adobe社）の色調補正の２階調化において、境界しきい値を１２８とした。

図２は人の顔の頬に粘着面を圧着、剥離して微生物をサンプリングした粘着シートの粘着面を寒天培地に積層した積層物をスキャナで撮像して、コンピュータの画面上に表示したもので、図２（ａ）は微生物を培養する前の画像、図２（ｂ）は微生物を培養した後（コロニー形成後）の画像である。また、図３は人の手の甲に粘着面を圧着、剥離して微生物をサンプリングした粘着シートの粘着面を寒天培地に積層した積層物をスキャナで撮像して、コンピュータの画面上に表示したもので、図３（ａ）は微生物を培養する前の画像、図３（ｂ）は微生物を培養した後（コロニー形成後）の画像である。図から分かるように、粒子が明確に映し出され、粒子の計数を迅速かつ容易に行うことができた。

以上の操作の結果、顔の頬の微生物量（コロニー数）は２８個／ｃｍ^２、手の甲の微生物量（コロニー数）は３２個／ｃｍ^２と判定した。

なお、撮像の際、スキャナの蓋部の反射面を白色にして同様の操作を行ったが、二値化処理後の画像はコントラストが弱くなり、粒子の計数が容易でなかった。

（実施例２）
上記実施例１の１．で作製した粘着シートの粘着面に正方形（１０ｃｍ^２）の枠を描き、該粘着シートの粘着面（正方形の枠内を含む領域）を種々の環境面（トイレ：照明スイッチ、手洗いカラン、ドアノブ／部屋：床面、照明スイッチ等）に圧着、剥離して、微生物のサンプリングを行った。そして、各微生物サンプリング後の粘着シート毎に、粘着シートの粘着面を上記実施例１の２．で作製した寒天培地（ＳＣＤ培地、厚み：３ｍｍ）の上に積層し、得られた積層物について、実施例１と同様の、スキャナによるブランク画像データの撮像と解析（粒子数の判定）、微生物の培養、及び微生物培養後のスキャナによる被験画像データの撮像と解析（粒子数の判定）を順次行って、コロニー数を算出した。なお、微生物の培養は３５℃で４８時間行った。

（比較例１）
実施例２での種々の被験面（環境面）と同じ被験面に対して、市販の寒天培地（ＳＣＤ培地、厚み：４〜５ｍｍ）を直接接触して、微生物を寒天培地上で４８時間培養（３５℃）し、培養後のコロニーを目視で計数するスタンプアガー法にて、被験面上の微生物量を計数した。なお、シャーレ周辺部の凹凸等がノイズとなり、コロニー計数を画像処理で行えなかったので、目視で計数するしかなかった。

（ａ）〜（ｄ）は、それぞれ、表面に粒子を散在させた寒天培地をスキャナで撮像して得られた画像データをモニタ（画面）に映出した画像である。 粘着面を人の顔の頬に圧着、剥離した後の粘着シートと寒天培地の積層物をスキャナで撮像し、モニタ（画面）に映出した画像であり、（ａ）は微生物を培養する前の画像、（ｂ）は微生物を培養した後（コロニー形成後）の画像である。 粘着面を人の手の甲に圧着、剥離した後の粘着シートと寒天培地の積層物をスキャナで撮像し、モニタ（画面）に映出した画像であり、（ａ）は微生物を培養する前の画像、（ｂ）は微生物を培養した後（コロニー形成後）の画像である。 実施例２と比較例１の微生物量検出結果（コロニー数の判定結果）を対比した図である。

Claims (4)

1. 次の各工程を含む、増殖能を有する微生物の検出方法。
   １）粘着シートの粘着面に微生物を捕集する工程、
   ２）前記微生物を捕集した後の粘着シートの粘着面を寒天培地と接触させた状態で微生物の培養を行い、コロニーを形成させる工程、
   ３）前記コロニーを形成した後の粘着シートと寒天培地とからなる積層物をスキャナで撮像して被験画像を得る工程、
   ４）前記被験画像を解析してコロニー数を判定する工程、
2. 次の各工程を含む、増殖能を有する微生物の検出方法。
   １）粘着シートの粘着面に微生物を捕集する工程、
   ２）前記微生物を捕集した後の粘着シートの粘着面を寒天培地に接触させた状態で、当該粘着シートと寒天培地からなる積層物をスキャナで撮像してブランク画像を得る工程、
   ３）前記微生物を捕集した後の粘着シートの粘着面を寒天培地と接触させた状態で微生物の培養を行い、コロニーを形成させる工程、
   ４）前記コロニーを形成した後の粘着シートと寒天培地からなる積層物をスキャナで撮像して被験画像を得る工程、
   ５）前記ブランク画像と被験画像をそれぞれ画像解析し、その解析結果に基づいてコロニー数を判定する工程、
3. 微生物捕集工程が、被験面に粘着シートの粘着面を圧着、剥離して被験面に存在する微生物を捕集する工程である、請求項１又は２に記載の微生物の検出方法。
4. 微生物捕集工程が、メンブレンフィルターを用いて水系サンプルから微生物を濾過捕集し、該メンブレンフィルターに粘着シートの粘着面を圧着、剥離して、水系サンプル中の微生物を粘着シートの粘着面に捕集する工程である、請求項１又は２に記載の微生物の検出方法。

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