CN101781673A

CN101781673A - 滤膜浓缩自动计数法

Info

Publication number: CN101781673A
Application number: CN200910051281A
Authority: CN
Inventors: 冯道伦; 许乐平; 邢小丽
Original assignee: Shanghai Maritime University
Current assignee: Shanghai Maritime University
Priority date: 2009-05-14
Filing date: 2009-05-14
Publication date: 2010-07-21

Abstract

一种滤膜浓缩自动计数法，包括步骤如下：现场采取船舶压载水样；采用生物过滤网，现场过滤，得浓缩水样；采用过滤器对浓缩水样进行真空抽滤，过滤器的滤膜的厚度为10μm，孔径为10μm，孔径大小一致，过滤时间约15min；过滤后，将滤膜置于显微镜下进行显微成像；利用工作站和软件，将显微镜拍摄的局部区域图像拼合起来用于计数；软件自动计数，利用图像的自动计数功能，对拼合图像中尺寸≥50um的物体数量进行自动计数，并与压载水活体生物指标进行比较；软件自动计数后，活体生物超过指标时，检测人员再用肉眼计数活体生物的个数。本发明的准确度更高，耗时短，工作量小。

Description

滤膜浓缩自动计数法

技术领域

本发明涉及一种滤膜浓缩自动计数法，具体涉及一种船舶压载水滤膜浓缩自动计数法，属于环境微生物监测技术领域。

背景技术

船舶运输超过世界商品运输量的80％，每年约有100亿吨的压载水在全球转移。据估计，每天约3000余种动、植物通过压载水在全世界范围内进行迁徙。船舶压载水造成的海洋入侵物种对海洋环境的侵害，已被全球环境基金组织确认为危害海洋的四大威胁之一(白敏冬等，2005)。

由于压载水问题的严重性，各国都对此比较重视，并投入了大量和人力和物力进行压载水的研究，2004年2月，国际海事组织(IMO)更是在伦敦召开的外交大会上通过了《国际船舶压载水及沉积物控制与管理公约》，该公约规定了船舶压载水的排放标准，即D-2，压载水性能标准。在未来的几年，该公约在超过一定数量的成员国签字后将生效。为此，众多研究人员都加入的压载水的研究中来。

但另一方面，尽管IMO规定了压载水中排放的生物限值，但这个指标更多的是一个各成员国相互妥协的结果。尤为重要的是，由于标准中规定的以及许多较干净海水中的实际生物量浓度很低，故需要采取大量的压载水并将其浓缩，其浓度才可能达到现有计数方法的最低限值；而且，由于船舶靠港费用高昂，并可能需要频繁的即时排放压载水，所以计数方法必须快速；此外，D-2标准规定只对活体生物进行计数，故在计数的同时还必须能区分死活。简而言之，对船舶压载水中生物计数的要求是：快速，准确，能区分死活。D-2标准分别对10～50um以及≥50um进行了规定，由于≥50um所允许排放的标准值只有10个/m³，生物量浓度非常低，是检测的难点所在，本专利只涉及对≥50um微生物的检测计数。

现有的计数方法大体可以归为两类：直接和间接计数法。根据是否用到显微镜，直接法可大致分为两类：一类是需要培养的，可称之为培养法，另一类需要用到显微镜，可称之为镜检法。

培养法主要包括三种，分别说明如下。

稀释培养测数法(MPN)：1915年，McCrady首次发表了用MPN法来估算细菌浓度的方法，这是一种应用概率理论来估算细菌浓度的方法。具体过程为：将待测样品经多次10倍稀释后，一定量菌液中细菌可以极少或无菌，然后每个稀释度取3～5次重复接种于适宜的液体培养基中。培养后，将有菌液生长的最后3个稀释度中出现细菌生长的管数作为数量指标，由最大或然数表上查出近似值，再乘以数量指标第一位数的稀释倍数，即为原菌液中的含菌数。目前，我国仍普遍将MPN法用于大肠菌群，大肠杆菌等的检测。

稀释平板测数法：这是另外一种广泛使用的生物计数方法。具体过程如下：将一定体积的待测水样经过适量的稀释，涂布或者倒入至装有培养基的平板中培养24小时，一个微生物在这段时间内可以长成一个菌落，在稀释倍数已知的情况之下，计算培养基上形成的菌落个数，便可以知道水样中的存活细菌总数。

滤膜培养法：使用孔径小于细菌个体的过滤膜过滤，将微生物集中在滤膜上，接着再将滤膜置于培养基上或浸润有液体培养基的垫状物上培养；计算在滤膜上形成的菌落数就可知样品中的活菌数。该技术在分析水样中低生物量浓度的标本时特别有用。

相对其它方法，培养法都能准确的计数出活体生物的个数，在计数某一类对营养需求相似的微生物时具有较高的可信度。但缺点也很明显，耗时长，且受限于物理和化学因素，各方法中配制的培养基无法满足所有微生物的营养需求，只能反应出水样中部分微生物的密度，很可能出现所测出的菌落数低于实际菌落数的情况。

镜检法：这其中目前最简单，使用最为广泛的是滴片法。将一滴准备好的生物样品滴到载玻片上，盖上盖玻片，即可进行观察计数(图1和图2)基础上，众多研究人员还开发了其它直接计数法。这些方法是利用不同的改进型计数装置(如：Sedgwick-Rafter counting cell、Palmer-Maloney nanoplankton cell、standard medical hemacytometer等)，在显微镜下直接观察，计算微生物细胞的总数量。每种计数装置都有其适用范围。Sedgewick Rafter cell亦是一种使用非常广泛的计数装置，适于计数50-500μm范围内的生物(Guillard，1973，1978；Rashash and Gallagher，1995)。Petroff-Hasser血细胞计数器用于直径＜1-5μm生物的计数(Guillard，1973)；标准医学血细胞计数器能用于直径在5-75μm范围内生物的计数(Guillard，1978)；Palmer Maloney计数装置适用于5-150μm的生物。

此外，还有一种滤膜浓缩计数法(Fournier，1978)。该方法的具体过程如下：参见图3，将薄膜过滤器安装在过滤器支架上，通过真空抽滤，水样品被过滤穿过薄膜过滤器，将待测微生物样品中的微生物截留在滤膜上，将滤膜放在显微镜下观察计数。相比较直接计数法，该方法具有更多的优点。由于将微生物截留在滤膜的过程，也是浓缩的过程，且浓缩后的滤膜可直接用于镜检计数，省却了中间转移的环节，所以更为快速，准确(Fournier，1981)。

直接计数法的优点包括：利用计数室(板)容易、迅速、成本低；且能观察细胞大小及部分形态特征。但是，由于计数室是在特制的玻璃板上制成有一定深度的凹槽，并在计数室底部刻有小方格，所以样品中细胞数量不能太少，否则会影响计数的精确度；此外，该检测方法依靠人眼来判别生物体的死活，这也可能会影响到计数的准确度。

间接观测法：

分光光度法：利用分光光度计测定含微生物悬浮液的吸光度。先测量一连串不同浓度的同种微生物悬液吸光度，做出标准曲线。随后测量同种未知浓度微生物悬液的吸光度值，依照之前做出的标准曲线，推算出悬液的生物量浓度。这是较为快速而方便的微生物计数的方法，不过大多情况下，这种方法难以区分微生物的死活。

电子计数器：对个体较大的微生物，可用电子计数器进行直接计数。其原理是测定小孔中液体的电阻变化，小孔仅能通过一个细胞，当一个细胞通过这个小孔时，电阻明显增加，形成一个脉冲，自动记录在电子记录装置上。该法测定结果较准确，但它只识别颗粒大小，而不能区分是否为细菌。在对电子计数器的研制过程中，交错发明和发展了自动血细胞计数器和流式细胞仪，这几种仪器的基本原理大体相似。这几种方法共有的优点是：计数快速，在计数的同时还能获得细胞形状，大小等信息，结合荧光技术，还可能快速区分同种生物的死活。

在现有的技术方法中，培养法能准确的计数出活体微生物的个数，但这种方法耗时太长，且当水样的生物种类多时，找不到能同时满足多种生物营养需求的培养基；间接法能非常快速的计数，但不能同时计数多种混合微生物中的活体。镜检法的准确度和耗时介于前两者之间。综上，尽管用于微生物计数的方法很多，但到目前为止，还没有找到一种(Lund et al.，1958；Paxinosand Mitchell，2000)能在任何条件下，实现任何检测目的微生物计数方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种滤膜浓缩自动计数法，以解决现有所存在的诸多不足之处。本发明要解决的技术问题，考虑到船舶压载水生物浓度检测的特殊性，提供一种微生物计数方法，特别适用于船舶压载水中≥50um的活体微生物量的计数方法。本发明能同时满足以下条件：

准确：要求检测方法能较为准确的计数出活体微生物的个数；

快速：这是排放压载水的实际需要，同时能为船务公司节约大量的靠港费用；

成本低，使用方便：不久的将来，对船舶压载水的生物检测将是一项例行工作，满足此要求能节省大量的人力和物力。

在背景技术部分的分析中，结合船舶压载水生物检测的要求，可以看出，目前还没有一种计数方法，能完全满足船舶压载水检测的要求。

考虑到鉴别微生物死活的需要，现有的间接法首先被剔除；另一方面，尽管培养法准确度高，但至少24h的培养时间使得其难以用于日常的检测工作。故此，尽管较之培养法，镜检法的准确度稍差些，却也能较为准确的计数出活体生物个数，故此，我们考虑从镜检法中选择一种方法，对其进行改进，用于船舶压载水的活体生物检测。

进一步选择的首要依据是耗时，传统的镜检法要先浓缩，然后转移到计数框中进行镜检，单个样品光镜检本身就耗时30～40min，如有要做三个重复样，耗时往往超过2h，且耗费大量人力在镜检上。故此，在镜检法中挑选耗时最短的滤膜浓缩计数法进行改进。

本发明所需要解决的技术问题，可以通过以下技术方案来实现：

一种滤膜浓缩自动计数法，包括步骤如下：

(1)现场采取船舶压载水样；

(2)采用生物过滤网，现场过滤，得浓缩水样；

(3)采用过滤器对浓缩水样进行真空抽滤，所述过滤器内设置滤膜；

(4)过滤完全后，将滤膜置于显微镜下进行显微成像，将整个滤膜分复数个局部区域图像，将任一局部区域图像在显微镜下的图像拍摄下来；

(5)显微成像后，利用工作站和软件，将显微镜拍摄的局部区域图像拼合起来用于计数；

(6)软件自动计数，利用图像的自动计数功能，对拼合图像中尺寸≥50um的物体数量进行自动计数；并与压载水活体生物指标进行比较。

(7)人工看图计数，软件自动计数后，活体生物超过指标时，检测人员再用肉眼计数活体生物的个数。

步骤(1)中每个样品都必须采集不少于1m³的压载水样。由于船舶压载水中≥50um的活体微生物量很少，通常在海水中的浓度为100个/m³。

步骤(2)中的浓缩水样为100ml。浓缩的样品集中在生物过滤网的底部，将底部阀门打开，用样品瓶将100ml浓缩样品移至样品瓶，带回实验室。

步骤(3)中滤膜的厚度为10um，孔径为10um，孔径大小一致，过滤时间约15min。

步骤(5)进行图像拼合的时间不超过15min。

步骤(6)压载水活体生物如果＜10个，表明压载水活体生物个数达标。

步骤(7)压载水活体生物如果＞10个，检测人员再用肉眼计数活体生物的个数，人工看图计数时间不超过15min。

至此，单个样品的检测完毕，样品在实验室从开始检测到完成，共计耗时最多不超过45min。

以做三个重复样品为例：单个样品所需时间约45min，但完成三个样品所需时间却只有要75min。

表1滤膜浓缩自动计数法检测单个样品和多个样品的耗时对比

本发明的有益效果

与其它的镜检法相比，滤膜浓缩自动计数法具有如下优点：

1.准确度更高。传统的镜检法在沉降过滤浓缩后，还要将浓缩的样品转移到计数框，这个环节不可避免会产生人为误差；而本方法的样品浓缩和过滤同时实现，微生物截留在滤膜上，直接用于观察，无需二次转移，故可提高准确度；

2.耗时短，工作量小。本方法将浓缩样品在实验室浓缩和固定在滤膜上，一步到位，传统镜检法沉降浓缩所需最短时间约2h，滤膜过滤只需15min，节省了约105min。此外，还节省了传统镜检法所需的样品转移时间(约5min)；共计节约110min左右的时间；

利用显微自动成像，并利用工作站和软件自动拼合，自动或在屏幕上观察拼合图像计数，较之镜检观察，检测人员的眼睛使用强度大幅降低，可进一步大幅减轻检测人员的工作强度，同时拼合的图像还可保存用于备查重计；

3.多个样品耗时更省：在需要做多个样品时，可边成像拼合，边计数上一个样品；增加一个样品，耗时增加一个样品的计数时间。

附图说明

以下结合附图和具体实施方式来进一步说明本发明。

图1为载玻片和盖玻片的主视图。

图2为载玻片和盖玻片的侧视图。

图3为滤膜浓缩计数法的操作示意图。

图4为生物过滤网结构示意图。

图5为Isopore滤膜和传统滤膜。

具体实施方式

为了使本发明的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体图示，进一步阐述本发明。

船舶压载水滤膜浓缩自动计数法的具体操作过程如下：

以检测船舶压载水样为例，现场采取船舶压载水样1m³→现场过滤，得浓缩水样约100ml→实验室里真空抽滤浓缩水样→滤膜显微成像→工作站拼合图像→软件自动计数→人工看图计数。

由于船舶压载水中≥50um的活体微生物量很少，通常在海水中的浓度为100个/m³，所以每个样品都必须采集不少于1m³的压载水样，水样为海水

在现场用No.438030型号，孔径为50um的生物过滤网(德国HYDRO-BIOS公司)对压载水样进行过滤浓缩，如图4所示，吊环1套在固定的装置上，压载水样1m³将倒入生物过滤网的椎体2内，将浓缩的样品集中在生物过滤网的椎体2的底部，将底部阀门3打开，用样品瓶将浓缩样品移至样品瓶。

带回实验室，用Satorius16306玻璃过滤器进行浓缩过滤，所用滤膜为厚度为10um，孔径为10um，孔径大小一致，透光性好的，的“ISOPORE”过滤膜，过滤时间约15min，参见图5。过滤的压力差越大，时间越短，但细胞变形也越厉害，为将细胞的变形降低到可接受的范围，可以适当降低过滤压力差为50KPa，即便这样，消耗的时间也不会超过30min。

过滤完全后，将滤膜置于Nikon 90I全自动显微镜下进行显微成像，后台同时利用工作站(配置不低于：CPU：英特尔(R)酷睿(TM)2Duo E6600(2.40G/1066FSB/4MB)；内存：2GB(2x1GB)ECC双通道DDR2 667MHzSDRAM；显卡：256MB PCIe x16 NVIDIA Quadro FX 3500图形卡，支持双显DVI或VGA；硬盘：160GB SATA(10,000RPM))和购置的Nikon NIS-ElementsAR 3.0软件(或其它具有此功能的软件)的图像拼合功能，将显微镜拍摄的局部区域图像拼合起来，时间不超过15min。

随后检测人员利用Nikon NIS-Elements AR 3.0软件(或其它具有此功能的软件)的图像自动计数功能，对拼合图像中尺寸≥50um的物体数量进行自动计数，如果＜10个，表明压载水活体生物个数达标，如果＞10个，检测人员再用肉眼计数活体生物的个数，通常这个过程耗时约15min。至此，单个样品的检测完毕，样品在实验室从开始检测到完成，共计耗时最多不超过45min。

如表1所示，完成单个样品所需时间约45min，但完成两个样品需要60min，完成三个样品所需时间只要75min。

本发明不是简单的重复滤膜过滤法，而是针对滤膜过滤法存在的问题，进行创造性的改进：

问题一：在过滤过程中，如果生物浓度较高，还存在微生物相互聚集，重叠的现象，影响计数的准确度(Fournier，1978)；

解决：由于船舶压载水中目标生物量浓度比较低，因此，这个问题对准确度造成的影响可以忽略不计；

问题二：过滤过程中，细胞难以均匀的分布在滤膜上，不能参照计数框的计数方式，选取几个区域读数，做平均即可；

解决：由于压载水样中的生物量浓度很低，所以，大多数情况下，过滤到滤膜表面的生物量个数很少，通常在0～100个之间，即使用计数框，也必须将整个框内的生物全部计数，否则误差会比较大。所以解决的办法是全部计数，由于生物个数较少，计数耗费的时间也会相对的缩短；

此外，传统的肉眼观察耗时，耗人力。为此，采用显微自动成像系统，将整个滤膜分复数个局部区域图像，将任一局部区域图像在显微镜下的图像拍摄下来，将拍摄到的所有图像利用软件自动拼合，将拼合的图像用于计数，这可大大降低检测人员的工作强度，并提高工作的效率。

问题三：过滤可能导致细胞变形，难以辨认；

解决：过滤过程实际上也是一个浓缩过程，对于其它的镜检法，通常是自然沉降进行浓缩，这种方式依据微生物大小的不同，耗时通常在2～24h之间，而滤膜浓缩所需的时间远小于2h，过滤的压力差越大，时间越短，但细胞变形也越厉害，为将细胞的变形降低到可接受的范围，可以通过适当降低过滤压力差，延长过滤时间实现。即便这样，消耗的时间也不会超过30min。

问题四：传统的滤膜厚度较大，光线难以透过滤膜，在光学显微镜下成像不清晰；而且，滤孔大小不一致，可能会将目标尺寸以外的微生物截留在滤膜上，造成计数过大。

解决：本方法选用了Millipore公司的聚碳酸酯Isopore滤膜。与传统滤膜(参见图5，右侧)不同，本发明采用的Isopore滤膜(参见图5，左侧)透光性好。该滤膜是在聚碳酸酯表面径迹蚀刻而成，具有如玻璃一般光滑的表面，可以进行清晰的样品观察。而且，Millipore独有的生产工艺保证了准确均一的孔径，可进行精确的依据孔径的分离。此外，Isopore滤膜具有很低的背景干扰，不会影响实验结果。Isopore滤膜是不吸湿的，可以很快干燥，减少实验中的等待时间。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。

Claims

1.一种滤膜浓缩自动计数法，包括步骤如下：

(1)现场采取船舶压载水样；

(2)采用生物过滤网，现场过滤，得浓缩水样；

2.根据权利要求1所述的滤膜浓缩自动计数法，其特征在于：步骤(1)中每个样品都必须采集不少于1m³的压载水样。

3.根据权利要求1所述的滤膜浓缩自动计数法，其特征在于：步骤(2)中的浓缩水样为100ml。

4.根据权利要求1所述的滤膜浓缩自动计数法，其特征在于：步骤(3)中滤膜的厚度为10um，孔径为10um，孔径大小一致，过滤时间约15min。

5.根据权利要求1所述的滤膜浓缩自动计数法，其特征在于：步骤(5)进行图像拼合的时间不超过15min。

6.根据权利要求1所述的滤膜浓缩自动计数法，其特征在于：步骤(6)压载水活体生物如果＜10个，表明压载水活体生物个数达标。

7.根据权利要求1所述的滤膜浓缩自动计数法，其特征在于：步骤(7)压载水活体生物如果＞10个，检测人员再用肉眼计数活体生物的个数，人工看图计数时间不超过15min。