CN108827891A - 船舶压载水微藻细胞生物量检测系统及方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种船舶压载水微藻细胞生物量检测系统及方法，该系统包括：进样室；进口与所述进样室出口连接的浓缩装置；进口与所述浓缩装置第一出口连接的废水箱；出口与所述浓缩装置第一出口连接的反冲洗装置；进口与所述浓缩装置第二出口连接的裂解室；进口与所述裂解室出口连接的流通池；进口与所述流通池出口连接的回收装置，及，光谱仪。本发明基于长光程流通池，利用分光光度法测叶绿素a的手段，设计了一种检测船舶压载水中10‑50μm微藻细胞生物的系统，具有装置结构简单，操作方便，检测过程快速高效，不依赖荧光染料、不受船舶摇晃等限制，可以为海事，检验检疫等执法部门提供一个对压载水进行有效快速监管的手段。

Description

船舶压载水微藻细胞生物量检测系统及方法

技术领域

本发明涉及船舶压载水微生物检测技术领域，具体涉及船舶压载水微藻细胞生物量检测系统及方法。

背景技术

随船舶压载水传播的外来生物的入侵已在世界范围内造成严重的环境危害和巨大的经济损失，因而受到越来越多的关注。IMO(国际海事组织)《压载水公约》已于2017年9月8日正式生效，海事主管机关即将对到港适用本公约船舶实施PSC检查。作为航运大国，公约生效与实施对我国海事管理机构履约能力提出了紧迫要求。

根据《压载水公约》，压载水标准分为两个层次，D-1标准即《船舶压载水更换标准》，D-2标准即《船舶压载水处理的生物和卫生标准》。D-1标准要求进行压载水交换的船舶满足一定的条件，即压载水容积的交换率至少为95％，或对每个压载舱注入并排除三倍容积的压载水量。该方法已被广泛采用，但它是压载水处理技术发展过程中的一种过渡性标准。D-2标准要求通过压载水处理设备对压载水中的有害生物及病原体进行杀灭，是船舶压载水排放控制的最终标准。该标准要求每立方米压载水中最小尺寸大于或等于50微米的可生存生物少于10个；每毫升压载水中最小尺寸小于50微米但大于或等于10微米的可生存生物少于10个。

此前国际海事组织海洋环境保护委员会(MEPC)71次会议为《压载水管理公约》的具体执行方案带来了很大变化——《MEPC69方案》与《MEPC70替代方案》的“折中方案”浮上水面。具体地来说：2017年9月8日及以后建造的新造船应于交付日起符合D-2标准(《船舶压载水处理的生物和卫生标准》，该要求对应于《MEPC69方案》)；对于新造船的船东而言，D-2标准将是绕不过的一道槛。

真正能支撑D-2标准的船舶压载水活体微生物快速计数方法还未见报道。目前使用最为广泛的方法是荧光探针染色+显微镜镜检。但该方法存在检测下限过高，只能适用于船舶压载水管理系统的性能测试，无法用于实际压载水的检测。该方法存在的另外问题是耗时，检测劳动强度大，且单个荧光探针无法对所有活体生物有效，结果的可靠性存疑。为此，众多学者，公司研究增加荧光探针数量，同时利用更为高效可靠的检测仪器，包括：流式细胞仪，微流芯片等来极大降低检测下限，提升计数结果的准确性，同时通过自动检测来降低检测人员的操作强度。但遗憾的是，目前的这些研究更多只是停留在实验室研究阶段，还无法应用到实践中。另一方面，压载水公约目前已经生效，而政府监管部门还缺乏有效的检测手段，去实现对船舶压载水排放的现场、实时监管。

在这一背景下，一个应急方案被世界各国提出，即假定船舶压载水中的活体微生物以光合的微藻为主，这样可以通过测定压载水中叶绿素的含量来快速，粗略的获取压载水中活体微生物的数量。

现有的现场快速检测手段主要有以下三种：荧光染料荧光强度检测法，叶绿素荧光强度检测法和基于微流控技术的叶绿素荧光检测法。

染料荧光强度检测法是通过对压载水样品进行荧光染料的染色后加入细胞裂解液，待样品中的微藻细胞充分裂解后，用荧光计检测相对荧光强度来检测微藻细胞含量的方法。这种方法使用荧光染料与微藻体内某些活性物质结合，根据所染荧光强度可判断微藻的活性，这种方法克服了人为观察微藻活性的缺点，某种程度上提高了准确性。但是此检测方法依赖荧光染料，且染色过程相对繁琐，需要具有专业知识的人员进行染色，因此检测成本相对较高，检测所需时间较长。

叶绿素荧光强度检测法是对检测样品进行浓缩，利用便携式的脉冲荧光测定仪测量浓缩样品中浮游生物的叶绿素荧光强度，从而判断压载水是否存在超标风险。此方法能够测定浮游植物细胞量，但压载水公约要求的存活水生物浓度很低，所以为了满足测量仪器的检测下限必须提高浓缩的倍数，因而耗时较长且此测量方法无法判断区分藻种，此外有研究表明，使用叶绿素荧光法测量出叶绿素a的含量，比实际值偏高。

基于微流控技术的叶绿素荧光检测法以微流控芯片技术为平台，利用激光诱导叶绿素荧光的原理，设计的一种船舶压载水中微藻细胞的检测方法。此方法能够实现微藻细胞快速检测的目的。此方法的本质仍是测叶绿素荧光，不同之处是利用微流控芯片作为平台实现对细胞的排序，并搭载光源和计数模块。此方法的测量结果在一定程度会受到仪器所使用的计数和分选设备型号的影响，例如仪器的激光强度、滤光器的差别。而压载水公约要求的存活水生物浓度很低，直接测量或许还存在进步的空间。

发明内容

本发明的目的是提供船舶压载水微藻细胞生物量检测系统及方法，以解决上述现有技术的问题。

为达到上述目的，本发明提供了一种船舶压载水微藻细胞生物量检测系统，其包括：进样室；进口与所述进样室出口连接的浓缩装置；进口与所述浓缩装置第一出口连接的废水箱；出口与所述浓缩装置第一出口连接的反冲洗装置；进口与所述浓缩装置第二出口连接的裂解室；进口与所述裂解室出口连接的流通池；进口与所述流通池出口连接的回收装置，及，光谱仪；

所述进样室和所述浓缩装置之间依次设置有取样阀和取样流量计；所述浓缩装置和所述废水箱之间依次设置有排液阀和取样泵；所述浓缩装置和反冲洗装置之间设置有冲洗阀；所述浓缩装置和所述裂解室之间依次设置有进液阀和进液泵；所述裂解室和所述流通池之间依次设置有裂解阀和进液流量计；所述流通池和所述回收装置之间设置有排水泵；所述浓缩装置的进口处设置有第一过滤器；所述浓缩装置的第一出口处设置有第二过滤器；所述第一过滤器的孔径大于所述第二过滤器的孔径。

上述的船舶压载水微藻细胞生物量检测系统，其中，所述流通池的光程为50cm-500cm。

上述的船舶压载水微藻细胞生物量检测系统，其中，所述第一过滤器的孔径为50μm；所述第二过滤器的孔径为10μm。

本发明还提供了一种如上述的船舶压载水微藻细胞生物量检测系统的方法，其包括以下步骤：

步骤1：将待测压载水样品导入进样室后，开启取样阀、排液阀和取样泵，将待测压载水样品泵入浓缩装置，进而使位于第二过滤器孔径和第一过滤器孔径之间的微藻细胞生物截留在浓缩装置中，得到浓缩样品，剩余液体排入废水箱；

步骤2：关闭取样阀、排液阀和取样泵，开启冲洗阀，使反冲洗装置内的纯水对浓缩装置的第二过滤器进行反冲洗，进而将残留在第二过滤器上的的微藻细胞生物冲洗至浓缩样品中；

步骤3：关闭冲洗阀，开启进液阀、进液泵和裂解阀，将浓缩样品通过未加入细胞裂解液的裂解箱后进入流通池；

步骤4：开启排水泵和光谱仪，使光谱仪对流通池内的浓缩样品在630nm、645nm、663nm和750nm波长下测定吸光度值，并判断浓缩样品在750nm波长下的吸光度值是否分别小于630nm、645nm和663nm波长下吸光度值的5％；若否，则降低待测压载水样品的浓缩倍数并重复步骤1-4；若是，则计算待测压载水样品中叶绿素a的含量，并执行步骤5；

步骤5：根据已建立的叶绿素a的含量与微藻细胞生物浓度对应关系的数据库，得到待测压载水样品中微藻细胞生物浓度。

本发明还提供了一种上述的船舶压载水微藻细胞生物量检测系统的方法，其包括以下步骤：

步骤1：将待测压载水样品导入进样室后，开启取样阀、排液阀和取样泵，将待测压载水样品泵入浓缩装置，进而使位于第二过滤器孔径和第一过滤器孔径之间的微藻细胞生物截留在浓缩装置中，得到浓缩样品，剩余液体排入废水箱；

步骤2：关闭取样阀、排液阀和取样泵，开启冲洗阀，使反冲洗装置内的纯水对浓缩装置的第二过滤器进行反冲洗，进而将残留在第二过滤器上的的微藻细胞生物冲洗至浓缩样品中；

步骤3：关闭冲洗阀和裂解阀，开启进液阀、进液泵；将浓缩样品泵入裂解箱后加入细胞裂解液，静置一段时间后开启裂解阀，经过裂解处理后的浓缩样品进入流通池；

步骤4：开启排水泵和光谱仪，使光谱仪对流通池内的浓缩样品在630nm、645nm、663nm和750nm波长下测定吸光度值，并判断浓缩样品在750nm波长下的吸光度值是否分别小于630nm、645nm和663nm波长下吸光度值的5％；若否，则降低待测压载水样品的浓缩倍数并重复步骤1-4；若是，则计算待测压载水样品中叶绿素a的含量，并执行步骤5；

步骤5：根据已建立的叶绿素a的含量与微藻细胞生物浓度对应关系的数据库，得到待测压载水样品中微藻细胞生物浓度。

本发明还提供了一种船舶压载水微藻细胞生物量检测系统，其包括：进样室；进口与所述进样室出口连接的浓缩装置；进口与所述浓缩装置第一出口连接的废水箱；出口与所述浓缩装置第一出口连接的反冲洗装置；进口与所述浓缩装置第二出口连接的回收装置；所述回收装置的另一进口与流通池出口连接；出口与所述流通池进口连接的进液箱，及，光谱仪；

所述进样室和所述浓缩装置之间依次设置有取样阀和取样流量计；所述浓缩装置和所述废水箱之间依次设置有排液阀和取样泵；所述浓缩装置和反冲洗装置之间设置有冲洗阀；所述浓缩装置的进口处设置有第一过滤器；所述浓缩装置的第一出口处设置有第二过滤器；所述浓缩装置和所述回收装置之间依次设置有过滤阀、过滤流量计、第三过滤器及过滤泵；所述回收装置和流通池之间设置有排水泵；所述流通池和所述进液箱之间设置有进液流量计；所述第一过滤器、第二过滤器和第三过滤器的孔径依次减小。

上述的船舶压载水微藻细胞生物量检测系统，其中，所述流通池的光程为50cm-500cm。

上述的船舶压载水微藻细胞生物量检测系统，其中，所述第一过滤器的孔径为50μm；所述第二过滤器的孔径为10μm。

本发明还提供了一种上述的船舶压载水微藻细胞生物量检测系统的方法，其包括以下步骤：

步骤1：将待测压载水样品导入进样室后，开启取样阀、排液阀和取样泵，将待测压载水样品泵入浓缩装置，进而使位于第二过滤器孔径和第一过滤器孔径之间的微藻细胞生物截留在浓缩装置中，得到浓缩样品，剩余液体排入废水箱；

步骤2：关闭取样阀、排液阀和取样泵，开启冲洗阀，使反冲洗装置内的纯水对浓缩装置的第二过滤器进行反冲洗，进而将残留在第二过滤器上的的微藻细胞生物冲洗至浓缩样品中；

步骤3：关闭冲洗阀，开启过滤阀和过滤泵，将浓缩样品通过第三过滤器后排入回收装置，使位于第二过滤器孔径和第一过滤器孔径之间的微藻细胞生物截留在第三过滤器的滤膜上；

步骤4：取出第三过滤器的滤膜并放入比色管，加入丙酮溶液进行提取，盖上盖子后振摇一段时间，用丙酮定容并静置后，将比色管中的样品导入进液箱；

步骤5：开启排水泵和光谱仪，将进液箱内的样品泵入流通池内，光谱仪对流通池内的浓缩样品在630nm、645nm、663nm和750nm波长下测定吸光度值，并判断浓缩样品在750nm波长下的吸光度值是否分别小于630nm、645nm和663nm波长下吸光度值的5％；若否，则降低待测压载水样品的浓缩倍数并重复步骤1-5；若是，则计算待测压载水样品中叶绿素a的含量，并执行步骤6；

步骤6：根据已建立的叶绿素a的含量与微藻细胞生物浓度对应关系的数据库，得到待测压载水样品中微藻细胞生物浓度。

相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

本发明基于长光程流通池，利用分光光度法测叶绿素a的手段，设计了一种检测船舶压载水中10-50μm微藻细胞生物的方法，实现了对船舶压载水中微藻细胞的快速检测。

与现有已知的检测方法相比，该方法具有装置结构简单，操作方便，检测过程快速高效，不依赖荧光染料、不受船舶摇晃等限制，可以迅速测定出样品中的微藻细胞生物量，可以为海事，检验检疫等执法部门提供一个对压载水进行有效快速监管的手段。

附图说明

图1为本发明所提供的一种船舶压载水微藻细胞生物量检测系统的结构示意图；

图2为本发明所提供的另一种船舶压载水微藻细胞生物量检测系统的结构示意图。

具体实施方式

以下结合附图通过具体实施例对本发明作进一步的描述，这些实施例仅用于说明本发明，并不是对本发明保护范围的限制。

如图1所示，本发明提供了一种船舶压载水微藻细胞生物量检测系统，其包括：进样室1；进口与所述进样室1出口连接的浓缩装置4；进口与所述浓缩装置4第一出口连接的废水箱7；出口与所述浓缩装置4第一出口连接的反冲洗装置9；进口与所述浓缩装置4第二出口连接的裂解室12；进口与所述裂解室12出口连接的流通池15；优选地，所述流通池15的光程为50cm-500cm；进口与所述流通池15出口连接的回收装置18，及，光谱仪16；

所述进样室1和所述浓缩装置4之间依次设置有取样阀2和取样流量计3；所述浓缩装置4和所述废水箱7之间依次设置有排液阀5和取样泵6；所述浓缩装置4和反冲洗装置9之间设置有冲洗阀8；所述浓缩装置4和所述裂解室12之间依次设置有进液阀10和进液泵11；所述裂解室12和所述流通池15之间依次设置有裂解阀13和进液流量计14；所述流通池15和所述回收装置18之间设置有排水泵17；所述浓缩装置4的进口处设置有第一过滤器；所述浓缩装置4的第一出口处设置有第二过滤器；所述第一过滤器的孔径大于所述第二过滤器的孔径；优选地，所述第一过滤器的孔径为50μm；所述第二过滤器的孔径为10μm。

本发明还提供了一种如上述的船舶压载水微藻细胞生物量检测系统的方法，其包括以下步骤：

步骤1：将待测压载水样品导入进样室1后，开启取样阀2、排液阀5和取样泵6，将待测压载水样品泵入浓缩装置4，进而使位于第二过滤器孔径和第一过滤器孔径之间的微藻细胞生物截留在浓缩装置4中，得到浓缩样品，剩余液体排入废水箱7；

步骤2：关闭取样阀2、排液阀5和取样泵6，开启冲洗阀8，使反冲洗装置9内的纯水对浓缩装置4的第二过滤器进行反冲洗，进而将残留在第二过滤器上的的微藻细胞生物冲洗至浓缩样品中；

步骤3：关闭冲洗阀8，开启进液阀10、进液泵11和裂解阀13，将浓缩样品通过未加入细胞裂解液的裂解箱后进入流通池15；

步骤4：开启排水泵17和光谱仪16，使光谱仪16对流通池15内的浓缩样品在630nm、645nm、663nm和750nm波长下测定吸光度值，并判断浓缩样品在750nm波长下的吸光度值是否分别小于630nm、645nm和663nm波长下吸光度值的5％；若否，则降低待测压载水样品的浓缩倍数并重复步骤1-4；若是，则计算待测压载水样品中叶绿素a的含量，并执行步骤5；

步骤5：根据已建立的叶绿素a的含量与微藻细胞生物浓度对应关系的数据库，得到待测压载水样品中微藻细胞生物浓度。

本发明还提供了一种上述的船舶压载水微藻细胞生物量检测系统的方法，其包括以下步骤：

步骤1：将待测压载水样品导入进样室1后，开启取样阀2、排液阀5和取样泵6，将待测压载水样品泵入浓缩装置4，进而使位于第二过滤器孔径和第一过滤器孔径之间的微藻细胞生物截留在浓缩装置4中，得到浓缩样品，剩余液体排入废水箱7；

步骤2：关闭取样阀2、排液阀5和取样泵6，开启冲洗阀8，使反冲洗装置9内的纯水对浓缩装置4的第二过滤器进行反冲洗，进而将残留在第二过滤器上的的微藻细胞生物冲洗至浓缩样品中；

步骤3：关闭冲洗阀8和裂解阀13，开启进液阀10、进液泵11；将浓缩样品泵入裂解箱后加入细胞裂解液，静置一段时间后开启裂解阀13，经过裂解处理后的浓缩样品进入流通池15；

步骤4：开启排水泵17和光谱仪16，使光谱仪16对流通池15内的浓缩样品在630nm、645nm、663nm和750nm波长下测定吸光度值，并判断浓缩样品在750nm波长下的吸光度值是否分别小于630nm、645nm和663nm波长下吸光度值的5％；若否，则降低待测压载水样品的浓缩倍数并重复步骤1-4；若是，则计算待测压载水样品中叶绿素a的含量，并执行步骤5；

步骤5：根据已建立的叶绿素a的含量与微藻细胞生物浓度对应关系的数据库，到待测压载水样品中微藻细胞生物浓度。

如图2所示，本发明还提供了一种船舶压载水微藻细胞生物量检测系统，其包括：进样室1；进口与所述进样室1出口连接的浓缩装置4；进口与所述浓缩装置4第一出口连接的废水箱7；出口与所述浓缩装置4第一出口连接的反冲洗装置9；进口与所述浓缩装置4第二出口连接的回收装置18；所述回收装置18的另一进口与流通池15出口连接；优选地，所述流通池15的光程为50cm-500cm；出口与所述流通池15进口连接的进液箱23，及，光谱仪16；

所述进样室1和所述浓缩装置4之间依次设置有取样阀2和取样流量计3；所述浓缩装置4和所述废水箱7之间依次设置有排液阀5和取样泵6；所述浓缩装置4和反冲洗装置9之间设置有冲洗阀8；所述浓缩装置4的进口处设置有第一过滤器；所述浓缩装置4的第一出口处设置有第二过滤器；所述浓缩装置4和所述回收装置18之间依次设置有过滤阀19、过滤流量计20、第三过滤器21及过滤泵22；所述回收装置18和流通池15之间设置有排水泵17；所述流通池15和所述进液箱23之间设置有进液流量计14；所述第一过滤器、第二过滤器和第三过滤器21的孔径依次减小。优选地，所述第一过滤器的孔径为50μm；所述第二过滤器的孔径为10μm。

本发明还提供了一种上述的船舶压载水微藻细胞生物量检测系统的方法，其包括以下步骤：

步骤1：将待测压载水样品导入进样室1后，开启取样阀2、排液阀5和取样泵6，将待测压载水样品泵入浓缩装置4，进而使位于第二过滤器孔径和第一过滤器孔径之间的微藻细胞生物截留在浓缩装置4中，得到浓缩样品，剩余液体排入废水箱7；

步骤2：关闭取样阀2、排液阀5和取样泵6，开启冲洗阀8，使反冲洗装置9内的纯水对浓缩装置4的第二过滤器进行反冲洗，进而将残留在第二过滤器上的的微藻细胞生物冲洗至浓缩样品中；

步骤3：关闭冲洗阀8，开启过滤阀19和过滤泵22，将浓缩样品通过第三过滤器21后排入回收装置18，使位于第二过滤器孔径和第一过滤器孔径之间的微藻细胞生物截留在第三过滤器21的滤膜上；

步骤4：取出第三过滤器21的滤膜并放入比色管，加入丙酮溶液进行提取，盖上盖子后振摇一段时间，用丙酮定容并静置后，将比色管中的样品导入进液箱23；

步骤5：开启排水泵17和光谱仪16，将进液箱23内的样品泵入流通池15内，光谱仪16对流通池15内的浓缩样品在630nm、645nm、663nm和750nm波长下测定吸光度值，并判断浓缩样品在750nm波长下的吸光度值是否分别小于630nm、645nm和663nm波长下吸光度值的5％；若否，则降低待测压载水样品的浓缩倍数并重复步骤1-5；若是，则计算待测压载水样品中叶绿素a的含量，并执行步骤6；

步骤6：根据已建立的叶绿素a的含量与微藻细胞生物浓度对应关系的数据库，得到待测压载水样品中微藻细胞生物浓度。

本方法基本原理：原样或经预处理的样品进入长光程流通池15中，通过微型光谱仪16，测试其中的叶绿素a对光的吸收，并通过公式换算出叶绿素a的浓度，并换算出对应的微藻生物量浓度。

在一实施例中，本方法根据样品的不同情况设计了三种检测方法，通过如图1和图2所示的两个检测系统实现。

方法一：使用如图1所示的检测系统，针对低浊度样品。将待测压载水样品导入进样室1，开启取样阀2、排液阀5和取样泵6，样品在泵的驱动下下进入浓缩装置4(浓缩装置4容积为0.5ml，入口设置孔径为50μm的第一过滤器，第一出口设置孔径10μm的第二过滤器)，浓缩装置4截留住10μm-50μm的细胞生物，剩余液体排入废水箱7；通过取样流量计3显示并控制最终通过取样流量计3的水样体积为500ml(浓缩倍数为通过取样流量计3的水样体积和浓缩装置4容积的比，在本实施例中，浓缩倍数为：500ml:0.5ml＝1000)；开启冲洗阀8，反冲洗装置9对压缩装置的第二过滤器进行反冲洗(使用纯水即可)，使残留在第二过滤器上的微生物进入浓缩样品中；开启进液阀10和裂解阀13，浓缩样品通过裂解箱(此方法不添加裂解液)进入长光程的流通池15(光程为50cm-500cm)，待进液流量计14显示浓缩样品通过150μl后，光谱仪16开始对流通池15内浓缩样品进行吸光度测量(分别读取750nm、663nm、645nm、630nm波长的吸光度)，以较高频率重复进行吸光度测量多次，测量过程中浓缩样品持续流经流通池15，并最终流入回收装置18。连接光谱仪16的计算机对重复测量的数据进行统计分析，自动剔除个别异常数据(指一组测定值中与平均值的偏差超过两倍标准差的测定值)并对其余数据做均值计算，运用下列计算公式(1)计算叶绿素a含量，并换算出未浓缩压载水中对应的微生物浓度(本方法根据测出叶绿素a，推算出微生物浓度采用的是一种半定量的方法，统计数据而非计算数据，实际操作中依靠大量实验室水样数据，收集足够多的水样数据后建立完善的叶绿素a的含量与微藻细胞生物浓度对应关系的数据库作为基础)。当微生物浓度小于每毫升10个，判定结果显示合格；当微生物浓度不小于每毫升10个，判定结果显示不合格。

计算公式(1)：

V——检测过程中，通过取样流量计3的水样体积(L)；

D 630、D 645、D 663和D 750分别是浓缩样品在630nm、645nm、663nm和750nm波长下的吸光度值；

V1——浓缩装置4的实际容量体积(ml)

δ——流通池15光程(cm)

其中在750nm波长下测量吸光度目的是避免悬浮物质的干扰，一般测量水中的浑浊度所采用的波长为680nm，为避免在680nm处仍有叶绿素a产生的吸收值，故将测量浑浊度的波长选在710nm以上。

在计算公式中，凡参与计算的各吸光度值都应减去750nm处的吸光度值，以扣除悬浮物质的干扰，各吸光度值应小于叶绿素a吸收峰的吸光度值的5％(即，D750＜5％D663；D750＜5％D645；D750＜5％D630。假定样品在663nm处的吸光度值为0.03，则在750nm处的吸光度值不得大于0.0015)，否则应重新检测且降低浓缩倍数(例如浓缩倍数降低为原来的1/2)。若降低浓缩倍数(例如浓缩倍数降低为原来的1/2)后的检测结果依然是750nm处的吸光度值不小于叶绿素a吸收峰的吸光度值的5％，则可采用加入细胞裂解液的强化措施，即下述方法二。

方法二：同样使用如图1所示的检测系统，针对中浊度的样品。检测中的取样、浓缩、反冲洗的过程与方法一相同，反冲洗装置9结束工作后开启进液阀10和进液泵11，关闭裂解阀13，浓缩样品进入裂解室12后，加入细胞裂解液(细胞裂解液为丙酮)，静置5min后裂解阀13开启，经过裂解处理的浓缩样品进入长光程流通池15。随后的步骤同方法一。

若样品经过方法二的检测结果依然是750μm处的吸光度值不小于叶绿素a吸收峰的吸光度值的5％，则可采用下述方法三。

方法三：使用如图2所示的检测系统，针对高浊度样品。将待测压载水样品导入进样室1，开启取样阀2、排液阀5和取样泵6，样品在取样泵6的驱动下进入浓缩装置4(浓缩装置4容积为0.5ml，入口设置孔径为50μm的第一过滤器，第一出口设置孔径10μm的第二过滤器)，浓缩装置4截留住10μm-50μm的细胞生物，剩余液体排入废水箱7；通过取样流量计3显示并控制最终浓缩样量为500ml；开启冲洗阀8，反冲洗装置9对压缩装置的第一出口的第二过滤器进行反冲洗，使残留在第二过滤器上的微生物进入浓缩样品中，开启过滤阀19，浓缩样品在过滤泵22的作用下，通过第三过滤器21后排入回收装置18(第三过滤器21的滤膜是乙酸纤维薄膜)，待过滤完成之后取出乙酸纤维薄膜，放入比色管，加适量90％丙酮溶液提取，盖严盖子后用力振摇2min，振摇结束后用90％丙酮定容到5ml，静止10min。之后将比色管中的样品导入进液箱23，样品在排水泵17的作用下进入长光程流通池15，待进液流量计14显示浓缩样品通过150μl后，光谱仪16开始对流通池15内浓缩样品进行吸光度测量(分别读取750nm、663nm、645nm、630nm波长的吸光度)，以较高频率重复进行吸光度测量多次，测量过程中裂解样品持续流经长光程流通池15，并最终流入回收装置18。连接光谱仪16的计算机对重复测量的数据进行统计分析，自动剔除个别异常数据并对其余数据做均值计算，运用下列计算公式(2)计算叶绿素a含量，并换算出未浓缩压载水中对应的微生物浓度。当微生物浓度小于每毫升10个，判定结果显示合格；当微生物浓度不小于每毫升10个，判定结果显示不合格。

计算公式(2)：

V——检测过程中，通过取样流量计3的水样体积(L)；

D 630、D 645、D 663和D 750分别是浓缩样品在630nm、645nm、663nm和750nm波长下的吸光度值；

V2——提取液使用丙酮定容后的体积(ml)；

δ——流通池15光程(cm)。

应用案例1：

将本发明运用于船舶压载水在线监测系统，在船上安装相应的检测装置，以根据使用需求实时检测压载水中的浮游生物的浓度，以便相关人员对压载舱中的压载水情况有一个直观的了解，满足实时监测的需求。亦可以实现定期自动检测功能，设定检测周期，检测结果自动存储，当检测结果不合格时自动向分管人员进行报警，工作人员介入并对压载水进行进一步的处理。

应用案例2：

将本发明运用于现场快速检测系统，适用于海事执法部门的快速检测压载水的需求。将本发明所需相关设备集成于一套便携的检测装置，海事执法人员运用该设备可在执法现场高效便捷地检测船舶压载水是否符合排放标准，降低海事执法人员检测难度，同时大幅度降低检测时长。

综上所述，本发明利用分光光度法测算压载水中出叶绿素a浓度，进而换算出活体生物量浓度；通过较高频率重复测量可得到多组吸光度数据，通过对这些数据统计分析，可有效降低提升检测精度，并甄别出无效样品，提升检测结果的可靠性；通过增加光程的方式打打降低了样品所需的浓缩倍数，从而大大减少了取样量，节省了浓缩所需时间(使用长光程流通池即为增加光程，标准池光程为1cm，而本方法选择使用50cm-500cm长光程流通池)；通过裂解、萃取的强化方式消除水体中杂质对检测的影响，扩大了该方法的适用范围。

尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。

Claims (9)

1.一种船舶压载水微藻细胞生物量检测系统，其特征在于，包括：进样室；进口与所述进样室出口连接的浓缩装置；进口与所述浓缩装置第一出口连接的废水箱；出口与所述浓缩装置第一出口连接的反冲洗装置；进口与所述浓缩装置第二出口连接的裂解室；进口与所述裂解室出口连接的流通池；进口与所述流通池出口连接的回收装置，及，光谱仪；

所述进样室和所述浓缩装置之间依次设置有取样阀和取样流量计；所述浓缩装置和所述废水箱之间依次设置有排液阀和取样泵；所述浓缩装置和反冲洗装置之间设置有冲洗阀；所述浓缩装置和所述裂解室之间依次设置有

进液阀和进液泵；所述裂解室和所述流通池之间依次设置有裂解阀和进液流量计；所述流通池和所述回收装置之间设置有排水泵；所述浓缩装置的进口处设置有第一过滤器；所述浓缩装置的第一出口处设置有第二过滤器；所述第一过滤器的孔径大于所述第二过滤器的孔径。

2.如权利要求1所述的船舶压载水微藻细胞生物量检测系统，其特征在于，所述流通池的光程为50cm-500cm。

3.如权利要求1所述的船舶压载水微藻细胞生物量检测系统，其特征在于，所述第一过滤器的孔径为50μm；所述第二过滤器的孔径为10μm。

4.一种船舶压载水微藻细胞生物量检测系统，其特征在于，包括：进样室；进口与所述进样室出口连接的浓缩装置；进口与所述浓缩装置第一出口连接的废水箱；出口与所述浓缩装置第一出口连接的反冲洗装置；进口与所述浓缩装置第二出口连接的回收装置；所述回收装置的另一进口与流通池出口连接；出口与所述流通池进口连接的进液箱，及，光谱仪；

所述进样室和所述浓缩装置之间依次设置有取样阀和取样流量计；所述浓缩装置和所述废水箱之间依次设置有排液阀和取样泵；所述浓缩装置和反冲洗装置之间设置有冲洗阀；所述浓缩装置的进口处设置有第一过滤器；所述浓缩装置的第一出口处设置有第二过滤器；所述浓缩装置和所述回收装置之间依次设置有过滤阀、过滤流量计、第三过滤器及过滤泵；所述回收装置和流通池之间设置有排水泵；所述流通池和所述进液箱之间设置有进液流量计；所述第一过滤器、第二过滤器和第三过滤器的孔径依次减小。

5.如权利要求4所述的船舶压载水微藻细胞生物量检测系统，其特征在于，所述流通池的光程为50cm-500cm。

6.如权利要求4所述的船舶压载水微藻细胞生物量检测系统，其特征在于，所述第一过滤器的孔径为50μm；所述第二过滤器的孔径为10μm。

7.一种如权利要求1-3中任意一项所述的船舶压载水微藻细胞生物量检测系统的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1：将待测压载水样品导入进样室后，开启取样阀、排液阀和取样泵，将待测压载水样品泵入浓缩装置，进而使位于第二过滤器孔径和第一过滤器孔径之间的微藻细胞生物截留在浓缩装置中，得到浓缩样品，剩余液体排入废水箱；

步骤2：关闭取样阀、排液阀和取样泵，开启冲洗阀，使反冲洗装置内的纯水对浓缩装置的第二过滤器进行反冲洗，进而将残留在第二过滤器上的的微藻细胞生物冲洗至浓缩样品中；

步骤3：关闭冲洗阀，开启进液阀、进液泵和裂解阀，将浓缩样品通过未加入细胞裂解液的裂解箱后进入流通池；

步骤4：开启排水泵和光谱仪，使光谱仪对流通池内的浓缩样品在630nm、645nm、663nm和750nm波长下测定吸光度值，并判断浓缩样品在750nm波长下的吸光度值是否分别小于630nm、645nm和663nm波长下吸光度值的5％；若否，则降低待测压载水样品的浓缩倍数并重复步骤1-4；若是，则计算待测压载水样品中叶绿素a的含量，并执行步骤5；

步骤5：根据已建立的叶绿素a的含量与微藻细胞生物浓度对应关系的数据库，得到待测压载水样品中微藻细胞生物浓度。

8.一种如权利要求1-3中任意一项所述的船舶压载水微藻细胞生物量检测系统的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1：将待测压载水样品导入进样室后，开启取样阀、排液阀和取样泵，将待测压载水样品泵入浓缩装置，进而使位于第二过滤器孔径和第一过滤器孔径之间的微藻细胞生物截留在浓缩装置中，得到浓缩样品，剩余液体排入废水箱；

步骤2：关闭取样阀、排液阀和取样泵，开启冲洗阀，使反冲洗装置内的纯水对浓缩装置的第二过滤器进行反冲洗，进而将残留在第二过滤器上的微藻细胞生物冲洗至浓缩样品中；

步骤3：关闭冲洗阀和裂解阀，开启进液阀、进液泵；将浓缩样品泵入裂解箱后加入细胞裂解液，静置一段时间后开启裂解阀，经过裂解处理后的浓缩样品进入流通池；

步骤4：开启排水泵和光谱仪，使光谱仪对流通池内的浓缩样品在630nm、645nm、663nm和750nm波长下测定吸光度值，并判断浓缩样品在750nm波长下的吸光度值是否分别小于630nm、645nm和663nm波长下吸光度值的5％；若否，则降低待测压载水样品的浓缩倍数并重复步骤1-4；若是，则计算待测压载水样品中叶绿素a的含量，并执行步骤5；

步骤5：根据已建立的叶绿素a的含量与微藻细胞生物浓度对应关系的数据库，得到待测压载水样品中微藻细胞生物浓度。

9.一种如权利要求4-6中任意一项所述的船舶压载水微藻细胞生物量检测系统的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1：将待测压载水样品导入进样室后，开启取样阀、排液阀和取样泵，将待测压载水样品泵入浓缩装置，进而使位于第二过滤器孔径和第一过滤器孔径之间的微藻细胞生物截留在浓缩装置中，得到浓缩样品，剩余液体排入废水箱；

步骤2：关闭取样阀、排液阀和取样泵，开启冲洗阀，使反冲洗装置内的纯水对浓缩装置的第二过滤器进行反冲洗，进而将残留在第二过滤器上的微藻细胞生物冲洗至浓缩样品中；

步骤3：关闭冲洗阀，开启过滤阀和过滤泵，将浓缩样品通过第三过滤器后排入回收装置，使位于第二过滤器孔径和第一过滤器孔径之间的微藻细胞生物截留在第三过滤器的滤膜上；

步骤4：取出第三过滤器的滤膜并放入比色管，加入丙酮溶液进行提取，盖上盖子后振摇一段时间，用丙酮定容并静置后，将比色管中的样品导入进液箱；

步骤5：开启排水泵和光谱仪，将进液箱内的样品泵入流通池内，光谱仪对流通池内的浓缩样品在630nm、645nm、663nm和750nm波长下测定吸光度值，并判断浓缩样品在750nm波长下的吸光度值是否分别小于630nm、645nm和663nm波长下吸光度值的5％；若否，则降低待测压载水样品的浓缩倍数并重复步骤1-5；若是，则计算待测压载水样品中叶绿素a的含量，并执行步骤6；

步骤6：根据已建立的叶绿素a的含量与微藻细胞生物浓度对应关系的数据库，得到待测压载水样品中微藻细胞生物浓度。