CN111413479A - 水质检测方法和系统 - Google Patents
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Abstract
本发明提供的水质检测方法，包括对检测对象进行过滤，采用浮游生物和细胞计数器进行浮游生物检测，直观判断浮游生物的死活、大小及数量，和/或，采用PMA结合PCR技术快速区分细菌的死活，判断细菌的数量是否符合IMO D2标准。相应地提供了实验检测方法的系统。采用本发明的水质检测方法及系统，可以在3小时以内检测完成检测，可检测检测对象中浮游生物及细菌的死活及数量，用于压载水时，能满足美国海岸警卫队的要求，也能判断压载水的排放是否符合IMO D2标准，从而减少船舶的靠岸时间，提高效率。
Description
技术领域
本发明涉及水处理领域，国际专利分类在C02F，尤其涉及水质检测，具体地，涉及水质检测方法和系统，特别是适用于船舶压载水处理后的检测领域。
背景技术
为了保证船舶安全航行，通常使用海水作为压载物，称为压载水。压载水中包含大量的浮游生物等可生存生物和大肠杆菌、肠球菌等微生物。在运到目的港口后，需把压载水排放后装货。这样容易将生物随着压载水带入不同的海域，破坏生态平衡，严重的还会造成生物入侵。船舶压载水已经被全球环境基金组织确定为世界海洋的四大威胁之一。
为应对由压载水排放所引起的外来生物入侵性问题，在2004年2月9日～13日外交大会上，国际海事组织（International Maritime Organization，简称IMO）通过了《船舶压载水及沉积物控制和管理国际公约》，以下简称《压载水公约》)。其中现行的第D-2条压载水性能标准规定：1.按本条进行压载水管理的船舶的排放，应达到每立方米中最小尺寸大于或等于50微米的可生存生物少于10个，每毫升中最小尺寸小于50微米但大于或等于10微米的可生存生物少于10个；并且，指示微生物的排放不应超过第2款中所述的规定浓度。2.作为一种人体健康标准，指示微生物应包括：（1）产毒霍乱弧菌（O1和O139）：少于没100毫升1个菌落形成单位（cfu）或小于每一克（湿重）浮游动物样品1个cfu；（2）大肠杆菌：少于每100毫升250个cfu；（3）肠球菌：少于每100毫升100个cfu。
水处理实际是两个主要的环节：1）水处理；2）水质检测。当水处理好的水通过水质检测后，才可排放，否则不允排放继续处理。为了达到相应的排放标准，每个在不同海域行驶的船舶都必须配置压载水处理系统，在靠岸后，必须检测合格才能进行压载水排放。美国海岸警卫队（USCG）要求检测压载水中的活的细菌，IMO实际是要求检测压载水中可以繁殖的细菌。
现有的压载水检测流程是：船舶靠岸后，由相关人员取样然后运送至实验室进行存活生物计数（如CN 106442488 A、CN 106244665 A），进行细菌检测时，考虑到压载水中细菌浓度很低，一般先进行细菌培养，再进行PCR扩增、计数等等，但这样的检测方法耗时时间长，一般需要2天才能出结果，船舶只能靠岸等着，要是压载水检测不合格，还需要进行处理然后再次检测，直至检测合格才能排放、装货，驶离，效率低。为了避免这个问题，后来就采取检查船舶压载水处理系统的工作记录，认为如果压载水处理系统工作时间够，则认为压载水符合标准，反之亦然。但是，这样的操作明显不客观，很有可能导致压载水不符合标准即排放。
为了解决传统检测方法耗时长的问题，公开号为CN106442920A的中国发明专利申请公开了一种压载水实时排放监控系统及方法，其包括：与压载水排出管路相连通的取样单元，其能够自压载水排出管路中提取适量样品并输送至检测单元；与所述取样单元相连接的检测单元，该检测单元能够对样品进行取样检测并输出对应的检测信号；与所述检测单元相连接的分析单元，该分析单元能够接收到的检测信号进行信号处理并输出相应的控制命令；受控于所述分析单元的执行单元，该执行单元依据接收到的控制命令进行动作，以控制压载水排出管路中压载水的流向；以及能够存储样品检测数据并进行显示的存储显示单元；采用荧光感应进行浮游生物检测，采用微流控技术进行菌类检测。能够实现船舶压载水浮游生物和菌类浓度的实时、快速、准确检测且改变了现有技术中船舶压载水检测和排放控制分离的现状。但是荧光感应不能区分浮游生物的死活及浮游生物的大小；常规PCR技术不能区分出细菌的死活，只有活体才对环境及人体有危害，所以这样的技术方案对实际压载水排放意义不大。目前海洋中活细菌的检测多是采用电化学方法，如US5254461A、WO9106670A，但是电化学方法无法区分细菌死活，也无法区分微生物种类以及细菌亚型且容易造成二次污染。
发明内容
为了解决以上不能区分浮游生物死活、浮游生物大小、细菌死活的技术问题，本发明提供水质检测方法及系统，尤其适用于船舶压载水处理后的检测，可同时满足IMO和USCG的要求。
首先，为了解决以上现有技术不能区分细菌死活的技术问题，本发明提供水质检测方法，步骤如下：对检测对象进行过滤，细菌检测，其中，细菌检测采用PMA结合qPCR进行。
优选的是，所述过滤是采用孔径为0.45μm的过滤膜 进行。
上述任一方案优选的是，过滤是在一定压力下进行，这有利于加快过滤速度，缩短整个检测时间。
上述任一方案优选的是，检测对象为压载水，进一步优选为按规定处理后的压载水。PMA是一种常用于检测死菌和活菌的试剂，PMA只能与死菌DNA分子共价交联，抑制该DNA分子PCR扩增，从而区分出死细菌和活细菌。但是目前PMA常用于食品、药品等领域，一般样品中细菌浓度较高，甚至达到百万级，没有用于符合IMO D2标准的细菌浓度非常低的压载水领域的细菌检测。
上述任一方案优选的是，检测对象在过滤前先除去其中的浮游生物。浮游生物的除去方法可随意，可分两次进行，也可以一次完成。
上述任一方案优选的是，过滤后得到的样品利用反冲单元收集，用于细菌检测。
上述任一方案优选的是，反冲单元的反冲液为灭菌的纯水或缓冲液，确保不会带入新的干扰因素。
相应地，本发明提供可实现上述方法的水质检测系统，包括相互连接的过滤单元和细菌检测单元，其中，细菌检测单元包括串联的PMA处理系统和PCR仪，PMA处理系统包括PMA试剂盒、反应罐、取样器。
优选的是，所述系统还包括过滤加压系统，与过滤单元连接，在过滤时提供一定压力，加快过滤速度。
上述任一方案优选的是，所述过滤加压系统为真空泵或蠕动泵，这类泵，在工作过程中，不会有液体进入并经过泵，不会对检测对象中的细菌造成干扰和污染。
上述任一方案优选的是，所述系统还包括反冲单元，反冲单元包括反冲液罐、反冲管道及泵；反冲管道连接反冲液罐、泵及过滤单元。
上述任一方案优选的是，所述过滤单元包括三个并列的子过滤单元，每个自过滤单元均与反冲单元和滤液收集罐连接，收集到的样品分别用于检测大肠杆菌、肠球菌和产毒霍乱弧菌（O1和O139）。
当需要检测的细菌种类不同于这些时，可适当更换检测目标及检测手段、引物等等。
上述任一方案优选的是，所述过滤单元为孔径为0.45微米的过滤膜 。
上述任一方案优选的是，还包括取样单元，将检测对象送入过滤单元。
上述任一方案优选的是，所述系统还包括滤液收集罐。
上述任一方案优选的是，所述系统还包括控制单元，调节阀门的开合，以控制液体的流动并实现自动化。
采用该水质检测方法，可以快速检测出检测对象中细菌的死活及数量，用于压载水检测时能同时满足USCG和IMO的要求，尤其是细菌检测步骤，仅需要60min即可（PMA处理30min，PCR反应30min），相对于传统细菌培养方法所需2天，时间大大缩短，效率大大提高。
其次，为了解决以上现有技术不能区分浮游生物死活和大小的技术问题，本发明提供水质检测方法，步骤如下：对检测对象进行过滤，浮游生物检测，其中，浮游生物检测采用浮游生物和细胞计数器进行，对浮游生物的死活、大小及数量进行判断及统计。
优选的是，所述过滤包括：
第一次过滤：取检测对象进行第一次过滤，得到尺寸大于或等于50微米的浮游生物；
第二次过滤，去第一次过滤后的滤液进行第二次过滤，得到尺寸小于50微米但大于或等于10微米的浮游生物；
对第一次过滤得到的浮游生物和/或第二次过滤得到的浮游生物用于浮游生物检测，检测死活、大小及数量。
上述任一方案优选的是，第一次过滤、第二次过滤后得到的浮游生物，采用反冲系统反冲进入浮游生物和细胞计数器。
上述任一方案优选的是，检测对象为压载水，进一步优选为按规定处理后的压载水。
上述任一方案优选的是，整个工艺流程公用一个反冲系统及一台浮游生物和细胞计数器，减少费用，节约占地。
上述任一方案优选的是，进行第一次过滤的检测对象为从检测对象舱舱中取的样品，具体量可根据当地的规定取样，如美国海岸警卫队规定取样3m3，IMO规定取样1m3。
上述任一方案优选的是，过滤前，检测对象经过初步过滤，采用70 至300微米单个或多个规格组合的滤膜进行过滤，然后将滤液进行第一次过滤，判断检测对象中尺寸大于50微米的活的浮游生物的数量时，将初滤和第一次过滤得到的结果相加作为最终结果。
相应地，本发明提供可实现改方法的水质检测系统，包括过滤单元、与过滤单元连接的浮游生物检测单元，其中，浮游生物检测单元为浮游生物和细胞计数器。
上述任一方案优选的是，所述系统还包括与过滤单元连接的反冲单元，反冲单元将过滤单元过滤得到的浮游生物反冲到检测单元，然后检测单元执行浮游生物的检测并显示检测结果。
上述任一方案优选的是，反冲单元包括反冲液罐、反冲管道及泵；反冲管道连接反冲液罐、泵及过滤单元。
上述任一方案优选的是，所述过滤单元包括串联的第一和第二子过滤单元，第一子过滤单元和/或第二子过滤单元收集到的样品分别用于浮游生物检测，包括浮游生物的生命状态、大小及数量。
上述任一方案优选的是，所述第一子过滤单元为孔径为50微米的过滤膜 ，所述第一子过滤单元为孔径为10微米的过滤膜 。
上述任一方案优选的是，所述系统还包括滤液收集单元，用于收集过滤单元过滤后的滤液。
上述任一方案优选的是，所述滤液收集单元包括第一收集罐和第二收集罐，第一收集罐用于收集第一子过滤单元过滤后的滤液，第二收集罐用于收集第二子过滤单元过滤后的滤液，第一收集罐与第一子过滤单元和第二子过滤单元通过管道连接，通过泵将第一收集罐里的滤液送至第二子过滤单元。
上述任一方案优选的是，所述系统包括一个反冲单元和一个检测单元。
上述任一方案优选的是，所述系统还包括初滤单元，初滤单元布置在过滤单元的进水管路上，检测对象先经过初滤单元，再进入过滤单元。
上述任一方案优选的是，所述初滤单元为孔径为70 至300微米单个或多个规格组合的滤膜。
上述任一方案优选的是，所述系统还包括与检测对象舱舱连接并将检测对象送至过滤单元的取样单元，取样单元包括蓄水罐和泵，优选泵为蠕动泵或真空泵。
上述任一方案优选的是，所述系统还包括控制单元，调节阀门的开合，以控制液体的流动并实现自动化。
第三，为了同时解决以上现有技术不能区分浮游生物死活、大小及细菌死活的技术问题，本分明提供水质检测方法，步骤依次如下：
（1）第一次过滤，将检测对象进行第一次过滤，得到尺寸大于或等于50微米的浮游生物；送至浮游生物和细胞计数器进行浮游生物的死活、大小、数量检测；
（32）第二次过滤，将第一次过滤后的滤液进行第二次过滤，得到尺寸小于50微米但大于或等于10微米的浮游生物；送至浮游生物和细胞计数器进行浮游生物的死活、大小、数量检测；
（3）第三次过滤，将第二次能所得到的滤液进行第三次过滤，得到含有尺寸大于0.45微米的细菌样品；将含有细菌的过滤液首先进行PMA处理，然后进行PCR扩增，最后进行细菌检测。
优选的是，每一次过滤后得到的样品利用反冲单元反冲进入检测单元用于检测。
上述任一方案优选的是，检测对象为压载水，进一步优选为按规定处理后的压载水。PMA是一种常用于检测死菌和活菌的试剂，PMA只能与死菌DNA分子共价交联，抑制该DNA分子PCR扩增，从而区分出死细菌和活细菌。但是目前PMA常用于食品、药品等领域，一般样品中细菌浓度较高，甚至达到百万级，没有用于符合IMO D2标准的细菌浓度非常低的压载水领域的细菌检测。
上述任一方案优选的是，反冲单元的反冲液为灭菌的纯水或缓冲液，确保不会带入新的干扰因素。
上述任一方案优选的是，所述过滤是采用孔径为0.45μm的过滤膜进行。
上述任一方案优选的是，第三次过滤是在一定压力下进行，这有利于加快过滤速度，缩短整个检测时间。
上述任一方案优选的是，步骤（1）中，进行第一次过滤的检测对象为从检测对象舱舱中取的样品，具体量可根据当地的规定取样，如美国海岸警卫队规定取样3m3，IMO规定取样1m3。
上述任一方案优选的是，第一次过滤前，检测对象经过初步过滤，采用70 至300微米单个或多个规格组合的滤膜进行过滤。
上述任一方案优选的是，整个工艺流程公用一个反冲系统及一台浮游生物和细胞计数器，减少费用，节约占地。
相应地，本发明提供可实现该检测方法的水质检测系统，包括过滤单元、与过滤单元连接的浮游生物检测单元和细菌检测单元，其中，浮游生物检测单元为浮游生物和细胞计数器，细菌检测单元包括串联的PMA处理系统和PCR仪，PMA处理系统包括PMA试剂盒、反应罐、取样器。
优选的是，所述过滤单元包括串联的第一、第二和第三子过滤单元，第一子过滤单元和第二子过滤单元收集到的样品分别用于浮游生物检测，包括浮游生物的生命状态、大小及数量，第三子过滤单元收集到的样品用于细菌检测。
上述任一方案优选的是，所述第一子过滤单元为孔径为50微米的过滤膜 ，所述第二子过滤单元为孔径为10微米的过滤膜 ，第三子过滤单元为孔径0.45微米的过滤膜 。
上述任一方案优选的是，所述系统还包括过滤加压系统，与过滤单元连接，在过滤时提供一定压力，加快过滤速度。
上述任一方案优选的是，所述过滤加压系统为真空泵或蠕动泵，这类泵，在工作过程中，不会有液体进入并经过泵，不会对检测对象中的细菌造成干扰和污染。
上述任一方案优选的是，所述系统还包括与过滤单元连接的反冲单元，反冲单元将过滤单元过滤得到的浮游生物反冲到检测单元，然后检测单元执行浮游生物的检测并显示检测结果。
上述任一方案优选的是，反冲单元包括反冲液罐、反冲管道及泵；反冲管道连接反冲液罐、泵及过滤单元。
上述任一方案优选的是，所述系统还包括滤液收集单元，用于收集过滤单元过滤后的滤液。
上述任一方案优选的是，所述滤液收集单元包括第一收集罐、第二收集罐、第三收集罐，第一收集罐用于收集第一子过滤单元过滤后的滤液，第二收集罐用于收集第二子过滤单元过滤后的滤液，第一收集罐与第一子过滤单元和第二子过滤单元通过管道连接，通过泵将第一收集罐里的滤液送至第二子过滤单元，第二收集罐与第二子过滤单元和第三子过滤单元通过管道连接，通过泵将第二收集罐里的滤液送至第三子过滤单元，第三收集罐用于收集第三子过滤单元的滤液。
上述任一方案优选的是，所述第三子过滤单元包括三个并列的细菌过滤单元，每个细菌过滤单元均与反冲单元和第三滤液收集罐连接，收集到的样品分别用于检测大肠杆菌、肠球菌和产毒霍乱弧菌（O1和O139）。当需要检测的细菌种类不同于这些时，可适当更换检测目标及检测手段、引物等等。
上述任一方案优选的是，所述系统还包括初滤单元，初滤单元布置在过滤单元的进水管路上，压水在先经过初滤单元，在进入过滤单元。
上述任一方案优选的是，所述初滤单元为孔径为70 至300微米单个或多个规格组合的滤膜。
上述任一方案优选的是，所述系统还包括与检测对象连接并将检测对象送至过滤单元的取样单元，取样单元包括蓄水罐和泵，优选泵为蠕动泵或真空泵。
上述任一方案优选的是，所述系统包括一个反冲单元和一个检测单元。
上述任一方案优选的是，所述系统还包括控制单元，调节阀门的开合，以控制液体的流动并实现自动化。
采用本发明的水质检测方法及系统，可以快速检测细菌种类及数量，细菌包括但不限于：产毒霍乱弧菌（O1和O139）、大肠杆菌和肠球菌，可检测检测对象中浮游生物的死活及数量，能满足美国海岸警卫队的要求，也能判断检测对象的排放是否符合IMO D2标准，从而减少船舶的靠岸时间，提高效率。第三方面的整个检测流程只需约3小时的时间。
本发明的系统为开放性，可根据需要增加设备，但是原则上只配置一套反冲单元和浮游生物检测单元及细菌检测单元。
附图说明
图1是按照本发明的水质检测方法的一优选实施例的流程图及系统结构示意图。
具体实施方式
为了更加正确、清楚地理解本发明的内容，下面结合具体实施例和附图进行进一步的说明、解释。
以下实施例中，强化剂为Biotium公司的G-细菌PMA增强剂5x溶液（PMA enhancerfor G- bacteria，5x solution）；反冲液为灭菌的纯水或缓冲液（0.05M的tris）。
没有详细说明的，本领域技术人员可以根据本领域的现有技术进行选择、操作。
实施例1
为了解决现有技术不能区分细菌死活的技术问题，本实施例提供压载水检测方法，步骤如下：对压载水进行过滤，细菌检测，其中，细菌检测采用PMA结合qPCR进行。PMA是一种用于检测活菌的试剂，PMA只能与死菌DNA分子共价交联，抑制该DNA分子PCR扩增，从而区分出死细菌和活细菌。但是目前PMA常用于食品、药品等领域，一般样品中细菌浓度较高，甚至达到百万级，没有用于符合IMO D2标准的细菌浓度非常低的压载水领域的细菌检测。
本实施例中，所述过滤可采用孔径为0.45μm的过滤膜进行，且可在一定压力下进行，这有利于加快过滤速度，缩短整个检测时间，这样的压力可以采用与过滤单元连接的过滤加压系统（如蠕动泵或真空泵，这类泵，在工作过程中，不会有液体进入并经过泵，不会对压载水中的细菌造成干扰，如死亡等）施加，在过滤时提供一定压力，加快过滤速度。
压载水经过滤单元缩后得到的样品优选利用反冲收集，用于细菌检测。
进行细菌检测时，PMA处理及PCR的具体步骤如下：
1) 过滤细菌后的0.45μm滤膜一张（置于滤膜管中）；
2) 加入1毫升强化剂；
3) 调暗灯光，把PMAxx用纯水稀释5倍，取2.5微升加入到加了强化剂的滤膜管；
4) 在黑暗中室温放置10分钟并不时混匀；
5) 放在650瓦卤素灯20厘米处照射15分钟；
6) 开动真空泵抽走液体；
7) 蒸馏水清洗滤膜后由真空泵抽走；
8) 清洗后的细菌反冲至内含qPCR试剂（Taq聚合酶、缓冲液、引物和探针）的qPCR芯片；
9) qPCR反应条件 95度 5分钟 （95度 5秒，64度30秒，40循环）；
10) 结果以qPCR 曲线和Ct值来表示。
压载水在过滤前可以先除去其中的浮游生物级其他杂物，方法可随意采用现有技术，可分两次进行，也可以一次完成等。
相应地，本实施例提供可实现上述方法的用于压载水处理后的检测系统，包括相互连接的过滤单元和细菌检测单元，其中，细菌检测单元包括串联的PMA处理系统和PCR仪，PMA处理系统包括PMA试剂盒、反应罐、取样器。
为了缩短时间，提高效率，系统设置与过滤单元连接的过滤加压系统（如蠕动泵或真空泵，这类泵，在工作过程中，不会有液体进入并经过泵，不会对压载水中的细菌造成干扰，如死亡等。）施加，在过滤时提供一定压力，加快过滤速度。
所述系统还可包括反冲单元，反冲单元包括反冲液罐、反冲管道及泵；反冲管道连接反冲液罐、泵及过滤单元。利用反冲技术将过滤后的的细菌反冲进入细菌检测单元。
本实施例中，所述过滤单元包括三个并列的子过滤单元，每个子过滤单元均与反冲单元和滤液收集罐（对应附图中的废水柜）连接，收集到的样品分别用于检测大肠杆菌、肠球菌和产毒霍乱弧菌（O1和O139）。
当需要检测的细菌种类不同于这些时，可适当更换检测目标及检测手段、引物等等。
本实施例中所述过滤单元为孔径为0.45微米的过滤膜 。并且，该系统还包括取样单元，将压载水送入过滤单元和/或所述系统还包括滤液收集罐；还可以包括控制单元，调节阀门的开合，以控制液体的流动并实现自动化。
本实施例的检测方法及系统，可快速检测出压载水中的活细菌及数量，并可快速判断压载水中包括但不限于大肠杆菌、肠球菌和产毒霍乱弧菌（O1和O139）是否符合IMO D2标准及美国海岸警卫队的要求。
实施例2
为了解决现有技术不能区分浮游生物死活和大小的技术问题，本实施例提供用于压载水处理后的检测方法，步骤如下：对压载水进行过滤，浮游生物检测，其中，浮游生物检测采用浮游生物和细胞计数器进行，对浮游生物的死活、大小及数量进行判断及统计。
所述过滤包括：
第一次过滤：取压载水进行第一次过滤，得到尺寸大于或等于50微米的浮游生物；
第二次过滤，去第一次过滤后的滤液进行第二次过滤，得到尺寸小于50微米但大于或等于10微米的浮游生物；
对第一次过滤得到的浮游生物和/或第二次过滤得到的浮游生物用于浮游生物检测，检测死活、大小及数量。
第一次过滤和/或第二次过滤后得到的浮游生物，采用反冲系统反冲进入浮游生物和细胞计数器。
进行第一次过滤的压载水为从压载水舱舱中取的样品，具体量可根据当地的规定取样，如美国海岸警卫队规定取样3m3，IMO规定取样1m3，并在过滤前，压载水经过初步过滤，采用100微米滤膜进行过滤，并对初滤得到的浮游生物中活的浮游生物进行计数，然后将滤液进行第一次过滤，判断压载水中尺寸大于50微米的活的浮游生物的数量时，将初滤和第一次过滤得到的结果相加作为最终结果 。
相应地，本实施例还提供可实现该方法的用于压载水处理后的检测系统，包括过滤单元、与过滤单元连接的浮游生物检测单元，其中，浮游生物检测单元为浮游生物和细胞计数器。
所述系统还包括与过滤单元连接的反冲单元，反冲单元将过滤单元过滤得到的浮游生物反冲到检测单元，然后检测单元执行浮游生物的检测并显示检测结果。反冲单元包括反冲液罐（反冲液水柜）、反冲管道及泵（正压泵）；反冲管道连接反冲液罐、泵及过滤单元。
所述过滤单元包括串联的第一和第二子过滤单元，第一子过滤单元和/或第二子过滤单元收集到的样品分别用于浮游生物检测，包括浮游生物的生命状态、大小及数量。所述第一子过滤单元为孔径为50微米的过滤膜 ，所述第一子过滤单元为孔径为10微米的过滤膜 。
所述系统还包括滤液收集单元，用于收集过滤单元过滤后的滤液。所述滤液收集单元包括第一收集罐和第二收集罐（对应附图中的两个储存水柜），第一收集罐用于收集第一子过滤单元过滤后的滤液，第二收集罐用于收集第一子过滤单元过滤后的滤液，第一收集罐与第一子过滤单元和第二子过滤单元通过管道连接，通过泵将第一收集罐里的滤液送至第二子过滤单元。
所述系统包括一个反冲单元和一个检测单元。所述系统还包括初滤单元，初滤单元（孔径为微米的滤膜）布置在过滤单元的进水管路上，压水在先经过初滤单元，在进入过滤单元。所述系统还包括与压载水舱舱连接并将压载水送至过滤单元的取样单元，取样单元包括蓄水罐和泵，优选泵为蠕动泵或真空泵。所述系统还包括控制单元，调节阀门的开合，以控制液体的流动并实现自动化。
采用本实施例的方法及系统，可方便地检测出压载水中浮游生物的死活、大小及数量，判断是否符合IMO D2标准及美国海岸警卫队的要求。
实施例3
为了同时解决现有技术不能区分浮游生物死活、大小及细菌死活的技术问题，本分明提供用于压载水处理后的检测方法，如图1所示，步骤依次如下：
（1）第一次过滤，将压载水进行第一次过滤，得到尺寸大于或等于50微米的浮游生物；送至浮游生物和细胞计数器进行浮游生物的死活、大小、数量检测；
（32）第二次过滤，将第一次过滤后的滤液进行第二次过滤，得到尺寸小于50微米但大于或等于10微米的浮游生物；送至浮游生物和细胞计数器进行浮游生物的死活、大小、数量检测；
（3）第三次过滤，将第二次能所得到的滤液进行第三次过滤，得到含有尺寸大于0.45微米的细菌样品；将含有细菌的过滤液首先进行PMA处理，然后进行PCR扩增，最后进行细菌检测。PMA是一种常用于检测活菌的试剂，PMA只能与死菌DNA分子共价交联，抑制该DNA分子PCR扩增，从而区分出死细菌和活细菌。但是目前PMA常用于食品、药品等领域，一般样品中细菌浓度较高，甚至达到百万级，没有用于符合IMO D2标准的细菌浓度非常低的压载水领域的细菌检测。
进行细菌检测时，PMA处理及PCR的具体步骤如下：
1) 过滤细菌后的0.45μm滤膜一张（置于滤膜管中）；
2) 加入1毫升强化剂；
3) 调暗灯光，把PMAxx用纯水稀释5倍，取2.5微升加入到加了强化剂的滤膜管；
4) 在黑暗中室温放置10分钟并不时混匀；
5) 放在650瓦卤素灯20厘米处照射15分钟；
6) 开动真空泵抽走液体；
7) 蒸馏水清洗滤膜后由真空泵抽走；
8) 清洗后的细菌反冲至内含qPCR试剂（Taq聚合酶、缓冲液、引物和探针）的qPCR芯片；
9) qPCR反应条件 95度 5分钟 （95度 5秒，64度30秒，40循环）；
10) 结果以qPCR 曲线和Ct值来表示。
每一次过滤后得到的样品利用反冲单元反冲进入检测单元用于检测。
所述过滤是采用孔径为0.45μm的过滤膜 进行。
第三次过滤是在一定压力下进行，这有利于加快过滤速度，缩短整个检测时间。
步骤（1）中，进行第一次过滤的压载水为从压载水舱舱中取的样品，具体量可根据当地的规定取样，如美国海岸警卫队规定取样3m3，IMO规定取样1m3，并在第一次过滤前，压载水经过初步过滤，采用300微米进行过滤，并对初滤得到的浮游生物中活的浮游生物进行计数，然后将滤液进行第一次过滤，判断压载水中尺寸大于50微米的活的浮游生物的数量时，将初滤和第一次过滤得到的结果相加作为最终结果。
整个工艺流程公用一个反冲系统及一台浮游生物和细胞计数器，减少费用，节约占地。
相应地，本实施例提供可实现该检测方法的用于压载水处理后的检测系统，包括过滤单元、与过滤单元连接的浮游生物检测单元和细菌检测单元，其中，浮游生物检测单元为浮游生物和细胞计数器，细菌检测单元包括串联的PMA处理系统和PCR仪，PMA处理系统包括PMA试剂盒、反应罐、取样器。
所述过滤单元包括串联的第一、第二和第三子过滤单元，第一子过滤单元和第二子过滤单元收集到的样品分别用于浮游生物检测，包括浮游生物的生命状态、大小及数量，第三子过滤单元收集到的样品用于细菌检测。所述第一子过滤单元为孔径为50微米的过滤膜 ，所述第二子过滤单元为孔径为10微米的过滤膜 ，第三子过滤单元为孔径0.45微米的过滤膜。
所述系统还包括过滤加压系统，与过滤单元连接，在过滤时提供一定压力，加快过滤速度。所述过滤加压系统为真空泵或蠕动泵，这类泵，在工作过程中，不会有液体进入并经过泵，不会对压载水中的细菌造成干扰和污染。
所述系统还包括与过滤单元连接的反冲单元，反冲单元将过滤单元过滤得到的浮游生物反冲到检测单元，然后检测单元执行浮游生物的检测并显示检测结果。反冲单元包括反冲液罐（反冲液水柜）、反冲管道及泵（正压泵）；反冲管道连接反冲液罐、泵及过滤单元。
所述系统还包括滤液收集单元，用于收集过滤单元过滤后的滤液。所述滤液收集单元包括第一收集罐、第二收集罐、第三收集罐，第一收集罐用于收集第一子过滤单元过滤后的滤液，第二收集罐用于收集第二子过滤单元过滤后的滤液，第一收集罐与第一子过滤单元和第二子过滤单元通过管道连接，通过泵将第一收集罐里的滤液送至第二子过滤单元，第二收集罐与第二子过滤单元和第三子过滤单元通过管道连接，通过泵将第二收集罐里的滤液送至第三子过滤单元，第三收集罐用于收集第三子过滤单元的滤液。
所述第三子过滤单元包括三个并列的细菌过滤单元，每个细菌过滤单元均与反冲单元和第三滤液收集罐连接，收集到的样品分别用于检测大肠杆菌、肠球菌和产毒霍乱弧菌（O1和O139）。当需要检测的细菌种类不同于这些时，可适当更换检测目标及检测手段、引物等等。
所述系统还包括初滤单元（孔径为300微米滤膜），初滤单元布置在过滤单元的进水管路上，压水在先经过初滤单元，在进入过滤单元。所述系统还包括与压载水舱舱连接并将压载水送至过滤单元的取样单元，取样单元包括蓄水罐（压载水柜）和泵，优选泵为蠕动泵或真空泵。为了节约占地，所述系统只包括一个反冲单元和一个检测单元。所述系统还包括控制单元，调节阀门的开合，以控制液体的流动并实现自动化。
采用本实施例中的方法和系统，可快速、系统的检测压载水中浮游生物的死活、数量及细菌的死活、数量，包括但不限于大肠杆菌、肠球菌和产毒霍乱弧菌（O1和O139），从而判断是否符合IMO D2标准及美国海岸警卫队的要求。系统的各部件之间，一般都是通过管道直接连接即可，而且为了美观且更便于操作、保证系统的密闭性，可将各部件封闭在一个封闭的盒子里。在反冲单元及过滤单元的连接管道上、过滤单元的子单元之间的连接管道上、均设置球阀，阀门是基于将已过滤后的部分隔离开，然后开启反冲系统将反冲液注入。
原则上，本发明只配套一个反冲单元和一个浮游生物检测单元及一个细菌检测单元，以节约占地。当系统不含滤液收集单元时，直接由泵或真空吸力或管道将滤液送至下一个过滤单元。
以上实施例中，初步过滤也可以采用多规格滤膜的组合，例如，水流动方向上依次布置的300/100/70微米滤膜的组合，这样有助于减少过滤时间。在第二次过滤（10微米）之前，还可假设预过滤，采用20微米滤膜进行。
以上实施例中，压载水是按要求经过处理后的压载水。尽管本发明基于船舶压载水处理后的检测的研发，但业内人员容易理解，其也可用于原生水、水源检测、生活用水等。
除本发明特别说明的外，没有提及或没有详细说明的技术，均可采用现有技术中常见的技术来实现，在此不赘述。
需要说明的是，以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (10)
1.水质检测方法，步骤如下：对检测对象进行过滤，细菌检测，其特征在于，细菌检测采用PMA结合qPCR进行；优选所述过滤是采用孔径为0.45μm的过滤膜进行；且优选过滤是在一定压力下进行；优选过滤后得到的样品利用反冲单元收集，用于细菌检测；优选反冲单元的反冲液为灭菌纯水或缓冲液；优选检测对象为压载水，进一步优选为按规定处理后的压载水。
2.实现权利要求1所述的方法的水质检测系统，包括相互连接的过滤浓缩单元和细菌检测单元，其特征在于，细菌检测单元包括串联的PMA处理系统和PCR仪，PMA处理系统包括PMA试剂盒、反应罐、取样器；优选所述系统还包括过滤加压系统，与过滤单元连接，在过滤时提供一定压力；进一步优选所述过滤加压系统为真空泵或蠕动泵；优选所述系统还包括反冲单元，反冲单元包括反冲液罐、反冲管道及泵；反冲管道连接反冲液罐、泵及过滤单元；优选所述过滤单元包括三个并列的子过滤单元，每个自过滤单元均与反冲单元和滤液收集罐连接，收集到的样品分别用于检测大肠杆菌、肠球菌和产毒霍乱弧菌；优选所述过滤单元为孔径为0.45微米的过滤膜；优选还包括取样单元，将检测对象送入过滤单元，和/或还包括与过滤单元连接的滤液收集罐，和/或，所述系统还包括控制单元，调节阀门的开合，以控制液体的流动并实现自动化。
3.水质检测方法，步骤如下：对检测对象进行过滤，浮游生物检测，其特征在于，浮游生物检测采用浮游生物和细胞计数器进行，对浮游生物的死活、大小及数量进行判断及统计；优选所述过滤包括：
第一次过滤：取检测对象进行第一次过滤，得到尺寸大于或等于50微米的浮游生物；
第二次过滤，取第一次过滤后的滤液进行第二次过滤，得到尺寸小于50微米但大于或等于10微米的浮游生物；
对第一次过滤得到的浮游生物和/或第二次过滤得到的浮游生物用于浮游生物检测，检测死活、大小及数量。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，第一次过滤、第二次过滤后得到的浮游生物，采用反冲系统反冲进入浮游生物和细胞计数器；优选检测对象为压载水，进一步优选为按规定处理后的压载水；优选过滤前，检测对象经过初步过滤，采用70 至300微米单个或多个规格组合的过滤膜进行过滤，并对初滤得到的浮游生物中活的浮游生物进行计数，然后将滤液进行第一次过滤，判断检测对象中尺寸大于50微米的活的浮游生物的数量时，将初滤和第一次过滤得到的结果相加作为最终结果。
5.实现权利要求3-4任一项所述的检测方法的水质检测系统，包括过滤单元、与过滤单元连接的浮游生物检测单元，其特征在于，浮游生物检测单元为浮游生物和细胞计数器；优选所述系统还包括与过滤单元连接的反冲单元，反冲单元将过滤单元过滤得到的浮游生物反冲到检测单元，然后检测单元执行浮游生物的检测并显示检测结果；优选反冲单元包括反冲液罐、反冲管道及泵；反冲管道连接反冲液罐、泵及过滤单元。
6.如权利要求5所述的系统，其特征在于，所述过滤单元包括串联的第一和第二子过滤单元，第一子过滤单元和/或第二子过滤单元收集到的样品分别用于浮游生物检测，包括浮游生物的生命状态、大小及数量；优选所述第一子过滤单元为孔径为50微米的过滤膜，所述第二子过滤单元为孔径为10微米的过滤膜；优选所述系统还包括滤液收集单元，用于收集过滤单元过滤后的滤液，优选所述滤液收集单元包括第一收集罐和第二收集罐，第一收集罐用于收集第一子过滤单元过滤后的滤液，第二收集罐用于收集第二子过滤单元过滤后的滤液，第一收集罐与第一子过滤单元和第二子过滤单元通过管道连接，通过泵将第一收集罐里的滤液送至第二子过滤单元，系统也可免除滤液收集单元，直接由泵或真空吸力或管道将滤液送至下一个过滤单元；优选所述系统只包括一个反冲单元和一个检测单元，和/或，所述系统还包括初滤单元，初滤单元布置在过滤单元的进水管路上，检测对象先经过初滤单元，再进入过滤单元，优选所述初滤单元为孔径为70 至300微米单个或多个规格组合的滤膜；优选所述系统还包括与检测对象连接并将检测对象送至过滤单元的取样单元，取样单元包括蓄水罐和泵，优选泵为蠕动泵或真空泵，和/或所述系统还包括控制单元，调节阀门的开合，以控制液体的流动并实现自动化。
7.水质检测方法，步骤依次如下：
（1）第一次过滤，将检测对象进行第一次过滤，得到尺寸大于或等于50微米的浮游生物；送至浮游生物和细胞计数器进行浮游生物的死活、大小、数量检测；
（2）第二次过滤，将第一次过滤后的滤液进行第二次过滤，得到尺寸小于50微米但大于或等于10微米的浮游生物；送至浮游生物和细胞计数器进行浮游生物的死活、大小、数量检测；
（3）第三次过滤，将第二次能所得到的滤液进行第三次过滤，得到含有尺寸大于0.45微米的细菌样品；首先将细菌从过滤膜反冲下来，先进行PMA处理，然后进行PCR扩增，检测活细菌的存在以及数量；
优选每一次过滤后得到的样品利用反冲单元反冲进入检测单元用于检测；优选检测对象为压载水，进一步优选为按规定处理后的压载水。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述第三次过滤是采用孔径为0.45μm的过滤膜进行，且优选第三次过滤是在一定压力下进行，进一步优选，第一次过滤前，检测对象经过初步过滤，采用70 至300微米单个或多个规格组合的滤膜进行过滤，并对初滤得到的浮游生物中活的浮游生物进行计数，然后将滤液进行第一次过滤，判断检测对象中尺寸大于50微米的活的浮游生物的数量时，将初滤和第一次过滤得到的结果相加作为最终结果；优选整个工艺流程公用一个反冲系统及一台浮游生物和细胞计数器。
9.实现权利要求7-8任一项所述的水质检测系统，包括过滤单元、与过滤单元连接的浮游生物检测单元和细菌检测单元，其中，浮游生物检测单元为浮游生物和细胞计数器，细菌检测单元包括串联的PMA处理系统和PCR仪，PMA处理系统包括PMA试剂盒、反应罐、取样器，优选所述过滤单元包括串联的第一、第二和第三子过滤单元，第一子过滤单元和第二子过滤单元收集到的样品分别用于浮游生物检测，包括浮游生物的生命状态、大小及数量，第三子过滤单元收集到的样品用于细菌检测；优选所述第一子过滤单元为孔径为50微米的过滤膜 ，所述第一子过滤单元为孔径为10微米的过滤膜 ，第三子过滤单元为孔径0.45微米的过滤膜 ，优选所述系统还包括过滤加压系统，与第三过滤单元连接，在过滤时提供一定压力，加快过滤速度；优选所述过滤加压系统为真空泵或蠕动泵；优选所述系统还包括与过滤单元连接的反冲单元，反冲单元将过滤单元过滤得到的浮游生物反冲到检测单元，然后检测单元执行浮游生物的检测并显示检测结果；优选反冲单元包括反冲液罐、反冲管道及泵；反冲管道连接反冲液罐、泵及过滤单元；优选所述系统还包括滤液收集单元，用于收集过滤单元过滤后的滤液；所述滤液收集单元包括第一收集罐、第二收集罐、第三收集罐，第一收集罐用于收集第一子过滤单元过滤后的滤液，第二收集罐用于收集第二子过滤单元过滤后的滤液，第一收集罐与第一子过滤单元和第二子过滤单元通过管道连接，通过泵将第一收集罐里的滤液送至第二子过滤单元，第二收集罐与第二子过滤单元和第三子过滤单元通过管道连接，通过泵将第二收集罐里的滤液送至第三子过滤单元，第三收集罐用于收集第三子过滤单元的滤液。
10.如权利要求9所述的系统，其特征在于，所述第三子过滤单元包括三个并列的细菌过滤单元，每个细菌过滤单元均与反冲单元和第三滤液收集罐连接，收集到的样品分别用于检测大肠杆菌、肠球菌和产毒霍乱弧菌（O1和O139）；优选所述系统还包括初滤单元，初滤单元布置在过滤单元的进水管路上，压载水先经过初滤单元，再进入过滤单元；优选所述初滤单元为孔径为70 至300微米单个或多个规格组合的滤膜；优选所述系统还包括与检测对象舱舱连接并将检测对象送至过滤单元的取样单元，取样单元包括蓄水罐和泵，优选泵为蠕动泵或真空泵；优选所述系统包括一个反冲单元和一个检测单元，和/或，所述系统还包括控制单元，调节阀门的开合，以控制液体的流动并实现自动化。
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