JP2007535935A - オリゴヌクレオチド指向性の核酸配列の変更効率を増大させるための方法およびキット - Google Patents

Abstract

細胞のある集団において標的ＤＮＡ分子中の特定の遺伝子座における、効率の増大した、オリゴヌクレオチド指向性（ＯＤＳＡ）の遺伝子変更を果たすための方法、キットおよび細胞株が示される。１つの実施形態では、本発明は、標的細胞の集団内の細胞の細胞周期を調節することによってＯＤＳＡの効率を増大させるための方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、標的細胞の集団内でＤＮＡ修復経路を誘導することによってＯＤＳＡの効率を増大するための方法を提供する。

Description

（関連出願の相互参照）
本出願は、２００４年５月４日に出願された米国特許仮出願第６０／５６８，３３９号；２００４年５月２７日に出願された米国特許仮出願第６０／５７５，５６９号；２００４年１２月８日に出願された米国特許仮出願第６０／６３４，５８４号の利益を要求する。これらの内容は、参考として本明細書中に援用される。

（連邦政府より支援された関連研究）
本出願に記載される研究は、契約番号Ｒ０１ＣＡ８９３２５の下で、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ（ＮＩＨ）により支援された。

（発明の分野）
本発明は、核酸配列のオリゴヌクレオチド指向性の核酸配列の変更に関する。

（発明の背景）
単離されたＤＮＡ分子ならびに細菌、植物、真菌およびヒトを含む動物のインタクトな細胞に存在するＤＮＡの両方における特定のヌクレオチドを変更するための多数の方法が開発されている。

１つのアプローチでは、ゲノム配列を、二重フラグメントを用いる相同組み換えによる変更のために標的する。この二重のフラグメントは大型で、数百の塩基対を有する。例えば、非特許文献１を参照のこと。

別のアプローチでは、オリゴヌクレオチドを用いて標的された遺伝的変更を達成する。初期の実験では、オリゴヌクレオチド指向性の配列変更は代表的には、高い組み換え性活性を有することが公知である真核生物のなかでも酵母において達成された（非特許文献２および非特許文献３が、一連の実験はヒト細胞で試みられた（非特許文献４）。

さらに近年では、高等な真核生物の細胞において遺伝物質の標的された変更を可能にする多数の異なるタイプのポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドが記載されており、これには（ｉ）三重鎖形成オリゴヌクレオチド；（ｉｉ）特に配列変更を指向するヌクレオチドを含む領域において内部で二重鎖であるキメラＲＮＡ−ＤＮＡオリゴヌクレオチド；および（ｉｉｉ）内部が二重鎖でないＤＮＡドメインおよび修飾された末端を有する末端修飾された一本鎖オリゴヌクレオチドが挙げられる。配列変更三重鎖オリゴヌクレオチドは、例えば、特許文献１、特許文献２、および特許文献３に記載される。

三重鎖形成オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ二重鎖およびオリゴヌクレオチドの主な溝の間のフーグスティーン（Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ）相互作用を通じてＤＮＡらせん二重鎖に結合する構造ドメインを要する。この結合ドメインは代表的には、ポリプリン区域またはポリピリミジン区域を標的としなければならない。これらの配列要件は、標的された配列変更のための三重鎖形成オリゴヌクレオチドの有用性を制限し、このようなポリプリン区域またはポリピリミジン区域に接近して位置されるように標的配列が改変される必要がある。三重鎖形成オリゴヌクレオチドはまた、オリゴヌクレオチド／標的塩基組成物からのフーグスティーン相互作用が不十分である場合、オリゴヌクレオチドの三重鎖形成ドメインとＤＮＡ二重らせんとの間の相互作用を安定化させるために、ソラレンのようなさらなるＤＮＡ反応性部分がオリゴヌクレオチドに共有結合されることを必要とし得る。例えば、特許文献４を参照のこと。しかし、このようなＤＮＡ反応性部分は、無差別に変異原性であり得る。

配列変更三重鎖オリゴヌクレオチドを用いたさらに近年の研究では、三重鎖形成ドメインは、標的された変更を達成するドメインに連結または結合され（非特許文献５）標的配列とポリプリン／ポリピリミジンストレッチとの間で可能な距離をいくから弛緩させる。

内部で二重鎖にされたヘアピンおよび二重ヘアピン含有キメラＲＮＡ−ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、とりわけ、特許文献５；特許文献６；特許文献７；特許文献８；特許文献９；特許文献１０；特許文献１１；特許文献１２および特許文献１３に記載されている。このようなキメラＲＮＡ−ＤＮＡオリゴヌクレオチドは報告によれば、一塩基対の標的された変更を指向し得、そして細菌、真菌、植物および動物を含む種々の宿主生物体由来の細胞および無細胞抽出物において、フレームシフト変更を誘導し得る。このオリゴヌクレオチドは報告によれば、ほとんどの任意の標的配列上で作動し得る。

しかし、このようなキメラ分子は、リボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドの両方についての要件、そして代表的には、オリゴヌクレオチドが二重ヘアピン構成を採用する要件をも含む、有意な構造的要件を有する。しかし、このような二重ヘアピンが必要でない場合でさえ、重大な構造的制約は残る。

配列変更を指向する修飾された末端および内部が非二重鎖のＤＮＡドメインを有する一本鎖オリゴヌクレオチドは、特許文献１４；特許文献１５；特許文献１６；特許文献１７；および特許文献１８、ならびに特許文献１９および特許文献２０（これらの開示はその全体が参考として本明細書に援用される）のような公開された同時係属の国際特許出願に記載される。「遺伝子変更（ｇｅｎｅ ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ）」とは、反応を指向する改変された一本鎖オリゴヌクレオチドを用いて染色体の状況内で、一塩基変異が変更されるプロセスである。オリゴヌクレオチドが作用する機構は、十分理解されていないが、この経路はＤＮＡ対合工程およびＤＮＡ修復段階を含む可能性が高い。非特許文献６を参照のこと。

これらの一本鎖オリゴヌクレオチドは、キメラオリゴヌクレオチドよりも有する構造的な要件が少なく、そして細菌、真菌、植物および動物を含む種々の宿主生物体由来の細胞および無細胞抽出物において、エピソーム標的および染色体標的において、ヘアピン含有内部二重鎖キメラオリゴヌクレオチドを用いて観察されたものをしばしば超える変更効率で、配列変更（フレームシフト変異の導入を含む）を指向し得る。

オリゴヌクレオチド指向性核酸配列変更の有用性（例えば、クローニングされたＤＮＡを操作する手段、増強された形質を有する農産物を生成する手段、研究室の使用のための細胞モデルを生成する手段、または所望の区域（ｔｒａｉｔ）を有する動物モデルもしくは動物を作製する手段としての有用性）は、その頻度によって影響される。効率が増大することで、所望の変更を有する細胞を見つける前にスクリーニングしなければならない標的細胞の数を減らすことによって、所望の配列変更を有する細胞を得るのに必要な労力および費用が減らせる。エキソビボまたはインビボの治療方法として、オリゴヌクレオチド指向核酸配列変更の有用性はまた、その効率を増大することによって増強される。なぜなら、標的細胞の最小閾値は任意の所定の遺伝子疾患に臨床上関連する治療上の利点を与えるために変更されなければならない可能性が高いためである。
米国特許第６，３０３，３７６号明細書 米国特許第５，９６２，４２６号明細書 米国特許第５，７７６，７４４号明細書 米国特許第５，４２２，２５１号明細書 米国特許第６，５７３，０４６号明細書 米国特許第５，８８８，９８３号明細書 米国特許第５，８７１，９８４号明細書 米国特許第５，７９５，９７２号明細書 米国特許第５，７６０，０１２号明細書 米国特許第５，７８０，２９６号明細書 米国特許第５，７５６，３２５号明細書 米国特許第５，７３１，１８１号明細書 米国特許第５，５６５，３５０号明細書 国際公開第０３／０２７２６５号パンフレット 国際公開第０２／１０３６４号パンフレット 国際公開第０１／９２５１２号パンフレット 国際公開第０１／８７９１４号パンフレット 国際公開第０１／７３００２号パンフレット 米国特許第６，４７９，２９２号明細書 米国特許第６，２７１，３６０号明細書 Ｋｕｎｚｅｌｍａｎｎら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．（１９９６）３：８５９〜８６７ Ｍｏｅｒｓｃｈｅｌｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）（１９８８）８５：５２４ Ｙａｍａｍｏｔｏら、Ｙｅａｓｔ ８：９３５（１９９２）） Ｃａｍｐｂｅｌｌら、Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｂｉｏｌｏｇｉｓｔ（１９８９）１：２２３〜２２７。 Ｃｕｌｖｅｒら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９９）１７：９８９〜９３ ＢｒａｃｈｍａｎおよびＫｍｉｅｃ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．（２００２）４：１７１〜７６

従って、遺伝物質の標的化変更の効率を増大する方法の必要性が存在する。

（発明の要旨）
本発明は、オリゴヌクレオチド指向性核酸配列変更（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ）（ＯＤＳＡ）の効率を増大する方法およびキットを提供する。

１つの実施形態では、本発明は、標的細胞の集団内の細胞の細胞周期を調節することによってＯＤＳＡの効率を増大させるための方法を提供する。

別の実施形態では、本発明は、標的細胞の集団内でＤＮＡ修復経路を誘導することによってＯＤＳＡの効率を増大するための方法を提供する。

さらに別の実施形態では、本発明は、標的細胞の集団内でＤＮＡ損傷を誘導することによってＯＤＳＡの効率を増大するための方法を提供する。

さらなる実施形態では、本発明は、標的細胞の集団内で相同組み換え経路を誘導することによってＯＤＳＡの効率を増大するための方法を提供する。

別の実施形態では、本発明は、ヒドロキシウレア（ＨＵ）を用いて標的細胞の集団を処置することによって、ＯＤＳＡの効率を増大するための方法を提供する。

別の実施形態では、本発明は、エトポシド（ＶＰ１６）を用いて標的細胞の集団を処置することによって、ＯＤＳＡの効率を増大するための方法を提供する。

別の実施形態では、本発明は、チミジンを用いて標的細胞の集団を処置することによって、ＯＤＳＡの効率を増大するための方法を提供する。

別の実施形態では、本発明は、メチルメタンスルホネート（ＭＭＳ）を用いて標的細胞の集団を処置することによって、ＯＤＳＡの効率を増大するための方法を提供する。

別の実施形態では、本発明は、バルプロ酸（ＶＰＡ）を用いて標的細胞の集団を処置することによって、ＯＤＳＡの効率を増大するための方法を提供する。

別の実施形態では、本発明は、カンプトテシン（ＣＰＴ）を用いて標的細胞の集団を処置することによって、ＯＤＳＡの効率を増大するための方法を提供する。

別の実施形態では、本発明は、ジデオキシシチジン（ｄｄＣ）を用いて標的細胞の集団を処置することによって、ＯＤＳＡの効率を増大するための方法を提供する。

別の実施形態では、本発明は、カフェインを用いて標的細胞の集団を処置することによって、ＯＤＳＡの効率を増大するための方法を提供する。

別の実施形態では、本発明は、チミジン、ＨＵ、ＶＰ１６、ＶＰＡ、ＭＭＳ、カンプトテシン、ｄｄＣおよびカフェインからなる群より選択される１つの因子を用いて標的細胞の集団を処置することによって、ＯＤＳＡの効率を増大するための方法を提供する。

さらに別の実施形態では、本発明は、チミジン、ＨＵ、ＶＰ１６、ＶＰＡ、ＭＭＳ、カンプトテシン、ｄｄＣおよびカフェインからなる群より選択される複数の因子を用いて標的細胞の集団を処置することによって、ＯＤＳＡの効率を増大するための方法を提供する。

別の態様では、本発明は、上述の方法を行うためのキットを提供する。

さらに別の態様では、本発明は、上述の方法を行うのにおける使用のため、および／または上述のキットに包含するための細胞株を提供する。

（好ましい実施形態の詳細な説明）
ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、原核生物細胞および真核生物細胞のゲノムへ一塩基変換を導入するために用いられ得る。その開示が全体として参照によって本明細書に援用されるＬｉｕら、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．（２００３）４：６７９〜６８９を参照のこと。本発明者らの結果によって、ＤＮＡ複製のプロセスが停止されるかもしくは延長されるか、または二本鎖切断（ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄ ｂｒｅａｋｓ）（ＤＳＢ）が誘導される条件下で増殖される細胞は、より高頻度のオリゴヌクレオチド指向性の配列変更を支持することが示される。本明細書において用いる場合、「オリゴヌクレオチド指向性配列変更（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ）（ＯＤＳＡ）」は、「オリゴヌクレオチド媒介性配列変更（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ」と同義である。オリゴヌクレオチド指向性配列変更の頻度は、Ｓ期にある細胞においてより高く、細胞がＳ期を通過する割合を減らすことは、おそらく、二重鎖切断の蓄積および相同組み換え経路の活性化に起因して、標的化された遺伝子変更の頻度の増大をもたらす。

本発明者らの結果はまた、オリゴヌクレオチド指向性配列変更の頻度が、遺伝子修復および遺伝子編集を促進する酵素活性が誘導される細胞ではより高いということを示す。このような酵素活性またはＤＮＡ修復経路としては、限定はしないが、相同組み換え、ミスマッチ修復、ＲＡＤ５１およびＲＡＤ５２媒介組み換え、λβタンパク質の発現および非相同末端結合が挙げられる。

このようなＤＮＡ修復経路を誘導するための機構としては、ＤＮＡを損傷させること、細胞周期の間に細胞を失速させること、およびＳ期を通じた細胞の進行を遅らせることが挙げられる。ＤＮＡ損傷を誘導するための手段としては、制限酵素での消化、イオン化照射に対する曝露、または遺伝毒性物質に対する細胞の曝露（下にさらに詳細に考察する）が挙げられる。Ｓ期で細胞を引き止めるか、またはそうでなければゲノムあたりの複製フォークの数を増大させるための手段としては、ＨＵ、カンプトテシンまたは他の因子での細胞の処置が挙げられる。

全体として、本発明者らの結果により、ＯＤＳＡの効率は、細胞周期における標的細胞の位置およびＤＮＡ損傷応答経路の活性化によって影響され得ることが示される。例えば、本発明者らは、Ｓ期を通じて移行する、活発に複製している哺乳動物細胞は配列変更に対してより従順であること、そして配列変更の効率がＤＮＡ損傷に対する応答において相同組み換え経路の活性化によって再現可能に増強されるということを観察した。本発明者らはまた、標的遺伝子の複製および／または転写状態が変更の効率に影響し得るということを観察した。

本発明の方法、キットおよび細胞株は、以前の手順よりも効率的でありかつ再現可能であるオリゴヌクレオチド指向性遺伝子変更のための手順を提供するために、これらの観察を利用する。このような高度に効率的な遺伝子変更は、エキソビボまたはインビボの遺伝子治療のような多くの目的のための方法に特に有用なオリゴヌクレオチド指向性遺伝子変更を行うのに必須である。

本発明の方法は、細菌、植物、真菌および動物細胞がオリゴヌクレオチド指向性の配列変更によって変更される効率を増大し得る。関連の態様では、本発明は、本発明の方法の実施を達成または促進するためのキット；オリゴヌクレオチド指向性配列変更の効率を決定するための哺乳動物細胞株；および関連のビジネス方法を提供する。

（標的されたゲノムＤＮＡ）
標的されたゲノムＤＮＡは、正常な、細胞の染色体ＤＮＡであっても；細胞小器官のＤＮＡ、例えば、ミトコンドリアもしくはプラスミドのＤＮＡであっても；または種々の形態で細胞に存在する染色体外ＤＮＡであってもよく、これには、例えば、哺乳動物人工染色体（ＭＡＣ）、Ｐ−１ベクター由来のＰＡＣ、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、植物人工染色体（ＰＬＡＣ）、ＢｉＢＡＣＳ、ならびにエピソームＤＮＡが挙げられ、これには植物もしくは組み換えベクターのような外来の供給源由来のエピソームＤＮＡが挙げられる。ヒトＤＮＡを含むこれらの人工染色体構築物の多くは、例えば、Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅを含む種々の供給源から得ることが可能であり、そして例えば、Ｃｏｈｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３３６：６９８〜７０１（１９９３）およびＣｈｕｍａｋｏｖら、Ｎａｔｕｒｅ ３７７：１７５〜２９７（１９９５）に記載される。

標的された核酸部位は、転写的にサイレントであるかまたは転写的に活性であるＤＮＡの一部であり得る。標的された部位は、例えば、エキソン、イントロン、プロモーター、エンハンサーまたは３’−もしくは５’−非翻訳領域を含む遺伝子の任意の部分であってもよく、そして遺伝子間領域にあってもよい。

（配列変更オリゴヌクレオチド）
ある実施形態では、配列変更オリゴヌクレオチドは、標的配列の転写された鎖の変更を指向するように設計される；他の実施形態では、この配列変更オリゴヌクレオチドは、非転写鎖の変更を指向するように設計される。

遺伝子変更のレベルはまた、配列変更オリゴヌクレオチド内のミスマッチ塩基対（すなわち、標的遺伝子座）の位置によって影響され得る。最高の遺伝子変更効率は、標的遺伝子座が補正のオリゴヌクレオチドの中心付近である場合に得られ、これは標的遺伝子座がオリゴの３’末端付近に位置する場合の効率における約２分の１の減少から、最大で、この標的遺伝子座がオリゴの５’末端付近に位置する場合の１７分の１への減少である。

変更効率はまた、オリゴヌクレオチドを変更する配列が標的遺伝子の転写鎖または非転写鎖にハイブリダイズするように設計されるか否かに依存して変化し得、そしてある場合には、非転写鎖に対するハイブリダイゼーションは、より高い変更効率を生じる。さらに、ＣＯＳ１細胞におけるエピソームに対する、複製のＳＶ４０起点に対する変異ｅＧＦＰ遺伝子の方向が変わる実験によって、上述の転写鎖バイアスが確認され、そしてさらにＤＮＡ複製におけるラギング鎖が配列変更のさらに効率的な標的であることが示されている。これらの２つの効果は本明細書においては、「転写バイアス（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｂｉａｓ」および「複製バイアス（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｂｉａｓ）」と呼ばれるが、これは、他の細胞で、または他の遺伝子座では同じでないかもしれない。この鎖バイアスの結果によって、標的遺伝子座で両方の鎖に指向されるオリゴヌクレオチドは、最高の可能な変更効率を与えるオリゴヌクレオチドが決定されることを保証するように試験されるべきであることが示唆される。

配列変更オリゴヌクレオチドは、（ｉ）三重鎖形成オリゴヌクレオチド；（ｉｉ）特に、配列変更を指向するヌクレオチドを含む領域で内部が二重鎖になっている、キメラＲＮＡ−ＤＮＡオリゴヌクレオチド；および（ｉｉｉ）内部が二重鎖でないＤＮＡドメインおよび修飾された末端を有する末端修飾された一本鎖オリゴヌクレオチドを包含する、当該分野で公知の任意のタイプの配列変更オリゴヌクレオチドから選択され得る。例えば、その開示がその全体が参照によって本明細書に援用される、Ｌｉｕら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．（２００２）８０：６２０〜２８：Ｎａｋａｍｕｒａら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（２００４年２月１２日）１〜９；Ｂｅｒｔｏｎｉら、Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．（２００３）１２（１０）：１０８７〜９９；Ａｌｅｘｅｅｖら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（２００２）９：１６６７〜７５；Ｐｉｅｒｃｅら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（２００３）１０：２４〜３３；Ｓｕｚｕｋｉら、Ｉｎｔ’ｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．（２００３）１２：１０９〜１４；Ｋｒｅｎら、ＤＮＡ Ｒｅｐａｉｒ（２００３）２：５３１〜４６；Ｇｏｕｋａｓｓｉａｎら、ＦＡＳＥＢ Ｊ．（２００２年３月２６日）を参照のこと。

本発明によって、細胞内の核酸標的部位で所望の配列変更を達成する機能を行う方法では、このような変更を達成するための工程としては、限定はしないが、三重らせん形成オリゴヌクレオチド、内部で二重鎖であるキメラＲＮＡ−ＤＮＡオリゴヌクレオチド、または内部が二重鎖でないＤＮＡドメインおよび修飾された末端を有する末端修飾された一本鎖オリゴヌクレオチドを用いて細胞を処置する工程が挙げられる。

本発明の方法、組成物およびキットにおいて有用な配列変更三重鎖形成オリゴヌクレオチドは、例えば、その開示がその内容全体として参照によって本明細書に援用される、米国特許第６，３０３，３７６号、同第５，９６２，４２６号、および同第５，７７６，７４４号に記載される。本発明の方法、組成物およびキットにおいて有用である、標的された変更を果たすドメインに対して結合されるかまたは連結された三重鎖形成ドメインを有する二機能性のオリゴヌクレオチドは、その開示がその内容全体として参照によって本明細書に援用される、Ｃｕｌｖｅｒら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９９）１７：９８９〜９３に記載される。

本発明の方法、組成物およびキットにおいて有用である、内部が二重鎖であるヘアピンおよび二重ヘアピン含有キメラＲＮＡ−ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、その開示がその内容全体として参照によって本明細書に援用される、とりわけ、米国特許第６，５７３，０４６号；同第５，８８８，９８３号；同第５，８７１，９８４号；同第５，７９５，９７２号；同第５，７８０，２９６号；同第５，７６０，０１２号；同第５，７５６，３２５号；同第５，７３１，１８１号および同第５，５６５，３５０号に記載される。

ある実施形態では、配列変更オリゴヌクレオチドは、修飾された末端および配列変更を指向する内部が二重鎖でないＤＮＡドメインを有する一本鎖オリゴヌクレオチドである。このようなオリゴヌクレオチドは、その開示がその全体として参照によって本明細書に援用される、ＷＯ０３／０２７２６５；ＷＯ０２／１０３６４；ＷＯ０１／９２５１２；ＷＯ０１／８７９１４；およびＷＯ０１／７３００２、ならびに米国特許第６，４７９，２９２号および同第６，２７１，３６０号のような公開された同時係属の国際特許出願にさらに記載される。

「配列変更オリゴヌクレオチド（ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ａｌｔｅｒｉｎｇ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」とは、該当の遺伝子座で所望の配列（例えば、変更されるべき塩基に対してミスマッチ）を有し、かつその遺伝子座の両側（上流および下流）に標的ＤＮＡ分子に対して相補性の配列を有するように設計される。本明細書において用いる場合、「配列変更（ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ）」とは、所望の変更の任意の特定の表現型効果を意味するのではないものとする。同様に、「遺伝子変更（ｇｅｎｅ ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ）」という句は、任意の特定の得られた表現型を意味するのではないものとする。「遺伝子修復（ｇｅｎｅ ｒｅｐａｉｒ）」という句は、本明細書において「遺伝子変更（ｇｅｎｅ ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ）」と同義に用いられる。配列変更オリゴヌクレオチドおよび遺伝子変更事象とは、機能を修復する、機能を破壊する、遺伝子発現を上方制御もしくは下方制御する、または変更された表現型を生じようと生じまいと任意の他の変更を果たすものを包含する、任意の所望の遺伝子変更の導入を包含し得る。遺伝子修復という句は、本明細書において用いる場合、限定はしないが、遺伝子の機能損失を修復するという意味で「修復する（ｒｅｐａｉｒ）」ことには限定されず、代わりに一般には任意の所望の遺伝子変更をいう。このような変更としては、遺伝子の活性を増大もしくは減少いずれかをし得るか、または得られたタンパク質もしくは遺伝子活性が不変のままである、ナンセンス、フレームシフト、ミスセンスまたは他の変異の導入が挙げられる。「補正（ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ）」という用語および「遺伝子補正（ｇｅｎｅ ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ）」という句は、本明細書において用いる場合、限定するものではないが、変異体遺伝子が、失われた機能を修復するように変更されている場合、変異緑色蛍光タンパク質に対する活性を修復するかまたは遺伝子疾患を処置するためのアッセイと同様に、単純化のために用いられ得る。

配列変更オリゴヌクレオチドは、標的配列における１、２、３またはそれ以上のヌクレオチドの例えば、欠失、挿入または置換を含む、任意の種類の変更を指向し得る。これらの変更されたヌクレオチドは、お互いに対して隣接してもよく、または隣接してなくてもよい。多数の変更が、単独のオリゴヌクレオチドによって、または１、２、３もしくはそれ以上の別個のオリゴヌクレオチドによって標的部位に指向され得る。ある実施形態では、多数の変更が、単独のオリゴヌクレオチドによって指向される。ある実施形態では、この多数の変更は、お互いの１〜１０ヌクレオチド内である。

例えば、本発明の方法およびキットは、特定のアミノ酸コドンの改変により「ノックアウト（ｋｎｏｃｋ ｏｕｔ）」変異を生成して終止コドンを生成するために用いられ得る（例えば、グルタミンを特定するＣＡＡコドンは、特定の部位でＴＡＡに改変され得る；リジンを特定するＡＡＧコドンは、特定の部位でＴＡＧコドンに改変され得る；そしてアルギニンについてのＣＧＡコドンは、特定の部位でＴＧＡコドンに改変され得る）。このような塩基対変化は、リーディングフレームを終わらせ、終止コドンの部位で短縮される短縮タンパク質を生じ、この短縮されたタンパク質は、欠損があってもよく、または機能が変更されてもよい。あるいはフレームシフトの追加または欠失は、リーディングフレームを中断して誤った（ｇａｒｂｌｅｄ）下流タンパク質を生じるように特定の配列で指向されてもよい。このような終止変異またはフレームシフト変異を導入して、植物または動物の細胞のいずれかにおいてタンパク質をノックアウトするという効果を決定することができる。

本明細書において開示されるオリゴヌクレオチド指向性遺伝子変更方法およびキットは、多くの遺伝子疾患において治療変化を果たすように十分適応される。Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｄａｔａｂａｓｅ（＜ｈｔｔｐ：／／ａｒｃｈｉｖｅ．ｕｗｃｍ．ａｃ．ｕｋ／ｕｗｃｍ／ｍｇ／ｈｇｍｄ０．ｈｔｍｌ＞）によれば、公知の疾患発生遺伝子変異の大部分は、「微小損傷（ｍｉｃｒｏ−ｌｅｓｉｏｎ）」、すなわちミスセンス、ナンセンス、スプライシング、調節性および小さい欠失、挿入および挿入欠失（ｉｎｄｅｌ）として分類され得る。＜ｈｔｔｐ：／／ａｒｃｈｉｖｅ．ｕｗｃｍ．ａｃ．ｕｋ／ｕｗｃｍ／ｍｇ／ｄｏｃｓ／ｈａｈａｈａ．ｈｔｍｌ＞。

代表的な遺伝子修復実施形態では、配列変更オリゴヌクレオチドは、１７〜１２１ヌクレオチド長であり、そして少なくとも８連続するデオキシリボヌクレオチドの内部で二重でないドメイン（すなわち、非ヘアピンドメイン）を有する。このオリゴヌクレオチドは、それぞれの核酸標的の第一鎖の配列に対して配列中で、ただし１つ以上のミスマッチについて、内部で二重鎖でないデオキシリボヌクレオチドドメインと標的核酸の第一の鎖に対するその相補体との間のオリゴヌクレオチドの配列として、完全に相補的である。各々のミスマッチは、各々のオリゴヌクレオチドの５’末端および３’末端から少なくとも８ヌクレオチドに位置する。このオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの末端修飾を有する。

ある実施形態では、この少なくとも１つの末端修飾は、２’−Ｏ−メチル残基のような２’−Ｏ−アルキル；ホスホロチオエートヌクレオシド間結合；およびロックされた核酸（ｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）（ＬＮＡ）残基；からなる群より選択され得る。ＬＮＡおよび関連のアナログのこの塩基構造および機能的な特徴は、その開示がその全体として本明細書において参照として援用される、ＷＯ９９／１４２２６、ＷＯ００／５６７４８、ＷＯ００／６６６０４、ＷＯ９８／３９３５２、ならびに米国特許第６，０４３，０６０号および同第６，２６８，４９０号を含む、種々の刊行物および特許に開示されている。ある実施形態では、末端修飾は、複数の隣接するホスホロチオエートヌクレオシド間結合、例えば、オリゴヌクレオチドの３’末端の３つのホスホロチオエート結合を含む。

ある実施形態では、修飾された末端および配列変更を指向する内部が二重鎖でないＤＮＡドメインを有する複数の一本鎖オリゴヌクレオチドを、配列変更を果たすために用いてもよい。このような複数のオリゴヌクレオチドの使用は、その開示がその内容全体として本明細書において参照によって援用される、２００３年７月１８日出願の同時係属の米国特許出願第１０／６２３，１０７号（「Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ Ｕｓｉｎｇ Ｐｌｕｒａｌ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ」）に記載される。

本発明の方法、組成物およびキットにおいて用いられるオリゴヌクレオチドは、当業者に公知の任意の技術によって細胞または組織に導入され得る。このような技術としては、例えば：エレクトロポレーション；トランスフェクション；例えば、リポソーム、水性コア脂質ビヒクル、脂質ナノスフェアまたはポリカチオンを用いるキャリア媒介性送達；裸の核酸挿入；微粒子銃およびリン酸カルシウム沈殿が挙げられる。

ある実施形態では、オリゴヌクレオチドは、例えば、ＢＴＸ ＥＣＭ（登録商標）８３０ Ｓｑｕａｒｅ Ｗａｖｅエレクトロポレーターを用いるエレクトロポレーションを用いて導入される。エレクトロポレーションは、各々が１３ｍｓｅｃの長さの２つの２５０Ｖのパルスを用いて、１秒のパルス間隔で、４ｍｍのギャップキュベットで行われてもよい。他の実施形態では、エレクトロポレーションは、１、２、３または１０のパルスを用いて、１７０、２５０、３００、６００または２０００Ｖで、各々のパルスを１０、３０、７０または９９ｍｓｅｃ継続して行う。エレクトロポレーションはまた、２ｍｍのギャップのキュベット中で１、２、３または１０のパルスを用いて、２２５、３００、４８０または５００Ｖで、各々のパルスを２２、９９または１０００ｍｓｅｃ継続して行ってもよい。当業者は、エレクトロポレーションの特定の設定は実験間で異なってもよく、そして本発明の実施形態の重要ではない態様であるということを認識する。

他の実施形態では、トランスフェクションは、リポソーム移入化合物、例えば、ＤＯＴＡＰ（Ｎ−１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムメチルサルフェート、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）または等価物、例えば、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）を用いて行う。他の実施形態では、このトランスフェクション技術は、カチオン性脂質を用いる。ある実施形態では、トランスフェクションは、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ^ＴＭ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いて行う。なおさらなる実施形態では、トランスフェクションは、ＦｕＧＥＮＥ^ＴＭ６（ＦＧ）（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｃｏｒｐ．，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，Ｉｎｄｉａｎａ，ＵＳＡ）を用いて行う。

（選択性表現型）
本発明の方法およびキットのある実施形態では、配列変更オリゴヌクレオチドは、選択性表現型を生じる変更を指向する。他の実施形態では、他の実施形態では、配列変更オリゴヌクレオチドは、スクリーニングによって、例えば、対応する核酸配列を決定することによって、または変更事象によって生成される非選択性表現型をアッセイすることによって同定されるべき変更を、指向する。

本発明のある実施形態では、第二のオリゴヌクレオチドを追加して、第二の核酸標的部位で配列変更を果たし、この第二の配列変更は好都合にも、標的細胞に対して選択マーカー表現型を付与し、これによって第一の核酸標的部位で所望の配列変更を保有する細胞の特定が容易になる。このような実施形態は、２００３年１０月７日出願の同時係属の米国特許出願第１０／６８１，０７４号（「Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｒｅｄｕｃｉｎｇ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｉｎ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ」）にさらに考察され、その開示は、その全体が参照によって本明細書に援用される。

選択性表現型に関与する実施形態では、選り抜きの選択表現型は、選り抜きの宿主細胞に、そしてその選択がインビトロで達成されるかインビボで達成されるかに依存する。当該分野で周知のとおり、例示的な選択表現型としては、例えば、抗生物質または他の化学物質に対する耐性、栄養源を用いる能力、蛍光タンパク質の発現、エピトープの存在、またはアポトーシスシグナルに対する耐性が挙げられる。

この選り抜きの選択性表現型は、所望の配列変更を有する細胞の優先的な増殖に基づいて選択され得る。このような選択性の表現型の例としては、例えば、アポトーシスシグナルまたは抗生物質のような細胞を殺傷するかその増殖を阻害する化合物の存在下で増殖する能力、配列変更の前に必要な栄養物の非存在下で増殖する能力、または配列変更の前には不可能である特定の資源を利用する能力が挙げられる。

この選択性表現型はまた、機械的に選択されてもよい。機械的に選択され得る表現型の例としては、例えば、蛍光タンパク質または特定のエピトープの発現が挙げられる。機械的な選択は、例えば、蛍光活性化細胞分取器（ＦＡＣＳ）（蛍光タンパク質の場合直接、またはエピトープについては標識された抗体を用いる）、カラムクロマトグラフィーを含むか、または例えば、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ（Ａｕｂｕｒｎ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）によって作製された常磁性ビーズを用いる、当業者に公知の任意の手段によるものであってもよい。選択はまた、インタクトな細胞は要しない。例えば、核酸分子中の一塩基多型（ＳＮＰ）は、その開示がその全体として参照によって本明細書に援用される、ＷＯ０３／０２７６４０に記載されるような方法をインビトロで用いて検出および単離され得る。このような場合、配列変更オリゴヌクレオチドは、選択された分子における変化を果たす。

本発明による標的細胞における選択性表現型の有無を検出する機能を行う方法では、選択のための工程としては、限定はしないが、抗生物質または他の化合物に対する耐性、栄養源を用いる能力、蛍光タンパク質の発現、エピトープの存在、アポトーシスシグナルに対する耐性、アポトーシスシグナルまたは抗生物質のような代表的には細胞を殺傷するかまたはその増殖を阻害する化合物の存在下で増殖する能力、配列変更の前に必要な栄養物の非存在下で増殖する能力、配列変更の前には不可能である特定の資源を利用する能力、ならびに蛍光タンパク質または特定のエピトープの発現、について選択を行うことが挙げられる。

（ＤＬＤ−１−１哺乳動物細胞試験系）
緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）をコードする遺伝子の変異バージョンを担持する哺乳動物細胞株ＤＬＤ−１−１を、実施例１に記載のとおり構築する。このＤＬＤ−１−１細胞株は、他に特定しない限り本明細書に記載される実験における実験モデル系として用いられる。親のＤＬＤ−１細胞株に導入される変異ｅＧＦＰ遺伝子を担持するこの遺伝子カセットは野性型配列とともに、図１Ａに示される。この遺伝子の８７５位置での変異は、緑色蛍光タンパク質を不活性化する未成熟終止コドン（Ｙ２９１Ｘ）を生じる。図１Ｂは、配列変更オリゴヌクレオチド（ＥＧＦＰ３Ｓ／７２ＮＴ）および非特異的なコントロールオリゴヌクレオチド（Ｈｙｇ３Ｓ／７４ＮＴ）を示しており、これらが本明細書で記載される実験で用いられる（他に示す場合を除く）。

オリゴヌクレオチド指向性配列変更のための一般的プロトコールは、図２に模式的に示される。さらなる詳細は、実施例１および他の実施例に示される。本発明の多くの実施形態は、図２に列挙される工程に加えた工程を含んでおり、これには、配列変更の有効性を増大するためのエレクトロポレーションの前後の処置工程が挙げられる。いくつかの実施形態は、列挙された工程から逸脱するか、またはそれらの１つ以上を省略する。

ＤＬＤ−１−１実験試験系の有用性は、図３に図示されており、ここでは蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）データを、実施例１にさらに詳細に考察したとおり、５０，０００個の未処置の細胞と比較して、１０μｇのＥＧＦＰ３Ｓ／７２ＮＴで処置した５０，０００個の細胞におけるｅＧＦＰ遺伝子の補正について示している。下部右側の四分円における細胞の画分は、補正されたｅＧＦＰ遺伝子を有する、生細胞に相当し、これは、ＥＧＦＰ３Ｓ／７２ＮＴで処置した場合、０．０１％から１％を超えて増大する。

オリゴヌクレオチド指向性配列変更を測定するための別のモデルシステムは、酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株ＬＳＹ６７８（ＭＡＴａ ｌｅｕ２−３、１１２ｔｒｐｌ−１ ｕｒａ３−１ ｈｉｓ３−１、１５ａｄｅ２−１ ｃａｎ１−１００）で開発されている。この株は、ハイグロマイシン遺伝子のコード領域における塩基対１３７で単独の点変異を含む組み込まれたＨＹＧｅＧＦＰ融合遺伝子標的を有し、これによって抗生物質に対する耐性を付与することができなくなる。オリゴヌクレオチド指向性配列変更は、変異を修復して、ハイグロマイシン耐性を回復させ得る。例えば、１つの実施形態では、ＬＳＹ６７８細胞は、補正性のオリゴヌクレオチドを用いて、α因子と同調されて解放されるかまたはエレクトロポレーションの前にα因子と同調されて、ヒドロキシウレア（ＨＵ）に解放される。α因子およびＨＵの組み合わせは、いずれの因子でも処置されてないが、オリゴヌクレオチド処置のみを、Ｇ１／Ｓ境界からの解放後に特定の時点で行う場合の細胞と比較して、補正効率を２５倍に増大した。米国特許出願公開第２００３０２０７４５１号も参照のこと。

（細胞周期調節）
オリゴヌクレオチド指向性遺伝子変更の技術では、時に著名に高レベルのヌクレオチド変化が得られるが、哺乳動物細胞における遺伝子修復の頻度は高度に可変性であった。観察された変動は、平均して種々の段階の細胞周期にある標的細胞の集団の使用に、少なくとも部分的には起因し得る。本発明の方法の多くの実施形態は、細胞集団を用い、ここでは細胞周期の段階が調節されて配列変更の効率が増大される。

本発明のある実施形態では、配列変更に供されるべき細胞は、変更誘導性オリゴヌクレオチドでの処置の前に同調される。同調は、本明細書において用いる場合、細胞周期の任意の所定の段階における細胞の画分を増大するような細胞の集団の処置をいう。細胞の代表的な非同期性集団は、細胞周期の種々の段階、例えば、Ｓ期、Ｍ期、Ｇ１期およびＧ２期における細胞の混合物からなる。同調は、細胞周期の所定のポイントで細胞を停止させる処置、この停止因子または条件を取り除くこと、次いで必要に応じて、前に停止した細胞を細胞周期を通じて、細胞周期の事前に決定されたポイントに達するまで前進させることによって達成され得る。一旦細胞が細胞周期の所望の部分に進行されれば、次にそれらは配列変更オリゴヌクレオチドで処置されて、高度に効率的なオリゴヌクレオチド指向性配列変更が得られる。

一連の実施形態では、本発明は、Ｓ期における細胞について標的細胞の集団を富化することによって、オリゴヌクレオチド指向性配列変更の頻度を増大するための方法を提供する。オリゴヌクレオチド指向性遺伝子変更の最高の頻度は、Ｓ期の細胞で得られる。この方法は、細胞の非同調性の集団を同調させる他の工程と、細胞の集団を同調させてＳ期に進行させる工程と、この富化された集団にオリゴヌクレオチド指向性配列変更を行う工程とを包含する。

細胞を同調させる種々の手段は、本発明の方法において用いられ得る。ミモシンおよびシクロピロックスオラミンのようなＤＮＡ複製インヒビターは、ＤＮＡ複製の開始を阻害することによって細胞周期において細胞を停止させることが公知である。他の化合物、例えば、アフィジコリンは、ＤＮＡ複製の伸長を阻害することによって細胞周期において細胞を停止させる。本発明のいくつかの実施形態では、細胞は、ミモシンでの処置の前に、血清を欠く培地（それらは、「血清枯渇される（ｓｅｒｕｍ ｓｔａｒｖｅｄ）」）中で増殖される。細胞周期に対する、そして配列変更の効率に対するミモシン処置の効果は図４に図示する。実施例２は、配列変更に対するミモシンの効果を評価するために用いた実験プロトコールを記載する。この結果によって、最高の補正効率は、Ｓ期の細胞について最も高度に富化される細胞の集団中で観察され、ここで細胞の８６％がＳ期である集団については２．４９％という最適補正効率であることが示される。

寒冷ショックのような条件がまた、細胞の集団を同調するために用いられ得る。

細胞はまた、二重チミジンブロック（ＤＴＢ）を用いて同調されてもよい。例えば、その開示がその全体として参照によって本明細書に援用される、Ｌｕｎｄｉｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２００３）３２８：５２１〜５３５を参照のこと。細胞周期に対するＤＴＢの効果、および遺伝子変更の効率は、図９Ａおよび図９Ｂに図示される。実施例４は、遺伝子変更に対する二重チミジンブロックの効果を評価するために用いた実験プロトコールを記載する。図９Ａは、ＤＴＢがＳ期におけるＤＬＤ−１−１細胞の割合を半分から１．５％に低下させることを示しており、この時点で、細胞のほぼ完全に同調された集団は増殖停止から解放されて、細胞周期に再度入ることが可能になる。増殖の２４時間後、細胞を補正性のオリゴヌクレオチドの存在下でエレクトロポレーションする。図９Ｂにおける「コントロール（ｃｏｎｔｒｏｌ）」のデータは、ＤＴＢによる同期化が補正効率を増大することを示す。

ＨＵは、複製フォークの動きをブロックまたは遅延させることによって、Ｓ期の増殖している細胞を同期させるために用いられ得る。ＨＵおよびＶＰ１６はまた、細胞がＤＮＡ損傷および代謝ストレスに応答するため、培養物中の哺乳動物細胞における複製フォークの失速を生じる。遺伝子変更を増強させるためのＨＵおよびＶＰ１６の使用は、ＤＮＡ損傷剤を考察しているセクションにおいて以下でさらに詳細に考察する。

本発明による標的細胞の集団内の細胞の細胞周期を調節する機能を行う方法では、このような調節を果たすための工程としては、限定はしないが：ＨＵ、ミモシン、ＶＰ１６、シクロピロックスオラミンまたはアフィジコリンを用いて細胞を処置する工程；細胞を二重チミジンブロックに供する工程；細胞を血清枯渇させる工程；または細胞を寒冷ショックさせる工程が挙げられる。当業者は、標的細胞の細胞周期を可逆的に破壊する任意の適切な方法は、本発明による細胞周期同期化を果たすために有用であり得ることを理解する。

本明細書において用いる場合、調節とは、細胞周期の所定の部分に対して標的細胞の集団の同期化を容易にするために標的細胞のある集団において細胞周期の正常な進行を変更する工程をいう。

ＤＬＤ−１−１細胞におけるオリゴヌクレオチド指向性染色体配列変更を果たすための技術は、実施例１に、そしてその開示がその全体として参照によって本明細書に援用される、２００４年１１月１０日出願の同時係属の米国特許出願第１０／９８６，４１８号（「Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅｓ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ，Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ，ａｎｄ Ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ」）にさらに考察される。

細胞周期同期化、ＤＮＡ損傷およびＤＮＡ修復によってオリゴヌクレオチド指向性遺伝子変更で観察された増強は、機構的に関連し得、例えば、それらは、複製フォークで起こる遺伝子編集の程度を増大することによって全て作用し得る。しかし、この機構にかかわらず、本発明の方法は、遺伝子変更の効率を劇的に増大する。

配列変更の効率を増大するために細胞周期を調節する方法は、効率を増大するために、必要に応じて、本明細書に開示される他の方法を含む他の方法と組み合わされてもよい。

（ＤＮＡ損傷因子およびＤＮＡ修復誘導）
例えば、二重鎖破壊（ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ ｂｒｅａｋｓ）（ＤＳＢ）を誘導することによってＤＮＡを損傷させる因子は、遺伝子変更の効率を増大するために用いられ得る。これらのＤＮＡ損傷剤は、配列変更の効率の増強を得るために、単独で用いられてもよいし、または前に記載した細胞同期化方法と組み合わせて用いられてもよい。細胞周期調節方法およびＤＮＡ損傷剤は、累積的、または相加的に、または配列変更の頻度を向上するように相乗的な方式でさえ作用し得る。

細胞の集団を同調させるのにおいて細胞周期停止剤としてのそれらの使用に加えて、いくつかのＤＮＡ複製インヒビター（例えば、ＨＵ）はまた、標的ＤＮＡにおいて二重鎖破壊を誘導することによって、ならびに／または細胞内のＤＮＡ修復および組み換え経路の活性を誘導することによって、オリゴヌクレオチド指向性遺伝子修復の効率を直接増強し得る。

ＶＰ１６（エトポシドおよび４’−デメチルエピポドフィロトキシンー９−（４，６−Ｏ−エチリデン−β−Ｄ−グルコピラノシド）とも呼ばれる）は、抗癌薬であって、トポイソメラーゼＩＩの遊離活性の特異的な阻害を通じてＤＮＡ二重鎖破壊を誘導もする。ＶＰ１６誘導性の破壊が優先的に複製フォークで起こるか、またはランダムな部位で起こるかは明確でないが、両方の処置（ＨＵおよびＶＰ１６）は、ＨＲ経路を誘導することが示されており、ＤＮＡ損傷の結果として、ＨＲの頻度が増大する。ＤＮＡ損傷を誘導する以外に、ＨＵおよびＶＰ１６はまた、細胞がＤＮＡ損傷および代謝ストレスに応答するため、培養物中の哺乳動物細胞において複製フォークの失速を生じる。ＶＰ１６のような化学療法剤は、それらが患者の処置のためにＦＤＡによる使用のために承認されており、従って患者への処置された細胞の再導入の前にそれらを徹底的に取り除く必要なしに、インビボの遺伝子修復に用いられてもよいし、またはエキソビボの治療に用いられてもよいという利点を有する。

ＨＵおよびＶＰ１６を用いた処置は、ＤＬＤ−１−１細胞のＤＮＡにおいてＤＳＢを誘導する。図５は、図示のとおり、未処置である細胞（「Ｃ」）から得るか、または種々の濃度のＨＵもしくはＶＰ１６で処置した細胞から得た、ＤＮＡのパルス・フィールドゲルを示す。ＤＳＢの結果である、低分子量のＤＮＡのわずかなスメアーは、ＨＵおよびＶＰ１６で処置したレーンにおける高いＭＷバンドの下に出現したが、コントロールには生じない。

図６は、実施例３に記載されるように行ったＯＤＳＡ実験の結果を示す。ＤＬＤ−１−１細胞を、エレクトロポレーションの前に２４時間種々の濃度のＨＵまたはＶＰ１６に曝して、洗浄し、そして補正性のオリゴヌクレオチド（ＥＧＦＰ３Ｓ／７２ＮＴ）の存在下でエレクトロポレーションした。ＨＵおよびＶＰ１６の両方とも用量依存性の方式で補正効率を増大する。図６はまた、細胞の生存をこれらの毒性因子での処置の関数として示しており、これは、最高の用量でさえ、細胞のほぼ８０％以上が生存したままであることを示す。図７は、ＨＵおよびＶＰ１６でのＤＬＤ−１−１細胞の前処置の時間経過を示しており、これは補正効率がＨＵについてはほぼ３５時間で、そしてＶＰ１６については１２〜２４時間でプラトーに達することを示す。

両方とも複製インヒビターとして、従って細胞周期調節剤としての、そしてＤＮＡ損傷剤としてのＨＵおよびＶＰ１６の二重効果に起因して、図６および図７に示される補正効率の増強が、少なくとも一部は、細胞周期を調節するＨＵおよびＶＰ１６の能力に起因するか否かを決定することが目的である。図８は、ＨＵまたはＶＰ１６での処置の関数として細胞周期におけるＤＬＤ−１−１細胞の分布の分析を示す。細胞をＦＡＣＳ分析の前に、何もなし、１ｍＭのＨＵまたは３μｍのＶＰ１６を用いて２４時間処置する。未処置の培養物における細胞の半分がＳ期であるが、ＶＰ−１６処置した細胞の５６％、そしてＨＵ処置した細胞の７７％がＳ期である。この結果によって、補正効率に対するＨＵの効果は、少なくとも一部は細胞周期に対するその効果に起因し得ることが示唆される。

ＨＵおよびＶＰ１６のようなＤＮＡ損傷剤はまた、細胞同調方法と組み合わせて用いて、さらに大きい補正効率を得ることもできる。例えば、オリゴヌクレオチド指向性の配列変更は、例えばＤＴＢによって最初に同調され、次いでＨＵで処置される細胞中で増強される。図９Ｂは、実施例４にさらに詳細に考察されるとおり、ＤＴＢによる細胞同調、ならびにＨＵ、ＶＰ１６およびチミジンのようなＤＮＡ損傷剤での処置の併用効果を図示する。図９Ａは、ＤＴＢ手順が、上記で考察したとおり、ＨＵおよびＶＰ１６処置の前にＤＬＤ−１−１細胞を効率的に同調したことを示す。ＨＵおよびチミジンの場合、同調された細胞を用いる場合、非同調性の培養物に比較して補正効率の劇的な増大がある。補正効率はＨＵについて１０％に達し、これは非同調性細胞で得た補正効率の３倍を上回り、そしてチミジンについては７．５％であり、これは非同調性細胞で得た効率の７倍を上回る。対照的に、ＶＰ１６は、非同調性細胞において最高の効率を生じるが、同調された細胞を用いる場合には、効率は増大しない。

図９Ｂで示された結果によって、ＨＵ処置は、少なくとも一部は、細胞周期に対する効果以外のいくつかの機構によって、例えば、標的ＤＮＡにおける二重鎖破壊の数を増大させること、および／または細胞内のＤＮＡ修復／組み換え経路を誘導することによって作用しているということが示唆される。この機構にもかかわらず、同期させた細胞のＨＵを用いる処置は、遺伝子修復の効率を劇的に増大する。

ＨＵは、１００ｍＭ、７５ｍＭ、５０ｍＭ、４０ｍＭ、２０ｍＭ、１０ｍＭ、２ｍＭ、１ｍＭ、１００μＭ、１０μＭ、１μＭ、１００ｎＭ、１０ｎＭまたはそれ以下を含む濃度で用いられ得る。この用量は好ましくは、酵母細胞について約４〜１００ｍＭ、そして哺乳動物細胞について約０．０５ｍＭ〜３ｍＭである。この用量は、少なくとも０．５５ｍＭ、０．６０ｍＭ、０．６５ｍＭ、０．７０ｍＭ、０．７５ｍＭ、０．８０ｍＭ、０．８５ｍＭ、０．９０ｍＭ、０．９５ｍＭ、またはさらに１ｍＭ、１．１ｍＭ、１．２ｍＭ、１．３ｍＭ、１．４ｍＭ、１．４ｍＭ、１．５ｍＭ、１．６ｍＭ、１．７ｍＭ、１．８ｍＭ、１．９ｍＭ、２．０ｍＭ、２．５ｍＭ、３ｍＭもしくはそれ以上を含む少なくとも０．０５ｍＭ、０．１０ｍＭ、０．１５ｍＭ、０．２０ｍＭ、０．２５ｍＭ、０．３０ｍＭ、０．３５ｍＭ、０．４０ｍＭ、０．５０ｍＭもしくはそれ以上であってもよい。代表的には、哺乳動物細胞についての用量は、約３．０ｍＭ未満であり、そして２．５ｍＭ、２．０ｍＭ、１．５ｍＭ、１．０ｍＭ未満であってもよく、さらに０．９０、０．８５、０．８０、０．７５、０．７０、０．６５、０．６０、０．５５、０．５０、０．４５、０．４０未満であってさえ、そして約０．３５または０．３０ｍＭ未満であってさえよい。最適の投薬およびタイミングは、その開示がその全体として参照によって本明細書に援用されるＷＯ０３／０７５８５６に示されるアッセイシステムを用いて慣用的な実験によって決定され得る。

ある実施形態では、ＤＮＡ損傷は、アルキル化剤（例えば、メチルメタンスルホネート（ＭＭＳ））、代謝拮抗剤（例えば、ＨＵ）、ＤＮＡを有する付加物を形成する化合物（例えば、ベンゾピレン、アセチルアミノフルオレン）、トポイソメラーゼＩＩインヒビター（例えば、ＶＰ１６、ＶＭ−２６、ドキソルビシン、３’−ヒドロキシダウノルビシン、クロロキン、アジ化ナトリウム、Ａ−７４９３２、クリナフロキサシン、メノガリル、ＡＭＳＡ）またはＤＳＢ−誘導剤（例えば、ブレオマイシン）を用いて誘導される。本発明の他の実施形態では、ＤＮＡ損傷剤は、例えば、シスプラチン、亜ヒ酸ナトリウム、制限エンドヌクレアーゼ、バナジウム酸ナトリウム、臭化エチジウム（ＥｔＢｒ）、クロロキン、ＶＰ２６および重金属イオン、例えば、カドミウムおよび亜鉛を用いる。本明細書に列挙される薬剤の範疇は、必ずしも相互に排他的ではなく、すなわち、本発明の方法において有用な化合物については前述の範疇の２つ以上におさまることが可能である（例えば、単一の薬剤がトポイソメラーゼＩＩインヒビターおよびＤＮＡ損傷剤として分類されてもよい）ことに注意のこと。

本発明のさらに他の実施形態では、ＤＮＡ損傷は物理的な手段、例えば、紫外線または他の電離放射線への曝露によって達成される。紫外線への曝露は、４−ニトロキノリン−Ｎ−オキシド（４ＮＱＯ）に対する曝露によって模倣され得る。ＤＮＡ損傷を誘導する機能を達成する手段としては、ここに列挙される全ての処置および因子、ならびにそれらの等価物が挙げられる。当業者は、任意の適切なＤＮＡ損傷剤または処置が本明細書に列挙されるものの代わりに用いられ得、そして本発明の範囲内にやはりおさまり得るということを認識する。

図１０は、実施例５にさらに詳細に記載されるような、０．７５μＭのブレオマイシンおよび０．２μＭのＭＭＳを用いたＤＬＤ−１−１細胞の処置によって生じたＤＮＡ損傷を示すパルス・フィールドゲルを示す。ブレオマイシンおよびＭＭＳのレーンにおける下部のバンド、ならびにこれは「処置なし（ｎｏ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」のコントロールでは示されていない、ＭＭＳレーンにおける下部のスメアーは、これらの因子によって誘導されるＤＳＢの結果であるＤＮＡフラグメントに相当する。このデータによって、これらの薬剤が、用いた実験条件下でＤＬＤ−１−１細胞においてＤＮＡを損傷することが確認される。

図１１Ａは、ＭＭＳ−処理されたＤＬＤ−１−１細胞上で行われた遺伝子補正実験の結果を示しており、これによって、ＭＭＳの前処置は補正効率を２倍より大きくすることが示される。図１１Ｂは、図１１Ａで図示された実験の複製を示しており、また細胞を、４ｍＭカフェインを用い、０．２μＭのＭＭＳを有無において処置する実験を包含する。両方のカフェイン実験とも、補正性のオリゴヌクレオチド以外の処置なしのコントロール実験よりも低い補正効率が得られた。

図１２は、ワートマニン（ＷＭ）を用いた細胞の前処置の効果を試験する実験の結果を示す。ＤＬＤ−１−１細胞は、示した濃度でＷＭを用い、３０ｎＭのＣＰＴの有無によって、補正性のオリゴヌクレオチドの存在下でのエレクトロポレーションの前に２４時間処置する。

図１３Ａは、ＤＬＤ−１−１システムにおいて、ジデオキシシチジン（ｄｄＣ）を用いる細胞の前処理の補正効率に対する効果を試験するための実験の結果を示す。ｄｄＣは、５００〜７５０μＭで用いた場合、補正効率を２倍より大きく増大する。

図１３Ｂは、カフェインを用いて、エレクトロポレーションの前（「前（ｐｒｉｏｒ）」）、またはエレクトロポレーションの後（「回復（ｒｅｃｏｖｅｒｙ）」のいずれかで、ｄｄＣ処置の有無によって、ＤＬＤ−１−１細胞を処置する実験の結果を示す。この結果によって、カフェインがＭＭＳと組み合わせて用いられる場合に観察されるとおり（図１１Ｂ）、カフェインは、前処置として用いられる場合、補正効率を低下させるが、これは、回復相で用いられる場合に補正効率を劇的に増大することが示される。図１３Ｄによって、カフェインの効果がより長く改善し、試験した最長時間（４８時間）まで回復相に含まれることが示される。図１３Ｃによって、１ｍＭのバニリンは、それが添加される時点にかかわらず、そしてｄｄＣ処置と組み合わされるか否かにかかわらず、補正効率に影響を有さないことが実証される。

図１４Ａおよび図１４Ｂは、３μＭ ＣＰＴを用いた１時間の細胞の処置、その後の種々の時間（０〜１０時間）の解放の結果を示す。例えば、「１Ｈ＋１０」データポイントとは、１時間ＣＰＴで処置され、次いでＢｒｄＵ標識またはエレクトロポレーションの前に新鮮なＣＰＴ培地中で１０時間インキュベートされた細胞を指す。「０」時と記されたデータポイントは、ＣＰＴで処置されていない細胞である。

図１４Ａは、ＤＬＤ−１−１細胞であって、処置していないか、または３μＭのカンプトテシン（ＣＰＴ）で１時間処置し、この時点でＣＰＴが洗い流され新鮮なＣＰＴなしの培地が添加されている、ＤＬＤ−１−１細胞のＢｒｄＵ取り込み（コントロールのパーセントとして）を示している。次いで、ＢｒｄＵ標識の前に細胞を種々の時間インキュベートして、ＢｒｄＵ取り込みをＣＰＴ後インキュベーション時間の関数としてプロットする。図１４Ｂは、処置したＤＬＤ−１−１細胞をＢｒｄＵ標識ではなく補正性のオリゴヌクレオチドの存在下でエレクトロポレーションする以外は、図１４Ａのものと同じ方法で処置したＤＬＤ−１−１細胞についての補正効率（コントロールに対する）を示す。

図１４Ｃは、３０〜１００ｎＭで用いた場合、ＣＰＴでのＤＬＤ−１−１細胞の前処理が補正効率を３倍にすることを示す。

図１４Ｄは、一連のＯＤＳＡ実験における補正効率（割合として）を、ＣＰＴ単独で、または他の因子と組み合わせた処置および関連のコントロールの処置の関数として示す。ＤＬＤ−１−１細胞は、示したとおり、同時にまたは連続して、示された因子で１時間処置される。次いで、この処置した細胞を、補正性のオリゴヌクレオチドの存在下でエレクトロポレーションして、補正効率を決定する。左から右で、細胞は未処置であるか、または４ｍＭのカフェイン、３０ｎＭのＣＰＴ、または４ｍＭカフェインおよび３０ｎＭのＣＰＴの混合物で処置される。「ＣＰＴ、２４時間、解放（ＣＰＴ ２４ｈ ｒｅｌｅａｓｅ）」とは、３０ｎＭ ＣＰＴで処置され、続いて洗浄工程およびエレクトロポレーションの前のさらに１時間の新鮮培地中でのインキュベーションを受ける細胞を指す。次のデータポイントは、同様であるが、第二の１時間のインキュベーションには４ｍＭのカフェインを含む。データは、１ｍＭのバニリンおよび１ｍＭのバニリンと３０ｎＭのＣＰＴとの混合物での処置について示す。

（高度に効率的なオリゴヌクレオチド指向性遺伝子変更の利点）
本発明の実施形態は、植物およびヒトを含む動物において遺伝子治療を行うのに有用であり得る。エキソビボ遺伝子治療は、生物体からの細胞の取り出し、インビトロの遺伝子治療および処置された細胞の宿主生物体（または、ある実施形態では、異なる宿主生物体）への置き換えを含む。例えば、多くのヒト疾患は、末梢血のサンプルからこのような細胞を取り出すこと、遺伝子変更を達成すること、および処置された細胞を患者の血流に再導入することにより、造血幹細胞の染色体において変化を達成することによって処置され得る。本発明のＯＤＳＡ方法は、遺伝子変更の効率を増大するための細胞周期調節に関与しており、これらの単離された造血幹細胞における遺伝子修復を達成するために用いられ得る。ある実施形態では、エキソビボ遺伝子治療を受けている細胞は、損傷からそれらを保護するように設計された方法、例えば、その開示がその全体として参照によって本明細書に援用される米国特許出願公開第２００３／０１３４７８９Ａ１号に記載の方法を用いて処置される。

本発明の方法およびキットは、核酸配列の標的化変更を指向する任意のオリゴヌクレオチドで用いられ得る。例えば、オリゴヌクレオチドは、例えば、ＡＤＡ、ｐ５３、βグロビン、ＲＢ、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＣＦＴＲ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＡＰＣ、第Ｖ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、ヘモグロビンα１、ヘモグロビンα２、ＭＬＨ１、ＭＳＨ２、ＭＳＨ６、ＡｐｏＥ、ＬＤＬレセプター、ＵＧＴ１、ＡＰＰ、ＰＳＥＮ１およびＰＳＥＮ２を含む多くのヒト遺伝子における配列を変更するように設計され得る。さらなる遺伝子を下に列挙する。

本発明の方法およびキットは代表的には、オリゴヌクレオチド指向性核酸配列変更を用いて、本発明の方法によって以前に処置されていない標的細胞の集団を用いて得られた効率に対して少なくとも約２倍まで、遺伝子変更の効率を増大する。遺伝子変更のこの効率の増大は、少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、３０および５０倍以上であり得る。

本発明の方法およびキットはまた、オリゴヌクレオチド指向性核酸配列変更を用いて、少なくとも約０．２、０．４、０．６、０．８、１、１．２、１．２、１．４、１．６、１．８、２、２．２、２．４、２．６、２．８、３、３．３、３．７、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１７パーセント以上の補正効率まで、遺伝子変更の効率を増大し得る。

ある実施形態では、変換の効率は、変換事象を受けている回復された基質の標的分子の割合として規定される。あるいは、標的遺伝子物質（例えば、細胞における染色体外エレメント）の性質に依存して、効率は、特定の表現型を示す染色体外エレメントを含む細胞またはクローンの割合として示され得る。配列変更オリゴヌクレオチドが、選択性の表現型を生じる変更を指向する実施形態では、変換の効率は、選択性の表現型についてアッセイされる標的細胞（またはそのクローン）の総数の画分として、選択性の表現型を示す標的細胞（またはそのクローン）の割合として表され得る。あるいは、変更によって付与される表現型が非選択性である実施形態では、標的遺伝物質の代表的なサンプルは、所望の変化を獲得している割合を決定するために、例えば、配列決定、対立遺伝子特異的なＰＣＲまたは匹敵する技術によって分析され得る。

（匹敵する細胞タイプ）
変更は通常、ヒトの細胞、例えば、肝臓、肺、結腸、頸部、腎臓および上皮細胞を含む哺乳動物細胞において本発明の方法によって行われ得る。

本発明の方法による所望の配列変更のために有効に標的され得る培養された哺乳動物細胞としては、ＨＴ１０８０細胞（ヒト上皮線維肉腫）、ＣＯＳ−１およびＣＯＳ−７細胞（アフリカミドリザル）、ＣＨＯ−Ｋ１細胞（チャイニーズハムスター卵巣）、Ｈ１２９９細胞（ヒト上皮癌腫、非小細胞肺癌）、Ｃ１２７Ｉ（不死のマウス乳腺上皮細胞）、ＭＥＦ（マウス胚性線維芽細胞）、ＨＥＣ−１−Ａ（ヒト子宮癌腫）、ＨＣＴ１５（ヒト結腸癌）、ＨＣＴ１１６（ヒト結腸癌）、ＬｏＶｏ（ヒト結腸腺癌）およびＨｅＬａ（ヒト子宮頸癌）の癌細胞、ならびにＰＣ１２細胞（ラットのクロム親和細胞腫）が挙げられる。

その開示がその全体として参照によって本明細書に援用される、ＷＯ０３／０２７２６４として発行された同時係属の国際特許出願および米国特許出願第１０／２６０，６３８号に記載されるように、培養された哺乳動物細胞における変更を有効に行って、類似遺伝子型の細胞コレクションを作製してもよい。このような類似遺伝子型のコレクションにおいて有効に標的された遺伝子としては、薬物耐性（薬物感度と等価）または薬物代謝に影響する遺伝子座が挙げられ、これには、以下が挙げられる：ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｃ１７、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ｅ、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ４Ａ１１、ＣＹＰ１Ｂ１、ＣＹＰ１Ａ１、ＣＹＰ２Ａ６、ＣＹＰ２Ａ１３、ＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ２Ｃ８、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ１１Ａ、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｆ１、ＣＹＰ２Ｊ２、ＣＹＰ３Ａ５、ＣＹＰ３Ａ７、ＣＹＰ４Ｂ１、ＣＹＰ４Ｆ２、ＣＹＰ４Ｆ３、ＣＹＰ６Ｄ１、ＣＹＰ６Ｆ１、ＣＹＰ７Ａ１、ＣＹＰ８，ＣＹＰ１１Ａ、ＣＹＰ１１Ｂ１、ＣＹＰ１１Ｂ２、ＣＹＰ１７、ＣＹＰ１９、ＣＹＰ２１Ａ２、ＣＹＰ２４、ＣＹＰ２７Ａ１、ＣＹＰ５１、ＡＢＣＢ１、ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＣ１、ＡＢＣＣ２、ＡＢＣＣ３、ＡＢＣＣ４、ＡＢＣＣ５、ＡＢＣＣ６、ＭＲＰ７、ＡＢＣＣ８、ＡＢＣＣ９、ＡＢＣＣ１０、ＡＢＣＣ１１、ＡＢＣＣ１２、ＥＰＨＸ１、ＥＰＨＸ２、ＬＴＡ４Ｈ、ＴＲＡＧ３、ＧＵＳＢ、ＴＭＰＴ、ＢＣＲＰ，ＨＥＲＧ、ｈＫＣＮＥ２、ＵＤＰグルクロノシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）、スルホトランスフェラーゼ、スルファターゼ、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）−α、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ−μ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ−π、ＡＣＥおよびＫＣＨＮ２。

他の実施形態では、標的された変更が本発明の方法に従ってその中で有効に発効され得る細胞としては、前駆細胞および幹細胞−両方とも（胚性）（ＥＳ）幹細胞および非ＥＳ細胞、例えば、造血前駆細胞または幹細胞が挙げられ、これにはＣＤ３４^＋ＣＤ３８⁻造血前駆体および幹細胞および筋由来幹細胞が挙げられる。

標的された配列変更がヒトの非ＥＳ細胞、例えば、造血前駆細胞または幹細胞、例えば、ＣＤ３４^＋ＣＤ３８⁻造血幹細胞で行われる本発明の方法の特定のエキソビボ実施形態では、配列変更された細胞が、エキソビボの遺伝子治療のためにヒト被験体に再導入され得る。

ＥＳ細胞は、哺乳動物ＥＳ細胞、非ヒト哺乳動物ＥＳ細胞またはヒトＥＳ細胞のいずれであってもよく；ヒトＥＳ細胞は、例えば、本発明の方法、組成物およびキットが用いられるべき管轄における使用について承認された細胞株由来であってもよい。例えば、米国における使用のためには、国の法律も政府の法律も破らない任意のヒト肝細胞株、例えば、米国の連邦政府補助金基準を満たす細胞株などが用いられ得る；国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）は、これらの既存の幹細胞株のリスト（ｈｔｔｐ：／／ｅｓｃｒ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）を保持しており、これは、以下によって保持されるリストを含む：ＢｒｅｓａＧｅｎ，Ｉｎｃ．，Ａｔｈｅｎｓ，Ｇｅｏｒｇｉａ（２つの利用可能な株）；ＥＳ Ｃｅｌｌ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ（６つの利用可能な株）；ＭｉｚＭｅｄｉ Ｈｏｓｐｉｔａｌ−Ｓｅｏｕｌ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｅｏｕｌ，Ｋｏｒｅａ（１つの利用可能な株）；Ｔｅｃｈｎｉｏｎ−Ｉｓｒａｅｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｈａｉｆａ，Ｉｓｒａｅｌ（２つの利用可能な株）；Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ（１つの利用可能な株）；Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ａｌｕｍｎｉ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ（５つの利用可能な株）。

本発明の方法のいくつかのエキソビボの実施形態では、標的された配列変更が、ヒトＥＳ細胞で行われ、これはその後に用いられて、法的に可能であれば、組織を生成するか、または許されれば、生きた胚を生成する。

（非ヒト哺乳動物細胞）
標的された配列変更が非ヒト細胞、例えば、非ヒト哺乳動物ＥＳ細胞または植物細胞で行われる本発明の方法の特定のエキソビボ実施形態では、配列変更された細胞を用いて、インタクトな生物体を生成し得、その後にこれを増殖させ得る。

例えば、本発明の方法は、所望の形質の発現を増強、および／または所望されない形質の発現を減少するために、最初に遺伝子操作された細胞を作製することによって、家畜−例えば、ウシ、バイソン、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ニワトリ、ガチョウ、アヒル、シチメンチョウ、キジ、ダチョウおよびハトを含む遺伝子操作された動物を作製するために用いられ得る。他の実施形態では、本発明の方法は、マウス、ラット、モルモットを含むげっ歯類；ウサギのようなウサギ目の動物；サル；類人猿；イヌ；およびネコのような実験動物として有用な遺伝子操作された動物を作製するために用いられ得る。遺伝子操作された細胞を含むトランスジェニック動物を生成するための方法は、当該分野で公知であり、そして例えば、その開示がその全体として参照によって本明細書に援用されるＷＯ００／５１４２４「Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｕｓｅｓ Ｔｈｅｒｅｏｆ」に開示されている。

本発明のさらなる態様は、それによって生成される非ヒト動物である。

（植物細胞）
さらに他の実施形態では、標的された変更がその中で行われている細胞は、植物細胞である。

公知の核酸配列変更により植物中で得られ得る所望の表現型としては、例えば、除草剤耐性；雄性不稔または雌性不稔；塩、干ばつ、鉛、凍結および他のストレス耐性；変更されたアミノ酸含量；デンプンの変更されたレベルまたは組成；油分の変更されたレベルまたは組成；ならびにセリアック病を有する個体において自己免疫応答を引き起こすことが公知であるグルテン中のエピトープの排除が挙げられる。

用いられるべき細胞が引き出され得る特に有用な植物としては、作物、例えば、カリフラワー（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ）、アーティチョーク（チョウセンアザミ）（Ｃｙｎａｒａ ｓｃｏｌｙｍｕｓ）、果物、例えば、リンゴ（Ｍａｌｕｓ、例えば、ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓ）、マンゴー（Ｍａｎｇｉｆｅｒａ、例えば、ｉｎｄｉｃａ）、バナナ（Ｍｕｓａ、例えば、ａｃｕｍｉｎａｔａ）、ベリー（例えば、干しブドウ、Ｒｉｂｅｓ、例えば、ｒｕｂｒｕｍ）、キーウィ（Ａｃｔｉｎｉｄｉａ、例えば、ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）、ブドウ（Ｖｉｔｉｓ，例えば、ｖｉｎｉｆｅｒａ）、ピーマン（Ｃａｐｓｉｃｕｍ、例えば、ａｎｎｕｕｍ）、サクランボ（例えば、セイヨウミザクラ、Ｐｒｕｎｕｓ、例えば、ａｖｉｕｍ）、キュウリ（Ｃｕｃｕｍｉｓ、例えば、ｓａｔｉｖｕｓ）、メロン（Ｃｕｃｕｍｉｓ、例えば、ｍｅｌｏ）、ナッツ（例えば、クルミ、Ｊｕｇｌａｎｓ、例えば、ｒｅｇｉａ；ピーナッツ、Ａｒａｃｈｉｓ ｈｙｐｏｇｅａｅ）、オレンジ（Ｃｉｔｒｕｓ、例えば、ｍａｘｉｍａ）、ピーチ（Ｐｒｕｎｕｓ、例えば、ｐｅｒｓｉｃａ）、洋ナシ（Ｐｙｒａ、例えば、ｃｏｍｍｕｎｉｓ）、プラム（Ｐｒｕｎｕｓ、例えば、ｄｏｍｅｓｔｉｃａ）、イチゴ（Ｆｒａｇａｒｉａ、例えば、ｍｏｓｃｈａｔａ またはｖｅｓｃａ）、トマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ、例えば、ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）；葉および飼料、例えば、アルファルファ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ、例えば、ｓａｔｉｖａまたはｔｒｕｎｃａｔｕｌａ）、キャベツ（例えば、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ）、エンダイブ（Ｃｉｃｈｏｒｅｕｍ、例えば、ｅｎｄｉｖｉａ）、リーク（西洋ニラネギ）（Ａｌｌｉｕｍ、例えば、ｐｏｒｒｕｍ）、レタス（Ｌａｃｔｕｃａ、例えば、ｓａｔｉｖａ）、ホウレンソウ（Ｓｐｉｎａｃｉａ、例えば、ｏｌｅｒａｃｅａｅ）、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ、例えば、ｔａｂａｃｕｍ）；根、例えば、クズウコンの根（Ｍａｒａｎｔａ、例えば、ａｒｕｎｄｉｎａｃｅａ）、ビート（Ｂｅｔａ、例えば、ｖｕｌｇａｒｉｓ）、ニンジン（Ｄａｕｃｕｓ、例えば、ｃａｒｏｔａ）、キャッサバ（Ｍａｎｉｈｏｔ、例えば、ｅｓｃｕｌｅｎｔａ）、カブ（Ｂｒａｓｓｉｃａ、例えば、ｒａｐａ）、ダイコン（Ｒａｐｈａｎｕｓ、例えば、ｓａｔｉｖｕｓ）、ヤムイモ（Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ、例えば、ｅｓｃｕｌｅｎｔａ）、サツマイモ（Ｉｐｏｍｏｅａ ｂａｔａｔａｓ）；脂肪種子を含む種子、例えば、マメ（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ、例えば、ｖｕｌｇａｒｉｓ）、エンドウマメ（Ｐｉｓｕｍ、例えば、ｓａｔｉｖｕｍ）、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ、例えば、ｍａｘ）、ササゲ（Ｖｉｇｎａ ｕｎｇｕｉｃｕｌａｔａ）、モスビーン（Ｖｉｇｎａ ａｃｏｎｉｔｉｆｏｌｉａ）、コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ、例えば、ａｅｓｔｉｖｕｍ）、ソルガム（Ｓｏｒｇｈｕｍ、例えば、ｂｉｃｏｌｏｒ）、オオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ、例えば、ｖｕｌｇａｒｅ）、トウモロコシ（Ｚｅａ、例えば、ｍａｙｓ）、コメ（Ｏｒｙｚａ、例えば、ｓａｔｉｖａ）、アブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）、雑穀（Ｐａｎｉｃｕｍ種）、ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｎｎｕｕｓ）、カラスムギ（Ａｖｅｎａ ｓａｔｉｖａ）、ヒヨコマメ（Ｃｉｃｅｒ、例えば、ａｒｉｅｔｉｎｕｍ）；塊茎、例えば、コールラビ（Ｂｒａｓｓｉｃａ、例えば、ｏｌｅｒａｃｅａｅ）、ジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ、例えば、ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）など；線維および木材の植物、例えば、アマ（Ｌｉｎｕｍ、例えば、ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ）、綿（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ、例えば、ｈｉｒｓｕｔｕｍ）、マツ（Ｐｉｎｕｓ種）、オーク（Ｑｕｅｒｃｕｓ種）、ユーカリプタス（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ種）、など、および観葉植物、例えば、芝草（Ｌｏｌｉｕｍ、例えば、ｒｉｇｉｄｕｍ）、ペチュニア（Ｐｅｔｕｎｉａ、例えば、ｘ ｈｙｂｒｉｄａ）、ヒヤシンス（Ｈｙａｃｉｎｔｈｕｓ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）、カーネーション（Ｄｉａｎｔｈｕｓ、例えば、ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌｕｓ）、ヒエンソウ（Ｄｅｌｐｈｉｎｉｕｍ、例えば、ａｊａｃｉｓ）、ジュズ玉（Ｊｏｂ’ｓ ｔｅａｒｓ）（Ｃｏｉｘ ｌａｃｒｙｍａ−ｊｏｂｉ）、スナップドラゴン（ｓｎａｐｄｒａｇｏｎ）（Ａｎｔｉｒｒｈｉｎｕｍ ｍａｊｕｓ）、ケシ（Ｐａｐａｖｅｒ、例えば、ｎｕｄｉｃａｕｌｅ）、ライラック（Ｓｙｒｉｎｇａ、例えば、ｖｕｌｇａｒｉｓ）、アジサイ（Ｈｙｄｒａｎｇｅａ、例えば、ｍａｃｒｏｐｈｙｌｌａ）、バラ（Ｇａｌｌｉｃａｓ、Ａｌｂａｓ、Ｄａｍａｓｋｓ、Ｄａｍａｓｋ Ｐｅｒｐｅｔｕａｌｓ、Ｃｅｎｔｉｆｏｌｉａｓ、Ｃｈｉｎａｓ、ＴｅａｓおよびＨｙｂｒｉｄ Ｔｅａｓを含む）および観賞用アキノキリンソウ（ｏｒｎａｍｅｎｔａｌ ｇｏｌｄｅｎｒｏｄｓ）（例えば、Ｓｏｌｉｄａｇｏ種）に加えて、例えば、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ、Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓおよびＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａのような例えば、実験モデル植物が挙げられる。

一般には、オリゴヌクレオチドは、本発明の方法に従って、単離された植物細胞またはプロトプラストに投与され、そして得られた細胞は、当該分野で公知の任意の方法に従って、植物全体を再生するために用いられる。

標的された変更がその中で本発明の方法に従って発効されている細胞は、初代の単離された細胞、選択的に富化された細胞、培養された細胞または組織移植片であってもよい。

（インビボ／エキソビボの遺伝子治療のための候補遺伝子）
本発明によるインビボの遺伝子修復は、種々のヒト疾患に関連する遺伝子を変更するために用いられ得る。あるいは、エキソビボ方法を用いて、インビトロで生物体（例えば、患者）から取り出されている細胞において遺伝子を変更してもよく、それによってそれらの細胞を患者に引き続いて導入（または再導入）してもよい。特定の遺伝子の種々の公知の変異が、疾患を生じることが公知であり、従って変異を修復するためにオリゴヌクレオチドを設計することは比較的直接的である。ヒト疾患を生じることが公知の遺伝子としては、限定はしないが、ｐ５３、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＣＤＫＮ２Ａ、ＡＰＣ、ＲＢ、ＭＬＨ１、ＭＳＨ２、ＭＳＨ６、ＡＤ１、ＡＤ２、ＡＤ３、ＡＤ４および第Ｖ凝固因子の遺伝子が挙げられる。このような実施形態はさらに、その開示がその全体として参照によって本明細書に援用される、２００３年１０月７日出願の同時係属の米国特許出願第１０／６８１，０７４号（「Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｒｅｄｕｃｉｎｇ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｉｎ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ」）に考察されている。

本発明の方法による処置に適合し得る他の疾患（およびそれらの対応する遺伝子）としては、α−地中海貧血（Ａｌｐｈａ−Ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａ）（α−グロビンＨＢＡ１、ＨＢＡ２）、鎌状赤血球病（βグロビン（ＨＢＢ））、β地中海貧血（Ｂ−グロビン（ＨＢＢ））、血友病Ａ（ＦＶＩＩＩ）、血友病Ｂ（クリスマス病）（ＦＩＸ）、フォン・ヴィレブランド病（ＶＷＦ）、マクロード症候群（ＭＬＳ）（ＸＫ）、遺伝性球状赤血球症（ＡＮＫ１、ＳＢＴＢ、ＳＬＣ４Ａ１）、楕円赤血球症／変形赤血球症（ＳＰＴＡ１、ＥＢＰ４１）、ＲＢＣ ピルビン酸キナーゼ欠損症（ＰＫ−ＬＲ）、Ｇ−６−Ｐ デヒドロゲナーゼ欠損症（Ｇ６ＰＤＨ）、ハンチントン舞踏病（ＨＤ（ＨＴＴ）、ＪＰＨ３）、アルツハイマー病（ＡＰＰ１、ＡＰＯＥ、ＰＳＥＮ１、ＰＳＥＮ２、ＰＬＣＤ１）、筋萎縮性側索硬化症（ＳＯＤ１）、レット症候群（ＭＥＣＰ２）、脆弱性Ｘ（ＦＭＲ１）、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）（ＳＭＮ１、ＳＭＮ２）、ゴーシェ（グルコセレブロシダーゼ）、ポンペ病（ａ−１，４−グルコシダーゼまたは酸マルターゼ欠損症（ＧＡＡ））、ファブリー病（α−ＧａｌＡ（ＧＬＡ））、クラッベ病（ガラクトシルセラミダーゼ遺伝子（ＧＡＬＣ））、テイ・サックス病（ヘキソサミダーゼＡ（ＨＥＸＡ））、サンドホフ病（ヘキソサミダーゼＢ（ＨＥＸＢ））、ニーマン・ピック病（スフィンゴミエリナーゼＡおよびＢ（ＮＰＣ１、ＮＰＣ２））、ムコリピドーシスＩＩ（Ｉ−細胞病）（ａ−Ｌ−イズロン酸スルファターゼ（ＧＮＰＴＡ））、ムコリピドーシスＩＩＩ（ｍ１３ｃ）、ムコリピドーシスＩＶ（ＭＣＯＬＮ１）、ＭＰＳ−Ｉ、ハーラー（Ｈｕｒｌｅｒ）（ａ−１−Ｌ−イズロニダーゼ（ＩＵＡＤ））、ＭＰＳ−Ｉシャイエ病（ａ−１−Ｌ−イズロニダーゼ（ＩＵＡＤ））、ＭＰＳ ＩＩ、ハンター病（ＩＤＵＲＯＮＡＴＥ ２−ＳＵＬＦＡＴＡＳＥ（ＩＤＳ）、ＭＰＳＩＩＩＡ、サンフィリポ症候群Ａ（ＳＧＳＨ）、ＭＰＳＩＩＩＢ、サンフィリポ症候群Ｂ（α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ欠損症（ＮＡＧＬＵ））、アルドステロン欠損症（ＣＹＰ１１Ｂ２）、バルデー・ビードル症候群（ＢＢＳ１）、バイラー症候群（ＡＴＰ８Ｂ１）、先天性ネフローゼ症候群（ＮＰＨＳ１）、グルタル酸尿症、Ｉ型（ＧＣＤＨ）、糖原病、６型（ＰＹＧＬ）、ヒルシュスプルング病（ＥＤＮＲＢ）、メープルシロップ尿症（ＢＣＫＤＨＡ、ＢＣＫＤＨＢ、ＤＢＴ）、中位鎖アシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ欠損症（ＡＣＡＤＭ）、メバロン酸キナーゼ欠損症（ＭＶＫ）、２−ケトグルタル酸尿症を有する小頭症（ＳＬＣ２５Ａ１９）、プロピオン酸尿症（ＰＣＣＡ，ＰＣＣＢ）、３−Ｂ−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ欠損症（ＨＳＤ３Ｂ２）、３−メチルクロトニルグリシン尿症（ＭＣＣＣ２）、ホモシスチン尿症（ＭＴＨＦＲ）、シスチン尿症（ＳＬ３Ａ１、ＳＬＣ７Ａ９）、シスチン症（シスチノシン（ＣＴＮＳ））、多発性嚢胞腎、優性遺伝子（ＰＫＤ１、ＰＫＤ２）、多発性嚢胞腎、劣性遺伝子（ＰＫＨＤ１）、ウォルマン症候群（スフィンゴリピドース酸リパーゼ）、ファーバー病（Ｃｅｒａｍｉｄａｓｅ（ＡＳＡＨ））、オースティン病（多発性スルファターゼ（ＡＲＳＡ））、ＭＰＳ ＶＩＩ（ＧＵＳＢ）、カナバン病（ＡＳＰＡ）、フェニルケトン尿症（ＰＡＨ）、クリーグラー・ナジャーＩ型（ＵＤＰＧＴ）、クリーグラー・ナジャーＩＩ型（ＵＧＴ１Ａ１）、ギルバート症候群（ＵＧＴ１Ａ１）、レッシュ・ナイハン症候群（ＨＰＲＴ）、オルニチントランスカルバミラーゼ欠損症（ＯＴＣ）、遺伝性ヘモクロマトーシス（ＨＦＥ，ＴＦＲ）、チロシン血症１型（ＨＴ１）（ＦＡＨ、ＭＯＤ２）、チロシン血症、３型（ＨＰＤ）、ポルフィリン症（ＦＣ）、糖尿病（ＧＣＫ）、抗トリプシンα１欠損症（ＡＡＴ）、ＡＤＡ欠損症（ＡＤＡ）、ＳＣＩＤ（ＤＮＡ−ＰＫ、ＲＡＧ１、ＲＡＧ２）、ＸＬＡＡＤ（Ｆｏｘｐ３）、ＸＳＣＩＤ（ＩＬ２ＲＧ）、慢性肉芽腫症（ＣＹＢＡ、ＣＹＢＢ、ＮＣＦ１、ＮＣＦ２）、ネマリン桿状体筋障害（ＴＮＮＴ１）、家族性周期性発熱（ＴＲＡＰＳ）（ＴＮＦＲＳＦ１Ａ）、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、嚢胞性線維症（ＣＦＴＲ）、表皮水疱症（Ｃｏｌ７Ａ１、Ｃｏｌｌ７Ａ−１、ＬＡＭＡ３、ＬＡＭＢ３、ＬＡＭＢ４、ＬＡＭＣ２）、回転状萎縮（Ｇｙｒａｔｅ ａｔｒｏｐｈｙ）（ＯＡＴ）、マルファン症候群（ＦＢＮ１）、アルポート症候群（ＣＯＬ４Ａ３、ＣＯＬ４Ａ４、Ｃｏｌ４Ａ５）、軟骨毛髪形成不全症（ＲＭＲＰ）、エリス・ファンクレフェルト病（ＥＶＣ）、マキュージック・カウフマン（ＭｃＫｕｓｉｃｋ−Ｋａｕｆｆｍａｎ）症候群（ＭＫＫＳ）、骨形成不全症（ＣｏｌｌＡ２）、高コレステロール血症（ＬＤＬＲ）、家族性高コレステロール血症（ＢＡＡＴ，ＴＪＰ２）、高脂質血症（ＡＰＯＥ）、血栓症（ＡＴ）、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＮ１，ＳＭＮ２）、およびシトステロール血症（ＡＢＣＧ８、ＡＢＣＧ５）が挙げられる。クリーグラー・ナジャーおよびＣＡＩＩ欠損症のような疾患はまた、本発明の方法を用いる遺伝子治療の候補である。本発明の方法の標的として適応可能な遺伝子はまた、その開示がその全体として参照によって本明細書に援用されるＬｉｕら、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（２００３）４（９）：６７９〜８９およびＡｎｄｅｒｓｏｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ（２００２）８０：７７０〜７８１に開示される。

特定のヒト疾患はエキソビボの遺伝子治療に特に適合可能であり、エキソビボの遺伝子治療は１つのバリエーションでは、患者から単離され、そして処置後にその患者に引き続いて再導入される細胞で行う遺伝子治療に関与する。エキソビボの遺伝子治療の候補疾患としては、限定はしないが、神経変性疾患、骨再生障害、糖尿病、アルツハイマー病、パーキンソン病、家族性高コレステロール血症、遺伝性高ビリルビン血症、変形性関節炎（ＯＡ）、接合型表皮水疱症（ＪＥＢ）、転移性腎細胞癌（ＲＣＣ）、前立腺癌およびリソソーム貯蔵障害、例えば、ファブリー病、ゴーシェ病、ポンペ病、およびニーマン・ピック病が挙げられる。遺伝子治療は、抽出された血液または骨髄で行われてもよく、これを患者に再導入することで患者の副作用のリスクは大きく低下し得る。エキソビボの遺伝子治療のための見込みのある標的である細胞タイプとしては、骨髄幹細胞、肝細胞、血管平滑筋細胞および腫瘍浸潤性リンパ球（ガン処置のため）が挙げられる。

本発明の方法は、このようなエキソビボの方法によく適している。なぜなら、それらの方法は遺伝子治療後に持続しない因子を用いる患者の細胞または組織の処置の処置を包含するためである。この方法はまた、なんらかの臨床効果を有するには少なすぎる細胞で変更を達成する先行技術の方法とは反対に、処置された細胞が患者に再導入される場合、治療効果を生じ得るレベルまでＯＤＳＡの効率を増大させる。

（ファブリー病）
ファブリー病は、ＧＬＡ遺伝子によってコードされるリソソームαガラクトシダーゼＡの欠損によって生じるＸ染色体連鎖劣性型のリソソーム貯蔵障害である。ＢｒａｄｙおよびＳｃｈｉｆｆｍａｎ，ＪＡＭＡ（２００１）２８５（２）：１６９。１２ｋｂ長のＧＬＡ遺伝子のいくつかの対立遺伝子改変体が疾患の表現型に関連する。ＧＬＡにおける有害突然変異についてのホモ接合性の患者は、進行性の腎、心血管および脳血管の機能不全および早期死亡を伴う、重篤な疼痛性の神経障害を被り得る。同上。

ファブリー病（および本明細書において考察される他のヒト疾患）およびそれらの関連の遺伝子変異に対するさらなる情報は、＜ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ＞でＥｎｔｒｅｚ Ｐｕｂｍｅｄウェブサイトを介してアクセス可能なＯｎｌｉｎｅ Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ ｉｎ Ｍａｎ（ＯＭＩＭ）データベースを通じて入手可能である。ファブリー病のＭＩＭコードはＭＩＭ＋３０１５００である。

実施例８は、試験系においてＧＬＡ機能を修復するためにこのような変異ＧＬＡ対立遺伝子の１つを修復する本発明の方法の１つの使用を図示しており、その結果は図１５Ａ〜図１５Ｅに示される。オリゴヌクレオチドは、実施例８に考察されるように、エレクトロポレーションではなく、トランスフェクションによってファブリー細胞に導入される。本明細書に呈示される前の実験のほとんどと異なり、ファブリー実験は、トランスフェクション前ではなく「回復期間（ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｐｅｒｉｏｄ）」の間に、トランスフェクションの後のいくつかの因子での処理を包含する。

図１５Ａは、実施例８に詳細に示される実験に相当し、これはオリゴヌクレオチド４９Ｔ／ｇｇが変更ＧＬＡにおいて試験したオリゴヌクレオチドのうち最も有効であること、および最適の用量が１０μｇであることを実証する。４９ＮＴ／ｐｍのオリゴヌクレオチドは、ＧＬＡにおける変異を補正する能力を有さないコントロールオリゴヌクレオチドである。変異ファブリー遺伝子を補正するさらなる実験では、他に示さない限り１０μｇの４９Ｔ／ｇｇを用いる。

図１５Ｂは、補正効率に対するいくつかの因子の効果のデータを種々の濃度で示す。最も劇的な結果は、０．３ｍＭ ＨＵを用いて得られた３．３６％の補正であり、これは４９Ｔ／ｇｇのオリゴヌクレオチドでの処理を包含するコントロール実験を６倍上回り、未処理のコントロールよりも２５倍上回る。図１５ＢのＦＧは、実施例８にさらに詳細に考察されるトランスフェクション増強因子を指す。１０ｎＭ ＣＰＴのような他の処理は補正効率をやや改善する。図１５Ｃは、図１５ＢにおいてＨＵを用いて得た結果が、単に一過性でなく持続性であることを示す。なぜなら図１５ＣにおけるＧＬＡ活性は、トランスフェクションの７日後に測定しているためである。

図１５Ｄは、ＧＬＡ活性に対するいくつかの因子の種々の濃度での、そしていくつかのオリゴの効果のデータを示す。ＧＬＡ活性における劇的な増大は、細胞を回復期において２〜５μＭのＶＰＡで処理する時に観察される。このような処理は、ＧＬＡ活性を、それ以外は同じであるがＶＰＡなしで処理した細胞と比較して８倍より大きく、そして未処理の細胞での活性より２５倍より大きく増大する。ＣＰＴ（７．５ｎＭ）も、ＧＬＡ活性を２倍より大きくする。

図１５Ｅは、トランスフェクションの前にＤＴＢによって同調されたファブリー細胞で得られた結果を示す。ＧＬＡ活性は、１ｍＭのＨＵで処理した同調された細胞について５倍に、そして５００μＭのｄｄＣで処理した同調された細胞について約２倍に増大される。

（遺伝子変更効率を増強するための他の方法との組み合わせ性）
本発明の方法およびキットは、当該分野で公知の核酸配列のオリゴヌクレオチド指向性変更の効率を増強する１つ以上の他の方法と組み合わせられ得る。このような方法は、例えば、その開示がその全体として参考によって本明細書中に援用される、ＷＯ０２／１０３６４（「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｅｎｈａｎｃｉｎｇ Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｇｅｎｅ Ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ Ｕｓｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ」）；ＷＯ０３／０２７２６５（「Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｅｎｈａｎｃｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ」）；およびＷＯ０３／０７５８５６（「Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ，ａｎｄ Ｋｉｔｓ ｆｏｒ Ｅｎｈａｎｃｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ Ｕｓｉｎｇ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ Ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ ａ Ｈｉｓｔｏｎｅ Ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，Ｌａｍｂｄａ Ｐｈａｇｅ Ｂｅｔａ Ｐｒｏｔｅｉｎ，ｏｒ Ｈｙｄｒｏｘｙｕｒｅａ」）として公開された同時係属の国際特許出願、ならびに同時係属の２００３年１０月７日出願の米国特許出願第１０／６８１，０７４号（「Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｒｅｄｕｃｉｎｇ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｉｎ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ」）および２００４年６月４日出願の同第１０／８６１，１７８号（「Ｒｅｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｒａｄ５１ ｆｏｒ Ｈｉｇｈ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｅｘｃｈａｎｇｅ」）に記載される。

１つの例示的な実施形態では、遺伝子変更効率を増強するさらなる方法は、オリゴヌクレオチド添加の前、間または後のヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）インヒビター、例えば、トリコスタチンＡ（ＴＳＡ）の添加である。しかし、当業者は、他のＨＤＡＣインヒビターがこれらの目的に適切であり得ることを理解する。例えば、その開示がその全体として参考によって本明細書中に援用される、米国特許出願第２００２／０１４３０５２号は亜鉛結合部分の存在に起因してＨＤＡＣインヒビター活性を有する化合物を開示している。本発明の目的に適切なＨＤＡＣインヒビターの他の例としては、酪酸、ＭＳ−２７−２７５、ヒドロキサム酸スベロイラニリド（ｓｕｂｅｒｏｙｌａｎｉｌｉｄｅ ｈｙｄｒｏｘａｍｉｃ ａｃｉｄ）（ＳＡＨＡ）、オキサムフラチン（ｏｘａｍｆｌａｔｉｎ）、トラポキシンＡ、デプデシン（ｄｅｐｕｄｅｃｉｎ）、ＦＲ９０１２２８（デプシペプチドとしても公知）、アピシジン（ａｐｉｃｉｄｉｎ）、ｍ−カルボキシ−桂皮酸ビシドロキサム酸（ｍ−ｃａｒｂｏｘｙ−ｃｉｎｎｎａｍｉｃ ａｃｉｄ ｂｉｓｈｙｄｒｏｘａｍｉｃ ａｃｉｄ）（ＣＢＨＡ）、スベリンビシドロキサム酸（ｓｕｂｅｒｉｃ ｂｉｓｈｙｄｒｏｘａｍｉｃ ａｃｉｄ）（ＳＢＨＡ）、バルプロ酸（ＶＰＡ）およびピロキサミドが挙げられる。その開示がその全体として参考によって本明細書に援用される、Ｍａｒｋｓら、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃ．Ｉｎｓｔ．９２（１５）：１２１０〜１２１６（２０００）を参考のこと。適切なＨＤＡＣインヒビターのさらに他の例は、その開示がその全体として参考によって本明細書に援用されるＷＯ００／２３５６７に開示されるように、クラミドシン（ｃｈｌａｍｙｄｏｃｉｎ）、ＨＣ−トキシン、Ｃｙｌ−２、ＷＦ−３１６１およびラジシコール（ｒａｄｉｃｉｃｏｌ）である。

細胞または細胞抽出物に対してＨＤＡＣインヒビターを投与する場合、投与されるべき投与量および投与のタイミングは、細胞タイプを含む、種々の要因に依存する。ＴＳＡの場合、この投薬量は、１０ｎＭ、１００ｎＭ、１μＭ、１０μＭ、１００μＭ、１ｍＭ、１０ｍＭもしくはそれ以上であってもよいし、または１ｍＭ、１００μＭ、１０μＭ、１μＭ、１００ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭ程度の小ささ、もしくはそれ以下であってもよい。ＨＵの場合、投与量は、１００ｎＭ、１μＭ、１０μＭ、１００μＭ、１ｍＭ、１０ｍＭ、１００ｍＭ、１Ｍもしくはそれ以上であってもよいし、または１００ｍＭ、１０ｍＭ、１ｍＭ、１００μＭ、１０μＭ、１μＭ、１００ｎＭ、１０ｎＭ程度の小ささ、もしくはそれ以下であってもよい。

細胞は、ＨＤＡＣインヒビターの存在下で増殖されてもよく、そして細胞抽出物は、配列変更オリゴヌクレオチドとの組み合わせの前に種々の時間ＨＤＡＣインヒビターで処理されてもよい。増殖または処理は、１時間、２時間、３時間、４時間、６時間、８時間、１２時間、２０時間、またはそれ以上であってもよく、これには最大で２８日、１４日、７日の長さ、もしくはそれ以下、または１２時間、８時間、６時間、４時間、３時間、２時間、１時間程度の短さもしくはそれ以下を含む。あるいは、ＨＤＡＣインヒビターおよび配列変更オリゴヌクレオチドでの細胞または細胞抽出物の処理は、同時に生じてもよく、またはＨＤＡＣインヒビターは、オリゴヌクレオチド添加後に添加されてもよい。

細胞はさらに、配列変更オリゴヌクレオチドでの処理の前に種々の時間のＨＤＡＣインヒビターの非存在下での増殖によって、ＨＤＡＣインヒビターでの処理から回復され得る。回復は、１０分、２０分、４０分、６０分、９０分、２時間、４時間程度の長さもしくはそれ以上、または９０分、６０分、４０分、２０分、１０分程度の短さもしくはそれ以下であってもよい。細胞はまた、配列変更オリゴヌクレオチドでの処理の後に回復させられてもよい。この回復期間は、１時間、２時間、４時間、６時間、８時間、１２時間程度の長さ、またはそれ以上であってもよく、または８時間、６時間、４時間、２時間、１時間程度の短さもしくはそれ以下であってもよい。ＨＤＡＣインヒビターは、回復期間の間に細胞培地に存在しても、しなくてもよい。

細胞または細胞抽出物に対するＨＤＡＣインヒビターの投与の最適の投与量ならびに時点および期間は、慣用的な実験によって決定され得る。例えば、ＴＳＡのようなＨＤＡＣインヒビターでの処理の最適用量およびタイミングは、ＷＯ０３／０７５８５６に記載されるアッセイシステムを用いて決定され得る。

本発明のいくつかの実施形態は、原核生物細胞または真核生物細胞における相同組み換えまたはＤＮＡ複製に関与する酵素を細胞に供給する工程を包含する。原核生物におけるＤＮＡ複製に関与するタンパク質としては、λファージアニーリングタンパク質レッドβが挙げられ、そして真核生物におけるこのようなタンパク質としては、Ｒａｄ５２上位群のメンバーが挙げられる。他の実施形態としては、このような酵素のレベルを変更する因子での細胞の処理が挙げられる。さらに他の実施形態では、細胞は、相同組み換え経路を誘導するＤＮＡ損傷剤で処理する。

本発明のさらなる実施形態は、本明細書に記載されるとおり、配列変更オリゴヌクレオチドの供給に加えて、遺伝子編集および修復を改善するように設計されたベクターを細胞に供給する工程を意図する。これらのベクターは本明細書を通じて、「遺伝子修復ベクター（Ｇｅｎｅ Ｒｅｐａｉｒ Ｖｅｃｔｏｒ）」と呼ばれるものとする。遺伝子修復ベクターのいくつかの例としては、限定はしないが、ＰＣＲフラグメント、一本鎖ＤＮＡを生成し、これが次に遺伝子編集を指向するウイルス、遺伝子編集を促進する分子を生成する二本鎖ＤＮＡフラグメント、遺伝子編集を促進するように設計されるプラスミド分子、および遺伝子修復を促進するようにタンパク質を阻害するために用いられるＲＮＡｉもしくはｓｉＲＮＡが挙げられる。この遺伝子修復ベクターは、当該分野で公知の任意の方法によって外因的に細胞に追加されてもよい。このような遺伝子修復ベクターの使用のいくつかの例は、その開示がその全体として参考によって本明細書に援用される以下の引用文献に見出すことができる：Ｋａｙら、Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ｔｈｅ Ａｒｔ ｏｆ Ｔｕｒｎｉｎｇ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ａｇｅｎｔｓ ｉｎｔｏ Ｖｅｈｉｃｌｅｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｎａｔｕｒｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ（２００１）；Ｃｏｌｏｓｉｍｏら、Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ Ｓｅｌｅｃｔａｂｌｅ Ｍａｒｋｅｒ Ｇｅｎｅ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌｓ ｂｙ Ｓｍａｌｌ ＤＮＡ Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，第３巻、第２号（２００１年２月）；Ｍａｊｕｍｄａｒら、Ｇｅｎｅ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｂｙ Ｔｒｉｐｌｅ Ｈｅｌｉｘ−Ｆｏｒｍｉｎｇ Ｏｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１００２：１４１〜１５３（２００３）；Ｍａｊｕｍｄａｒら、Ｃｅｌｌ Ｃｙｃｌｅ Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｂｙ ａ Ｔｒｉｐｌｅ Ｈｅｌｉｘ−Ｆｏｒｍｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ；Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第２７８巻、第１３号、頁１１０７２０１１０７７（２００３年３月）；Ｈ．Ｄ．ＮｉｃｋｅｒｓｏｎおよびＷ．Ｈ．Ｃｏｌｌｅｄｇｅ，Ａ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｒｅｐａｉｒ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｕｓｉｎｇ ａ ｌａｃＺ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，１０，１５８４〜１５９１（２００３）；Ｐ．Ａ．Ｏｌｓｅｎら、Ｂｒａｎｃｈｅｄ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ Ｉｎｄｕｃｅ ｉｎ ｖｉｖｏ Ｇｅｎｅ Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｏｆ ａ Ｍｕｔａｔｅｄ ＥＧＦＰ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，１０，１８３０〜１８４０（２００３）；Ｈ．Ｎａｋａｉ．ら、Ｐａｔｈｗａｙｓ ｏｆ Ｒｅｍｏｖａｌ ｏｆ Ｆｒｅｅ ＤＮＡ Ｖｅｃｔｏｒ Ｅｎｄｓ ｉｎ Ｎｏｒｍａｌ ａｎｄ ＤＮＡ−ＰＫｃｓ Ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ＳＣＩＤ Ｍｏｕｓｅ Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ Ｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ ｗｉｔｈ ｒＡＡＶ Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，第１４巻、第９号、８７１〜８８１（２００３年６月）。

（キット／検索ツール）
本発明のさらなる実施形態は、細胞、無細胞抽出液、または細胞修復タンパク質、ＯＧＤＡ（またはその等価物）の効率を増大するとして本明細書に開示される因子から選択された少なくとも１つの因子、ならびに核酸標的部位で所望の配列変更を果たし得る少なくとも１つの配列変更オリゴヌクレオチドを含む組成物およびキットである。ある実施形態では、この組成物またはキットは、配列変更が選択性の表現型を付与する、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドの核酸標的配列を含む核酸分子を含む。

本発明の組成物またはキットのための細胞、無細胞抽出物または細胞修復タンパク質は、任意の生物体由来であってもよい。本発明の組成物およびキットは、細胞、無細胞抽出物、または細胞修復タンパク質の任意の組み合わせを含んでもよく、そしてこの細胞、無細胞抽出物、または細胞修復タンパク質は、同じ生物体由来であっても、異なる生物体由来であってもよい。用いられ得る細胞修復タンパク質としては、例えば、ＲＡＤ５２上位群、ミスマッチ修復群、またはヌクレオチド切り取り修復群由来のタンパク質が挙げられる。ある実施形態では、細胞、無細胞抽出物、または細胞修復タンパク質は、真核生物細胞もしくは組織であるか、またはそれに由来する。ある実施形態では、真核生物細胞は真菌細胞、例えば、酵母細胞である。他の実施形態では、この細胞は植物細胞、例えば、トウモロコシ、コメ、コムギ、オオムギ、ダイズ、綿、ジャガイモまたはトマトの細胞である。他の例示的な植物細胞としては、本明細書のいずれかに記載される細胞が挙げられる。ある実施形態では、このキットは、ＯＧＤＡ（またはその等価物）の効率を増大すると本明細書に記載される因子から選択される少なくとも１つの因子を含む。ある実施形態では、このようなキットはまた、使用の説明書を含む。

本発明の他の実施形態は、核酸分子であってその核酸配列が本発明の方法に従って、または本発明の組成物もしくはキットを用いて変更されている核酸分子を含むキットに関する。ある実施形態では、本発明は、核酸分子であってその核酸配列が本発明の方法に従って、または本発明の組成物もしくはキットを用いて変更されている核酸分子を含む細胞を含むキットに関する。ある実施形態では、この核酸分子は、以下：哺乳動物人工染色体（ＭＡＣ）、Ｐ−１ベクター由来のＰＡＣ、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、植物人工染色体（ＰＬＡＣ）、プラスミド、ウイルスまたは他の組み換えベクターからなる群より選択される。

（薬学的組成物）
精製されたオリゴヌクレオチド組成物は、培養物中の細胞を浸すために、培養物中の細胞への微量注入のために、そしてヒトまたは動物への静脈内投与のために適した薬学的組成物として慣用的な手順に従って処方され得る。代表的には、細胞投与のため、またはヒトを含む動物への静脈内投与のための組成物は、無菌の等張性の水性緩衝液中の溶液である。必要に応じて、この組成物はまた、可溶化剤および注射部位の疼痛を和らげるための局所麻酔薬、例えば、リグノカインを含んでもよい。一般には、この成分は、別々にまたは単位剤形に一緒に混合されて、例えば、乾燥した、凍結乾燥の粉末または水なしの濃縮物として供給される。この組成物は、活性因子の量を活性単位で示している、アンプルまたは小袋（ｓａｃｈｅｔｔｅ）などの密封してシールされた容器に保管されてもよい。この組成物が注入によって投与される場合、この組成物は、滅菌の薬学的等級の「注射用水」または生理食塩水を含む注入ボトルで分注されてもよい。この組成物が注射によって投与されるべき場合、滅菌注射用水または生理食塩水のアンプルが提供されてもよく、その結果この成分は投与の前に混合され得る。

本発明の薬学的組成物は、本発明の方法において用いられるオリゴヌクレオチド、およびその薬学的に受容可能な塩を、薬学的に受容可能な成分、賦形剤、キャリア、アジュバントまたはビヒクルとともに含む。

本発明のオリゴヌクレオチドは好ましくは、注射用組成物の形態で被験体に投与される。この組成物は好ましくは、非経口的に、すなわち、静脈内に、動脈内に、クモ膜下腔内に、間質内にまたは腔内に投与される。本発明の薬学的組成物は、他の診断または治療因子と同様の方式でヒトを含む哺乳動物に投与され得る。投与されるべき用量、および投与の形態は、年齢、体重、性別、被験体の状態および遺伝的要因を含む種々の要因に依存し、そして最終的には、本明細書において記載されるような種々の投与量の実験的決定に引き続いて医療従事者によって決定される。一般には、標的された核酸配列変更および治療有効性に必要な投与量は、約０．００１〜５０，０００μｇ／ｋｇ、例えば、宿主の細胞または体重あたり１〜２５０μｇ／ｋｇ、または３０〜６０μＭの濃度におよぶ。

細胞投与のためには、核への直接注入、微粒子銃照射（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）、エレクトロポレーション、リポソーム転移およびリン酸カルシウム沈殿が用いられ得る。酵母では、酢酸リチウムまたはスフェロプラスト形質転換も用いられてもよい。１方法では、投与は、リポソーム転移化合物、例えば、ＤＯＴＡＰ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ^ＴＭ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ^ＴＭ）またはリポフェクチンのような等価物で行われる。例えば、用いられるオリゴヌクレオチド対の量は、１００，０００個の細胞あたり３μｇのＤＯＴＡＰに約５００ナノグラムであるか、または１，０００，０００個の細胞あたり１μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ^ＴＭ２０００とともに約１μｇである。エレクトロポレーションに関しては、本明細書に記載の方法に従って適切な配列という観点から遺伝子変更の効率を改善するために増大され得る、適切な用量の範囲は、エレクトロポレーションされるべき百万個の細胞あたり２０ナノグラム〜３０μｇというオリゴヌクレオチドである。

矛盾しない場合、本発明の方法に従うＯＤＳＡを増強する因子は、遺伝子変更の効率を増大するために、精製されたオリゴヌクレオチドの薬学的組成物に組み込まれてもよいし、またはその組成物とともに配合されてもよい。

本発明をよりよく理解し得るために、以下の実施例を示す。これらの実施例は、例示のみの目的であって、いかなる方法でも本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。

（実施例１）
（哺乳動物細胞株における遺伝子変更を定量するためのＤＬＤ−１−１システム）
細胞株および培養条件：ＤＬＤ−１細胞は、ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から入手した。ＤＬＤ−１を組み込んだクローン１（ＤＬＤ−１−１）は、２００４年１１月１０日出願の同時係属の米国特許出願第１０／９８６，４１８号（「Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅｓ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ，Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ，ａｎｄ Ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ」）に記載のとおりｅＧＦＰ遺伝子に単一点突然変異（ＴＡＧ）を含むベクターｐＥＧＦＰ−Ｎ３の組み込みによって得られる。細胞は、２ｍＭのグルタミン、４．５ｇ／Ｌのグルコース、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１ｍＭのピルビン酸ナトリウムを含み、そして１０％のＦＢＳを補充されたＲＰＭＩ １６４０培地で増殖する。細胞は、５％ＣＯ_２、３７℃で、そして２００μｇ／ｍＬのＧ４１８（Ｇｉｂｃｏ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中での選択下で維持する。

ｅＧＦＰ遺伝子補正：１０％ＦＢＳを補充された完全培地中で増殖した細胞をトリプシン処理して、遠心分離によって回収する。細胞ペレットは、無血清培地中で１×１０^６細胞／１００μＬの密度に再懸濁して、４ｍｍのギャップのキュベット（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）に移す。次いでこのオリゴヌクレオチドを、４μＭの濃度で添加して、細胞を、ＢＴＸ ＥＣＭ８３０装置（ＢＴＸ，Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ，ＭＡ）を用いてエレクトロポレーションする（ＬＶ，２５０Ｖ，１３ｍｓｅｃ，２パルス、１秒間隔）。次いで細胞を、１０％ＦＢＳを補充された新鮮培地を含む６０ｍｍのディッシュに移して、ＦＡＣＳ分析のための回収の前に３７℃で４８時間インキュベートする。

フローサイトメトリー分析：補正された細胞のｅＧＦＰ蛍光を、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ^ＴＭフローサイトメトリー（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｒｕｔｈｅｒｆｏｒｄ，ＮＪ）によって測定する。細胞をエレクトロポレーションの４８時間後に回収して、ＦＡＣＳ緩衝液（０．５％のＢＳＡ、２ｍＭのＥＤＴＡ、２μｇ／ｍＬのヨウ化プロピジウムを含有するＰＢＳ）中に再懸濁する。さらに詳細には、このプログラムは、適切な細胞サイズに設定され（前方散乱対側方散乱）そして、単独細胞の集団が分析のためにゲートされる。負のコントロール（マイナスＰＩ、マイナスＧＦＰ）を用いて、バックグラウンド蛍光は、ＦＬ１（ＧＦＰ）およびＦＬ２（ＰＩ）の電圧を調節することによりドットブロットの１０^１デケイドに細胞を配置することによって設定した。次いでこの組成物を、ＰＩを含まないＧＦＰコントロールサンプルを用い、ＦＬ１パラメーターに向かうシグナルを生じる補償を増大するマルチ蛍光実験について設定する。最終的に、最終のコントロール、ＰＩおよびＧＦＰなしを用いて、ＦＬ２パラメーターに向かうシグナルをもたらす補償を増大する。５０，０００個の細胞の各々のサンプルを分析して、ＧＦＰ陽性でかつＰＩ陰性であるそれらの細胞を、補正された細胞としてスコア付けする。

次いで、全体の集団における変換された細胞の割合をＣｅｌｌＱｕｅｓｔ^ＴＭ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）およびＧＦＰ／ＰＩプログラムによって算出する。補正効率は、各々の実験において分析した細胞の数（通常、５０，０００個の細胞）でｅＧＦＰ陽性細胞の数を割ることによって決定する。各々のクローンを３回試験して、補正効率の標準偏差を決定し、この標準偏差はＭｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌを用いて算出する。エレクトロポレーションの２日後、および８日後に得た細胞の共焦点画像に基づいたコントロール実験によって、同時係属の米国特許出願第１０／９８６，４１８号（上記を参考のこと）に考察されるとおり、遺伝子変更は遺伝性であることが示される。

図３は、未処理であるか、または補正性のオリゴヌクレオチドＥＧＦＰ３Ｓ／７２ＮＴで処理したＤＬＤ−１−１のついてのフローサイトメトリー分析からのヒストグラム（ドットプロット）を示しており、ここでＹ軸上はヨウ化プロピジウム蛍光であり、そしてＸ軸上はｅＧＦＰ蛍光である。このドットプロットは、下記のとおり４つの四分円に分けられる。ＬＲ（下方右側の四分円）：ｅＧＦＰ発現を有する生きた細胞の数；ＬＬ（下方左側の四分円）：ｅＧＦＰ発現なしの生きた細胞の数；ＵＲ（上方右側の四分円）：ｅＧＦＰ発現を有する死んだ細胞の数；ＵＬ（上部左側の四分円）：ｅＧＦＰ発現なしの死んだ細胞の数。フローサイトメトリーは、蛍光発光のために細胞を個々にクエリーし得、そしてまた群の統計学を提供し得、従って、共焦点顕微鏡検査を用いる初期のアッセイに対して整合性に優れている。さらに、ＦＡＣＳによって検出可能であるｅＧＦＰのレベルはしばしば、共焦点可視化では検出できない。

細胞周期分析のために、１×１０^６個の細胞を、薬物での処理の２４時間前に、そして処理の２４時間後にプレートして、細胞をトリプシン処理して、３００μｌの冷ＰＢＳに再懸濁し、７００μｌの冷エタノールを添加することによって固定する。次いで、細胞を、５００ｇ／ｍｌのＲＮａｓｅＡおよび２．５０ｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウムを含有する１ｍｌのＰＢＳに再懸濁して、ＤＮＡ含量について分析する。活発に複製しているフォークをプロセシングする細胞の数は、製造業者の示唆に従ってＢｒｄＵ染色（Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ，ＦＬＵＯＳ，Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）によって決定する。

パルス・フィールドゲル電気泳動：ＨＵまたはＶＰ１６での処理の２４時間前に、１×１０^６個の細胞を組織培養フラスコにプレートして、その後にＨＵまたはＶＰ１６を用いるＤＮＡ損傷の誘導を２４時間行う。細胞はトリプシン処理によって遊離して、アガロース挿入物中に溶解する。アガロース挿入物を、０．５Ｍ ＥＤＴＡ−１％Ｎ−ラウロシルサルコシン−プロテイナーゼＫ（１ｍｇ／ｍｌ）中において、５０℃で４８時間インキュベートし、次いで１％アガロースゲル（Ｐｕｌｓｅ−Ｆｉｅｌｄ Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ Ａｇａｒｏｓｅ，Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）上への負荷の前にＴＥ緩衝液中で４回洗浄し、パルス・フィールドゲル電気泳動によるＤＮＡ分離を、２４時間行う（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，１２０°フィールドアングル、６０〜２４０秒、切り替え時間４Ｖ／ｃｍ）。このゲルは臭化エチジウムで引き続き染色し、ＡｌｐｈａＩｍａｇｅｒ^ＴＭ２２００（Ａｌｐｈａ Ｉｎｎｏｔｅｃｈ Ｃｏｒｐ．，Ｓａｎ Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）を用いて分析する。

結果：標的として変異ｅＧＦＰ遺伝子を用いて遺伝子修復活性をアッセイする。野性型遺伝子は、発色団領域においてアミノ酸６７で変異しており、その結果緑色蛍光は、発現されるときに観察される。この変異によって、もともとチロシン残基をコードする部位（ＴＡＣ）に終止コドン（ＴＡＧ）が生じる。このｅＧＦＰ遺伝子は、ＤＬＤ−１−１として公知のクローン細胞株（クローン−１）を生成するｐＥＧＦＰ−Ｎ３ベクターを用いてＤＬＤ−１細胞へ組み込まれる（Ｈｕら、提出）。これらの細胞は、２〜４個のコピーの変異ｅＧＦＰ遺伝子を含むが、機能的なｅＧＦＰは生じない（下記を参考のこと）。

実験ストラテジーは、エレクトロポレーションによるＤＬＤ−１−クローン１細胞へのオリゴヌクレオチドの導入、それに続くその４８時間後の補正されたｅＧＦＰ遺伝子の表現型読み取りを包含する。補正性のオリゴヌクレオチド（ＥＧＦＰ３Ｓ／７２ＮＴ）は、変異ｅＧＦＰの非転写鎖に相補的であるが、コドン６７の第３塩基における単独のミスマッチを生じるように設計された、７２塩基長（７２−マー）である（図１Ａを参考のこと）。これは、ＦＡＣＳによって検出され得るｅＧＦＰの表現型発現を可能にするＴＡＧ→ＴＡＣコドンの変換を指向する。図１Ｂは標的遺伝子の配列をまとめており、７２−マーおよび非特異的な７４−マーをコントロールとして用いる。オリゴヌクレオチドのエレクトロポレーションのタイミングに対する、ヒドロキシウレアまたはＶＰ１６のような特定の因子の添加の時間は下に記載する（図２を参考のこと）。

図３は、ｅＧＦＰシステムの有用性および有効性を示す。クローン１細胞を、ＥＧＦＰ３Ｓ／７２ＮＴまたはＨｙｇ３Ｓ／７４ＮＴのいずれかでエレクトロポレーションして、遺伝子補正のレベルを、ＦＡＣＳ分析によって４８時間後に測定する。ＥＧＦＰ３Ｓ／７２ＮＴで処理した細胞の約１．２％がｅＧＦＰ発現について陽性とスコアされるが、任意の所定の実験における補正の頻度は、０．８％〜１．４％まで変化することが観察される。細胞の集団を非特異的なオリゴヌクレオチドＨｙｇ３Ｓ／７４ＮＴを用いるか、または完全に相補性のオリゴヌクレオチドで処理する場合、コントロール（下方右側の四分円）では緑の蛍光は観察されない（データ示さず）。図１Ｂで呈示されるとおり、Ｈｙｇ３Ｓ／７４ＮＴは、変異ｅＧＦＰ標的部位に対する直接の配列相補性は有さない。

（実施例２）
（配列変更効率を増大する細胞周期の調節）
早期Ｓ期で細胞を停止させるミモシン、および血清枯渇を用いてＤＬＤ−１−１細胞の集団を同調させることによって、ＯＤＳＡの効率に対する細胞周期の効果を評価する。細胞を、１００ｍｍのディシュあたり０．８×１０^６個の密度で播種し、２０時間結合させ、次いで０．２％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含有するＲＭＰＩ−１６４０培地中で培養する。これらの細胞を４８時間増殖させ、その後に０．１ｍＭのミモシン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ，ＵＳＡ）で２０時間処理する。細胞をＰＢＳを用いて２回洗浄し、１０％のＦＢＳを補充した新鮮な培地に種々の時点で遊離させて、その後にエレクトロポレーションする。細胞をＰＢＳで１回リンスし、トリプシン処理して、遠心分離によって回収して、１０μｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウム、０．０３％のＴｒｉｔｏｎ−１００および１ｍｇ／ｍｌのＲＮａｓｅを含有するＰＢＳに再懸濁する。細胞を室温で１時間インキュベートして、その後にＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ^ＴＭフローサイトメトリーによってＤＮＡ含量の測定を行った。細胞周期の種々の段階での細胞の割合は、ＭｏｄＦｉｔＬＭ^ＴＭソフトウェア（Ｖｅｒｉｔｙ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｈｏｕｓｅ，Ｉｎｃ．，Ｔｏｐｓｈａｍ，Ｍａｉｎｅ，ＵＳＡ）によって決定する。

オリゴヌクレオチド指向性配列変更：得られた同調された細胞の集団および非同調性のコントロールを、１０％ＦＢＳを補充した完全培地中で増殖させ、トリプシン処理して、１５００ｒｐｍで５分間の遠心分離によって回収する。細胞ペレットを、新鮮な無血清培地中で、２×１０^６細胞／１００μｌの密度で再懸濁する。全体的な細胞懸濁液を、２０μｇのＥＧＦＰ／７２ＮＴと混合して、４ｍｍのギャップのキュベット（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ，ＵＳＡ）に移し、その後に、期間中に各々１３ｍｓの２つの２５０Ｖのパルスであって、パルス間１秒、単極のエレクトロポレーションを行う。

フローサイトメトリー分析：補正されたｅＧＦＰ遺伝子を有する細胞を、フローサイトメトリーによって検出可能な蛍光を示す。細胞をＰＢＳで１回洗浄し、トリプシン処理によって収集し、遠心分離して、１ｍｌのＦＡＣＳ緩衝液（０．５％ＢＳＡ，２ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０、２μｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウム）に再懸濁する。細胞を、室温で３０分間インキュベートする。変換された細胞の割合を、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ^ＴＭフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｒｕｔｈｅｒｆｏｒｄ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ，ＵＳＡ）を用いて測定する。変換された細胞の頻度は、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ^ＴＭおよびＧＦＰ／ＰＩプログラムによって算出する。

図４は、エレクトロポレーションの時間でもある、細胞周期における細胞中の細胞の分布を停止からの解放後の時間の関数として示すヒストグラムを示す。各々のパネルは、観察される細胞の数を、その細胞からのヨウ化プロピジウム蛍光の強度の関数としてプロットする。遺伝子補正は、その４８時間後に測定する。結果の数値的なまとめは、図４の表に示す。補正効率（Ｃ．Ｅ．）は、Ｓ期における細胞の割合が３５％（非同調性細胞）から８６％（増殖停止からの解放後８時間）に２．５倍に増大するにつれて、０．９２％から２．２９％に２．５倍に増大する。これらの結果は、Ｓ期の細胞の割合と遺伝子修復の効率との間の強い相関を表す。

（実施例３）
（ＨＵ，ＶＰ１６またはチミジンで処理した哺乳動物細胞株における遺伝子修復）
ＤＬＤ−１−１細胞は、細胞が以下のようにＨＵ、ＶＰ１６またはチミジンのいずれかで前処理されることを除いて、実施例１にまとめられた遺伝子修復プロトコールに供される。

ヒドロキシウレア、ＶＰ１６またはチミジンを用いたＤＬＤ−１−１細胞培養物の処理：細胞は、ヒドロキシウレア（ＨＵ）（０、０．３、１、２、５ｍＭ）またはエトポシド（ＶＰ１６）（０、０．５、１、３、１０μＭ）の添加の前に０．８×１０^６個の細胞の密度で２４時間播種する。５００ｍＭのＨＵ（Ａｃｒｏｓ Ｏｒｇａｎｉｃｓ，Ｍｏｒｒｉｓ Ｐｌａｉｎｓ，ＮＪ）ストック溶液は、蒸留水中で調製し、そしてＶＰ１６（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）の５０ｍＭのストック溶液を、ＤＭＳＯ（１００％）中で調製する。ヒドロキシウレアおよびＶＰ１６を、示した濃度で細胞に添加し、処理の時間は、それぞれ０〜４５時間および０〜２４時間に変える。他に示さない限り、細胞をＨＵまたはＶＰ１６で２４時間処理する。

次いで、細胞を、実施例２に記載されるように、補正性のオリゴヌクレオチドＥＧＦＰ３Ｓ／７２ＮＴの存在下でエレクトロポレーションして、ＦＡＣＳによって分析して、遺伝子修復を受けている細胞の割合を反映する、ｅＧＦＰ蛍光を示す割合を決定する。

ＨＵおよびＶＰ１６によって生じるＤＮＡ損傷：本発明者らの実験で用いられるＨＵおよびＶＰ１６の濃度範囲は、ほとんどの場合二本鎖ＤＮＡ破壊であるＤＮＡ損傷を誘導するために前に報告されている。しかし、これらの結論は、ＤＬＤ−１株ではなく、他の細胞株で行われる実験から導かれた。従って、本発明者らは、パルス・フィールドゲル電気泳動（ＰＦＧＥ）によって、ＤＬＤ−１細胞における二本鎖破壊の形成および／または蓄積をモニターして、ＨＵおよび／またはＶＰ１６の添加から生じるＤＮＡ損傷の程度を評価する。非同調性に増殖しているＤＬＤ−１細胞の培養物を種々の濃度のＨＵまたはＶＰ１６とともに２４時間インキュベートし、次いでＤＮＡ破壊をＰＦＧＥによって評価する。図５に示されるように、損傷されたＤＮＡの量の進行性の増大は、ＨＵまたはＶＰ１６の濃度の関数として観察される。重要なことに、二本鎖破壊は、遺伝子修復の頻度を刺激することが偶然に一致して示されているＨＵおよびＶＰ１６の濃度で見出される。

ＨＵおよびＶＰ１６の存在下において増大した補正効率：図６によって、１ｍＭ ＨＵで処理されたＤＬＤ−１−１細胞は、未処理細胞におけるわずか約１％の頻度と比較して、２．２％の頻度で遺伝子修復を受けることが示される。ＤＮＡ損傷が増大した遺伝子修復効率の原因であるという仮説と一致して、ＨＵは、１ｍＭで二本鎖破壊を誘導することが公知である。図６はまた、３μＭ ＶＰ１６で処理されたＤＬＤ−１−１細胞が６％を超える頻度で遺伝子修復を受けることを示す。図６および７における星印は、（ゼロ）コントロールからの統計学的に有意な相違を示すポイントを示す：星１つ（＊）＝ｐ値＜０．０５であるが、星２つ（＊＊）＝ｐ値＜０．０１である。

図６の下側パネルに例示されるとおり、ヨウ化プロピジウムで染色されたＤＬＤ−１−１細胞集団でのＦＡＣＳの結果によって、エレクトロポレーションの前に細胞をＨＵまたはＶＰ１６で処理する場合、生存度は適度に低下されることが示される。

最適のＨＵ処理時間を評価する実験では、細胞を２４時間増殖させ、次いで１ｍＭのＨＵを用いて１５時間、２４時間、３０時間、３５時間、４０時間または４５時間処理した。図７に示されるとおり、遺伝子修復効率は、ＨＵ処理が３０〜３５時間まで増大するにつれて増大し、次いでプラトーに達する。３μＭ ＶＰ１６での同様の実験によって、補正の効率は、ほぼ１２時間でプラトーになり始めることが示される。

ＨＵおよびＶＰ１６による細胞周期調節：細胞周期を調節するいかなる他の試み（例えば、実施例４にさらに考察されるようなミモシン処理またはＤＴＢ）もない場合、細胞周期を通じた、処理されたＤＬＤ−１−１細胞の分布に対するＨＵおよびＶＰ１６の効果を、以下に決定する。ＤＬＤ−１−１細胞を１ｍＭ ＨＵ、３μＭ ＶＰ１６で処理するか、または２４時間未処理のままとする。次いで得られた細胞をＦＡＣＳによって分析するか、またはＳ期の細胞の割合を、ＢｒｄＵ取り込みによって決定する。図８は、実験の両方のセットの結果を示す。ＦＡＣＳの結果によって、ＨＵ処理は、Ｓ期の細胞に相当する、最も左側のピークへの細胞の実質的なシフトを生じること、およびＶＰ１６処理はさらに穏やかなシフトを生じることが示される。ＢｒｄＵデータによってまた、ＨＵがＳ期における細胞の割合を４９％から７７％に増大すること、そしてＶＰ１６がその割合を５６％に増大することが示される。

（実施例４）
（ＨＵ、ＶＰ１６またはチミジンで処理された哺乳動物細胞株における遺伝子修復に対する細胞周期の効果）
１セットの実験では、ＤＬＤ−１−１細胞をエレクトロポレーションの前に二重チミジンブロック（ＤＴＢ）プロトコールを用いて細胞周期に同調すること以外は、この細胞を、実施例３にまとめられた遺伝子修復プロトコールに供する。

二重チミジンブロック：二重チミジンブロックによって細胞をＧ１またはＧ１／Ｓの境界で同調する。任意の因子（ＨＵなど）の添加の２４時間前、細胞を１００ｍｍのディッシュあたり０．５×１０^６細胞の密度でプレートし、続いて２ｍＭのチミジン（Ｓｉｇｍａ）中で１６時間インキュベートして、洗浄し、新鮮培地中に１０時間遊離させ、次いで２ｍＭのチミジン中でさらに１５時間インキュベートする。

ヒドロキシウレア、ＶＰ１６またはチミジンでのＤＬＤ−１−１細胞培養物の処理：第二のチミジンブロックを洗い流すことによって二重チミジンブロックからＤＬＤ−１−１細胞を遊離させた後、この細胞を、１ｍＭのＨＵ、３μＭのＶＰ１６または１０ｍＭのチミジンの存在下でさらに２４時間インキュベートする。次いでＦＡＣＳを用いて各々の集団から５０，０００個の細胞を分析して、実施例１に記載のとおり、機能的なｅＧＦＰを発現する細胞の割合を決定する。

図９Ｂは、補正効率を、細胞の同期（二重チミジンブロックされた）および非同期集団の両方について処理の関数として示す。細胞のコントロール集団を、いずれの他の因子も非存在下でＥＧＦＰ３Ｓ／７２ＮＴとともにエレクトロポレーションして、非同調性細胞において約１．５％、または同調性細胞において約２．５％の補正効率を得る。ＨＵは、非同調性細胞の補正効率を１．５％からほぼ３％に増大し、そしてこれは、同調された培養物において遺伝子補正をさらに有意に刺激し、頻度を約２．５％〜９％より大きくまで増大する。対照的に、同調化では、ＶＰ−１６処理細胞の補正効率を増大しない。チミジンは、非同調性細胞では補正効率を増強しないが、細胞の同調性集団において７％を超えて効率を増大する。

（実施例５）
（遺伝子修復に対するＭＭＳおよびブレオマイシンの効果）
オリゴヌクレオチド指向性遺伝子変更に対するＭＭＳおよびブレオマイシンの効果を以下のように決定する。ＤＬＤ−１−１細胞を１プレートあたり２×１０^６細胞で１００ｍｍディッシュに播種し、直ちに０．２μＭのＭＭＳまたは０．７５μＭのブレオマイシンで処理する。次いで約５０％コンフルエントになるまで、この細胞を２４時間増殖させて、ＰＢＳで２回洗浄する。実施例１に記載のように、細胞の各々の集団の一部を、パルスフィールド電気泳動によるＤＮＡ分析のために取り出す。次いで、補正性のオリゴＥＧＦＰ／７２ＮＴ（１０μｇ）を添加して、細胞を実施例３のようにエレクトロポレーションする。次いで細胞を分析して、実施例３に記載されるように補正されたｅＧＦＰ遺伝子を有する細胞の割合を決定する。

図１０は、ブレオマイシンおよびＭＭＳ標的細胞由来のＤＮＡを有するレーンにおける下側のバンドを示しており、これは二本鎖破壊から生じるＤＮＡフラグメントに相当し、これによってこのアッセイの条件下でのＤＬＤ−１−１細胞に対してＭＭＳおよびブレオマイシンがＤＮＡ損傷を発揮することが示される。図１１Ａは、遺伝子補正がグラフおよび表の形態の両方で生じることを示す。ＭＭＳ処理は、非ＭＭＳ処理コントロールに比較して補正効率を２倍にし、オリゴ処理した細胞よりもかなり大きい。細胞死は、このアッセイの条件下のＭＭＳ処理によっては増大されない。

４ｍＭのカフェインをＭＭＳの代わりにまたはＭＭＳに加えて用いること以外は、上記で報告したＭＭＳ実験と同様にさらなる実験を行う。この結果によって、カフェインを単独で用いた場合、遺伝子修復の効率を増大することについて無効であり、そしてそうでなければＭＭＳによって生じる増強を完全に抑制し得ることが示される。

（実施例６）
（遺伝子修復に対するｄｄＣおよびカフェインの効果）
遺伝子変更効率に対するジデオキシシチジン（ｄｄＣ）およびカフェインの効果を、ＤＬＤ−１−１細胞を用いる標準的な遺伝子変更手順の間に種々の時点でｄｄＣおよびカフェインを添加することによって試験し、そしてその結果を比較する。カフェインは、プレインキュベーションの２４時間の間に含まれてエレクトロポレーションの前に洗い去られるか、またはカフェインはエレクトロポレーションの後にのみ添加される。ｄｄＣが添加される場合、ｄｄＣはプレインキュベーションの２４時間の間にのみ添加される。

哺乳動物ＤＬＤ−１−１細胞（実施例１にさらに記載される）を、ＲＰＭＩ＋中で維持して、このとき、細胞をエレクトロポレーションする場合、またはその後２４時間はＧ４１８が存在しないこと以外は、細胞の各連続継代ではＧ４１８を２００μｇ／ｍｌまで添加する。ＲＰＭＩ＋は、１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、２ｍＭのＬ−グルタミン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、１０ｍＭのＨＥＰＥＳおよび０．４５％のＤ（＋）グルコースを補充されたＲＰＭＩ培地１６４０を含む。細胞を１または２つの１００ｍＭディッシュ中で約９０％コンフルエンシーになるまで増殖させる。次いで細胞をトリプシン処理して、カウントして、１〜２×１０^６個の細胞を新しい１００ｍＭディッシュ（各々のサンプルについて１）にプレートする。平行した実験では、ｄｄＣは、０、１００、２５０、５００または７５０μＭのいずれかの最終濃度まで培地に添加して、その細胞を２４時間インキュベートする。平行の実験では、この２４時間のインキュベーションの間、カフェイン（４ｍＭ）を７５０μＭのｄｄＣ処理した細胞に添加する。トリプシン処理によって細胞をプレートから収集し、スピンダウンして、１ｍＬあたり２×１０^７個の細胞の濃度までＲＰＭＩ １６４０（血清なし）に再懸濁する。

次いでＢＴＸ ＥＣＭ８３０方形波エレクトロポレーションデバイスを用いてエレクトロポレーションを行う。ｅＧＦＰ遺伝子における変異を補正するためのオリゴヌクレオチドを、上記で考察したとおり、エレクトロポレーションの前に細胞に添加する。エレクトロポレーションは、１００μｌの容積中に２×１０^６個の細胞を用いて、４ｍｍのギャップのキュベットで行う。この細胞を、各々１３ｍｓｅｃ続く、２つの２５０Ｖパルスに曝す。エレクトロポレーション後、５００μｌのＲＰＭＩ＋をキュベットに添加して、その内容全体を、２．５ｍＬの予め温めた培地を含む６０ｍＭディッシュに移す。

カフェインで事前に処理していない細胞については、エレクトロポレーションの直後（「回復期（ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｐｈａｓｅ）」）に６０ｍＭのディッシュ中に４ｍＭの最終濃度まで培地にカフェインを添加する。カフェインで事前処理した細胞については、回復期の間にカフェインの添加はしない。回復の２４時間後、その培地を交換して、カフェイン（最終濃度４ｍＭ）をこの培養物に添加して戻す。回復の４８時間後、サンプルをＦＡＣＳによって読む：ｅＧＦＰ蛍光は、遺伝子変更（補正）を反映しており、そしてヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色は、細胞生存度を反映する。

実験のさらなる平行セットをカフェインについての記載どおり、ただし４ｍＭのカフェインの代わりにバニリンを最終濃度１ｍＭまで添加して行う。別の平行セットの実験は、回復期にカフェインが存在する時間の長さを変えて行う。

図１３Ａは、カフェインの非存在下におけるｄｄＣの用量曲線を示す。約２倍〜３倍という補正効率における最大増大が５００μＭのｄｄＣで観察される。

図１３Ｂによって、カフェインがエレクトロポレーションの前に添加される場合、オリゴヌクレオチド指向性遺伝子補正を阻害すること、ただしカフェインは回復期（すなわち、エレクトロポレーション後の期間）に添加される場合、補正を刺激することが示される。カフェインによる遺伝子補正の阻害は、前処理の間にｄｄＣと組み合わせた場合増強される。図１３Ｃに図示されるとおり、これらの効果のいずれも、１ｍＭのバニリンをカフェインの代わりに用いる場合はみられない。

図１３Ｄは、回復期におけるカフェインでの細胞の処理が長いほど、試験される時間の範囲（すなわち、カフェイン処理なし、１２時間、２４時間または４８時間）にわたる補正効率の増強が大きくなることを示す。図１３Ｄにおける全ての実験は、ｄｄＣの前処理なしである最も左側のデータバーを除いて、プレインキュベーションの２４時間において５００μＭ ｄｄＣを含む。

（実施例７）
（ｄｄＣ、カフェイン、ＡｒａＣ、アフィジコリンおよびｐ５３の遺伝子修復に対する効果）
（ジデオキシシチジンの添加は補正頻度を刺激する）
複製フォークを失速させることが、標的された遺伝子修復の頻度を増大するか否かを決定するために、オリゴヌクレオチドをエレクトロポレーションする２４時間前に細胞培養培地にｄｄＣを添加する。実際のところ、ジデオキシシチジンの添加は、オリゴヌクレオチド媒介性の遺伝子修復に用量依存性の増大を生じる（図１６）。修復を刺激するための最も有効な濃度は、細胞毒性をもたらす、より高レベルで５００μＭ〜７５０μＭであることが見出されている（データ示さず）。５００μＭおよび７５０μＭのレベルは、コントロールから統計学的に有意な相違を有することが見出される（図１６）。

（ジデオキシシチジンはＳ期の延長を生じるが、ジデオキシイノシンは生じない）
オリゴヌクレオチド添加の時点での、未処理の細胞の細胞周期分析およびＢｒｄＵ取り込み分析によって、細胞の３５％がＳ期であり、そして４７％がＤＮＡ塩基を活発に取り込んでいる（活発なフォーク）ことが明らかになる（図１７Ａおよび図１７Ｂ）。５００μＭのｄｄＣでの処理は、Ｓ期の細胞の数を７０％まで増大することが示され、このことはｄｄＣが予想どおり細胞がＳ期に費やす時間を延長することを示している（図１７Ａ）。さらに、複製フォーク失速が生じているという証拠は、ＢｒｄＵ取り込み実験によって得られるデータから明らかである（図１７Ｂ）。ｄｄＣの添加（５００μＭまで）によって、複製フォークの一時的な失速の特徴であるＢｒｄＵ取り込みの量の増大（７１．８％）がもたらされる。

比較の目的のために、本発明者らは、ジデオキシイノシン（ｄｄＩ）を添加するが、このｄｄＩとは、ＤＮＡへ取り込まれる前に、最初に細胞によってその活性型２’，３’−ジデオキシアデノシン５’トリホスフェート（ｄｄＡＴＰ）に代謝されなければならないｄｄＣのような連鎖停止剤である。細胞周期分析およびＢｒｄＵ取り込みによって測定される場合、ｄｄＩは、Ｓ期にある細胞数の増大も示さず、活発に複製しているフォークの数の増大をもたらすこともない（図１７Ａ、図１７Ｂ）。実際は、ｄｄＩで処理した細胞は、細胞周期またはＢｒｄＵ取り込みアッセイにおいて、非処理細胞との相違を示さず、このことは、ｄｄＩが複製プロセスに検出可能な影響をほとんど有さないことを示唆している。

対照的に、１−β−Ｄ−アラビノフラニシルシトシン（ＡｒａＣ）は、その三リン酸型に変換された後に、伸長しているＤＮＡ鎖に極めて効率的に組み込まれることが公知である。ＡｒａＣは、フォークが通過できない付加物であるトポイソメラーゼＩ切断複合体をＤＮＡ上に作製することによって、複製フォーク進行を停止する。

ＡｒａＣで処理した細胞の細胞周期分析によって、Ｓ期の細胞数はＡｒａＣでの処理の２４時間後に、未処理細胞における３５％から２６％まで低下することが明らかになる。この減少はそれ自体では十分ではないようである（図１７Ａ）；しかし、細胞集団に対するＡｒａＣの効果がＢｒｄＵ取り込みによってアッセイされる場合、活発にＤＮＡ塩基を取り込んでいる細胞の数は実質的にゼロであるとみられる（図１７Ｂ）。従って、ＡｒａＣは、通常、複製およびＳ期に対するさらに一過性の効果を有するｄｄＣの作用と対照的に、伸長をブロックして、フォークの動きの再スタートを妨げることが示される。

（ジデオキシイノシンもＡｒａ−Ｃも遺伝子修復活性を刺激しない）
ジデオキシイノシン（ｄｄＩ）の種々の用量をＤＬＤ−１細胞に添加する場合、遺伝子補正における有意な増大は観察されない（図１８Ａ）。２５０μＭのｄｄＩレベルでは、遺伝子修復における統計学的に有意でない増大が観察され、このことは、少数の複製フォークが失速されているかもしれないことを示唆する。しかし、事実であれば、この数は、細胞周期分析によってまたはＢｒｄＵ取り込みアッセイによって検出されるのに十分に高くはないように思われる。

ｄｄＩは、その活性型２’，３’−ジデオキシアデノシン５’−三リン酸塩への細胞内代謝を要することが公知である；これが効率的に生じない場合、ＤＮＡへの取り込みは生じ得ない。結果として、複製フォークは、失速も減速もしない。理論によって束縛されることは意図しないが、ｄｄＩ支持体の刺激性の活性の欠失によって、ｄｄＣは伸長している鎖へ組み込まれることによって、遺伝子修復に対して直接でかつある程度特異的な効果を有し得るという概念が支持される。

同様に、ＡｒａＣは、広範な濃度を通じて（５μＭ〜２５０μＭ）補正レベルの増強をもたらさない（図１８Ｂ）。２０μＭおよび２５０μＭでの細胞周期分析によって、Ｓ期の細胞におけるわずか９％の減少が明らかになるが、ＢｒｄＵ取り込みのレベルは、ＤＮＡ合成が停止されていることを示す（図１７Ａ、図１７Ｂ）。これらの条件下では、細胞周期は効率的に停止されて、細胞は薬物が洗い流されるまでＤＮＡ合成を開始しないようである。いずれの場合にも、複製フォークはエレクトロポレーションの時点ではもはや活性ではない。従って、ＡｒａＣは複製フォークの失速には極めて効果的であるが、補正の増強には効果的でなく、このことは遺伝子修復活性には、オリゴヌクレオチド添加の時点で活発に複製しているテンプレートとともにＳ期の細胞を要するということを意味する。

（遺伝子修復活性は、複製のＡｒａＣブロックからの遊離の際に刺激される）
上記のとおり、ＡｒａＣで処理された細胞で観察される刺激の欠失は、Ｓ期を通過する細胞の数の減少または活発に複製しているフォークの非存在によって説明され得る。事実ならば、細胞がＡｒａＣブロックから解放されて、複製フォークがオリゴヌクレオチドのエレクトロポレーションの前に再スタートすることを可能にされる場合に、遺伝子修復頻度の上昇が出現すると本発明者らは予想し得る。本発明者らは、ＡｒａＣを用いて細胞を２４時間処理すること、次いで特定の時間で薬物を洗い流すことによってそれらを解放させることによってこの予測を試験する。本発明者らは、エレクトロポレーションの時点でのＢｒｄＵ取り込みのレベルを測定し、そして４８時間後の補正の頻度を評価する。

図１８Ｃおよび図１８Ｄに示されるとおり、ＢｒｄＵ取り込みにおけるわずかな上昇が解放後２時間内に観察され、このことは活発に複製しているフォークの再生を示す。同時に、本発明者らは、遺伝子修復活性における上昇を観察し、これは次に解放後８時間で最大レベルに達する。この取り込みレベルおよび遺伝子修復レベルは、広範な時点にわたって相関しているようである。従って、Ｓ期の細胞の数の増大および活発に複製しているフォークの数の増大は、ＤＬＤ−１細胞における遺伝子修復のレベルを増大すると考えられる。

ＤＮＡ複製の別のインヒビターであるアフィジコリンを用いる場合、同じ結果が観察される（データ示さず）。

本実施例から遠いこのように用いられる実験プロトコールは、ｅＧＦＰの変異の修復および最大発現を可能にするために、エレクトロポレーション後４８時間の回復期間を含む。これによって、ＡｒａＣによってブロックされ、そして解放直後（図１８Ｃおよび図１８Ｄにおけるゼロ時点）にエレクトロポレーションされた細胞が依然として遺伝子修復を受けられる（補正は４８時間の回復期間の間に生じる）理由が説明され得る。

本発明者らは、複製が４８時間の回復期間にブロックされる場合に補正が消失するか否か疑問に思った。

この疑問に取り組むために、エレクトロポレーション後、ＡｒａＣを種々の時間、培養物中に添加する。図１８Ｅにおける表でわかるように、ＡｒａＣをエレクトロポレーション後任意の期間、培養物に添加する場合、補正レベルは実質的に低下する。Ｓ期の細胞数および活発にＢｒｄＵを取り込んでいる細胞の数は、遺伝子修復活性の低下と相関するため、本発明者らは、遺伝子修復に対して最も従順な細胞は、活発な複製の期間の間にオリゴヌクレオチドを含む細胞であることを示唆する。エレクトロポレーション後のＡｒａＣの２時間〜４８時間の補正レベルに相違はないため、このデータは、エレクトロポレーションの直後の時間の間に活発な複製が最も重要であることを示唆する。

従って、遺伝子修復活性の最大レベルについては、活性な複製の期間の間にオリゴが存在すべきであると思われる。補正の最高レベルは、より多くの細胞が同時にＳ期に入るか、または細胞がＳ期でさらに長時間費やす場合に得られる。

本発明者らは、種々の機構によってＤＮＡ合成をブロックする複製伸長の別のインヒビターを用いてこの実験を繰り返す。アフィジコリン（６μＭ）をこの反応物に、エレクトロポレーションの２、６および２４時間後に添加して、遺伝子修復の頻度を４８時間後に測定する（図１８Ｅ）。ＡｒａＣでの結果と一致して、この反応の回復段階／エレクトロポレーション後段階におけるアフィジコリンの存在は、低レベルの補正を生じる。

（野性型ｐ５３は、ｄｄＣによって刺激された遺伝子補正レベルをブロックするが、変異体ｐ５３は頻度を増強する）
腫瘍サプレッサーｐ５３は多数の遺伝子をトランス活性化し、細胞周期チェックポイントを調節し、そしてアポトーシスのトリガー−スイッチとして機能し得る。近年では、相同組み換えに対するｐ５３の抑制的な役割は、そのトランス活性化機能と独立して、同定されている。ｐ５３は、失速されたフォークに補充されて、複製プロセスにおける妨害に応答しているＨＲ活性のレベルの上昇を抑制または邪魔する。興味深いことに、ＭＥＦ細胞におけるオリゴヌクレオチド指向性修復のインビトロ研究によって、ｐ５３^−／−の株はそのｐ５３^＋／＋対応物よりも高い補正レベルを示したことが示された。これらの結果によって、野性型ｐ５３の抑制活性は、おそらく複製フォークに対する結合というその調節性機能を通じて遺伝子修復反応に伸展し得る。

ｐ５３遺伝子のＤＮＡ結合ドメインは、ｐ５３タンパク質が相同組み換えを抑制する能力を失うように変異され得る；Ｒａｄ５１媒介性の鎖交換を阻害することおよび失速された複製フォークの分枝点移動を逆にすることはもはや不可能である。２〜３の変異体ｐ５３タンパク質、例えば、ｐ５３（１７５Ｈ）およびｐ５３（２７３Ｐ）は、ＨＲの抑制を排除するだけでなく、自然な、放射線誘導性のそして複製阻害誘導性のＨＲを実際に刺激もする。詳細には、ｐ５３（１７５Ｈ）は、Ｇ１チェックポイントコントロールの消失を示し、そしてｐ５３（２７３Ｐ）変異は、ｐ５３⁻Ｒａｄ５１相互作用に影響する。

失速された複製フォークは、遺伝子修復活性の刺激因子であると思われ、従って、本発明者らは、この効果が野性型のｐ５３の作用によってブロックされるはずであると予想し得る。

遺伝子修復反応に対するｐ５３およびその関連の変異体の効果を試験するために、本発明者らは、ＤＬＤ−１細胞において野性型ｐ５３またはＤＮＡ結合ドメイン変異体［ｐ５３（１７５Ｈ、ｐ５３（２７３Ｐ）］の１つのいずれかを一時的に発現する。

ｐ５３構築物のタンパク質発現は、発現構築物のトランスフェクション後に、モノクローナルｐ５３抗体であるＰａｂ１８０１を用いてウエスタンブロット分析によって確認する。各々のｐ５３構築物は、ＣＭＶプロモーターによって駆動され、ほぼ同じレベルだが内因性のレベルを超えるｐ５３タンパク質を発現する（図１９Ａ）。

野性型の発現構築物がｄｄＣで前処理された細胞に導入される場合、遺伝子補正のレベルの低下が観察される（図１９Ｂ）。変異体ｐ５３（２７３Ｐ）の過剰発現は、補正のわずかな増大を示し、ｐ５３（１７５Ｈ）の発現は、補正のレベルの増強を示す（図１９Ｂ）。ＤＬＤ−１細胞は、１コピーの野性型ｐ５３対立遺伝子および１コピーの変異体ｐ５３遺伝子（残基Ｓｅｒ２４１Ｐｈｅ）を含むため、外因性の供給源由来の野性型ｐ５３の発現は、基礎的なレベルの野性型ｐ５３タンパク質をまだ有していない細胞株が有する補正の強力な阻害を有する可能性が高い。

これにもかかわらず、補正の統計学的に有意な減少が既に観察されている。さらに、変異体ｐ５３の発現は、内因性の野性型ｐ５３のレベルの効果を克服し得、そしてそのドミナントナガティブな（優性阻害）効果を通じて遺伝子修復活性を増強し得る。

まとめると、これらのデータによって、野性型ｐ５３は、一時的に失速された複製フォークの存在下において遺伝子修復の活性を下方制御することが示唆される。

（カフェインは遺伝子修復活性のジデオキシシトシン誘導性刺激を阻害する）
ｄｄＣが遺伝子修復の刺激因子として作用する機構は、後期Ｓ期を含むＳ期、およびＨＲ経路がその最高レベルの活性を示す段階である早期Ｇ２期の延長に関与するようである。ＨＲタンパク質の発現は、失速された複製フォークにおけるＤＮＡ損傷またはＤＮＡ合成の間に天然に生じる傷害に応答して上昇する。しかし、非相同性末端結合（ＮＨＥＪ）はまた、変更されたＤＮＡ合成プロセスに応答してある役割を果たし得、そしてその活性はＨＲの活性を上回ることが公知である。

従って、遺伝子修復事象を支配する最も優勢な経路を同定するために、本発明者らは、ＮＨＥＪまたはＨＲのインヒビターに対して、各々の経路を個々にブロックすることが公知である用量で細胞を曝露する。

カフェイン、キサンチン誘導体および放射線増感剤は、ＡＴＭによるｐ５３ ｓｅｒ−１５リン酸化反応を阻害し、６０〜９０％の間でＨＲのレベルを減少するが、ＮＨＥＪにはほとんど効果を有さない。逆に、バニリンは、ＮＨＥＪ経路における本質的な酵素であるＤＮＡ−ＰＫの活性をブロックする。図２０に示されるように、ｄｄＣ単独で処理された細胞での補正レベルは、本発明者らの初期のデータと一致して、２．９％のレベルに達した。バニリンをこの培地に添加する場合、遺伝子修復の頻度は統計学的に変化しない；しかし、カフェインを混合物に添加する場合、補正は実質的に低下する（０．６％）。まとめると、これらの結果によって、オリゴヌクレオチドによって指向される遺伝子修復事象は、相同組み換え経路の活性により大きく依存するということが示される。

（考察）
理論によって束縛されることは意図しないが、カフェインおよびバニリンを用いる研究によって、相同組み換えは遺伝子修復プロセスに関与するという概念が支持される。カフェインはＡＴＭキナーゼ活性およびｐ５３^{ｓｅｒ−１５}の下流のリン酸化を阻害し、これによって細胞のＨＲ活性の６０〜９０％を阻害する。カフェインを細胞培養培地に添加することによるカフェインでの細胞の前処理は、基本的な修復レベルの減少をもたらすだけでなく、ｄｄＣ処理によって生じる遺伝子修復の刺激をブロックもする（図２０）。ＤＮＡ−ＰＫの活性を阻害するバニリンでの前処理を通じたＮＨＥＪのブロックは、遺伝子修復活性を阻害せず、このことは、ＨＲが遺伝子修復応答経路を支配することを示唆している。

この解釈は、ｐ５３過剰発現実験から得られたデータと一致する。相同組み換えは、三本鎖組み換え中間体、特に１つ以上のミスマッチを含むものと高い親和性を有することが公知である、野性型ｐ５３の過剰発現によって阻害されると考えられる。同時に、この構造は、遺伝子修復経路における反応中間体であると考えられる。ｐ５３はまた、失速した複製フォークに結合し、それらを安定化して、組み換え誘導性の複製再スタートに対抗するプロセスであるフォークの逆行を促進する。内因性に添加されたプラスミドからのｐ５３の過剰発現は、遺伝子修復活性の減少をもたらす。理論によって束縛されることは意図しないが、本発明者らは、修復活性における減少は一過性に失速された複製フォークに対する相同組み換え応答の阻害に関与すると考えている。

細胞周期分析およびＢｒｄＵ取り込み実験の結果によって証明されるように、細胞培養物におけるｄｄＣの存在は複製プロセスの減速を生じる。事実上、ｄｄＣでの処理はＳ期からＧ２への細胞の進行を遅らせ、そしてＳ期への細胞の進行を実際に阻害する。これらの条件下では、活発な複製を示す細胞の数は、エレクトロポレーションおよびオリゴヌクレオチドの導入の時点で増大する。

この解釈は、ＡｒａＣ処理によって得られるデータとよく一致している；ＡｒａＣは、ＤＮＡ合成をブロックし、Ｇ１／Ｓ境界で、またはＳ期の初期での蓄積を生じる。この場合、より少ない細胞がＳ期であり、活発に複製しているフォークは含まないと思われる細胞である。解放の際、もともとＧ１／Ｓ境界で凍結された「同調した（ｓｙｎｃｈｒｏｎｉｚｅｄ）」細胞集団は、オリゴヌクレオチドエレクトロポレーションの時点でまたはその直前のいずれかで均一にＳ期に入る。従って、ｄｄＣおよびＡｒａＣの両方は現実に、エレクトロポレーションの時点でＳ期における同じ増強された集団をもたらすが、それらは種々の方法によってこれを達成する。

さらに、ＡｒａＣ実験からの結果によって、活発に複製しているＤＮＡフォークを保有する細胞が、遺伝子修復に対して実はさらに影響を受け易いか、または遺伝子修復の増強されたレベルの影響を受け易いということが示唆される。これらの結果は、複製インヒビターであるアフィジコリンを用いることによって確認される。

細胞をその分裂周期に移動させることによって治療標的に対する遺伝子修復の頻度を増大することが可能である。

（実施例８）
（ファブリー疾患変異のオリゴヌクレオチド指向性遺伝子変更）
ファブリー病を罹患するヒト患者由来のヒト線維芽細胞株である、細胞株ＤＭＮ−１は、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ（ＮＩＨ））から入手される。これらの細胞を用いて、本発明の方法を用いるα−ガラクトシダーゼＡ（ＧＬＡ）の変異対立遺伝子の補正の効率を測定する。本明細書において用いられるファブリー細胞株において特定の疾患を生じる変異は、遺伝子におけるＧ→Ｃの変異によって生じるＡ１４３Ｐである。Ｂｒａｎｔｏｎら、Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ）（２００２）８１（２）：１２２〜３８を参考のこと。

ＧＬＡの変異ファブリー病対立遺伝子を補正する際の本発明の方法の効率を評価するために合成されたオリゴヌクレオチドは、表１に示す。オリゴは、左から右に５’→３’で示される。星印は、ホスホロチオエート結合に相当する。

４９Ｔ／ｐｍと命名された第一のオリゴヌクレオチド（配列番号１）は、全ての位置において遺伝子の転写された鎖に相補性の配列を含むコントロールのオリゴヌクレオチドであり、変異の遺伝子座の上流および下流の両方に伸びている。オリゴヌクレオチド５１ＮＴ／ｐｍは、別のコントロールオリゴヌクレオチドであって、非転写鎖に完全に相補性の配列を含む。

４９ＮＴ／ｃｃと命名された第三のオリゴヌクレオチド（配列番号３）は、変異の遺伝子座以外の全ての位置において遺伝子の非転写鎖に相補性の配列を含み、この変異の遺伝子座の上流および下流の両方に伸びている。この実験で用いられるＧＬＡ変異のためには、シトシン（Ｃ）残基は、転写された鎖における変異の遺伝子座に存在する。４９ＮＴ／ｃｃは、変異の遺伝子座で野性型Ｃ残基を有し、ゲノムＤＮＡにアニーリングされた場合、Ｃ−Ｃ塩基ミスマッチ（Ｃ−Ｇ塩基対ではない）を生じる。

４９Ｔ／ｇｇと命名された第四のオリゴヌクレオチド（配列番号４）は、変異の遺伝子座以外の全ての位置において遺伝子の転写鎖に相補性の配列を含み、この変異の遺伝子座の上流および下流の両方に伸びている。この実験で用いられるＧＬＡ変異のためには、グアニン（Ｇ）残基は、転写されない鎖における変異の遺伝子座に存在する。４９ＮＴ／ｇｇは、変異の遺伝子座で野性型Ｇ残基を有し、ゲノムＤＮＡにアニーリングされた場合、Ｇ−Ｃ塩基ミスマッチ（Ｇ−Ｃ塩基対ではない）を生じる。

前述のオリゴヌクレオチド配列は、例示的であり、そして当業者は、他の配列を含むオリゴヌクレオチドがまた、ＧＬＡ遺伝子における変異を保有する細胞でＯＤＳＡを果たすために用いられ得るということを認識する。ＧＬＡのためのｍＲＮＡ配列は、その開示がその全体として参考によって本明細書に援用される、アクセッション番号ＮＭ＿０００１６９として利用可能であり、そしてヒト遺伝子配列は、アクセッション番号Ｕ７８０２７として利用可能である。このような配列は＜ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ＞でアクセス可能な、Ｅｎｔｒｅｚ ＰｕｂＭｅｄのような公的な配列データベースから容易に入手可能である。

上記で呈示される４９Ｔ／ｇｇおよび４９ＮＴ／ｃｃオリゴヌクレオチドに関して、そしてヒトＧＬＡの公知配列に照らして、ＧＬＡのＡ１４３Ｐ変異の遺伝子修復を果たし得る他のオリゴを作製するには、さらなる塩基を５’末端、３’末端、またはその両方に追加してもよく、塩基を３’末端、５’末端またはその両方から欠失させてもよい。１つの実施形態では、ＧＬＡ遺伝子を修復するために用いられるオリゴヌクレオチドは、１２０ｎｔを含み、そしてオリゴヌクレオチドの中心に近い関連の変異体の遺伝子座を有する。１つの実施形態では、補正性のオリゴヌクレオチドの配列は、

（配列番号５）であり、ここで太字の塩基は、本実施例で用いられる特定の細胞株における変異塩基である。別の実施形態では、ＧＬＡ遺伝子を修復するために用いられるオリゴヌクレオチドは、１７ｎｔを含み、そしてこのオリゴヌクレオチドの中心に近い関連の変異体の遺伝子座を有する。１つの実施形態では、補正性のオリゴヌクレオチドの配列は、

（配列番号６）である。

他の長さのオリゴヌクレオチドを用いてもよく、そして変異の遺伝子座は、本明細書に列挙される特定の実施例におけるようにオリゴヌクレオチドの中心付近である必要はない。本発明の補正性のオリゴヌクレオチドは、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０またはそれ以上の塩基長であってもよい。補正性のオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート結合、２’−Ｏ−メチルアナログまたはＬＮＡ、またはこれらの改変の任意の組み合わせを含んでもよい。

当業者は、本実施例に列挙されるオリゴヌクレオチドの作製から類推して、ファブリー疾患を生じる他の変異は同様に、適切なオリゴヌクレオチドを用いて修復され得ることを認識する。関連の変異の上流および下流の遺伝子の配列は、配列データベースを用いて得られ、それらの位置で相補性であるが、変異の遺伝子座でミスマッチしているオリゴヌクレオチドが設計され、その位置では補正性のオリゴヌクレオチドは、その位置で野性型塩基の相補体を含み、すなわちこの補正性のオリゴヌクレオチドは標的ＤＮＡにおける変異鎖に対合した野性型の反対鎖の短いストレッチを提供する。このオリゴヌクレオチドは、１７〜１２０ｎｔ長の任意の長さであってもよい。

４９Ｔ／ｃｃおよび４９ＮＴ／ｇｇオリゴヌクレオチドの両方とも、ＧＬＡ変異を潜在的に補正し得る配列を提供するが、４９Ｔ／ｐｍおよび５１ＮＴ／ｐｍオリゴヌクレオチドはこのような配列を提供せず、コントロールとして働く。４つの全てのオリゴヌクレオチドを用いて、細胞がエレクトロポレーションされるのではなく、オリゴヌクレオチドでトランスフェクトされることを除いて、実施例１に記載されるとおりＯＤＳＡを実質的に果たす。オリゴを、１反応あたり５μｇ、１０μｇまたは３０μｇで添加する。ＯＤＳＡを行った後、その開示がその全体として参考によって本明細書に援用される、Ｍｅｄｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）（１９９６）９３：７９１７〜２２に記載されるとおり、細胞を培養して、Ｂｒａｄｙの方法に従ってＧＬＡ活性についてアッセイする。処理培養物対未処理培養物における活性を比較することによって遺伝子補正の指標としてＧＬＡ活性を用いる。補正効率は、処理細胞の数における変異の遺伝子座の配列決定によって、引き続いて確認される。

前の実施例と同様に、補正性のオリゴヌクレオチドでのトランスフェクションの前に、ＨＵ、ＶＰ１６またはＣＰＴを用いて標的細胞を処理する。しかし、実施例１に記載されるＤＬＤ−１−１細胞でのｅＧＦＰの補正に関与する実験とは異なり、本実施例中の実験における特定の因子（ＶＰＡ、カフェイン、ＴＳＡ）は、トランスフェクションの前には添加されないが、代わりに回復期間の間に、トランスフェクション後にのみ添加される。

標的細胞へのオリゴヌクレオチドの導入の手段はまた、前の実施例とは異なり、エレクトロポレーションではなく、トランスフェクション増強因子ＦｕＧＥＮＥ^ＴＭ６（ＦＧ）（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｃｏｒｐ．，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，Ｉｎｄｉａｎａ，ＵＳＡ）の存在下でのトランスフェクションが用いられている。各々のトランスフェクション反応は、ＦＧが関連の図面における各々のデータポイントについてはっきり示されていない事実にもかかわらず、他に示さない限り、１００μｌの標的細胞および１２μｌのＦＧを含む。その他は、ＤＬＤ−１−１実験およびファブリー実験において用いられる手順は同様である。

図１５Ａは、オリゴヌクレオチド用量に対する、タンパク質濃度あたりの単位としてＧＬＡ活性を示す。この図は、三連で行われた実験の結果を反映する。コントロールのオリゴである４９Ｔ／ｐｍは、最低のレベルのＧＬＡ活性を与え、これは、変異ＧＬＡ対立遺伝子のみを保有する細胞におけるＧＬＡ活性の基礎レベルを示す。最高のＧＬＡ活性は、コントロールと比較した場合４倍を超えるまで活性を改善する、４９Ｔ／ｇｇでの処理後に得られる。４９ＮＴ／ｃｃは、４９Ｔ／ｇｇよりもＯＤＳＡを果たすのに有効性が低いが、それにもかかわらずいくつかの用量では３倍を超えて活性を改善した。これらの結果は、ＯＤＳＡにおける鎖のバイアスを示す他の実験と一致するが、最も補正の影響を受け易い鎖は変化し得る。最適の補正は、１０μｇのオリゴで得られ、３０μｇで有意に低下する。

図１５Ａに関して記載されている同じ実験を、本発明の実施形態が遺伝子変更（本実施例では、補正）効率を増大し得るか否かを評価する種々の因子および処理の存在下で反復する。図１５Ｂは、１つのこのような一連の実験の結果を示しており、これは左から右に考察される。バーは、種々の実験において観察される補正効率を示す。他に示さない限り、全ての実験は、細胞を処理するために用いられる任意の他の因子に加えて１０μｇの４９Ｔ／ｇｇを含む。

処理を受けない細胞、またはＦＧでのみ処理される細胞は、低いみかけの補正効率を示す。コントロールオリゴヌクレオチド５１ＮＴ／ｐｍで処理された細胞は０．２７％の補正を示すが、４９Ｔ／ｇｇで処理した細胞は、その補正効率を二倍にすることが示される。

４９Ｔ／ｇｇとともに０．３ｍＭのＨＵで処理される細胞は、３．３６％の効率で補正され、ここで高濃度のＨＵほど低い効率の補正を生じる。１〜５０μＭにおよぶ濃度範囲のＶＰ１６の添加は、補正性のオリゴヌクレオチドの有無に関わらず、補正効率にほとんど影響を有さない。カンプトテシン（ＣＰＴ）は１０ｎＭでは、補正効率を０．８２％まで増大するが、２〜５０ｍＭの濃度範囲におよぶチミジンでの処理は、補正性のオリゴヌクレオチドの有無にかかわらず、補正効率にほとんど影響を有さない。ＤＮＡ修復経路を刺激することが公知のｐ７マー（ｐＡＧＴ ＡＴＧ Ａ、ここで「ｐ」は５’リン酸塩である）での処理は、補正効率を０．６２％まで穏やかに改善する。

図１５Ｃによって、図１５Ｂに示されるＨＵで増強された遺伝子補正は一過性の減少ではないということを確認するようにデザインされた一連の実験の結果が示される。細胞を、図に例示されるように処理し、次いでＧＬＡ活性をアッセイする前に７日間増殖させる。図１５Ｂに例示されるように、補正性のオリゴ４９Ｔ／ｇｇでの処理は、ＧＬＡ活性をコントロールオリゴ４９Ｔ／ｐｍでの処理の２倍にし、ここで図１５Ｃにおけるデータは、これが一過性ではない効果であることを示す。０．３ｍＭおよび１ｍＭのＨＵの両方で処理された細胞は、未処理の細胞と比較して、ＧＬＡ活性におけるほぼ３倍の持続性（７日後）の増大を示す。１ｍＭのＨＵで処理した場合、補正性のオリゴ４９Ｔ／ｇｇは、コントロールオリゴ４９Ｔ／ｐｍと同じく２倍を超えてＧＬＡ活性を増強し、このことはこの結果が配列特異的であることを示す。

さらなる一連の実験の結果を図１５Ｄに示しており、ここではこのデータは、ＧＬＡ活性として、単位タンパク質濃度あたり１時間あたりに生成されたＧＬＡアッセイの産物のナノモル（ｎＭ）濃度として示される（図ＤおよびＥにおけるデータと同様に）。変異の遺伝子座の周囲のＧＬＡの転写された鎖に好ましくは相補性である、１０μｇのコントロールオリゴヌクレオチド４９Ｔ／ｐｍの添加は、処理なしの細胞に比較してＧＬＡ活性を感知できるほど増強しない。対照的に、４９Ｔ／ｇｇでの処理は、ＧＬＡ活性を２倍より大きくする。ＧＬＡ活性は回復期、すなわち、４９Ｔ／ｇｇでのトランスフェクション後の期間の間に５μＭのＶＰＡの添加によって、未処理の細胞よりも２０倍を超えて、９８．７１へ劇的に増強される。ＧＬＡ活性はまた、回復の間に７．５ｎＭのＣＰＴの添加によって２６．８４まで、非処理コントロールよりもほぼ６倍高くまで増強される。ＶＰＡおよびＣＰＴの両方とも非線形性の用量応答曲線を示し、ここで各々の因子の試験した最高濃度は、最低のＧＬＡ活性を与える。

ファブリー細胞に対する実験のさらなるセットでは、その結果を図１５Ｅに示しており、細胞は、オリゴヌクレオチドおよび他の因子での処理の前に二重チミジンブロックプロトコールを用いて細胞周期が同調される。これらの条件下では、補正性のオリゴヌクレオチド４９Ｔ／ｇｇでのトランスフェクションの前に１ｍＭのＨＵを用いる処理は、未処理の細胞に比較してＧＬＡ活性を５倍に増大する。他の実験において観察されるように、ＨＵ用量応答は非線形である。回復期間の間の４ｍＭのカフェインの添加は、０．３ｍＭのＨＵで処理した細胞においてＧＬＡ活性にわずかな影響を有する。エレクトロポレーションの前の５００μＭのｄｄＣでの処理は、未処理の細胞に比較してＤＬＡ活性を二倍にするが、回復期間の間の４ｍＭのカフェインまたは１００ｎｇ／ｍｌのトリコスタチンＡ（ＴＳＡ）でのさらなる処理は、５００μＭのｄｄＣがＧＬＡ活性を増強する能力を廃する。

（実施例９）
（ポンペ病変異のオリゴヌクレオチド指向性遺伝子変更）
グリコーゲン貯蔵疾患ＩＩとしても公知のポンペ病（ＭＩＭ２３２３００）は、常染色体劣性リソソーム蓄積症である。酸αグルコシダーゼ（ＧＡＡ）をコードする遺伝子中の変異は、ポンペ病に関連する。イスラエルでの研究によって、１００例の患者中約１例がＧＡＡの疾患発生変異形態のキャリアであること、およびポンペ病を持って生まれた個体の予想数が４０，０００に対して１であることが示される。Ｂａｓｈａｎら、Ｉｓｒａｅｌ Ｊ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．（１９８８）２４：２２４〜２７。ＧＡＡのｍＲＮＡ配列は、その開示がその全体として参考によって本明細書に援用される、アクセッション番号ＮＭ＿０００１５２およびＮＭ＿１９９１１８として利用可能である。ＧＡＡにおける変異を修復するためのオリゴヌクレオチドは、実施例８における補正性のオリゴヌクレオチドとの類似性によって設計される。ＯＤＳＡは、実施例８においてと同様にポンペ病を生じる変異ＧＡＡ改変体を保有する細胞で行って、変異体遺伝子を修復する。

（実施例１０）
（ゴーシェ病変異のオリゴヌクレオチド指向性遺伝子変更）
ゴーシェ病（ＭＩＭ２３０８００）は、グルコセレブロシダーゼをコードする遺伝子における変異によって生じる。ゴーシェ病は、一般では１００，０００人に約１人に罹患し、アシュケナージ系ユダヤ人では４５０例に１例の頻度である。グルコセレブロシダーゼ（ＧＢＡ）をコードする遺伝子における変異は、ゴーシェ病に関連する。ＧＢＡのｍＲＮＡ配列は、アクセッション番号ＮＭ＿０００１５７として利用可能であり、そしてヒト遺伝子配列は、その開示がその全体として参考によって本明細書に援用される、アクセッション番号ＡＦ０２３２６８およびＪ０３０５９として利用可能である。ＧＢＡにおける変異を修復するためのオリゴヌクレオチドは、実施例８における補正性のオリゴヌクレオチドとの類似性によって設計される。ＯＤＳＡは、実施例８においてと同様にゴーシェ病を生じる変異ＧＢＡ改変体を保有する細胞で行って、変異体遺伝子を修復する。

（実施例１１）
（ヒト血球中の効率的なエキソビボ遺伝子修復）
アッセイシステム。オリゴヌクレオチド指向性配列変更（遺伝子修復）は、標的としてヘモグロビンのβサブユニットをコードする染色体遺伝子を用いてヒト血球における遺伝物質で行われる。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子の変異体コピーを含む２つのオリゴヌクレオチドおよびプラスミドを、細胞に同時導入する。第二のオリゴヌクレオチドを設計して、蛍光を生じる変異ＧＦＰを修復する変更を指向する。野性型のタンパク質を鎌状の対立遺伝子に変換するように第一のオリゴヌクレオチドを設計する。本発明者らは、遺伝子へ鎌状変異を導入するように設計された単独のヌクレオチド位置を除く全ての位置で、野性型対立遺伝子に対して配列中で対応する第一のオリゴヌクレオチドを用いる。従って、これらのオリゴヌクレオチドは、単一の塩基を除いて、実施例６に記載され、かつ表７に示されるオリゴヌクレオチドと同一である。例えば、本発明者らは、

から選択される第一のオリゴヌクレオチドを用いる。野性型対立遺伝子に対してミスマッチするオリゴヌクレオチド中の塩基は小文字で示す。オリゴヌクレオチドは、各々の末端上の３つのホスホロチオエート結合で（星印で示される）、または各々の末端での単一のＬＮＡ塩基で合成される（太字）。

細胞の調製および処理。細胞を解凍して、以下のとおりエレクトロポレーションする。１０％のＦＣＳ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含有するＱＢＳＦ−６０培地（Ｑｕａｌｉｔｙ Ｂｉｏ）を３７℃まで温める。凍結されたＧ−ＣＳＦ移動末梢血ＣＤ−３４^＋細胞のバイアル（Ｂｉｏ Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ）を３７℃の水浴中で急速解凍し、そのチューブの外側を７０％エタノールで拭いて、約２ｍＬ（約１×１０^６個の細胞）の細胞懸濁液を１５ｍｌまたは５０ｍｌの円錐のチューブに無菌的に移す。そのバイアルを１ｍｌの培地でリンスし、次いでこれを細胞に滴下し、２〜３滴ごとにこのチューブを穏やかに回旋する。容積が約５ｍｌになるまで培地をゆっくりと滴下して加え、やはり２〜３滴ごとにこの円錐のチューブを穏やかに回旋し、次いで１〜２ｍｌの培地滴下を添加することによって、このチューブを満たすまで容積をゆっくりと増やし、各添加後に回旋する。この細胞懸濁液を室温で１５分間、２００×ｇ（１５００ｒｐｍ）で遠心分離する。ピペットを用いて、ほとんどの洗浄液を第二のチューブに移し、細胞ペレットを乱さないように２〜３ｍｌを残す。このペレットを残りの培地に再懸濁して、１５ｍｌの円錐チューブに移す。もとのチューブを５ｍｌの培地でリンスして、その洗浄液を細胞に滴下して加え、各々の添加後には穏やかに回旋する。この細胞を２００×ｇで１５分間、再遠心分離する。

洗浄液の２ｍｌを除く全てをピペットして除き、その細胞を残りの培地中で穏やかに再懸濁してカウントする。この細胞を３７℃でかつ５％ＣＯ_２で１時間、静止させ、次いで再カウントする。サイトカインｆｌｔ−３、ＳＣＦおよびＴＰＯを１００ｎｇ／ｍｌの最終濃度で含むＦＣＳなしの５ｍｌのＱＢＳＦ−６０培地（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を添加して、細胞を２００×ｇ（１５００ｒｐｍで１５分間）再ペレット化し、そしてできるだけ多くの液体容積を、ペレットを乱すことなく穏やかに取り出す。細胞を１ｍｌあたり約５×１０^５〜１×１０^６個の細胞で再懸濁して、６ウェルの組織培養処理されたディッシュに移す。細胞をサイトカイン（ＱＢＳＦ−６０培地、ＦＣＳなし、サイトカインｆｌｔ−３、ＳＣＦおよびＴＰＯを１００ｎｇ／ｍｌの最終濃度で含む）を用いて３日間刺激して、トリパンブルー排除染色を用いて細胞カウントを行う。この細胞を２００×ｇ（１５００ｒｐｍ）で１５分間遠心分離する。過剰な容積をピペットによって除去して、その細胞を同じ培地に２×１０^６細胞／ｍｌで再懸濁する。

オリゴヌクレオチドおよびＧＦＰプラスミドを、以下のような方形波条件下で細胞にエレクトロポレーションする。細胞懸濁液（２５０μｌ）、５μｇのＧＦＰプラスミド、および３０μｇの各々のオリゴヌクレオチドを、２ｍｍのギャップのキュベットに添加して、２２０Ｖで１つの１９ｍｓｅｃパルスの間エレクトロポレーションする。次いで、Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ^ＴＭ）、１０％ＦＣＳ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）（７５０μｌ）、サイトカイン ｆｌｔ−３、ＳＣＦ、ＴＰＯ（１００ｎｇ／ｍｌの最終濃度で）、グルタミンおよびペニシリン／ストレプトマイシンを添加する。

あるいは、２５０μｌの細胞懸濁液、ｆｌｔ−３、ＳＣＦおよびＴＰＯを補充した２５０μｌのＱＢＳＦ−６０培地、ならびに３０μｇのオリゴヌクレオチドを４ｍｍのギャップキュベットに添加して、１秒のパルス間隔で２２０Ｖの５つの１９ｍｓｅｃパルスについてエレクトロポレーションする。次いで、Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ^ＴＭ）（５００μｌ）、１０％ＦＣＳ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）およびサイトカイン ｆｌｔ−３、ＳＣＦおよびＴＰＯ（１００ｎｇ／ｍｌの最終濃度）を添加する。

修復された機能的なＧＦＰタンパク質を保有する細胞を、ＦＡＣＳを用いて選択する。選択された細胞におけるヘモグロビン標的の配列は、２つのオリゴヌクレオチド：

を用いてＰＣＲ増幅およびＳＮａｐＳｈｏｔ^ＴＭデバイスでの分析によって決定する。

多数の実施形態および特徴が本明細書に記載されるが、この記載された実施形態および特徴の改変および変化が、本発明の精神または添付の特許請求の範囲から逸脱することなくなされ得るということが当業者によって理解される。特に言及しない限り、本発明の方法のどの工程も、いかなる特定の順序の物質の添加も、工程の実行の順序も必要としない。本明細書に言及される全ての特許、特許刊行物および他の公開された引用文献は、あたかも個々にかつ詳細に本明細書に参考によって援用されたかのように、その全体が参考によって本明細書に援用される。

特許請求の範囲における要素は、これが「〜のための方法、手段（ｍｅａｎｓ ｆｏｒ）」、「〜のための工程、ステップ（ｓｔｅｐ ｆｏｒ）」または「〜のための工程（複数）、ステップ（複数）（ｓｔｅｐｓ ｆｏｒ）」という句を明確に含む場合、および明確に含む場合に限り、米国特許法第１１２条第６段落を発動するものとする。「〜のための工程、ステップ」または「〜のための工程（複数）、ステップ（複数）」という句は、特許請求の範囲の要素に含まれようと、または序文に含まれようと、米国特許法第１１２条第６段落を行使するものではない。

（配列表）
９９６８９−０００３２ＵＳ（３ＫＢのサイズを有するＰａｔｅｎｔＩｎ Ｄｏｃｕｍｅｎｔ）および９９６８９−０００３２ＵＳ．ＳＴ２５（３ＫＢのサイズを有するテキスト文書）と題されたファイルを含む２００５年５月３日付けの添付されたコンパクトディスクに含まれる構成要素は、その全体が参考として本明細書に援用される。

本発明の上記および他の目的および利点は、同様の記号が全体を通じて同様の部分を指している、かつ以下のとりである添付の図面とあわせて考慮して、添付の詳細な説明を考慮すれば明白になる。
図１Ａは、２００４年１１月１０日出願の同時係属の米国特許出願第１０／９８６，４１８号（「Ｍａｍｍａｌｌｉａｎ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅｓ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ，Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ，ａｎｄ Ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ」）（その開示がその全体として参照によって本明細書に援用される）に記載されるような、緑色蛍光タンパク質をコードする変異遺伝子（ＥＧＦＰ−Ｎ３（変異体））を含む統合的カセットの構造、ならびにＤＬＤ−１−１と命名されるＤＬＤ−１由来哺乳動物細胞株を作製するために用いられる、野性型対応配列（ＥＧＦＰ−Ｎ３（野性型））を示す。 図１Ｂは、変異体および野性型のｅＧＦＰ対立遺伝子の配列の関連のセグメント、ならびにｅＧＦＰ変異（ＥＧＦＰ３Ｓ／７２ＮＴ）および非特異的なコントロールオリゴヌクレオチド（Ｈｙｇ３Ｓ／７４ＮＴ）を補正するために用いられる一本鎖オリゴヌクレオチドの配列を示す。星印は、ホスホロチオエート結合を示す。 図２は、本発明による、操作されたＤＬＤ−１−１細胞における配列変更（「遺伝子変更」）のためのプロトコールを示す。 図３は、未処置の細胞に比較してＥＧＦＰ３Ｓ／７２ＮＴで処置したＤＬＤ−１−１細胞において高レベルのＧＦＰを発現する細胞の割合の増大を示す蛍光活性化細胞分取（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ（ＦＡＣＳ））のデータを示す。 図４は、血清枯渇およびミモシンでの処置によって影響されるような、細胞周期停止からの解放後、種々の時間での、ＤＮＡ含量の関数としてのＤＬＤ−１−１培養物の集団における細胞の数を示すＦＡＣＳデータを示す。図４はまた、細胞の上述の集団がＥＧＦＰ３Ｓ／７２ＮＴで処置される場合の、管状の形態での、細胞周期における細胞の分布、および平均「補正効率（ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）」（「Ｃ．Ｅ．」）を示す。非同調細胞とは、細胞周期停止に対して供されないが、それ以外は同等に処置される細胞である。 図５は、０．３、１または５ｍＭのＨＵまたは０．５、１または３μＭのＶＰ１６で処置されているＤＬＤ−１−１細胞由来のＤＮＡのパルス・フィールドゲルを示す。「Ｃ」は、ＨＵにもＶＰ１６にも曝されなかった細胞由来のコントロールサンプル、そして「Ｍ」は、サイズマーカーのレーンである（特に、７４５、７８５、８１５および１１２０＋１１００Ｋｂｐ）。 図６は、補正効率を、処置された細胞数の割合として、そして細胞生存度を、ＤＬＤ−１−１細胞を処置するために用いたＨＵおよびＶＰ１６の用量の関数として示す。補正効率は、「パーセントとして（ａｓ ａ ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ）」示され、本明細書では、これは他に示されない限り、処置後に補正された表現型を示す全ての処置された細胞の割合をいう。 図７は、ＯＤＳＡ実験におけるＨＵおよびＶＰ１６を用いたＤＬＤ−１−１細胞の処置についての時間経過を示す。 図８は、処置なし、１ｍＭのＨＵでの２４時間の処置、または３μＭのＶＰ１６を用いた２４時間の処置後の細胞周期におけるＤＬＤ−１−１細胞の分布を示すＦＡＣＳデータを示す。表は、ＦＡＣＳデータに基づくＳ期の細胞の割合、および細胞の各々の集団についてのＢｒｄＵ取り込み実験の結果に相当する。 図９Ａは、二重チミジンブロック手順を用いる、同調していないかまたは同調したＤＬＤ−１−１細胞の集団についての細胞周期の各段階における細胞の画分を示すＦＡＣＳデータであって、各々のプロットの下にはＳ期の細胞の割合を示している。 図９Ｂは、同調した（暗いバー）および同期していない（明るいバー）ＤＬＤ−１−１培養物で行った、ＯＤＳＡ実験での補正効率を、１ｍＭのＨＵ、３μＭのＶＰ１６または１０ｍＭのチミジンでの処置の関数として示す。コントロールの細胞は、列挙した因子のいずれでも処置せず、ただしそれ以外は同等に処置した。 図１０は、未処置の細胞由来のＤＮＡと比較した、０．７５μＭのブレオマイシンまたは０．２μＭのＭＭＳを用いたＤＬＤ−１−１の処置によって生じたＤＮＡ損傷を図示するパルス・フィールドゲルを示す。 図１１Ａは、１０μｇ ＥＧＦＰ３Ｓ／７２ＮＴを用いて、０．２μＭ ＭＭＳの有無で処置した集団における、そして未処置の集団におけるＧＦＰを発現するＤＬＤ−１−１細胞の割合である。このデータはまた、細胞死データとともに、プロットの下の表に示される。 図１１Ｂは、１０μｇ ＥＧＦＰ３Ｓ／７２ＮＴで処置した、そして：なしで；０．２μＭ ＭＭＳで；０．２μＭのＭＭＳ＋４ｍＭカフェインで；４ｍＭのカフェインで処置した集団における、ＧＦＰを発現するＤＬＤ−１−１細胞の割合を示す。このデータはまた、細胞死データとともに、プロットの下の表に示される。ここで、または本明細書の他の図面において、「ｕＭ」は「μＭ」（マイクロモル濃度）と同義語として用いる。 図１２は、一連のＯＤＳＡ実験における補正効率（割合として）を、ウォルトマニン（ＷＭ）の用量を単独で、または３０ｎＭ ＣＰＴと組み合わせての関数として示す。 図１３Ａは、一連のＯＤＳＡ実験において補正効率（割合として）を、ｄｄＣの用量の関数として示す。 図１３Ｂは、エレクトロポレーションの前（「前（ｐｒｉｏｒ）」）または後（「回復（ｒｅｃｏｖｅｒｙ）」のいずれかで添加した、５００μＭ ｄｄＣを用いる、４ｍＭカフェインなしで、または４ｍＭのカフェインありでの処置の関数として、一連のＯＤＳＡ実験における補正効率（割合として）を示す。 図１３Ｃは、エレクトロポレーションの前（「前（ｐｒｉｏｒ）」）または後（「回復（ｒｅｃｏｖｅｒｙ）」のいずれかで添加した、５００μＭ ｄｄＣを用いる、１ｍＭのバニリンなしで、または１ｍＭのバニリンありでの処置の関数として、一連のＯＤＳＡ実験における補正効率（割合として）を示す。 図１３Ｄは、１２時間、２４時間または４８時間のエレクトロポレーションの後に添加した、５００μＭ ｄｄＣを用いる、カフェインなしで、または４ｍＭのカフェインありでの処置の関数として、一連のＯＤＳＡ実験における補正効率（割合として）の時間経過を示す。 図１４Ａは、ＤＬＤ−１−１細胞についてのＢｒｄＵ取り込み（コントロールの割合として）を、３μＭ ＣＰＴでの処置後の時間の関数として示す。 図１４Ｂは、３μＭ ＣＰＴでの処置後の時間の関数としてＤＬＤ−１−１細胞についてのＤＬＤ−１−１細胞についての補正効率を（コントロールに対して）示す。 図１４Ｃは、ＣＰＴの割合の関数として一連のＯＤＳＡ実験における補正効率を（割合として）示す。 図１４Ｄは、ＣＰＴ単独で、または他の因子および関連のコントロールと組み合わせての処置の関数として、一連のＯＤＳＡ実験における補正効率（割合として）を示す。 図１５Ａは、ファブリー（Ｆａｂｒｙ）細胞におけるＧＬＡ活性を、ファブリー細胞でのＯＤＳＡ実験において用いたオリゴヌクレオチドの配列、および用いた各々のオリゴの量の関数として示す。 図１５Ｂは、ＨＵ、ＶＰ１６、ＣＰＴ、チミジン（ｔｈｙ）、ｐ７およびその種々の組み合わせ、割合および用量で用いた処置の関数として、一連のＯＤＳＡ実験におけるファブリー細胞での補正効率を（割合として）示す。 図１５Ｃは、示したとおり、エレクトロポレーションの７日後のファブリー細胞におけるＧＬＡ活性をＨＵでの処置、およびその用量の関数として示しており、ここでオリゴヌクレオチドは、４９Ｔ／ｐｍまたは４９Ｔ／ｇｇのいずれか、またはオリゴヌクレオチドなしである。 図１５Ｄは、示したとおり、ファブリー細胞におけるＧＬＡ活性を、ＶＰＡ、ＣＰＴ、ｐ７およびその種々の組み合わせ、順列および用量での処置の関数として示しており、ここでオリゴヌクレオチドは、４９Ｔ／ｐｍまたは４９Ｔ／ｇｇのいずれか、またはオリゴヌクレオチドなしである。 図１５Ｅは、示したとおり、同調したファブリー細胞におけるＧＬＡ活性を、ＨＵ（０．３、１または３ｍＭ）、５００μＭ ｄｄＣ、４ｍＭカフェインまたは１００ｎｇ／ｍＬのトリコスタチンＡ（ＴＳＡ）の組み合わせでの処置の関数として示す。 図１６は、オリゴヌクレオチドでのエレクトロポレーションの前の２４時間、種々の用量の２’３’−ジデオキシシチジン（ｄｄＣ）に曝したＤＬＤ−１細胞における遺伝子修復のｄｄＣ刺激についての用量応答曲線を、ｅＧＦＰ遺伝子の補正の関数として蛍光細胞のパーセントによって４８時間後に決定した補正効率パーセント（ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ（Ｃ．Ｅ．（％））を用いて示す；結果は、４つの実験にまたがる平均である。（＊）によって区分けした処置は、処置なしのコントロールに対して０．０５未満のｐ値で統計学的に有意である。 図１７Ａは、種々の示した（２４時間）反応条件下で細胞周期のプロフィールを示す。 図１７Ｂは、種々の示した（２４時間）反応条件下でＢｒｄＵ取り込みのプロフィールを示す。 図１８Ａは、補正効率に対するｄｄＩの統計学的に有意な効果を示す。 図１８Ｂは、補正効率に対するＡｒａＣの統計学的に有意な効果を示す。 図１８Ｃは、ＡｒａＣからの解放後、種々の時点でのそれぞれ、ＢｒｄＵ取り込みおよび補正効率に対する効果を示す。 図１８Ｄも、ＡｒａＣからの解放後、種々の時点でのそれぞれ、ＢｒｄＵ取り込みおよび補正効率に対する効果を示す。 図１８Ｅは、ＡｒａＣまたはＡｐｈｉｄｉｃｏｌｉｎ処置のいずれかからの解放後、種々の時点での補正効率を表にしており、一緒に、生存率、蛍光細胞の総カウント、および補正頻度（ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ）（Ｃ．Ｅ．）を示している。 図１９Ａは、ｐ５３が、ｄｄＣによって刺激された遺伝子修復活性をブロックするかまたは抑制することを実証しており、ここで図１９Ａによって、発現構築物の導入２４時間後に調製した細胞抽出物のウエスタンブロット分析によってｐ５３の発現が確認される。 図１９Ｂは、示されたｐ５３またはコントロールの構築物の存在における補正効率を示す。星印は、コントロール（空の発現構築物）からの統計学的に有意な相違を示す（０．０５未満のｐ値）。 図２０は、カフェインがｄｄＣによって誘導された補正をノックダウンするがバニリンはノックダウンしないことを、標準偏差を提示して、３つの実験の平均をグラフにして示している。コントロールとの統計学的に有意な相違（ｐ値が０．０５未満）を示すサンプルを示している。

Claims (27)

1. 細胞のある集団において標的ＤＮＡ分子中の特定の遺伝子座における、オリゴヌクレオチド指向性の遺伝子変更の効率を増大させるための方法であって、該方法は：
   遺伝子修復または遺伝子編集を促進する細胞酵素活性を誘導する少なくとも１つの因子を用いて細胞の該集団を処置する工程と；
   配列変更オリゴヌクレオチドを用いて細胞の該集団を処置する工程と；
   を包含する、方法。
2. 前記因子がヒドロキシウレア、チミジン、ミモシン、エトポシド、メチルメタンスルフェート、カプトテシン、ジデオキシシチジンおよびバルプロ酸からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
3. 前記遺伝子修復または遺伝子編集を促進する細胞酵素活性を誘導するいくつかの因子をさらに含む、請求項１に記載の方法。
4. 前記因子がヒドロキシウレア、チミジン、ミモシン、エトポシド、メチルメタンスルフェート、カプトテシン、ジデオキシシチジン、バルプロ酸およびそれらの組み合わせからなる群より選択される１つ以上の因子を含む、請求項３に記載の方法。
5. 前記配列変更オリゴヌクレオチドが、前記標的ＤＮＡ分子に対して、前記特定の遺伝子座において非相補性であることによって、該標的ＤＮＡ分子の１つの鎖に対していくつかのヌクレオチド位置で相補性である、請求項１に記載の方法。
6. 前記遺伝子編集または遺伝子修復を改善するように設計されたベクターを用いて細胞の集団を処置する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
7. 前記細胞の集団を、細胞周期の特定の段階で細胞について該細胞の集団を富化する少なくとも１つの因子を用いて処置する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
8. 前記細胞周期の特定の段階がＳ期である、請求項７に記載の方法。
9. 前記標的ＤＮＡの複製速度を低下させる少なくとも１つの因子を用いて細胞の集団を処置する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
10. 前記細胞の集団においてＤＮＡ損傷を誘導する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
11. 細胞のある集団において標的ＤＮＡ分子中の特定の遺伝子座における、オリゴヌクレオチド指向性の遺伝子変更の効率を増大させる方法であって、該方法は：
    細胞の該集団を、細胞周期の特定の段階で細胞について該細胞の集団を富化する少なくとも１つの因子を用いて処置する工程と；
    配列変更オリゴヌクレオチドを用いて細胞の集団を処置する工程と；
    を包含する、方法。
12. 細胞周期の前記特定の段階がＳ期である、請求項１１に記載の方法。
13. 前記因子がヒドロキシウレア、チミジン、ミモシン、エトポシド、メチルメタンスルフェート、カプトテシン、ジデオキシシチジンおよびバルプロ酸からなる群より選択される、請求項１１に記載の方法。
14. 細胞周期の特定の段階において細胞について前記細胞の集団を富化するいくつかの因子をさらに含む、請求項１１に記載の方法。
15. 細胞周期の前記特定の期がＳ期である、請求項１４に記載の方法。
16. 前記因子がヒドロキシウレア、チミジン、ミモシン、エトポシド、メチルメタンスルフェート、カプトテシン、ジデオキシシチジン、バルプロ酸およびそれらの組み合わせからなる群より選択される１つ以上の因子を含む、請求項１４に記載の方法。
17. 前記配列変更オリゴヌクレオチドが、前記標的ＤＮＡ分子に対して、前記特定の遺伝子座において非相補性であることによって、該標的ＤＮＡ分子の１つの鎖に対していくつかのヌクレオチド位置で相補性である、請求項１１に記載の方法。
18. 遺伝子編集または遺伝子修復を改善するように設計されたベクターを用いて細胞の集団を処置する工程をさらに包含する、請求項１１に記載の方法。
19. 標的ＤＮＡの複製速度を低下させる少なくとも１つの因子を用いて細胞の集団を処置する工程をさらに包含する、請求項１１に記載の方法。
20. 細胞の集団においてＤＮＡ損傷を誘導する工程をさらに包含する、請求項１１に記載の方法。
21. 細胞のある集団において標的ＤＮＡ分子中の特定の遺伝子座における、オリゴヌクレオチド指向性の遺伝子変更の効率を増大させるための方法であって、該方法は：
    標的ＤＮＡの複製速度を低下させる少なくとも１つの因子を用いて細胞の該集団を処置する工程と；
    配列変更オリゴヌクレオチドを用いて細胞の該集団を処置する工程と；
    を包含する、方法。
22. 前記因子がヒドロキシウレア、チミジン、ミモシン、エトポシド、メチルメタンスルフェート、カプトテシン、ジデオキシシチジンおよびバルプロ酸からなる群より選択される、請求項２１に記載の方法。
23. 標的ＤＮＡ分子の複製速度を低下させる複数の因子をさらに含む、請求項２１に記載の方法。
24. 前記因子がヒドロキシウレア、チミジン、ミモシン、エトポシド、メチルメタンスルフェート、カプトテシン、ジデオキシシチジン、バルプロ酸およびそれらの組み合わせからなる群より選択される１つ以上の因子を含む、請求項２３に記載の方法。
25. 前記配列変更オリゴヌクレオチドが、前記標的ＤＮＡ分子に対して、前記特定の遺伝子座において非相補性であることによって、該標的ＤＮＡ分子の１つの鎖に対していくつかのヌクレオチド位置で相補性である、請求項２１に記載の方法。
26. 遺伝子編集または遺伝子修復を改善するように設計されたベクターを用いて細胞の集団を処置する工程をさらに包含する、請求項２１に記載の方法。
27. 前記細胞の集団においてＤＮＡ損傷を誘導する工程をさらに包含する、請求項２１に記載の方法。

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