JP2007530047A - 腫瘍内皮細胞の増殖を検出するための方法及びバイオマーカー - Google Patents
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Abstract
Description
本発明を実施するには、特記しない限り、当業界の範囲内である分子生物学(組換え技術を含む)、微生物学、細胞生物学及び生化学の従来技術を使用する。このような技術は、「Molecular Cloning:A Laboratory Manual」、2.sup.nd edition (Sambrook他、1989);「Oligonucleotide Synthesis」(M.J.Gait、ed.、1984);「Animal Cell Culture」(R.I.Freshney著、1987);「Methods in Enzymology」(Academic Press、Inc.);「Handbook of Experimental Immunology」、4.sup.th edition(D.M.Weir & C.C.Blackwell著、Blackwell Science Inc.、1987);「Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells」(J.M.Miller & M.P.Calos著、1987);「Current Protocols in Molecular Biology」(F.M.Ausubel他著、1987);及び「PCR:The Polymerase Chain Reaction」、(Mullis他著、1994)等の文献に十分に説明されている。
静止内皮細胞と比べて、増殖する内皮細胞で調節される遺伝子を同定するために、増殖因子とのインキュベーションによって初代培養微小血管内皮細胞が静止状態から増殖を始めたインビトロ血管形成モデルを使用した。初代ヒト皮膚微小血管内皮細胞(HDMVEC)、又は4回から7回継代したラット心臓微小血管内皮細胞(RHMVEC)を組織培養皿で単層で増殖させ、分裂促進剤を24時間欠乏させて、その後VEGF、bFGF又はENDOGROに曝露することによって増殖を誘導した。
結果:10%FBSを補給した増殖培地は内皮細胞を増殖させるために十分ではなかったが、10%FBS+その他の増殖因子は迅速な内皮細胞増殖を誘発した。
実施例1で同定された増殖因子誘導増殖特性がKDRキナーゼ阻害剤に敏感かどうかを決定するために、HDMVEC又はRHMVECを化合物B 100nMの存在下でVEGF又はbFGFで24時間刺激した。VEGFはfms様チロシンキナーゼ(FLT1)及びKDRに結合し活性化する(23、24)。FLT1及びKDRは両方とも化合物B(表1)によって阻害される。bFGFはFGFR1及びFGFR2に結合するが、FLT1及びKDRには結合しない。FGFR1及びFGFR2はいずれも化合物Bに比較的影響を受けない(表1参照)。
上記で示した実験データは、遺伝子発現プロフィール又は増殖する内皮細胞に特異的な発現特性の確認に役立つ。しかし、内皮細胞増殖中に調節される遺伝子の多くはまた、他の種類の増殖細胞においても発現する(たとえば、細胞周期及び代謝過程を調節する遺伝子)。腫瘍は、様々な細胞種の複雑な混合体で、2000個に約1個(0.05%)の細胞が増殖性内皮細胞である(Joanne Antanavage、Rosemary、McFall、及びKen Thomas、私信)。したがって、腫瘍内皮細胞増殖を特異的に測定する薬力学測定法を開発しようとする試みには、HDMVEC及びRHMVEC増殖特性の内皮細胞特異的部分を同定する必要があった。内皮細胞特異的遺伝子候補は、分裂促進剤に対するインビトロでの増殖反応中では発現が調節されるが、非内皮細胞では比較的低濃度で発現することが特徴の遺伝子として定義された。
同系のラット腫瘍モデル2種(すなわち、C6神経膠腫側腹部腫瘤モデル及びMatBIII乳癌転移モデル)を使用して、インビトロにおいて内皮細胞増殖中に制御される内皮細胞特異的と同定された遺伝子に対する小分子KDRキナーゼ阻害剤、化合物A及び化合物Bの効果を評価した。腫瘍の研究は、材料及び方法で前述したように実施した。該腫瘍モデルは、いずれもFischer344ラットから得られたC6神経膠腫及びMatBIII乳癌細胞株を使用した。これらの細胞株はそれぞれVEGFを分泌し、KDRキナーゼ阻害剤に敏感な、高度に血管化した腫瘍を形成する。
実施した3種類の動物実験それぞれにおいて、培養中に増殖するRHMVECに特異的であると同定した遺伝子の画分についてKDRキナーゼ阻害剤によって誘導された発現の変化を検出できることを所見した。図6は、本明細書で開示した様々な測定様式で同定された一連の遺伝子の間の重複程度をまとめたベン図である。より具体的に、図6AはC6側腹部腫瘍とMatBIII乳癌との間の、KDRキナーゼ阻害剤に対する腫瘍遺伝子発現応答の重複程度をまとめて示す。図6Bは、分裂促進剤によってインビトロで、及びKDRキナーゼ阻害剤によって腫瘍組織で調節されることが測定された一連の内皮細胞特異的遺伝子の重複の程度を示している。パネルBで示された遺伝子/配列は全て、分裂促進剤曝露後にインビトロで認められたものとは対照的な方法でKDRキナーゼ阻害剤によってインビボで調節されることが認められた。
腫瘍内皮細胞増殖の有望なバイオマーカーとして同定した7種類の遺伝子が腫瘍の脈管構造で特異的に発現し、その発現レベルは内皮細胞増殖速度を反映することを確認するために、いくつかの検証実験を実施した。まず、マイクロアレイハイブリダイゼーションの結果を確かめるために、定量的リアルタイムPCRによって動物腫瘍RNA試料における遺伝子発現レベルを独立して評価した。前述したマイクロアレイ実験で得られたバイオマーカーデータは、リアルタイム定量リアルタイムPCRによって検証された。
結果:調べた5種類の蛋白質(ANGPT2、CLU、CYR61、ENDRB及びPLAU)はそれぞれMatBIII腫瘍の腫瘍脈管構造に特異的に局在することを発見した(図8)。ラット乳癌でのバイオマーカー蛋白質発現は血管に局在していることを示した。Cyr61以外の遺伝子は全て、KDRキナーゼ阻害剤に対する曝露に応じて予測したとおりに発現レベルが変化した。
Claims (16)
- a)複数のアドレスを有する基盤を含み、各アドレスには内皮細胞増殖のバイオマーカーに特異的に結合できる捕捉プローブ又はオリゴヌクレオチドが配置されているアレイを提供することと、
b)内皮細胞集団から核酸試験試料を調製することと、
c)前記核酸試料を前記アレイと接触させることと、及び
d)前記試験試料中の前記核酸が、前記アレイ上に存在する前記複数のアドレスそれぞれに結合するのを検出することによって発現特性を測定し、それによって前記内皮細胞の増殖速度を測定することと、
を含む、内皮細胞集団の増殖状態を測定する方法。 - アレイが、表3又は表4に記載された遺伝子配列から選択される1個以上の遺伝子に特異的に結合するオリゴヌクレオチドを含む、請求項1に記載の方法。
- アレイが、表3から6で同定された遺伝子から選択されたその他のバイオマーカーと組み合わせて、Angpt−2、Clu(ApoJ)、Cyr61(CCN1)、Endrb(Etb)、Ifit−3(Garg49)、Fut−4、Plau(uPA)遺伝子と特異的に結合するオリゴヌクレオチドを含む、請求項2に記載の方法。
- 核酸試料が、腫瘍生検から得られた血管内皮細胞の集団から調製される、請求項1に記載の方法。
- 試料は、腫瘍脈管構造中の内皮細胞の増殖を阻害するように企図された治療薬による治療を受けた癌患者から調製される、請求項4に記載の方法。
- 患者が、KDRキナーゼ阻害剤で治療される、請求項5に記載の方法。
- 患者が、化合物Aで治療される、請求項6に記載の方法。
- 表4及び表5で同定されたバイオマーカーからなる群から選択される核酸配列を含むポリヌクレオチドを含有する細胞集団と化合物を、前記ポリヌクレオチドが発現される条件下で接触させることと、及び内皮細胞増殖特性の発現における変化を測定することを含み、発現の変化は抗血管形成活性の指標である、抗血管形成活性用の複数の治療薬のスクリーニング方法。
- 細胞集団が、腫瘍脈管構造中の内皮細胞の増殖を阻害するように企図された治療薬によって治療されている癌患者の腫瘍生検から単離される、請求項8に記載の方法。
- 治療薬が、受容体型キナーゼ阻害剤である、請求項10に記載の方法。
- 内皮細胞発現特性の変化が、内皮細胞増殖バイオマーカーに特異的に結合できるオリゴヌクレオチドを含むマイクロアレイに対するハイブリダイゼーション、又はRT−PCRによって測定される、請求項8に記載の方法。
- 内皮細胞増殖特性が、表5又は表6で同定された遺伝子から選択されるその他のバイオマーカーと組み合わせて、Angpt−2、Clu(ApoJ)、Cyr61(CCN1)、Endrb(Etb)、Ifit−3(Garg49)、Fut−4、Plau(uPA)遺伝子と特異的に結合する捕捉プローブ又はオリゴヌクレオチドを含む、請求項11に記載の方法。
- 複数のアドレスを有する基盤を含み、各アドレスには表3及び表4で定義された増殖特性を含む遺伝子からなる群から選択されるバイオマーカー遺伝子のポリヌクレオチド配列に特異的に結合できる捕捉プローブ又はオリゴヌクレオチドがその上に配置されているアレイ。
- 表3又は表4に記載された増殖特性を含むバイオマーカー遺伝子を含む組成物。
- 表5又は表6に記載された発現特性を含むバイオマーカー遺伝子を含む組成物。
- Angpt−2、Clu(ApoJ)、Cyr61(CCN1)、Endrb(Etb)、Ifit−3(Garg49)、Fut−4、Plau(uPA)遺伝子を含む内皮細胞増殖特性。
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