JP2007517185A - 電気化学発光電極 - Google Patents
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Abstract
ＥＣＬ分析に有用な双極電極、および、双極電極を用いるための方法が開示される。該方法は、双極電極に電気化学発光を接触させることであって、双極電極は、電気伝導性の第１のアーム、電気伝導性の第２のアーム、および、この２つのアームの間に配置される電気スイッチを有する、ことと、双極電極にて、検体内においての電気化学発光反応を起こすために十分な電界を印加することと、スイッチを閉じることと、検体からの電気化学発光を監視することとを包含する、方法である。方法は、スイッチを開けることと、以上のステップを繰り返すことをさらに包含し得る。
Description
（関連出願の参照）
本出願は、２００３年６月１３日に出願された米国仮出願特許出願番号６０／４７８，６８５の利益を主張し、その開示は援用される。
本出願は、２００３年６月１３日に出願された米国仮出願特許出願番号６０／４７８，６８５の利益を主張し、その開示は援用される。
（技術分野）
本発明は、一般的に分子の検出、およびより特定的に電気化学発光分子に関連する。
本発明は、一般的に分子の検出、およびより特定的に電気化学発光分子に関連する。
電気化学発光（ＥＣＬ）は、電極にて電位をかけられた核種が、電磁放射、通常は可視光線を放射する現象である。ＥＣＬを基にした多数の分析は、外部のサーキットに、電気的に接続されない電極である双極電極を使用する。この型の電極は、浮動電極としてもまた知られている。この型の装置において、外部電界は、双極電極を含む電解質に印加される。外部電界は、電解質周辺に関して、浮動電極上に、アノードおよびカソード領域を生成する。従って、双極電極とされる。特許出願 ＷＯ ９９／６３３４７、およびＷＯ ００／０３２３３は共に、双極電極を用いるＥＣＬ分析を開示し、その開示は援用される。
双極電極を用いるキャピラリー電気泳動（ＣＥ）のためのＥＣＬ検出概要は、Ａｒｏｒａ ｅｔ ａｌ．「Ａ Ｗｉｒｅｌｅｓｓ Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ Ａｐｐｌｉｅｄ ｔｏ Ｄｉｒｅｃｔ ａｎｄ Ｉｎｄｉｒｅｃｔ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｏｎ ａ Ｍｉｃｒｏｆａｂｒｉｃａｔｅｄ Ｇｌａｓｓ Ｄｅｖｉｃｅ」 Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２００１、７３、３２８２〜３２８８において、報告され、その開示は援用される。一実施例において、ＥＣＬ反応は、λｍａｘ＝６１０ｎｍを放出する、電気化学的に発生されるトリプロピルアミン（ＴＰＡ）から、トリス―（２，２’―ビピリジル）ルテニウム＋３（ＴＢＲ）への電子移動を伴う。Ａｒｏｒａ ｅｔ ａｌ．「Ｓｕｂｍｉｃｒｏｌｉｔｅｒ Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ−Ａ Ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ Ｓｍａｌｌ Ｖｏｌｕｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍｓ」Ａｎａｌ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９９７、３４，３９３〜３９５に報告されたように、小容量の電気化学電池である、有効容量１００ｎＬにおいての検出限度、５×１０−１３Ｍ（Ｓ／Ｎ＝３）は、３０，０００ＴＢＲ分子の検出に相当し、上記の出版物の開示は援用される。
ＣＥにおいての、ＥＣＬを基にした検出は、他の検出方法、例えば、蛍光検出の中でも、多数の優越な点を有する。第１に、その方法は、蛍光を基にするものではないので、レーザ励起源を必要としない。第２に、電極が、その電極自体に備える光学配置を提供するため、光学系は、より簡略であり、低価格である。第３に、ＥＣＬ検出は、蛍光基質の、または励起源のバックグランドをも使用しないため、より敏感である。最後に、電界が、双極電極にて局地的な電位を発生するため、ＥＣＬは、ＣＥを行うために使用される電界によって、自動的に始められる。
ＥＣＬ検出システムの一問題は、例えば水の電気分解が、双極電極周辺、および双極電極上に気泡を形成し、検体バンド（ｂａｎｄ）をゆがめたり、または、完全にＣＥチャネルを塞いだりもする。媒体が水の場合、気泡は水素、および／または、酸素である。他の媒体においては、当業者には知られるように、気泡は他の構成である。電極での気泡の形成は、ＣＥ検出器のような限られた容量においての、ＥＣＬ分析にとって、問題ではあるが、その問題は、双極電極を使用する、全てのＥＣＬ分析に存在する。第二の問題は、双極電極上、または、双極電極周辺に蓄積する電荷を帯びた核種、例えばＥＣＬの活発な核種が、バックグラウンド光シグナルを増加させ、それによって、システムの敏感さが縮小する。双極電極は、局所的に、電界を”ショート”し、それによって、双極電極の領域においての電荷を帯びた核種の移動が遅くなり、また、それによって、電荷を帯びた核種に、双極電極上、または、双極電極周辺に蓄積することを可能にしてしまう。
ＥＣＬ分析に有用な双極電極、および、双極電極を用いるための方法が開示される。一部の双極電極の実施形態は、気泡形成の、および／また、電極においての、電荷を帯びた核種の蓄積の問題を、克服する。一部の双極電極の実施形態は、ＥＣＬ検出器、例えば、キャピラリー電気泳動装置において、有利に使用されている。
ここにて、開示される一局面は、ＥＣＬ分析に有用に、双極電極を提供する。双極電極は、電気伝導性の第１のアーム、電気伝導性の第２アーム、およびそれらのアームの間に配置される電気スイッチを備える。一部の実施形態において、スイッチは、マイクロプロセッサ、または、マイクロコントローラによって、コントロールされる。一部の実施形態において、第１のアームと第２のアームとの間の距離は、少なくとも２０μｍである。
一部の実施形態において、第１のアーム、または、第２のアームのうち少なくとも１つが、プラチナを含む。他の実施形態において、第１のアーム、または第２のアームのうち少なくとも１つが、気泡形成を阻止する材料を備える。一部の実施形態において、材料の電位窓が少なくとも約１．５Ｖ、または約２Ｖである。そのような材料の実施例は、半導体の、または伝導性のダイヤモンド、例えば、ボロンドープダイヤモンドである。気泡形成を阻止する材料の他の実施例は、水素を吸収する材料、例えば、バラジウムである。他の実施例は、酸素を吸収する金属酸化物である。
一部の実施形態において、双極電極は、電気化学発光検出器においての構成部分であり、検出器は、光検出器をさらに備える。一部の実施形態において、電気化学発光検出器は、キャピラリー電気泳動装置において検出器である。一部の実施形態において、キャピラリー電気泳動装置は、マイクロプロセッサ、およびマイクロコントローラをさらに備え、マイクロプロセッサ、およびマイクロコントローラは、スイッチによってコントロールされる。
他の局面は、電気化学発光検体を検出するのに、双極電極を用いる方法である。方法は、少なくとも（ａ）双極電極は、電気伝導性の第１のアーム、電気伝導性の第２のアーム、および、それらのアームの間にに配置される電気スイッチを備え、双極電極に、電気化学発光検体を接触させるステップ、（ｂ）双極電極にて、検体内においての電気化学発光反応を起こすために、十分な電界を印加するステップ、（ｃ）スイッチを閉じるステップと、（ｄ）検体からの電気化学発光を監視するステップを包含する。方法の一部の実施形態は、ステップ（ｅ）スイッチを開けるステップと、（ｆ）ステップ（ａ）から（ｅ）を繰り返すステップを、さらに包含する。
一部の実施形態において、スイッチは、第１のアーム上、または、第２のアーム上のうち少なくとも１つにおいての気泡の形成を減少させる周期にて、閉じられ、および開かれる。一部の実施形態において、スイッチは、第１のアーム上、または第２のアーム上のうち少なくとも１つにおいて蓄積され、または、第１のアーム、または第２のアームのうち少なくとも１つの周辺に蓄積される電荷を帯びた核種を解放する周期にて、閉じられ、および開かれる。
一部の実施形態において、電気化学発光検体は、一部の実施形態において、電界を印加するためにも用いられるキャピラリー電気泳動装置を用いて、双極電極に接触する。一部の実施形態において、キャピラリー電気泳動装置は、電気化学発光のための監視用のために、光検出器をさらに備える。一部の実施形態において、スイッチは、マイクロプロセッサ、またはマイクロコントローラによってコントロールされる。
一部の実施形態において、電気化学発光検体は、トリス―（２，２’―ビピリジル）ルテニウム＋３を含む。一部の実施形態において、ＥＣＬ反応は、トリプロピルアミンラジカルに、トリス―（２，２’―ビピリジル）ルテニウム＋３を接触させることを、さらに包含する。
一部の実施形態において、第１のアームと第２のアームとの間の距離は、少なくとも２０μｍである。一部の実施形態において、第１のアーム、または、第２のアームのうち少なくとも１つが、プラチナを含む。他の実施形態において、第１のアーム、または第２のアームのうち少なくとも１つが、気泡形成を阻止する材料を備える。一部の実施形態において、材料の電位窓が、少なくとも約１．５Ｖ、または約２Ｖである。そのような材料の実施例は、半導体の、または伝導性のダイヤモンド、例えば、ボロンドープダイヤモンドである。気泡形成を阻止する材料の他の実施例は、水素を吸収する材料、例えば、パラジウムである。他の実施例は、酸素を吸収する金属酸化物である。
他の局面は、第１の電気伝導アーム、第２の電気伝導アームを有する双極電極であり、第１のアーム、または第２のアームのうち少なくとも１つが、気泡形成を阻止する材料を独立して備える。
そのような材料の実施例は、ボロンドープダイヤモンドである。他の実施例は、水素を吸収する材料、例えば、パラジウムである。他の実施例は、酸素を吸収する金属酸化物である。一部の実施形態において、第１のアームと第２のアームとの間の距離は、少なくとも２０μｍである。
一部の実施形態において、双極電極は、電気化学発光検出器においての構成部分であり、検出器は、光検出器をさらに備える。一部の実施形態において、電気化学発光検出器は、キャピラリー電気泳動装置において検出器である。
他の局面は、少なくとも（ａ）双極電極に、電気化学発光検体を接触させ、双極電極が、電気伝導性の第１のアーム、電気伝導性の第２のアームを備え、前記第１のアーム、または、前記第２のアームのうち少なくとも１つが、気泡形成を阻止する材料を独立して備えるステップ、（ｂ）該双極電極にて、該検体内においての電気化学発光反応を起こすために、十分な電界を印加するステップと、（ｃ）該検体からの、電気化学発光を監視するステップを包含する、電気化学発光検体を検出するための方法を提供する。
一部の実施形態において、方法は、ステップ（ａ）から（ｃ）を繰り返すことを、さらに包含する。材料の電位窓が、少なくとも約１．５Ｖ、または約２Ｖである。そのような材料の実施例は、半導体の、または、伝導性のダイヤモンド、例えば、ボロンドープダイヤモンドである。気泡形成を阻止する材料の他の実施例は、水素を吸収する材料、例えば、バラジウムである。他の実施例は、酸素を吸収する金属酸化物である。一部の実施形態において、第１のアームと第２のアームとの間の距離は、少なくとも２０μｍである。
一部の実施形態において、電気化学発光検体は、キャピラリー電気泳動装置を用いて双極電極に接触する。一部の実施形態において、キャピラリー電気泳動装置は、電界を印加するために用いられる。一部の実施形態において、キャピラリー電気泳動装置は、電気化学発光のための監視用のために、光検出器をさらに包含する。
一部の実施形態において、電気化学発光検体は、トリス―（２，２’―ビピリジル）ルテニウム＋３を含む。一部の実施形態において、ＥＣＬ反応は、トリプロピルアミンラジカルに、トリス―（２，２’―ビピリジル）ルテニウム＋３を接触させることを、さらに包含する。
以下に、ＥＣＬ分析に関して改善された双極電極が提供される。本双極電極は、一部の実施形態において、双極電極あるいは浮遊電極上およびその周辺に堆積した気泡および／または荷電核種の問題を克服する。また、一部の実施形態において、電気スイッチはアノード領域とカソード領域との間または双極電極のアーム間に配置される。また、一部の実施形態において、双極電極の少なくとも一部は気泡の形成を抑制する材料から製造されている。一部の実施形態は、アノード領域およびカソード領域のうち少なくとも一方が気泡の形成を抑制する材料から製造され、アノード領域とカソード領域との間に配置されたスイッチを有する、双極電極を含む。これらの特徴はＣＥシステム用のＥＣＬ検出器という意味で記載されているが、開示の双極電極は、双極電極を用いた任意のＥＣＬ分析において有用である。
要約すれば、キャピラリー電気泳動またはＣＥは、化合物の分離および／または識別方法である。ＣＥ装置は、アノードと、カソードと、両極間に配置されたキャピラリーとを備える。一般的に、キャピラリーの各端部は、流動的に容器と連結しており、この容器の中にアノードおよびカソードが浸っている。たとえば水性の媒体などの適当な電解質または基質がキャピラリー内に与えられる。アノードとカソードとの間に電位を加えることによって、キャピラリーの一方の端から他方の端へ電解質が流出し始める。このことは電気浸透流出（ＥＯＦ）として知られている。非修飾シリカのキャピラリーを用いたＣＥ装置において、ＥＯＦはアノードからカソードへ起こる。ＥＯＦの方向は、たとえば修飾シリカのキャピラリー等、他のタイプのキャピラリーを用いたＣＥ装置内ではカソードからアノードへ向かう。検体がキャピラリーの一方の端から他方の端へ移動するレートは、寸法、荷電、電解質の組成、キャピラリーの長さや種類、任意の混合物、ＥＯＦ、加えられる電位等、当技術において既知の要因に依存する。一部の実施形態において、検体はＥＯＦと同一方向に移動する。その他の実施形態において、検体はＥＯＦに逆行する。異なる化合物が異なるレートで移動するため、ＣＥは化合物を分離および／または識別するために用いられる。検出器は一般的にキャピラリーの端部か、その近傍におかれ、そこから単数または複数の関連する化合物が流出する。適当なＣＥ装置の一例が米国特許第５，５７８，１７９号において開示されており、その開示を援用する。
図１は、双極のＥＣＬ電極１０２を備えるＥＣＬ検出器１００の一実施形態を示す。図示した実施形態において、ＥＣＬ検出器１００はＣＥ装置用の検出器であるが、検出器１００が以下により詳細に説明するその他の応用方法において有用であることは、当業者であれば理解できよう。ＥＣＬ電極１０２は、第１のアーム１０４と、第２のアーム１０６と、両アーム間に配置されるスイッチ１０８とを備える。スイッチ１０８は、アーム１０４とアーム１０６とを電気接続する。このため、スイッチ１０８は必ずしも物理的にアーム１０４およびアーム１０６に接近しているわけではない。スイッチ１０８は、たとえば、機械的スイッチおよび／または電気機械的スイッチおよび／または固体の物理的特性を有するスイッチを含む、当技術において既知である任意の適当なスイッチである。一部の実施形態において、スイッチ１０８はコンピュータまたはマイクロプロセッサ１１０の制御下にある。アーム１０４およびアーム１０６は導電性であり、プラチナ、パラジウム、金、弁金属、ダイヤモンド、炭素、黒鉛、カーボンナノチューブ、導電性セラミック、およびそれらの組み合わせを含む任意の材料から製造されている。アーム１０４およびアーム１０６に適当なその他の材料は、気泡の形成を抑制する材料であり、これについては以下により詳細に論じる。一部の実施形態において、アーム１０４およびアーム１０６のそれぞれは異なる材料から製造されている。
アーム１０４およびアーム１０６は、寸法、チャネル１１２の形状、アーム１０４およびアーム１０６の製造に用いられた方法、アーム１０４およびアーム１０６を製造した材料等を含む要因に依存する任意の適切な形状を有する。図示した実施形態においては、第１のアーム１０４および第２のアーム１０６は、チャネル１１２へ突出しているように図示されている。第１のアーム１０４および第２のアーム１０６が、たとえばチャネル１１２の内側の面に接触している等、他の形状を有する実施形態も存在するということは当業者であれば理解できよう。そのため、「アーム」という用語は、任意の特定の形状を定義するように意図されないものとする。したがって、本明細書中では、アノード極のアーム１１４も、双極電極１０２のアノード領域を指し、カソード極のアーム１１６も、双極電極１０２のカソード領域を指す。
アーム１０４およびアーム１０６は、チャネル１１２内に配置される。一部の実施形態において、アーム１０４およびアーム１０６のうちの一方または両方が、チャネル１１２内部に、たとえば電気化学的に堆積される。その他の実施形態においては、アーム１０４およびアーム１０６のうちの一方または両方が、蒸着またはプラズマ堆積によってチャネル１１２内に堆積される。また、一部の実施形態において、アーム１０４およびアーム１０６のうちの一方または両方がチャネル１１２の外部に製造され、次いで、たとえば接着材の使用またはスクリュー、スロット、移動止め、スエージング、張力、および同様のもの等の物理的手段によってチャネル１１２内に固定される。装置１００は、アノード１１４と、カソード１１６とをさらに備え、両者は検出器１００またはＣＥ装置の一部である。
使用に際して、チャネル１１２には電解質が充填される（図示せず）。一部の実施形態において、検出器はポストキャピラリー（ｐｏｓｔ−ｃａｐｉｌｌａｒｙ）である。このような構成の利点は、キャピラリーが検出器から独立していることであり、このことによって器械内のキャピラリーの交換が簡単になる。一部の実施形態において、検出器はプレキャピラリー（ｐｒｅ−ｃａｐｉｌｌａｒｙ）である。このプレキャピラリーによって、たとえば注入の発生を検出することができる。また、一部の実施形態において、検出器はオンキャピラリー（ｏｎ−ｃａｐｉｌｌａｒｙ）にあり、一般的には、関連する検体がキャピラリーを出る端部か、端部近傍にある。電気泳動状態下において、電界はＣＥのアノード１１４およびカソード１１６によって電解質へ与えられる。その他の実施形態において、検出器１００は、以下により詳細に論じるように、特にＣＥのない応用方法において用いられる場合に、アノード１１４およびカソード１１６を備える。電解質の電位は、チャネル１１２内の位置に伴って変動する。電極のアーム１０４周辺の電解質の電位はＶ１であり、アーム１０６周辺の電位はＶ２である。スイッチ１０８が閉状態にあるとき、電極１０２は局所的に電界をショートさせ、平均電位を１／２（Ｖ１＋Ｖ２）と仮定する。したがって、電極のアーム１０４は周辺の電解質に対してポジティブ（アノード）であり、アノードアームともいわれる。同様に、アーム１０６はネガティブ（カソード）であり、カソードアームともいわれる。図示した実施形態において、この局所的な電位差はＥＣＬ反応を生じる。
図１に示す実施形態において、たとえば、ＴＢＲラベル化ＤＮＡ等のＥＣＬ活性検体１２０は、カソード１１６からアノード１１４へ向かってチャネル１１２内を移動している。検体１２０がアノードアーム１０４を通過すると、ＥＣＬ反応によって光１２２のパルスが生じる。ＴＰＡが過剰に、または継続的に補給される場合、光１２２は、たとえば写真フィルム、光電セル、光電子増倍管、または電荷結合素子（ＣＣＤ）等、当技術において既知である任意の光検出器１２６を用いて検出される。
上述したように、浮遊電極１０２のアーム１０４とアーム１０６との間の距離および電圧の勾配が、電極のアノードアーム１０４とカソードアーム１０６とにおける電位を決定する。キャピラリー電気泳動は、一般的に、内側の直径が約１０μｍから約１００μｍ（約２５μｍから約７５μｍのものが代表的である）、長さが約１０ｃｍから約１００ｃｍ（約５０ｃｍから約７５ｃｍのものが代表的である）のキャピラリーを用いて行われるが、その他の直径および長さのキャピラリーが当技術において既知であり、開示の装置および方法はこれらのキャピラリーについて同様に適用される。分離電圧は、一般的に約５ｋＶから約３０ｋＶである。キャピラリーやＥＣＬ検出器を含め、アノードとカソードとの間において電位は直線的に降下するため、ＥＣＬ信号を観測するのに必要な浮遊電極のアーム間の最短距離は、電気化学発光核種の酸化還元電位と、キャピラリーの長さと、電圧とに伴って変動する。たとえば、ＴＰＡおよびＴＢＲの酸化電位はどちらも約１．１Ｖであり、水の酸化電位は約１．２Ｖである。２０ｋＶで長さ５０ｃｍのキャピラリーに対し（４００Ｖ／ｃｍ）ＴＰＡ／ＴＢＲのアーム間の最短距離は、約５５μｍであろう［（１．１Ｖ×２）／４００Ｖ／ｃｍ］。約６０μｍの場合、水の酸化が観察され、アノードアーム１０４にＯ２を生じ、かつ／またはカソードアーム１０６にＨ２を生じる。キャピラリーの長さ、分離電圧、およびＥＣＬの化学的性質のさらに広範囲にわたって、より長い浮遊電極を用いることができる。一部の実施形態において、双極電極のアーム間の距離は、少なくとも約１０μｍ、少なくとも約２０μｍ、少なくとも約３０μｍ、少なくとも約４０μｍ、少なくとも約５０μｍ、少なくとも約６０μｍ、少なくとも約７０μｍ、少なくとも約８０μｍ、少なくとも約９０μｍ、少なくとも約１００μｍ、少なくとも約１５０μｍ、少なくとも約２００μｍ、少なくとも約２５０μｍ、少なくとも約３００μｍ、少なくとも約４００μｍ、少なくとも約５００μｍ、または少なくとも約１ｍｍである。
チャネル１１２内の、アーム１０４およびアーム１０６を含む双極電極１０２の部分は、チャネル１１２に適応し、またチャネル１１２内で電解質および検体が流れるような寸法になっている。ＣＥの応用方法において、検出器１００内のチャネル１１２の幅は、一般的にキャピラリーの内径と同等であり、上記のように数十ミクロン程度である。ＬＣの応用方法において、チャネル１１２の幅は一般的に数ミリメートル程度である。アーム１０４およびアーム１０６の長さは、チャネル１１２内に適当な流動を与え、かつ十分なＥＣＬ信号を与えるように選択される。ＥＣＬ信号の強度は、光検出器１２６がモニターするアームの領域に伴って増大する。アーム１０４および／またはアーム１０６の領域は長さ、幅、高さに依存し、また、これらの要因は所望のＥＣＬ信号出力を与えるために容易に変動されるということは当業者であれば理解できよう。したがって、光検出器１２６の性能および感度は、アーム１０４および／またはアーム１０６の寸法を決定するのに利用される要因である。一部の実施形態において、アーム１０４およびアーム１０６のそれぞれの長さおよび幅は独立しており、約１０μｍから約１００μｍである。さらに、一部の実施形態において、アーム１０４およびアーム１０６のうち一方または両方、または双極電極１０２の別の部分は、光検出器１２６を用いた双極電極１０２の光の照準を容易にするような特徴を含むか、または、たとえば半球レンズまたは十字型等の、光検出器１２６を用いた双極電極１０２の光の照準を容易にするような形状を有している。
開示の装置および方法は、当技術において既知である任意のＥＣＬ反応物またはシステムに対して有用であり、本明細書中で例示したＴＰＡシステム／ＴＢＲシステムは単なる例示であるということは、当業者であれば理解できよう。また、ルテニウムビピリジルシステムが、当技術において既知であるその他の遷移金属の核種のように電気化学発光反応物として有用であることは、当業者ならば理解できよう。ＥＣＬシステムの例は、ルミノールシステムおよびアクリダンエステル（ａｃｒｉｄａｎ ｅｓｔｅｒ）システムを含む。その他の適当なＥＣＬシステムは、２００３年１１月１４日出願の、米国特許出願第１０／７１３，４７９号に開示されている。一部の実施形態において、ＥＣＬ反応が、個々のシステムに依存して、アノードアーム、カソードアーム、またはその両方において生じるということは、当業者であれば理解できよう。したがって、双極電極の個々のアーム上に対する荷電核種の気泡の形成および／または蓄積の重大さは、ＥＣＬの起こっているアームに一部依存する。たとえば、関連するＥＣＬ反応の起こっているアームにおいて気泡が発生すると、他方のアームにおいて気泡が発生するよりも反応の検出が妨害されやすい。同様に、荷電したＥＣＬ活性核種が、関連するＥＣＬ反応の起こっているアーム上またはその周辺に堆積すると、所望でない不要な信号が生成されやすい。
一部の実施形態において、関連する核種すなわち検体が電気化学発光性であることは、当業者であれば理解できよう。その他の実施形態において、ＥＣＬのラベルまたはタグは、たとえば生体分子、ＤＮＡ片、ポリペプチド等の関連する核種に取り付けられている。一部の実施形態において、ＥＣＬラベルは関連する核種に共有結合するように取り付けられている。また一部の実施形態において、ＥＣＬラベルは関連する核種に共有結合しないように取り付けられている。たとえば、一部の実施形態において、ＴＢＲは二本鎖ＤＮＡを挿入している。したがって、本明細書中では、関連する核種に共有結合するように取り付けられていても共有結合しないように取り付けられていても、同じ用語を用いてラベルを指す。たとえば、本明細書中で使用する「ＴＢＲ」および「トリス−（２，２’−ビピリジル）ルテニウム＋３」は、共有結合修飾された、化合物の変形物と、もとの化合物との両方を指す。
双極電極１０２は、双極電極を用いたＥＣＬ検出器の任意の型について有用である。一部の実施形態において、ＥＣＬ検出器はＣＥ装置内で用いられる。ＥＣＬ検出器は、たとえば、キャピラリーゾーン電気泳動（ＣＺＥ）、キャピラリーゲル電気泳動、キャピラリー等電点電気泳動（ｃＩＥＦ）、ミセル動電クロマトグラフィ（ＭＥＫＣ）、等速電気泳動、またはキャピラリー電気クロマトグラフィ（ＣＥＣ）等の任意のタイプのＣＥ装置において有用である。一部の実施形態において、双極電極１０２は、たとえば、選択されたカラムを介し、化合物の溶液に関連する化合物を分離させるために機械ポンプを用いて化合物を分離および／または識別する装置等、別のタイプの装置用のＥＣＬ検出器において用いられる。このような装置の例は、液体クロマトグラフィ（ＬＣ）、高速（圧力）液体クロマトグラフィ（高圧液体クロマトグラフィ）（ＨＰＬＣ）、中圧液体クロマトグラフィ（ＭＰＬＣ）、高速（プロテイン）液体クロマトグラフィー（高速タンパク質液体クロマトグラフィ）（ＦＰＬＣ）等を含む。上述したように、一部の実施形態において、検出器はポストカラム（ｐｏｓｔ−ｃｏｌｕｍｎ）、プレカラム（ｐｒｅ−ｃｏｌｕｍｎ）、またはオンカラム（ｏｎ−ｃｏｌｕｍｎ）である。
また、電気化学発光分子または検体を検出する方法が提供され、その実施形態２００は図２に示されている。以下の説明は、図１に示した装置を参照にする。ステップ２０２において、電気化学発光分子１２０は双極電極１０２と接触する。ステップ２０４において、双極電極１０２における電気化学発光反応を開始するのに十分な電界が印加される。ステップ２０６において、スイッチ１０８は閉じられ、それによってアーム１０４およびアーム１０６と電気接続する。ステップ２０８において、システムは電気化学発光を監視される。ステップ２１０において、スイッチ１０８は開かれる。ステップ２１４において、ステップ２０２からステップ２１０は選択的に繰り返される。
一部の実施形態において、ステップ２０２において、検体１２０はＣＥを用いた電極１０２に接触する。双極電極がＣＥ検出器内で用いられる実施形態において、ステップ２０４の電界は、実質的にはアノード１１４およびカソード１１６を用いた全体の検出プロセス中で印加される。スイッチ１０８を開けると、アーム１０４およびアーム１０６は非電気接続である。したがって、アーム１０４およびアーム１０６のそれぞれの電位は電解質周辺の電位と同等であり、電極１０２において電気化学反応は起こらない。スイッチ１０８が閉じると、双極電極１０２は上記のように働く。ＥＣＬ測定は、スイッチ１０８が閉じているときに得られる。実際には、スイッチ１０８によって、ユーザは双極電極１０２をスイッチオンおよびスイッチオフできる。双極電極１０２をスイッチオンおよびスイッチオフすることによって、ユーザは、第１に、双極電極の断続的な動作サイクルを制御でき、それによって電極１０２上の気泡１２４の形成を最小限にすることができる。第２に、電極１０２周辺に電界がゼロの領域から、任意の荷電核種を放出することができ、それによって不要な光信号を低減することができる。上述したように、スイッチ１０８が閉じているとき、双極電極１０２周辺の電界は減少し、それによって荷電核種の移動は遅くなり、また、それによって双極電極１０２上または双極電極１０２周辺にその荷電核種が蓄積する。スイッチ１０８が開いているときアーム１０４およびアーム１０６における電位は局所的な電位と等しいため、荷電核種はアーム１０４およびアーム１０６から放出される。
スイッチ１０８の開閉周期は、分析状況および／または双極電極１０２上もしくは双極電極１０２周辺の不要な荷電核種の蓄積の下での、双極電極１０２における気泡の形成の傾向に依存する。これらの要因自体は、検体の集中、ＥＣＬ反応の効率、双極電極１０２の実質電位、双極電極１０２の組成等、当技術において既知の変数に依存する。一部の実施形態において、スイッチングの周期を決定するのに用いられる要因は、たとえば光検出器の集積時間等、ＥＣＬ信号を得るのに費やされた時間である。一部の実施形態において、スイッチ１０８はデータ取得の間、閉じられており（オン）、そうでないときは開いている（オフ）。詳細な時間は光検出器の特性に依存するということは、当業者であれば理解できよう。一部の実施形態において、スイッチは約１００ｍｓから約１ｓの間閉じられている。一部の実施形態において、スイッチは約１０ｍｓから約１００ｍｓの間開かれている。一部の実施形態において、スイッチ１０８は、コンピュータ、マイクロプロセッサ、またはマイクロコントローラ１１０によって制御される。これらは、たとえばＣＥ電極１１４と電極１１６との間の電位、光検出システム１２６、データ取得システム、サンプル操作および／またはトラッキング等、ＣＥシステムにおけるその他の変数を制御するためにも用いられる。
その他の実施形態において、双極電極を製造する材料は、電極上の気泡の蓄積という問題を克服するように、２つのメカニズムのいずれか一方またはそれらの組み合わせによって選択される。図３は、ＥＣＬ検出器１００’の一実施形態を示す。図１中の構成要素と同様のものは、同様の参照番号で示してある。ＥＣＬ検出器１００’は、気泡の形成を抑制する材料で適切に形成されたＵ字型の双極電極１０２’を備える。その他の形状が双極電極１０２’に有用であるということは、当業者であれば理解できよう。一部の実施形態において、アーム１０４’およびアーム１０６’のそれぞれは異なる材料から製造されている。双極電極１０２’の寸法および応用方法は、双極電極１０２について上述したものと同様である。
ある種の電極材料は、分析の媒体内で大きな電位窓を有する。本明細書中で使用されるように、特定の媒体内の電極の「電位窓」とは、所望の電気化学反応を妨害する媒体の電気化学反応が起こらないような電位の範囲である。異なる化合物が異なる電位でＥＣＬを受けるため、より大きな電位窓を有する電極によって、広範囲のＥＣＬ活性化合物を使用することができる。特定の電極材料用の電位窓は媒体にも所望の電気化学反応の特性にも依存するということは、当業者であれば理解できよう。水性の媒体内で、大きな電位窓とは、少なくとも約１．５Ｖまたは少なくとも約２Ｖである。たとえば、水性の媒体内では、電極１０２’のＥＣＬ化合物用の酸化電位は、理論上は水の酸化電位よりも小さい。したがって、双極電極１０２’において、感知できるほどの水の電気分解は起こらないため、気泡１２４の形成は低減する。そのような、水性の媒体用の電極材料の一例は、導電性のダイヤモンドまたは半導体の性質を有するダイヤモンドである。導電性のダイヤモンドまたは半導体の性質を有するダイヤモンドから製造した電極を、本明細書中ではダイヤモンド電極と呼ぶ。ボロンドープダイヤモンドは、導電性のダイヤモンド材料の一例である。ボロンドープダイヤモンド電極の製造は、たとえば米国特許第６，２６７，８６６号、第５，９００，１２７号、第５，７７６，３２３号、および第５，３９９，２４７号に記載されており、それらの開示を援用する。ダイヤモンド電極およびプラチナ電極の電位窓の比較を、以下、実施例１に示す。ダイヤモンド電極のさらなる利点は、ＥＣＬ反応用に対する光の生成が効率的であり、それによってより高感度のシステムを提供するということである。
第２の種類の電極材料は、酸素および／または水素および／または媒体の電気分解によって生じたその他の気体を物理吸着または化学吸着する。物理吸着すなわち物理的な吸着は、たとえばファンデルワールス力等の、化合物と基質との間の引力が分子間にある、化合物の基質に対する吸着である。化学吸着すなわち化学的な吸着は、化合物と基質との間の引力が化学的である、すなわちヴァランス電子を含んでいる、化合物の基質に対する吸収である。水素を例に用いると、電極で生成された水素ガスを物理吸着または化学吸着する材料から製造された電極において、水素は電極自体の上および／または中へ吸着されるため、電極の表面に気泡を形成しない。
約５０の金属元素が、著しい量の水素を吸着すると知られている。２００１年８月２４日に出願の、米国特許出願第０９／９３８，９４７号に記載されるように、そのような材料の一例はパラジウムであり、その開示を援用する。他の例として銅とニッケルが含まれる。カーボンナノチューブも、水素を化学吸着すると知られている。多くの材料は、水素化物（たとえばＭｇＨ２、ＭＧ２ＮｉＨ４、ＦｅＴｉＨ２、ＬａＮｉ５Ｈ６）として水素を吸着すると知られている。一般的な使用において、ＡＢ５（たとえばＬａＮｉ５）、ＡＢ（たとえばＦｅＴｉ）、Ａ２Ｂ（たとえばＭｇ２Ｎｉ）、およびＡＢ２（たとえばＺｒＶ２）という４つの異なる形式の水素吸蔵合金が生じる。
たとえば一部のセラミック材料等の一部の金属酸化物は、電極として有用であり、また、酸素を吸着する。例として、二元酸化物、ペロブスカイト、およびスピネルが含まれる。適切な化合物は化学量論的または非化学量論的である。その他の適切な電極材料は、たとえば水酸化ニッケル（ＩＩ）等の含水の金属酸化物すなわち水酸化物である。酸素に可逆的に反応する電極材料の一例は鉛である。
一部の実施形態において、双極電極のカソードアームおよびアノードアームは異なる材料から製造されている。たとえば、カソードアームは水素吸着材料から製造され、アノードアームは酸素吸着材料から製造される。
図４は、図３に示す装置を参照した、ＥＣＬに関する方法４００のフローチャートである。ステップ４０２において、電気化学発光分子１２０は双極電極１０２’と接触する。ステップ４０４において、双極電極１０２’で電気化学発光反応を始めるのに十分な電界が印加される。ステップ４０６において、システムは電気化学発光１２２を監視される。ステップ４０８において、ステップ４０２からステップ４０６は選択的に繰り返される。
（実施例１）
１×Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ緩衝液（１×ＧＡ緩衝液、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）におけるプラチナ（固体）の電極およびダイヤモンド（粉砕済み）の電極のサイクリックボルタモグラム（ＣＶ）を図５に示す。電位を０Ｖから２．４Ｖまで変動させると共に、プラチナ電極の電流は、それぞれ約０．２５×１０−４Ａから約−４×１０−４Ａへ変動する。ダイヤモンド電極については、電流は、同等の電位窓に対しては約０Ａから約−２×１０−４Ａまで流れ、ダイヤモンド電極に対しより大きな電位窓を示す。電位窓がより大きいということは、ダイヤモンド電極がこの媒体内でプラチナ電極よりも多数のＥＣＬ活性検体と融和性であるということを示す。
１×Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ緩衝液（１×ＧＡ緩衝液、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）におけるプラチナ（固体）の電極およびダイヤモンド（粉砕済み）の電極のサイクリックボルタモグラム（ＣＶ）を図５に示す。電位を０Ｖから２．４Ｖまで変動させると共に、プラチナ電極の電流は、それぞれ約０．２５×１０−４Ａから約−４×１０−４Ａへ変動する。ダイヤモンド電極については、電流は、同等の電位窓に対しては約０Ａから約−２×１０−４Ａまで流れ、ダイヤモンド電極に対しより大きな電位窓を示す。電位窓がより大きいということは、ダイヤモンド電極がこの媒体内でプラチナ電極よりも多数のＥＣＬ活性検体と融和性であるということを示す。
（実施例２）
図６は、バックグランド電流（１×ＧＡ緩衝液）をダイヤモンド電極を用いて低減した後の１×ＧＡ緩衝液における１００μＭ ＴＢＲおよび１００ｍＭ ＴＰＡのサイクリックボルタモグラムであり、ダイヤモンド電極を用いると可能である大きな電位窓を示している。この例において、ダイヤモンド電極の可能な電位窓は約２Ｖまで拡大する。図５に示すダイヤモンド電極のＣＶと比較した場合のＣＶのさらなる特徴は、ＴＢＲおよびＴＰＡの電気化学反応を示す。
図６は、バックグランド電流（１×ＧＡ緩衝液）をダイヤモンド電極を用いて低減した後の１×ＧＡ緩衝液における１００μＭ ＴＢＲおよび１００ｍＭ ＴＰＡのサイクリックボルタモグラムであり、ダイヤモンド電極を用いると可能である大きな電位窓を示している。この例において、ダイヤモンド電極の可能な電位窓は約２Ｖまで拡大する。図５に示すダイヤモンド電極のＣＶと比較した場合のＣＶのさらなる特徴は、ＴＢＲおよびＴＰＡの電気化学反応を示す。
（実施例３）
双極電極用のスイッチは改善された電極材料と独立して使用され得るが、以下の実験で示すとおり、２つの技術を同時に使用することによって改善された結果が与えられるということが発見された。
双極電極用のスイッチは改善された電極材料と独立して使用され得るが、以下の実験で示すとおり、２つの技術を同時に使用することによって改善された結果が与えられるということが発見された。
図７Ａおよび図７Ｂは、それぞれダイヤモンドとプラチナ電極におけるＥＣＬを比較する実験結果である。双方の電極材料についての実験条件は以下のとおりであった：０．１μＭ ＴＢＲ、１００ｍＭ ＴＰＡを１×ＧＡ緩衝液内に与え、１００ｍｓ集積した。スイッチおよび光検出器を、データ取得制御カードとソフトウェア（ＬａｂＶＩＥＷ（登録商標）、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）とを具備するパーソナルコンピュータを用いて制御した。この例において、スイッチの周期は、閉状態が１００ｍｓ、開状態が１０ｍｓであった。データは、スイッチが閉じている間に取得した。プラチナ電極の実験（−１．８Ｖ）においてよりも、ダイヤモンド電極の実験（−２．５Ｖ）においてより大きな電位が与えられ、より大きな電位窓を示した。ダイヤモンド電極の光子数は、各酸化還元反応周期について、プラチナ電極よりも少なくとも２０倍大きく、より再生可能であった。
以上に図示説明した実施形態は、例として与えられたものにすぎず、様々な変更および修正が本明細書中に示したことの精神および範囲から逸脱することなく当業者によってなされ得る。
Claims (53)
- 電気化学発光検体を検出するための方法であって、該方法は、
（ａ）双極電極に電気化学発光を接触させることであって、該双極電極は、電気伝導性の第１のアーム、電気伝導性の第２のアーム、および、この２つのアームの間に配置される電気スイッチを有する、ことと、
（ｂ）該双極電極にて該検体内においての電気化学発光反応を起こすために、十分な電界を印加することと、
（ｃ）該スイッチを閉じることと、
（ｄ）該検体からの電気化学発光を監視することと
を包含する、方法。 - （ｅ）前記スイッチを開けることと、
（ｆ）ステップ（ａ）からステップ（ｅ）を繰り返すことと
をさらに包含する、請求項１に記載の方法。 - 前記スイッチは、前記第１のアーム上、または前記第２のアーム上のうち少なくとも１つにおいて、気泡の形成を減少させる周期にて閉じられおよび開かれる、請求項２に記載の方法。
- 前記スイッチは、前記第１のアーム上、または前記第２のアーム上のうち少なくとも１つに蓄積される、または、前記第１のアーム、または前記第２のアームのうち少なくとも１つの周辺に蓄積される、電荷を帯びた核種を解放する周期にて、閉じられおよび開かれる、請求項２に記載の方法。
- 前記電気化学発光検体は、キャピラリー電気泳動装置を用いて、前記双極電極に接触させられる、請求項１に記載の方法。
- 前記電界が、前記キャピラリー電気泳動装置を用いて印加される、請求項５に記載の方法。
- 前記キャピラリー電気泳動装置が、電気化学発光のための監視用のために、光検出器をさらに備える、請求項５に記載の方法。
- 前記電気化学発光検体が、トリス―（２，２’―ビピリジル）ルテニウム＋３を備える、請求項１に記載の方法。
- トリプロピルアミンラジカルに、前記トリス―（２，２’―ビピリジル）ルテニウム＋３を接触させることを、さらに包含する、請求項８に記載の方法。
- 前記スイッチは、マイクロプロセッサまたはマイクロコントローラによって、コントロールされる、請求項１に記載の方法。
- 前記第１のアームと前記第２のアームとの間の距離は、少なくとも２０μｍである、請求項１に記載の方法。
- 前記第１のアーム、または、前記第２のアームのうち少なくとも１つが、プラチナから成る、請求項１に記載の方法。
- 前記第１のアーム、または、前記第２のアームのうち少なくとも１つが、気泡形成を阻止する材料を備える、請求項１に記載の方法。
- 水性の媒体において、前記材料の電位窓が、少なくとも約１．５Ｖである、請求項１３に記載の方法。
- 前記材料が、ボロンドープダイヤモンドである、請求項１４に記載の方法。
- 前記材料が、水素を吸収する、請求項１３に記載の方法。
- 前記材料が、パラジウムである、請求項１６に記載の方法。
- 前記材料が、酸素を吸収する金属酸化物である、請求項１３に記載の方法。
- 第１の電気伝導アーム、第２の電気伝導アーム、および、この２つのアームの間に配置される電気スイッチを備える、双極電極。
- 前記スイッチが、マイクロプロセッサ、またはマイクロコントローラによってコントロールされる、請求項１９に記載の双極電極。
- 前記第１のアームと前記第２のアームとの間の距離は、少なくとも、２０μｍである、請求項１９に記載の双極電極。
- 前記第１のアーム、または、前記第２のアームのうち少なくとも１つは、プラチナを備える、請求項１９に記載の双極電極。
- 前記第１のアーム、または、前記第２のアームのうち少なくとも１つは、気泡形成を阻止する材料を独立して備える、請求項１９に記載の双極電極。
- 水性の媒体において、前記材料の電位窓が、少なくとも約１．５Ｖである、請求項２３に記載の双極電極。
- 前記材料が、ボロンドープダイヤモンドである、請求項２４に記載の双極電極。
- 前記材料が、水素を吸収する、請求項２３に記載の双極電極。
- 前記材料が、パラジウムである、請求項２６に記載の双極電極。
- 前記材料が、酸素を吸収する金属酸化物である、請求項２３に記載の双極電極。
- 前記双極電極は、電気化学発光検出器においての構成部分であり、該検出器は、光検出器をさらに備える、請求項１９に記載の双極電極。
- 前記電気化学発光検出器が、キャピラリー電気泳動装置における検出器である、請求項２９に記載の双極電極。
- 前記キャピラリー電気泳動装置は、マイクロプロセッサ、または、マイクロコントローラを、さらに備え、該マイクロプロセッサ、または、該マイクロコントローラは、前記スイッチをコントロールする、請求項３０に記載の双極電極。
- 電気化学発光検体を検出するための方法であって、該方法は、
（ａ）双極電極に電気化学発光検体を接触さることであって、該双極電極が、電気伝導性の第１のアーム、電気伝導性の第２のアームを備え、該第１のアーム、または、該第２のアームのうち少なくとも１つが、気泡形成を阻止する材料を独立に備える、ことと、
（ｂ）該双極電極にて該検体内においての電気化学発光反応を起こすために、十分な電界を印加することと、
（ｃ）該検体からの電気化学発光を監視することと
を包含する、方法。 - ステップ（a）からステップ（ｃ）を繰り返すことを、さらに包含する請求項３２に記載する方法。
- 前記電気化学発光検体は、キャピラリー電気泳動装置を用いて、前記双極電極に接触させられる、請求項３２に記載する方法。
- 前記電界が、前記キャピラリー電気泳動装置を用いて印加される、請求項３４に記載する方法。
- 前記キャピラリー電気泳動装置が、電気化学発光を監視するための光検出器をさらに備える、請求項３４に記載の方法。
- 前記電気化学発光が、トリス―（２，２’―ビピリジル）ルテニウム＋３を含む、請求項３２に記載の方法。
- トリプロピルアミンラジカルに、トリス―（２，２’―ビピリジル）ルテニウム＋３を接触させることを、さらに備える、請求項３７に記載の方法。
- 前記第１のアームと前記第２のアームとの間の距離は、少なくとも２０μｍである、請求項３２に記載の方法。
- 水性の媒体において、前記材料の電位窓が、少なくとも約１．５Ｖである、請求項３０に記載の方法。
- 前記材料が、ボロンドープダイヤモンドである、請求項３２に記載の方法。
- 前記材料が、水素を吸収する、請求項３２に記載の方法。
- 前記材料が、パラジウムである、請求項４２に記載の方法。
- 前記材料が、酸素を吸収する金属酸化物である、請求項３２に記載の方法。
- 第１の電気伝導アーム、第２の電気伝導アームを備える双極電極であって、該第１のアーム、または、該第２のアームのうち少なくとも１つが、気泡形成を阻止する材料を備える、双極電極。
- 前記第１のアームと前記第２のアームとの間の距離は、少なくとも２０μｍである、請求項４５に記載の双極電極。
- 水性の媒体において、前記材料の電位窓が、少なくとも約１．５Ｖである、請求項４５に記載の双極電極。
- 前記材料が、ボロンドープダイヤモンドである、請求項４７に記載の双極電極方法。
- 前記材料が、水素を吸収する、請求項４５に記載の双極電極。
- 前記材料が、パラジウムである、請求項５０に記載の双極電極。
- 前記材料が、酸素を吸収する金属酸化物である、請求項４５に記載の双極電極。
- 前記双極電極は、電気化学発光検出器においての構成部分であり、該検出器は、光検出器をさらに備える、請求項４５に記載の双極電極。
- 前記電気化学発光検出器が、キャピラリー電気泳動装置において、検出器である、請求項５２に記載の双極電極。
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