JP2007514411A - 骨形成タンパクのcd4+エピトープ - Google Patents
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Abstract
【選択図】図1
Description
BMP-1を例外として、BMPタンパクは、形質転換成長因子β(「TGF-β」)スーパーファミリータンパクの一種である。異なる形態形成タンパクの中には、同様のタンパク質をもつ数種を含め、かなりの種の保存が存在する。BMPファミリーは、下記のタンパク質を含む一連のタンパク質を含む。BMP-1( シグナル配列をコードする22アミノ酸を含む730アミノ酸)は、いくつかのプロコラーゲンを成熟コラーゲン繊維を形成する断片に開裂する、システインに富む亜鉛ぺプチダーゼである。それは、プロコラーゲンC-プロテイナーゼ、すなわち細胞外基質(ECM)形成に関与するメタロプロテイナーゼと同一である。BMP-2A(「BMP-2α」および「BMP-2 アルファ」としても知られる)は、BMP-2に改名された。この因子の114アミノ酸は、ヒト、マウス、およびラットのタンパク質において同一であることが示された。更に、このタンパク質はショウジョウバエdpp(すなわち、胚発生に関与する遺伝子座である「デカペンタプレジック(decapentaplegic)」と68%の相同性を示す。BMP-2B(BMP-2β) は、116アミノ酸を含む因子であり、「BMP-4」と改名された。マウスおよびラットのBMP-4タンパクは、それらのアミノ酸配列において同一である。BMP-3 (110アミノ酸) は、「オステオゲニン(osteogenin)」と同一の糖タンパクである。成熟したヒトおよびラットのBMP-3タンパクは、98%同一である。また、アフリカツメガエル(Xenopus laevis)には、密接に関連した因子がある。BMP-3β(110アミノ酸)は、BMP-3と関連しており、82% の同一性を共有している。ヒトおよびマウスのタンパク質は97%の同一性を示し(3つの異なるアミノ酸)、他方、ヒトおよびラットのタンパク質配列は2つのアミノ酸だけが異なる。更に、その因子はGDF-10 (すなわち、「成長/分化因子‐10」)と同一である。前記に示したように、BMP-4は、BMP-2βと同一である。加えて、それはDVR-4(すなわち「デカペンタプレジック‐Vg関連‐4(decapentaplegic-Vg-related-4)」)と同一である。また、そのタンパク質は、ショウジョウバエdppと72%の相同性を示す。加えて、BMP-4は、ノギン(noggin)およびコルディン(chordin)との結合を示している。BMP-5は、138のアミノ酸からなるタンパク質である。ヒトおよびマウスのBMP-5タンパクは96%同一である。BMP-6(139アミノ酸)は、DVR-6および生長特異関連‐1(vegetal-specific-related-1「Vg-1」)タンパクと同一である。BMP-7(139アミノ酸)は、OP-1(「骨形成タンパク-1(osteogenic protein-1)」)と同一である。マウスおよびヒトのBMP-7は98%同一である。BMP-5、BMP-6およびBMP-7の成熟形態は75%の同一性を共有することが示されている。BMP-8aとも言われるBMP-8(139アミノ酸)は、「OP-2」と同一である。BMP-8b(139アミノ酸)は「OP-3」と同一であり、また「OP-2」と言われることもあり、ネズミだけに確認されてきた。BMP-9(110アミノ酸)もまた、「GDF-5」(すなわち成長/分化因子‐5)と言われる。BMP-9は、肝臓網内系において、オートクリンおよびパラクリンメディエーターであり得る。BMP-10(108アミノ酸)は、様々な生物源から分離され、ウシおよびヒトのタンパク質が同一である。マウスBMP-10の発現は心臓の発達と関連し、また胎児心の横線(trabeculation)に関係する場合がある。BMP-11(109アミノ酸)もまた配列が同一であるヒトおよび牛を含む様々な生物源から分離される。このタンパク質はまた「GDF-11」と言われる。GMP-12(104アミノ酸)もまた「GDF-7」および「GDMP-3」(すなわち軟骨由来の形態形成タンパク‐3(cartilage-derived morphogenetic protein-3))と言われる。BMP-13(120アミノ酸)もまた「GDF-6」および「CDMP-2」として知られる。BMP-14(120アミノ酸)もまた「GDF-5」および「CDMP-1」と言われる。BMP-15(125アミノ酸)は、どちらもX染色体についての遺伝子マッピングを含めてマウスおよびヒトにおいて同定されている。マウスタンパク質はGDF-9に最も密接に関連していると思われ、卵母細胞において特に発現される。またこれらのBMPの何種類かはヘテロ二量体形成に存在することも知られている。例えば、OP-1はBMP-2αと結合する。
BMPは、骨形成の開始に先立って、軟骨および骨芽細胞に間葉型細胞の分化を誘導する。それらは異所性配置のみならず骨折部位付近の軟骨および骨形成細胞の分化を促進する。いくつかのBMPは、骨芽細胞におけるアルカリフォスファターゼおよびコラーゲンの合成を誘発し、一方、他のBMPは直接に骨芽細胞に作用して、それらの成熟を促進し、筋原性(myogenous)分化を抑制する。その他のBMPは、典型的な繊維芽細胞の軟骨細胞への転換を促進し、またそれらは非骨形成細胞タイプにおいて骨芽細胞フェノタイプの発現を誘導することも可能である。
BMPの臨床使用は今なお初期段階であるが、多くの研究と関心がこれらのタンパク質の適切な使用の間質に向けられている。例えば、比較的純でないBMPの調製液は骨折の治療に使われてきた。更に、骨由来の間質において骨分化を開始するために、オステオゲニンを含む因子の組合せが要求され得る。例えば、不溶性コラーゲン骨間質と組合わせたオステオゲニンは、成長霊長類の頭蓋冠異常において局部軟骨内の骨分化を誘発するために使用されている。その他の設定において、追加の成分は重要と思われる。例えば、多孔質β‐リン酸三カルシウムと結合したBMP調製液の骨誘導能力および骨移植術材料としてのトゥルーボーン(true bone)セラミックと結合したBMPの使用は、骨組織異常の治療および新骨形成の促進についてBMPのみの単独治療よりも優れていることが認められた。
本発明は骨形成タンパク(BMPs)におけるCD4+T細胞エピトープを提供する。特定の態様において、本発明はBMP-7およびBMP-14のCD4+T細胞エピトープを提供する。いくつかの好ましい態様において、本発明はBMP-7およびBMP-14タンパクの免疫原性(例えば、野生型)を低減するための修飾に適切なBMP-7およびBMP-14のCD4+T細胞エピトープを提供する。
本発明の追加的な態様において、その方法は更に、親(すなわち由来する又は源の)タンパク質に比べて変化した免疫原性反応を示す変異体タンパクを製造するためにタンパク質を修飾する工程を含む。しかしながら、そのことは本発明が任意の特定の置換の組み合わせまたはタンパク質のアミノ酸配列の他の変換に限定されることを意図するものではない。
図1は、BMP-7(パネルA)およびBMP-14(パネルB)由来のペプチドを用いてテストされた83の無作為の個体からなる母集団からの応答のパーセントを示す2つのグラフを提供する。また、バックグラウンドおよび構造値も示される。3つのアミノ酸によって分けられる連続15-merペプチドはX軸に記載され(「ペプチド数」によって示した)、および各ペプチドに反応したドナーのパーセンテージが、Y軸に表示される。
本発明は、骨形成タンパク(BMPs)におけるCD4+T細胞エピトープを提供する。特別な態様において、本発明はBMP-7およびBMP-14のCD4+T細胞エピトープを提供する。いくつかの好ましい態様において、本発明は、(例えば、未処理)BMP-7およびBMP-14タンパクの免疫原性を低減するための修飾に適したBMP-7およびBMP-14のCD4+T細胞エピトープを提供する。
本発明に別個の定義がない限り、本発明で使用される全ての技術的および科学的用語は、本発明に関連する分野における当業者によって一般的に理解されているものと同じ意味内容を有する。例えば、シングレトンおよびセインスべリー著(Singleton and Sainsbury)『微生物学および分子生物学辞典』第2版、J.ワイリー父子(John Wiley and Sons)編、ニューヨーク(1994年)、そしてヘイルおよびマーハム著(Hale and Marham)『ハーパーコリンズ生物学辞典』ハーパー・ペレニアル、ニューヨーク(1991年)は、本発明において使用される多くの用語の一般辞書を当業者に提供する。本発明の実施においては、本発明に記述されるものと類似の、または等価な任意の方法および材料が用いられるが、好ましい方法および材料は本発明に記述される。従って、以下に定義される用語は全体として本明細書を参照することによって、より完全に記述される。また、本発明で使用されるように、単数形の「a」、「an」および「the」は文中に別個の明確な記載がない限り複数への言及を含む。発明の理解を容易にするために多くの用語は以下に定義される。
本発明で使用されるように「骨形成タンパク」および「BMP」は、軽質転換成長因子ベータ(「TGF-β」)スーパーファミリータンパク質(BMP-1を例外として)の中にあるタンパク質ファミリーのことを言うために使用される。
本発明で使用されるように「ベースラインT細胞増殖」は、ペプチドまたはタンパク抗原の非存在下において、抗原提示細胞に晒した反応において個体内に通常見られるT細胞増殖の程度のことを言う。本発明の目的において、ベースラインT細胞増殖レベルは、抗原非存在下における抗原提示細胞への反応におけるT細胞増殖の際の各個体に関するサンプルベースごとに決定される。
本発明で使用されるように「顕著な領域」は、バックグラウンド反応率の約2倍より大きな、特定の一組のペプチドを用いて得られるI-MUNE(商標)アッセイ反応のことを言う。本発明の一つの態様において、タンパク質のすべての顕著な領域は、本発明のI-MUNE(商標)アッセ系におけるそれらの反応が低減されるように縮小される。追加的な態様において、顕著な領域の数は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10またはそれ以上縮小され、好ましくは関連するタンパク質において1から5の間の顕著な領域が縮小される。いくつかの態様において、顕著な領域はまたT細胞エピトープの要求を満たす。
本発明で使用されるように「タンパク質」は、任意のアミノ酸からなる組成物および当業者によってタンパク質として認識されているもののことを言う。「タンパク質」、「ペプチド」の用語およびポリペプチドは、本発明において互換的に使用される。アミノ酸は、それらの完全な名前(例えば、アラニン)によって、または認められた1文字(例えば、A)または3文字(例えば、ala)の略記によって言及することができる。ペプチドがタンパク質の一部である場合については、当業者は文脈においてこれら用語の使用を理解する。「タンパク質」の用語は、関連するタンパク質のプレ(pre-)およびプレプロ(prepro-)形態だけでなくタンパク質の成熟形態も含む。タンパク質のプレプロ形態は、タンパク質のアミノ末端に操作可能に結合した「プロ」を有するタンパク質の成熟形態、およびプロ配列のアミノ末端に操作可能に結合した「プレ」または「シグナル」配列を含む。
Doolittle, J.Mol.Evol.,35:351-360〔1987年〕)の簡略化を利用する。この方法はヒギンスおよびシャープ(Higgins and Sharp, CABIOS 5:151-153〔1989年〕)によって記述された方法と類似している。有用なPILEEUPパラメータは、3.00のデフォルトギャップ重み(default gap weight)、0.10のデフォルトギャップ長重み(default gap length weight)および重み末端ギャップ(weighted end gaps)を含む。有用なアルゴリズムの他の具体例は、Altschul他(Altschul他、J.Mol.Biol.,215:403-410、〔1990年〕;およびカーリン他、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-5787〔1993年〕)によって記述されたBLASTアルゴリズムである。ある特別に有用なBLASTプログラムは、WU- BLAST-2プログラムである(Altschul他、Meth.Enzumol、266:460-480〔1996年〕を参照)。パラメータ「W」、「T」および「X」は、アラインメントの感度と速度を決定する。BLASTプログラムは、デフォルトとして11の語長(W)、BLOSUM62スコアマトリクス(ヘニコフおよびヘニコフ((Henikoff and Henikoff))、Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:10915〔1989年〕参照)、50のアラインメント(B)、10の期待値、M’5、N’-4、および両方の鎖(strands)の比較を使用する。
「核酸分子のコードする」、「DNA配列のコードする」、および「DNAのコードする」の用語は、デオキシリボ核酸鎖に沿ったデオキシリボヌクレオチドの順番または配列のことを言う。これらのデオキシリボヌクレオチドの順番はポリペプチド(タンパク質)鎖に沿ったアミノ酸の順番を決定する。従ってDNA配列は、アミノ酸配列をコードする。
本発明は、骨形成タンパク(BMPs)におけるCD4+T細胞エピトープを提供する。特定の態様において、本発明は、BMP-7およびBMP-14のCD4+T細胞エピトープを提供する。いくつかの好ましい態様において、本発明はBMP-7およびBMP-14タンパクの免疫原性(例えば、未処理)を低減する修飾に適切なBMP-7およびBMP-14のCD4+T細胞エピトープを提供する。
タンパク質よりも低い免疫原性のタンパクとしてランクされる。更なる態様において、第一タンパクに対する陽性反応は、約2.7および約3.2の間の刺激指数値を含む。更に他の態様において、追加タンパクに対する陽性反応は、約2.7および約3.2の間の刺激指数値を含む。更なる態様において、第一タンパクに対する陽性反応は約2.7および約3.2の間の刺激指数値を含み、追加タンパクに対する陽性反応は約2.7および約3.2の間の刺激指数値を含む。いくつかの態様において、工程(d)におけるT細胞の増殖は約2.95以上の刺激指数を生じ、他方、追加的態様において、工程(e)におけるT細胞の増殖は約2.95以上の刺激指数を生じる。より更なる態様において、工程(d)におけるT細胞の増殖は約2.95以上の刺激指数を生じ、工程(e)におけるT細胞の増殖は約2.95以上の刺激指数を生じる。いくつかの特に好ましい態様において、1以上の追加的ヒト血液源が工程(b)で使用される。追加的な特に好ましい態様において、ヒト血液源およびタンパク質のそれぞれについて得られる構造値が比較される。本発明はまた、バックグラウンド反応パーセントおよび構造値の両方に基づいてタンパク質を分類する手段を提供する。従って、いくつかの更なる態様において、分析されたタンパク質はバックグラウンド反応パーセントおよび構造値に従って分類および/またはランク付けされる。
以下の実施例は、本発明のある好ましい態様および局面を明示およびさらに説明するために提供されるものであり、その範囲を限定するものとして解釈されるものではない。
BMPエピトープの調製
ヒトBMP-7(GenBank Accession No.P18075)およびBMP-14(GenBank Accession No.P43026)前駆タンパクの完全な長さのアミノ酸配列は、15-merのペプチドセットに使用された。これらの前駆ペプチドは、当業者に周知のマルチピンシステム(マエジ他.、J.Immunol. Meth.,134:23-33〔1990年〕参照)を使用したミノトープスによって合成された。15merのペプチドは、12アミノ酸を共有した隣接するペプチドを有す配列に作られた(すなわち、各ペプチドは、3つのアミノ酸によって分けられた)。ペプチドは、濃度およそ2 mg/mlのストックを提供するためにDMSOを用いて希釈された。各分析法において使用されるペプチドの最終濃度は、5μ/mlであった。
ペプチドの同定のためのアッセイ系において使用される細胞の調製−BMP-7およびBMP-14におけるT細胞エピトープ
新鮮なヒト抹消血球は、83グループのドナーから集められた。実施例3で記述されるように、これらの細胞は、BMP-7およびBMP-14における抗原性エピトープを測定するために試験された。
を使用して分離された。細胞は、Abbot Cell-Dyn 3700システムを使用して計算された。これらの方法を用いて得られた純度は、通常90%以上であることが分かった。
T細胞増殖アッセイ
この実施は、本発明において使用されるアッセイ系について記述する。このアッセイ系は、I-MUNE(商標)アッセイ反応とも言われる。96-well、丸底のプレートにおいて、自己樹状細胞およびCD4+T細胞は、試験ペプチドと混合された。より具体的には、AIM Vにおける100μ/well、2×104の樹状細胞は個体のペプチドと混合された(最終的なペプチド濃度は5μg/mlおよび最終的なDMSO濃度は0.25%)。37℃、5%の二酸化炭素での一時間の培養の後、2×104のCD4+T細胞が、総量200μlの培養液に加えられた。陰性対照ウエルは、樹状細胞、CD4+T細胞および0.25%のDNSOを含んでいた。陽性対照ウエルは、樹状細胞、CD4+T細胞(試験ウエルとおなじ濃度)および0.4μg/mlの破傷風トキソイド(List)を有す0.25%のDMSOを含んでいた。個体のペプチドは各ドナーに関して二度づつ試験された。
データ分析
各個体の軟膜資料に関して、全ペプチドの平均CPM数値が分析された。「刺激指数」(SI)を測定するために、各ペプチドの平均CPMを、対照(DMSOのみ)ウェルの平均CPM数値で除した。ドナーは、各ペプチドセットを用いて、1ペプチドにつき2以上の反応の平均が集められるまで試験された。各タンパク質についてのデータは、セット内の各ペプチドへの応答者率を示すためグラフにされた。SI値が2.95以上であった場合、陽性反応が照合された。この数値は、標準の母集団分布における3つの標準偏差の差異に近似するために選択された。各タンパク質の評価のために、個々のドナーによる個々のペプチドへの陽性反応が集められた。
刺激指数
以上の分析に加えて、平均刺激指数またはBMP-7、BMP-14が測定された。全部で83のドナーについての刺激指数が平均化された。図3にQCデータについて、および図4に非QCデータについて、結果が示された。前記に詳述したペプチド反応は、全ドナーについてのより強い増殖反応によって支持される。BMP-7ペプチドセットにおけるペプチドエピトープへの増殖反応の大きさは、BMP-14における反応よりも高いことが判明した。これらのペプチドセットが、83のドナーにおいてパラメトリックに試験されたので、この結果は、BMP-7はBMP-14よりも総合的により免疫原性が強いという構造値測定を支持する。
HLA結合
上記分析に加えて、BMP-7およびBMP-14エピトープペプチドを有すHLA関連が測定された。これらの実験において、5つのエピトープペプチド(#3、#7、#8、#16、#31)の増殖反応データが、83のドナーについて、DRB1でのHLA ClassIIの発現に関して試験され、およびDQB1も試験された。4つのペプチドに関して、二つの方法(すなわち、上述したように“QC”および“non-QC”、〔“nQC”〕)によって、反応が評価された。両方の方法によって見出された統計的に有意な関連は、以下の通りであった。エピトープ#3およびDR11について、相対リスク(RR)は、6.25;p<0.0005〔QC〕、RR=4.17 p<0.005〔nQC〕であった。エピトープ#3およびDQ2について、RRは、0.17p<0.04〔QC〕、RR=0.13 p<0.01〔nQC〕であった。エピトープ#3およびDQ9について、RRは、6.67;p<0.003〔QC〕、RR=4.85 p<0.013〔nQC〕であった。エピトープ#8およびDR11について、RRは、6.6;p<0.0003。エピトープ#31およびDR7について、RRは、8.32;p<0.001〔QC〕、RR=4.44 p<0.002〔nQC〕であった。
Claims (16)
- タンパク質のT細胞エピトープを決定する方法であって、ここで前記タンパク質は骨形成タンパク(BMP)であり、以下の
(a)単一のヒト血液源からの樹状細胞の溶液および未処理CD4+および/またはCD8+T細胞の溶液を得る工程、
(b)分化した樹状細胞の溶液を作るために、前記樹状細胞の溶液において前記樹状細胞を分化する工程、
(c)前記タンパク質からペプチドのペプセットを調製する工程、
(d)前記分化した樹状細胞の溶液および前記未処理CD4+および/またはCD8+T細胞エピトープを前記ペプセットと混合する工程であり、ここで前記ペプセットは前記T細胞エピトープを含む工程、および
(e)前記工程(d)における前記T細胞の増殖を測走する工程、
を含むことを特徴とする方法。 - 前記タンパク質がBMP-7およびBMP-14からなる群から選択されることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記ペプセットが、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、および配列番号5からなる群より選択される配列を有するペプチドを含むことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記ペプセットが、配列番号6、配列番号7、および配列番号8からなる群より選択される配列を有するペプチドを含むことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 変異体タンパクを生成するために、前記タンパク質を修飾する工程を更に含み、ここで前記タンパク質と比較して前記変異体タンパクは、変化した免疫原性反応を示すことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、および配列番号8からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むペプチド。
- タンパク質の免疫原性を低減する方法であって、ここで前記タンパク質は骨形成タンパクであり、以下の
(a)以下の段階によって、前記タンパク質において1つ以上のT細胞エピトープを同定する工程であり、
(i)in vitroで1つ以上のサイトカインに晒すことによって分化された接着単球由来樹状細胞を、前記T細胞エピトープを含む1つ以上のペプチドと接触させる段階、および
(ii)前記樹状細胞および前記ペプチドを未処理T細胞と接触させる段階、
ここで、前記未処理T細胞は前記接着単球由来樹状細胞と同一の源から得られるため前記T細胞は前記ペプチドに反応して増殖する工程、および
(b)前記変異体タンパクが、より低いまたは実質的に等しい前記未処理T細胞の基本増殖を誘導するように変異体タンパクを作るため、前記T細胞エピトープを中和するために前記タンパク質を修飾する工程
を含むことを特徴とする方法。 - 前記T細胞エピトープのアミノ酸配列の部分を、前記タンパク質のホモログの類似配列で置換することによって、前記T細胞エピトープが修飾されることを特徴とする請求項7に記載の方法。
- 前記T細胞エピトープのアミノ酸配列を、前記T細胞エピトープの主要三次構造特性を実質的に模倣した配列で置換することによって、前記T細胞エピトープが修飾されることを特徴とする請求項7に記載の方法。
- 前記タンパク質がBMP-7およびBMP-14からなる群から選択されることを特徴とする請求項7に記載の方法。
- 前記エピトープ領域が、アミノ酸配列を含み、前記アミノ酸配列が配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、および配列番号8からなる群から選択されることを特徴とする請求項7に記載の方法。
- 低減されたアレルギー誘発性を有する変異体タンパクを生成する方法であって、
以下の
(a)天然発生タンパク質を得て、ここで前記天然発生タンパク質が骨形成タンパクであり、前記天然発生タンパク質の断片を調製する工程、
(b)前記天然発生タンパク質の前記断片を、未処理ヒトCD4+またはCD8+T細胞および分化した樹状細胞を含む第一溶液と接触させる工程、
(c)前記天然発生タンパク質のエピトープ領域を同定し、ここで前記同定が前記未処理ヒトCD4+またはCD8+T 細胞の増殖を刺激するため前記天然発生タンパク質のエピトープ領域の前記断片の能力を測走することを含む工程、および
(d)前記変異体タンパクを生成するために、工程c)において同定された前記エピトープ領域における1つ以上のアミノ酸を修飾する工程、
を含むことを特徴とする方法。 - 前記未処理ヒトCD4+またはCD8+T 細胞の増殖を刺激するための前記天然発生タンパク質の前記断片の能力を、前記未処理ヒトCD4+またはCD8+T 細胞の増殖を刺激するための前記変異体タンパクの前記断片の能力と比較する工程を更に含むことを特徴とする請求項12に記載の方法。
- 前記タンパク質が骨形成タンパクであることを特徴とする請求項14に記載の方法。
- 前記骨形成タンパクがBMP-7およびBMP-14からなる群から選択されることを特徴とする請求項14に記載の方法。
- 前記エピトープ領域が、アミノ酸配列を含み、ここで前記アミノ酸配列が配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、および配列番号8からなる群から選択されることを特徴とする請求項12に記載の方法。
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