JP2007510436A - 油性酵母中において多価不飽和脂肪酸レベルを変更するのに適したδ１２デサチュラーゼ - Google Patents

油性酵母中において多価不飽和脂肪酸レベルを変更するのに適したδ１２デサチュラーゼ Download PDF

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Abstract

本発明は、オレイン酸からリノール酸（ＬＡ、１８：２）への転換を触媒できる真菌Δ１２脂肪酸デサチュラーゼに関する。デサチュラーゼをコードする核酸配列、それにハイブリダイズする核酸配列、デサチュラーゼ遺伝子を含んでなるＤＮＡコンストラクト、および増大したレベルのデサチュラーゼを発現する組換え宿主微生物について記載されている。Δ１２脂肪酸デサチュラーゼの過剰発現によって特定のω−３およびω−６脂肪酸の生成を増大させる方法についてもまた、本明細書で記載されている。

Description

関連出願の相互参照
本願は２００３年１１月１２日に出願された米国仮特許出願第６０／５１９１９１号明細書、および２００４年５月１３日に出願された米国仮特許出願第６０／５７０,６７９号明細書の優先権の利益を主張する。
本発明はバイオテクノロジー分野に関する。より具体的には本発明は、油性酵母などの油性微生物中において多価不飽和脂肪酸の生成を中断または中断または向上させるのに有用な、Δ１２脂肪酸デサチュラーゼ酵素をコードする核酸断片の同定に関する。
特定の多価不飽和脂肪酸、すなわちＰＵＦＡが健康な細胞の重要な生物学的構成要素であることが、長期にわたり認識されている。例えばこのようなＰＵＦＡは、
哺乳類において新規に（ｄｅ ｎｏｖｏ）合成できず、食餌中で得られなくてはならない、またはリノール酸（ＬＡ）またはα−リノレン酸（ＡＬＡ）のさらなる不飽和化と延長によって誘導されなくてはならない「必須」脂肪酸、
リン脂質またはトリグリセリドなどの形態で見いだされてもよい細胞原形質膜の構成物、
特に成長中の幼児の脳において適切な発達、そして組織形成および修復に必要である、
プロスタサイクリン、エイコサノイド、ロイコトリエン、およびプロスタグランジンをはじめとする、哺乳類において重要ないくつかの生物学的に活性なエイコサノイドの前駆物質
として認識されている。
１９７０年代に、グリーンランドのエスキモーの観察から、心疾患の低発生率と長鎖ω−３ＰＵＦＡの高摂取量とが結びつけられた（非特許文献１）（非特許文献２）。より最近の研究はω−３ＰＵＦＡの心臓血管保護効果を確証した（非特許文献３）（非特許文献４）。さらに血管形成術後の再狭窄率、炎症および関節リウマチ、喘息、乾癬および湿疹の症状などのいくつかの障害はω−３脂肪酸による処置に反応することが見いだされている。γ−リノレン酸（ＧＬＡ、ω−６ＰＵＦＡ）はストレスに関係した血圧上昇を低下させ、算術試験能力を改善することが示されている。ＧＬＡおよびジホモ−γ−リノレン酸（ＤＧＬＡ、もう１つのω−６ＰＵＦＡ）は、血小板凝集を阻害し、血管拡張を引き起こし、コレステロールレベルを低下させ、血管壁平滑筋および繊維組織の増殖を阻害することが示されている（非特許文献５）。ＧＬＡまたはＤＧＬＡの単独でのまたはエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ、ω−３ＰＵＦＡ）との組み合わせでの投与は、非ステロイド性抗炎症薬によって引き起こされる消化管出血およびその他の副作用を低下させ、または防止することが示されている（特許文献１）。さらにＧＬＡおよびＤＧＬＡは、子宮内膜症および月経前症候群を防止または治療し（特許文献２）、筋痛性脳脊髄炎およびウィルス感染後の慢性疲労（特許文献３）を治療することが示されている。その他の証拠は、ＰＵＦＡがカルシウム代謝調節に関与するかもしれないことを示唆し、骨粗鬆症および腎臓または尿道結石の治療または防止においてそれらが有用であるかもしれないことを示唆する。最後にＰＵＦＡは癌および糖尿病の治療において使用できる（特許文献４）（非特許文献６）。
ＰＵＦＡは、必須脂肪酸であるＬＡおよびＡＬＡそれぞれの不飽和化および延長によって誘導される、２つの主要なクラス（ω−６およびω−３脂肪酸からなる）に概して分けられる。天然供給源からの多様なＰＵＦＡの商業的供給源［例えばサクラソウ、ルリヂサ、およびクロフサスグリの種子や糸状菌（モルティエレラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）、チノリモ属（Ｐｏｒｐｈｙｒｉｄｉｕｍ）（紅藻）、魚油および海洋性プランクトン（キクロテラ（Ｃｙｃｌｏｔｅｌｌａ）、ニッチア（Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ）、クリプテコジニウム（Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ））］にもかかわらず、これらの生成方法と結びついたいくつかの不都合がある。第１に魚および植物などの天然供給源は、高度に不均一な油組成物を有しがちである。したがってこれらの供給源から得られた油は、所望のＰＵＦＡの１つもしくはそれ以上を分離または濃縮するために大規模な精製を必要とすることがある。天然供給源はまた、制御できない供給のばらつきを被りやすい（例えば魚資源の場合、天候、疾患、または乱獲に起因する）。ＰＵＦＡを生成する作物は、食物生成のために開発されたハイブリッド作物と、経済的競争力がないことが多い。またＰＵＦＡを自然に生成するいくつかの生物体（例えばポルフィリディウム（Ｐｏｒｐｈｙｒｉｄｉｕｍ）、モルティエレラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ））の大規模発酵は、商業的規模で培養するのが高価、および／または困難なことがある。
上述の限界の結果として、次に向けた大規模な研究が行われている。１．）商業的に容易に生成できるＰＵＦＡの組換え供給源の開発、および２．）所望のＰＵＦＡ生成を可能にする脂肪酸生合成経路の修正。例えば過去数年間にわたり、様々な生物体からの脂肪酸デサチュラーゼおよびエロンガーゼ遺伝子の単離、クローニング、および操作において進歩があった。これらの遺伝子配列の知識は、ＰＵＦＡを自然に生成しない新しい宿主生物体中で、所望の脂肪酸、および／または脂肪酸組成物を生成する見込みを提供する。文献は、サッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）における以下のようないくつかの例を報告する。
（非特許文献７）では、海洋珪藻フェオダクチルム・トリコルヌーツム（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ）からの２個のデサチュラーゼがＳ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中にクローンされ、ＥＰＡの生成をもたらす。
（非特許文献８）では、シノラブディス・エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）からの遺伝子を使用して、ω−３およびω−６ＰＵＦＡ生合成経路がＳ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中に再構成される。
（非特許文献９）では、植物脂肪酸デサチュラーゼ（ＦＡＤ２およびＦＡＤ３）がＳ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中に発現し、ＡＬＡの生成をもたらす。
アボット・ラボラトリーズ（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）のナットゾン（Ｋｎｕｔｚｏｎ）らに付与された（特許文献５）では西洋油菜（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）からの１個のデサチュラーゼおよび真菌モルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ）からの２個のデサチュラーゼが、Ｓ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中にクローンされ、ＬＡ、ＧＬＡ、ＡＬＡ、およびＳＴＡの生成をもたらす。
しかしこれらのタイプの遺伝子を発現させて、商業的量の１つもしくはそれ以上のＰＵＦＡの経済的生成を提供できる適切な微生物のシステムに対する必要性がなおもある。さらに特定のＰＵＦＡ、特にＥＰＡおよびＤＨＡが濃縮されている油に対する必要性が存在する。
ＰＵＦＡの生成プラットフォームとしてこれまで調査されていない微生物の１つのクラスは、油性酵母菌である。これらの生物体は、乾燥細胞重量の８０％までの油を蓄積できる。高い油含量で油性酵母菌を生育させる技術は十分に開発されており（例えば（特許文献６、非特許文献１０）を参照されたい）、ω−３またはω−６ＰＵＦＡ生成のための商業的な微細藻類発酵と比べてコスト優位性を提供するかもしれない。そのままの酵母菌細胞はまた、機能食品および動物飼料サプリメントで使用するためのω−３またはω−６ＰＵＦＡ濃縮油を封入する都合よい方法になるかもしれない。
上述の利点にもかかわらず、ほとんどの油性酵母菌中の自然に生成されるＰＵＦＡは、通常１８：２脂肪酸（そしてもっとまれには１８：３脂肪酸）に限定されるので、これらの生物体は自然にはω−６およびω−３ＰＵＦＡを欠いている。したがって解決すべき問題は、ω−３および／またはω−６脂肪酸が濃縮された油を蓄積する油性酵母菌を開発することである。このような目的で、油性酵母菌におけるω−３および／またはω−６脂肪酸の合成および蓄積を可能にする、デサチュラーゼおよびエロンガーゼを導入するだけでなく、１８：２基質（すなわちＬＡ）の利用可能性を増大させることも必要である。概してこの基質の利用可能性は、オレイン酸からＬＡへの転換を触媒するΔ１２デサチュラーゼの活性によって制御される。
多様な既知のΔ１２デサチュラーゼが公共文献で開示され、そのいくつかは真菌起源（例えばモルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ）、エメリセラ・ニデュランス（Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ ｎｉｄｕｌａｎｓ）、ムコール・ルキシー（Ｍｕｃｏｒ ｒｏｕｘｉｉ）である。これらのデサチュラーゼは、例えばモルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ）デサチュラーゼが以前に非油性酵母サッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中で発現されて、１８：２を蓄積できた（非特許文献１１）にもかかわらず、油性酵母中で脂肪酸組成物を変更するのに効果的でないと考えられている。（特許文献７）は、ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）およびボトリチス・シネリア（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ）からのΔ１２デサチュラーゼについて述べる。引き続くＳ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中での発現分析は、Ｎ．クラッサ（Ｎ．ｃｒａｓｓａ）デサチュラーゼがオレイン酸を１８：２に転換する能力を確認したが、この反応の基質転換百分率（（［１８：２］／［１８：１＋１８：２］）＊１００として計算される）はわずか６８％であった。したがってＰＵＦＡの生産で使用するための油生成宿主生物体（例えば 油性酵母）中で、高レベルの１８：２（ＬＡ）の生成を支持できるΔ１２デサチュラーゼをコードする遺伝子の同定および単離に対する必要性がある。
出願人らは真菌フザリウム・モニリフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）からΔ１２デサチュラーゼをコードする遺伝子を単離して、油性酵母における発現時のオレイン酸から１８：２（ＬＡ）への意外にも効率的な転換を実証することで、既述の問題を解決した。さらにこのΔ１２デサチュラーゼのオルソログが、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・フラバス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｕｓ）、アスペルギルス・フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、マグナポルテ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）、ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）、およびフザリウム・グラミネアルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅａｒｉｕｍ）中で同定された。
米国特許第４，６６６，７０１号明細書 米国特許第４，７５８，５９２号明細書 米国特許第５，１１６，８７１号明細書 米国特許第４，８２６，８７７号明細書 米国特許第６，１３６，５７４号明細書 欧州特許第０ ００５ ２７７Ｂ１号明細書 国際公開第２００３／０９９２１６号パンフレット ダイヤーバーグ（Ｄｙｅｒｂｅｒｇ）Ｊ．ら、Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ Ｎｕｔｒ．２８：９５８〜９６６（１９７５） ダイヤーバーグ（Ｄｙｅｒｂｅｒｇ），Ｊ．ら、Ｌａｎｃｅｔ ２（８０８１）：１１７〜１１９（１９７８年７月１５日） シモカワ（Ｓｈｉｍｏｋａｗａ）Ｈ．、Ｗｏｒｌｄ Ｒｅｖ Ｎｕｔｒ Ｄｉｅｔ、８８：１００〜１０８（２００１） フォンシャッキー（ｖｏｎ Ｓｃｈａｃｋｙ），Ｃ．およびダイヤーバーグ（Ｄｙｅｒｂｅｒｇ）Ｊ．、Ｗｏｒｌｄ Ｒｅｖ Ｎｕｔｒ Ｄｉｅｔ、８８：９０〜９９（２００１） ブレナー（Ｂｒｅｎｎｅｒ）ら、Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．８３：８５〜１０１（１９７６） ホロビン（Ｈｏｒｒｏｂｉｎ）ら、Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．５７（Ｓｕｐｐｌ．）７３２Ｓ〜７３７Ｓ（１９９３） ドマーグ（Ｄｏｍｅｒｇｕｅ），Ｆ．ら、（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６９：４１０５〜４１１３（２００２）） ボードイン（Ｂｅａｕｄｏｉｎ），Ｆ．ら、（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９７（１２）：６４２１〜６（２０００）） ダイヤー（Ｄｙｅｒ），Ｊ．Ｍ．ら、（Ａｐｐｌ．Ｅｎｉｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、５９：２２４〜２３０（２００２）） ラトレッジ（Ｒａｔｌｅｄｇｅ），Ｃ．、Ｐｒｏｇ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１６：１１９〜２０６（１９８２） サクラダニ（Ｓａｋｕｒａｄａｎｉ）Ｅ．ら、Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６１（３）：８１２〜２０（１９９９）
本発明は、ω−３およびω−６脂肪酸の生成をもたらす生化学的経路操作のために有用なフザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）から単離されたΔ１２デサチュラーゼ酵素をコードする遺伝子に関する。したがって本発明は、
（ａ）配列番号４に記載のアミノ酸配列をコードする単離された核酸断片、
（ｂ）０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで６５℃、および２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗浄後、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳというハイブリダイゼーション条件下で（ａ）とハイブリダイズする単離された核酸断片、または
（ｃ）（ａ）または（ｂ）と相補である単離された核酸断片
からなる群から選択される、真菌Δ１２デサチュラーゼ酵素をコードする単離された核酸断片を提供する。
１つの具体的実施態様では本発明は、配列番号３に記載の配列を有する核酸断片と比較した場合に、Ｃｌｕｓｔａｌ法によるアライメントに基づいて少なくとも８９．２％の同一性を有するΔ１２デサチュラーゼ酵素をコードする第１のヌクレオチド配列、または第１のヌクレオチド配列の相補体を含んでなる第２のヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸断片を提供する。
同様に本発明は、配列番号４に記載の配列を有するポリペプチドと比較した場合に、Ｃｌｕｓｔａｌ法によるアライメントに基づいて９５％の同一性を有する、少なくとも４７７個のアミノ酸があるΔ１２デサチュラーゼ酵素をコードする第１のヌクレオチド配列、または第１のヌクレオチド配列の相補体を含んでなる第２のヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸断片を提供する。
同様に本発明は、本発明の単離された核酸ならびにこれらの核酸の遺伝的キメラによってコードされるポリペプチド、および該物質を含んでなる形質転換宿主細胞を提供する。
別の実施態様では、本発明は、
（ａ）ゲノムライブラリーを本発明の核酸断片でプローブする工程と、
（ｂ）本発明の核酸断片とハイブリダイズするＤＮＡクローンを同定する工程と、
（ｃ）工程（ｂ）で同定されたクローンを含んでなるゲノムの断片を配列決定する工程、を含んでなり、
配列決定したゲノムの断片がΔ１２デサチュラーゼ酵素をコードする、Δ１２デサチュラーゼ酵素をコードする核酸断片を得る方法を提供する。
同様に本発明は、
（ａ）配列番号４、８、１２、１６、２０、２１、および２２に記載の配列の部分に対応する少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーを合成する工程と、
（ｂ）工程（ａ）のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、クローニングベクター中に存在する挿入断片を増幅する工程、を含んでなり、
増幅された挿入断片がΔ１２デサチュラーゼ酵素をコードするアミノ酸配列の部分をコードする、
Δ１２デサチュラーゼをコードする核酸断片を得る方法を提供する。
別の実施態様では、本発明は、
ａ）（ｉ）配列番号４に記載の配列を有するポリペプチドと比較した場合に、Ｃｌｕｓｔａｌ法によるアライメントに基づいて少なくとも５６．３％の同一性を有するΔ１２デサチュラーゼ活性を有する真菌ポリペプチドをコードする単離された核酸断片、および
（ｉｉ）オレイン酸供給源
を含んでなる油性酵母を提供する工程と、
ｂ）キメラデサチュラーゼ遺伝子が発現し、かつオレイン酸がリノール酸に転換される条件下で、工程（ａ）の酵母を生育させる工程と、
ｃ）任意に工程（ｂ）のリノール酸を回収する工程
を含んでなるリノール酸の製造方法を提供する。
同様に本発明は、
ａ）（ｉ）配列番号４に記載の配列を有するポリペプチドと比較した場合に、Ｃｌｕｓｔａｌ法によるアライメントに基づいて少なくとも５６．３％の同一性を有するΔ１２デサチュラーゼ活性を有するタンパク質をコードする単離された核酸断片、および
（ｉｉ）機能性ω−３／ω−６脂肪酸生合成経路をコードする遺伝子
を含んでなる油性酵母を提供する工程と、
ｂ）オレイン酸を含んでなるデサチュラーゼ基質源を提供する工程と、
ｃ）（ａ）の油性酵母を（ｂ）のデサチュラーゼ基質と接触させて多価不飽和脂肪酸が生成する工程と、
ｄ）任意に工程（ｃ）の多価不飽和脂肪酸を回収する工程
を含んでなるω−３またはω−６多価不飽和脂肪酸の製造方法を提供する。
さらに本発明は、本発明の方法によって生成される微生物油を提供する。
配列説明
本願明細書の一部を形成する以下の詳細な説明および添付の配列説明によって、本発明をより完全に理解できるであろう。
以下の配列は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．§８２１〜１．８２５（「ヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列開示を含む特許出願の要件−配列規則」）を満たし、世界知的所有権機関（ＷＩＰＯ）標準ＳＴ．２５（１９９８）およびＥＰＯおよびＰＣＴの配列表要件（規則５．２および４９．５（ａの２）、および実施細則第２０８号および附属書Ｃ）に一致する。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列データのために使用される記号および型式は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２２で述べられる規則に従う。
配列番号１〜２２、５１および５２は、表１で同定されるような遺伝子またはタンパク質をコードするＯＲＦである。
Figure 2007510436
配列番号２３および２４は、それぞれＴＥＦプロモーターを単離するのに使用されるプライマーＴＥＦ５’およびＴＥＦ３’である。
配列番号２５および２６は、それぞれＸＰＲ２転写ターミネーターを単離するのに使用されるプライマーＸＰＲ５’およびＸＰＲ３’である。
配列番号２７〜３８は、それぞれプラスミド構築のために使用されるプライマーＹＬ５、ＹＬ６、ＹＬ９、ＹＬ１０、ＹＬ７、ＹＬ８、ＹＬ３、ＹＬ４、ＹＬ１、ＹＬ２、ＹＬ６１、およびＹＬ６２に対応する。
配列番号３９および４１は、それぞれヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Δ１２デサチュラーゼ遺伝子の単離のために使用される、Ｐ７３およびＰ７６として同定される変性プライマーである。
配列番号４０および４２は、それぞれ変性プライマーＰ７３およびＰ７６に対応するアミノ酸共通配列である。
配列番号４３〜４６は、それぞれ天然Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Δ１２デサチュラーゼ遺伝子の標的を定めた中断のために使用されるプライマーＰ９９、Ｐ１００、Ｐ１０１、およびＰ１０２に対応する。
配列番号４７〜５０は、それぞれ、中断されたＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Δ１２デサチュラーゼ遺伝子の標的を定めた組み込みをスクリーンするのに使用されるプライマーＰ１１９、Ｐ１２０、Ｐ１２１、およびＰ１２２に対応する。
配列番号５３および５４は、それぞれ全長Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Δ１２デサチュラーゼコード領域を増幅するのに使用されるプライマーＰ１４７およびＰ１４８に対応する。
配列番号５５および５６は、それぞれ全長フザリウム・モニリフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）Δ１２デサチュラーゼコード領域を増幅するのに使用されるプライマーＰ１９４およびＰ１９５に対応する。
配列番号５７は、プラスミドｐＫＵＮＦ１２Ｔ６ＥのＤＮＡ配列を提供する。
配列番号５８、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＦＢＡＩＮプロモーター領域に対応する。
配列番号５９は、モルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ）から誘導され、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中での発現のためにコドン最適化された合成エロンガーゼ１遺伝子の９５７ｂｐヌクレオチド配列であり、他方、配列番号６０は対応する３１８個のアミノ酸配列である。
配列番号６１は、モルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ）から誘導され、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中での発現のためにコドン最適化された合成Δ６デサチュラーゼ遺伝子の１３７４ｂｐヌクレオチド配列であり、他方、配列番号６２は対応する４５７個のアミノ酸配列である。
配列番号６３は、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＦＢＡプロモーター領域に対応する。
配列番号６４は、スラウストキトリウム・オーレウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ａｕｒｅｕｍ）から誘導され、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中での発現のためにコドン最適化された合成エロンガーゼ２遺伝子の８１９ｂｐヌクレオチド配列であり、他方、配列番号６５は対応する２７２個のアミノ酸配列である。
配列番号６６は、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）種中で最適に発現される遺伝子のためのコドン最適化された翻訳開始部位に対応する。
本発明に従って、出願人らはΔ１２デサチュラーゼをコードするフザリウム・
モニリフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）遺伝子を単離し
て同一性を確認し、その他の真菌におけるそのオルソログを同定した。さらにヤ
ロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）などの油
性酵母の長鎖多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）含量および組成の変更を可能にする
方法、および組成が提供される。
本発明は、健康的なＰＵＦＡ生成のための生化学的経路の操作のために使用してもよい、新しいΔ１２デサチュラーゼ酵素、および該物質をコードする遺伝子に関する。したがって本発明には多くの用途がある。ここで開示される方法によって製造されるＰＵＦＡ、またはその誘導体は、食餌代用品、またはサプリメント、特に乳児用調製粉乳として、静脈内栄養補給を受けている患者のために、または栄養不良を防止または処置するために使用できる。代案としては、精製されたＰＵＦＡ（またはその誘導体）は、正常な使用で受領者が食餌栄養補給のための所望量を受容するように調合された料理用油、脂肪またはマーガリンに組み込まれてもよい。ＰＵＦＡはまた、乳児用調製粉乳、栄養サプリメントまたはその他の食品に組み込まれてもよく、抗炎症薬またはコレステロール低下剤としての用途があるかもしれない。場合により組成物は、医薬用途（ヒトまたは獣医学）のために使用されてもよい。この場合、ＰＵＦＡは概して経口投与されるが、例えば非経口的（例えば皮下、筋肉内または静脈内）、経直腸、経腟または局所的（例えば皮膚用軟膏またはローションとして）など、それによって成功裏に吸収されるあらゆる経路で投与することができる。
組換え手段によって製造されたＰＵＦＡによるヒトまたは動物の栄養補給は、追加的なＰＵＦＡ、ならびにそれらの代謝産物の増大したレベルをもたらすことができる。例えばアラキドン酸（ＡＲＡ）による処置は、ＡＲＡの増大したレベルだけでなく、プロスタグランジンなどのＡＲＡの下流生成物ももたらすことができる。複雑な制御機序は、このような機序を防止、制御または克服して、個々の特定のＰＵＦＡの所望のレベルを達成するために、様々なＰＵＦＡを組み合わせ、または異なるＰＵＦＡのコンジュゲートを追加することを望ましいものにできる。
定義
本開示では、いくつかの用語および略語を使用する。以下の定義が提供される。
「読み取り枠」はＯＲＦと略記する。
「ポリメラーゼ連鎖反応」はＰＣＲと略記する。
「米国微生物系統保存機関」はＡＴＣＣと略記する。
「多不飽和脂肪酸」はＰＵＦＡと略記する。
用語「フザリウム・モニリフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）」は、フザリウム・ベルチシリオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｏｉｄｅｓ）と同義である。
「脂肪酸」という用語は、（より長い、およびより短い鎖長の酸の双方も知られているが）約Ｃ１２〜Ｃ２２の様々な鎖長の長鎖脂肪族酸（アルカン酸）を指す。優勢な鎖長は、Ｃ１６〜Ｃ２２の間である。脂肪酸の構造は単純な表記法システム「Ｘ：Ｙ」によって表され、ここでＸは特定の脂肪酸中の炭素原子の総数であり、Ｙは二重結合の数である。
概して脂肪酸は、飽和または不飽和として分類される。「飽和脂肪酸」という用語は、炭素主鎖間に「二重結合」を有さない脂肪酸を指す。対照的に「不飽和脂肪酸」は、それらの炭素主鎖に沿って「二重結合」を有する（それらは最も一般的にｃｉｓ−配置である）。「一価不飽和脂肪酸」は、（例えばパルミトレイン酸（１６：１）およびオレイン酸（１８：１）のように通常９および１０番目の炭素原子の間に）炭素主鎖に沿って１個の「二重結合」のみを有し、他方「多価不飽和脂肪酸」（すなわち「ＰＵＦＡ」）は、（例えばリノール酸（１８：２）のように９および１０番目、および１２および１３番目の炭素原子間、およびα−リノレン酸（１８：３）のように９および１０番目、１２および１３番目目、および１５および１６番目の炭素原子間に）炭素主鎖に沿って少なくとも２個の二重結合を有する。
「ＰＵＦＡ」は、（脂肪酸炭素鎖のメチル末端に最も近い第１の二重結合の位置（ｎ）次第で）２つの主要ファミリーに分類できる。したがって「ω−６脂肪酸」（ω−６またはｎ−６）は、第１の不飽和二重結合を分子のω（メチル）末端から６個めの炭素原子に有し、さらに分子のカルボキシル末端に向かって３個めの追加的な炭素原子にそれぞれの続く不飽和がある、全部で２つ以上の二重結合を有する。対照的に「ω−３脂肪酸」（ω−３またはｎ−３）は、第１の不飽和二重結合を分子のω末端から３個離れた炭素原子に有し、さらに分子のカルボキシル末端に向かって３個目の追加的な炭素原子にそれぞれの続く不飽和がある、全部で３個以上の二重結合を有する。
本開示の目的のために、ω参照システムを使用して、炭素数、二重結合数、およびω炭素（この目的では１番目とする）から数えたω炭素に最も近い二重結合の位置を示す。この命名法を下の表２で、「省略表記法」と題された欄に示す。表の残りは、ω−３およびω−６脂肪酸の一般名、明細書全体で使用される略語、および各化合物の化学名をまとめる。
Figure 2007510436
「必須脂肪酸」と言う用語は、個体が特定の必須脂肪酸を新規に（ｄｅ ｎｏｖｏ）合成できないことから、生きるために摂取しなくてはならない特定のＰＵＦＡを指す。ヒトはリノール（１８：２、ω−６）およびリノレン（１８：３、ω−３）脂肪酸を合成できず、それらを食餌中で得なくてはならないので、これらは「必須脂肪酸」である。
「脂肪」と言う用語は、２５℃で固体であり、通常飽和である脂質物質を指す。
「油」と言う用語は、２５℃で液体であり、通常多価不飽和である脂質物質を指す。ＰＵＦＡは、いくつかの藻類、油性酵母菌、および糸状菌の油中に見られる。「微生物油」または「単細胞油」は、微生物がそれらの寿命中に自然に生成する油である。このような油は長鎖ＰＵＦＡを含有することができる。
「ＰＵＦＡ生合成経路酵素」と言う用語は、ＰＵＦＡの生合成に関連した以下の酵素（および前記酵素をコードする遺伝子）のいずれかを指す。Δ４デサチュラーゼ、Δ５デサチュラーゼ、Δ６デサチュラーゼ、Δ１２デサチュラーゼ、Δ１５デサチュラーゼ、Δ１７デサチュラーゼ、Δ９デサチュラーゼ、Δ８デサチュラーゼ、および／またはエロンガーゼ。
「ω−３／ω−６脂肪酸生合成経路」と言う用語は、適切な条件下で発現すると、ω−３およびω−６脂肪酸の片方または双方の生成を触媒する酵素をコードする一揃いの遺伝子を指す。典型的にω−３／ω−６脂肪酸生合成経路に関与する遺伝子は、以下の酵素のいくつかまたは全てをコードする。Δ１２デサチュラーゼ、Δ６デサチュラーゼ、エロンガーゼ、Δ５デサチュラーゼ、Δ１７デサチュラーゼ、Δ１５デサチュラーゼ、Δ９デサチュラーゼ、Δ８デサチュラーゼ、およびΔ４デサチュラーゼ。代表的な経路は図２に示され、ＤＨＡへの様々な中間体を通じたオレイン酸の変換が提供され、共通の供給源からいかにしてω−３およびω−６脂肪酸の双方が生成できるかを実証する。経路は２つの部分に自然に分けられ、１つの部分はω−３脂肪酸を生じ、別の部分はω−６脂肪酸のみを生じる。ω−３脂肪酸のみを生じる部分はここではω−３脂肪酸生合成経路と称され、他方ω−６脂肪酸のみを生じる部分はここではω−６脂肪酸生合成経路と称される。
「機能性」と言う用語は、ここでω−３／ω−６脂肪酸生合成経路の文脈における用法では、経路中の遺伝子のいくつか（または全て）が活性酵素を発現することを意味する。いくつかの脂肪酸生成物はこの経路の遺伝子のサブセットの発現のみを必要とするので、「ω−３／ω−６脂肪酸生合成経路」または「機能的なω−３／ω−６脂肪酸生合成経路」は、上の段落に列挙する全ての遺伝子が必要であることを暗示しないものとする。
「デサチュラーゼ」と言う用語は、不飽和化できる、すなわち１つもしくはそれ以上の脂肪酸中に二重結合を導入して、一価または多価の不飽和脂肪酸を生じるポリペプチドを指す。特定の脂肪酸を指すために、本願明細書全体を通じてω参照システムを使用するのにもかかわらず、Δシステムを使用して基質のカルボキシル末端から数えることで、デサチュラーゼの活性を示す方が都合よい。ここで特に関心が高いのは、分子のカルボキシル末端から数えて１２および１３番目の炭素原子間で脂肪酸を不飽和化し、オレイン酸からＬＡへの転換を触媒するΔ１２デサチュラーゼである。本開示に関連したその他のデサチュラーゼとしては、ＬＡからＡＬＡへの転換を触媒するΔ１５デサチュラーゼ、ＤＧＬＡからＥＴＡおよび／またはＡＲＡからＥＰＡへの転換を触媒するΔ１７デサチュラーゼ、ＬＡからＧＬＡへのおよび／またはＡＬＡからＳＴＡへの転換を触媒するΔ６デサチュラーゼ、ＤＧＬＡからＡＲＡへのおよび／またはＥＴＡからＥＰＡへの転換を触媒するΔ５デサチュラーゼ、ＤＰＡからＤＨＡへの転換を触媒するΔ４デサチュラーゼ、ＥＤＡからＤＧＬＡへのおよび／またはＥＴｒＡからＥＴＡへの転換を触媒するΔ８デサチュラーゼ、およびパルミチン酸からパルミトレイン酸（１６：１）および／またはステアリン酸からオレイン酸（１８：１）への転換を触媒するΔ９デサチュラーゼが挙げられる。技術分野で、Δ１５およびΔ１７デサチュラーゼはまた、「ω−３デサチュラーゼ」、「ｗ−３デサチュラーゼ」および／または「ω−３デサチュラーゼ」と称されることもある。いくつかのデサチュラーゼは、２つ以上の基質に対する活性を有する（例えばサプロレグニア・ディクリナ（Ｓａｐｒｏｌｅｇｎｉａ ｄｉｃｌｉｎａ）Δ１７デサチュラーゼの基質としてはＡＲＡおよびＤＧＬＡが挙げられ、他方シノラブディス・エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）ω−３デサチュラーゼの基質としてはＬＡおよびＧＬＡが挙げられる）。
「ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Δ１２デサチュラーゼに対する相同性を有するタンパク質」という用語は、ここで配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２１、および２２として同定され、ここで配列番号５２として同定されるＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）デサチュラーゼ（参照によってその全体をここに援用する同時係属米国特許出願第１０／８４０３２５号明細書で特徴付けられた）に対する相同性を有するタンパク質を指す。系統学的分析は、これらのタンパク質（すなわち配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２１、および２２）が、「亜科１」および「亜科２」と称される２つの明確な亜科にクラスター化することを判定した。具体的には亜科１タンパク質は、Δ１５デサチュラーゼ（すなわち配列番号２、６、１０、１４、および１８；参照によってその全体をここに援用する同時係属米国仮特許出願第６０／５１９１９１号明細書参照）をコードするようである。対照的に亜科２のタンパク質は、ここで特徴付けられるようにΔ１２デサチュラーゼ活性を有するタンパク質（すなわち配列番号４、８、１２、１６、２０、２１、および２２）をコードする。
「転換効率」および「基質転換百分率」と言う用語は、それによって特定の酵素（例えばデサチュラーゼまたはエロンガーゼ）が基質から生成物に転換できる効率を指す。転換効率は以下の式に従って測定される。（［生成物］／［基質＋生成物］）＊１００（式中、「生成物」には即時の生成物およびそれから誘導される経路中の全生成物が含まれる）。本願明細書では、油性酵母中で発現する場合に、高い基質転換百分率によって特徴付けられるΔ１５デサチュラーゼを同定することが望ましい。したがって例えばＬＡへの少なくとも約７０％の転換効率が好ましく、ＬＡへの少なくとも約８０％の転換効率が特に適切であり、ＬＡへの少なくとも約８５％の転換効率が最も好ましい。
「エロンガーゼ」と言う用語は、脂肪酸炭素鎖を伸長して、エロンガーゼが作用した脂肪酸基質よりも炭素２個分長い酸を生成できるポリペプチドを指す。この延長プロセスは、ＣｏＡがアシルキャリアである脂肪酸合成酵素と関連した多段階機序で起きる（ラスナー（Ｌａｓｓｎｅｒ）ら、Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ８：２８１〜２９２（１９９６））。手短に述べると、マロニル−ＣｏＡが長鎖アシル−ＣｏＡと縮合して、ＣＯ２およびβ−ケトアシル−ＣｏＡ（アシル部分が炭素原子２個分伸長された）を生じる。引き続く反応には、β−ヒドロキシアシル−ＣｏＡへの還元、エノイル−ＣｏＡへの脱水、および伸長されたアシル−ＣｏＡを生じる第２の還元が含まれる。エロンガーゼによって触媒される反応の例は、ＧＬＡからＤＧＬＡ、ＳＴＡからＥＴＡ、およびＥＰＡからＤＰＡへの転換である。したがってエロンガーゼは、異なる特異性を有することができる。例えばＣ１６／１８エロンガーゼはＣ１６基質を好み、Ｃ１８／２０エロンガーゼはＣ１８基質を好み、Ｃ２０／２２エロンガーゼはＣ２０基質を好む。同様にΔ９エロンガーゼは、ＬＡおよびＡＬＡからＥＤＡおよびＥＴｒＡへの転換をそれぞれ触媒できる。
「油性」と言う用語は、それらのエネルギー源を脂質の形態で保存する傾向がある生物体を指す（ウィーテ（Ｗｅｅｔｅ）「真菌脂質生化学（Ｆｕｎｇａｌ Ｌｉｐｉｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」第二版、Ｐｌｅｎｕｍ、１９８０）。これらとしては、油料種子植物（例えばダイズ、コーン、ベニバナ、ヒマワリ、カノーラ、アブラナ、亜麻、トウモロコシ、およびサクラソウ）、および微生物（例えばスラウストキトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）種、シゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）種、モルティエレラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）種、および特定の油性酵母）が挙げられる。
「油性酵母」という用語は、油を生成できる酵母として分類される微生物を指す。概して油性微生物の細胞油またはトリアシルグリセロール含量はＳ字形曲線に従い、脂質濃度は、対数増殖後期または増殖静止初期において最大に達するまで増大し、次に増殖静止後期および死滅期中に徐々に減少する（ヨンマニットチャイ（Ｙｏｎｇｍａｎｉｔｃｈａｉ）およびワード（Ｗａｒｄ）、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５７：４１９〜２５（１９９１））。油性微生物が、約２５％を超えるそれらの乾燥細胞重量を油として蓄積することは、珍しいことではない。油性酵母菌の例としてはヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）、およびリポマイセス（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ）属が挙げられるが、決してこれに限定されるものではない。
「発酵性炭素基質」と言う用語は、微生物が代謝してエネルギーを引き出す炭素源を意味する。本発明の典型的な炭素基質としては、単糖類、少糖類、多糖類、アルカン、脂肪酸、脂肪酸のエステル、モノグリセリド、二酸化炭素、メタノール、ホルムアルデヒド、ギ酸、および炭素含有アミンが挙げられるが、これに限定されるものではない。
様々な宿主の形質転換のための遺伝子または核酸断片のコード領域について言及する場合、「コドン最適化」と言う用語は、ＤＮＡがコードするポリペプチドを改変することなく、宿主生物体の典型的なコドン使用を反映させる、遺伝子中のコドンまたは核酸分子のコード領域の改変を指す。
ここでの用法では、「単離された核酸断片」は、場合により合成、非天然または修飾ヌクレオチド塩基を含有する一本鎖または二本鎖であるＲＮＡまたはＤＮＡのポリマーである。ＤＮＡポリマーの形態の単離された核酸断片は、１つまたはそれ以上のｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは合成ＤＮＡの断片を含んでなってもよい。
核酸断片は、適切な温度および溶液イオン強度条件下で、核酸断片の一本鎖形態がその他の核酸断片とアニールできる場合、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはＲＮＡなどの別の核酸断片と「ハイブリダイズ可能」である。ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件については良く知られており、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ），Ｊ．、フリッチュ（Ｆｒｉｔｓｃｈ），Ｅ．Ｆ．およびマニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ），Ｔ．「分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」、第二版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（１９８９）の特に第１１章およびその表１１．１で例証される（参照によってその全体をここに援用する）。温度およびイオン強度条件が、ハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」を定める。ストリンジェンシー条件は、（遠縁の生物からの相同的配列などの）中程度に類似の断片をスクリーニングするため、そして（機能的酵素を複製する近縁の生物からの遺伝子などの）高度に類似した断片をスクリーニングするために調節できる。ハイブリダイゼーション後の洗浄が、ストリンジェンシー条件を決定する。１つの好ましい条件のセットは、室温において６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳで１５分間に始まり、次に４５℃において２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳで３０分間を反復し、次に５０℃において０．２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳを３０分間を２回反復する、一連の洗浄を使用する。より好ましいストリンジェントな条件のセットはより高い温度を使用し、そこでは洗浄は、最後の０．２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ中での２回の３０分間の洗浄の温度を６０℃に増大させること以外は上述したのと同一である。別の好ましい高度にストリンジェントな条件のセットは、６５℃において０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中での２回の最終洗浄を使用する。さらに別のストリンジェントな条件のセットは、例えば０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで６５℃でのハイブリダイゼーション、および２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗浄後、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを含む。
ハイブリダイゼーションのストリンジェンシー次第で塩基間のミスマッチは可能であるが、ハイブリダイゼーションは、２つの核酸が相補的配列を含有することを要求する。核酸がハイブリダイズする適切なストリンジェンシーは、当技術分野で良く知られた変数である核酸の長さおよび相補性の程度に左右される。２つのヌクレオチド配列間の類似性または相同性の程度が高い程、これらの配列を有する核酸ハイブリッドのＴｍ値は大きくなる。核酸ハイブリダイゼーションの相対安定性（より高いＴｍに対応する）は、次の順で低下する。ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＤＮＡ。長さが１００ヌクレオチドを超えるハイブリッドでは、Ｔｍを計算する式が導かれている（サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、前述９．５０〜９．５１参照）。より短かい核酸、すなわちオリゴヌクレオチドによるハイブリダイゼーションのためにはミスマッチの配置がより重要になり、オリゴヌクレオチドの長さがその特異性を決定する（サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、前述１１．７〜１１．８参照）。一実施態様では、ハイブリダイズ可能な核酸の長さは少なくともヌクレオチド約１０個である。ハイブリダイズ可能な核酸の好ましい最小の長さは少なくともヌクレオチド約１５個、より好ましくは少なくともヌクレオチド約２０個、そして最も好ましくは長さが少なくともヌクレオチド約３０個である。さらに当業者は、温度および洗浄液の塩濃度が、プローブの長さなどの要因次第で必要に応じて調節できることを認識する。
アミノ酸またはヌクレオチド配列の「かなりの部分」とは、当業者による配列の手動評価によって、あるいはＢＬＡＳＴ（「基礎的局在性整列化検索ツール（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）」アルトシュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ），Ｓ．Ｆ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０（１９９３））などのアルゴリズムを使用したコンピュータ自動化配列比較および同定によって、遺伝子またはポリペプチドの推定上の同定を得るのに十分なポリペプチドまたは遺伝子のヌクレオチド配列のアミノ酸配列を含んでなる部分である。推定的にポリペプチドまたは核酸配列が既知のタンパク質または遺伝子に相同的であると同定するためには、概して１０個以上の隣接するアミノ酸または３０個以上のヌクレオチド配列が必要である。さらにヌクレオチド配列に関して、２０〜３０個の隣接するヌクレオチドを含んでなる遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブを配列依存遺伝子同定法（例えばサザンハイブリダイゼーション）および単離（例えば細菌コロニーまたはバクテリオファージ・プラークの原位置（ｉｎ ｓｉｔｕ）ハイブリダイゼーション）において使用しても良い。さらにプライマーを含んでなる特定の核酸断片を得るために、塩基１２〜１５個の短いオリゴヌクレオチドを増幅プライマーとしてＰＣＲで使用しても良い。したがってヌクレオチド配列の「かなりの部分」は、配列を含んでなる核酸断片を特異的に同定、および／または単離できるようにする十分な配列を含んでなる。本願明細書は、特定の真菌タンパク質をコードする完全なアミノ酸およびヌクレオチド配列を教示する。当業者はここで報告される配列の恩恵を被り、当業者に既知の目的のために、今や開示された配列の全てまたはかなりの部分を使用できる。したがって本発明は、添付の配列表で報告される完全な配列、ならびに上で定義される配列のかなりの部分を含んでなる。
「相補的」と言う用語は、互いにハイブリダイズできるヌクレオチド塩基間の関係について述べるために使用される。例えばＤＮＡについて、アデノシンはチミンに相補的であり、シトシンはグアニンに相補的である。したがって本発明は添付の配列表で報告されるような完全な配列、ならびに実質的に類似した核酸配列に相補である単離された核酸断片も含む。
当技術分野で既知の「％同一性」と言う用語は、配列を比較して判定される２つ以上のポリペプチド配列または２つ以上のポリヌクレオチド配列の関係である。当技術分野において「同一性」は、場合によってはこのような配列ストリング間の整合によって判定されるような、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列間の配列関連性の程度も意味する。「同一性」および「類似性」は、１）「計算分子生物学（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）（レスク（Ｌｅｓｋ），Ａ．Ｍ．編）Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、ＮＹ（１９８８）、２）「バイオコンピューティング：情報科学およびゲノム・プロジェクト（Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ）」（スミス（Ｓｍｉｔｈ），Ｄ．Ｗ．編）Ａｃａｄｅｍｉｃ、ＮＹ（１９９３）、３）「配列データのコンピュータ分析（Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ）」、第一部、（グリフィン（Ｇｒｉｆｆｉｎ），Ａ．Ｍ．、およびグリフィン（Ｇｒｉｆｆｉｎ），Ｈ．Ｇ．編）Ｈｕｍａｎｉａ、ＮＪ（１９９４）、４）「分子生物学における配列分析（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」フォン・ハインェ（ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ），Ｇ．編、Ａｃａｄｅｍｉｃ、ＮＹ（１９８７）、５）「配列分析入門（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ）」（グリブスコフ（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ），Ｍ．およびデュヴルー（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ），Ｊ．編）Ｓｔｏｃｋｔｏｎ、ＮＹ（１９９１）で述べられたものをはじめとするが、これに限定されるものではない既知の方法によって容易に計算できる。同一性を判定する好ましい方法は、試験される配列間に最良の整合を与えるように設計される。同一性および類似性を判定する方法は、一般に入手できるコンピュータプログラムで体系化される。配列整合および同一性百分率の計算は、ウィスコンシン州マディソンのＤＮＡＳＴＡＲ（ＤＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ．（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ））からのＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクス計算スイートのＭｅｇａｌｉｇｎプログラムを使用して実施しても良い。特に断りのない限り、Ｃｌｕｓｔａｌ法によるアライメント（ヒギンズ（Ｈｉｇｇｉｎｓ）およびシャープ（Ｓｈａｒｐ）、ＣＡＢＩＯＳ．５：１５１−１５３（１９８９））を使用して、デフォルトのパラメータ（ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０、ＧＡＰ ＬＥＮＧＴＨ ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０）で、配列の複数の整合を実施する。Ｃｌｕｓｔａｌ法を使用した対整合のデフォルトのパラメータは、ＫＴＵＰＬＥ １、ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝３、ＷＩＮＤＯＷ＝５、およびＤＩＡＧＯＮＡＬＳ ＳＡＶＥＤ＝５である。
適切な核酸断片（本発明の単離ポリヌクレオチド）は、ここで報告するアミノ酸配列と少なくとも約７０％同一、好ましくは少なくとも約７５％同一、そしてより好ましくは少なくとも約８０％同一のポリペプチドをコードする。好ましい核酸断片は、ここで報告するアミノ酸配列と約８５％同一のアミノ酸配列をコードする。より好ましい核酸断片は、ここで報告するアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一のアミノ酸配列をコードする。最も好ましい核酸断片は、ここで報告するアミノ酸配列と少なくとも約９５％同一のアミノ酸配列をコードする。適切な核酸断片は上の相同性を有するだけでなく、典型的に少なくとも５０個のアミノ酸、好ましくは少なくとも１００個のアミノ酸、より好ましくは少なくとも１５０個のアミノ酸、さらにより好ましくは少なくとも２００個のアミノ酸、そして最も好ましくは少なくとも２５０個のアミノ酸を有するポリペプチドをコードする。
「相同性」という用語は、典型的に共通の先祖配列に由来するために、ある程度の類似性がある配列間の関係を指す。相同体配列は、遺伝子、構成、機能および／または動態特性に基づく相同性を共有する。「オルソログ」または「オルソロガス配列」という用語は、ここでは配列分岐が種分化に続く関係を指す（すなわち異なる種における相同的配列が、種分化中に共通の先祖遺伝子から生じる）。対照的に「パラロガス」という用語は、遺伝子重複によって生じる単一種内の相同的配列を指す。当業者は、相同的、オルソロガス、およびパラロガス配列を同定するのに必要な技術になじみが深い。
「コドン縮重」とは、コードされるポリペプチドのアミノ酸配列に影響しないヌクレオチド配列の変動を可能にする遺伝子コードの性質を指す。当業者は、特定のアミノ酸を特定化するヌクレオチドコドンの使用における、特定の宿主細胞によって示される「コドンバイアス」についてよく知っている。したがって宿主細胞中の改善された発現のために遺伝子を合成する場合、そのコドン使用頻度が、宿主細胞の好むコドン使用頻度に近くなるように遺伝子をデザインすることが望ましい。
ＤＮＡ配列に関連して「化学的に合成された」とは、構成要素ヌクレオチドが、生体外で（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）構築されたことを意味する。ＤＮＡの手動化学合成は確立した手順を使用して達成されてもよく、あるいはいくつかの市販の機器の１つを使用して自動化学合成を実施できる。「合成遺伝子」は、当業者に知られる手順を使用して、化学的に合成されるオリゴヌクレオチド構成単位から構築できる。これらの構成単位をライゲーションしアニールして、遺伝子断片を形成し、次にそれを酵素的に構築して所望の遺伝子全体を構成する。したがって遺伝子をヌクレオチド配列の最適化に基づいて、最適な遺伝子発現のために調整し、宿主細胞のコドンバイアスを反映させることができる。当業者は、コドン利用が宿主によって好まれるコドンに偏っている場合の遺伝子発現成功の見込みを理解する。好ましいコドンの判定は、配列情報が利用できる宿主細胞から誘導される遺伝子の調査に基づくことができる。
「遺伝子」とは特定のタンパク質を発現する核酸断片を指し、それはコード領域のみを指してもよく、またはコード配列に先行する（５’非コード配列）およびそれに続く（３’非コード配列）制御配列を含んでもよい。「天然遺伝子」とは、自然界にそれ自体の制御配列と共に見られる遺伝子を指す。「キメラ遺伝子」とは、自然界に共に見られない制御およびコード配列を含んでなる天然遺伝子でないあらゆる遺伝子を指す。したがってキメラ遺伝子は、異なる供給源から誘導される制御配列およびコード配列、あるいは同一供給源から誘導されるが、自然界に見られるのとは異なるやり方で配列される制御配列およびコード配列を含んでなってもよい。「内在性遺伝子」とは、生物体ゲノムにおいてその天然位置にある天然遺伝子を指す。「外来性」遺伝子とは、遺伝子移入によって宿主生物体に導入された遺伝子を指す。外来性遺伝子は、非天然生物体中に導入された天然遺伝子、天然宿主内の新しい位置に導入された天然遺伝子、あるいはキメラ遺伝子を含んでなることができる。「導入遺伝子」とは、形質転換によってゲノム中に導入される遺伝子である。「コドン最適化遺伝子」とは、そのコドン使用頻度が宿主細胞の好むコドン使用頻度を模倣するようにデザインされる遺伝子である。
「コード配列」とは、特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を指す。「適切な調節配列」とは、コード配列の上流（５’非コード配列）、配列内、または下流（３’非コード配列）に位置して、転写、ＲＮＡプロセシングまたは安定性、または関連コード配列の翻訳に影響を及ぼすヌクレオチド配列を指す。調節配列は、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセッシング部位、エフェクター結合部位、およびステム−ループ構造を含んでも良い。
「プロモーター」とは、コード配列または機能性ＲＮＡの発現を調節できるＤＮＡ配列を指す。概してコード配列は、プロモーター配列に対して３’に位置する。プロモーターは、そっくりそのまま天然遺伝子から誘導されても良く、あるいは自然界に見られる異なるプロモーターから誘導される異なる要素からなっても良く、あるいは合成ＤＮＡセグメントをさらに含んでも良い。異なるプロモーターは、異なる組織または細胞タイプ中で、あるいは異なる開発段階において、あるいは異なる環境または生理学的条件に呼応して、遺伝子の発現を導いても良いことが当業者には理解される。ほとんどの細胞タイプ中でほとんどの場合に遺伝子の発現を引き起こすプロモーターは、一般に「構造プロモーター」と称される。ほとんどの場合、制御配列のはっきりした境界は完全に画定されていないので、異なる長さのＤＮＡ断片が同一のプロモーター活性を有しても良いこともさらに認識される。
「３’非翻訳配列」および「転写ターミネーター」と言う用語は、コード配列の下流に位置するＤＮＡ配列を指す。これには、ｍＲＮＡプロセッシングまたは遺伝子発現に影響できる調節シグナルをコードするポリアデニル化認識配列およびその他の配列が含まれる。ポリアデニル化シグナルは、通常、ｍＲＮＡ前駆物質の３’末端へのポリアデニル酸トラクトの付加に影響することで特徴付けられる。３’領域は、転写、ＲＮＡプロセッシングまたは安定性、または関連コード配列の翻訳に影響できる。
「ＲＮＡ転写物」とは、ＤＮＡ配列のＲＮＡポリメラーゼが触媒する転写から得られる生成物を指す。ＲＮＡ転写物がＤＮＡ配列の完全な相補的コピーである場合、それは一次転写物と称され、あるいはそれは一次転写物の転写後プロセッシングから誘導されるＲＮＡ配列であるかもしれず、成熟ＲＮＡと称される。「メッセンジャーＲＮＡ」または「ｍＲＮＡ」とはイントロンがなく、細胞によってタンパク質に翻訳されることができるＲＮＡを指す。「ｃＤＮＡ」とは、ｍＲＮＡに対して相補的であり、それから誘導される二重鎖ＤＮＡを指す。「センスＲＮＡ」とは、ｍＲＮＡを含み、細胞によってタンパク質に翻訳されることができるＲＮＡ転写物を指す。「アンチセンスＲＮＡ」とは、標的一次転写物またはｍＲＮＡの全部または一部に相補的であり、標的遺伝子の発現をブロックするＲＮＡ転写物を指す（米国特許第５，１７０，０６５号明細書、国際公開第９９／２８５０８号パンフレット）。アンチセンスＲＮＡの相補性は、特定の遺伝子転写物のあらゆる部分、すなわち５’非コード配列、３’非コード配列、またはコード配列にあっても良い。「機能ＲＮＡ」とは、翻訳されないがそれでもなお細胞プロセスに影響するアンチセンスＲＮＡ、リボザイムＲＮＡ、またはその他のＲＮＡを指す。
「作動可能に連結した」と言う用語は、１つの機能が他方の機能によって影響される、単一核酸断片上の核酸配列のつながりを指す。例えばプロモーターはコード配列の発現に影響できる場合、そのコード配列と作動可能に連結する（すなわちコード配列がプロモーターの転写調節下にある）。コード配列は、センスまたはアンチセンス方向で制御配列に作動可能に連結できる。
「発現」と言う用語は、ここでの用法では発明の核酸断片から誘導されたセンス（ｍＲＮＡ）またはアンチセンスＲＮＡの転写および安定した蓄積を指す。発現は、ｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳も指す。
「成熟」タンパク質とは翻訳後処理された、すなわちそれから一次翻訳生成物中に存在するあらゆるプレまたはプロペプチドが除去された、ポリペプチドを指す。「前駆物質」タンパク質はｍＲＮＡ翻訳の一次生成物を指し、すなわちプレおよびプロペプチドがなおも存在する。プレおよびプロペプチドは細胞内局在化シグナルであってもよい（が、これに限定されるものではない）。
「形質転換」とは、遺伝的に安定した遺伝形質をもたらす、宿主生物体または宿主生物体中への核酸断片の転移を指す。核酸断片は、例えば自律的に複製するプラスミドであってもよく、またはそれは宿主生物体のゲノム中に組み込まれてもよい。形質転換核酸断片を含有する宿主生物体は、「トランスジェニック」または「組換え」または「形質転換」生物体と称される。
「プラスミド」、「ベクター」、および「カセット」と言う用語は、細胞の中心的代謝の一部ではない遺伝子を運ぶことが多く、通常環状二本鎖ＤＮＡ断片の形態である染色体外要素を指す。このような要素は、あらゆる供給源から誘導される一本鎖または二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡの配列、ゲノム一体化配列、直鎖または環状のファージまたはヌクレオチド配列を自律的に複製するかもしれず、そこではいくつかのヌクレオチド配列が独自の構成に連結または組換えられ、それは選択された遺伝子産物のために、例えば適切な３’非翻訳配列と共にプロモーター断片およびＤＮＡ配列を細胞中に導入することができる。「形質転換カセット」とは、外来性遺伝子を含有し、外来遺伝子に加えて特定の宿主細胞の形質転換を容易にする要素を有する特定のベクターを指す。「発現カセット」とは、外来性遺伝子を含有し、外来性遺伝子に加えて外来性宿主におけるその遺伝子の促進された発現を可能にする要素を有する特定のベクターを指す。
「相同遺伝子組換え」と言う用語は、（交差中における）２つのＤＮＡ分子間のＤＮＡ断片の交換を指す。交換される断片は、２個のＤＮＡ分子間で同一のヌクレオチド配列部位に挟まれる（すなわち「相同性領域」）。「相同性領域」と言う用語は、相同遺伝子組換えに関与する、核酸断片上の互いに相同性を有するひと続きのヌクレオチド配列を指す。効果的な相同遺伝子組換えは、一般に長さが少なくとも約１０ｂｐである相同性領域で起き、少なくとも約５０ｂｐの長さが好ましい。典型的に遺伝子組換えが意図される断片は、標的を定めた遺伝子中断または置換が所望される領域に少なくとも２つの相同性領域を含む。
「配列分析ソフトウェア」と言う用語は、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列の分析のために有用なあらゆるコンピュータアルゴリズムまたはソフトウェアプログラムを指す。「配列分析ソフトウェア」は、市販のものでも、あるいは独立して開発されても良い。典型的な配列分析ソフトウェアとしては、１．）ウィスコンシン州マディソンのジェネティック・コンピュータ・グループからのＧＣＧパッケージプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ ９．０、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ），Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、２．）ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ（アルトシュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら著、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０（１９９０））、および３．）ウィスコンシン州マディソンのＤＮＡＳＴＡＲ（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）からのＤＮＡＳＴＡＲ、４．）ミシガン州アンアーバーのジーンコーズ社（Ｇｅｎｅ Ｃｏｄｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ、ＭＩ））からのシーケンチャー（Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ）、および５．）スミス−ウォーターマン・アルゴリズムを組み入れたＦＡＳＴＡプログラム（Ｗ．Ｒ．ピアソン（Ｐｅａｒｓｏｎ）著、Ｃｏｍｐｕｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．［Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．］（１９９４）、１９９２年会議、１１１〜２０編集者：スハイ，サンドル（Ｓｕｈａｉ，Ｓａｎｄｏｒ）、Ｐｌｅｎｕｍ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ）が挙げられるが、これに限定されるものではない。本願明細書の文脈内では、配列分析ソフトウェアを分析のために使用する場合、分析結果は特に断りのない限り、言及されるプログラムの「デフォルト値」に基づくものと理解される。ここでの用法では、「デフォルト値」とは、最初に初期化されるときにソフトウェアに元からロードされる、あらゆる値またはパラメータの組を意味する。
ここで使用される標準組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は当技術分野で良く知られており、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）Ｊ．、フリッチュ（Ｆｒｉｔｓｃｈ）Ｅ．Ｆ．、およびマニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）Ｔ．「分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」第二版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（１９８９）（以下マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ））；シルハビー（Ｓｉｌｈａｖｙ）Ｔ．Ｊ．、ベンナン（Ｂｅｎｎａｎ）Ｍ．Ｌ．およびエンクイスト（Ｅｎｑｕｉｓｔ）Ｌ．Ｗ．「遺伝子融合実験（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｇｅｎｅ Ｆｕｓｉｏｎｓ）」Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（１９８４）；およびオースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）、Ｆ．Ｍ．ら「分子生物学現代プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅによる出版（１９８７）で述べられている。
脂肪酸の微生物生合成
一般に油性微生物中の脂質の蓄積は、増殖培地中に存在する全体的な炭素と窒素の比率に応答してトリガーされる（図１）。細胞が利用できる窒素供給を消耗した場合（例えば炭素と窒素の比率が約４０を超える場合）、細胞アデノシン一リン酸（ＡＭＰ）の枯渇は、ミトコンドリア中のＡＭＰ−依存イソクエン酸デヒドロゲナーゼ活性の休止、およびクエン酸の蓄積、クエン酸の細胞質ゾル内への輸送、そして引き続くＡＴＰクエン酸リアーゼによるクエン酸の切断をもたらして、アセチル−ＣｏＡが生成する。アセチル−ＣｏＡは、脂肪酸の新規（ｄｅ ｎｏｖｏ）生合成の主要構成ブロックである。効果的に代謝されてアセチル−ＣｏＡを生成できるあらゆる化合物が脂肪酸前駆物質の役割を果たせるが、このタイプの反応ではグルコースが炭素の主な供給源である（図１）。グルコースは解糖を通じてピルビン酸に変換され、次にピルビン酸はミトコンドリア中に輸送され、そこでピルビン酸デヒドロゲナーゼ（「ＰＤ」）によってアセチル−ＣｏＡに変換される。アセチル−ＣｏＡはミトコンドリア膜を越えて細胞質中に直接輸送できないので、アセチル−ＣｏＡからの２個の炭素がオキサロ酢酸と縮合して、クエン酸を生成する（クエン酸合成酵素によって触媒される）。クエン酸は細胞質内に直接輸送されて、そこでＡＴＰ−クエン酸リアーゼによって切断され、アセチル−ＣｏＡおよびオキサロ酢酸が再生する。オキサロ酢酸は、リンゴ酸への転換を通じてトリカルボン酸サイクルに再び入る。
マロニル−ＣｏＡの合成は、細胞質内で起きる脂肪酸生合成の第１の前駆ステップである。マロニル−ＣｏＡは、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（「ＡＣＣ」）によって、アセチル−ＣｏＡのカルボキシル化を通じて生成される。脂肪酸合成は、多酵素脂肪酸合成酵素複合体（「ＦＡＳ」）によって触媒され、８個の二炭素断片（アセチル−ＣｏＡからのアセチル基）の縮合によって起き、炭素１６個の飽和脂肪酸であるパルミチン酸が形成する。より具体的には、ＦＡＳは以下が関与する一連の７つの反応を触媒する（スミス（Ｓｍｉｔｈ）Ｓ．ＦＡＳＥＢ Ｊ．、８（１５）：１２４８〜５９（１９９４））。
１．アセチル−ＣｏＡおよびマロニル−ＣｏＡが、ＦＡＳのアシルキャリアタンパク（ＡＣＰ）に転移される。次にアセチル基がマロニル基に転移されて、β−ケトブチリル−ＡＣＰが形成し、ＣＯ２を放出する。
２．β−ケトブチリル−ＡＣＰが還元（β−ケトアシル還元酵素による）および脱水（β−ヒドロキシアシルデヒドラターゼによる）を被り、ｔｒａｎｓ−一価不飽和脂肪アシル基が形成する。
３．二重結合がＮＡＤＰＨによって還元され、最初のものよりも炭素が２個分長い飽和脂肪−アシル基が生じる。次に新しいマロニル基と縮合して、延長プロセスを繰り返すブチリル基の能力が再生する。
４．脂肪アシル基が炭素１６個の長さになったら、チオエステラーゼ活性がそれを加水分解して遊離パルミチン酸を放出する。
パルミチン酸（１６：０）は、小胞体膜に存在するエロンガーゼおよびデサチュラーゼの作用を通じた、より鎖長が長い飽和および不飽和脂肪酸（例えばステアリン酸（１８：０）、パルミトレイン酸（１６：１）、およびオレイン酸（１８：１））の前駆物質である。パルミチン酸およびステアリン酸は（ＣｏＡ、および／またはＡＣＰエステルとして）、Δ９デサチュラーゼの作用によってそれらの不飽和誘導体であるパルミトレイン酸（１６：１）およびオレイン酸（１８：１）酸にそれぞれ変換される。
トリアシルグリセロール（脂肪酸の主な貯蔵単位）は、リン酸１,２−ジアシルグリセロール（一般にホスファチジン酸として同定される）を生じる、アシル−ＣｏＡの２個の分子からグリセロール−３−リン酸へのエステル化によって形成される（図１）。次にホスファチジン酸ホスファターゼによってリン酸が除去され、１,２−ジアシルグリセロールが生成する。例えば第３の脂肪酸を添加すると、ジアシルグリセロール−アシルトランスフェラーゼの作用によってトリアシルグリセロールが形成する。
ω脂肪酸の生合成
非常に単純化すると、ＬＡをＧＬＡ、ＤＧＬＡ、およびＡＲＡ（ω−６経路）に、ＡＬＡをＳＴＡ、ＥＴＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡ、およびＤＨＡ（ω−３経路）に変換する代謝プロセスは、２−炭素単位の付加を通じた炭素鎖の延長と、二重結合の添加を通じた分子の不飽和化を伴う（図２）。これは小胞体膜に存在する一連の特別な不飽和化および延長酵素を必要とする。
ω−６脂肪酸
オレイン酸は、Δ１２デサチュラーゼの作用によって、最初のω−６脂肪酸であるＬＡ（１８：２）に変換される。引き続くω−６脂肪酸は、次のようにして生成される。１．）ＬＡがΔ６デサチュラーゼの作用によってＧＬＡに変換され、２．）ＧＬＡがエロンガーゼの作用によってＤＧＬＡに変換され、３．）ＤＧＬＡがΔ５デサチュラーゼの作用によってＡＲＡに変換される。
ω−３脂肪酸
リノール酸（ＬＡ）は、Δ１５−デサチュラーゼの作用によって、最初のω−３脂肪酸であるＡＬＡに変換される。引き続くω−３脂肪酸は、ω−６脂肪酸と類似した一連のステップで生成される。具体的には、１．）ＡＬＡがΔ６デサチュラーゼ活性によってＳＴＡに変換され、２．）ＳＴＡがエロンガーゼ活性によってＥＴＡに変換され、３．）ＥＴＡがΔ５デサチュラーゼ活性によってＥＰＡに変換される。代案としては、ＥＴＡおよびＥＰＡは、Δ１７デサチュラーゼ活性によって、ＤＧＬＡおよびＡＲＡからそれぞれ生成できる。ＥＰＡは、エロンガーゼおよびΔ４デサチュラーゼ活性によって、ＤＨＡにさらに変換できる。
代案の実施態様では、Δ９エロンガーゼは、ＬＡおよびＡＬＡのＥＤＡおよびＥｔｒＡへの転換をそれぞれ触媒できる。次にΔ８デサチュラーゼはこれらの生成物をそれぞれＤＧＬＡおよびＥＴＡに転換する。
ω脂肪酸生成に関与する遺伝子
藻類、細菌、カビおよび酵母菌をはじめとする多くの微生物は、通常の細胞代謝経路内でＰＵＦＡおよびω脂肪酸を合成できる。特によく適するのは、ヤブレツボカビ（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属の種であるシゾキトリウム・アグレガトム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ａｇｇｒｅｇａｔｍ）、およびモルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｅｒｉｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ）をはじめとする真菌である。さらに多くの渦鞭毛藻類（Ｄｉｎｏｐｈｙｃｅａａｅ）は、高濃度のＰＵＦＡを自然に生成する。このようにして油生成に関与する多様な遺伝子が遺伝的手段を通じて同定されており、これらのいくつかの遺伝子のＤＮＡ配列は公的に入手できる（制限を意図しない例を下の表３に示す）。
Figure 2007510436
Figure 2007510436
さらに特許文献は、油の生成に関与する遺伝子の多くの追加的ＤＮＡ配列（および／または上のいくつかの遺伝子に関する詳細およびそれらの単離方法）を提供する。例えば米国特許第５,９６８,８０９号明細書（Δ６デサチュラーゼ）、米国特許第５,９７２,６６４号明細書および米国特許第６,０７５,１８３号明細書（Δ５デサチュラーゼ）、国際公開第９１／１３９７２号パンフレットおよび米国特許第５,０５７,４１９号明細書（Δ９デサチュラーゼ）、米国出願公開公報第２００３／０１９６２１７ Ａ１号明細書（Δ１７デサチュラーゼ）、国際公開第０２／０９０４９３号パンフレット（Δ４デサチュラーゼ）、国際公開第９３／１１２４５パンフレットおよび国際公開第０３／０９９２１６号パンフレット（Δ１５デサチュラーゼ）、国際公開第００／１２７２０号パンフレットおよび米国出願公開公報第２００２／０１３９９７４ Ａ１号明細書（エロンガーゼ）を参照されたい。これらの各特許および出願は、参照によってその全体をここに援用する。
特に関心が高いのはΔ１２デサチュラーゼであり、より具体的には、油性酵母（例えばヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ））中における異種性発現に適したΔ１２デサチュラーゼである。いくつかのΔ１２デサチュラーゼ（すなわちダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）、アブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）、アラビドプシス・サリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）、トウゴマ（Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ）、トウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）、ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）、ボトリチス・シネリア（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ））の配列は、国際公開第９４／１１５１６号パンフレットおよび国際公開第０３／０９９２１６号パンフレットで開示される。
さらに天然ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Δ１２脂肪酸デサチュラーゼは最近単離され、特徴付けられている（参照によってその全体をここに援用する同時係属米国特許出願第１０／８４０３２５号参照、ここでの実施例２および３および配列番号５１および５２もまた参照されたい）。簡単に述べると、変性ＰＣＲプライマーを使用して、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）からの部分的な推定上のΔ１２デサチュラーゼＤＮＡ断片をＰＣＲによってクローニングした。生じた断片を使用した内在性ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Δ１２デサチュラーゼ遺伝子の標的を定めた中断は、１８：１のレベルを増大させ、中断株中には検出可能な１８：２がなく、それによって天然Δ１２デサチュラーゼ活性が除去されたことが確認された。引き続いて、プラスミドレスキューを使用して組み込まれたプラスミドに隣接するゲノムＤＮＡ配列を単離し、全長ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Δ１２デサチュラーゼ遺伝子（配列番号５１）をアセンブリーした。配列が１２５７塩基（配列番号５１のヌクレオチド＋２８３〜＋１５３９）の読み取り枠を含んだのに対し、推定されたコードされたアミノ酸配列は（配列番号５２）長さが４１９残基であった。このΔ１２デサチュラーゼの過剰発現は、オレイン酸からＬＡへの基質転換百分率（（［１８：２］／［１８：１＋１８：２］）＊１００として計算される）を増大させるのに適し、それは野生型細胞中の５９％から形質転換宿主細胞中の７４％に増大した。しかしこれらの宿主細胞内のＬＡの増大した可用性にもかかわらず、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）形質転換体細胞内で、多様なω−３および／またはω−６ ＰＵＦＡの高レベル生成を可能にするのに適した、さらにより大きい基質プールを得ることが望ましかった。したがって高レベルのΔ１２デサチュラーゼ活性を有する異種タンパク質の発現は、生物体の経路エンジニアリングにおいて有利であった。
ＰＵＦＡ生成のために宿主細胞中で発現させる、Δ１２デサチュラーゼ活性を有する特定のポリペプチドの選択（場合によりその他のデサチュラーゼおよびエロンガーゼとの組み合わせで）には、多くの要素が影響する。しかし宿主細胞、基質および所望の最終生成物の入手可能性、いくつかの関心のあるポリペプチド次第で、デサチュラーゼ活性を有する特定のポリペプチドを選択する上での考察としては、ポリペプチドの基質特異性、ポリペプチドまたはその構成要素が律速酵素であるかどうか、ポリペプチドが必要とする所望のＰＵＦＡおよび／または補助因子の合成のためにデサチュラーゼが必須であるかどうかが挙げられる。発現するポリペプチドは、好ましくは宿主細胞中でのその位置の生化学的環境と適合性のパラメータを有する。例えばポリペプチドは、宿主細胞内で基質獲得のためにその他の酵素と競争しなくてはならないかもしれない。したがってポリペプチドのＫＭおよび特定の活性分析は、特定の宿主細胞内でＰＵＦＡ生成を修正するために、特定のポリペプチドの適性を判定する上で考慮される。特定の宿主細胞で使用されるポリペプチドは、意図される宿主細胞中に存在する生化学的条件下で機能できるものであるが、その他の点では所望の脂肪酸（すなわちオレイン酸）を修正できる、Δ１２デサチュラーゼ活性を有するあらゆるポリペプチドであることができる。したがって配列は、例えば天然供給源（細菌、藻類、真菌、植物、動物など）から単離された、半合成経路によって生成された、または新規に（ｄｅ ｎｏｖｏ）合成された、あらゆる供給源に由来してもよい。
しかしここでは本発明の目的のためには、Δ１２デサチュラーゼ活性を有するポリペプチドが、所望の宿主細胞中で発現すると少なくとも約７０％の転換効率を有することが最も望ましく、少なくとも約８０％の転換効率が特に適切であり、少なくとも約８５％の転換効率が最も好ましい。
新しい真菌Δ１２デサチュラーゼの同定
クエリー配列としてヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Δ１２デサチュラーゼタンパク質配列（配列番号５２）を使用した配列比較によって、フザリウム・モニリフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）からの新しいΔ１２デサチュラーゼがここで同定された。具体的には、このヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）クエリー配列を使用して、デラウェア州ウィルミントンのＥ．Ｉ．デュポン・ドゥ・ヌムール・アンド・カンパニー（Ｅ．Ｉ． ｄｕＰｏｎｔ ｄｅ Ｎｅｍｏｕｒｓ ａｎｄ Ｃｏ．，Ｉｎｃ．（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＤＥ）からのフザリウム・モニリフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）株Ｍ−８１１４の専売特許デュポン（ＤｕＰｏｎｔ）発現配列タグ（ＥＳＴ）ライブラリーの推定上のコードされるタンパク質配列を検索した。これはそれぞれ配列番号１および３のヌクレオチド配列によってコードされる２つの相同的配列、Ｆｍ１（配列番号２）およびＦｍ２（配列番号４）の同定をもたらした。
いくつかの糸状菌類公開データベースに対するクエリーとして、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）Δ１２デサチュラーゼ配列もまた使用した。具体的にはアスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）（配列番号６および８）、マグナポルテ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）（配列番号１０および１２）、ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）（配列番号１４および１６）フザリウム・グラミネアルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅａｒｉｕｍ）（配列番号１８および２０）、アスペルギルス・フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）（配列番号２１）、およびアスペルギルス・フラバス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｕｓ）（配列番号２２）中において相同的タンパク質配列が同定された。Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ法（緩慢、正確、Ｇｏｎｎｅｔオプション；トンプソン（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２：４６７３〜４６８０（１９９４））を使用した、これらの配列（すなわち配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２１、および２２）の比較に基づいた引き続く系統学的および相同性分析からは、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）Δ１２デサチュラーゼとの相同性を有する２つの明確なタンパク質「亜科」が明らかにされた。具体的には「亜科１」の全てのタンパク質（配列番号２、６、１０、１４、および１８）は互いに少なくとも４６．２％同一であり、「亜科２」のタンパク質（配列番号４、８、１２、１６、２０、２１、および２２）に対しては３９．６％未満同一であった（図４および５、Ｃｌｕｓｔａｌ法によるアライメント（前出））。亜科２のタンパク質は互いに少なくとも５６．３％同一であった（実施例４参照）。
ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）が１８：２のみを合成できる（しかし１８：３は合成できない）のに対して、上述のほとんどの糸状菌類は１８：２およびＡＬＡの双方を生成でき、そしてヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）が単一のΔ１２デサチュラーゼを有するのに対して、ほとんどの糸状菌類はヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）Δ１２デサチュラーゼの２つの相同体を有するので、出願人らはこれらの生物体中のデサチュラーゼの１つの亜科がΔ１２デサチュラーゼに相当し、もう１つがΔ１５デサチュラーゼに相当すると仮定した。発現分析を使用して、２つの各亜科中で代表的なタンパク質の活性を測定し、この仮説を試験した。具体的には、Ｆｍ１およびＭｇ１をヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中で発現させ、Δ１５デサチュラーゼをコードすることを見いだした（同時係属米国特許仮出願第６０／５１９１９１号明細書参照）。同様に２００３年１２月４日付け公報の国際公開第０３／０９９２１６号パンフレットは、ここで亜科１ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）およびアスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）配列として同定された配列が、Δ１５デサチュラーゼ活性を有することを提案する。対照的にここで述べられるようにしてＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中でＦｍ２が発現され、Δ１２デサチュラーゼとして特徴付けられた。亜科２ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）配列のΔ１２デサチュラーゼ活性は、国際公開第０３／０９９２１６号パンフレットで同様に確認された。
Ｃｌｕｓｔａｌ法によるアライメント（トンプソン（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２：４６７３〜４６８０（１９９４））を使用して、フザリウム・モニリフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）Δ１２デサチュラーゼ推定アミノ酸配列（配列番号４）を公共データベース配列と比較した。このようにして、ここで配列番号２０として提供されるフザリウム・グラミネアルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅａｒｉｕｍ）Δ１２デサチュラーゼに対する％同一性に基づいて、フザリウム・モニリフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）Δ１２デサチュラーゼアミノ酸配列は、最も類似していた（４７７のアミノ酸長にわたり９５％同一）。より好ましいアミノ酸断片はここでの配列と少なくとも約９６％同一であり、９７％〜９８％同一の配列が特に適切であり、約９９％同一の配列が最も好ましい。
同様にして、Ｃｌｕｓｔａｌ法によるアライメントを使用した、フザリウム・モニリフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）Δ１２デサチュラーゼヌクレオチド塩基配列の公共データベースとの比較は、最も類似した既知の核酸配列（Ｆ．グラミネアルム（Ｆ．ｇｒａｍｉｎｅａｒｉｕｍ）ゲノム・プロジェクト中のコンティグ１．２３３；ここでの配列番号１９）が、ここで報告されるフザリウム・モニリフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）Δ１２デサチュラーゼの核酸配列（配列番号３）と約８９．２％同一であることを明らかにした。本ＯＲＦに対応する好ましいΔ１２デサチュラーゼをコードする核酸配列は、活性タンパク質をコードして、ここで報告されるフザリウム・モニリフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）Δ１２デサチュラーゼをコードする核酸配列と少なくとも約８９％〜９０％同一のものであり、９１％〜９５％同一の配列が特に適切であり、９５％を超えて同一の配列が最も好ましい。
相同体の同定および単離
本発明のΔ１２デサチュラーゼ核酸断片を使用して、同一または別の細菌、藻類、真菌、または植物種から相同タンパク質をコードする遺伝子を同定および単離してもよい。
同定技術
例えば当業者による配列手動評価、またはＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ；アルトシュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）Ｓ．Ｆ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０（１９９３））およびＣｌｕｓｔａｌ Ｗ（ＤＮＡＳＴＡＲソフトウェアのメガライン（Ｍｅｇａｌｉｇｎ）プログラム）などのアルゴリズムを使用したコンピュータ自動化配列比較および同定のいずれかによって、ここで述べられるフザリウム・モニリフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）Δ１２デサチュラーゼのアミノ酸またはヌクレオチド配列のかなりの部分を使用して、近縁ポリペプチドまたは遺伝子を推定的に同定できる。上述のようにヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Δ１２デサチュラーゼ（配列番号５２）を使用することで、分析すると２つの明確なタンパク質の亜科（すなわち亜科１および亜科２）としてクラスター化する一揃いの真菌デサチュラーゼの同定が可能になった。亜科２は、上述のフザリウム・モニリフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）Δ１２デサチュラーゼ、ならびにそのコードＤＮＡ配列が以下に見られるタンパク質を含んでなる。
・ マサチューセッツ州ケンブリッジのゲノム研究センター（Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ＣＧＲ）（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）の後援を受けている、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）ゲノム・プロジェクト中のコンティグ１．１５（骨格１）（ＡＡＧ３６９３３）（配列番号８）、
・ ＣＧＲおよび国際イネＢｌａｓｔゲノム・コンソーシアム（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｉｃｅ Ｂｌａｓｔ Ｇｅｎｏｍｅ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ）の後援を受けている、マグナポルテ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）ゲノム・プロジェクト中のコンティグ２．３７５中の遺伝子座ＭＧ０１９８５．１（配列番号１２）、
・ ジェンバンク登録番号ＡＡＢＸ０１０００３７４（ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ））（配列番号１６）、
・ ＣＧＲおよび国際ジベレラ・ゼア・ゲノミックス・コンソーシアム（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ ｚｅａｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ（ＩＧＧＲ）の後援を受けている、フザリウム・グラミネアルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅａｒｉｕｍ）ゲノム・プロジェクト中のコンティグ１．２３３；（配列番号２０）。
・ アスペルギルス・フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）ゲノム・プロジェクト（サンガー・インスティテュート（Ｓａｎｇｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）、マンチェスター大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ）の協力者、およびゲノム研究インスティテュート（Ｔｈｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｇｅｎｏｍ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ＴＩＧＲ））の後援を受けている）（配列番号２１）、および
・ ジェンバンク登録番号ＡＹ２８０８６７（アスペルギルス・フラバス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｕｓ））（配列番号２２）。
上の各タンパク質はΔ１２デサチュラーゼをコードすると仮定される。この仮説は国際公開第０３／０９９２１６号パンフレットで、ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）について確認された。
Ｃｌｕｓｔａｌ法によるアライメント（前出）（図５）によれば、上のタンパク質の分析から、これらのタンパク質がフザリウム・モニリフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）Δ１２デサチュラーゼ（配列番号４）に対して少なくとも５６．３％の配列同一性を有することが明らかになった。さらに本発明における亜科２のΔ１２デサチュラーゼを他の既知のΔ１２デサチュラーゼタンパク質とも比較したが、ここにおける亜科２のΔ１２デサチュラーゼは、いかなる既知のΔ１２デサチュラーゼよりもヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Δ１２デサチュラーゼにさらに相同的（５１．６％の同一性、図６）である。当業者は類似の方法を使用して、亜科２（Δ１２デサチュラーゼとして同定された）にクラスター化するその他のオルソロガスタンパク質を同定できる。
代案としては、相同体同定のためのハイブリッド形成試薬として、本デサチュラーゼ配列（すなわち配列番号３、４、７、８、１１、１２、１５、１６、１９、２０、２１、および２２）のいずれかを用いても良い。核酸ハイブリダイゼーション試験の基本的構成要素には、プローブ、関心のある遺伝子または遺伝子断片を含有することが疑われるサンプル、および特定のハイブリダイゼーション法が含まれる。本発明のプローブは典型的に、検出する核酸配列に相補である一本鎖核酸配列である。プローブは、検出する核酸配列と「ハイブリダイズ可能」である。本発明のプローブの長さは、５個の塩基から数万個の塩基の間で変動しても良く、実施する特定の試験に左右される。典型的に、約１５個の塩基から約３０個の塩基のプローブ長が適切である。プローブ分子の一部のみが、検出する核酸配列に相補的であればよい。さらにプローブと標的配列との相補性は完璧でなくても良い。ハイブリダイゼーションは不完全に相補である分子間でも生じ、その結果、ハイブリダイズした領域内の特定の塩基の一部は、適切な相補的塩基と対合形成しない。
ハイブリダイゼーション法は良く定義されている。典型的には、プローブおよびサンプルは、核酸ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で混合されなくてはならない。これは適切な濃度および温度条件下において、無機または有機塩存在下で、プローブとサンプルを接触させることを伴う。プローブとサンプル核酸の間であらゆる可能なハイブリダイゼーションが起きるように、プローブおよびサンプル核酸は、十分長い時間接触しなくてはならない。混合物中のプローブまたは標的濃度が、ハイブリダイゼーションが生じるのに必要な時間を決定する。プローブまたは標的濃度が高いほど、必要なハイブリダイゼーションインキュベーション時間は短くなる。場合により、カオトロピック剤を添加しても良い。カオトロピック剤は、ヌクレアーゼ活性を阻害することによって核酸を安定化させる。さらにカオトロピック剤は、室温において短いオリゴヌクレオチドプローブの高感応性でストリンジェントなハイブリダイゼーションを可能にする（ヴァン・ネス（Ｖａｎ Ｎｅｓｓ）およびチェン（Ｃｈｅｎ）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９：５１４３〜５１５１（１９９１））。適切なカオトロピック剤としては、特に塩化グアニジニウム、グアニジニウムチオシアネート、ナトリウムチオシアネート、リチウムテトラクロロ酢酸、過塩素酸ナトリウム、ルビジウムテトラクロロ酢酸、ヨウ化カリウム、およびセシウムトリフルオロ酢酸が挙げられる。典型的にカオトロピック剤は、約３Ｍの最終濃度で存在する。所望ならば、ハイブリダイゼーション混合物にホルムアミドを典型的に３０〜５０％（ｖ／ｖ）で添加できる。
様々なハイブリダイゼーション溶液を用いることができる。典型的にそれらは約２０〜６０容量％、好ましくは３０容量％の極性有機溶剤からなる。一般的なハイブリダイゼーション溶液は、約３０〜５０％ｖ／ｖのホルムアミドと、約０．１５〜１Ｍの塩化ナトリウムと、（例えばクエン酸ナトリウム、トリス−ＨＣｌ、ＰＩＰＥＳまたはＨＥＰＥＳ（ｐＨ範囲約６〜９）などの）約０．０５〜０．１Ｍの緩衝液と、（例えばドデシル硫酸ナトリウムなどの）約０．０５〜０．２％の洗剤、または０．５〜２０ｍＭＥＤＴＡ、ＦＩＣＯＬＬ（ファーマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）Ｉｎｃ．）（約３００〜５００ｋｄａｌ）、ポリビニルピロリドン（約２５０〜５００ｋｄａｌ）、および血清アルブミンを用いる。また典型的なハイブリダイゼーション溶液には、約０．１〜５ｍｇ／ｍＬの非標識の担体核酸、（例えば仔ウシ胸腺またはサケ精子ＤＮＡ、または酵母菌ＲＮＡなどの）破片核酸ＤＮＡ、および場合により約０．５〜２％ｗｔ／ｖｏｌのグリシンも含まれる。様々な（例えばポリエチレングリコールなどの）極性水溶性または水性膨張剤、（例えばポリアクリレートまたはポリメチルアクリレートなどの）陰イオンポリマー、（例えばデキストラン硫酸などの）陰イオン糖類ポリマーをはじめとする容積排除剤などのその他の添加剤を含めても良い。
核酸ハイブリダイゼーションは多様なアッセイ型式に適合できる。最も適切なもの１つは、サンドイッチアッセイ型式である。サンドイッチアッセイは、特に非変性条件下でのハイブリダイゼーションに適合できる。サンドイッチ−タイプアッセイの主要構成要素は固形担体である。固形担体はそれに吸着され、あるいはそれと共有結合的に結合する、未標識で配列の一部分と相補である固定核酸プローブを有する。
単離方法
本発明のフザリウム・モニリフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）Δ１２デサチュラーゼ核酸断片（またはここで同定されたΔ１２デサチュラーゼのいずれか［配列番号７、８、１１、１２、１５、１６、および１９−２２］）を使用して、同一またはその他の細菌、藻類、真菌または植物種から相同的タンパクをコードする遺伝子を分離しても良い。配列−依存性プロトコルを使用した相同的遺伝子の分離は、当技術分野で周知である。
配列依存性プロトコルの例としては１．）核酸ハイブリダイゼーション法、２．）様々な核酸増幅技術の使用で例証されるように、ＤＮＡおよびＲＮＡ増幅法［例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、マリス（Ｍｕｌｌｉｓ）らの米国特許第４，６８３，２０２号明細書、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（タボール（Ｔａｂｏｒ），Ｓ．ら、Ｐｒｏｃ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２、１０７４（１９８５））、または連鎖置換増幅（ＳＤＡ）（ウォーカー（Ｗａｌｋｅｒ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８９、３９２（１９９２））］、および３．）ライブラリー構築および相補性によるスクリーニング法が挙げられるが、これに限定されるものではない。
例えばここで述べられるデサチュラーゼに類似したタンパク質またはポリペプチドをコードする遺伝子は、当業者によく知られている方法を使用して、本核酸断片の全てまたは一部をＤＮＡハイブリダイゼーションプローブとして使用して、あらゆる所望の酵母菌または真菌からライブラリーをスクリーニングして直接単離できる（そこではＬＡ［またはＬＡ誘導体］を生成する酵母または真菌が好ましい）。本核酸配列に基づく特定のオリゴヌクレオチドプローブは、当技術分野で既知の方法によって、デザインおよび合成できる（マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）前述）。さらに当業者に既知の方法（例えばランダムプライマーＤＮＡ標識、ニック翻訳または末端標識技術）によって、配列全体を直接使用してＤＮＡプローブを合成でき、または利用できる生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）転写システムを使用してＲＮＡプローブを合成できる。さらに特定のプライマーをデザインして使用し、本配列の一部（または全長）を増幅できる。得られる増幅生成物を増幅反応中に直接標識し、または増幅反応後に標識して、適切なストリンジェンシーの条件下でプローブとして使用し、完全長ＤＮＡ断片を単離できる。
典型的にＰＣＲ−タイプ増幅技術では、プライマーは異なる配列を有し、互いに相補的でない。所望の試験条件次第で、プライマーの配列は、標的核酸の効率的かつ忠実な複製を提供するようにデザインすべきである。ＰＣＲプライマーデザインの方法は当技術分野で一般的であり、よく知られている（「ヒトにおける遺伝病：実際的アプローチ（Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｄｉｓｅａｓｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ）」Ｋ．Ｅ．デービス（Ｄａｖｉｓ）編より、テリン（Ｔｈｅｉｎ）およびウォリス（Ｗａｌｌａｃｅ）著「遺伝的障害診断における特異的ハイブリダイゼーションプローブとしてのオリゴヌクレオチドの使用（Ｔｈｅ Ｕｓｅ ｏｆ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ａｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｐｒｏｂｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ）」、（１９８６）ｐ３３〜５０、ＩＲＬ：Ｈｅｒｎｄｏｎ，ＶＡ。「分子生物学における方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」ホワイト（Ｗｈｉｔｅ）Ｂ．Ａ．編より、ライクリック（Ｒｙｃｈｌｉｋ）Ｗ．著「ＰＣＲプロトコル：最近の方法と応用（ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）」（１９９３）第１５巻、ｐ３１〜３９、Ｈｕｍａｎｉａ：Ｔｏｔｏｗａ、ＮＪ）。
概してポリメラーゼ連鎖反応プロトコルにおいて、本配列の２本の短い断片を使用して、ＤＮＡまたはＲＮＡから相同遺伝子をコードするより長い核酸断片を増幅しても良い。またポリメラーゼ連鎖反応はクローンされた核酸断片のライブラリーにおいて実施しても良く、そこでは１つのプライマーの配列が本核酸断片から誘導され、もう一つのプライマーの配列は、微生物細胞をコードするｍＲＮＡ前駆物質の３’末端のポリアデニル酸トラクトの存在を利用する。
代案としては、第２のプライマー配列は、クローニングベクターから誘導される配列に基づいても良い。例えば当業者は、ＲＡＣＥプロトコル（フローマン（Ｆｒｏｈｍａｎ）ら、ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８５：８９９８（１９８８））に従って、ＰＣＲを使用して、転写物の一点と３’または５’末端との間の領域のコピーを増幅し、ｃＤＮＡを作り出すことができる。３’および５’方向に向けたプライマーは、本配列からデザインできる。メリーランド州ゲーサーズバーグのギブコ／ＢＲＬ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ））から商業的に入手できる３’ＲＡＣＥまたは５’ＲＡＣＥシステム系を使用して、特定の３’または５’ｃＤＮＡ断片を単離できる（オハラ（Ｏｈａｒａ）ら、ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８６：５６７３（１９８９）；ロー（Ｌｏｈ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４３：２１７（１９８９））。
本ヌクレオチドおよび推定されたアミノ酸配列が利用できれば、ＤＮＡ発現ライブラリーの免疫学的スクリーニングが容易になる。本アミノ酸配列の部分をなす合成ペプチドは合成してもよい。これらのペプチドを使用して、アミノ酸配列を含んでなるペプチドまたはタンパク質に対して特異性があるポリクローナルまたはモノクローナル抗体を生成するように、動物を免疫できる。次にこれらの抗体を使用してＤＮＡ発現ライブラリーをスクリーニングし、関心のある完全長ＤＮＡクローンを単離できる（レーナー（Ｌｅｒｎｅｒ）Ｒ．Ａ．、Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３６：１（１９８４）、マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）前述）。
改善された異種発現のための遺伝子最適化
多様な技術を使用して、代案の宿主において関心のある特定のΔ１２デサチュラーゼの発現を改善できる。このような２つの技術としては、コドン最適化および遺伝子の変異誘発が挙げられる。
コドン最適化
いくつかの実施態様では、例えばΔ１２デサチュラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするコドンの部分を修正して、代案の宿主（すなわち油性酵母菌）におけるこれらのポリペプチドをコードする遺伝子の発現を向上させることが望ましいかもしれない
一般に宿主が好むコドンは、タンパク質（好ましくは最も大量に発現するタンパク質）中でのコドン使用を調べ、いずれのコドンが最高頻度で使用されるか判定することで、関心のある特定の宿主種内で判定できる。次に宿主種で好まれるコドンを使用して、デサチュラーゼ活性を有する関心のあるポリペプチドのコード配列を全部または部分的に合成できる。ＤＮＡの全部（または部分）はまた、転写ｍＲＮＡ中に存在するあらゆる不安定化配列または二次構造領域を除去するように合成できる。ＤＮＡの全部（または部分）はまた、塩基組成を所望の宿主細胞中でより好まれるものに変更するように合成できる。
本発明の好ましい実施態様では、例えばフザリウム・モニリフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）、マグナポルテ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）、ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）、フザリウム・グラミネアルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅａｒｉｕｍ）アスペルギルス・フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、およびアスペルギルス・フラバス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｕｓ）からのΔ１２デサチュラーゼが、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）などの異種油性酵母宿主中でのそれらの発現に先だって、コドン最適化できる。
変異誘発
配列を合成し、配列を一緒にまとめる方法は、文献においてよく確立されている。例えば生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）での変異誘発および選択、部位特異的変異誘発、誤りがちなＰＣＲ（メルニコフ（Ｍｅｌｎｉｋｏｖ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２７（４）：１０５６〜１０６２（１９９９年２月１５日））、「遺伝子シャフリング」（米国特許第５,６０５,７９３号明細書、米国特許第５,８１１,２３８号明細書、米国特許第５,８３０,７２１号明細書、および米国特許第５,８３７,４５８号明細書）またはその他の手段を用いて、本明細書に記載のΔ１２デサチュラーゼなどの天然デサチュラーゼ遺伝子の変異を得ることができる。これによって生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）でデサチュラーゼ活性を有し、宿主細胞中で機能するためのより望ましい物理的および動力学的パラメータ（例えば所望ＰＵＦＡのより長い半減期またはより高い生成率）があるポリペプチドの生成が可能になる。
所望ならば、酵素活性に重要なデサチュラーゼポリペプチドの領域は、ルーチンの変異誘発、得られる変異体ポリペプチドの発現、およびそれらの活性の算出を通じて判定できる。変異体は、欠失、挿入、および点変異、またはそれらの組み合わせを含んでもよい。典型的な機能分析は、欠失変異誘発に始まって機能に必要なタンパク質のＮ−およびＣ−末端限界を判定し、次に内部欠損、挿入または点変異体を作り出し、機能に必要な領域をさらに判定する。カセット変異誘発または完全合成などのその他の技術もまた使用できる。欠失変異誘発は例えば、エキソヌクレアーゼを使用して、５’または３’コード領域を逐次除去して達成される。このような技術のためのキットが入手できる。欠失後、開始または停止コドンを含有するオリゴヌクレオチドをそれぞれ５’または３’欠失後に、欠失コード領域にライゲーションして、コード領域が完成する。代案としては、部位特異的変異誘発、変異原性ＰＣＲをはじめとする多様な方法によって、または既存の制限部位において消化されたＤＮＡ上へのライゲーションによって、開始または停止コドンをコードするオリゴヌクレオチドをコード領域に挿入する。内部欠損は、部位特異的変異誘発または変異原性ＰＣＲを通じた変異原性プライマーの使用によって、ＤＮＡ中の既存の制限部位の使用をはじめとする多様な方法を通じて同様に作り出せる。挿入は、リンカー−スキャニング変異誘発、部位特異的変異誘発または変異原性ＰＣＲなどの方法を通じて作り出される。点変異は、部位特異的変異誘発または変異原性ＰＣＲなどの技術を通じて作り出される。
化学変異誘発もまた、活性に重要なデサチュラーゼポリペプチドの領域を同定するために使用できる。変異したコンストラクトが発現し、得られる改変タンパク質がデサチュラーゼとして機能する能力がアッセイされる。このような構造−機能分析は、どの領域が欠失してもよいか、どの領域が挿入を許容するか、どの点変異によって変異体タンパク質が、天然デサチュラーゼと実質的に同じように機能できるようにするかを判定できる。ここで述べるデサチュラーゼ遺伝子から誘導されるこのような全ての変異体タンパク質、およびそれらをコードするヌクレオチド配列は、本発明の範囲内である。
したがって本発明は、添付の配列表で報告されるようなΔ１２デサチュラーゼ遺伝子の完全な配列、これらの完全な配列の相補体、これらの配列のかなりの部分、それから誘導されるコドン最適化されたデサチュラーゼ、およびそれらと実質的に相同的な配列を含んでなる。
ω−３、および／またはω−６脂肪酸の微生物による生成
微生物によるω−３、および／またはω−６脂肪酸の生成は、魚または植物などの天然供給源からの精製に比べて、例えば以下のようないくつかの利点を有することができる。
１．）多くの微生物は、油組成が高等生物のものと比べてはるかに単純であることが知られており、所望の構成要素の精製を容易にする。
２．）微生物による生成には、天候および食物供給などの外部変数によって引き起こされるばらつきがない。
３．）微生物的に生成された油は、実質的に環境汚染物質による混入物フリーである。
４．）微生物は特定用途を有するかもしれない特定形態のＰＵＦＡを提供できる。
５．）微生物による油生成は、培養条件を制御することで、特に微生物的に発現される酵素のために特定の基質を提供することで、または化合物の添加または遺伝子工学アプローチによって望まれない生化学的経路を抑制することで操作できる。
これらの利点に加えて、組換え微生物からのω−３、および／またはω−６脂肪酸の生成は、宿主中に新しい生合成経路を提供することによって、または所望されない経路を抑制することによって、所望のＰＵＦＡ（またはその抱合形態）レベルを増大させ、所望されないＰＵＦＡレベルを低下させることで、自然発生的微生物の脂肪酸プロフィールを変更する能力を提供する（参照によってその全体をここに援用する同時係属米国特許出願第１０／８４０５７９号明細書参照）。
様々なω−３および／またはω−６脂肪酸の生成方法
適切なプロモーターの制御下における、ここで述べられるΔ１２デサチュラーゼをコードするキメラ遺伝子の導入は、形質転換された宿主生物体においてＬＡの増大する生成をもたらすことが予想される。このようにして本発明は、基質が所望の脂肪酸生成物（すなわちＬＡ）に転換されるように、ここで述べられる脂肪酸基質（すなわちオレイン酸）をＰＵＦＡ酵素（例えばフザリウム・モニリフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）Δ１２デサチュラーゼ）に曝すステップを含んでなる、ＰＵＦＡの直接的生成方法を包含する。より具体的には、油性酵母におけるＬＡの製造方法を提供することが本発明の目的であり、そこでは油性酵母に、（ａ）配列番号４に記載の配列を有するポリペプチドと比較した場合に、Ｃｌｕｓｔａｌ法によるアライメントに基づいて少なくとも５６．３％の同一性を有するΔ１２デサチュラーゼ活性を有する真菌タンパク質をコードする単離された核酸断片、および（ｂ）オレイン酸からなるデサチュラーゼ基質源が提供され、キメラのデサチュラーゼ遺伝子が発現し、かつオレイン酸がＬＡに転換されるような条件下で酵母を生育させ、場合によりＬＡが回収される。したがってこの方法は、少なくともここで述べられるような配列番号４、８、１２、１６、２０、２１、および２２のΔ１２デサチュラーゼの使用を含む。
代案としては、ここで述べられる各ＰＵＦＡ遺伝子およびその対応する酵素生成物が、ω−３および／またはω−６ＰＵＦＡの生成のために間接的に使用できる。ＰＵＦＡの間接的生成は、中間ステップまたは経路中間体の手段を通じて、脂肪酸基質が所望の脂肪酸生成物に間接的に転換する場合に起きる。したがって一連の反応が起きて所望の生成物を生成するように、ここで述べられるΔ１２デサチュラーゼが、その他の酵素をコードする１つもしくはそれ以上の遺伝子との組み合わせで発現してもよいことが考察される。好ましい実施態様では、例えばＰＵＦＡ生合成経路の酵素をコードする追加的遺伝子を含んでなるベクターで宿主生物体を同時形質転換して、ω−３および／またはω−６脂肪酸（例えばＧＬＡ、ＤＧＬＡ、ＡＲＡ、ＡＬＡ、ＳＴＡ、ＥＴＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡ、およびＤＨＡ）のより高レベルの生成を得てもよい。具体的には、例えば以下もまた発現する宿主細胞において、ここで述べられるΔ１２デサチュラーゼのいずれか１つを過剰発現することが望ましいかもしれない。１．）ＧＬＡの過剰生成のためのΔ６デサチュラーゼをコードする遺伝子、２．）ＤＧＬＡの過剰生成のためのΔ６デサチュラーゼおよび高親和力エロンガーゼをコードする遺伝子を含んでなる発現カセット、３．）ＡＲＡの過剰生成のためのΔ６デサチュラーゼ、高親和力エロンガーゼ、およびΔ５デサチュラーゼをコードする遺伝子、または４．）ＥＰＡの過剰生成のためのΔ６デサチュラーゼ、高親和力エロンガーゼ、Δ５デサチュラーゼ、およびΔ１７デサチュラーゼをコードする遺伝子。別の実施態様では、例えば以下もまた発現する宿主細胞において、ここで述べられるΔ１２デサチュラーゼを過剰発現することが望ましいかもしれない。１．）ＡＬＡの過剰生成のためのΔ１５デサチュラーゼをコードする遺伝子、２．）ＳＴＡの過剰生成のためのΔ１５デサチュラーゼおよびΔ６デサチュラーゼをコードする遺伝子、３．）ＥＴＡの過剰生成のための１５デサチュラーゼ、Δ６デサチュラーゼ、および高親和力エロンガーゼをコードする遺伝子、または４．）ＥＰＡの過剰生成のためのΔ１５デサチュラーゼ、Δ６デサチュラーゼ、高親和力エロンガーゼ、およびΔ５デサチュラーゼをコードする遺伝子。当業者にはよく知られているように、ここでのデサチュラーゼとの組み合わせで宿主において発現させるのに、以下の酵素活性の様々な別の組み合わせが、有用かもしれない。Δ１５デサチュラーゼ、Δ４デサチュラーゼ、Δ５デサチュラーゼ、Δ６デサチュラーゼ、Δ１７デサチュラーゼ、Δ９デサチュラーゼ、Δ８デサチュラーゼおよび／またはエロンガーゼ（図２参照）。特定の発現カセット内に含まれる特定の遺伝子は、宿主細胞（およびそのＰＵＦＡプロフィールおよび／またはデサチュラーゼプロフィール）、基質の入手可能性、および所望の最終生成物に左右される。
別の実施態様では、ここで述べられる完全な配列に基づく宿主生物体の未変性Δ１２デサチュラーゼ、これらの完全な配列の相補体、それらの配列のかなりの部分、それから誘導されるコドン最適化デサチュラーゼ、および実質的にそれと相同である配列を中断することが有用かもしれない。例えば宿主生物体中でのΔ１２デサチュラーゼの標的を定めた中断からは、ＬＡを合成できない変異体株が生成される。
発現システム、カセット、およびベクター
ここで述べられる本配列の遺伝子および遺伝子生成物は、異種の微生物宿主細胞、特に油性酵母菌（例えばヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ））の細胞中で生成されてもよい。組換え微生物宿主中の発現は、様々なＰＵＦＡ経路中間体の生成のために、またはこれまで宿主を使用してできなかった新しい生成物の合成のための、宿主に既存のＰＵＦＡ経路の調節のために有用かもしれない。
微生物の発現システム、および外来タンパク質の高レベル発現を導く制御配列を含有する発現ベクターは、当業者によく知られている。これらのいずれも本配列の遺伝子生成物のいずれかを生成するためのキメラ遺伝子を構築するのに使用できる。次に形質転換を通じてこれらのキメラ遺伝子を適切な微生物に導入して、コードされた酵素の高レベル発現を提供できる。
適切な宿主細胞の形質転換に有用なベクターまたはＤＮＡカセットは、当技術分野でよく知られている。コンストラクト中に存在する配列の特定の選択は、所望の発現生成物（上述）、宿主細胞の性質、および提案される形質転換細胞と非形質転換細胞とを分離する手段に左右される。しかし典型的にベクターまたはカセットは、関連遺伝子の転写および翻訳を導く配列、選択性標識、および自律性複製または染色体組み込みを可能にする配列を含有する。適切なベクターは、転写開始を制御する遺伝子の５’領域、および転写終結を制御するＤＮＡ断片の３’領域を含んでなる。双方の制御領域が形質転換された宿主細胞の遺伝子に由来することが最も好ましいが、このような制御領域は、必ずしも生成宿主として選択された特定種に天然の遺伝子に由来しなくてよいものと理解される。
所望の宿主細胞中で、本ＯＲＦの発現を推進するのに有用な開始制御領域またはプロモーターは多数あり、当業者にはなじみが深い。選択された宿主細胞中でのこれらの遺伝子の発現を導くことができる、実質的にあらゆるプロモーターが本発明に適する。宿主細胞中での発現は、一過性または安定様式で達成できる。一過性発現は、関心のある遺伝子に作動可能に連結された、調節可能プロモーターの活性を誘導することで達成できる。安定発現は、関心のある遺伝子に作動可能に連結された構成プロモーターの使用によって達成できる。一例として宿主細胞が酵母菌の場合、酵母菌細胞中で機能する転写および翻訳領域が、特に宿主種から提供される。転写開始調節領域は、例えば以下から得ることができる。１．）アルコールデヒドロゲナーゼ、グリセルアルデヒド３−リン酸−デヒドロゲナーゼ（米国特許出願第１０／８６９６３０号明細書参照）、ホスホグリセリン酸ムターゼ（米国特許出願第１０／８６９６３０号明細書参照）、フルクトース−ビスリン染色体外要素アルドラーゼ（米国仮特許出願第６０／５１９９７１号明細書参照）、ホスホグルコース−異性化酵素、ホスホグリセラートキナーゼ、グリセロール−３−リン酸塩Ｏ−アシル転移酵素（米国仮特許出願第６０／６１００６０号明細書参照）などの解糖経路中の遺伝子、または２．）酸ホスファターゼ、ラクターゼ、メタロチオネイン、グルコアミラーゼ、翻訳延長要素ＥＦ１−α（ＴＥＦ）タンパク質（米国特許第６，２６５，１８５号明細書）、リボソームタンパク質Ｓ７（米国特許第６，２６５，１８５号明細書）などの調節可能遺伝子。構成または誘導転写が所望されるかどうか、関心のあるＯＲＦを発現する上でのプロモーター効率、構築の容易さなど次第で、いくつかの制御配列のいずれでも使用できる。
翻訳開始コドンＡＴＧを取り囲むヌクレオチド配列は、酵母菌細胞中の発現に影響することが分かっている。本Δ１２デサチュラーゼのいずれかが酵母菌中で発現不良であれば、外来性遺伝子のヌクレオチド配列を修正して効率的な酵母菌翻訳開始配列を含め、最適遺伝子発現を得ることができる。酵母菌における発現では、これは、非効率的に発現する遺伝子をインフレームで内在性酵母菌遺伝子、好ましくは高度に発現する遺伝子に融合させることによる部位特異的変異誘発によって実施できる。代案としては、宿主中の共通翻訳開始配列を判定して、関心のある宿主中でのそれらの最適発現のために、この配列を異種性遺伝子内に遺伝子操作できる（ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）に適用できる特定の教示については例えば米国特許出願第１０／８４０４７８号明細書参照）。
終結領域は、開始領域がそれから得られる遺伝子の３’領域から、または異なる遺伝子から誘導されることができる。多数の終結領域が知られており、多様な宿主において満足に機能する（それらが由来するのと同一のおよび異なる属および種の双方で使用した際に）。終結領域は、通常、特定の特性のためと言うよりも便宜的に選択される。好ましくは終結領域は、特にサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、分裂酵母（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）またはクリヴェロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）である酵母菌遺伝子から誘導される。γ−インターフェロンおよびα−２インターフェロンをコードする哺乳類の遺伝子の３’−領域もまた、酵母菌中で機能することが知られている。終結制御領域もまた、好ましい宿主に天然の様々な遺伝子から誘導されてもよい。場合により終結部位は不必要かもしれないが、含まれることが最も好ましい。
当業者は気づいているように、遺伝子をクローニングベクターに単に挿入するだけでは、それが必要なレベルで成功裏に発現することは保証されない。高発現率の必要性に応答して、転写、翻訳、タンパク質安定性、酸素限界、および宿主細胞からの分泌の態様を制御するいくつかの異なる遺伝的要素を操作することで、多くの特殊化した発現ベクターが作り出されている。より具体的には、遺伝子発現を制御するように操作される分子の特徴のいくつかとして以下が挙げられる。１．）関連転写プロモーターおよびターミネーター配列の性質、２．）クローンされた遺伝子のコピー数、および遺伝子がプラスミド上にあるかまたは宿主細胞のゲノム中に組み込まれているかどうか、３．）合成された外来タンパク質の最終細胞内位置、４．）宿主生物体中の翻訳効率、５．）宿主細胞内のクローン遺伝子タンパク質の本質的な安定性、および６．）頻度が宿主細胞の好むコドン使用頻度に近づくようなクローン遺伝子内のコドン使用。これらの各タイプの修正は、ここで述べられるΔ１２デサチュラーゼの発現をさらに最適化する手段として、本発明中に包含される。
微生物宿主の形質転換
油性酵母菌中での発現に適したポリペプチドをコードするＤＮＡがひとたび得られると、それは宿主細胞中で自律複製できるプラスミドベクター中に入れられ、またはそれは宿主細胞のゲノム中に直接組み込まれる。発現カセットの組み込みは、宿主ゲノム内で無作為に起きることができ、または宿主遺伝子座との遺伝子組換えを標的とするのに十分な宿主ゲノムとの相同性領域を含有するコンストラクトの使用を通じて、標的を定めることができる。コンストラクトが内在性遺伝子座に標的を定めると、全てまたはいくつかの転写および翻訳調節領域が、内在性遺伝子座によって提供できる。
別々の複製ベクターから２つ以上の遺伝子が発現する場合、各ベクターが異なる選択手段を有することが望ましく、他のコンストラクトに対する相同性を欠いて、安定した発現を維持し、コンストラクト中の要素の再集合を防止すべきである。調節領域、選択手段、および導入コンストラクト増殖方法の思慮深い選択は、全ての導入された遺伝子が必要なレベルで発現して、所望の生成物の合成を提供するように実験的に判定できる。
関心のある遺伝子を含んでなるコンストラクトは、あらゆる標準的技術によって宿主細胞に導入してもよい。これらの技術としては、形質転換（例えば酢酸リチウム形質転換［Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１９４：１８６〜１８７（１９９１）］）、プロトプラスト融合、微粒子銃衝撃、電気穿孔、微量注入、または宿主細胞中に関心のある遺伝子を導入するその他のあらゆる方法が挙げられる。油性酵母菌（すなわちヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ））に適用できるより具体的な教示としては、米国特許第４，８８０，７４１号明細書および米国特許第５，０７１，７６４号明細書、およびチェン（Ｃｈｅｎ）Ｄ．Ｃ．ら（Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４８（２）：２３２〜２３５（１９９７））が挙げられる。
便宜上、ＤＮＡ配列（例えば発現カセット）を取り込むように、あらゆる方法によって操作されている宿主細胞を「形質転換された」または「組換え」とここで称する。形質転換された宿主は、遺伝子がゲノム中に組み込まれるか、増幅されるか、または複数のコピー数を有する染色体外要素上に存在するかどうか次第で、発現コンストラクトの少なくとも１つのコピーを有し、２つ以上を有してもよい。形質転換された宿主細胞は、導入されたコンストラクト上に含有される標識について選択することで同定できる。多くの形質転換技術は、多くのＤＮＡ分子を宿主細胞中に導入するので、代案としては、別の標識コンストラクトを所望のコンストラクトと共に同時形質転換してもよい。典型的に形質転換された宿主は、選択的培地上で生育するそれらの能力について選択される。選択培地には抗生物質が組み込まれていてもよく、または栄養素または成長要素などの非形質転換宿主の生育に必要な要素が欠如していてもよい。導入された標識遺伝子は、形質転換された宿主中で発現すると、抗生物質抵抗性を与え、または必須成長要素または酵素をコードしてもよく、それによって選択培地上での生育を可能にしてもよい。また発現した標識タンパク質が直接または間接に検出できる場合に、形質転換された宿主の選択ができる。標識タンパク質は単独で、または別のタンパク質と融合して発現してもよい。標識タンパク質は、次によって検出できる。１．）その酵素活性（例えばβ−ガラクトシダーゼは基質Ｘ−ｇａｌ［５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド］を着色生成物に変換でき、ルシフェラーゼはルシフェリンを発光生成物に変換できる）、または２．）その発光性または光修正特性（例えばオワンクラゲ（Ａｅｑｕｏｒｅａ ｖｉｃｔｏｒｉａ）の緑色蛍光タンパク質は青色光で照明されると蛍光を発する）。代案としては抗体を使用して、標識タンパク質、または例えば関心のあるタンパク質の上の分子タグを検出できる。標識タンパク質またはタグを発現する細胞は、例えば視覚的に、またはＦＡＣＳ、または抗体を使用したパニングなどの技術によって選択できる。酵母菌形質転換体の選択のためには、酵母菌で機能するあらゆる標識を使用してもよい。望ましくはカナマイシン、ハイグロマイシン、およびアミノグリコシドＧ４１８に対する抵抗性、ならびにウラシルまたはロイシンを欠く培地で生育する能力も重要である。
形質転換に続いて、本Δ１２デサチュラーゼ（そして場合により宿主細胞内で同時発現するその他のＰＵＦＡ酵素）に適切な基質が、宿主によって自然にまたは遺伝子組換え的に生成されてもよく、またはそれらは外来性に提供されてもよい。
微生物中でのω−３、および／またはω−６脂肪酸生合成の代謝エンジニアリング
本Δ１２デサチュラーゼの配列の知識は、油性酵母菌、特にヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）におけるω−３、および／またはω−６脂肪酸生合成を操作するために有用であろう。これは直接ＰＵＦＡ生合成経路内での代謝エンジニアリング、または炭素をＰＵＦＡ生合成経路に与える経路の追加的操作を必要とするかもしれない。生化学的経路を操作するのに有用な方法は、当業者にはよく知られている。
望ましい生合成経路を上方制御する技術
典型的にマルチコピープラスミドの使用を通じて、デサチュラーゼ（および場合によりエロンガーゼ）遺伝子の追加的コピーを宿主に導入して、ω−３、および／またはω−６脂肪酸生合成経路の生成量を増大させてもよい。デサチュラーゼおよびエロンガーゼ遺伝子の発現はまた、ｍＲＮＡまたはコードされたタンパク質のいずれかから不安定化配列を除去／消去することで、または安定化配列をｍＲＮＡ（米国特許第４,９１０,１４１号明細書）に追加することで、（制御されたまたは構成的な）より強力なプロモーターの使用を通じて増大する発現を引き起こして、転写レベルで増大できる。異種のデサチュラーゼまたはエロンガーゼ遺伝子の発現を増大させるさらに別のアプローチは、選択された宿主微生物中での最適遺伝子発現のためのコドンで、天然遺伝子中のコドンを置換することにより、コードされたｍＲＮＡの翻訳効率を増大させることである。
望ましくない生合成経路を下方制御する技術
反対に、エネルギーまたは炭素についてω−３、および／またはω−６脂肪酸生合成経路と競合する生化学的経路、または特定のＰＵＦＡ最終生成物の生成を妨げる天然ＰＵＦＡ生合成経路酵素を遺伝子中断または下方制御、またはその他の手段（例えばアンチセンスｍＲＮＡ）によって除去してもよい。遺伝子中断では、そのコード配列を妨害し、それによって遺伝子を機能的に不活性化するために、中断させたい構成的遺伝子中に外来ＤＮＡ断片（典型的に選択可能標識遺伝子）を挿入し、中断させる。中断カセットの宿主細胞中への形質転換は、相同的組換えによって、機能的天然遺伝子の非機能的中断遺伝子による置換をもたらす（例えばハミルトン（Ｈａｍｉｌｔｏｎ）ら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７１：４６１７〜４６２２（１９８９）；バルバス（Ｂａｌｂａｓ）ら、Ｇｅｎｅ、１３６：２１１〜２１３（１９９３）；ゲルデナー（Ｇｕｅｌｄｅｎｅｒ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．２４：２５１９〜２５２４（１９９６）；およびスミス（Ｓｍｉｔｈ）ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：２７０〜２７７（１９９６）参照）。
アンチセンス技術は、標的遺伝子配列が既知の場合に遺伝子を下方制御する別の方法である。これを達成するためには、ＲＮＡのアンチセンスストランドが転写されるように、所望の遺伝子からの核酸セグメントをクローンしてプロモーターに作動的に結合する。次にこのコンストラクトを宿主細胞中に導入し、ＲＮＡのアンチセンスストランドを生成する。アンチセンスＲＮＡは、関心のあるタンパク質をコードするｍＲＮＡの蓄積を防止することで、遺伝子発現を阻害する。当業者は特定遺伝子の発現を低下させるためのアンチセンス技術の使用に関連して、特別な配慮があることを理解するであろう。例えばアンチセンス遺伝子発現の適切なレベルは、当業者に既知の異なる制御要素を使用する異なるキメラ遺伝子の使用を必要とするかもしれない。
配列が知られている場合、標的を定めた遺伝子中断およびアンチセンス技術が遺伝子を下方制御する効果的手段を提供するが、配列ベースではないその他のより特異性が低い方法が開発されている。例えば細胞をＵＶ放射線暴露して、次に所望の表現型についてスクリーンしてもよい。変異体を作り出すために、化学薬品による変異誘発もまた効果的であり、一般に使用される物質としては非複製ＤＮＡに影響する化学物質（例えばＨＮＯ２およびＮＨ２ＯＨ）、ならびに複製ＤＮＡに影響する薬剤（例えばフレームシフト変異を引き起こすことで注目に値するアクリジン染料）が挙げられる。放射線または化学薬品を使用して変異体を作り出す特定の方法は、当技術分野でよく文書化されている。例えばトーマスＤ．ブロック（Ｔｈｏｍａｓ Ｄ．Ｂｒｏｃｋ）著「バイオテクノロジー：工業微生物学テキストブック（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）第二版（１９８９）Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ：Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ、ＭＡ、またはデシュパンデ，ムカンド（Ｄｅｓｈｐａｎｄｅ，Ｍｕｋｕｎｄ）Ｖ．、Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、３６：２２７（１９９２）を参照されたい。
別の非特異的遺伝子中断方法は、転移要素またはトランスポゾンの使用である。トランスポゾンは、ＤＮＡに無作為に挿入される遺伝的要素であるが、後で配列に基づいて検索して、挿入がどこで起きたのか判定できる。生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）および生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）転位法の双方が知られている。どちらの方法にもトランスポザーゼ酵素と組み合わされた転移要素の使用が関与する。転移要素またはトランスポゾンがトランスポザーゼ存在下で核酸断片に接触すると、転移要素が核酸断片中に無作為に挿入される。中断された遺伝子は転移要素配列に基づいて同定されてもよいので、技術は、ランダム変異誘発のため、そして遺伝子単離のために有用である。生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）転位のためのキットは市販される。例えば１．）ニュージャージー州ブランチバーグのパーキン・エルマー・アプライド・バイオシステムズ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｂｒａｎｃｈｂｕｒｇ、ＮＪ））から入手できる酵母菌Ｔｙ１要素に基づく、プライマー・アイランド転位キット、２．）マサチューセッツ州のニュー・イングランド・バイオ・ラブズ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ））から入手できる細菌性トランスポゾンＴｎ７に基づくゲノム・プライミング・システム、および３．）ウィスコンシン州マディソンのエピセンター・テクノロジーズ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ））から入手できる、Ｔｎ５細菌性転移要素に基づくＥＺ：：ＴＮトランスポゾン挿入システムを参照されたい。
本発明の文脈では、上述のいずれか１つの方法によって、脂肪酸生合成経路の発現を調節することが有用であるかもしれない。例えば本発明は、ω−３、および／またはω−６脂肪酸生成をもたらす、生合成経路中の重要な酵素をコードする遺伝子（すなわちΔ１２デサチュラーゼ）を提供する。宿主生物体の代謝遺伝子操作のための様々な手段を使用して、不十分な量の１８：２脂肪酸を生成する油性酵母菌においてこれらの遺伝子を発現し、これおよびその他のＰＵＦＡ生合成遺伝子発現を調節して、好ましいＰＵＦＡ生成物の生成を最大化することは特に有用であろう。同様にこれらの遺伝子によってＰＵＦＡ生成を最大化するために、ＰＵＦＡ生合成に向かう炭素の流れを得るために競合する経路を中断させることが必要かもしれない。
別の実施態様では、ここでのΔ１２デサチュラーゼを中断して、ω−３および／またはω−６脂肪酸合成を防止することが望ましいかもしれない。別の実施態様では、本Δ１２デサチュラーゼ遺伝子のいずれかを誘導性または調節的プロモーターの制御下に置くことにより、ω−３および／またはω−６脂肪酸の生成を調節することが可能である。
Δ１２デサチュラーゼの組換え発現のための好ましい微生物宿主
本遺伝子および核酸断片の発現のための宿主細胞は、広範な温度およびｐＨで、単純または複合炭水化物、有機酸およびアルコール、および／または炭化水素をはじめとする多様な原材料上で生育する微生物宿主を含んでもよい。本発明で述べられる遺伝子は、油性酵母菌、そして特にヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）における発現のために単離されているが、転写、翻訳およびタンパク質生合成器管は高度に保存されているので、あらゆる細菌、酵母菌、藻類、および／または糸状菌が、本核酸断片の発現のための適切な宿主になることが考察される。
好ましい宿主は、油性酵母菌などの油性生物体である。これらの油性生物体は自然に油の合成および蓄積ができ、油は細胞乾燥重量の約２５％を超え、より好ましくは細胞乾燥重量の約３０％を超え、最も好ましくは細胞乾燥重量の約４０％を超える量を構成できる。油性酵母菌として典型的に同定されている属としては、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）、およびリポマイセス（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ）が挙げられるが、これに限定されるものではない。より具体的には、例証的な油合成酵母菌としては、ロドスポリジウム・トルイデス（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ）、リポマイセス・スターケイ（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ ｓｔａｒｋｅｙｉｉ）、Ｌ．リポフェラス（Ｌ．ｌｉｐｏｆｅｒｕｓ）、カンジダ・レブカウフィ（Ｃａｎｄｉｄａ ｒｅｖｋａｕｆｉ）、Ｃ．プルケリマ（Ｃ．ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍａ）、Ｃ．トロピカリス（Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、Ｃ．ユチリス（Ｃ．ｕｔｉｌｉｓ）、トリコスポロン・プランス（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ｐｕｌｌａｎｓ）、Ｔ．クタネウム（Ｔ．ｃｕｔａｎｅｕｍ）、ロドトルラ・グルティナス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｇｌｕｔｉｎｕｓ）、Ｒ．グラミニス（Ｒ．ｇｒａｍｉｎｉｓ）、およびヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）（以前はカンジダ・リポリティカ（Ｃａｎｄｉｄａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）として分類されていた）が挙げられる。
最も好ましいのは油性酵母菌ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）であり、さらなる実施態様で最も好ましいのは、ＡＴＣＣ番号７６９８２、ＡＴＣＣ番号２０３６２、ＡＴＣＣ番号８８６２、ＡＴＣＣ番号１８９４４、および／またはＬＧＡＭＳ（７）１と称されるヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株である（パパニコラオウ（Ｐａｐａｎｉｋｏｌａｏｕ）Ｓ．、およびアゲリス（Ａｇｇｅｌｉｓ）Ｇ．、Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．８２（１）：４３〜９（２００２））。
その他の好ましい微生物宿主としては、油性の細菌、藻類、およびその他の真菌（例えばスラウストキトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）種、シゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）種、およびモルティエレラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）種）が挙げられる。
ＰＵＦＡ生成のための発酵プロセス
形質転換された微生物宿主細胞を脂肪酸生合成遺伝子活性を最適化させ、脂肪酸（例えば様々なω−３および／またはω−６脂肪酸の生成を増大できるＬＡ）の最大かつ最も経済的な収率を生じる条件下で生育させる。一般に最適化されてもよい培地条件としては、炭素源のタイプおよび量、窒素源のタイプおよび量、炭素−対−窒素比率、酸素レベル、生育温度、ｐＨ、バイオマス生成相の長さ、油蓄積相の長さ、および細胞採取時間が挙げられる。油性酵母菌などの関心のある微生物を複合培地（例えば酵母菌抽出物−ペプトン−デキストロース液体培地（ＹＰＤ））上で生育させ、または生育に必要な構成要素が欠如する合成最少培地（例えばミシガン州デトロイトのディフコ・ラボラトリーズ（ＤＩＦＣＯ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｄｅｔｒｏｉｔ、ＭＩ））からの酵母菌窒素ベース）上で生育させて、所望の発現カセットを選択させる。
本発明における発酵培地は、適切な炭素源を含有しなくてはならない。適切な炭素源としては、単糖類（例えばグルコース、フルクトース）、二糖類（例えばラクトースまたはスクロース）、少糖類、多糖類（例えばデンプン、セルロースまたはそれらの混合物）、糖アルコール（例えばグリセロール）または再生可能原材料からの混合物（例えば乳清透過液、コーンスティープリーカー、甜菜モラセス、大麦の麦芽）が挙げられるが、これに限定されるものではない。さらに炭素源としては、アルカン、脂肪酸、脂肪酸エステル、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、リン脂質、および植物油（例えばダイズ油）、および動物脂肪をはじめとする脂肪酸の様々な商業的供給源が挙げられる。さらに炭素基質としては、重要な生化学的中間体への代謝転換が実証されている一炭素基質（例えば二酸化炭素またはメタノール）が挙げられる。したがって本発明で使用される炭素源は多種多様な炭素含有基質を包含し、宿主生物体の選択によってのみ制限されることが考察された。上述の全ての炭素基質およびそれらの混合物が本発明で適切であることが予想されるが、好ましい炭素基質は糖、および／または脂肪酸である。最も好ましいのは、１０〜２２個の炭素含有グルコース、および／または脂肪酸である。
窒素は、無機源（例えば（ＮＨ４）２ＳＯ４）または有機源（例えば尿素、グルタミン酸）から供給されてもよい。適切な炭素および窒素源に加えて、発酵培地はまた、適切なミネラル、塩、補助要素、緩衝液、ビタミン、および当業者には既知である微生物の生育とＰＵＦＡ生成に必要な酵素的経路の促進に適したその他の構成要素を含有しなくてはならない。脂質およびＰＵＦＡの合成を促進するいくつかの金属イオン（例えばＭｎ＋２、Ｃｏ＋２、Ｚｎ＋２、Ｍｇ＋２）が注目されている（ナカハラ（Ｎａｋａｈａｒａ）Ｔ．ら、「単細胞油の工業的応用（Ｉｎｄ．Ａｐｐｌ．Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｅｌｌ Ｏｉｌｓ）」、Ｄ．Ｊ．カイル（Ｋｙｌｅ）およびＲ．コリン（Ｃｏｌｉｎ）編、ｐ６１〜９７（１９９２））。
本発明における好ましい増殖培地は、ミシガン州デトロイトのディフコ・ラボラトリーズ（ＤＩＦＣＯ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｄｅｔｒｏｉｔ、ＭＩ））からの酵母菌窒素ベースなどの一般的な商業的調製培地である。またその他の合成または人工増殖培地を使用してもよく、特定の微生物の生育に適した培地は、微生物学または発酵科学の当業者に知られている。発酵に適したｐＨ範囲は、典型的に約ｐＨ４．０〜ｐＨ８．０の間であり、ｐＨ５．５〜ｐＨ７．０が最初の生育条件の範囲として好ましい。発酵は好気性または好気性条件下で実施されてもよく、マイクロ好気性条件が好ましい。
典型的に、油性酵母菌細胞におけるＰＵＦＡの高レベルの蓄積は、代謝状態が生育と脂肪合成／貯蔵間で「バランスが取れて」いなくてはならないので、二段階プロセスを必要とする。したがって最も好ましくは、油性酵母菌におけるＰＵＦＡ生成には二段階発酵プロセスが必要である。このアプローチでは、発酵の第１段階は細胞集団の生成および蓄積のみを行い、迅速な細胞生育および細胞分割によって特徴付けられる。発酵の第２段階では、培養内の窒素欠乏条件を確立して高レベルの脂質蓄積を促進することが好ましい。この窒素欠乏の効果は、細胞内のＡＭＰの効果的濃度を低下させることにより、ミトコンドリアのＮＡＤ−依存イソクエン酸デヒドロゲナーゼ活性を低下させることである。これが起きるとクエン酸が蓄積するので、細胞質中にアセチル−ＣｏＡの豊富なプールが形成し、脂肪酸合成の下準備をする。したがってこの相は、細胞分割休止と、それに続く脂肪酸合成および油蓄積によって特徴付けられる。
細胞は典型的に約３０℃で生育させるが、いくつかの研究は、より低い温度における不飽和脂肪酸の増大した合成を示している（ヨンマニットチャイ（Ｙｏｎｇｍａｎｉｔｃｈａｉ）およびワード（Ｗａｒｄ）、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５７：４１９〜２５（１９９１））。プロセスの経済に基づけば、この温度シフトは、大部分の生物体の生育が起きる二段階発酵の第１相後に起きるはずである。
多様な発酵プロセスデザインを適用してもよいことが考察され、本Δ１２デサチュラーゼ遺伝子を使用したω脂肪酸の商業生産が所望される。例えば、組換え微生物宿主からのＰＵＦＡの商業生産は、バッチ、供給バッチまたは連続発酵プロセスによって生成されてもよい。
バッチ発酵プロセスは閉鎖システムであり、培地組成がプロセス開始時に設定され、プロセス中にｐＨおよび酸素レベル維持のために必要とされるもの以外は、さらなる追加を受けない。したがって培養プロセスの始めに所望の生物体を培地に接種し、培地への追加的基質（すなわち炭素および窒素源）の添加なしに、生育または代謝活性を生じさせる。バッチプロセスでは、システムの代謝産物およびバイオマス組成物は、培養が終結するまで絶えず変化する。典型的なバッチプロセスでは、細胞は静止対数相から高生育対数相を通過して、最終的に発達速度が減少または停止する定常相に減速する。処置されない場合、定常相の細胞は次第に死滅する。標準バッチプロセスのバリエーションが供給バッチプロセスであり、基質は発酵プロセス経過中に発酵槽に連続的に添加される。供給バッチプロセスもまた、本発明に適している。供給バッチプロセスは分解産物抑制が、細胞代謝を阻害する傾向がある場合に、またはあらゆる時点で培地中に限定量の基質を有することが望ましい場合に有用である。供給バッチシステム中の基質濃度の測定は困難であるので、ｐＨ、溶解酸素、および排ガス（例えばＣＯ２）分圧などの測定可能な要素の変化に基づいて推定してもよい。バッチおよび供給バッチ培養方法は一般的で当技術分野でよく知られており、実例が以下にある。トーマス（Ｔｈｏｍａｓ）Ｄ．ブロック（Ｂｒｏｃｋ）著、バイオテクノロジー：工業的微生物学テキストブック（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）第二版、Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ：Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ、ＭＡ（１９８９）、またはデシュパンデ，ムカンド（Ｄｅｓｈｐａｎｄｅ，Ｍｕｋｕｎｄ）Ｖ．、Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、３６：２２７（１９９２）。これらは参照によってここに援用される。
本Δ１２デサチュラーゼを使用したω脂肪酸の商業生産はまた、連続発酵プロセスによって達成されてもよく、そこでは生成物の回収のため等量の培養物を除去するのと同時に、合成培地をバイオリアクター内に連続的に添加する。連続培養は、概して細胞を一定細胞密度の対数増殖期に保つ。連続または半連続培養法は、細胞生育または最終生成物濃度に影響する１つの要素またはあらゆるいくつかの要素の調節を可能にする。例えば１つのアプローチでは炭素源を制限して、あらゆるその他のパラメータが代謝を調節できるようにしてもよい。その他のシステムでは、培地濁度によって測定される細胞濃度を一定に保ちながら、生育に影響するいくつかの要素を連続的に変化させてもよい。連続システムは定常状態生育を維持することを目指すので、細胞生育率は、培養から培地が抜き取られることによる細胞損失に対してバランスが取れていなくてはならない。連続的培養プロセスのために栄養素および成長要素を調節する方法、ならびに生成物形成速度を最大化する技術は工業微生物学の当技術分野でよく知られており、多様な方法が上記のブロック（Ｂｒｏｃｋ）で詳述される。
ＰＵＦＡの精製
ＰＵＦＡは、遊離脂肪酸として、またはアシルグリセロール、リン脂質、スルホリピドまたは糖脂質などのエステル化形態で宿主微生物中に見ることができ、当技術分野でよく知られている多様な手段を通じて宿主細胞から抽出されてもよい。酵母菌脂質の抽出技術、品質分析、および許容性基準に関する１つのレビューは、Ｚ．ジェーコブス（Ｊａｃｏｂｓ）（Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １２（５／６）：４６３〜４９１（１９９２））である。下流プロセスに関する簡潔なレビューは、Ａ．シン（Ｓｉｎｇｈ）およびＯ．ワード（Ｗａｒｄ）（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４５：２７１〜３１２（１９９７））にもある。
一般にＰＵＦＡの精製手段としては、有機溶剤、超音波処理、超臨界流体抽出（例えば二酸化炭素を使用して）による抽出と、鹸化と、圧搾などの物理的手段またはそれらの組み合わせが挙げられる。特に興味深いのは、水存在下でのメタノールおよびクロロホルムによる抽出である（Ｅ．Ｇ．ブライ（Ｂｌｉｇｈ）およびＷ．Ｊ．ダイヤー（Ｄｙｅｒ）、Ｃａｎ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．３７：９１１〜９１７（１９５９））。望ましい場合、水性層を酸性化して負の電荷を帯びた部分をプロトン化することで、有機層中への所望の生成物の分配を増大できる。抽出後、有機溶剤は窒素流の下で蒸発によって除去できる。コンジュゲートされた形態で単離されると、生成物は酵素的にまたは化学的に切断されて、関心のある遊離脂肪酸またはより単純なコンジュゲートを遊離させしてもよく、次にさらに操作されて所望の最終生成物を生成してもよい。望ましくはコンジュゲートされた形態の脂肪酸は、水酸化カリウムによって切断される。
さらに精製が必要ならば、標準法を用いることができる。このような方法としては、抽出、尿素処理、分別結晶化、ＨＰＬＣ、分留、シリカゲルクロマトグラフィー、高速遠心分離または蒸留、またはこれらの技術の組み合わせが挙げられる。酸またはアルケニル基などの反応性基の保護は、既知の技術（例えばアルキル化またはヨウ素化）を通じて、あらゆるステップで実施してもよい。使用される方法としては、メチルエステルを生成するための脂肪酸のメチル化が挙げられる。同様に保護基は、あらゆるステップで除去されてもよい。望ましくはＧＬＡ、ＳＴＡ、ＡＲＡ、ＤＨＡ、およびＥＰＡを含有する画分の精製は、尿素、および／または分留による処置によって達成されてもよい。
好ましい実施態様の説明
ここで述べられる研究の究極の目的は、ω−３および／またはω−６ＰＵＦＡが濃縮された油を蓄積する油性酵母菌の開発である。このような目的で、これらの宿主における好ましいＰＵＦＡの合成および高い蓄積を可能にするために、油性酵母菌において効率的に機能するデサチュラーゼが同定されなくてはならない。効率的なデサチュラーゼの同定はまた、宿主細胞中で生成されるω−３とω−６ＰＵＦＡの比率の操作のためにも必要である。
以前の研究で、出願人らは天然ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Δ１２デサチュラーゼを単離して、このタンパク質を過剰発現し、野生型細胞と比べて、増大したオレイン酸からＬＡへの転換をもたらした（参照によってその全体をここに援用する米国特許出願第１０／８４０３２５号参照、ここでの実施例２および配列番号５１および５２もまた参照されたい）。具体的には野生型ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）におけるわずか５９％の基質転換百分率（（［１８：２］／［１８：１＋１８：２］）＊１００として測定された）とは対照的に、形質転換された細胞中における基質転換百分率は７４％であった。しかしこれらの宿主細胞において観察されたＬＡの増大した可用性にもかかわらず、より多量のオレイン酸からＬＡへの転換を可能にする、Δ１２デサチュラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を同定することが望ましかった。これはＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）形質転換体細胞中における多様なω−３および／またはω−６ ＰＵＦＡ（例えばＧＬＡ、ＤＧＬＡ、ＡＲＡ、ＡＬＡ、ＳＴＡ、ＥＴＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡ、およびＤＨＡ）の高レベル合成のための基質としてのＬＡの増大する可用性を可能にする。したがって高レベルのΔ１２デサチュラーゼ活性を有する異種タンパク質の発現は、生物体の経路エンジニアリングにおいて有利であった。
これらの目標を達成するために、本発明で出願人らは、Δ１２デサチュラーゼ酵素をコードするフザリウム・モニリフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）からＤＮＡ断片を単離しクローニングした（配列番号３および４）。この遺伝子のΔ１２デサチュラーゼとしての活性の確認は、以下に基づいて提供された。１．）天然Δ１２デサチュラーゼ遺伝子が中断されたヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株におけるフザリウム・モニリフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）遺伝子発現に際しての（相補を通じた）ＬＡ生合成回復、および２．）Ｆ．モニリフォルメ（Ｆ．ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）遺伝子を発現する野生型Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）細胞中におけるＬＡの過剰生成（実施例６）。
しかし上述の実験は、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中において１８：２を生成する上で、Ｆ．モニリフォルメ（Ｆ．ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）Δ１２デサチュラーゼが、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Δ１２デサチュラーゼよりも効率的であるという意外な発見をもたらした（実施例６、表１１参照）。具体的には、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中におけるＴＥＦプロモーターの制御下のＦ．モニリフォルメ（Ｆ．ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）Δ１２デサチュラーゼ発現は、これまでにＴＥＦプロモーターの制御下で、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Δ１２デサチュラーゼをコードするキメラ遺伝子の発現によって達成された（５９％のＬＡ生成物蓄積）よりも高レベルの１８：２を生成する（６８％のＬＡ生成物蓄積）と判定された。これはそれぞれ８５％対７４％の基質転換百分率（（［１８：２］／［１８：１＋１８：２］）＊１００として計算される）の差に相当する。さらにＦ．モニリフォルメ（Ｆ．ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）Δ１２デサチュラーゼは、これまでに報告されたいかなる既知のΔ１２デサチュラーゼよりもはるかに効率的に機能した（例えばＳ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中におけるニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）Δ１２デサチュラーゼの過剰発現に際しては、わずか６８％のオレイン酸から１８：２への基質転換が達成される［国際公開第２００３／０９９２１６号パンフレット］）。
これらの結果に基づいて、ω−３および／またはω−６ ＰＵＦＡが豊富な油を蓄積する油性酵母をエンジニアリングする手段として、本真菌Ｆ．モニリフォルメ（Ｆ．ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）Δ１２デサチュラーゼの発現は、その他の知られているΔ１２デサチュラーゼに比べて好ましい（しかし当業者は、例えばコドン最適化に続いて、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中で、Ｆ．モニリフォルメ（Ｆ．ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）Δ１２デサチュラーゼ活性が向上できることを予期するであろう）。
さらに出願人らはまた、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）、マグナポルテ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）、ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）、フザリウム・グラミネアルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅａｒｉｕｍ）、アスペルギルス・フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、およびアスペルギルス・フラバス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｕｓ）（すなわち配列番号８、１２、１６、２０、２１、および２２）から、上述のフザリウム・モニリフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）タンパク質とオルソロガスな一揃いのΔ１２デサチュラーゼも同定した。これらのタンパク質（フザリウム・モニリフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）Δ１２デサチュラーゼ（配列番号４）を含む）は、ここで配列番号５２（同時係属米国特許出願第１０／８４０３２５号で特徴付けられる）として同定されたＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Δ１２デサチュラーゼの相同体としての全てのタンパク質の同一性にもかかわらず、「亜科１」（すなわち同時係属米国特許仮出願第６０／５１９１９１号明細書でΔ１５デサチュラーゼとして同定された、配列番号２、６、１０、１４、および１８）にクラスター化するタンパク質とはっきり区別される、タンパク質の明確な亜科（ここで「亜科２」と称される）にクラスター化した。全体的に亜科２のタンパク質（ここでΔ１２デサチュラーゼとして同定され、国際公開第０３／０９９２１６号パンフレットにおけるΔ１２デサチュラーゼとしてのニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）タンパク質の機能特徴付けによって支持される）は、互いに少なくとも５６．３％の同一性を有するタンパク質群に相当し（実施例４）、それらは配列相同性によって、これまでに述べられたΔ１２デサチュラーゼとはっきり区別される。
それらが高い効率（すなわち基質転換百分率；オレイン酸からＬＡへの少なくとも約７０％の基質転換百分率が好ましく、ＬＡへの少なくとも約８０％の基質転換百分率が特に適切であり、ＬＡへの少なくとも約８５％の基質転換百分率が最も好ましい）で機能するという予想に基づいて、このユニークなクラスの真菌Δ１２デサチュラーゼは、脂肪酸組成を変更する手段として、油性酵母（例えばヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ））中における発現のために有用であることが予想された。したがって本発明の一実施態様は、油性酵母中において脂肪酸プロフィールを変更する方法であり、そこでは亜科２のΔ１２デサチュラーゼタンパク質が単独で、またはその他の脂肪酸生合成遺伝子（例えばΔ４デサチュラーゼ、Δ５デサチュラーゼ、Δ６デサチュラーゼ、Δ１２デサチュラーゼ、Δ１５デサチュラーゼ、Δ１７デサチュラーゼ、Δ９デサチュラーゼ、Δ８デサチュラーゼおよび／またはエロンガーゼ）との組み合わせで発現する。
以下の実施例において本発明をさらに定義する。これらの実施例は本発明の好ましい実施態様を示すが、例証のためにのみ提供されることを理解すべきである。上の考察およびこれらの実施例から、当業者は本発明の本質的な特性を確認でき、その精神と範囲を逸脱することなく、本発明の様々な変更と修正を実施して、それを様々な用途と条件に適合させることができる。
一般方法
実施例で使用する標準組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は、当技術分野でよく知られており、１．）サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ），Ｊ．、フリッチュ（Ｆｒｉｔｓｃｈ），Ｅ．Ｆ．およびマニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）「Ｔ．分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」第二版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（１９８９）マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）、２．）Ｔ．Ｊ．シルハビー（Ｓｉｌｈａｖｙ）、Ｍ．Ｌ．ベンナン（Ｂｅｎｎａｎ）およびＬ．Ｗ．エンクイスト（Ｅｎｑｕｉｓｔ）、「遺伝子融合実験（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｇｅｎｅ Ｆｕｓｉｏｎｓ）」（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８４）、および３．）オースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）Ｆ．Ｍ．ら「分子生物学現代プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」（Ｇｒｅｅｎｅ ＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇおよびＷｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅによる出版；１９８７）で述べられる。
細菌培養の維持および生育に適した材料および方法は、当技術分野でよく知られている。以下の実施例で使用するのに適した技術は、次で述べられる。「一般微生物学方法マニュアル（Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ」、フィリップス・ゲアハルト（Ｐｈｉｌｌｉｐｐ Ｇｅｒｈａｒｄｔ）、Ｒ．Ｇ．Ｅ．マレー（Ｒ．Ｇ．Ｅ．Ｍｕｒｒａｙ）、ラルフＮ．コスティロウ（Ｒａｌｐｈ Ｎ．Ｃｏｓｔｉｌｏｗ）、ユージーンＷ．ネスター（Ｅｕｇｅｎｅ Ｗ．Ｎｅｓｔｅｒ）、ウィリスＡ．ウッド（Ｗｉｌｌｉｓ Ａ．Ｗｏｏｄ）、ノエルＲ．クリーグ（Ｎｏｅｌ Ｒ．Ｋｒｉｅｇ）、およびＧ．ブリッグス・フィリップス（Ｇ．Ｂｒｉｇｇｓ Ｐｈｉｌｌｉｐｓ）編、米国微生物学会、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．（１９９４）または２．）トーマス（Ｔｈｏｍａｓ）Ｄ．ブロック（Ｂｒｏｃｋ）著、バイオテクノロジー：工業的微生物学テキストブック（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）第二版、Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ：Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ、ＭＡ（１９８９）。細菌細胞の生育および維持のために使用される全ての試薬および材料は、特に断りのない限り、ウィスコンシン州ミルウォーキーのアルドリッチ・ケミカルズ（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩ））、ミシガン州デトロイトのディフコ・ラボラトリーズ（ＤＩＦＣＯ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｄｅｔｒｏｉｔ、ＭＩ））、メリーランド州ゲーサーズバーグのギブコ／ＢＲＬ（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ））、またはミズーリ州セントルイスのシグマケミカル（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ））から得た。
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０細胞および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）エレクトロマックス（Ｅｌｅｃｔｒｏｍａｘ）ＤＨ１０Ｂ細胞は、カリフォルニア州カールズバッドのインビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ））から得た。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５αのマックスエフィシェンシー（Ｍａｘ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）コンピテント細胞は、メリーランド州ゲーサーズバーグのＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ））から得た。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＸＬ１−Ｂｌｕｅ）コンピテント細胞は、カリフォルニア州サンディエゴのストラタジーン社（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｏｍｐａｎｙ）（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ））から購入した。全ての大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株は、典型的にルリア・ベルターニ（Ｌｕｒｉａ Ｂｅｒｔａｎｉ）（ＬＢ）プレート上で３７℃で生育させた。
一般分子クローニングは、標準法に従って実施された（サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、同上）。オリゴヌクレオチドはシグマジェノシス（Ｓｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓ、テキサス州スプリング（Ｓｐｒｉｎｇ、ＴＸ））によって合成された。ＰＣＲ生成物は、ウィスコンシン州マディソンのプロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ））からのｐＧＥＭ−Ｔ−イージーベクター中にクローンした。
ＤＮＡ配列は、ベクターと挿入特異性プライマーの組み合わせを使用して、染料ターミネーター技術（米国特許第５，３６６，８６０号明細書、ＥＰ２７２，００７号明細書）を使用して、ＡＢＩ自動シーケンサー上に生成した。ミシガン州アンアーバーのジーンコーズ社（Ｇｅｎｅ Ｃｏｄｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ、ＭＩ））からのシーケンチャー（Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ）中で配列編集を実施した。全配列は、双方向で少なくとも２回のカバレッジを示す。遺伝的配列の比較は、ウィスコンシン州マディソンのＤＮＡＳＴＡＲ（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）からのＤＮＡＳＴＡＲソフトウェアを使用して達成された。
略語の意味は以下の通り。「ｓｅｃ」は秒を意味し、「ｍｉｎ」は分を意味し、「ｈ」は時間を意味し、「ｄ」は日を意味し、「μＬ」はマイクロリットルを意味し、「ｍＬ」はミリリットルを意味し、「Ｌ」はリットルを意味し、「μＭ」はマイクロモルを意味し、「ｍＭ」はミリモルを意味し、「Ｍ」はモルを意味し、「ｍｍｏｌ」はミリモルを意味し、「μｍｏｌｅ」マイクロモルを意味し、「ｇ」はグラムを意味し、「μｇ」はマイクログラムを意味し、「ｎｇ」はナノグラムを意味し、「Ｕ」は単位を意味し、「ｂｐ」は塩基対を意味し、「ｋＢ」はキロベースを意味する。
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の培養
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株ＡＴＣＣ番号７６９８２およびＡＴＣＣ番号９０８１２は、メリーランド州ロックビルの米国微生物系統保存機関（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）から購入した。Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ））株は、通常、２８℃においてＹＰＤ寒天（１％酵母菌抽出物、２％バクトペプトン、２％グルコース、２％寒天）上で生育させた。形質転換体選択のために最少培地（ミシガン州デトロイトのディフコ・ラボラトリーズ（ＤＩＦＣＯ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｄｅｔｒｏｉｔ、ＭＩ））からの硫酸アンモニウムを含まない、そしてアミノ酸を含まない０．１７％酵母菌窒素ベース、２％グルコース、０．１％プロリン、ｐＨ６．１）を使用した。適切ならばアデニン、ロイシン、リジン、および／またはウラシル・サプリメントを最終濃度０．０１％に添加した。
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の脂肪酸分析
ブライ（Ｂｌｉｇｈ）Ｅ．Ｇ．およびダイヤー（Ｄｙｅｒ）Ｗ．Ｊ．（Ｃａｎ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．３７：９１１〜９１７（１９５９））で述べられるように、脂肪酸分析のために細胞を遠心分離し収集して脂質を抽出した。ナトリウムメトキシド（ローガン（Ｒｏｕｇｈａｎ）Ｇ．およびニシダ（Ｎｉｓｈｉｄａ）Ｉ．Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ．２７６（１）：３８〜４６（１９９０））による脂質抽出物のエステル交換反応によって、脂肪酸メチルエステルを調製し、３０ｍ×０．２５ｍｍ（内径）ＨＰ−ＩＮＮＯＷＡＸヒューレットパッカード（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ）カラムを装着したヒューレットパッカード（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ）６８９０ ＧＣで引き続き分析した。オーブン温度は１７０℃（２５ｍｉｎ保持）から１８５℃に３．５℃／ｍｉｎで上昇させた。
直接塩基エステル転移反応のためには、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ｃｕｌｔｕｒｅ（３ｍＬ）を採取し、蒸留水中で１回洗浄して、スピードバック（Ｓｐｅｅｄ−Ｖａｃ）内で５〜１０分、真空下で乾燥させた。ナトリウムメトキシド（１００μｌの１％）をサンプルに添加して、次にサンプルをボルテックスし、２０分振盪した。３滴の１Ｍ ＮａＣｌおよび４００μｌヘキサンを添加した後、サンプルをボルテックスし遠沈した。上層を除去して、上述のようにＧＣで分析した。
実施例１
ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）発現ベクターの構築
本実施例は、プラスミドｐＹ５、ｐＹ５−１３（キメラのＴＥＦプロモーター：：ＸＰＲターミネーター遺伝子を含んでなる）、およびｐＹ５−２０（キメラのハイグロマイシン抵抗性遺伝子を含んでなる）の構築について述べる。
プラスミドｐＹ５の構築
ｐＩＮＡ５３２の誘導体であるプラスミドｐＹ５（Ｉｎｓｉｔｕｔ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｇｒｏｎｏｍｉｃｓ、Ｃｅｎｔｒｅ ｄｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ ＡｇｒｏＩｎｄｕｓｔｒｉｅｌｌｅ、ｌａｂｏｒａｔｏｉｒｅ ｄｅ Ｇｅｎｅｔｉｑｕｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｉｒｅ ｅｔ Ｃｅｌｌｕｌａｒｉｅ ＩＮＲＡ−ＣＮＲＳ、Ｆ−７８８５０、Ｔｈｉｖｅｒｖａｌ−Ｇｒｉｇｎｏｎ、Ｆｒａｎｃｅのクロード・ガィヤルダン（Ｃｌａｕｄｅ Ｇａｉｌｌａｒｄｉｎ）博士からの贈与）をヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）における異種性遺伝子発現のために構築した（図３）。
最初に、ｐＩＮＡ５３２のＡＲＳ１８配列およびＬＥＵ２遺伝子を含有する部分的に消化された３５９８ｂｐのＥｃｏＲＩ断片をカリフォルニア州サンディエゴのストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ））からのｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔのＥｃｏＲＩ部位にサブクローニングしてｐＹ２を生成した。ＴＥＦ５’（配列番号２３）およびＴＥＦ３’（配列番号２４）をプライマーとして使用して、ＰＣＲによりヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ゲノムのＤＮＡからＴＥＦプロモーターを増幅した（ミュラー（Ｍｕｌｌｅｒ）Ｓ．ら、Ｙｅａｓｔ、１４：１２６７−１２８３（１９９８））。１００ｎｇのヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ゲノムＤＮＡと、１０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．７５）、２ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）、１００μｇ／ｍＬ ＢＳＡ（最終濃度）を含有するＰＣＲ緩衝液と、各２００μＭのデオキシリボヌクレオチド三リン酸と、１０ｐｍｏｌｅの各プライマーと、カリフォルニア州サンディエゴのストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ））からの１μＬのＰｆｕＴｕｒｂｏ ＤＮＡポリメラーゼとを含有する、５０μＬの総容積でＰＣＲ増幅を実施した。増幅は以下のように実施した。９５℃で３ｍｉｎの初期変性、続いて９５℃で１ｍｉｎ、５６℃で３０ｓｅｃ、７２℃で１ｍｉｎを３５サイクル。７２℃で１０ｍｉｎの最終延長サイクルを実施し、続いて４℃での反応終結。４１８ｂｐのＰＣＲ生成物をｐＣＲ−ＢｌｕｎｔにライゲーションしてｐＩＰ−ｔｅｆを生成した。ｐＩＰ−ｔｅｆのＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＶ断片をｐＹ２のＢａｍＨＩ／ＳｍａＩ部位にサブクローニングして、ｐＹ４を生成した。
テンプレートとしてｐＩＮＡ５３２、プライマーとしてＸＰＲ５’（配列番号２５）およびＸＰＲ３’（配列番号２６）を使用して、ＰＣＲによってＸＰＲ２転写ターミネーターを増幅した。上述の構成要素および条件を使用して、ＰＣＲ増幅を５０μＬの総容積中で実施した。１７９ｂｐのＰＣＲ生成物をＳａｃＩＩで消化し、ｐＹ４のＳａｃＩＩ部位にライゲーションしてｐＹ５を生成した。したがってｐＹ５（図３に示す）は、以下を含有するヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）−大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）シャトルプラスミドとして有用である。
１．）ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）自律性複製配列（ＡＲＳ１８）、
２．）ＣｏｌＥ１プラスミド複製起点、
３．）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における選択のためのアンピシリン−抵抗性遺伝子（ＡｍｐＲ）、
４．）ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）における選択のためのヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ＬＥＵ２遺伝子、
５．）ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）における異種性コード領域発現のための翻訳延長プロモーター（ＴＥＦ）、および
６．）ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）中の異種性遺伝子発現の転写終結のための細胞外のプロテアーゼ遺伝子ターミネーター（ＸＰＲ２）。
プラスミドｐＹ５−１３およびｐＹ５−２０の構築
ｐＹ５−１３およびｐＹ５−２０をｐＹ５の誘導体として構築して、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中のサブクローニングおよび異種性遺伝子発現を容易にした。
具体的にはｐＹ５をテンプレートとして使用して、６ラウンドの部位特異的変異誘発によりｐＹ５−１３を構築した。オリゴヌクレオチドＹＬ５およびＹＬ６（配列番号２７および２８）を使用して、部位特異的変異誘発によってＳａｌＩおよびＣｌａｌＩ部位の双方をｐＹ５から除去し、ｐＹ５−５を生成した。オリゴヌクレオチドＹＬ９およびＹＬ１０（配列番号２９および３０）を使用して、部位特異的変異誘発によってＳａｌＩ部位をＬｅｕ２遺伝子とＴＥＦプロモーターとの間でｐＹ５−５に導入し、ｐＹ５−６を生成した。オリゴヌクレオチドＹＬ７およびＹＬ８（配列番号３１および３２）を使用して、ＰａｃＩ部位をＬＥＵ２遺伝子とＡＲＳ１８との間でｐＹ５−６に導入し、ｐＹ５−８を生成した。オリゴヌクレオチドＹＬ３およびＹＬ４（配列番号３３および３４）を使用して、ｃｏＩ部位をＴＥＦプロモーターの翻訳開始コドン周囲でｐＹ５−８に導入し、ｐＹ５−９を生成した。ＹＬ１およびＹＬ２オリゴヌクレオチド（配列番号３５および３６）を使用して、ｐＹ５−９のＬｅｕ２遺伝子の内側のＮｃｏＩ部位を除去し、Ｙ５−１２を生成した。最後に、オリゴヌクレオチドＹＬ６１およびＹＬ６２（配列番号３７および３８）を使用して、ＢｓｉＷＩ部位をＣｏｌＥＩとＸＰＲ領域との間でｐＹ５−１２に導入し、ｐＹ５−１３を生成した。
プラスミドｐＹ５−２０はｐＹ５の誘導体である。これはキメラのハイグロマイシン抵抗性遺伝子を含有するＮｏｔ Ｉ断片をｐＹ５のＮｏｔ Ｉ部位に挿入して構築された。キメラ遺伝子はヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＴＥＦプロモーターのコントロール下にあるハイグロマイシン抵抗性ＯＲＦを有した。
実施例２
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Δ１２デサチュラーゼのクローニングおよび内在性Δ１２デサチュラーゼ遺伝子の中断
生物体がＬＡ（１８：２）を作れるがＡＬＡ（１８：３）を作れないことを実証する、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）（ＡＴＣＣ番号７６９８２）の脂肪酸組成に基づいて、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）がおそらく、Δ１２デサチュラーゼ活性を有するが、Δ１５デサチュラーゼ活性は有さない遺伝子を含有することが想定された。したがって本実施例は、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Δ１２デサチュラーゼの部分的コード配列を単離するための変性ＰＣＲプライマーの使用、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中の天然遺伝子を中断するための部分的配列の使用、および引き続く遺伝子全長のクローニングについて述べる。
変性ＰＣＲプライマーを使用したＰＣＲによるヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）からの部分的推定Δ１２デサチュラーゼ配列のクローニング
ＤＮイージー（ＤＮｅａｓｙ）組織キット（キアジェン（Ｑｉａｇｅｎ）カタログ番号６９５０４）を使用して、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）（ＡＴＣＣ番号７６９８２）からゲノムＤＮＡを単離し、ＤＮＡ濃度０．５μｇ／μｌでキット緩衝液ＡＥ中に再懸濁した。ゲノムＤＮＡをテンプレートとして、および異なるΔ１２デサチュラーゼ間で保存されたアミノ酸配列に対して作られた数組の変性プライマーを使用して、ＰＣＲ増幅を実施した。それぞれ下の表で示されるように、上方および下方変性プライマーＰ７３およびＰ７６の組によって最良の結果を得た。
Figure 2007510436
製造業者の推奨に従って、エッペンドルフマスターサイクラー勾配サーモサイクラー内でＰＣＲを実施した。増幅を以下のようにして実施した。９５℃で１ｍｉｎの初期変性、それに続いて９５℃で３０ｓｅｃの変性、５８℃で１ｍｉｎのアニール、および７２℃で１ｍｉｎの延長を３０サイクル。７２℃で１０ｍｉｎの最終延長サイクルを実施し、それに続いて４℃での反応終結。
アガロース・ゲル電気泳動法によって、予想された（約７４０ｂｐ）サイズのＰＣＲ生成物を検出して単離、精製し、ｐＴＡベクター（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））中にクローンし、配列決定した。ＢＬＡＳＴプログラム分析（基本的局在性整合検索ツール；アルトシュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）Ｓ．Ｆ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０（１９９３））に基づいて、得られた配列は既知のΔ１２デサチュラーゼと相同性を有した。
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Δ１２デサチュラーゼ遺伝子の標的を定めた中断
ｐＹ２３Ｄ１２と命名した標的とするカセットによるΔ１２デサチュラーゼ遺伝子の相同的遺伝子組換え媒介置換によって、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ番号７６９８２中のΔ１２デサチュラーゼ遺伝子の標的を定めた中断を実施した。ｐＹ２３Ｄ１２はプラスミドｐＹ２０から誘導された（実施例１）。
具体的にはｐＹ２３Ｄ１２は、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩ断片を同様に直線化されたｐＹ２０中に挿入して作り出された。この６４２ｂｐの断片は（５’〜３’に向けて）以下から構成された。（配列番号５１中のコード配列（ＯＲＦ）の）位置＋７１８〜＋１０３１の３’相同配列、（配列番号５１中のコード配列（ＯＲＦ）の）位置＋４０３〜＋７１７のＢｇｌＩＩ制限部位、および５’相同配列。ＰＣＲプライマーＰ９９およびＰ１００（配列番号４３および４４）およびＰ１０１およびＰ１０２（配列番号４５および４６）のそれぞれの組を使用して、６４２ｂｐのＰＣＲ生成物からの３’および５’配列のＰＣＲ増幅によって断片を調製した。
ＢｇｌＩＩ制限酵素消化によってｐＹ２３Ｄ１２を直線化し、チェン（Ｃｈｅｎ）Ｄ．Ｃ．ら（Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４８（２）：２３２〜２３５（１９９７））の方法に従った酢酸リチウム法によって、対数中期Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ番号７６９８２細胞に形質転換した。手短に述べると、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）をＹＰＤプレート上に画線して、３０℃でおよそ１８時間生育させた。いくつかの大型白金耳を満たす細胞をプレートからこすり取り、以下を含有する１ｍＬの形質転換緩衝液に再懸濁した。
２．２５ｍＬの５０％ＰＥＧ、平均分子量３３５０、
０．１２５ｍＬの２Ｍ酢酸Ｌｉ、ｐＨ６．０、
０．１２５ｍＬの２Ｍ ＤＴＴ、および
５０μｇの剪断サケ精子ＤＮＡ。
１００μＬの再懸濁細胞中で約５００ｎｇのプラスミドＤＮＡを培養して３９℃に１時間保ち、１５ｍｉｎ間隔でボルテックス混合した。細胞をＹＰＤハイグロマイシン選択プレート上に接種して、３０℃に２〜３日間保った。
４個のハイグロマイシン抵抗性コロニーを単離し、ＰＣＲによって標的を定めた中断についてスクリーニングした。ＰＣＲプライマー（Ｐ１１９［配列番号４７］およびＰ１２０［配列番号４８］）の１つの組をデザインし、相同遺伝子組換えに続いて特定の接合部断片を増幅した。ＰＣＲプライマー（Ｐ１２１［配列番号４９］およびＰ１２２［配列番号５０］）の別の組をデザインして、天然遺伝子を検出した。４つのハイグロマイシン抵抗性コロニーの内３つが接合部断片について陽性であり、天然断片について陰性であったので標的を定めた組み込みが確認された。
Δ１２デサチュラーゼを中断させた株における脂肪酸プロフィールの判定
Ｑ−ｄ１２Ｄと命名された中断させた株の１つにおける総脂質のＧＣ分析によって、天然Δ１２デサチュラーゼ遺伝子の中断をさらに確認した。野生型（ＡＴＣＣ番号７６９８２）およびＱ−ｄ１２Ｄの単一コロニーをそれぞれ３ｍＬの最少培地（調合物／Ｌ：２０ｇグルコース、１．７ｇ酵母菌窒素ベース、１ｇＬ−プロリン、０．１ｇＬ−アデニン、０．１ｇＬ−リジン、ｐＨ６．１）中で３０℃でＯＤ６００が約１．０になるまで生育させた。細胞を収集して蒸留水で洗浄し、高速真空乾燥させて、直接トランスエステル化してＧＣ分析した（一般方法で述べたように）。
野生型ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）および中断させたΔ１２デサチュラーゼを含んでなる形質転換体Ｑ−ｄ１２Ｄの脂肪酸プロフィールを下の表５に示す。脂肪酸は１６：０（パルミチン酸）、１６：１（パルミトレイン酸）、１８：０、１８：１（オレイン酸）および１８：２（ＬＡ）として同定され、それぞれの組成は総脂肪酸の％として表される。
Figure 2007510436
結果は、Ｑ−ｄ１２Ｄ株中の天然Δ１２デサチュラーゼ遺伝子が不活性化されたことを示唆した。したがってヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ番号７６９８２中において、１つの遺伝子のみが機能性Δ１２デサチュラーゼをコードすると結論することが可能であった。
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Δ１２デサチュラーゼ遺伝子のプラスミドレスキュー
Δ１２デサチュラーゼ遺伝子は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）アンピシリン抵抗性遺伝子および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｏｒｉもまた含有するｐＹ２３Ｄ１２ベクター全体の挿入によって中断させたので、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中の側方配列をレスキューすることが可能であった。このためにはＤＮイージー（ＤＮｅａｓｙ）組織キットを使用して、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株Ｑ−ｄ１２ＤのゲノムＤＮＡを単離した。具体的には１０μｇのゲノムＤＮＡを反応容積２００μＬ中の５０μＬの制限酵素Ａｇｅ Ｉ、Ａｖｒ ＩＩ、Ｎｈｅ Ｉ、およびＳｐｈ Ｉで消化した。消化されたＤＮＡをフェノール：クロロホルムで抽出し、４０μＬの脱イオン水に再懸濁した。３ＵＴ４ＤＮＡリガーゼを含有する２００μＬライゲーション混合物中で、消化されたＤＮＡ（１０μＬ）を自己ライゲーションさせた。ライゲーションを１６℃で１２時間実施した。ライゲーションさせたＤＮＡをフェノール：クロロホルムで抽出し、４０μＬの脱イオン水に再懸濁した。最後に１μＬの再懸濁ライゲーションＤＮＡを使用して、電気穿孔によって大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を形質転換し、アンピシリン（Ａｐ）を含有するＬＢプレート上に接種した。Ａｐ−抵抗性コロニーを単離して、ミニプレップによりプラスミドの存在について分析した。以下のインサートサイズが、回復またはレスキューされたプラスミド中に見いだされた（表６）。
Figure 2007510436
プラスミドの配列決定は、配列決定プライマーＰ９９（配列番号４３）およびＰ１０２（配列番号４６）によって開始した。
配列決定結果に基づき、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Δ１２デサチュラーゼ遺伝子をコードする遺伝子全長をアセンブルした（１９３６ｂｐ、配列番号５１）。具体的には本配列が１２５７塩基の読み取り枠（配列番号５１のヌクレオチド＋２８３〜＋１５３９）をコードし、他方推定されたアミノ酸配列は４１９個の残基の長さであった（配列番号５２）この遺伝子はまた、「Ｙｅａｓｔ Ｐｒｏｊｅｃｔ Ｇｅｎｏｌｅｖｕｒｅｓ」（Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、ＬａＢＲＩ、Ｔａｌｅｎｃｅ Ｃｅｄｅｘ、Ｆｒａｎｃｅ）（ドゥジョン（Ｄｕｊｏｎ），Ｂ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ４３０（６９９５）：３５〜４４（２００４）もまた参照されたい）の公共Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）タンパク質データベース内でＹＡＬＩ−ＣＤＳ３０５３．１として公開される。
実施例３
異種のヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）プロモーターの制御下におけるヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Δ１２デサチュラーゼＯＲＦの発現
本実施例は、キメラ遺伝子中における異種の（非Δ１２デサチュラーゼ）ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）プロモーターの制御下でのＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Δ１２デサチュラーゼＯＲＦ（実施例２から）発現について述べる。これによってΔ１２デサチュラーゼ−中断変異体の相補、および野生型Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株におけるＬＡの過剰生成が可能になる。
具体的には、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ番号７６９８２のゲノムＤＮＡからの上流プライマーＰ１４７（配列番号５３）および下流プライマーＰ１４８（配列番号５４）を使用して、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Δ１２デサチュラーゼをコードするＯＲＦをＰＣＲ増幅した。正確なサイズの（１２６０ｂｐ）断片を単離、精製し、Ｎｃｏ ＩおよびＮｏｔ Ｉで消化して、遺伝子がＴＥＦプロモーターの制御下にあるように、ＮｃｏＩ−Ｎｏｔ Ｉ ｃｕｔ ｐＹ５−１３ベクター内にクローニングした（実施例１）。ミニプレップ分析によって正確な形質転換体を確認し、得られたプラスミドをｐＹ２５−ｄ１２ｄと命名した。
実施例２で述べられる形質転換法を使用して、プラスミドｐＹ５−１３（「対照」）およびｐＹ２５−ｄ１２ｄをそれぞれ個別にＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ番号７６９８２野生型（ＷＴ）およびΔ１２−中断株（Ｑ−ｄ１２Ｄ）に形質転換した。陽性形質転換体をＢｉｏ１０１ ＤＯＢ／ＣＳＭ−Ｌｅｕプレート上で選択した。
形質転換体の単一コロニーを生育させ、一般方法で述べられるようにＧＣ分析した。結果を下の表に示す。脂肪酸は１６：０（パルミチン酸）、１６：１（パルミトレイン酸）、１８：０、１８：１（オレイン酸）、および１８：２（ＬＡ）と同定され、それぞれの組成は総脂肪酸の％で表わされる。「Ｄ１２ｄＳＣ」は以下の式に従って計算され、基質転換百分率（ＳＣ）を表す。（［１８：２］／［１８：１＋１８：２］）*１００
Figure 2007510436
結果は、ＴＥＦプロモーターを使用したＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Δ１２デサチュラーゼの発現が、内在性遺伝子が中断された株において、１８：２の生成を復元することを示した。
さらに結果は、野生型細胞におけるＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Δ１２デサチュラーゼ遺伝子の過剰発現が、増大するＬＡ生成（１８：２）レベルをもたらすことを実証した。具体的には、ＬＡの％生成物蓄積は、野生型細胞中の４７％から形質転換体細胞中の５９％に増大した（野生型中の５９％の基質転換百分率［「Ｄ１２ｄＳＣ」］から、キメラのΔ１２デサチュラーゼで形質転換された細胞中の７４％への変化に相当する）。
実施例４
糸状菌類からのΔ１２デサチュラーゼの同定
本実施例は、様々な糸状菌類中のΔ１２デサチュラーゼの同定について述べる。これらの配列は、それらのヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Δ１２デサチュラーゼ（実施例２）との相同性に基づいて同定され、それぞれの種からの配列は、系統学的分析に基づいて２つの「亜科」の１つに属する。
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Δ１２デサチュラーゼタンパク質配列（配列番号５２）を以下をはじめとする利用できる糸状菌類配列データベースに対するクエリーとして使用して、ＢＬＡＳ検索（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ；アルトシュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）Ｓ．Ｆ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０（１９９３））を実施した。１．）ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）、マグナポルテ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）およびフザリウム・グラミネアルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅａｒｉｕｍ）の公開データベース、および２．）フザリウム・モニリフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）株Ｍ−８１１４のデュポン（ＤｕＰｏｎｔ）ＥＳＴライブラリー（デラウェア州ウィルミントンのＥ．Ｉ．デュポン・ドゥ・ヌムール・アンド・カンパニー（Ｅ．Ｉ． ｄｕＰｏｎｔ ｄｅ Ｎｅｍｏｕｒｓ ａｎｄ Ｃｏ．，Ｉｎｃ．（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＤＥ））（ペンシルベニア州ユニバーシティ・パークのフザリウム研究センター（Ｆｕｓａｒｉｕｍ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐａｒｋ、ＰＡ））から入手できるＦ．モニリフォルメ（Ｆ．ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）株Ｍ−８１１４；Ｐｌａｎｔ Ｄｉｓｅａｓｅ ８１（２）：２１１〜２１６（１９９７）もまた参照されたい）。これらのＢＬＡＳＴ検索から各生物体中に、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Δ１２デサチュラーゼタンパク質の２つの相同体が同定された。下の表にこれらの各相同体に関する詳細をまとめる。
Figure 2007510436
Figure 2007510436
全ての相同体は、注釈なし、またはΔ１２デサチュラーゼまたは脂肪酸デサチュラーゼとして注釈されるのいずれかであった。さらにＦ．グラミネアルム（Ｆ．ｇｒａｍｉｎｅａｒｉｕｍ）からのヌクレオチド配列は、推定上のイントロン配列のゲノムであった。出願人らは、その他の相同体からのアミノ酸配列との比較のために、推定アミノ酸の暫定的アセンブリーを作製した。
ウィスコンシン州マディソンのＤＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ．（ＤＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ．（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ））のレーザージーン（ＬＡＳＥＲＧＥＮＥ）バイオインフォマティクス・コンピューティング・スイートのメガライン（Ｍｅｇａｌｉｇｎ）プログラム（Ｗｉｎｄｏｗｓ ３２ Ｍｅｇａｌｉｇｎ ５．０６ １９９３−２００３）を使用した、それぞれの種からのΔ１２デサチュラーゼ相同体の系統樹分析からは、意外にも２つの亜科が明らかになった。図４に示すように、Ｎｃ１、Ｍｇ１、Ｆｇ１、Ｆｍ１、およびＡｎ１は、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Δ１２デサチュラーゼに対する相同性を有するタンパク質の「亜科１」にクラスター化したのに対し、Ｆｇ２、Ｆｍ２、Ｍｇ２、Ｎｃ２、およびＡｎ２は、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Δ１２デサチュラーゼタンパク質相同体中の「亜科２」にクラスター化した。
引き続いて、下の表９に示すように、２つの追加的生物体について、単一Δ１２デサチュラーゼ相同体もまた公開配列データベース中に同定された。
Figure 2007510436
これらの追加的配列は、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Δ１２デサチュラーゼタンパク質相同体の亜科２にクラスター化した。
次にＤＮＡＳＴＡＲソフトウェアのメガライン（Ｍｅｇａｌｉｇｎ）プログラムのＣｌｕｓｔａｌ Ｗ法（緩慢、正確、Ｇｏｎｎｅｔオプション；トンプソン（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２：４６７３〜４６８０（１９９４））を使用して、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Δ１２デサチュラーゼに対する相同性を有する各タンパク質を整合した。この方法で明らかにされた％同一性を使用して、タンパク質がオルソログかどうかを判定した（図５）。さらに相同体を下の表１０（図６）に示す既知のΔ１２デサチュラーゼと比較した。
Figure 2007510436
Figure 2007510436
亜科１のタンパク質（配列番号２、６、１０、１４、および１８；図５）は、互いに少なくとも４６．２％同一であり、亜科２のタンパク質（配列番号４、８、１２、１６、２０；図５）と４５．２％未満同一である。さらに亜科２のタンパク質（配列番号４、８、１２、１６、２０；図５）は互いに少なくとも５６．３％同一である。亜科２のタンパク質と、Ｓ．プラテンシス（Ｓ．ｐｌａｔｅｎｓｉｓ）、Ｃ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）、緑藻クラミドモナス（Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）、Ｃ．ブルガリス（Ｃ．ｖｕｌｇａｒｉｓ）、Ａ．サリアナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、Ｄ．ハンセニ（Ｄ．ｈａｎｓｅｎｉｉ）、Ｍ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）、Ｍ．ルキシー（Ｍ．ｒｏｕｘｉｉ）、およびＰ．アウグスタ（Ｐ．ａｕｇｕｓｔａ）からのΔ１２デサチュラーゼとの間の最大同一性は５１．６％である（図６）。
図５または図６には示されないが、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ（前出）方法を使用して、アスペルギルス・フラバス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｕｓ）Δ１２デサチュラーゼ相同体（配列番号２２）を亜科２のその他のタンパク質（配列番号４、８、１２、１６、２０、および２１）と同様に比較した。以下の結果が得られた。アスペルギルス・フラバス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｕｓ）はＡ．フミガタス（Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）に対して７９％のタンパク質同一性を有し、Ｎ．クラッサ（Ｎ． ｃｒａｓｓａ）に対して６８．５％のタンパク質同一性を有し、Ｆ．グラミネアルム（Ｆ．ｇｒａｍｉｎｅａｒｉｕｍ）に対して６０．９％のタンパク質同一性を有し、Ｆ．モニリフォルメ（Ｆ．ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）に対して６１．８％のタンパク質同一性を有し、Ｍ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）に対して６６．１％のタンパク質同一性を有し、Ａ．ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）に対して７６％のタンパク質同一性を有する。したがって図５および６および上に提示した相同性から、Ｆ．モニリフォルメ（Ｆ．ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）とＭ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）タンパク質配列との相同性に基づいて、Ｆ．モニリフォルメ（Ｆ．ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）Δ１２デサチュラーゼ（配列番号４）は、亜科２の残りのΔ１２デサチュラーゼタンパク質（ここで配列番号４、８、１２、１６、２０、２１、および２２と定義される）と少なくとも５６．３％同一であった。
上の分析は、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Δ１２デサチュラーゼ（配列番号５２）に対する相同性を有する２つのタンパク質亜科を明らかに区別した。さらにＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）などの酵母が１８：２のみを合成できる（しかし１８：３は合成できない）のに対し、５つの各糸状菌類は１８：２および１８：３の双方を合成できることが知られている。さらにヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）から単一のΔ１２デサチュラーゼが単離されたのに対し、ほとんどの真菌はヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）Δ１２デサチュラーゼに対する２つの相同体を有した。したがって出願人らは、これらの生物体中のデサチュラーゼの亜科の１つがΔ１２デサチュラーゼ（オレイン酸からＬＡ（１８：２）への転換を可能にする）に相当し、その他がΔ１５デサチュラーゼ（ＬＡからＡＬＡ（１８：３）への転換を可能にする）に相当すると仮定した。
実施例５
亜科２のフザリウム・モニリフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）デサチュラーゼを含んでなる発現プラスミドｐＹ３５（ＴＥＦ：：Ｆｍ２）（推定上のΔ１２デサチュラーゼをコードする）の構築
本実施例は、実施例４で同定された亜科２（「Ｆｍ２」または「Ｆｍｄ１２」）のフザリウム・モニリフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）Δ１２デサチュラーゼを含んでなる、発現プラスミドの構築について述べる。具体的にはヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ＴＥＦプロモーターの制御下で、推定上のΔ１２デサチュラーゼが発現するようにキメラ遺伝子が作り出される。これによって、発現したＯＲＦが野生型株中でＬＡ生成をもたらし、Δ１２デサチュラーゼ−中断変異体を補完する能力を試験することで、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中のタンパク質活性の引き続く判定が可能になる（下記、実施例６）。
全長ｃＤＮＡをテンプレートとして含有するｃＤＮＡクローンｆｆｍ２ｃ．ｐＫ００７．ｇ１３およびｆｆｍ２ｃ．ｐｋ００１．ｐ１８を使用し、上方および下方プライマーＰ１９４（配列番号５５）およびＰ１９５（配列番号５６）を使用して、Ｆ．モニリフォルメ（Ｆ．ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）Δ１２デサチュラーゼをコードするＰＣＲを増幅した。製造業者の推奨に従って、ＴＡ Ｔａｑおよびｐｆｕポリメラーゼを使用して、エッペンドルフマスターサイクラー勾配サイクラー内でＰＣＲを実施した。増幅を以下のようにして実施した。９５℃で１分の初期変性、それに続いて９５℃で３０秒の変性、５８℃で１分のアニール、および７２℃で１分の延長を３０サイクル。７２℃で１０分の最終延長サイクルを実施し、それに続いて４℃での反応終結。
双方のテンプレートから正確なサイズの（約１４４１ｂｐ）断片を得た。キアジェン（Ｑｉａｇｅｎ）ＤＮＡ精製キットを使用してアガロース・ゲルから断片を精製し、ＮｃｏＩおよびＮｏｔＩで消化し、ＮｃｏＩおよびＮｏｔＩ ｃｕｔ ｐＹ２５−ｄ１２ｄ（実施例３）中にクローニングし、それによってＴＥＦ：：ＹｌＤ１２ｄキメラ遺伝子中のヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）Δ１２デサチュラーゼＯＲＦを置換した。これによって、ｐＹ３５と命名される８５７１ｂｐプラスミドの創造がもたらされ、それは（ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）Δ１２デサチュラーゼとは対照的に）ＴＥＦ：：Ｆｍ２キメラ遺伝子を含有した。プラスミドｐＹ３５は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）複製起点、細菌アンピシリン抵抗性遺伝子、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）Ｌｅｕ２遺伝子、およびヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）自律性複製配列（ＡＲＳ）をさらに含有した。
実施例６
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中における亜科２のフザリウム・モニリフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）デサチュラーゼを含んでなるプラスミドｐＹ３５（ＴＥＦ：：Ｆｍ２）（推定上のΔ１２デサチュラーゼをコードする）の発現
本実施例は、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中におけるプラスミドｐＹ３５（実施例５からのキメラのＴＥＦ：：Ｆｍ２遺伝子を含んでなる）の発現について述べる。具体的にはＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）野生型株中でＬＡ生成を与え、Δ１２デサチュラーゼ−中断変異体（実施例２から）を補完するその能力について、推定上のΔ１２デサチュラーゼを含んでなる発現したＦ．モニリフォルメ（Ｆ．ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）ＯＲＦの能力を試験した。
実施例２で述べられる形質転換手順を使用して、プラスミドｐＹ５（ベクター単独対照、実施例１から）、ｐＹ２５−ｄ１２ｄ（ＴＥＦ：：ＹｌＤ１２ｄ、実施例３からの「陽性対照」）、およびｐＹ３５（ＴＥＦ：：Ｆｍ２）をそれぞれ個別に、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ番号７６８９２の野生型（ＷＴ）およびΔ１２デサチュラーゼ−中断（Ｑ−ｄ１２Ｄ）株に形質転換した。Ｂｉｏ１０１ ＤＯＢ／ＣＳＭ−Ｌｅｕプレート上で形質転換体細胞を選択した。
実施例２および一般方法で述べられるようにして、野生型および形質転換体細胞の単一コロニーをそれぞれ３ｍＬの最小培地上に生育させ、採取して洗浄し、乾燥させて分析した。
野生型ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）および各形質転換体の脂肪酸プロフィールを下の表１１（２つの実験から得られた結果）に示す。脂肪酸は、１６：０（パルミチン酸）、１６：１（パルミトレイン酸）、１８：０、１８：１（オレイン酸）、１８：２（ＬＡ）、および１８：３（ＡＬＡ）として同定され、それぞれの組成は全脂肪酸の％として表される。「ｄ１２ｄ ＳＣ」は、以下の式に従って計算され（［１８：２］／［１８：１＋１８：２］）＊１００、１８：２への基質転換百分率を表す。
Figure 2007510436
Figure 2007510436
上の結果は、ここでＦｍ２と称され、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Δ１２デサチュラーゼに対する相同性を有するタンパク質の亜科２内のタンパク質として同定されるＦ．モニリフォルメ（Ｆ．ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）ＯＲＦが、Δ１２デサチュラーゼであることを実証した。この確認に基づいて出願人らは、亜科２の全ての他のメンバー（配列番号８、１２、１６、２０、２１、および２２）がΔ１２デサチュラーゼの機能を有すると予測する。
さらに結果は、意外にも、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）中におけるその活性において、フザリウム・モニリフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）Δ１２デサチュラーゼ（Ｆｍ２）が、天然Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Δ１２デサチュラーゼよりさらに効率的なことを実証した。具体的には表１１のデータと表７（実施例３）のデータとの比較は、ＷＴ ＋ ＴＥＦ：：ＹｌＤ１２ｄ細胞中におけるわずか７４％の基質転換百分率（ＳＣ）に対して、ＷＴ ＋ ＴＥＦ：：Ｆｍ２細胞中における８５％の基質転換百分率（ＳＣ）を明らかにする。同様にＱ−ｄ１２Ｄ ＋ ＴＥＦ：：Ｆｍ２細胞中における基質転換百分率は６７％であったのに対し、Ｑ−ｄ１２Ｄ ＋ ＴＥＦ：：ＹｌＤ１２ｄ細胞中における基質転換百分率はわずか５７％であった。したがってＰＵＦＡ生合成のためのその他の遺伝子（例えばΔ６デサチュラーゼ、エロンガーゼ、Δ５デサチュラーゼ、Δ１７デサチュラーゼ、Δ９デサチュラーゼ、Δ４デサチュラーゼ、Δ８デサチュラーゼ、Δ１５デサチュラーゼ）と組み合わせたフザリウム・モニリフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）Δ１２デサチュラーゼの発現は、天然Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Δ１２デサチュラーゼを使用して得られるよりも高いω−３およびω−６ ＰＵＦＡの生成をもたらすことが予想される。
実施例７
フザリウム・モニリフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）Δ１２デサチュラーゼで構築されたキメラ遺伝子を使用したヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中におけるＤＧＬＡの生成
コンストラクトｐＫＵＮＦ１２Ｔ６Ｅ（図７、配列番号５７）を生成して、４個のキメラ遺伝子（フザリウム・モニリフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）Δ１２デサチュラーゼ、Δ６デサチュラーゼ、および２つのエロンガーゼを含んでなる）を野生型ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）株ＡＴＣＣ番号２０３６２のＵｒａ３遺伝子座に組み込み、それによってＤＧＬＡの生成を可能にした。ｐＫＵＮＦ１２Ｔ６Ｅプラスミドは以下の構成要素を含有した。
Figure 2007510436
Figure 2007510436
ｐＫＵＮＦ１２Ｔ６ＥプラスミドをＡｓｃＩ／ＳｐｈＩで消化し、次に野生型Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ番号２０３６２の形質転換のために使用した（実施例２で述べられるように）。形質転換体細胞を５−フルオロウラシル−６−カルボン酸一水和物（「ＦＯＡ」）選択培地プレート（硫酸アンモニウムまたはアミノ酸なしの０．１７％酵母窒素ベース（ミシガン州デトロイトのディフコ・ラボラトリーズ（ＤＩＦＣＯ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、（Ｄｅｔｒｏｉｔ、ＭＩ）））、２％グルコース、０．１％プロリン、７５ｍｇ／Ｌウラシル、７５ｍｇ／Ｌウリジン、２０ｇ／Ｌ寒天および８００ｍｇ／Ｌ ＦＯＡ（カリフォルニア州オレンジのチモリサーチ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐ．（Ｏｒａｎｇｅ、ＣＡ９２８６７）））上に播種して、３０℃に２〜３日維持した。ＦＯＡ抵抗性コロニーを選択し、最小培地（２０ｇ／Ｌグルコース、アミノ酸なしの１．７ｇ／Ｌ酵母窒素ベース、１ｇ／Ｌ Ｌ−プロリン、０．１ｇ／Ｌ Ｌ−アデニン、０．１ｇ／Ｌ Ｌ−リジン、ｐＨ６．１）または最小培地プラス０．０１％ウラシル（「ＭＭＵ」）のいずれかを含んでなる選択プレート上に画線培養した。ＭＭＵプレート上で生育できるが、最小培地プレート上で生育できないコロニーをＵｒａ−株として選択した。次にＵｒａ−株の単一コロニーを３０℃の液体ＭＭＵに接種して、２５０ｒｐｍ／分で２日間振盪した。
ＧＣ分析（一般方法で述べられるような）からは、ｐＫＵＮＦ１２Ｔ６Ｅの４つのキメラ遺伝子を含有する形質転換体中におけるＤＧＬＡの存在が示されたが、野生型ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）対照株中には示されなかった。選択された３２Ｕｒａ−株のほとんどは、総脂質の約６％のＤＧＬＡを生成した。２つの株は、総脂質の約８％のＤＧＬＡを生成した。
実施例８
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中における発現のためのコドン最適化されたΔ１２デサチュラーゼ遺伝子の合成
ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）コドン使用頻度パターン、ＡＴＧ翻訳開始コドン周囲の共通配列、およびＲＮＡ安定性の一般法則（グアニヨギ（Ｇｕｈａｎｉｙｏｇｉ）、Ｇ．およびＪ．ブルーアー（Ｂｒｅｗｅｒ）、Ｇｅｎｅ ２６５（１〜２）：１１〜２３（２００１））に従って、フザリウム・モニリフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）ＤＮＡ配列（配列番号３）に基づいて、コドン最適化されたΔ１２デサチュラーゼ遺伝子をデザインする。
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中における好ましいコドン使用頻度の判定
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中のコドン使用頻度を表１３に示す。これは国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）公共データベースにあるヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）のおよそ１００遺伝子のコード領域に基づく。１２１,１６７ｂｐを含んでなるこれらの遺伝子のコード領域をＤＮＡＳｔａｒのＥｄｉｔｓｅｑプログラムによって、対応する４０,３８９アミノ酸に翻訳し、表にして、表１３に示すＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）コドン使用頻度プロフィールを判定した。「Ｎｏ．」と題されたカラムは、４０,３８９個のアミノ酸のサンプルにおいて、特定のコドンが特定のアミノ酸をコードする回数を指す。「％」と題されたカラムは、特定のコドンが特定のアミノ酸をコードする頻度を指す。太字で示されるエントリーはヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）において好まれるコドンを表す。
Figure 2007510436
合成されコドン最適化されたΔ１２デサチュラーゼは、当業者に既知の方法によって作られる。
Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中における遺伝子発現のさらなる最適化のために、７９遺伝子の「ＡＴＧ」開始コドン周囲の共通配列を調べた。分析された遺伝子の７７％が−３位（翻訳開始コドン（ＡＴＧ）の第１の「Ａ」を＋１と標識する）に「Ａ」を有し、この位置における「Ａ」に対する強力な優先度が示唆される。−４、−２および−１位における「Ａ」または「Ｃ」、＋５位における「Ａ」、「Ｃ」または「Ｔ」、そして＋６位における「Ｇ」または「Ｃ」に対する優先度もある。したがってＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中の遺伝子の最適発現のためのコドン最適化された翻訳開始部位の好ましい共通配列は「ＭＡＭＭＡＴＧＮＨＳ」（配列番号６６）であり、ここで使用される核酸縮重コードは、Ｍ＝Ａ／Ｃ、Ｓ＝Ｃ／Ｇ、Ｈ＝Ａ／Ｃ／Ｔ、およびＮ＝Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｔ。
当業者は上に提供した情報を容易に使用して、ここで提供されるフザリウム・モニリフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）Δ１２デサチュラーゼ配列に基づいて、コドン最適化されたΔ１２デサチュラーゼ遺伝子を合成できるであろう。
油性酵母中における脂質蓄積の生化学的機序の概略図を示す。 ω−３およびω−６脂肪酸生合成経路を図示する。 ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中における遺伝子発現のためのプラスミドベクターｐＹ５の構築を図示する。 メガライン（Ｍｅｇａｌｉｇｎ）ＤＮＡＳＴＡＲソフトウェアを使用して作製された、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Δ１２デサチュラーゼ酵素に対する相同性を有する、異なる糸状菌類（すなわちアスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）、フザリウム・モニリフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）、Ｆ．グラミネアルム（Ｆ．ｇｒａｍｉｎｅａｒｉｕｍ）、マグナポルテ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）、およびニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ））からのタンパク質の系統樹を示す。 Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ分析（ＤＮＡＳＴＡＲソフトウェアのメガライン（Ｍｅｇａｌｉｇｎ）プログラム）を使用した、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Δ１２デサチュラーゼ酵素に対する相同性を有する異なる糸状菌（すなわちアスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）、フザリウム・モニリフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）、Ｆ．グラミネアルム（Ｆ．ｇｒａｍｉｎｅａｒｉｕｍ）、マグナポルテ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）、およびニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ））からのタンパク質間のペア比較（％同一性）を示す。 Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ分析（ＤＮＡＳＴＡＲソフトウェアのメガライン（Ｍｅｇａｌｉｇｎ）プログラム）を使用した、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Δ１２デサチュラーゼ、およびいくつかのその他の真菌および非真菌種からのΔ１２デサチュラーゼタンパク質に対する相同性を有する異なる糸状菌からのタンパク質間のペア比較（％同一性）を示す。 ｐＫＵＮＦ１２Ｔ６Ｅのプラスミドマップを提供する。

Claims (28)

  1. （ａ）配列番号４に記載のアミノ酸配列をコードする単離された核酸断片、
    （ｂ）０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで６５℃、および２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗浄後、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳというハイブリダイゼーション条件下で（ａ）とハイブリダイズする単離された核酸断片、または
    （ａ）または（ｂ）と相補である単離された核酸断片
    からなる群から選択される、真菌Δ１２デサチュラーゼ酵素をコードする単離された核酸断片。
  2. 配列番号３に記載の請求項１に記載の単離された核酸断片。
  3. フザリウム・モニリフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）から単離された請求項１に記載の単離された核酸断片。
  4. 配列番号３に記載の配列を有する核酸断片と比較した場合に、Ｃｌｕｓｔａｌ法によるアライメントに基づいて少なくとも８９．２％の同一性を有するΔ１２デサチュラーゼ酵素をコードする第１のヌクレオチド配列、
    または第１のヌクレオチド配列の相補体を含んでなる第２のヌクレオチド配列
    を含んでなる単離された核酸断片。
  5. 配列番号４に記載の配列を有するポリペプチドと比較した場合に、Ｃｌｕｓｔａｌ法によるアライメントに基づいて少なくとも９５％の同一性を有する、少なくとも４７７個のアミノ酸があるΔ１２デサチュラーゼ酵素をコードする第１のヌクレオチド配列、
    または第１のヌクレオチド配列の相補体を含んでなる第２のヌクレオチド配列
    を含んでなる単離された核酸断片。
  6. 適切な制御配列に作動的に結合された請求項１〜４のいずれか一項に記載の単離された核酸断片を含んでなるキメラ遺伝子。
  7. 請求項１〜４のいずれか一項に記載の単離された核酸断片を含んでなる、形質転換宿主細胞。
  8. 細菌、植物、藻類、真菌、および酵母からなる群から選択される請求項７に記載の形質転換宿主細胞。
  9. 酵母が油性酵母である請求項８に記載の形質転換宿主細胞。
  10. 油性酵母が、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）、およびリポミセス（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ）からなる群から選択される請求項９に記載の形質転換宿主細胞。
  11. ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）が、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ番号２０３６２、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ番号８８６２、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ番号１８９４４、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ番号７６９８２、およびヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＬＧＡＭＳ（７）１からなる群から選択される請求項１０に記載の形質転換宿主細胞。
  12. ａ）（ｉ）配列番号４に記載の配列を有するポリペプチドと比較した場合に、Ｃｌｕｓｔａｌ法によるアライメントに基づいて少なくとも５６．３％の同一性を有するΔ１２デサチュラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする単離された核酸断片、および
    （ｉｉ）オレイン酸供給源
    を含んでなる油性酵母を提供する工程と、
    ｂ）Δ１２デサチュラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸断片が発現し、かつオレイン酸がリノール酸に転換される条件下で、工程（ａ）の酵母を生育させる工程と、
    ｃ）任意に工程（ｂ）のリノール酸を回収する工程
    を含んでなるリノール酸の製造方法。
  13. Δ１２デサチュラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする単離された核酸断片が、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・フラバス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｕｓ）、アスペルギルス・フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、マグナポルテ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）、ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）、フザリウム・グラミネアルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅａｒｉｕｍ）、およびフザリウム・モニリフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）からなる群から選択される真菌から単離される請求項１２に記載の方法。
  14. Δ１２デサチュラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする単離された核酸断片が、配列番号４、８、１２、１６、２０、２１、および２２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する請求項１３に記載の方法。
  15. Δ１２デサチュラーゼ活性を有するポリペプチドが、オレイン酸からリノール酸への少なくとも約７０％の基質転換百分率をもたらす請求項１２に記載の方法。
  16. Δ１２デサチュラーゼ活性を有するポリペプチドが、オレイン酸からリノール酸への少なくとも約８０％の基質転換百分率をもたらす請求項１２に記載の方法。
  17. Δ１２デサチュラーゼ活性を有するポリペプチドが、オレイン酸からリノール酸への少なくとも約８５％より大きい基質転換百分率をもたらす請求項１２に記載の方法。
  18. ａ）（ｉ）配列番号４に記載の配列を有するポリペプチドと比較した場合に、Ｃｌｕｓｔａｌ法によるアライメントに基づいて少なくとも５６．３％の同一性を有するΔ１２デサチュラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする単離された核酸断片、および
    （ｉｉ）機能性ω−３／ω−６脂肪酸生合成経路をコードする遺伝子
    を含んでなる油性酵母を提供する工程と、
    ｂ）オレイン酸を含んでなるデサチュラーゼ基質源を提供する工程と、
    ｃ）多価不飽和脂肪酸が生成する条件下で、工程（ａ）の油性酵母を（ｂ）のデサチュラーゼ基質と共に生育させる工程と、
    ｄ）任意に工程（ｃ）の多価不飽和脂肪酸を回収する工程
    を含んでなる、多価不飽和脂肪酸の製造方法。
  19. 多価不飽和脂肪酸がω−３およびω−６脂肪酸からなる群から選択される請求項１８に記載の方法。
  20. Δ１２デサチュラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする単離された核酸断片が、請求項１〜５のいずれか一項に記載の核酸断片によってコードされる請求項１８に記載の方法。
  21. Δ１２デサチュラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする単離された核酸断片が、配列番号４、８、１２、１６、２０、２１、および２２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１８に記載の方法。
  22. 機能性ω−３／ω−６脂肪酸生合成経路をコードする遺伝子が、Δ６デサチュラーゼ、エロンガーゼ、Δ５デサチュラーゼ、Δ４デサチュラーゼ、Δ１５デサチュラーゼ、Δ９デサチュラーゼ、Δ８デサチュラーゼ、Δ９エロンガーゼ、およびΔ１７デサチュラーゼからなる群から選択される酵素をコードする請求項１８に記載の方法。
  23. ω−３およびω−６脂肪酸が、リノール酸、γ−リノレン酸、エイコサジエン酸、ジホモ−γ−リノレン酸、アラキドン酸、α−リノレン酸、ステアリドン酸、エイコサトリエン酸、エイコサテトラエン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサペンタエン酸、およびドコサヘキサエン酸からなる群から選択される請求項１８に記載の方法。
  24. 油性酵母が、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）種、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）種、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）種、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）種、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）種、およびリポミセス（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ）種からなる群から選択される請求項１２または１８のいずれか一項に記載の方法。
  25. ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）種が、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ番号２０３６２、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ番号８８６２、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ番号１８９４４、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ番号７６９８２、およびヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＬＧＡＭＳ（７）１からなる群から選択される請求項２４に記載の方法。
  26. 請求項１２または１８のいずれかに記載の方法によって生成される微生物油。
  27. （ａ）ゲノムライブラリーを請求項１に記載の核酸断片でプローブする工程と、
    （ｂ）請求項１に記載の核酸断片とハイブリダイズするＤＮＡクローンを同定する工程と、
    （ｃ）工程（ｂ）で同定されたクローンを含んでなるゲノムの断片を配列決定する工程を含んでなり、かつ、
    配列決定したゲノムの断片がΔ１２デサチュラーゼ酵素をコードする、Δ１２デサチュラーゼ酵素をコードする核酸断片を得る方法。
  28. （ａ）配列番号３に記載の配列の部分に対応する少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーを合成する工程と、
    （ｂ）クローニングベクター中に存在する挿入断片を工程（ａ）のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して増幅する工程を含んでなり、
    増幅された挿入断片が、Δ１２デサチュラーゼ酵素をコードするアミノ酸配列の部分をコードする、かつ、
    Δ１２デサチュラーゼ酵素をコードする核酸断片を得る方法。
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