JP2008524984A - 油性生物体中の多価不飽和脂肪酸および含油量変更のためのジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ - Google Patents
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- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
(a)配列番号14および18よりなる群から選択されるアミノ酸配列をコードする単離された核酸分子、
(b)0.1×SSC、0.1%SDSで65℃、および2×SSC、0.1%SDSで洗浄、次いで0.1×SSC、0.1%SDSのハイブリダイゼーション条件下で(a)とハイブリダイズする単離された核酸分子、または
(c)(a)または(b)と完全に相補である単離された核酸分子
よりなる群から選択される、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ−1酵素をコードする単離された核酸分子を提供する。
(a)配列番号16に記載のアミノ酸配列をコードする単離された核酸分子、
(b)0.1×SSC、0.1%SDSで65℃、および2×SSC、0.1%SDSで洗浄、次いで0.1×SSC、0.1%SDSのハイブリダイゼーション条件下で(a)とハイブリダイズする単離された核酸分子、または
(c)(a)または(b)と完全に相補である単離された核酸分子
よりなる群から選択されるアシル−CoA:ステロール−アシルトランスフェラーゼをコードする単離された核酸分子を提供する。
a)配列番号31、
b)配列番号32、
c)配列番号33、
d)配列番号34、
e)配列番号35、
f)配列番号36、
g)配列番号37、
h)配列番号23、
i)配列番号24、
j)配列番号25、
k)配列番号26、
l)配列番号27、
m)配列番号28、
n)配列番号29、および
o)配列番号30よりなる群から選択されるアミノ酸モチーフ配列をコードする単離された核酸分子を提供する。
a)配列番号31、
b)配列番号32、
c)配列番号33、
d)配列番号34、
e)配列番号35、
f)配列番号36、
g)配列番号37、
h)配列番号23、
i)配列番号24、
j)配列番号25、
k)配列番号26、
l)配列番号27、
m)配列番号28、
n)配列番号29、および
o)配列番号30よりなる群から選択されるアミノ酸モチーフ配列を提供する。
(a)(i)適切な制御配列の制御下にある配列番号14、18、19、20、21、および22よりなる群から選択される、アミノ酸配列を有するジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ−1酵素をコードする少なくとも1つの遺伝子、および
(ii)脂肪酸供給源
を含んでなる、形質転換された宿主細胞を準備し、
(b)ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ−1酵素をコードする少なくとも1つの遺伝子が発現する条件下でステップ(a)の細胞を生育させて、脂肪酸をトリアシルグリセロールに転移させ、
(c)ステップ(b)のトリアシルグリセロールを場合により回収すること
を含んでなる形質転換された宿主細胞中のトリアシルグリセロール含量の増大方法を提供する。
(a)(i)機能性ω−3/ω−6脂肪酸生合成経路をコードする遺伝子、
(ii)適切な制御配列の制御下にある配列番号14、18、19、20、21、および22よりなる群から選択されるアミノ酸配列を有するジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ−1酵素をコードする少なくとも1つの遺伝子
を含んでなる形質転換された宿主細胞を準備し、
(b)(i)および(ii)の遺伝子が発現する条件下でステップ(a)の細胞を生育させて、少なくとも1つのω−3またはω−6脂肪酸の生産、およびそのトリアシルグリセロールへの転移がもたらされ、
(c)ステップ(b)のトリアシルグリセロールを場合により回収すること
を含んでなる形質転換された宿主細胞中のトリアシルグリセロールのω−3またはω−6脂肪酸含量の増大方法を提供する。
(a)(i)適切な制御配列の制御下にある、
1)配列番号31、
2)配列番号32、
3)配列番号33、
4)配列番号34、
5)配列番号35、
6)配列番号36、および
7)配列番号37に記載のアミノ酸モチーフの全てを含んでなる、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ−1酵素をコードする少なくとも1つの遺伝子、および
(ii)脂肪酸供給源
を含んでなる形質転換宿主細胞を準備し、
(b)ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ−1酵素をコードする少なくとも1つの遺伝子が発現し、脂肪酸をトリアシルグリセロールに転移させる条件下で、ステップ(a)の細胞を生育させ、
(c)ステップ(b)のトリアシルグリセロールを場合により回収すること
を含んでなる形質転換宿主細胞中のトリアシルグリセロール含量の増大方法を提供する。
(a)(i)適切な制御配列の制御下にある、
1)配列番号23、
2)配列番号24、
3)配列番号25、
4)配列番号26、
5)配列番号27、
6)配列番号28、
7)配列番号29、および
8)配列番号30に記載のアミノ酸モチーフの全てを含んでなる、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ−1酵素をコードする少なくとも1つの遺伝子、および
(ii)脂肪酸供給源
を含んでなる形質転換宿主細胞を準備し、
(b)ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ−1酵素をコードする少なくとも1つの遺伝子が発現し、脂肪酸をトリアシルグリセロールに転移させる条件下で、ステップ(a)の細胞を生育させ、
(c)ステップ(b)のトリアシルグリセロールを場合により回収すること
を含んでなる形質転換宿主細胞中のトリアシルグリセロール含量の増大方法を提供する。
(a)(i)機能性のω−3/ω−6脂肪酸生合成経路をコードする遺伝子、および
(ii)適切な制御配列の制御下にある、
1)配列番号31、
2)配列番号32、
3)配列番号33、
4)配列番号34、
5)配列番号35、
6)配列番号36、および
7)配列番号37に記載のアミノ酸モチーフの全てを含んでなる、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ−1酵素をコードする少なくとも1つの遺伝子
を含んでなる形質転換宿主細胞を準備し、
(b)(i)および(ii)の遺伝子が発現し、少なくとも1つのω−3またはω−6脂肪酸の生成、およびそのトリアシルグリセロールへの転移がもたらされる条件下で、ステップ(a)の細胞を生育させ、
(c)ステップ(b)のトリアシルグリセロールを場合により回収すること
を含んでなる形質転換宿主細胞中のトリアシルグリセロールのω−3またはω−6脂肪酸含量の増大方法を提供する。
(a)(i)機能性のω−3/ω−6脂肪酸生合成経路をコードする遺伝子、および
(ii)適切な制御配列の制御下にある、
1)配列番号23、
2)配列番号24、
3)配列番号25、
4)配列番号26、
5)配列番号27、
6)配列番号28、
7)配列番号29、および
8)配列番号30に記載のアミノ酸モチーフの全てを含んでなる、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ−1酵素をコードする少なくとも1つの遺伝子
を含んでなる形質転換宿主細胞を準備し、
(b)(i)および(ii)の遺伝子が発現し、少なくとも1つのω−3またはω−6脂肪酸の生成、およびそのトリアシルグリセロールへの転移がもたらされる条件下で、ステップ(a)の細胞を生育させ、
(c)ステップ(b)のトリアシルグリセロールを場合により回収すること
を含んでなる形質転換宿主細胞中のトリアシルグリセロールのω−3またはω−6脂肪酸含量の増大方法を提供する。
(a)ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ−1活性を有することが疑われるポリペプチドのアミノ酸配列を得て、
(b)ステップ(a)のポリペプチドのアミノ酸配列中で、
1)配列番号31、
2)配列番号32、
3)配列番号33、
4)配列番号34、
5)配列番号35、
6)配列番号36、および
7)配列番号37に記載のアミノ酸モチーフ配列の全ての存在を同定すること
を含んでなり、
ポリペプチド中のステップ(a)のモチーフ配列の全ての存在が、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ−1活性の徴候である、
ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ−1活性を有するポリペプチドの同定法を提供する。
(a)ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ−1活性を有することが疑われる真菌ポリペプチドのアミノ酸配列を得て、
(b)ステップ(a)のポリペプチドのアミノ酸配列中で、
1)配列番号23、
2)配列番号24、
3)配列番号25、
4)配列番号26、
5)配列番号27、
6)配列番号28、
7)配列番号29、および
8)配列番号30に記載のアミノ酸モチーフ配列の全ての存在を同定すること
を含んでなり、
ポリペプチド中のステップ(a)モチーフ配列の全ての存在が、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ−1活性の徴候である、
ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ−1活性を有する真菌ポリペプチドの同定法を提供する。
本願明細書の一部を形成する以下の詳細な説明および添付の配列説明によって、本発明をより完全に理解できるであろう。
本開示中では、いくつかの用語および略語を使用する。以下の定義が提供される。
一般に油性微生物中の脂質の蓄積は、増殖培地中に存在する全体的な炭素と窒素の比率に応答してトリガーされる(図1)。細胞が利用できる窒素供給を消耗した場合(例えば炭素と窒素の比率が約40を超える場合)、細胞アデノシン一リン酸(AMP)の枯渇は、ミトコンドリア中のAMP−依存イソクエン酸デヒドロゲナーゼ活性の休止、およびクエン酸の蓄積、クエン酸の細胞質ゾル内への輸送、そして引き続くATPクエン酸リアーゼによるクエン酸の切断をもたらして、アセチル−CoAおよびオキサロ酢酸が生成する。アセチル−CoAは、脂肪酸の新規(de novo)生合成の主要構成ブロックである。効果的にアセチル−CoAに代謝されることができるあらゆる化合物が、脂肪酸前駆物質の役割を果たせるが、このタイプの反応ではグルコースが炭素の主な供給源である(図1)。グルコースは解糖を通じてピルビン酸に変換され、次にピルビン酸はミトコンドリア中に輸送され、そこでピルビン酸デヒドロゲナーゼ(「PD」)によってアセチル−CoAに変換される。アセチル−CoAはミトコンドリア膜を越えて細胞質中に直接輸送できないので、アセチル−CoAからの2個の炭素がオキサロ酢酸と縮合して、クエン酸を生成する(クエン酸合成酵素によって触媒される)。クエン酸は細胞質内に直接輸送されて、そこでATP−クエン酸リアーゼによって切断され、アセチル−CoAおよびオキサロ酢酸が再生する。オキサロ酢酸はリンゴ酸への変換を通じて、トリカルボン酸サイクルに再び入る。
1.アセチル−CoAおよびマロニル−CoAが、FASのアシルキャリアペプチド(ACP)に転移される。次にアセチル基がマロニル基に転移されて、β−ケトブチリル−ACPが形成し、CO2が放出される。
2.β−ケトブチリル−ACPが還元(β−ケトアシル還元酵素による)および脱水(β−ヒドロキシアシルデヒドラターゼによる)を被り、trans−単不飽和脂肪アシル基が形成する。
3.二重結合がNADPHによって還元され、最初のものよりも炭素が2個分長い飽和脂肪−アシル基が生じる。次に新しいマロニル基と縮合して、延長プロセスを繰り返すブチリル基の能力が再生する。
4.脂肪アシル基が炭素16個の長さになったら、チオエステラーゼ活性がそれを加水分解して遊離パルミチン酸(16:0)を放出する。
DGAT1をコードする遺伝子
歴史的に、(アシル−CoA基がアシル−CoAからDAGのsn−3位に転移してTAGを形成する、第3のアシルトランスフェラーゼ反応に関与する)DGAT1が、特異的にTAG合成に関与する唯一の酵素と考えられていた。この酵素は、アシル−CoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼ(ACAT)と相同的であることが知られていた。しかし最近の研究から、ACAT遺伝子ファミリーとは関係のないDAGアシルトランスフェラーゼの新しいファミリー(DAG AT)が同定されている。したがって命名法は今や、ACAT遺伝子ファミリーに関連性があるDAG AT酵素(DGAT1ファミリー)と、関連性のないもの(DGAT2ファミリー)との間で区別する(ラルディザバル(Lardizabal)ら著、「J.Biol.Chem.」276(42):38862〜28869頁(2001年))。
DGAT2ファミリーのメンバーは、全ての主要な真核生物門(真菌、植物、動物、および基底真核生物)に存在するようである。したがってDGAT2酵素をコードする多くの遺伝子が遺伝的手段を通じて同定されており、これらの遺伝子のいくつかのDNA配列は公的に入手できる。例えばいくつかの制限を意図しない例としては、以下のジェンバンク登録番号が挙げられる。NC_001147(遺伝子座NP_014888(サッカロミセス・セレヴィシエ(Saccharomyces cerevisiae)))、NM_012079(ヒト)、NM_127503、AF051849およびAJ238008(シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana))、NM_026384、NM_010046およびAB057816(マウス)、AY093657(ブタ)、AB062762(ラット)、AF221132(エレガンス線虫(Caenorhabditis elegans))、AF391089およびAF391090(クサレケカビ・ラマニアナ(Mortierella ramanniana))、AF129003(タバコ(Nicotiana tabacum))、そしてAF251794およびAF164434(アブラナ(Brassica napus))。さらに特許文献は、DGAT2遺伝子の多くのさらに別のDNA配列(および/または上のいくつかの遺伝子に関連した詳細とそれらの単離法)を提供する。例えばケーシズ(Cases)らの米国特許出願公開第2003/124126号明細書、バナーズ(Banas)らの国際公開第2001/034814号パンフレット、およびラルディザバル(Lardizabal)らの米国特許出願公開第2003/115632号明細書、米国特許出願公開第2003/0028923号明細書、および米国特許出願公開第2004/0107459号明細書を参照されたい。ラルディサバル(Lardizabal)らの研究は、例えばクサレケカビ・ラマニアナ(Mortierella ramanniana)、ニューロスポラ・クラッサ(Neurospora crassa)、サッカロミセス・セレヴィシエ(Saccharomyces cerevisiae)、オオムギ(Hordeum vulgare)、トウモロコシ(Zea mays)、ダイズ(Glycine max)、コムギ(Triticum aestivum)、ショウジョウバエ(Drosophila)、ヒト(Homo sapiens)、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)、およびシロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)からのDGAT2のDNA配列を含む。
ダルキビスト(Dahlqvist)ら(「Proc.Nat.Acad.Sci.」(USA)97:6487〜6492頁(2000年))およびエルカース(Oelkers)ら(「J.Biol.Chem.」275:15609〜15612頁(2000年))によって最近発見されたように、TAG合成はアシル−CoA−非依存性PDAT酵素を通じてアシル−CoAの不在下でもまた起きることができる。具体的にはPDATがホスファチジルコリン基質のsn−2位からアシル基を除去して、DAGのsn−3位に転移させてTAGを生じる。そしてPDATの機能はDGAT2程にはよく特性決定されていないが、PDATは、いくつかの油料種子においてリン脂質から「異常な」脂肪酸を除去する上で主要な役割を果たすと見なされている(バナーズ(Banas),A.ら著、Biochem.Soc.Trans.28(6):703〜705頁(2000年))。
酵母中のステロールのエステル化プロセスは、最初にH.ヤン(Yang)ら(「Science.」272(5266):1353〜1356頁(1996年))によって研究され、そこでは2つの遺伝子(ARE1およびARE2)が、コレステロールをエステル化させるACAT関連酵素をコードすることが発見された。わずか2、3のARE2遺伝子のDNA配列が公的に入手できる。例えばジェンバンク登録番号Q876L2(サッカロミセスバヤヌ(Saccharomyces bayanus))、P53629(S.セレヴィシエ(S.cerevisiae))、およびQ10269(シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe))を参照されたい。
S.セレヴィシエ(S.cerevisiae)では、4つの遺伝子(すなわちARE1、ARE2、DGA1[DGAT2をコードする]、およびLRO1[PDATをコードする])が油生合成に寄与する。PDATおよびDGAT2は、油生合成のおよそ95%に関与する(サンダガー(Sandager),L.ら著、「J.Biol.Chem.」277(8):6478〜6482頁(2002年))、エルカース(Oelkers)ら(「J.Biol.Chem.」277:8877頁(2002年))。
LAをGLA、DGLA、およびARA(ω−6経路)に、ALAをSTA、ETA、EPA、DPA、およびDHA(ω−3経路)に変換する代謝プロセスは、2−炭素単位の付加を通じた炭素鎖の延長と、二重結合の添加を通じた分子の不飽和化を伴う(図2)。これは一連の不飽和化および延長酵素を必要とする。具体的にはオレイン酸は、Δ12デサチュラーゼの作用によって、最初のω−6脂肪酸であるLA(18:2)に変換される。引き続くω−6脂肪酸は、次のようにして生成される。1.)LAがΔ6デサチュラーゼの作用によってGLAに変換され、2.)GLAがエロンガーゼの作用によってDGLAに変換され、3.)DGLAがΔ5デサチュラーゼの作用によってARAに変換される。同様にしてリノール酸(LA)は、Δ15デサチュラーゼの作用によって、最初のω−3脂肪酸であるALAに変換される。引き続くω−3脂肪酸は、ω−6脂肪酸と類似した一連のステップで生成される。具体的には1.)ALAがΔ6デサチュラーゼ活性によってSTAに変換され、2.)STAがエロンガーゼ活性によってETAに変換され、3.)ETAがΔ5デサチュラーゼ活性によってEPAに変換される。代案としてはETAおよびEPAは、Δ17デサチュラーゼ活性によって、DGLAおよびARAからそれぞれ生成できる。EPAは、エロンガーゼおよびΔ4デサチュラーゼ活性によってDHAにさらに変換できる。
油性酵母菌(例えばヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica))における異種発現のために使用できる、DGAT1(前出)をコードするいくつかの遺伝子が利用できるにもかかわらず、可能なら、異種(または「外来性」)酵素よりも天然酵素の発現の方が好ましいことがある。この選択の理由は次のようである。1.)天然酵素は細胞中のその他の酵素およびタンパク質との相互作用のために最適化されており、2.)異種遺伝子が、宿主生物体において同一コドン選択をすることはありそうにない。宿主生物体の天然DGAT1の配列の知識はまた、標的を定めた中断による相同染色体の遺伝子の中断を容易にする。そして本発明が示したように、生物体中でTAG合成ができるようにするアシルトランスフェラーゼ遺伝子の完全相補体の理解は、宿主生物体が多様なやり方で生成する含油量を容易に操作できるようにする。
ヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)ARE2ヌクレオチド塩基(配列番号15)および推定アミノ酸(配列番号16)配列と公共データベースとの比較は、低複雑性フィルターおよび次のパラメーターがあるBLASTP法によるアラインメントを使用して、最も類似した既知の配列が、アミノ酸543個の長さにわたり本願明細書で報告するARE2のアミノ酸配列と約44%同一であることを明らかにする。期待値=10、マトリックス=Blosum 62(アルシュール(Altschul)ら、「Nucleic Acids Res.」25:3389〜3402頁(1997年))。より好ましいARE2アミノ酸断片は、本願明細書の配列と少なくとも約70%〜80%同一であり、85%〜90%同一の配列が特に適切であり、約95%同一の配列が最も好ましい。同様に本ORFに対応する核酸配列をコードする好ましいARE2は、本願明細書で報告するARE2をコードする核酸配列と少なくとも約70%〜80%同一の活性タンパク質をコードするものであり、85%〜90%同一の配列が特に適切であり、約95%同一の配列が最も好ましい。
本発明の各アシルトランスフェラーゼ核酸断片を使用して、同一のまたは他の微生物種からの相同的タンパクをコードする遺伝子を単離してもよい。配列依存プロトコルを使用した相同的遺伝子の単離は、技術分野で周知である。配列依存プロトコルの例としては以下が挙げられるが、これに限定されるものではない。1.)核酸ハイブリダイゼーション法、2.)核酸増幅技術の様々な使用で例示されるようなDNAおよびRNA増幅法[例えばマリス(Mullis)らに付与された米国特許第4,683,202号明細書のポリメラーゼ連鎖反応(PCR);タボール(Tabor),S.ら著、「Proc.Acad.Sci.USA」82;1074頁(1985年)のリガーゼ連鎖反応(LCR);または(ウォーカー(Walker)ら著、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.、89、392頁(1992年)の連鎖置換増幅(SDA)]、および3.)相補性によるライブラリー構築およびスクリーニング法。
特定宿主生物内で所望される特定のTAG組成物次第で、本アシルトランスフェラーゼおよび/またはPUFA生合成経路酵素の発現を修正して、それぞれの最適変換効率を達成することが望ましいかもしれない。このように多様な技術を使用して、代案の宿主における関心のあるポリペプチドの発現を改善および/または最適化できる。このような2つの技術としては、コドン最適化および遺伝子の変異誘発が挙げられる。
当業者によって理解されるように、修正ポリペプチドが代案の宿主に好まれるコドンを使用するように、異種宿主中で発現される特定ポリペプチドをコードするコドンの一部を修正するのは有用なことが多い。宿主が好むコドンの使用は、ポリペプチドをコードする異種遺伝子の発現を実質的に増強できる。
配列を合成し、配列を一緒にまとめる方法は、文献においてよく確立されている。例えば生体外(in vitro)での変異誘発および選択、部位特異的変異誘発、誤りがちなPCR(メルニコフ(Melnikov)ら著、「Nucleic Acids Research」、27(4):1056〜1062頁(1999年2月15日))、「遺伝子シャフリング」またはその他の手段を用いて、天然由来アシルトランスフェラーゼの変異を得ることができる。これによって生体内(in vivo)でアシルトランスフェラーゼ活性を有し、宿主細胞中での機能により望ましい物理的および動力学的パラメーター(例えばより長い半減期またはより高速の脂肪酸からのTAG合成)がある、ポリペプチドの生成が可能になる。
微生物による脂肪酸およびTAGの生成には、魚または植物などの天然供給源からの精製に比べて、いくつかの利点がある。例えば、
1.)多くの微生物は、油組成が高等生物のものと比べてはるかに単純であることが知られており、所望の構成要素の精製を容易にする。
2.)微生物による生成には、天候および食物供給などの外的変数によって引き起こされるばらつきがない。
3.)微生物的に生成された油は、実質的に環境汚染物質による混入がない。
4.)微生物による油生成は、培養条件を制御することで、特に微生物的発現酵素のための特定基質を提供することで、または化合物の添加または遺伝子工学的アプローチによって望まれない生化学的経路を抑制することで操作できる。
適切なプロモーターの制御下における、本願明細書で述べるアシルトランスフェラーゼをコードするキメラ遺伝子の導入からは、脂肪酸から貯蔵TAGへの転移の増大がもたらされることが予期される。したがって本発明は、脂肪酸を生成する形質転換された油性酵母菌宿主細胞において、脂肪酸がTAGプールに転移するように、本発明の少なくとも1つのアシルトランスフェラーゼを発現するステップを含んでなる、油性酵母菌のTAG含量の増大方法を包含する。
a)機能性ω−3/ω−6脂肪酸生合成経路および少なくとも1つの本発明のアシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を有する、形質転換した油性酵母菌宿主細胞を準備し、
b)発酵性炭素基質の存在下でステップ(a)の酵母菌細胞を生育させることで、ω−3/ω−6脂肪酸生合成経路の遺伝子およびアシルトランスフェラーゼが発現することにより、ω−3および/またはω−6脂肪酸が生成し、それによってω−3および/またはω−6脂肪酸がTAGに転移するステップ
を含んでなる。
実施態様によっては、本願明細書で述べる完全な配列、これらの完全な配列の相補体、それらの配列のかなりの部分、それから誘導されるコドン最適化アシルトランスフェラーゼ、および実質的にそれと相同である配列に基づいて、宿主生物体の天然DGAT1および/またはARE2を中断させ、または不活性化することが有用かもしれない。
本願明細書で述べる本配列の遺伝子および遺伝子産物は、微生物宿主細胞、特に油性酵母菌(例えばヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica))の細胞中で生成されてもよい。組み換え微生物宿主における発現は、様々な脂肪酸のTAGへの転移のために有用かもしれない。
本DGAT1およびARE2遺伝子および核酸断片の発現のための宿主細胞としては、広範な温度およびpHで、単純または複合炭水化物、有機酸およびアルコール、および/または炭化水素をはじめとする多様な原材料上で生育する微生物宿主が挙げられる。本発明で述べられる遺伝子は、油性酵母菌および特にヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)における発現のために単離されているが、転写、翻訳、およびタンパク質生合成器官は高度に保存されているので、あらゆる細菌、酵母菌、藻類および/または糸状菌が、本核酸断片の発現のための適切な宿主になることが考察される。
油性酵母菌中での発現に適したポリペプチドをコードするDNAがひとたび得られると、それは宿主細胞中で自律複製できるプラスミドベクター中に入れられ、またはそれは宿主細胞のゲノム中に直接組み込まれる。発現カセットの組み込みは、宿主ゲノム内で無作為に起きることができ、または宿主遺伝子座内における遺伝子組み換えを標的とするのに十分な宿主ゲノムとの相同性領域を含有するコンストラクトの使用を通じて、標的を定めることができる。コンストラクトが内在性遺伝子座に標的を定めると、全てまたはいくつかの転写および翻訳調節領域が、内在性遺伝子座によって提供できる。
形質転換された微生物宿主細胞を脂肪酸生合成遺伝子およびアシルトランスフェラーゼ遺伝子活性を最適化する条件下で生育させる。これによって脂肪酸の最大かつ最も経済的な収率の生成がもたらされ、それは次に貯蔵のためにTAGに転移できる。一般に最適化されてもよい培地条件としては、炭素源のタイプおよび量、窒素源のタイプおよび量、炭素−対−窒素比、酸素レベル、生育温度、pH、バイオマス生成相の長さ、油蓄積相の長さ、および細胞収穫時間が挙げられる。油性酵母菌などの関心のある微生物を複合培地(例えば酵母菌抽出物−ペプトン−デキストロース液体培地(YPD))、または生育に必要な構成要素が欠如する合成最少培地(例えばミシガン州デトロイトのディフコ・ラボラトリーズ(DIFCO Laboratories(Detroit,MI))からの酵母菌窒素ベース)上で生育させて、所望の発現カセットの選択を強要する。
PUFAをはじめとする脂肪酸は、遊離脂肪酸として、またはアシルグリセロール、リン脂質、スルホリピドまたは糖脂質などのエステル化形態で宿主微生物中に見ることができ、技術分野でよく知られている多様な手段を通じて宿主細胞から抽出されてもよい。酵母菌脂質の抽出技術、品質分析、および許容性基準に関する1つのレビューは、Z.ジェーコブス(Jacobs)著、「Critical Reviews in Biotechnology」12(5/6):463〜491頁(1992年)である。下流プロセスに関する簡潔なレビューはまた、A.シン(Singh)およびO.ワード(Ward)著、「Adv.Appl.Microbiol.」45:271〜312頁(1997年)にもある。
本願明細書で述べる研究の究極の目的は、ω−3および/またはω−6 PUFAが濃縮されたTAGを蓄積する油性酵母菌の開発である。このような目的で、貯蔵脂質プールおける好ましいTAGの合成および高い蓄積を可能にするために、油性酵母菌において効率的に機能するアシルトランスフェラーゼが同定されなくてはならない。具体的にはこれらのアシルトランスフェラーゼの発現レベルの修正が、脂肪酸(特にPUFA)のTAGへの転移増大を可能にする。したがって宿主細胞において生産されるTAG画分に組み込まれるω−3/ω−6 PUFA量の操作のために、効率的なアシルトランスフェラーゼの同定が必要である。
実施例で使用する標準組み換えDNAおよび分子クローニング技術は、技術分野でよく知られており、1.)サムブルック(Sambrook),J.、フリッチュ(Fritsch),E.F.およびマニアティス(Maniatis),T.著、「分子クローニング:実験室マニュアル(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)」第2版、コールドスプリングハーバー研究所(Cold Spring Harbor Laboratory):ニューヨーク州コールドスプリングハーバー(Cold Spring Harbor,NY)(1989年)、マニアティス(Maniatis)、2.)T.J.シルハビー(Silhavy)、M.L.ベンナン(Bennan)、およびL.W.エンクイスト(Enquist)著、「遺伝子融合実験(Experiments with Gene Fusions)」、コールドスプリングハーバー研究所(Cold Spring Harbor Laboratory):ニューヨーク州コールドスプリングハーバー(Cold Spring Harbor,NY)(1984年)、および3.)オースベル(Ausubel),F.M.ら著、「分子生物学現代プロトコル(Current Protocols in Molecular Biology)」、Greene Publishing and Wiley−Interscienceによる出版(1987年)で述べられる。
ヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)ATCC#20362、#76982、および#90812株は、メリーランド州ロックビル(Rockville,MD)の米国微生物系統保存機関から購入した。Y.リポリティカ(Y.lipolytica)株は、YPD寒天(1%酵母菌抽出物、2%バクトペプトン、2%グルコース、2%寒天)上において通常28℃で生育させた。
脂肪酸分析のために、ブライ(Bligh),E.G.およびダイヤー(Dyer),W.J.著、Can.J.Biochem.Physiol.37:911〜917頁(1959年)で述べられるように、細胞を遠心分離し収集して脂質を抽出した。ナトリウムメトキシドでの脂質抽出物のエステル交換反応によって、脂肪酸メチルエステルを調製し(ローガン(Roughan),G.およびニシダ(Nishida),I.著、Arch Biochem Biophys.276(1):38〜46頁(1990年))、引き続きヒューレットパッカード(Hewlett−Packard)からの30m×0.25mm(内径)HP−INNOWAXカラムを装着したヒューレットパッカード(Hewlett−Packard)6890 GCで分析した。オーブン温度は3.5℃/分で、170℃(25分間保持)から185℃であった。
ヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)における遺伝子発現に適したプラスミドの構築
本実施例は、プラスミドpY5、pY5−13、pY20、およびpLV5の構築について述べる。
フランス国ティベルバル−グリニョン、F−78850、国立作物学研究所、バイオテクノロジー農業関連産業センター、遺伝分子および細胞研究所INRA−CNRS(Insitut National Agrinomique,Centre de Biotechnologie Agro−Industrielle,laboratoire de Genetique Moleculaire et Cellularie INRA−CNRS(F−78850,Thiverval−Grignon,France)のクロード・ガィヤルダン(Claude Gaillardin)博士から贈与されたpINA532の誘導体であるプラスミドpY5を図3に図解するようにヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)における異種性遺伝子発現のために構築した。
pY5の誘導体としてpY5−13を構築し、ヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)中のサブクローニングおよび異種性遺伝子発現を容易にした。具体的にはpY5をテンプレートとして使用して、6ラウンドの部位特異的変異誘発により、pY5−13を構築した。オリゴヌクレオチドYL5およびYL6(配列番号43および44)を使用して、部位特異的変異誘発によってSalIおよびClaI部位の双方をpY5から除去し、pY5−5を生成した。オリゴヌクレオチドYL9およびYL10(配列番号45および46)を使用して、部位特異的変異誘発によって、LEU2遺伝子とTEFプロモーター間のpY5−5にSalI部位を導入し、pY5−6を生成した。オリゴヌクレオチドYL7およびYL8(配列番号47および48)を使用して、LEU2遺伝子とARS18の間のpY5−6にPacI部位を導入し、pY5−8を生成した。オリゴヌクレオチドYL3およびYL4(配列番号49および50)を使用して、TEFプロモーターの翻訳開始コドン周囲のpY5−8にNcoI部位を導入し、pY5−9を生成した。YL1およびYL2オリゴヌクレオチド(配列番号51および52)を使用して、pY5−9のLEU2遺伝子の内側のNcoI部位を除去し、PY5−12を生成した。最後にオリゴヌクレオチドYL61およびYL62(配列番号53および54)を使用して、ColEIとXPR2領域間のpY5−12にBsiWI部位を導入し、pY5−13を生成した。
プラスミドpY20(配列番号55)はpY5の誘導体である。これはキメラハイグロマイシン抵抗性遺伝子を含有するNot I断片をpY5のNot I部位に挿入して構築された。具体的には発現のために、大腸菌(E.coli)ハイグロマイシン抵抗性遺伝子(配列番号56、「HPT」、カスター(Kaster),K.R.ら著、「Nucleic Acids Res.」11:6895〜6911頁(1983年))をPCR増幅した。キメラ遺伝子は、Y.リポリティカ(Y.lipolytica)TEFプロモーターの制御下にあるハイグロマイシン抵抗性ORFを有した。
ヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)アシル−CoA:ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ(DGAT2)遺伝子の一部のクローニング、および内在性DGAT2遺伝子の中断
本実施例は、ヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)DGAT2の部分的コーディング配列を単離するための変性PCRプライマーの使用、およびY.リポリティカ(Y.lipolytica)の天然遺伝子を中断させるための部分的配列の使用について述べる。
キアゲン(Qiagen)からのDNeasy組織キット(カタログ番号69504)を使用して、Y.リポリティカ(Y.lipolytica)(ATCC#76982)からゲノムDNAを単離し、DNA濃度0.5μg/μLでキット緩衝液AEに再懸濁した。テンプレートとしてゲノムDNAを使用し、異なる既知のDGAT2(すなわちジェンバンク登録番号NC_001147[サッカロミセス・セレヴィシエ(Saccharomyces cerevisiae)]およびAF391089およびAF391090[クサレケカビ・ラマニアナ(Mortierella ramanniana)])の間で保存されるアミノ酸配列をコードするようにデザインされた、いくつかの変性プライマーセットを使用して、PCR増幅を実施した。下の表で示すように、変性プライマーP7およびP8によって最良の結果が得られた。
1.)ゲノムDNA(5μg)を制限酵素Pst IまたはSac Iで、3’のオーバーハングを残して消化した。
2.)消化したDNAを0.1Uの子ウシ小腸由来アルカリホスファターゼで処理し、DNAを脱リン酸した。
3.)DGAT2特異的プライマーP80(配列番号66)およびTaqポリメラーゼを使用して、プライマー延長を実施した。
4.)TOPO(登録商標)リンカー(1μL)を添加し、反応を37℃で5分インキュベートして、TOPO(登録商標)リンカーをDNAにライゲートした。
5.)DGAT2遺伝子特異的プライマー、P81(配列番号67)およびLinkAmpプライマー1(配列番号68)を使用して、PCRを実施した。
6.)プライマーP81およびLinkAmpプライマー1によって、新たに増幅された断片を配列決定した。
プラスミドpY21DGAT2と称される標的カセットによる内在性DGAT2遺伝子の相同的遺伝子組み換え媒介置換によって、Y.リポリティカ(lipolytica))ATCC#90812およびATCC#76982中のDGAT2遺伝子の標的を定めた中断を実施した。pY21DGAT2は、プラスミドpY20から誘導された(実施例1、配列番号55)。具体的にはpY21DGAT2は、570bpのHind III/Eco RI断片を同様に直線化されたpY20中に挿入して作り出された。この570bpの断片は(5’から3’に向けて)次を含有した。(配列番号1中のコード配列(ORF)の)位置+1090〜+1464の3’相同配列、(配列番号1中のコード配列(ORF)の)位置+906から+1089のBglII制限部位および5’相同配列。2組のPCRプライマーP95およびP96(配列番号69および70)、そしてP97およびP98(配列番号71および72)をそれぞれ使用して、染色体歩行によって得られた673bpのDGAT2 PCR生成物からの3’および5’配列のPCR増幅によって断片を調製した。
ヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)リン脂質:ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ(PDAT)遺伝子の一部のクローニング、および内在性PDAT遺伝子の中断
本実施例は、Y.リポリティカ(Y.lipolytica)PDATの部分的コード配列を単離するための変性PCRプライマーの使用、およびY.リポリティカ(Y.lipolytica)の天然遺伝子を中断させるための部分的配列の使用について述べる。
キアゲン(Qiagen)からのDNeasy組織キット(カタログ番号69504)を使用して、Y.リポリティカ(Y.lipolytica)(ATCC#76982)からゲノムDNAを単離し、DNA濃度0.5μg/μLでキット緩衝液AEに再懸濁した。テンプレートとしてゲノムDNAを使用し、異なる既知のPDAT(ジェンバンク登録番号NP 190069およびAB006704[gi:2351069シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)]、およびNP_596330[分裂酵母(Schizosaccharomyces pombe];およびサッカロミセス・セレヴィシエ(Saccharomyces cerevisiae)Lro1遺伝子[ダルキビスト(Dahlqvist)ら著、Proc.Natl.Acad.Sci.USA97:6487頁(2000年)])間で保存されるアミノ酸配列をコードする変性プライマーのいくつかの組を使用して、PCR増幅を実施した。下の表で示すように、変性プライマーP26およびP27によって最良の結果が得られた。
この約600bpのPDATコード領域部分の配列決定に続いて、この配列をコードするより大きいDNA断片が、「酵母菌プロジェクト・ジェノレビュール(Genolevures)」(バイオインフォマティクス・センター(Center for Bioinformatics)、LaBRI、フランス国タランスセデックス(Cedex))の公共Y.リポリティカ(lipolytica)タンパク質データベースに発見された(ドゥジョン(Dujon),B.ら、Nature 430(6995):35〜44頁(2004年)もまた参照されたい)。これによりPCRプライマーP39およびP42(配列番号80および81)を使用して、Y.リポリティカ(lipolytica)ATCC#90812からのPDAT遺伝子の一部を含んでなる1008bpゲノムDNA断片の単離が可能になった。
PDATおよびDGAT2遺伝子の双方に中断を含有するヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)ダブルノックアウト菌株の構築
本実施例は、PDATおよびDGAT2遺伝子の双方が中断された、ダブルノックアウト菌株の作成について述べる。
完全長のヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)DGAT2およびPDAT遺伝子のクローニング
本実施例は、天然遺伝子の天然ORFをPCRするための、レスキューされたプラスミド中の配列を使用したプラスミドレスキューによる、中断されたDGAT2およびPDAT遺伝子の傍らにあるゲノム配列の回復について述べる。完全長の遺伝子およびそれらの推定アミノ酸配列をその他の真菌DGAT2およびPDAT配列と、それぞれ比較する。
アシルトランスフェラーゼ遺伝子は、大腸菌(E.coli)アンピシリン抵抗性遺伝子および大腸菌(E.coli)oriをそれぞれ含有する完全なpY21DGAT2およびpLV13ベクターの挿入によって中断されたので、大腸菌(E.coli)中の隣接PDATおよびDGAT2配列をレスキューすることが可能であった。このためにDNeasy組織キットを使用して、Y.リポリティカ(Y.lipolytica)株「S−D2」(中断されたDGAT2遺伝子を保有する、実施例2)およびY.リポリティカ(Y.lipolytica)株「S−P」(中断されたPDAT遺伝子を保有する、実施例3)のゲノムDNAを単離した。具体的には200μLの反応容積内で、10μgのゲノムDNAをDGAT2のためにはAge IおよびNhe I、PDATのためにはKpn I、Pac I、およびSac Iの制限酵素50Uで消化した。消化DNAをフェノール:クロロホルムで抽出し、40μLの脱イオン水に再懸濁した。3UのT4 DNAリガーゼを含有する200μLのライゲーション混合物中で、消化DNA(10μL)を自己ライゲートした。各ライゲーション反応を16℃で12時間実施した。ライゲートしたDNAをフェノール:クロロホルムで抽出し、40μLの脱イオン水に再懸濁した。最後に1μLの再懸濁したライゲートDNAを使用して、電気穿孔によって大腸菌(E.coli)を形質転換し、アンピシリン(Ap)を含有するLB上に播種した。Ap抵抗性形質転換体を単離し、プラスミドの存在について分析した。以下の挿入サイズが、再生またはレスキューされたプラスミド内に見出された(表6および7)。
追加的な推定上のヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)DAG ATの同定
ヤロウィア(Yarrowia)中の追加的DAG ATを同定するために、サッカロミセス・セレヴィシエ(Saccharomyces cerevisiae)ARE1(Sc ARE1、ジェンバンク登録番号CAA42296)およびARE2(Sc ARE2、ジェンバンク登録番号P53629)タンパク質配列(ヤン(Yang),H.ら(「Science.」272(5266):1353〜1356頁(1996年))を使用して、酵母菌プロジェクト・ジェノレビュール(Genolevures)(前出)の公共Y.リポリティカ(lipolytica)タンパク質データベースを探索した。双方の探索から、次のY.リポリティカ(lipolytica)ORFがそれぞれ第1および第2のヒットとして同定された。
(1)YALI−CDS2011.1:「sp|P53629サッカロミセス・セレヴィシエ(Saccharomyces cerevisiae)YNR019w ARE2アシル−CoAステロールアシルトランスフェラーゼに類似、仮説的開始」と注釈される、長さアミノ酸543個(配列番号9および10)、および
(2)YALI−CDS2141.1:「無名タンパク質生成物、tr|Q9FUL6シソ(Perilla frutescens)ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ(PfDGAT1)に弱く類似、仮説的開始」と注釈される、長さアミノ酸526個(配列番号11および12)。
ヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)アシル−CoA:ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ(DGAT1)遺伝子のクローニングおよび内在性DGAT1遺伝子の中断
本実施例は、ヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)DGAT1(ORFYALI−CDS2011.1(実施例6)によってコードされる)の全長コード配列を単離するための縮重PCRプライマーの使用、およびY.リポリティカ(lipolytica)中の天然遺伝子を中断するための配列の使用について述べる。
縮重PCRプライマーP201およびP203(それぞれ配列番号92および93)、およびテンプレートとして(実施例2からの)Y.リポリティカ(lipolytica)ATCC#76982ゲノムDNAを使用して、PCRによって全長Yl DGAT1 ORFをクローンした。Yl DGAT1をコードするヌクレオチド配列が分かっていなかったので、縮重プライマーが必要であった。
(実施例2で述べられる方法を使用して)内在性DGAT1遺伝子のターゲティングカセットとの相同的組換え媒介置換によって、Y.リポリティカ(lipolytica)ATCC#90812中の推定上のDGAT1遺伝子の標的を定めた中断を実施した。具体的には1.6kBの単離されたYl DGAT1 ORF(配列番号13)をPCRテンプレート分子として使用し、5’相同的Yl DGAT1配列、ヤロウィア(Yarrowia)ロイシン2(Leu2)遺伝子、および3’相同的Yl DGAT1配列からなるYl DGAT1ターゲティングカセットを構築した。このために、以下に記載するプライマーを使用して、最初にターゲティングカセットの各部分を個別に増幅した。
5’相同的DGAT1配列の増幅のための上方プライマーP214および下方プライマーP215(それぞれ配列番号94および95)、
3’相同的DGAT1配列の増幅のための上方プライマーP216および下方プライマーP217(それぞれ配列番号96および97)、および
Leu2遺伝子(ジェンバンク登録番号AAA35244)増幅のための上方プライマーP218および下方プライマーP219(それぞれ配列番号98および99)。
ヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)アシル−CoA:ステロール−アシルトランスフェラーゼ(ARE2)遺伝子のクローニングおよび内在性ARE2遺伝子の中断
本実施例は、(ORF YALI−CDS2141.1(実施例6)によってコードされる)ヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)ARE2の全長コード配列単離するための縮重PCRプライマーの使用、およびY.リポリティカ(lipolytica)中の天然遺伝子を中断するための配列の使用について述べる。
縮重PCRプライマーP205およびP208(それぞれ配列番号102および103)、およびテンプレートとしてY.リポリティカ(lipolytica)ATCC#76982(実施例2からの)ゲノムDNAを使用したPCRによって全長Yl ARE2 ORFをクローンした。Yl ARE2をコードするヌクレオチド配列が分かっていなかったので、縮重プライマーが必要であった。実施例7で述べられるプロトコルを使用して、PCRを実施した。予期されたサイズのPCR生成物が検出された。
(実施例7で述べられるようにして)内在性ARE2遺伝子のターゲティングカセットとの相同的組換え媒介置換によって、Y.リポリティカ(lipolytica)ATCC#90812中のARE2遺伝子の標的を定めた中断が実施される。具体的には推定上のYlARE2タンパク質(配列番号15)をコードする約1.6kBの単離されたORFをPCRテンプレート分子として使用し、5’相同的Yl ARE2配列、ヤロウィア(Yarrowia)ロイシン2(Leu2)遺伝子、および3’相同的Yl ARE2配列からなるYl ARE2ターゲティングカセットを構築する。このために、実施例7で述べられるようにして、以下に記載するプライマーを使用して、最初にターゲティングカセットの各部分が個別に増幅される。
5’相同的ARE2配列の増幅のための上方プライマーP220および下方プライマーP221(それぞれ配列番号104および105)、
3’相同的ARE2配列の増幅のための上方プライマーP222および下方プライマーP223(それぞれ配列番号106および107)、および
Leu2遺伝子増幅のための上方プライマーP224および下方プライマーP225(それぞれ配列番号108および109)。
突然変異および野生型ヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)株(ATCC#90812)中のTAG含量測定
本実施例は、野生型および次を含有する突然変異Y.リポリティカ(lipolytica)ATCC#90812中のTAG含量の比較について述べる。(1)PDAT、DGAT2、およびDGAT1中の単一中断、(2)PDATおよびDGAT2、DGAT1およびPDAT、およびDGAT1およびDGAT2中の二重中断、および(3)PDAT、DGAT2、およびDGAT1中の三重中断。
TLCのために使用される方法は、以下の5段階で述べられる。1)内部標準15:0脂肪酸(10μLの10mg/mL)を2〜3mgの乾燥細胞塊に添加し、メタノール/クロロホルム法を使用した総脂質の抽出がそれに続いた。2)25〜50μLの微量ピペットを使用して、5×20cmシリカゲル60プレートの下端からおよそ1インチのところに鉛筆で薄く描いた線を横切って、抽出した脂質(50μL)をブロットした。3)次にTLCプレートをN2下で乾燥させ、約100mLの80:20:1のヘキサン:エチルエーテル:酢酸溶剤を含有するタンクに挿入した。4)バンドの分離後、プレートの片面にヨウ素蒸気を吹き付けてバンドを同定した。これによってさらなる分析のために、カミソリの刃を使用してプレートのもう一方の面のサンプルがこすり取れるようになった。5)こすり取ったサンプルの塩基性エステル交換反応、およびGC分析を一般方法で述べられるようにして実施した。
GC結果を下の表9に示す。培養は「S」株(野生型)、「S−P」(PDATノックアウト)、「S−D1」(DGAT1ノックアウト)、「S−D2」(DGAT2ノックアウト)、「S−D1−D2」(DGAT1およびDGAT2ノックアウト)、「S−P−D1」(PDATおよびDGAT1ノックアウト)、「S−P−D2」(PDATおよびDGAT2ノックアウト)、および「S−P−D1−D2」(PDAT、DGAT1、およびDGAT2ノックアウト)として既述される。使用される略語は次のとおり。「WT」=野生型。「FA」=脂肪酸、「dcw」=乾燥細胞重量、および「FA%dcw、重量%」=野生型中の%に対するFA%dcw、「S」株は野生型である。
EPA産生ヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)ATCC#20362 MU株およびY2067U株の発生
本実施例は、ヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)ATCC#20362にそれぞれ由来する、MU株およびY2067U株の構築について述べ、各株は全脂質と比較して顕著な濃度のEPAを生成できた(図5)。実施例11、12、および15(下記)で述べられるように、TAG含量および/または脂肪酸組成の分析に基づいて、これらのEPA生成株中で、様々なアシルトランスフェラーゼノックアウトおよびアシルトランスフェラーゼ遺伝子過剰発現の効果を調べた。
コンストラクトpKUNF12T6E(図6A、配列番号110)を生成して、野生型ヤロウィア(Yarrowia)ATCC#20362株のUra3遺伝子座に、4つのキメラ遺伝子(Δ12デサチュラーゼ、Δ6デサチュラーゼ、および2つのエロンガーゼを含んでなる)を組み入れ、それによってDGLAの生成を可能にした。pKUNF12T6Eプラスミドは次の構成要素を含有した。
コンストラクトpDMW232(図6B、配列番号121)を生成して、2つのΔ5キメラ遺伝子をヤロウィア(Yarrowia)M4株のLeu2遺伝子に組み入れた。プラスミドpDMW232は、次の構成要素を含有した。
コンストラクトpZP3L37(図6C、配列番号124)を作り出して、3つの合成Δ17デサチュラーゼキメラ遺伝子をY2034株のアシル−CoAオキシダーゼ3(すなわちPOX3)遺伝子中に組み入れた。プラスミドpZP3L37は、次の構成要素を含有した。
5−FOA抵抗性であるE株の突然変異細胞を同定して、EU(Ura-)株を作り出した。具体的にはループ1つ分のヤロウィア(Yarrowia)E株細胞を3mLのYPD培地に接種して、30℃で24時間250rpm/分で振盪して生育させた。培養をOD6000.4にYPDで希釈して、次にさらに4時間インキュベートした。培養をFOA選択プレート上に播種(100μL/プレート)して、30℃に2〜3日間保った。全部で16個のFOA抵抗性コロニーを拾って、MMおよびFOA選択プレート上に画線培養した。これらから10個のコロニーがFOA選択プレート上で生育したが、MMプレートでは生育せず、可能なUra-株として選択された。
コンストラクトpZKO2UM26E(図6E、配列番号129)を使用して、(エロンガーゼ、Δ6デサチュラーゼ、およびΔ12デサチュラーゼを含んでなる)3つのキメラ遺伝子およびUra3遺伝子のクラスターをEU株のヤロウィア(Yarrowia)Δ12デサチュラーゼ遺伝子部位に組み入れた。プラスミドpKO2UM26Eは、次の構成要素を含有した。
MU株はM26株のUra栄養要求株であった。この株はPacIおよびHincIIで消化された5μgのプラスミドpZKUM(図7A、配列番号137)で、M26株を形質転換して作られた。形質転換は、カリフォルニア州オレンジのザイモリサーチ社(Zymo Research Corporation(Orange,CA))からの凍結EZ酵母形質転換キットを使用して実施され、形質転換体は、100μLの形質転換細胞ミクスを次の培地を含む寒天プレート上に播種して選択された。ミシガン州デトロイトのディフコ・ラボラトリーズ(DIFCO Laboratories(Detroit,MI))からの6.7g/Lの酵母窒素ベース、20g/Lのデキストロース、50mg/Lのウラシル、および800mg/LのFOA。7日後、小型コロニーが出現し、それをMMおよびMMU寒天プレート上に播種した。全てUra栄養要求株であった。株の1つを「MU」と命名した。
プラスミドpKO2UF2PE(図7B、配列番号138)を作り出して、(異種のΔ12デサチュラーゼおよびエロンガーゼを含んでなる)2つのキメラ遺伝子およびUra3遺伝子を含有するクラスターをEU株(前出)の天然ヤロウィア(Yarrowia)Δ12デサチュラーゼ遺伝子に組み入れた。プラスミドpKO2UF2PEは、次の構成要素を含有した。
Y2067株中のUra3遺伝子を中断するために、コンストラクトpZKUT16(図7C、配列番号139)を作り出して、TEF::rELO2S::Pex20キメラ遺伝子をY2067株のUra3遺伝子に組み入れた。rELO2Sは、16:0を18:0に延長するラット肝酵素をコードする、コドン最適化rELO遺伝子である。プラスミドpZKUT16は、次の構成要素を含有した。
EPA生合成のために組み換えた突然変異および野生型ヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica) MU株のTAG含量の測定
本実施例は、MU株(ヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)ATCC#20362の組み換え株、10%を超えるEPAを生成できる)の様々なアシルトランスフェラーゼノックアウト株中のTAG含量および脂肪酸組成について述べる。より具体的にはMU株において、PDAT、DGAT2、およびDGAT1中の単一中断、PDATおよびDGAT2中の二重中断が作り出された。4つの異なる生育条件での生育に続いて、これらの各株中で脂質含量および組成物を比較する。
ヤロウィア(Yarrowia)プロモーターの制御下にあるヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)DGAT1の配列決定およびORF発現
本実施例は、YlDGAT1の配列決定、および野生型ヤロウィア(Yarrowia)株中のヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)TEFプロモーター、YlDGAT1、およびヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)ペルオキシン(Pex20)ターミネーター(すなわちTEF::YlDGAT1::Pex20遺伝子)を含んでなるキメラ遺伝子の過剰発現について述べる。
最初に、Y.リポリティカ(lipolytica)ATCC#90812の縮重プライマーP201およびP203(配列番号92および93)、およびテンプレートとしてゲノムDNA(実施例2から)を使用して、Y.リポリティカ(lipolytica)DGAT1のORFをPCR増幅した。一般方法で述べられるようにして、インディアナ州インディアナポリスのロシュ・アプライド・サイエンス(Roche Applied Sciences(Indianapolis,IN))からのエキスパンド・ハイ・フィディリティ(Expand High Fidelity)PCRシステムを使用してPCRを実施した。
プラスミドpYAP23−42をNcoIおよびNot Iで1時間消化して、YlDGAT1を含有する1.6kBの断片を単離し、ORFがTEFプロモーターの制御下でクローンされ、組み込みベクター中のPEX20−3’ターミネーター領域がヤロウィア(Yarrowia)POX2遺伝子中に標的を定めるように、NcoI−およびNot I消化pZP2l7+Ura(配列番号144、図7DA)にインサートした。ミニプレップ分析によって正しい形質転換体を確認し、得られたプラスミドを「pYDA1」と命名した。
クサレケカビ・アルピナ(Mortierella alpina)cDNAライブラリーの構築および配列決定
本実施例は、クサレケカビ・アルピナ(Mortierella alpina)のDNAライブラリーの構築、および引き続くライブラリーの配列決定について述べる。
カナダ国オンタリオ州ミシサーガのBDクロンテック(BD−Clontech(Mississauga,ON,Canada)からのクリエーター・スマートCreator Smart(登録商標)cDNAライブラリーキットを使用して、製造業者のプロトコルに従ってM.アルピナ(alpina)cDNAを合成した。
ライゲーション生成物を使用して、ストラタジーン(Stratagene)からの大腸菌(E.Coli)XL−1ブルー電気穿孔コンピテント細胞を形質転換した。推定総数2×106個のコロニーが得られた。マサチューセッツ州ベバリーのアージンコート・バイオサイエンス社(Agencourt Bioscience Corporation(Beverly,MA))によってM13順方向プライマー(配列番号148)を使用して、cDNAライブラリーの配列決定が実施された。
クサレケカビ・アルピナ(Mortierella alpina)ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ(DGAT1)遺伝子の同定およびクローニング
本実施例は、9,984個のcDNA配列の1つの内の推定上のM.アルピナ(alpina)DGAT1の同定について述べる。具体的にはBLAST((「基礎的局在性配列探索ツール(Basic Local Alignment Search Tool)」アルトシュル(Altschul),S.F.ら著、「J.Mol.Biol.」215:403〜410頁(1993年))を使用して、Y.リポリティカ(lipolytica)DGAT1タンパク質配列(実施例7、配列番号14)をM.アルピナ(alpina)cDNAの各配列に対するクエリー配列として使用した。1つのcDNA断片はY.リポリティカ(lipolytica)DGAT1との顕著な相同性を有したので、M.アルピナ(alpina)DGAT1(配列番号175)として暫定的に同定された。引き続く公的に入手できる配列データベースに対するクエリーとして配列番号175を用いたBLAST分析は、cDNAといくつかのその他の種からのDGAT1との顕著な類似度を確認した。次にcDNA末端迅速増幅(RACE)技術およびゲノム歩行を使用して、そのクサレケカビ・アルピナ(Mortierella alpina)コード配列全体を単離した。
キアゲン(Qiagen)からのキアプレップ(QiaPrep)スピンミニプレップキット(カタログ番号627106)を使用してクサレケカビ・アルピナ(Mortierella alpina)(ATCC#16266)からゲノムDNAを単離した。YPD寒天プレート上に生育した細胞をこすり取り1.2mLのキット緩衝液P1に再懸濁した。再懸濁した細胞をそれぞれ0.6mLのガラスビーズ(0.5mm径)を含有する2本の2.0mLネジ蓋管に入れた。オクラホマ州バートルズビルのバイオスペック(Biospec(Bartlesville,OK))からのミニビーズビーターの均質化設定において、細胞を2分間均質化した。次に管をエッペンドルフ(Eppendorf)微量遠心管内で14,000rpmで2分間遠心分離した。上清(0.75mL)を3本の1.5mL微量遠心管に移した。各管に等容積のキット緩衝液P2を添加した。管を反転して3回混合した後、0.35mLの緩衝液N3を各管に添加した。管を5回反転させて内容物を再度混合した。混合物をエッペンドルフ(Eppendorf)微量遠心管中で14,000rpmで5分間遠心分離した。各管からの上清を別々のキットスピンカラムに移した。カラムを14,000rpmで1分間遠心分離し、緩衝液PEで1回洗浄し、再度14,000rpmで1分間遠心分離し、続いて14,000rpmで1分間、最終遠心分離した。各カラムに緩衝液EB(50μL)を添加して、1分間静置した。次にゲノムDNAを14,000rpmで1分間の遠心分離によって溶出した。
カリフォルニア州パロアルトのクロンテック(Clontech(Palo Alto,CA))からのユニバーサル・ゲノム歩行TMキットを利用して、M.アルピナ(alpina)DGAT1の5’末端領域に対応する1辺のゲノムDNAを得た。クローニングで使用するために、入手できる部分的DGAT1遺伝子配列(配列番号149)に基づいて、プライマーMARE2−N1およびMARE2−N2(配列番号150および151)を合成した。
RACEによる推定上のDGAT1遺伝子の3’末端領域をクローニングするために、プライマーARE−N3−1およびARE−N3−2(それぞれ配列番号157および158)を合成した。
5’領域(配列番号156)配列、オリジナルのcDNA断片(配列番号149)、および3’領域(配列番号161)のアセンブリーからは、M.アルピナ(alpina)DGAT1コード配列(配列番号17)が生じた。5’領域ゲノムの配列は、イントロン(配列番号17内のヌクレオチド塩基449〜845)を含んだ。
多価不飽和脂肪酸を生じるように組み換えたクサレケカビ・アルピナ(Mortierella alpina)DGAT1Inヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)Y2067U株の発現
本実施例は、Y.リポリティカ(lipolytica)Y2067U株におけるM.アルピナ(alpina)DGAT1(前出、実施例10)の発現、および生成されるEPAおよびその他のPUFAの最終濃度に対するMDGAT1発現の効果について述べる。
DGAT1真菌相同体の同定
本実施例は、ヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)およびクサレケカビ・アルピナ(Mortierella alpina)DGAT1配列(それぞれ配列番号13および17)を使用した、その他の真菌中のオルソロガスタンパク質の同定について述べる。
普遍的および真菌DGAT1モチーフの同定
本実施例は、その他の既知のDGAT1配列に関連して、本発明のDGAT1配列を使用した真菌および普遍的DGAT1モチーフの同定について述べる。
Claims (39)
- (a)配列番号14および18よりなる群から選択されるアミノ酸配列をコードする単離された核酸分子、
(b)0.1×SSC、0.1%SDSで65℃、および2×SSC、0.1%SDSで洗浄、次いで0.1×SSC、0.1%SDSのハイブリダイゼーション条件下で(a)とハイブリダイズする単離された核酸分子、または
(c)(a)または(b)と完全に相補である単離された核酸分子
よりなる群から選択される、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ−1酵素をコードする単離された核酸分子。 - 配列番号13および17よりなる群から選択される請求項1に記載の単離された核酸分子。
- 請求項1に記載の単離された核酸分子によってコードされるポリペプチド。
- 請求項2に記載の単離された核酸分子によってコードされるポリペプチド。
- 配列番号14に記載の配列を有するポリペプチドと比較して、BLASTP法によるアラインメントに基づいて少なくとも70%の同一性を有する少なくともアミノ酸526個のジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ−1酵素をコードする第1のヌクレオチド配列、または
第1のヌクレオチド配列の相補体を含んでなる第2のヌクレオチド配列
を含んでなる単離された核酸分子。 - 配列番号18に記載の配列を有するポリペプチドと比較して、BLASTP法によるアラインメントに基づいて少なくとも70%の同一性を有する少なくともアミノ酸525個のジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ−1酵素をコードする第1のヌクレオチド配列、または
第1のヌクレオチド配列の相補体を含んでなる第2のヌクレオチド配列
を含んでなる単離された核酸分子。 - (a)配列番号16に記載のアミノ酸配列をコードする単離された核酸分子、
(b)0.1×SSC、0.1%SDSで65℃、および2×SSC、0.1%SDSで洗浄、次いで0.1×SSC、0.1%SDSのハイブリダイゼーション条件下で(a)とハイブリダイズする単離された核酸分子、または
(c)(a)または(b)と完全に相補である単離された核酸分子
よりなる群から選択される、アシル−CoA:ステロール−アシルトランスフェラーゼをコードする単離された核酸分子。 - 配列番号15よりなる群から選択される請求項7に記載の単離された核酸分子。
- 請求項7に記載の単離された核酸分子によってコードされるポリペプチド。
- 請求項8に記載の単離された核酸分子によってコードされるポリペプチド。
- 配列番号16に記載の配列を有するポリペプチドと比較して、BLASTP法によるアラインメントに基づいて少なくとも70%の同一性を有する少なくともアミノ酸543個のアシル−CoA:ステロール−アシルトランスフェラーゼをコードする第1のヌクレオチド配列、または
第1のヌクレオチド配列の相補体を含んでなる第2のヌクレオチド配列
を含んでなる単離された核酸分子。 - 適切な制御配列に作動的に結合した請求項1または7のいずれかに記載の単離された核酸分子を含んでなるキメラ遺伝子。
- 請求項12に記載のキメラ遺伝子を含んでなる形質転換宿主細胞。
- 藻類、細菌、カビ、真菌、および酵母よりなる群から選択される請求項13に記載の形質転換宿主細胞。
- 酵母が油性酵母である請求項14に記載の形質転換宿主細胞。
- 油性酵母細胞が、ヤロウィア(Yarrowia)、カンジダ(Candida)、ロドトルラ(Rhodotorula)、ロドスポリジウム(Rhodosporidium)、クリプトコッカス(Cryptococcus)、トリコスポロン(Trichosporon)、およびリポミセス(Lipomyces)よりなる群から選択される請求項15に記載の形質転換宿主細胞。
- 宿主細胞がヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)である請求項16に記載の形質転換宿主細胞。
- ヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)が、ヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)ATCC#20362、ヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)ATCC#8862、ヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)ATCC#18944、ヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)ATCC#76982、ヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)ATCC#90812、およびヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)LGAMS(7)1よりなる群から選択される株である請求項17に記載の形質転換宿主細胞。
- a)ゲノムライブラリーを請求項1に記載の核酸分子で探索し、
b)請求項1に記載の核酸分子とハイブリダイズするDNAクローンを同定し、
c)ステップ(b)で同定されたクローンを含んでなるゲノム断片を配列決定することを含んでなり、
配列決定されたゲノム断片が、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ−1酵素をコードする、
ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ−1酵素をコードする核酸分子の取得方法。 - a)配列番号13および17よりなる群から選択される配列の一部に対応する少なくとも1つのオリゴヌクレオチドプライマーを合成し、
b)ステップ(a)のオリゴヌクレオチドプライマーを使用してクローニングベクター中に存在するインサートを増幅させることを含んでなり、
増幅されたインサートが、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ−1をコードするアミノ酸配列の一部をコードする
ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ−1酵素をコードする核酸分子の取得方法。 - 請求項19または20に記載の方法の生成物。
- a)配列番号31、
b)配列番号32、
c)配列番号33、
d)配列番号34、
e)配列番号35、
f)配列番号36、
g)配列番号37、
h)配列番号23、
i)配列番号24、
j)配列番号25、
k)配列番号26、
l)配列番号27、
m)配列番号28、
n)配列番号29、および
o)配列番号30よりなる群から選択されるアミノ酸モチーフをコードする単離された核酸分子。 - a)配列番号31、
b)配列番号32、
c)配列番号33、
d)配列番号34、
e)配列番号35、
f)配列番号36、
g)配列番号37、
h)配列番号23、
i)配列番号24、
j)配列番号25、
k)配列番号26、
l)配列番号27、
m)配列番号28、
n)配列番号29、および
o)配列番号30よりなる群から選択されるアミノ酸モチーフ配列。 - (a)(i)適切な制御配列の制御下にある配列番号14、18、19、20、21、および22よりなる群から選択されるアミノ酸配列を有するジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ−1酵素をコードする少なくとも1つの遺伝子、および
(ii)脂肪酸供給源
を含んでなる、形質転換された宿主細胞を準備し、
(b)ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ−1酵素をコードする少なくとも1つの遺伝子が発現する条件下でステップ(a)の細胞を生育させて、脂肪酸をトリアシルグリセロールに転移させ、
(c)ステップ(b)のトリアシルグリセロールを場合により回収すること
を含んでなる形質転換された宿主細胞中のトリアシルグリセロール含量の増大方法。 - (a)(i)機能性ω−3/ω−6脂肪酸生合成経路をコードする遺伝子、
(ii)適切な制御配列の制御下にある配列番号14、18、19、20、21、および22よりなる群から選択されるアミノ酸配列を有するジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ−1酵素をコードする少なくとも1つの遺伝子
を含んでなる形質転換された宿主細胞を準備し、
(b)(i)および(ii)の遺伝子が発現する条件下でステップ(a)の細胞を生育させて、少なくとも1つのω−3またはω−6脂肪酸の生産、およびそのトリアシルグリセロールへの転移がもたらされ、
(c)ステップ(b)のトリアシルグリセロールを場合により回収すること
を含んでなる形質転換された宿主細胞中のトリアシルグリセロールのω−3またはω−6脂肪酸含量の増大方法。 - (a)(i)適切な制御配列の制御下にある、
1)配列番号31、
2)配列番号32、
3)配列番号33、
4)配列番号34、
5)配列番号35、
6)配列番号36、および
7)配列番号37に記載のアミノ酸モチーフの全てを含んでなる、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ−1酵素をコードする少なくとも1つの遺伝子、および
(ii)脂肪酸供給源
を含んでなる形質転換宿主細胞を準備し、
(b)ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ−1酵素をコードする少なくとも1つの遺伝子が発現し、脂肪酸をトリアシルグリセロールに転移させる条件下で、ステップ(a)の細胞を生育させ、
(c)ステップ(b)のトリアシルグリセロールを場合により回収すること
を含んでなる形質転換宿主細胞中のトリアシルグリセロール含量の増大方法。 - (a)(i)適切な制御配列の制御下にある、
1)配列番号23、
2)配列番号24、
3)配列番号25、
4)配列番号26、
5)配列番号27、
6)配列番号28、
7)配列番号29、および
8)配列番号30に記載のアミノ酸モチーフの全てを含んでなる、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ−1酵素をコードする少なくとも1つの遺伝子、および
(ii)脂肪酸供給源
を含んでなる形質転換宿主細胞を準備し、
(b)ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ−1酵素をコードする少なくとも1つの遺伝子が発現し、脂肪酸をトリアシルグリセロールに転移させる条件下で、ステップ(a)の細胞を生育させ、
(c)ステップ(b)のトリアシルグリセロールを場合により回収すること
を含んでなる形質転換宿主細胞中のトリアシルグリセロール含量の増大方法。 - (a)(i)機能性のω−3/ω−6脂肪酸生合成経路をコードする遺伝子、および
(ii)適切な制御配列の制御下にある、
1)配列番号31、
2)配列番号32、
3)配列番号33、
4)配列番号34、
5)配列番号35、
6)配列番号36、および
7)配列番号37に記載のアミノ酸モチーフの全てを含んでなる、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ−1酵素をコードする少なくとも1つの遺伝子
を含んでなる形質転換宿主細胞を準備し、
(b)(i)および(ii)の遺伝子が発現し、少なくとも1つのω−3またはω−6脂肪酸の生成、およびそのトリアシルグリセロールへの転移がもたらされる条件下で、ステップ(a)の細胞を生育させ、
(c)ステップ(b)のトリアシルグリセロールを場合により回収すること
を含んでなる形質転換宿主細胞中のトリアシルグリセロールのω−3またはω−6脂肪酸含量の増大方法。 - (a)(i)機能性のω−3/ω−6脂肪酸生合成経路をコードする遺伝子、および
(ii)適切な制御配列の制御下にある、
1)配列番号23、
2)配列番号24、
3)配列番号25、
4)配列番号26、
5)配列番号27、
6)配列番号28、
7)配列番号29、および
8)配列番号30に記載のアミノ酸モチーフの全てを含んでなる、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ−1酵素をコードする少なくとも1つの遺伝子
を含んでなる形質転換宿主細胞を準備し、
(b)(i)および(ii)の遺伝子が発現し、少なくとも1つのω−3またはω−6脂肪酸の生成、およびそのトリアシルグリセロールへの転移がもたらされる条件下で、ステップ(a)の細胞を生育させ、
(c)ステップ(b)のトリアシルグリセロールを場合により回収すること
を含んでなる形質転換宿主細胞中のトリアシルグリセロールのω−3またはω−6脂肪酸含量の増大方法。 - 機能性のω−3/ω−6脂肪酸生合成経路をコードする遺伝子が、デサチュラーゼおよびエロンガーゼよりなる群から選択される請求項25、28または29のいずれか一項に記載の方法。
- デサチュラーゼが、Δ9デサチュラーゼ、Δ12デサチュラーゼ、Δ6デサチュラーゼ、Δ5デサチュラーゼ、Δ17デサチュラーゼ、Δ8デサチュラーゼ、Δ15デサチュラーゼ、およびΔ4デサチュラーゼよりなる群から選択される請求項30に記載の方法。
- 宿主細胞が、藻類、細菌、カビ、真菌、および酵母よりなる群から選択される請求項24〜29のいずれか一項に記載の方法。
- 宿主細胞が油性酵母である請求項32に記載の方法。
- 油性酵母が、ヤロウィア(Yarrowia)、カンジダ(Candida)、ロドトルラ(Rhodotorula)、ロドスポリジウム(Rhodosporidium)、クリプトコッカス(Cryptococcus)、トリコスポロン(Trichosporon)、およびリポミセス(Lipomyces)よりなる群から選択される属のメンバーである請求項33に記載の方法。
- 油性酵母がヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)である請求項34に記載の方法。
- ヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)が、ヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)ATCC#20362、ヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)ATCC#8862、ヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)ATCC#18944、ヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)ATCC#76982、ヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)ATCC#90812、およびヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)LGAMS(7)1よりなる群から選択される株である請求項35に記載の方法。
- 脂肪酸が、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、γ−リノール酸、ジホモ−γ−リノール酸、アラキドン酸、α−リノール酸、ステアリドン酸、エイコサテトラエン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサペンタエン酸、エイコサジエン酸、およびエイコサトリエン酸よりなる群から選択される請求項24、25、26、27、28または29のいずれか一項に記載の方法。
- (a)ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ−1活性を有することが疑われるポリペプチドのアミノ酸配列を得て、
(b)ステップ(a)のポリペプチドのアミノ酸配列中で、
1)配列番号31、
2)配列番号32、
3)配列番号33、
4)配列番号34、
5)配列番号35、
6)配列番号36、および
7)配列番号37に記載のアミノ酸モチーフ配列の全ての存在を同定すること
を含んでなり、
ポリペプチド中のステップ(a)のモチーフ配列全ての存在が、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ−1活性の徴候である
ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ−1活性を有するポリペプチドの同定法。 - (a)ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ−1活性を有することが疑われる真菌ポリペプチドのアミノ酸配列を得て、
(b)ステップ(a)のポリペプチドのアミノ酸配列中で、
1)配列番号23、
2)配列番号24、
3)配列番号25、
4)配列番号26、
5)配列番号27、
6)配列番号28、
7)配列番号29、および
8)配列番号30に記載のアミノ酸モチーフ配列の全ての存在を同定すること
を含んでなり、
ポリペプチド中のステップ(a)のモチーフ配列の全ての存在が、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ−1活性の徴候である
ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ−1活性を有する真菌ポリペプチドの同定法。
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